Пероксидаза в полиэлектролитном комплексе и мицеллах поверхностно-активных веществ для определения ее субстратов и эффекторов в водно-органических средах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

/Л,

11111111111 □□3468685

• Г"-г ------

Кирейко Антонина Викторовна

ПЕРОКСИДАЗА В ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНОМ КОМПЛЕКСЕ И МИЦЕЛЛАХ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЕЕ СУБСТРАТОВ И ЭФФЕКТОРОВ В ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИХ СРЕДАХ

02.00.02 - Аналитическая химия

СО

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2009

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, профессор Шеховцова Татьяна Николаевна

доктор химических наук, профессор Штыков Сергей Николаевич,

Саратовский государственный университет имени Н.Г.Чернышевского, кафедра аналитической химии

доктор химических наук, профессор Клячко Наталья Львовна,

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, кафедра химической энзимологии

Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН, г. Москва

Защита состоится 22 апреля 2009 г. в 15 ч. 00 мин. в ауд. 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ имени М.В. Ломоносова, химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 20 марта 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, -г-/

кандидат химических наук Торочешникова И.И.

//

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время широкое применение ферментативных методов в биоаналитической практике ограничивается невозможностью их использования для определения нерастворимых или ограниченно растворимых в водных средах субстратов и эффекторов биокатализаторов.

Перспективным подходом к решению проблемы проведения ферментативных процессов в растворах органических растворителей является включение биокатализаторов в надмолекулярные ансамбли амфифильных молекул - природных и синтетических полиэлектролитов, поверхностно-активных веществ (ПАВ). В настоящее время использование таких организованных молекулярных структур в химическом анализе сдерживается недостатком фундаментальных знаний и экспериментальных данных, а также фрагментарностью и разобщенностью исследований в этой области, как в России, так и за рубежом.

Изучение взаимодействия ферментов с полиэлектролитами и ПАВ, варьирование природы последних, условий получения комплексов и т.д. является основой создания биосенсоров нового поколения с заданными свойствами (чувствительностью и селективностью). Результаты таких исследований позволят расширить круг определяемых соединений за счет ограниченно растворимых и плохо окисляемых субстратов и эффекторов ферментов путем включения последних в полиэлектролитные комплексы и мицеллы ПАВ, каталитически активные как в водных, так и водно-органических средах; повысить селективность определения ряда органических и неорганических веществ за счет их избирательного транспорта через полиэлектролитную мембрану; повысить активность ферментов и направленно регулировать их чувствительность к субстратам и эффекторам; обеспечить устойчивость биологических компонентов в средах органических растворителей. Все вышеперечисленное свидетельствует об актуальности, перспективности и целесообразности проведения фундаментальных исследований в этой области.

Цель работы заключалась в разработке подходов к проведению реакций, катализируемых пероксидазой из корней хрена в средах органических растворителей, которые состояли во включении фермента в полиэлектролитный комплекс с хитозаном и прямые и обращенные мицеллы ПАВ, а также в их применении для определения ограниченно растворимых в воде биологически активных органических соединений (лекарственных веществ и органических пероксидов).

Автор выражает искреннюю благодарность к.х.н., доценту кафедры аналитической химии Московского государственного университета им. М.Б. Ломоносова H.A. Веселовой за участие в постановке задач и обсуждении результатов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- получить высокоактивный и стабильный полиэлектролитный комплекс пероксидаза хрена - хитозан и оптимизировать условия получения прямых и обращенных мицелл ПАВ (додецилсульфата натрия (ДЦС) и аэрозоля ОТ (АОТ) с включенным в них ферментом;

- изучить кинетику и химизм процессов, катализируемых полученными надмолекулярными структурами, а также стабильность пероксидазных препаратов в водных растворах и в средах полярных и неполярных органических растворителей;

- выяснить эффективность пероксидазы, включенной в полиэлектролитный комплекс и прямые и обращенные мицеллы ПАВ, по отношению к ее субстратам, а также чувствительность к действию эффекторов (ингибиторов и активаторов);

- показать возможности аналитического применения препаратов пероксидазы, включенной в полиэлектролитный комплекс и в прямые и обращенные мицеллы ПАВ, для определения • ее органических субстратов (фенотиазинов, цистеина и органических пероксидов) и эффекторов (сульфаниламида и имидазола) в средах полярных (ДМСО) и неполярных (бензоле, октане) органических растворителей, в том числе при анализе реальных нерастворимых в воде объектов.

Научная новизна. Получен полиэлектролитный комплекс пероксидаза хрена-хитозан, стабильный в водных растворах и в присутствии полярного органического растворителя ДМСО и обладающий большей каталитической активностью, чем нативный фермент. Установлено, что высокая активность биокатализатора в составе полиэлектролитного комплекса обусловлена изменением рКа ионогенных групп субстрата-восстановителя и пероксидазы в присутствии хитозана. Показано, что полиэлектролитный комплекс пероксидаза-хитозан сохраняет каталитическую активность в присутствии 60 об.% ДМСО в реакции окисления о-дианизидина пероксидом водорода. Для определения фенотиазинов в водно-органических средах предложено использовать обнаруженный эффект субстрат-субстратной активации реакции окисления о-дианизидина пероксидом водорода, катализируемой комплексом пероксидаза-хитозан.

Предложено применение пероксидазы, включенной в прямые и обращенные мицеллы ДЦС, для проведения ферментативных реакций в водных растворах и в средах органических растворителей. Показано, что проведение реакций окисления о-дианизидина, 5,5',5,5'-тетраметилбензидина и о-фенилендиамина в прямых мицеллах ДЦС и АОТ обеспечивает стабилизацию промежуточных продуктов окисления арилдиаминов, которые характеризуются большими молярными коэффициентами поглощения, чем конечные продукты их окисления. Этот эффект использован для

улучшения аналитических характеристик методик определения ряда лекарственных веществ (цистеина, сульфаниламида и имидазола) в водных растворах.

При изучении кинетики пероксидазного окисления о-дианизидина в средах прямых мицелл ДЦС установлено, что введение ПАВ практически не влияет на кинетику превращения пероксида водорода, но приводит к значительному улучшению кинетических параметров (¿са! и к^/Км) превращения ограниченно растворимых в воде органических пероксидов - 2-бутанонпероксида и /пре/л-бутилгидропероксида и, следовательно, улучшению метрологических характеристик методик их определения.

При сравнительном изучении кинетических параметров реакции пероксидазного окисления о-дианизидина в среде обращенных мицелл ПАВ установлено, что чувствительность пероксидазы к ее субстратам-восстановителям выше в трехкомпо-нентных мицеллах АОТ, а к эффекторам (ингибиторам и активаторам) - в четырех-компонентных мицеллах ДЦС, то есть зависит как от природы ПАВ, так и состава мицеллы.

Практическая значимость. На основе полученных высокоактивных препаратов пероксидазы, включенной в полиэлектролитный комплекс с хитозаном и обращенные мицеллы ДЦС и АОТ, стабильных в среде полярного растворителя ДМСО и в неполярных растворителях (бензоле и октане), соответственно, разработаны методики определения ряда фенотиазинов (промазина, хлорпромазина и трифторперазина) и органических пероксидов в водно-органических средах; методики апробированы в анализе нерастворимых в водных растворах объектов -органического экстракта из плазмы крови и оливкового масла соответственно.

Автор выносит на защиту:

- способы получения высокоактивных препаратов пероксидазы из корней хрена, включенной в полиэлектролитный комплекс с хитозаном и обращенные мицеллы ПАВ, стабильных в средах полярных и неполярных органических растворителей соответственно;

- схему активирования хитозаном пероксидазы в реакции окисления о-дианизидина пероксидом водорода за счет изменения рКа ионогенных групп субстрата-восстановителя и фермента;

- результаты изучения кинетики совместного окисления пероксидом водорода о-дианизидина и фенотиазинов, катализируемого натизным ферментом и полиэлектролитным комплексом в присутствии ДМСО;

- сведения о химизме и кинетике реакций окисления о-дианизидина, 3,3 ',5,5 '-тетра-метилбензидина и о-фенилендиамина, катализируемых пероксидазой, включенной в прямые и обращенные мицеллы ДЦС и АОТ;

- данные о влиянии природы ПАВ и состава обращенных мицелл на эффективность взаимодействия пероксидазы с ее субстратами и эффекторами в органических средах;

- методики определения ряда фенотиазинов и органических пероксидов в водно-органических средах, апробированные в анализе реальных нерастворимых в воде объектов - органическом экстракте из плазмы крови и растительном масле.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на 10 международных и всероссийских конференциях: международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (С-Петербург, 2003); международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов - 2003" (Москва, 2003), 6lh International Symposium & Exhibition on Environmental Contamination in Central and Eastern Europe and the Commonwealth of Independent States (Prague, Czech Republic, 2003), Всероссийской конференции по аналитической химии "Аналитика России - 2004" (Москва, 2004), International Conference "Fundamentals and applications. Biocatalysis-2005" (St-Petersburg, 2005), International Congress on Analytical Sciences "ICAS-2006" (Москва, 2006), International Symposium "Kinetics in analytical chemistry" (Marrakesh, Morocco, 2006), Euroanalysis XIV (Antwerp, Belgium, 2007), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), II Всероссийской конференции по аналитической химии "Аналитика России -2007" (Краснодар, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 11 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 257 источников, и приложения. Работа изложена на 213 страницах машинописного текста, содержит 74 рисунка и 22 таблицы.

Во Введении обоснована актуальность работы, сформулированы ее цели и задачи, научная новизна и практическая значимость.

Обзор литературы включает 2 главы. В первой главе рассмотрены основные свойства ферментов в составе полиэлектролитных комплексов (ПЭК), полученных либо в водном растворе, либо за счет послойной иммобилизации фермента и полиэлектролита (ПЭ). Особое внимание уделено вопросам сохранения каталитической активности и стабильности ферментов в составе комплексов в водно-органических и органических средах; термостабильности, применению таких комплексов в аналитической практике при создании биосенсоров, функционирующих в водно-органических средах. Во второй главе рассмотрены основные свойства и закономерности поведения ферментов, солюбилизованных в обращенные мицеллы и в составе

комплексов фермент - ПАВ в органических полярных и неполярных средах; примеры их применения в химическом анализе для создания биосенсоров для определения гидрофобных веществ.

Экспериментальная часть работы представлена четырьмя главами (3 - 6). В третьей главе перечислены исходные вещества, их характеристики, использованное оборудование, а также приведены методики приготовления растворов и проведения реакций. В четвертой главе описаны результаты оптимизации условий получения высокоактивного и стабильного ПЭК пероксидаза из корней хрена (ПХ) - хитозан; изучения кинетики катализируемой этим комплексом индикаторной реакции окисления с-дианизидина (о-Д) пероксидом водорода в водной и водно-органической (30 об.% ДМСО) средах; обсуждены причины повышения каталитической активности ПХ в составе комплекса в водном растворе по сравнению со свойствами нативного фермента и сохранения ее каталитических свойств в составе ПЭК в водно-органической среде. В пятой главе приведены и обсуждены результаты изучения пероксидазного окисления фенотиазинов (промазина, хлорпромазина и трифторпера-зина) в водной и водно-органической (в присутствии ДМСО) средах; данные по оптимизации условий их окисления. Обсуждено обнаруженное явление "субстрат-субстратной" активации фенотиазинами окисления о-Д в присутствии ПХ, как нативной, так и в составе ПЭК. Приведены данные по разработке методик определения промазина, хлорпромазина и трифторперазина в водной и водно-органической (30 об.% ДМСО) средах и апробации их в анализе органических экстрактов из плазмы крови. Шестая глава посвящена изучению аналитических возможностей применения ПХ в среде прямых и обращенных мицелл ДДС. В ней описаны результаты изучения механизма реакций пероксидазного окисления ароматических диаминов в водной среде в присутствии анионных ПАВ; данные исследования влияния на активность ПХ цистеина, сульфаниламида, имидазола в прямых мицеллах ДЦС; результаты изучения кинетики реакций окисления о-Д пероксидом водорода и органическими пероксидами, катализируемых пероксидазой в среде прямых и обращенных мицелл; характеристики разработанных методик определения пероксидов и лекарственных веществ в модельных растворах и реальных объектах.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Включение пероксидазы в полиэлектролнтный комплекс с хитозаном как средство повышения ее активности и стабильности в водно-органических средах

Одним из перспективных подходов к проведению ферментативных реакций в водно-органических средах с высоким содержанием полярной органической фазы

является включение биокатализатора в комплекс с природным или синтетическим ПЭ. Фермснт-полиэлектролитные комплексы устойчивы в довольно широких интервалах рН и ионной силы. При этом ПЭ стабилизирует ту конформацию белка, которая существует в условиях формирования комплекса. Для формирования ПЭК ферментов широко применяют природные полисахариды. Ранее на кафедре аналитической химии МГУ показано, что включение ПХ в матрицы различных полисахаридов позволяет получить значительно более стабильные, а в некоторых случаях и более активные препараты фермента, чем нативный биокатализатор. При этом среди всех изученных полисахаридов наибольшую стабильность и активность ПХ обеспечивает хитозан.

Целями этого этапа работы было выяснить природу взаимодействия ПХ с хитозаном; исследовать причины и механизм влияния этого полисахарида на свойства ПХ; изучить зависимость свойств ПЭК пероксидаза-хитозан от содержания ПЭ, рН, ионной силы и природы буферного раствора; оптимизировать условия образования высокоактивного и стабильного ПЭК в водных и водно-органических средах, а также оценить перспективность и целесообразность его использования в химическом анализе.

В качестве объекта исследования был выбран хитозан с молекулярной массой 150 кДа, поскольку именно этот препарат коммерчески доступен, его строение и свойства хорошо охарактеризованы; при иммобилизации в присутствии именно этого полисахарида ПХ стабильна в течение наиболее длительного времени. В качестве индикаторной для спектрофотометрического контроля активности ПХ была выбрана реакция окисления о-Д пероксидом водорода в водных растворах, а в дальнейшем и в присутствии полярного органического растворителя ДМСО. Оптимальными концентрациями компонентов в реакционной смеси в присутствии 0,006 мас.% хитозана являются следующие: пероксидазы - ОД нМ; о-Д - 10 мкМ и пероксида водорода - 80 мкМ.

Установлено, что хитозан значительно ускоряет индикаторную реакцию пероксидазного окисления о-Д в 0,05 М фталатном буферном растворе при рН 5,4 -6,0, и степень активации ПХ растет по мере увеличения содержания хитозана в диапазоне 0,001 - 0,006 мас.%. Для получения высокоактивного препарата ПХ оптимально содержание хиггозана 0,006 мас.%.

Изучение зависимости каталитической активности ПХ в реакции окисления о-Д в присутствии 0,0005 - 0,01 мас.% хитозана от рН (в интервале 4,4 - 6,2) и концентрации фталатного буферного раствора (в диапазоне 0,05 - 0,2 М) показало, что активность ПЭК максимальна в 0,05 М буферном растворе при рН 5,8 - 6,2. Судя по значениям рКа хитозана (~ 6,5) и точки электронейгральности пероксидазы (р! 7,2), в этом диапазоне рН наиболее вероятно формирование каталитически активного

ПЭК, образованного, очевидно, в результате электростатического взаимодействия между заряженными группами хитозана и поверхностными группами пероксидазы.

Образование ПЭК пероксидаза-хитозан подтверждено методом фотонно-корре-ляционного анализа. Установлено, что при содержании хитозана 0,006 мас.% по мере увеличения концентрации фермента в системе возрастает средний гидродинамический радиус образующихся частиц (/?, нм), что свидетельствует о взаимодействии молекул пероксидазы и хитозана.

Электростатическая природа взаимодействия между ПХ и ПЭ доказана введением сильного электролита - хлорида калия, при увеличении концентрации которого в реакционной смеси степень активирующего действия хитозана на пероксидазу понижается.

Для выяснения влияния природы буферного раствора на свойства и условия формирования ПЭК изучена каталитическая активность ПХ в присутствии хитозана не только во фталатном, но и в фосфатном и цитратном буферных растворах при рН 5,8. Оптимальным для формирования высокоактивного ПЭК пероксидаза-хитозан является 0,05 М фталатный буферный раствор с рН 5,8.

Изучение кинетики реакции окисления о-дианизидина пероксидом водорода, катализируемой полнэлектролитным комплексом пероксидаза-хитозан

Из литературы известно, что ПЭ могут значительно изменять такие кинетические характеристики ферментативных реакций, как каталитическая константа кы и наблюдаемая константа Михаэлиса Км. Нами была изучена кинетика окисления о-Д пероксидом водорода в отсутствие и в присутствии хитозана. Кинетические параметры Ктах и Км определены методом линеаризации уравнения Михаэлиса-Ментен в двойных обратных координатах Лайнуивера-Берка. Выяснено, что в условиях проведения реакции, оптимальных для формирования ПЭК пероксидаза-хитозан, кинетические параметры, рассчитанные из данных стационарной кинетики и полученные относительно пероксида водорода в отсутствие и в присутствии хитозана, практически совпадают. В то же время сравнительное изучение кинетических параметров по отношению к о-Д показало, что Кшах и к^ индикаторной реакции, катализируемой ПЭК, почти в 1,5 раза выше, чем в случае катализа нативным ферментом. Кроме того, константа Михаэлиса в присутствии хитозана незначительно понижается, а эффективность пероксидазы к о-дианизидину, характеризуемая отношением ка1/Ки, возрастает в 2 раза. Это свидетельствует о том, что активирующее действие хитозана на пероксидазу обусловлено влиянием

полисахарида на присоединение и превращение субстрата-восстановителя пероксидазы - о-Д.

Для выяснения причин влияния хитозана на активность нативной пероксидазы и фермент-субстратного комплекса изучена зависимость кинетических параметров индикаторной реакции (кся и ¿саДм, характеризующих активность фермент-субстратного комплекса и нативного фермента соответственно) от рН в диапазоне 4,5 - 6,0. Поскольку значения рК ионогенных групп пероксидазы и о-дианизидина в свободном и связанном состояниях могут изменяться, для выяснения причин влияния хитозана на скорость индикаторной реакции были определены рК ионогенных групп субстрата и фермента в этих двух состояниях в отсутствие и в присутствии хитозана (табл. 1).

Таблица 1. Значения ионогенных групп о-дианизидина (рКс) и пероксидазы (рК„) в свободном состоянии (I) и в составе фермент-субстратного комплекса (И) в отсутствие (А) и в присутствии 0,006 мас.% хитозана (Б)

Система К, кя

I II I II

А 5,6 5,6 5,7 5,8

Б 5,0 5,0 6,2 5,5

Как видно из табл. 1, в присутствии 0,006 мас.% хитозана в составе ПЭК рКа ионогенной группы свободного фермента возрастает, а рКс субстрата уменьшается. Аналогичная зависимость рК<. ионогенной группы о-Д от концентрации ПЭ наблюдается и в случае фермент-субстратного комплекса, а рКа ионогенной группы биокатализатора в связанном состоянии несколько понижается.

На основании зависимостей значений рК ионогенных групп фермента и субстрата от содержания хитозана в реакционной смеси и данных о механизме превращения ароматических аминов под действием пероксидазы, можно предложить следующую схему активирующего действия хитозана в составе ПЭК с ПХ. Увеличение рКа имидазольной группы гистидина His 42 в активном центре ПХ (рис.1) в свободном состоянии с увеличением содержания хитозана в составе ПЭК повышает ее способность принять протон от донора о-Д в изученном диапазоне рН. В свою очередь понижение рКс ионогенной группы субстрата-восстановителя усиливает ее кислотные Свойства, и она более эффективно отдает протон ионогенной группе фермента. А некоторое понижение рКа имидазольной группы гистидина His 42 в активном центре ПХ в фермент-субстратном комплексе способствует повышению ее

a, ^ThriTi

J

Рис. 1. Кpисталлографичеекая структура окружения тема пероксидазы.

донорных свойств при передаче протона на кислород, связанны» с железом(ГУ) в теме ПХ. В результате последнего железо я геме восстанавливается до основного трехвалентного состояния, И молекула воды покидает активный центр фермента. Образующееся при

ТТОГ.; СЭПрллСКпиС './X ии1),:;!;'л —

имидазол, становится более слабым и в меньшей степени передает электронную плотность на гем, что также способствует повышению эффективности катализа ПХ окисления о-Д в присутствии хитозана.

Влияние диметилсульфоксида на каталитическую активность и стабильность по л »электролитного комплекса перокендаза—хитозан

В смесях полярных органических растворителей ферменты часто теряют каталитическую активность вследствие денатурации биомолекулы, степень которой зависит как от полярности органического растворителя, так и его содержания б реакционной среде. В то же время комплексы белков с полиэлектролитами устойчивы в присутствии органических растворителей, и ферменты в составе таких комплексов защищены от инактивирующего действия органической среды, благодаря их многоточечному электростатическому взаимодействию с полимером. Нами была изучена активность и стабильность ПЭК пероксидаза-хнтозан я среде полярного органического растворителя - ДМСО. Выбор ДМСО обусловлен тем, что его часто применяют в медицинской практике для обеспечения направленного транспорта лекарственных веществ через кожный покров и клеточные мембраны, вследствие чего он входит в состав многих фармацевтических препаратов. Кроме того, ДМСО используют для подготовки проб к анализу биохимическими методами.

Влияние ДМСО на скорость реакции окисления о-Д, катализируемую нативной ПХ и ПЭК пероксидаза—хитозан, изучено в водно-органической среде при различном содержании растворителя. Установлено (рис. 2), что активность ПЭК практически не изменяется вплоть до содержания ДМСО в реакционной смеси 30 об,%, а активность нативной ПХ при таком содержании органического растворителя понижается почти в 3 раза. По мере дальнейшего увеличения содержания ДМСО » системе активность фермента как нативного, так и в составе ПЭК понижается. При 50 об.% ДМСО

скорость иероксидазного окисления о-Д в присутствия хитозана уменьшается в три раза, а в отсутствие полисахарида ферментативная реакция не протекает вообще (рис. 2). При 70 об.% ДМСО в системе ПЭК пероксидаза-хитозан не проявляет каталитическую активность.

0 10 20 30 40 50 50

ДМСО, об,%

Рис. 1. Активность ПХ натканой и в составе ПЭК (А) при разных содержаниях ДМСО относительно активности нативного фермента в отсутствие ДМСО (А0).

Для выяснения причин влияния ДМСО на скорость окисления о-Д, катализируемого ПХ нэтивной и в составе ПЭК с хитозаном, были рассчитаны кишпмеские параметры двух процессов в отсутствие и н присутствии 30% органического растворителя в системе (табл. 2), Из полученных данных следует, что кинетические параметры ферментативного процесса в среде вода - ДМСО (70:30 об.%) в присутствии ПЭК остаются практически теми же, что и в водной среде. В случае нативной ПХ присутствие 30 об.% ДМСО не влияет на максимальную скорость реакции и, соответственно, на каталитическую константу, однако приводит к увеличению в - 2 раза наблюдаемой Я"м по отношению к о-Д и, как следствие, к уменьшению эффективности {£М/Ям) фермента по отношению к этому субстрату.

Таблица 2. Кинетические параметры реакции окисления о-Д пероксидом водорода, катализируемой нативной нерокеадазой (1) и ПЭК (И) в подпой среде и в присутствии ДМСО {«= 5. Р = 0,95)

Кинетические параметры Водная среда ! Вода (70 %) ДМСО (30 %)

1 И 1 П

А"м, мкМ 17 + 2 14 + 3 34+2 15+2

Гта*, мкМ/с 0,17 + 0,01 0,32 + 0,03 0,17 + 0,02 0,32 + 0,04

кж- №3,1/с и ±0,1 3,2 + 0,3 1,7 + 0,2 3,2 ±0,4

/сса1/А'м, 1/с-мкМ 98 226 50 21!

Согласно литературным данным, наблюдаемый эффект изменения К^ при сохранении FmM указывает на то, что ДМСО при его 30 об.% содержании меняет поверхностный потенциал белковой глобулы ПХ, в результате чего субстрат или продукт его окисления концентрируются вблизи поверхности фермента, чем уменьшают каталитическую активность ПХ. Хитозан, по-видимому, предохраняет белковую глобулу ПХ от негативного воздействия ДМСО; по этой причине кинетические параметры реакции окисления о-Д, катализируемой ПЭК в отсутствие и в присутствии 30 об.% ДМСО, совпадают. При изучении стабильности ПХ нативной и в составе ПЭК в присутствии 30% об. ДМСО установлено, что фермент сохраняет половину первоначальной активности в его среде в течение 7 и 28 ч соответственно.

Таким образом, показано, что ПЭК пероксидаза-хитозан является перспективным катализатором при проведении биохимических реакций в водно-органических средах, в том числе при разработке ферментативных методик определения субстратов пероксидазы в присутствии полярных органических растворителей.

Пероксидазное окисление фенотиазннов в водно-органических средах

Фенотиазины представляют собой класс гетероциклических соединений, используемых в медицине в качестве транквилизаторов, антидепрессантов, нейролептиков, антиаллергенов и т.д. Вследствие своей амфифильной природы производные фенотиазинового ряда в организме взаимодействуют с клеточной мембраной и распределяются между двумя фазами - межклеточной жидкостью и гидрофобным липидным бислоем (клеточной' мембраной). Для эффективного направленного переноса производных фенотиазина в клетки в состав препаратов в качестве транспортера сквозь мембранные структуры часто добавляют ДМСО. Этот же растворитель применяют для экстракции фенотиазинов из биологических жидкостей, для растворения лекарственных средств при подготовке проб к анализу.

Для изучения пероксидазного окисления фенотиазинов в водных и водно-органических средах и разработки методик их определения нами были выбраны промазин, хлорпромазин и трифторперазин. Скорости окисления этих соединений контролировали по накоплению промежуточных продуктов окисления - катион-радикалов при длинах волн 512, 525 и 500 нм соответственно. Оптимальным буферным раствором для проведения всех реакций оказался 0,05 М цитратный буферный раствор с pH 3,5, концентрации Н2О2 - 50 мкМ, фермента - 0,6 - 1,5 нМ. Наличие линейных зависимостей скоростей реакций пероксидазного окисления промазина, хлорпромазина и трифторперазина от их концентраций в диапазонах 1 -50, 5 - 100 и 10 - 150 мкМ, соответственно, позволило разработать методики их определения в водном растворе (табл. 3).

Таблица 3. Метрологические характеристики методик определения промазина, хлорпромазина и трифторперазина в водном растворе (л = 5)

Параметр Промазин Хлорпромазин Трифгорперазин

Уравнения градуировочных графиков /' = 0,3 ж"'+ 0,5 у = 0,12 х +0,5 у = 0,07 х + 0,3

с„_ мкг/мл 0,3 1,8 4,8

■уг(прис„) 0,03 0,04 0,06

''-тангенс угла наклона кинетической кривой; '- концентрация фенотиазина, мкМ.

Для разработки методик определения фенсгтиазинов по их окислению в присутствии ДМСО нами было изучено его влияние на скорость пероксидазного окисления двух наиболее легкоокисляющихся фенотиазинов - промазина и хлорпромазина. Выявлено резкое уменьшение каталитической активности ПХ в указанных реакциях в присутствии даже малых содержаний ДМСО (2 об.%), что обусловлено, по-видимому, весьма низким значением рН (3,5) проведения реакций. Поскольку р1 ПХ равен 7,2, то при рН 3,5 конформационное состояние фермента сильно изменено, и любое дополнительное негативное воздействие, в том числе добавление органического растворителя, в еще большей степени влияет на структуру фермента, что приводит к понижению его каталитической активности.

Для выявления возможности уменьшения влияния органического растворителя на каталитическую активность фермента было изучено пероксидазное окисление промазина и хлорпромазина в присутствии ДМСО в широком диапазоне рН. Выяснено, что денатурирующее действие ДМСО на пероксидазу максимально при рН 3,0 - 4,0. При увеличении рН различие мювду скоростями реакции в отсутствие и в присутствии органического растворителя уменьшается, а при рН 5,0 - 5,8 эти скорости практически равны. Однако, скорость пероксидазного окисления фенотиазинов в этом диапазоне рН низка, и, следовательно, разработка методик их определения в таких условиях невозможна.

Определение фенотиазинов в водных растворах и в присутствии ДМСО по их влиянию на скорость окисления о-дианизидина, катализируемого комплексом пероксидаза—хитозан

Нами выяснено, что как в водном, так и водно-органическом растворах (при 30 об.% ДМСО) в присутствии фенотиазинов возрастает скорость окисления о-Д, катализируемого ферментом нативным и включенным в ПЭК с хитозаном. Кинетические параметры трехсубстратной реакции, катализируемой нативной пероксидазой и ПЭК, показывают, что в присутствии промазина возрастают максимальная скорость индикаторной

реакции, значения ксл и эффективность фермента по отношению к о-Д. Это свидетельствует об эффекте «субстрат-субстратной» активации индикаторного процесса в присутствии фенотиазинов - среднеокисляемых субстратов пероксидазы. При этом в присутствии второго субстрата-восстановителя эффективность пероксидазы в составе комплекса с хитозаном по отношению к о-Д примерно в 2 раза выше, чем в случае нативного фермента. Кинетические параметры реакции окисления о-Д в присутствии промазина в 30 об.% растворе ДМСО лучше в случае катализа ПЭК. Так, в составе комплекса эффективность ПХ по отношению к о-Д в присутствии 30 об.% ДМСО возрастает почти в 3 раза (kQJKM = 115 и 322 с"1 мкМ"1), а максимальная скорость - в 2 раза (0,22 и 0,42 мкМ/'с соответственно). Кроме того, в присутствии нативной пероксидазы процесс прекращается при 60 об.% ДМСО, а при добавлении хитозана реакция протекает даже при 70 об.% ДМСО (рис. 3).

Разработаны методики определения промазина, хлорпромазина и трифторперазина по их активирующему действию на реакцию пероксидазного окисления о-дианизиди-на в присутствии 30 об.% ДМСО, отличающиеся гораздо лучшими метрологическими характеристиками, чем методики в присутствии нативной ПХ (табл. 4). Разработать методику определения в водно-органической среде в отсутствие хитозана самого трудно окисляемого из изученных субстратов пероксидазы - трифторперазина, не удалось.

А/Ао.% 200

150

100

ШПЭК

□ Нативная ПХ

40 50 60 ДМСО, об.%

Рис. 3. Активность нативной ПХ и ПЭК (А) в присутствии 150 мкМ промазина при различных содержаниях ДМСО относительно активности нативного фермента в отсутствие ДМСО (Ао).

На примере промазина показана возможность применения разработанных ферментативных методик для определения фенотиазинов в органическом экстракте (гексан - ДМСО) из плазмы крови человека, а также эффективность использования ДМСО для извлечения этих лекарственных веществ из плазмы крови при подготовке проб к анализу.

Таблица 4. Метрологические характеристики методик определения фенотиазинов по их активирующему действию на реакцию окисления о-Д, катализируемую нативным ферментом (I) и комплексом пероксидаза-хитозан (II) в присутствии 30 об.% ДМСО

Фенотиазин Диапазон определяемых концентраций, мМ Уравнение 1радуировочного графика При сн (И = 5)

Промазин (I) 0,1-0,8 у = 0,20 * + 0,03 0,07

(Н) 0,02 - 0,1 у = 1,19*+ 0,19 0,05

Хлорпромазин (I) 0,5-2 у = 0,04 х + 0,04 0,06

(И) 0,05 - 0,4 у = 0,46 х + 0,19 0,04

Трифторперазин (I) - - -

(И) 0,09 - 0,7 у = 0,23 л+ 0,18 0,08

у* - значение оптической плотности раствора (/. = 450 нм) через 5 мин с момента начала реакции;

х** - концентрация фенотиазина, мМ.

Аналитические возможности применения пероксидазы в средах прямых и обращенных мицелл

Для осуществления пероксидазного катализа, как в полярных, так и неполярных органических растворителях был использован подход, заключающийся в проведении биохимических процессов в мщеллярных средах. Для включения пероксидазы в прямые и обращенные трех- и четырехкомпонентные структуры мицелл нами были выбраны анионные ПАВ - аэрозоль ОТ и додецилсульфат натрия. Были выбраны условия формирования сферических с узким распределением по размеру (4-6 нм) структур прямых и обращенных мицелл. Полученные результаты подтверждены методом фотонно-корреляционного анализа.

На первом этапе исследований было изучено влияние ДДС и АОТ на каталитическую активность ПХ и механизм катализируемых ею в водной среде реакций окисления о-Д, 3,3 ',5,5 '-тетраметилбензидина (ТМБ) и о-фенилендиамина (о-ФДА), часто используемых в качестве индикаторных в ферментативных методах анализа. Установлено, что в присутствии анионных ПАВ происходит стабилизация катион-радикалов - промежуточных продуктов окисления арилдиаминов, обусловленная взаимодействием анионного ПАВ с высокой плотностью отрицательного заряда с положительно заряженными промежуточными продуктами в предмицеллярных и мицеллярных средах. Скорость образования промежуточных продуктов и их молярные коэффициенты поглощения значительно выше, чем у конечных продуктов окисления арилдиаминов. Таким образом, введение ПАВ позволяет воздействовать на

ход процесса для выделения индикаторной стадии, наиболее подходящей для аналитических целей, и, как будет показано далее, для повышения чувствительности методик определения субстратов и эффекторов пероксидазы.

Сравнительное изучение кинетики реакции окисления о-дианизидина пероксидом водорода и органическими пероксидами, катализируемых пероксидазой в средах прямых и обращенных мицелл ПАВ

Для сравнения эффективности пероксидазного окисления о-Д в разных средах (водном буферном растворе, прямых и обращенных мицеллах ДДС, обращенных мицеллах АОТ) были рассчитаны кинетические параметры реакций по отношению к субстрату-восстановителю. В присутствии прямых мицелл ДДС сродство (Ям) биокатализатора к о-Д практически не меняется, но при- этом возрастает (в 2,5 раза) каталитическая константа скорости и эффективность пероксидазы по отношению к оД по сравнению с теми же характеристиками в водном растворе. Солюбилизация фермента в обращенные мицеллы ПАВ приводит к значительному увеличению константы Михаэлиса по отношению к субстрату-восстановителю (в 20 и 6 раз в мицеллах ДДС и АОТ соответственно). При этом каталитическая константа скорости индикаторной реакции не только не понижается, а возрастает (в 1,3 и 1,8 раза в обращенных мицеллах ДДС и АОТ соответственно). Этот факт обусловлен концентрированием субстрата и/или промежуточного продукта окисления о-Д вблизи динамической границы раздела фаз вода - органический растворитель, образованной дифилытыми молекулами анионных ПАВ. Таким образом, реакции пероксидазного окисления о-Д, проводимые в среде трехкомпонентных мицелл АОТ, характеризуются лучшими кинетическими параметрами по отношению к субстрату-восстановителю, чем ферментативные процессы в четырехкомпонентных обращенных мицеллах ДДС.

Органические пероксиды так же, как и пероксид водорода, являются субстратами-окислителями пероксидазы. Однако их ограниченная растворимость в воде осложняет проведение индикаторных реакций с их участием в водных средах.

Нами была сопоставлена кинетика реакций ферментативного окисления о-Д пероксидом водорода, 2-бутанонпероксидом и /иреяг-бутилгидропсроксидом в водном растворе, в присутствии прямых и ■ обращенных мицелл АОТ и ДДС (рис. 4). Установлено, что скорость пероксидазного окисления о-Д (£са1) и эффективность (кщ/Км) фермента по отношению к пероксидам как в водной среде, так и в средах прямых и обращенных мицелл растет в ряду /дае/я-бутилгидро пер ока ц < 2-бутанон-пероксид < пероксид водорода. Проведение в прямых и обращенных мицеллах

реакций окисления о-Д неорганическим и более гидрофобными органическими пероксидами улучшает их кинетические параметры (рис. 4).

к с"1

□ Персксид водорода

□ 2-Бутанонпероксид

□ Трет-бутилгидро-перокснд (водный)

ш Трет-бутилгидро-пероксид (в декане)

(о)

25г 20 15 10 5 0

I fl III IV

(ct;it/K.ltJc'1-MHM"' 0,016

0,012

'fcltiKw.C'^MKM"'

Юг

a 6 4 2 0

-mJ

Ml IV

m

(в)

0,008

0,004

ш

Рис. 4. Кинетические параметры kC3l (а) и kcJКм по отношению к пероксиду водорода (б), 2 - бутан онпе ро кс иду (в), водному раствору и раствору в декане трет-бут и л гидр о перо кс и да (г) в водном растворе (i), прямых мицеллах ДДС (II), обращенных мицеллах ДДС (III) и ЛОТ (IV).

Следует отметить, что в работе были использованы два коммерческих препарата тирет-бутилгидропероксида - его водный раствор и в декане. В водном растворе эффективность пероксидазы по отношению к трет-бутилгидропероксиду, растворенному в органическом растворителе, ниже, чем эффективность к тому же соединению, растворенному в воде (рис. 4). При проведении пероксидазного окисления о-Д в прямых и обращенных мицеллах ПАВ кинетические характеристики ферментативного процесса не зависели от природы растворителя органического пероксида.

Влияние второго субстрата и эффекторов на каталитическую активность пероксидазы в средах прямых и обращенных мицелл ПАВ.

Ферментативные методики их определения

Проведено сравнительное изучение влияния второго субстрата-восстановителя пероксидазы хрена - цистеина и классических эффекторов: ингибитора (сульфаниламида) и активатора (имидазола), на ее каталитическую активность в реакции окисления о-Д пероксидом водорода в водном растворе и в обращенных мицеллах ДЦС. Установлено, что в среде обращенных четырехкомпонентных мицелл ДДС в результате микроконцентрирования эффектора и компонентов индикаторного процессса во внутренней полости мицеялярной структуры эффективность ингибиро-вания пероксидазы сульфаниламидом выше, чем в водном растворе, что выражается уменьшением константы ингибирования в 3 раза. Проведение индикаторной реакции в среде обращенных мицелл ДЦС повышает эффективность активации пероксидазы имидазолом: а-коэффициент, характеризующий отличие каталитической константы активированной реакции от неакгивированной, возрастает в 2,7 раза, а Ка уменьшается в 1,3 раза. В обращенных трехкомпонентных мицеллах АОТ, сульфаниламид и имидазол не влияют на каталитическую активность пероксидазы. Такое различие в поведении эффекторов в средах обращенных мицелл ДЦС и АОТ может быть обусловлено разным строением молекул и составом мицелл ПАВ. АОТ содержит объемные разветвленные гидрофобные остатки, которые, формируя границу раздела фаз вода - органический растворитель, структурируются с образованием полостей, в которые могут включаться эффекторы; вследствие этого эффекторы не проникают внутрь мицеллы. Обращенные мицеллы ДДС содержат большое количество полярного пентанола, который, по-видимому, обеспечивает транспорт водорастворимых эффекторов через межфазную границу вода - органический растворитель.

Полученные данные были использованы для разработки ферментативных методик определения цистеина, сульфаниламида и имидазола в водных растворах и

средах прямых и обращенных мицелл ДЦС. Установлено, что метрологические характеристики методик определения второго субстрата и эффекторов в мицеллярных растворах ПАВ значительно улучшаются по сравнению с таковыми в водных средах. Так, в среде обращенных мицелл ДДС нижние границы определяемых содержаний цистеина, сульфаниламида и имидазола понижаются в 5, 10 и 2 раза, соответственно, по сравнению с аналогичной характеристикой в водном растворе (рис. 5), а коэффициенты чувствительности градуировочных графиков при определении тех же соединений увеличиваются в 5,5; 8 и 2 раза соответственно.

с и, мкМ 1,2

0,8 0,4 0

III

с», мМ 2_

1,5 1

0,5 О

/

с„, мкМ

У

(а)

(б)

(в)

Рис. 5. Нижние границы определяемых содержании цистеина (а), сульфаниламида (б) и имидазола (в) в водном растворе (I), средах прямых (II) и обращенных (III) мицелл ДДС.

Определение пероксида водорода и органических пероксидов в водном растворе и в средах прямых и обращенных мицелл ПАВ

Данные, полученные при сравнительном изучении кинетики реакции пероксидазного окисления о-Д в различных средах, были использованы для разработки методик определения пероксида водорода, 2-бутанонпероксида и трет-бутилгидропероксида в водных растворах и в средах прямых и обращенных мицелл ДДС и АОТ. Результаты, представленные на рис. 6, свидетельствуют о том, что методики определения неорганического и органических пероксидов в средах обращенных мицелл обладают лучшими метрологическими характеристиками, чем в водных средах. Так, в среде обращенных мицелл ДДС нижние границы определяемых содержаний пероксида водорода, 2-бутанонпероксида и трьта-бутилгидропероксида понижаются в 12, 14 и 30 раз, соответственно, по сравнению с той же характеристикой в водной среде. В среде прямых мицелл чувствительность определения органических пероксидов также выше, чем в водном растворе (рис. 6). Это, вероятно, связано с тем, что ПАВ повышает растворимость органических пероксидов в воде.

Разработанные нами методики определения органических пероксидов в среде обращенных мицелл ДЦС были применены для их определения в водонерастворимых объектах - рафинированном и нерафинированном оливковых маслах.

ся,мкМ

с„мкМ 12

10

□ Пероксид водорода

S 2-Бутанон пероксид

3000

2000

1000

Р7

es?;- g,7

п in

(а)

IV

I II III IV

(6)

Рис. 6. Нижние границы определяемых содержаний пероксида водорода, 2-бутанон-пероксида (а) и тре/и-бутилгидропероксида в декане (б) в водном буферном растворе (I), в среде прямых мицелл ДЦС (II) и обращенных мицелл ДДС (III) и АОТ (IV).

***

Результаты проведенных нами исследований свидетельствуют о перспективности применения в химическом анализе подходов к проведению ферментативных процессов в средах полярных и неполярных органических растворителей, основанных на включении биокатализаторов в надмолекулярные ансамбли амфифильных молекул, образованных в результате нековалентных взаимодействий. Особо следует подчеркнуть, что включение биокатализатора в состав полиэлектролитных комплексов, прямых и обращенных мицелл поверхностно-активных веществ обеспечивает не только сохранение каталитической активности ферментов в органических средах, но и позволяет путем варьирования природы, состава и условий формирования надмолекулярных структур изменять кинетические параметры катализируемых ими реакций. Последнее, как было убедительно показано нами, может быть использовано для направленного регулирования чувствительности биокатализатора к его субстратам и эффекторам в целях создания высокочувствительных ферментативных методик определения биологически активных соединений в водных растворах и в средах с высоким содержанием полярных и неполярных органических растворителей.

выводы

1. Получен полиэлектролитный комплекс пероксидаза из корней хрена-хитозан, обладающий в два раза большей каталитической активностью, чем нативный фермент и стабильный в присутствии полярного органического растворителя ДМСО. Активирующее действие хитозана на пероксидазу в реакции окисления о-дианизидина пероксидом водорода обусловлено изменением рКа ионогенных групп субстрата-восстановителя и фермента.

2. Обнаруженный эффект субстрат-субстратной активации при соокислении о-дианизидина и фенотиазинов (промазина, хлорпромазина и трифтор-перазина) пероксидом водорода, катализируемого полиэлектролитным комплексом пероксидаза-хитозан, использован для разработки методик определения указанных лекарственных веществ в водно-органических средах (на примере ДМСО).

3. При проведении реакции окисления о-дианизидина, З.З'ДУ-тетраметил-бензидина и о-фенилендиамина в присутствии пероксидазы, включенной в прямые мицеллы ДДС и АОТ, стабилизируются промежуточные продукты окисления арилдиаминов, которые характеризуются большими молярными коэффициентами поглощения, чем конечные продукты. Это позволило улучшить аналитические характеристики методик определения субстрата-восстановителя - цистеина и эффекторов пероксидазы - сульфаниламида и имидазола в водных растворах.

4. При проведении реакции ферментативного окисления о-дианизидина 2-бутанонпероксидом и отреот-бутилгидропероксидом в среде прямых мицелл значительно улучшаются кинетические параметры (ксА и кал!Кн) индикаторного процесса, а, вследствие этого, улучшаются метрологические характеристики методик определения органических пероксидов.

5. Разработаны методики определения фенотиазинов и органических пероксидов в средах полярных (ДМСО) и неполярных (октан, бензол) органических растворителей соответственно. Показана возможность применения методик в анализе реальных нерастворимых в воде объектов на примере анализа органического экстракта из плазмы крови человека и оливкового масла соответственно.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих статьях:

1. Кирейко А.В., Веселова И.А., Шеховцова Т.Н. Механизм реакций окисления о-дианизидина, 3,3 ',5,5 '-тетраметилбензидина, о-фенилендиамина, катализируемых пероксидазой, в присутствии додецилсульфата натрия. //

. Биоорганическая химия. 2006. Т.32. № 1. С. 80 - 86.

2. Кирейко А.В., Веселова И.А., Шеховцова Т.Н. Ферментативное определение ряда лекарственных веществ в прямых и обращенных мицеллах додецилсульфата натрия. // Вестник МГУ. Серия Химия. 2007. Т. 62. № 4. С. 216-220.

3. Веселова И.А., Кирейко А.В., Шеховцова Т.Н. Повышение каталитической активности и стабильности пероксидазы хрена за счет включения ее в полиэлектролитный комплекс с хитозаном. // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т.45. № 2. С. 1 - 6.

тезисах докладов:

1. Veselova I.A., Kireyko А. V., Karkeshkin М.А., Shekhovtsova T.N., Varlamov V.P. Influence of chitosan and Л'-phthaIvlchitosan on peroxidase and alcoholdehydrogenase properties. // 7 Международная конференция "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана", С-Петербург, Россия. 2003. Тезисы докладов. С. 37.

2. Кирейко А.В. Ферментативное определение высокомолекулярного хитозана. // Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов 2003", 15 - 18 апреля 2003. Москва, Россия. Тезисы докладов. С. 24.

3. Kireyko A.V., Veselova I.A., Shekhovtsova T.N. An enzymatic sensor for chitosan determination. // Sixth International Symposium & Exhibition on Environmental Contamination in Central and Eastern Europe and the Commonwealth of Independent States, 1 - 4 September 2003. Prague, Czech Republic. Symposium program. P. 149.

4. Кирейко A.B., Каркешкин M.A., Веселова И.А. Шеховцова Т.Н. Ферментативное определение ряда лекарственных препаратов. // Всероссийская конференция по аналитической химии "Аналитика России 2004", 27 сентября - 1 октября 2004. Москва, Россия. Тезисы докладов. С. 205.

5. Kireyko A.V., Veselova I.A, Shekhovtsova T.N. The influence of sodium dodecyl sulfate on the mechanism of o-dianisidine, 3,3 ',5,5 '-tetramethy[benzidine, and o-phenylenediamine oxidation catalyzed by horseradish peroxidase. // International Conference "Fundamentals and applications. Biocatalysis-2005", 19-23 June 2005. St-Petersburg, Russia. Book of abstracts. P. 110.

6. Kireyko A.V., Veselova I.A, Shekhovtsova T.N. Activation and stabilization of horseradish peroxidase in the presence of chitosan. // International Conference "Fundamentals and applications. Biocatalysis-2005", 19-23 June 2005. St-Petersburg, Russia. Book of abstracts. P. 109.

7. Kireyko A.V., Veselova I.A., Shekhovtsova T.N. Enzymatic determination of pharmaceuticals in aqueous and aqueous-organic solutions. // International Congress on Analytical Sciences "ICAS-2006", 25 - 30 June 2006. Moscow, Russia. Book of abstracts. V. 1. P. 123.

8. Shekhovtsova T.N., Muginova S. V, Veselova L.A., Karkeshkin M.A, Kireyko A. V., Yablotskii К. V. Approaches to improve analytical characteristics of enzymatic methods for the determination of biologically active compounds. // International Symposium "Kinetics in analytical Chemistry", 4-8 November 2006. Marrakesh, Morocco. Book of abstracts. P. 18.

9. Veselova LA., Kireyko A.V., Oleynik L.L., Shekhovtsova T.N. Analytical application of nanostructured colloid particles formed by the self-assembled polyelectrolyte complex {horseradish peroxidase-chitosan}. // Euroanalysis XIV, 9-14 September 2007. Antwerp, Belgium. Book of abstracts. P. 315.

10. Кирейко A.B., Олейник Л.И., Родионов П.В., Веселова И.А., Шеховцова Т.Н. Определение ряда //-замещенных производных фенотиазина с использованием пероксидазы, включенной в полиэлектролитный комплекс и обращенные мицеллы ПАВ. // II Всероссийская конференция по аналитической химии "Аналитика России 2007", 7-12 октября 2007. Краснодар, Россия. Тезисы докладов. С. 438.

11 .Веселова И.А., Мугинова С.В., Кирейко А.В., Яблоцкий К.В., Шеховцова Т.Н. Новые подходы к повышению чувствительности и селективности определения лекарственных препаратов и их метаболитов — субстратов растительных пероксидаз. // XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, 23 - 28 сентября 2007. Москва, Россия. Тезисы докладов. Т. 4. С. 514.

Подписано в печать 2009 года. Заказ N2 у .

Формат 60х90/1е. Усл. пен. л. .Тираж/¿>0 экз. Отпечатано на ризографе в отделе оперативной печати и информации Химического факультета МГУ.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Основные свойства комплексов фермент-полиэлектролит и возможности их использования в химическом анализе

1.1. Иммобилизация фермента путем его включения в полиэлектро- 10 литный комплекс

1.2. Иммобилизация ферментов по технологии послойного нанесения 18 пленок фермент-полиэлектролит

1.3. Применение полиэлектролитных пленок для создания биосенсо- 25 ров

Глава 2. Свойства и применение ферментов, модифицированных 34 поверхностно-активными веществами и солюбилизованных в обращенных мицеллах

2.1. Каталитическая активность и стабильность ферментов, солюби- 35 лизованных в обращенных мицеллах ПАВ

2.2. Применение комплексов фермент-ПАВ в качестве катализаторов 53 в неполярных органических растворителях

2.3. Биосенсоры на основе солюбилизованных ферментов

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Исходные вещества, посуда, аппаратура, обработка результа- 66 тов измерений, методика эксперимента

3.1. Исходные вещества

3.2. Посуда, аппаратура

3.3. Методики эксперимента

3.4. Обработка результатов измерений

Глава 4. Включение пероксидазы в полиэлектролитный комплекс с хитозаном как средство повышения активности и стабильности фермента в водной и водно-органической средах

4.1. Обоснование выбора полиэлектролита для образования 79 кохмплекса с пероксидазой

4.2. Получение полиэлектролитного комплекса пероксидаза-хитозан

4.2.1. Обоснование выбора индикаторной реакции для контроля 84 активности пероксидазы в присутствии хитозана

4.2.2. Влияние хитозана на скорость реакции окисления о- 85 дианизидина пероксидом водорода

4.2.3. Выбор оптимальных концентраций компонентов индикаторной 89 реакции, катализируемой полиэлектролитным комплексом перокси-даза— хитозан

4.2.4. Влияние природы, рН и концентрации буферного раствора на 91 активность полиэлектролитного комплекса пероксидаза-хитозан

4.3. Изучение кинетики реакции окисления о-дианизидипа 97 пероксидом водорода, катализируемой полиэлектролитным комплексом пероксидаза -хитозан

4.4. Влияние диметилсульфоксида на каталитическую активность и 105 стабильность полиэлектролитного комплекса пероксидаза-хитозан

Глава 5. Пероксидазное окисление фенотиазинов в водно-органичес- 111 ких средах

5.1. Ферментативное определение фенотиазинов по их пероксидаз- 113 ному окислению в водных растворах и в присутствии ДМСО

5.2. Определение фенотиазинов в водных растворах и в присутствии 124 ДМСО по их влиянию на скорость окисления о-Д пероксидом водорода, катализируемого полиэлектролитным комплексом пероксидаза -хитозан

5.3. Определение промазина в плазме крови

Глава 6. Аналитические возможности применения пероксидазы в 134 средах прямых и обращенных мицелл ПАВ

6.1. Обоснование выбора поверхностно-активных веществ

6.2. Изучение механизма индикаторных реакций пероксидазного окисления о-дианизидина, 5,3'5,5'-тетраметилбензидина и о-фенилендиамина в средах прямых мицелл ДДС и АОТ

6.3. Оптимизация условий проведения индикаторной реакции 148 пероксидазного окисления о-дианизидина в средах обращенных мицелл АОТ и ДДС

6.4. Изучение реакций окисления о-Д пероксидом водорода и органи- 154 ческими пероксидами, катализируемых пероксидазой в средах прямых и обращенных мицелл ПАВ

6.5. Влияние второго субстрата-восстановителя и эффекторов на 161 каталитическую активность пероксидазы в среде обращенных мицелл ПАВ

6.5.1. Влияние цистеина на каталитическую активность 162 пероксидазы в водном растворе и в среде обращенных мицелл

6.5.2. Влияние сульфаниламида на каталитическую активность 166 пероксидазы в водном растворе и в среде обращенных мицелл

6.5.3. Влияние имидазола на каталитическую активность перок- 168 сидазы в водном растворе и в среде обращенных мицелл ПАВ

6.6. Ферментативное определение сульфаниламида, цистеина и 173 имидазола в водном растворе и в средах прямых и обращенных мицелл ДДС

6.7. Определение пероксида водорода и органических пероксидов в 175 водном растворе и в средах прямых и обращенных мицелл ПАВ

6.8. Определение органических пероксидов в оливковом маслс

ВЫВОДЫ

Актуальность работы. В настоящее время широкое применение ферментативных методов в биоаналитической практике ограничивается невозможностью их использования для определения нерастворимых или ограниченно растворимых в водных средах субстратов и эффекторов биокатализаторов.

Перспективным подходом к решению проблемы проведения ферментативных процессов в растворах органических растворителей является включение биокатализаторов в надмолекулярные ансамбли амфифильных молекул - природных и синтетических полиэлектролитов, поверхностно-активных веществ (ПАВ). В настоящее время использование таких организованных молекулярных структур в химическом анализе сдерживается недостатком фундаментальных знаний и экспериментальных данных, а также фрагментарностью и разобщенностью исследований в этой области, как в России, так и за рубежом.

Изучение взаимодействия ферментов с полиэлектролитами и ПАВ, варьирование природы последних, условий получения комплексов и т.д. является основой создания биосепсоров нового поколения с заданными свойствами (чувствительностью и селективностью). Результаты таких исследований позволят расширить круг определяемых соединений за счет ограниченно растворимых и плохо окисляемых субстратов и эффекторов ферментов путем включения последних в полиэлектролитпые комплексы и мицеллы ПАВ, каталитически активные как в водных, так и водно-органических средах; повысить селективность определения ряда органических и неорганических веществ за счет их избирательного транспорта через полиэлектролитную мембрану; повысить активность ферментов и направленно регулировать их чувствительность к субстратам и эффекторам; обеспечить устойчивость биологических компонентов в средах органических растворителей. Все вышеперечисленное свидетельствует об актуальности, перспективности и целесообразности проведения фундаментальных исследований в этой области.

Автор выражает искреннюю благодарность к.х.н., доценту кафедры аналитической химии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова И.А. Веселовой за участие в постановке задач и обсуждении результатов.

Цель работы заключалась в разработке подходов к проведению реакций, катализируемых пероксидазой из корней хрена в средах органических растворителей, которые состояли во включении фермента в полиэлектролитный комплекс с хитозаном и прямые и обращенные мицеллы ПАВ, а также в их применении для определения ограниченно растворимых в воде биологически активных органических соединений (лекарственных веществ и органических пероксидов).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- получить высокоактивный и стабильный полиэлектролитный комплекс пероксидаза хрена — хитозан и оптимизировать условия получения прямых и обращенных мицелл ПАВ (додецилсульфата натрия (ДДС) и аэрозоля ОТ (АОТ) с включенным в них ферментом;

- изучить кинетику и химизм процессов, катализируемых полученными надмолекулярными структурами, а также стабильность пероксидазных препаратов в водных растворах и в средах полярных и неполярных органических растворителей;

- выяснить эффективность пероксидазы, включенной в полиэлектролитный комплекс и прямые и обращенные мицеллы ПАВ, по отношению к ее субстратам, а также чувствительность к действию эффекторов (ингибиторов и активаторов);

- показать возможности аналитического применения препаратов пероксидазы, включенной в полиэлектролитный комплекс и в прямые и обращенные мицеллы ПАВ, для определения ее органических субстратов (фенотиазинов, цистеипа и органических пероксидов) и эффекторов (сульфаниламида и имидазола) в средах полярных (ДМСО) и неполярных (бензоле, октане) органических растворителей, в том числе при анализе реальных нерастворимых в воде объектов.

Научная новизна. Получен полиэлектролитный комплекс пероксидаза хрена-хитозап, стабильный в водных растворах и в присутствии полярпого органического растворителя ДМСО и обладающий большей каталитической активностью, чем нативпый фермент. Установлено, что высокая активность биокатализатора в составе полиэлектролитного комплекса обусловлена изменением рКа ионогепных групп субстрата-восстановителя и пероксидазы в б присутствии хитозапа. Показано, что полиэлектролитный комплекс пероксидаза-хитозап сохраняет каталитическую активность в присутствии 60 об.% ДМСО в реакции окисления о-диапизидина пероксидом водорода. Для определения фепотиазипов в водно-органических средах предложено использовать обнаруженный эффект субстрат-субстратной активации реакции окисления о-дианизидина пероксидом водорода, катализируемой комплексом пероксидаза-хитозап.

Предложено применение пероксидазы, включенной в прямые и обращенные мицеллы ДДС, для проведения ферментативных реакций в водных растворах и в средах органических растворителей. Показано, что проведение реакций окисления о-дианизидина, 3,3',5,5'-тетраметилбензидина и о-фепилендиамина в прямых мицеллах ДДС и АОТ обеспечивает стабилизацию промежуточных продуктов окисления арилдиамипов, которые характеризуются большими молярными коэффициентами поглощения, чем конечные продукты их окисления. Этот эффект использован для улучшения аналитических характеристик методик определения ряда лекарственных веществ (цистеина, сульфаниламида и имидазола) в водных растворах.

При изучении кинетики пероксидазного окисления о-дианизидина в средах прямых мицелл ДДС установлено, что введение ПАВ практически не влияет на кинетику превращения пероксида водорода, но приводит к значительному улучшению кинетических параметров (kcai и kQJKM) превращения ограниченно растворимых в воде органических пероксидов — 2-бутапои-пероксида и м/зеш-бутилгидропероксида и, следовательно, улучшению метрологических характеристик методик их определения.

При сравнительном изучении кинетических параметров реакции пероксидазного окисления о-диапизидипа в среде обращенных мицелл ПАВ установлено, что чувствительность пероксидазы к ее субстратам-восстаповитслям выше в трехкомпонентных мицеллах АОТ, а к эффекторам (ингибиторам и активаторам) - в четырехкомпопентных мицеллах ДДС, то есть зависит как от природы ПАВ, так и состава мицеллы.

Практическая значимость. На основе полученных высокоактивных препаратов пероксидазы, включенной в полиэлектролитный комплекс с хитозаном и обращенные мицеллы ДДС и АОТ, стабильных в среде полярного растворителя ДМСО и в неполярных растворителях (бензоле и октане), соответственно, разработаны методики определения ряда фенотиазипов (промазина, хлорпромазина и трифторперазина) и органических пероксидов в водно-органических средах; методики апробировапы в анализе нерастворимых в водных растворах объектов - органического экстракта из плазмы крови и оливкового масла соответственно.

Автор выносит на защиту:

- способы получения высокоактивных препаратов пероксидазы из корней хрена, включенной в полиэлектролитный комплекс с хитозаном и обращенные мицеллы ПАВ, стабильные в средах полярных и неполярных органических растворителей соответственно;

- схему активирования хитозаном пероксидазы в реакции окисления о-дианизидина пероксидом водорода за счет изменения рКа ионогенных групп субстрата-восстановителя и фермента;

- результаты изучения кинетики совместного окисления пероксидом водорода о-дианизидина и фенотиазинов, катализируемого нативным ферментом и полиэлектролитным комплексом в присутствии ДМСО;

- сведения о химизме и кинетике реакций окисления о-дианизидина, 3,3',5,5'-тетраметилбензидина и о-фенилепдиамина, катализируемых пероксидазой, включенной в прямые и обращенные мицеллы ДДС и АОТ;

- данные о влиянии природы ПАВ и состава обращенных мицелл на эффективность взаимодействия пероксидазы с ее субстратами и эффекторами в органических средах;

- методики определения ряда фенотиазипов и органических пероксидов в водно-органических средах, апробированные в анализе реальных нерастворимых в воде объектов - органическом экстракте из плазмы крови и растительном масле.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Получен полиэлектролитный комплекс пероксидаза из корней хрепа -хитозап, обладающий в два раза большей каталитической активностью, чем натпвный фермент, и стабильный в присутствии полярного органического растворителя ДМСО. Активирующее действие хитозана на псроксидазу в реакции окисления о-диапизидипа пероксидом водорода обусловлено изменением рКд. ионогенных групп субстрата-восстановителя и фермента.

2. Обнаруженный эффект субстрат-субстратной активации при соокислепии о-дианизидина и феиотиазинов (промазипа, хлорпромазииа и трифторперазииа) пероксидом водорода, катализируемого полиэлектролитным комплексом пероксидаза—хитозан использован для разработки методик определения указанных лекарственных препаратов в водно-органических средах (на примере ДМСО).

3. При проведении реакции окисления о-дианизидина, 3,3',5,5'-тетраметилбензидипа и о-фепилендиамина в присутствии пероксидазы, включенной в прямые мицеллы ДДС и АОТ, стабилизируются промежуточные продукты окисления арилдиаминов, которые характеризуются большими молярными коэффициентами поглощения, чем конечные продукты. Это позволило улучшить аналитические характеристики методик определения субстратрата-восстановителя -цистеипа и эффекторов пероксидазы - сульфаниламида и имидазола в водных растворах.

4. При проведении реакции ферментативного окисления о-дианизидина 2-бутапоппероксидом и /?г/?еш-бутилгидропероксидом в среде прямых мицелл значительно улучшаются кинетические параметры (кса{ и /гса,//<",,) индикаторного процесса, а, вследствие этого, улучшаются метрологические характеристики методик определения органических пероксидов.

5. Разработаны методики определения феиотиазинов и органических пероксидов в средах полярных (ДМСО) и неполярных (октан, бензол) органических растворителей соответственно. Показана возможность применения методик в анализе реальных нерастворимых в воде объектов па примере анализа органического экстракта из плазмы крови человека и оливкового масла соответственно.

1. Klibanov AM. Improving enzymes by using them in organic solvents. // Nature. 2001. V. 409. P. 241 -246.

2. Martinek K., Levashov A.V., Khmelnitsky Y.L., Klyachko N.L., Berezin I.V. Colloidal solution of water in organic solvents: a microgeterogeneous medium for enzymatic reactions. // Scicnce. 1982. V. 218. P. 889 891.

3. Krieger N., Bhatnagar Т., Baratti J.C., Baron A.N., Lima V.D., Mitchell D. Non-aqueous biocatalysis in heterogeneous solvent systems. // Food Technol. Biotechnol. 2004. V. 42. P. 279 286.

4. Ramirez-Corredores M., Borole A. Biocatalysis in oil refining. London: Elsevier. 2007.416 р.

5. Fitzpatrick P.A., Steinmetz A.C.U., Ringe D., Klibanov A.M. Enzyme crystal structure in a neat organic solvent. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. V. 90. P. 8653 8657.

6. Yennawar H.P., Yennawar N.H., Farber G.K. A structural explanation for enzyme memory in nonaqueous solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 577-585.

7. Zaks A., Klibanov A.M. Enzymatic catalysis in organic media at 100 degrees C. // Science. 1984. V. 224. P. 1249 1251.

8. Khmelnitsky Yu. L., Mozhaev V. V, Belova A.B., Sergeeva M. V., Martinek K. Denaturation capacity: a new quantitative criterion for selection of organic solvents as reaction media in biocatalysis. // Eur. J. Biochem. 1991. V. 198. P. 31-41.

9. Zaks A., Klibanov A.M. Enzymatic catalysis in nonaqueous solvents. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 3194 3201.

10. Vakurov А. V., Gladilin A.K., Levashov A.V., Khmelnitsky, Y.L. Dry enzymepolymer complexes — stable organosoluble biocatalysts for nonaqueous enzymology. //Biotechnol. Lett. 1994. V. 16. P. 175 178.

11. Dordick J.S. Designing enzymes for use in organic solvents. // Biotechnol. Prog. 1992. V. 8. P. 259-267.

12. Khmelnitsky Yn. L., Belova A.B., Levashov A. V., Mozhaev V. V. Relationship between surface hydrophilicity of a protein and its stability against denaturation by organic solvents. // FEBS Lett. 1991. V. 284. P. 267 269.

13. Inada Y., Takahashi К, Yoshimoto Т., Ajima A., Matsushima A., Saito Y. Engineering physicochemical and biological properties by chemical modification. // Trends Biotechnol. 1986. V. 4. P. 190 194.

14. Rich J.O., Mozhaev V.V., Dordick J.S., Clark D.S., Khmelnitsky Yu. L. Molecular imprinting of enzymes with water-insoluble ligands for nonaqueous biocatalysis. // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 5254 5255.

15. Veselova I.A., Shekhovtsova T.N. Visual determination of lead(II) by inhibition of alkaline phosphatase immobilized on polyurethane foam. // Anal. Chim. Acta. 2000. V. 413. P. 95-101.

16. Chaniotakis N.A. Enzyme stabilization strategies based on electrolytes and polyelectrolytes for biosensor applications. // Anal. Bioanal. Chem. 2004. V. 378. P. 89 95.

17. Bickerstaff G.F. Immobilization of enzymes and cells. N.-Y. and London: Humana Press, 1997. 366 p.

18. Decher G. Fuzzy nonoassemblies: toward layered polymeric multicomposites. // Science. 1997. V. 277. P. 1232 1237.

19. Andersson M.M., Hatti-Kaul R. Protein stabilising effect of polyethyleneimine. //J. Biotechnol. 1999. V. 72. P. 21 31.

20. Hart A.L., Cox H., Janssen D. Stabilization of lactate oxidase in screen-printed enzyme electrodes. // Biosens. Bioelectron. 1996. V. 11. P. 833 837.

21. Gamez L., Ramirez H.L., Neira-Carrillo A., Villalonga R. Polyelectrolyte complex formation mediated immobilization of chitosan-invertase neoglyco-conjugate on pectin-coated chitin. // Bioprocess Biosyst. Eng. 2006. V. 28. P. 387-395.

22. Gamez L., Ramirez H.L., Villalonga R. Immobilization of chitosan-invertase neoglycoconjugate on carboxymethylcellulose-modified chitin. // Preparative Biochem. Biotechnol. 2006. V. 36. P. 259 271.

23. Gavalas V.G., Chaniotakis N.A. Lactate biosensor based on the adsorption of polyelectrolyte stabilized lactate oxidase into porous conductive carbon. // Mikrochim. Acta. 2001. V. 136. P. 211 215.

24. Gavalas V.G., Chaniotakis N.A., Gibson T.D. Improved operational stability of biosensors based on enzyme-polyelectrolyte complex adsorbed into a porous carbon electrode. // Biosens. Bioelectron. 1998. V. 13. P. 1205 1211.

25. Dimakis V.T., Gavalas V.G., Chaniotakis N.A. Polyelectrolyte-stabilized biosensors based on macroporous carbon electrode. // Anal. Chim. Acta. 2002. V. 467. P. 217-223.

26. Gavalas V.G., Chaniotakis N.A. Polyelectrolyte stabilized oxidase based biosensors: effect of diethylaminoethyl-dextran on the stabilization of glucose and lactate oxidases into porous conductive carbon. // Anal. Chim. Acta. 2000. V. 404. P. 67-73.

27. Gavalas V.G., Chaniotakis N.A. 60.Fullerene-mediated amperometric biosensors. //Anal. Chim. Acta. 2000. V. 409. P. 131 135.

28. Gavalas V.G., Chaniotakis N.A. Phosphate biosensor based on polyelcctrolyte-stabilized pyruvate oxidase. //Anal. Chim. Acta. 2001. V. 427. P. 271 277.

29. Sotiropoulou S., Gavalas V.G., Vamvakaki V., Chaniotakis N.A. Novel carbon materials in biosensor systems. // Biosens. Bioelectron. 2003. V. 18. P. 211 -215.

30. Wei X., Zhang M., Gorski W. Coupling the lactate oxidase to electrodes by lonotropic gelation of biopolymer. // Anal. Chem. 2003. V. 75. P. 2060 2064.

31. Mizutani F., Yabuki S., Hirata Y. Amperometric L-lactate-sensing electrode based on a polyion complex layer containing lactate oxidase. Application to serum and milk samples. // Anal. Chim. Acta. 1995. V. 314. P. 233 239.

32. Bergmann W., Rudolph R., Spohn U. A bienzyme modified carbon paste electrode for amperometric detection of pyruvate. // Anal. Chim. Acta. 1999. V. 394. P. 233-241.

33. Lutz M., Burestedt E., Emneus J., Liden H., Gobhadi S., Gorton L., Marko-Varga G. Effects of different additives on a tyrosinase based carbon paste electrode. // Anal. Chim. Acta. 1995. V. 305. P. 8 17.

34. Joo H., Yoo Y., Ryu D.D.Y. A biosensor stabilized by polyethylene glycol for the monitoring of hydrogen peroxide in organic solvent media. // Enzyme Microbiol. Techn. 1996. V. 19. P. 50 56.

35. Wang J., Dempsey E., Eremenko A. Organic-phase biosensing of enzyme inhibitors. //Anal. Chim. Acta. 1993. V. 276. P. 203-208.

36. Xing Q., Eadula S.R., Lvov Y.M. Cellulose fiber-enzyme composites fabricated through layer-by-layer nanoassembly. // Biomacromolecules. 2007. V. 8. P. 1987- 1991.

37. Santos J.P., Welsh E.R., Gaber B.P., Singh A. Polyelectrolyte-assisted immobilization of active enzymes on glass beads. // Langmuir. 2001. V. 17. P. 5361 -5367.

38. Lee Y., Stanish I., Rastogi V., Cheng T., Singh A. Sustained enzyme activity of organophosphorus hydrolase in polymer encased multilayer assemblies. // Langmuir. 2003. V. 19. P. 1330- 1336.

39. Caruso F., Schuler C. Enzyme multilayers on colloid particles: assembly, stability and enzymatic activity. // Langmuir. 2000. V. 16. P. 9595 9603.

40. Patel D.S., Aithal R.K., Krishna G., Lvov Y.M., Tien M„ Kuila D. // Nanoassembly of manganese peroxidase and lignin peroxidase from P. chrysospo-rium for biocatalysis in aqueous and non-aqueous media. // Colloids Surf. B. 2005. V. 43. P. 13-19.

41. Lvov Y.M., Caruso F. Biocolloids with ordered urease multilayer shells as enzymatic reactors. //Anal. Chem. 2001. V. 73. P. 4212 -4217.

42. Haupt B., Neumann T., Wittermann A., Ballauff M. Activity of enzymes immobilized in colloidal spherical polyelectrolyte brushes. // Biomacromolecules. 2005. V. 6. P. 948 955.

43. Liang Z., Wang C., TongZ., Ye W., Ye S. Biocatalytic nanoparticles with urease immobilized in multilayer assembled through LbL technique. // Reactive and Functional Polymers. 2005. V. 63. P. 85 94.

44. Smuleac V., Butterfield D.A., Bhattacharyya D. Layer-by-layer-assembled microfilration membranes for biomolecule immobilization and enzymatic catalysis. // Langmuir. 2006. V. 22. P. 10118 10124.

45. SzykL., Schwinte P., Voegel J. C., Schaaf P., Tinland B. Dynamical behavior of human albumin adsorbed on or embedded in polyelectrolyte multilayers. // J. Phys. Chem. B. 2002. V. 106. P. 6049 6055.

46. Ladam G., Schaaf P., Cuisinier F.J.G., Decker G., Voegel J-C. Protein adsorption onto auto-assembled polyelectrolyte films. 11 Langmuir. 2001. V. 17. P. 878-882.

47. Hamlin R.E., Dayton T.L., Johnson L.E., Johal M.S. A QCM study of the immobilization of (3-galactosidase on polyelectrolyte surfaces: effect of the terminal polyion on the enzymatic surface activity. // Langmuir. 2007. V. 23. P. 4432-4437.

48. Yang. S., Li Y., Jiang X, Chen Z., Lin X Horseradish peroxidase biosensor based on layer-by-layer technique for the determination of phenolic compounds. // Sens. Act. B. 2006. V. 114. P. 774 780.

49. Sun C. Li W., Sun Y., Zhang X, Shen J. Fabrication of multilayer films containing horseradish peroxidase based on electrostatic interaction and theirapplication as a hydrogen peroxide sensor. // Electrochim. Acta. 1999. V. 44. P. 3401 -3407.

50. Yu A., Caruso F. Thin films of polyelectrolyte-encapsulated catalase microcrystals for biosensing. //Anal. Chem. 2003. V. 75. P. 3031 -3037.

51. Hoshi Т., Saiki H., Anzai J-I. Amperometric uric acid sensors based on polyelectrolyte multilayer films. // Talanta. 2003. V. 61. P. 363 368.

52. Beissenhirtz M.K., Scheller F. IV., Lisdat F. A superoxide sensor based on a multilayer cytochrome с electrode. // Anal. Chem. 2004. V. 76. P. 4665 4671.

53. Дубачева Г.В., Соколовская JI.Г., Сиголаева JJ.B., Ярославов А.А, Еременко А.В., Курочкгш И.Н. Тирозиназные биосепсоры па основе наноструктурироваппых пленок полиэлектролитов. // Сепс. сист. 2006. Т. 20. С. 336-343.

54. Zhang S., Yang W., Niu Y., Li Y., Zhang M. Construction of glucose biosensor based on sorption of glucose oxidase onto multilayers of polyelectro-lyte/nanoparticles. // Anal. Bioanal. Chem. 2006. V. 284. P. 736 71.

55. Yang S., Chen Z., Li Y., JiangX., LinX. A novel reagentless biosensor based on self-assembled HRP and Nile Blue premixed with poly(styrenesulfonate) architectures. // Can. J. of Analyt. Sciences and Spectroscopy. 2006. V. 51. P. 174- 179.

56. Hou S-F., Yang K-S., Fang H-Q., Chen H-Y. Amperometric glucose enzyme electrode by immobilizing glucose oxidase in multilayers on self-assembled monolayers surface. // Talanta. 1998. V. 47. P. 561 567.

57. Wang Y, Joshi P.P., Hobbs K.L., Johnson M.B., Schmidtke D.W. Nanostructured biosensors built by LbL electrostatic assembly of enzyme-coated single-walled carbon nanotubes and redox polymers. // Langmuir. 2006. V. 22. P. 9776-9783.

58. Hodak J., Etchenique R., Calvo E.J., Singhal K., Bartlett P.N. Layer-by-layer self-assembly of glucose oxidase with a poly(allylamine)ferrocene redox mediator. //Langmuir. 1997. V. 13. P. 2708-2716.

59. Forzani E.S., Solis V.M., Calvo E.J. Electrochemical behavior of polyphenol oxidase immobilized in self-assembled structures layer by layer with cationic polyallylamine. // Anal. Chem. 2000. V. 72. P. 5300 5307.

60. Narvaez A., Suarez G., Popescu I.C., Kotakis I., Dominguez E. Reagentless biosensors based on self-deposited redox polyelectrolyte-oxidoreductases architectures. //Biosens. Bioelectron. 2000. V. 15. P. 43 52.

61. Wen D., Liu Y., Yang G., Dong S. Electrochemistry of glucose oxidase immobilized on the carbon nanotube wrapped by polyelectrolyte. // Electrochim. Acta. 2007. V. 52. P. 5312 5317.

62. Yan X.B., Chen X.J., Tay B.K., Khor K.A. Transparent and flexible glucose biosensor via layer-by-layer assembly of multi-wall carbon nanotubes and glucose oxidase. // Electrochem. Com. 2007. V. 9. P. 1269 1275.

63. Liu G., Lin Y. Amperometric glucose biosensor based on self-assembling glucose oxidase on carbon nanotubes. // Electrochem. Com. 2006. V. 8. P. 251 -256.

64. Liu S., Cai C. Immobilization and characterization of alcohol dehydrogenase on single-walled carbon nanotubes and its application in sensing ethanol. // J. Electroanal. Chem. 2007. V. 602. P. 103 114.

65. Ram M.K., Bertoncella P., Ding H., Paddeu S., Nicolini C. Cholesterol biosensors prepared by layer-by-layer technique. // Biosens. Bioelectron. 2001. V. 16. P. 849-856.

66. Khmelnitsky Yu. L„ Welch S.H., Clark D.S., Dordick J.S. Salts dramatically enhance activity of enzymes suspended in organic solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. P. 2647 2648.

67. Kamiya N., Okazaki S., Goto M. Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhyrous benzene. // Biotechnol. Techn. 1997. V. 11. P. 375 -378.

68. Kamiya N., Furusaki S., Goto M. Peroxidase activity and stability of surfactant-heme complex in nonaqueous media. I I Biotechnol. Lett. 1997. V. 10. P. 1015-1018.

69. Okazaki S., Goto M., Wariishi H., Tanaka H., Furusaki S. Characterization and catalytic property of surfactant—laccase complex in organic media. // Biotechnol. Prog. 2000. V. 16. P. 583 588.

70. Okazaki S., Kamiya N. Goto M. Application of novel preparation method for surfactant-protease complexes catalytically active in organic media. // Biotechnol. Prog. 1997. V. 13. P. 551 556.

71. Левашов А.В. Клячко H.JI., Мартииек К. Катализ ферментами, включенными в обращенные мицеллы поверхностно-активных веществ в органических растворителях. // Биоорг. химия. 1981. Т. 7. 3. 670 679.

72. Левашов А.В., Клячко Н.Л. Мицеллярная энзимология: методы и техника. //Изв. Акад. наук. Сер. Химия. 2001. Т. 50. С. 1638 1651.

73. Мартииек К., Левашов А.В., Клячко Н.Л., Березин И.В. Катализ водорастворимыми ферментами в органических растворителях. // Докл. АН СССР. 1977. Т. 236. С. 920 929.

74. Клячко Н.Л., Левашов А.В., Мартинек К. Катализ ферментами, включенными в обращенные мицеллы поверхностно-активных веществ, в органических растворителях. Пероксидаза в системе АОТ вода - октан. //Молек. биол. 1984. Т. 18. С. 1019-1031.

75. Gebicka L., PawlakJ. Kinetic investigations of horseradish peroxidase in АОТ/ n-heptan reverse micelles. // J. Mol. Cat. B. 1997. V. 2. P. 185 192.

76. Parida S., Parida G.R., Maitra A.N. Studies on the catalytic activity of horseradish peroxidase hasted in AOT reverse micelles containing cholesterol. // Colloids Surf. 1991. V. 55. P. 223 229.

77. Chiang C.-L. Activity and stability of lipase in AOT isooctane reverse micelles. //Biotechnol. Techniq. 1999. V. 13. P. 453 -457.

78. Ono Т., Goto M. Peroxidative catalytic behavior of cytochrome С solubilized in reverse micelles. // Biochem. Eng. J. 2006. V. 28. P. 156 160.

79. Rojo M., Gomez M., Izorna P., Estrada P. Micellar catalysis of polyphenol oxidase in AOT/cyclohexane. // J. Mol. Catal. B. 2001. V. 11. P. 857 865.

80. Moreno-Beltran A., Salgano L., Vazquez-Duhalt R., Lopez-Munguia A. Modelling the alcoholysis reaction of p-galactosidase with butanol in reverse micelles. //J. Mol. Catal. B. 1999. V. 6. P. 1 10.

81. Avramiotis S., Stamatis H. Kolisis F.N. Líanos P., Xenakis A. Structural studies of lecithin- and AOT- based w/o microemulsions, in the presence of lipase. // Langmuir. 1996. V. 12. P. 6320 6325.

82. Shipovskov S., Feropontova E., Ruzgas T., Levashov A. Stabilization of tyrosinase by reversed micelles for bioelcctrocatalysis in dry organic media. // Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1620. P. 119 124.

83. Bru R., Sanchez-Ferrer A., Garcia-Carmona F. Characteristics of tyrosinase in AOT-isooctane reverse micelles. // Biotechnol. Bioeng. 1989. V. 34. P. 304 -308.

84. Sanchez-Ferrer A., Bru R., Garcia-Carmona. Kinetic properties of polyphenol-oxidase in organic solvents. //FEBS Lett. 1988. V. 233. P. 363 366

85. SettiL., FevereiroP., Meló E.P., PifferiP.G., Cabral J.M.S., Aires-Barros M.R. Superactivity of peroxidase solubilized in reversed micellar systems. // Biochem. Biotechnol. 1995. V. 55. P. 207-218.

86. Nagayama K., Matsu-ura S., Doi T., Imai M. Kinetic characterization of esterification catalyzed by Rhizopus delemar lipase in lecithin-AOT microemulsion systems. // J. Mol. Catal. B. 1998 V. 4. P. 25 32.

87. Zhang D.-H., Guo Z., Dong X.-Y., Sun Y. Characterization of lipase in reversed micelles formulated with Cibacron Blue F-3GA modified Span 85. 11 Biotechnol. Prog. 2007. V. 23. P. 108 115.

88. Menger F.M., Yamada K. Enzyme catalysis in water pools. // J. Am. Chem. Soc. 1979. V. 101. P. 6731 -6734.

89. Pinheiro T.J.T., Elove G.A., Watts A., Roder H. Structural and kinetic description of cytochrome c unfolding induced by the interaction with lipid vesicles.//Biochemistry. 1997. V. 36. P. 13122- 13132.

90. Brochette P., Petit C., Pileni M.P. Cytochrome c in AOT reverse micelles: structure and reactivity.//J. Am. Chem. Soc. 1988. V. 110. P. 3505-3511.

91. Salamon Z., Tollin G. Interaction of horse heart cytochrome c with lipid bilayer. // J. Bioenerg. Biomembr. 1997. V. 29. P. 211 221.

92. Hamachi I. Fujita A., Kiinitake T. Protein engineering using molecular assembly, functional conversion of cytochrome c via noncovalent interactions. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 9096 9102.

93. Adachi M., Harada M. Solubilization mechanism of cytochrome c in AOT water/oil microemulsion. // J. Phys. Chem. 1993. V. 97. P. 3631 3640.

94. Wong M., Thomas J.K., Nowak J. Structure and state of water in reversed micelles. // J. Am. Chem. Soc. 1977. V. 99. P. 4730 4737.

95. Gebicka L., Gebicki J.L., Pawlak J. Formation of compound I of horseradish peroxidase in AOT reverse micelles as studied by pulse radiolysis and stopped-flow methods. // J. Mol. Catal. A. 1995. V. 98. P LI L4.

96. Chen J., Xia C., Niu J., Li S. FTIR study of horseradish peroxidase in reverse micelles. //Biochem. Biophys. Res. Com. 2001. V. 282. P. 1220- 1223.

97. Roy S., Dasgupta A., Das P. K. Tailoring of horseradish peroxidase activity in cationic water-in-oil microemulsions. // Langmuir. 2006. V. 22. P. 4567 4573.

98. Mahiuddin S., Renoncourt A., Banduin P., Touraud D., Kimz W. Horseradish peroxidase activity in catanionic microemulsion. I I Langmuir. 2005. V. 21. P. 5259 5262.

99. Nazario L.M.M., Hatton T.A., Grespo J.P.S.G. Nonionic cosurfactants in AOT reversed micelles: effect on percolation, size and solubilization site. // Langmuir. 1996. V. 12. P. 6326 6335.

100. Ruckenstein E., Karpe P. Enzymatic super- and sudactivity in nonionic reverse micelles. // J. Phys. Chem. 1991. V. 95. P. 4869 4882.

101. Walde P., Han D., Luisi P.L. Spectroscopic and kinetic studies of lipase solubilized in reverse micelles. // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 4029 4034.

102. Talukder M.M.R., Hayashi Y., Takeyama T., Zamam M.M., WuJ.C., Kawanishi T., Shimizu N. Activity and stability of lipase in modified AOT reverse micelles. // J. Mol. Catal. B. 2003. V. 22. P. 203 209.

103. Shome A, Roy S., Das P.K. Nonionic surfactants: a key to enhance the enzyme activity at cationic reverse micellar interface. // Langmuir. 2007. V. 23. P. 4130 -4136.

104. Das S., Maitra A. Temperature-dependent catalytic behaviour of peroxidase entrapped in reverse micelles. // Colloids Surf. 1989. V. 35. P. 101 104.

105. Freeman K.S., Tang T.T., Shah R.D.E., Kiserow D.J., McGown L.B. Activity and stability of lipase in AOT reversed micelles with bile salt cosurfactant // J. Phys. Chem B. 2000. V. 104. P. 9312 9316.

106. Yang H., Kiserow D.J., McGown L.B. Effects of bile salts on the solubility and activity of yeast alcohol dehydrogenase in AOT reversed micelles. // J. Mol. Catal. B. 2001. V. 14. P. 7-14.

107. Клячко Н.Л., Богданова Н.Г., Левашов А.В., Кабанов А.В., Пшежецкий А.В, Хмельницкий Ю.Л., Мартинек К., Березин И.В. Ферментативный катализ в коллоидном растворе глицерина в органическом растворителе. // Докл. АН СССР. 1987. Т. 297. С. 483 487.

108. Klyachko N.L., Bogdanova N.G., Levashov A.V., Martinek К. Micellar enzymology: superactivity of enzymes in reversed micelles of surfactants solvated by water/organic cosolvent mixtures. // Collect. Czech. Chem. Commun. 1992. V. 57. P. 625 635.

109. Munshi N., Sarcar S., Maitra A. The effect of droplet dynamics on the kinetics of the horseradish peroxidase catalysed reactions in reverse micelles. // Colloids Surf. A. 1994. V. 88. P. 181 189.

110. Liu Y, Dong X.Y., Sun Y. Characterization of reversed micelles modified span 85 for protein solubilization. // J. Colloid Interface Sci. 2005. V. 290. P. 259 -266.

111. Han D., Rhee J.S. Characteristics of lipase catalyzed hydrolysis of olive oil in AOT-isooctane reversed micelles. // Biotechnol. Bioeng. 1986. V. 28. P. 1250 -1255.

112. Shield J.W., Ferguson H.D., Bommarius A.S., Hatton T.A. Enzymes in reversed micelles as catalysts for organic-phase synthesis reactions. // Ind. Eng. Chem. Fundam. 1986. V. 25. P. 603 612.

113. Barbaric S., Luisi P.L. Micellar solubilization of biopolymers in organic solvents. Activity and conformation of a-chymotrypsin in isooctane-AOT reverse micelles. //J. Am. Chem. Soc. 1981. V. 103. P. 4239-4244.

114. Mar tine k K, Levashov A.V., Khmelnitsky Y.L., Klyachko N.L., Berezin I.V. Micellar enzymology. // Eur. J. Biochem. 1986. V. 155. P. 453 468.

115. Martinek K, Klyachko N.L., Kabanov A.V., Khmelnitsky Y.L., Levashov A.V. The second E.C. Slater lecture. Micellar enzymology: its relation to membranology. // Biochim. Biophys. Acta. 1989. V. 981. P. 161 172.

116. Lis si E., Abuin E. A general treatment for meaningful comparison of rate parameters of enzyme-catalyzed reactions in aqueous and reverse micellar solutions. // Langmuir. 2000. V. 16. P. 10084 10086.

117. Lee KM., Biellmann J-F. Cholesterol oxidase in microemulsion: enzymatic activity on a substrate of low water solubility and inactivation by hydrogen peroxide. // Bioorg. Chem. 1986. V. 14. P. 262 273.

118. Khamessan A., Kermasha S. Biocatalysis of chlorophyllase in micellar ternary system containing spans. // J. Biotechnol. 1996. V. 45. P. 253 264.

119. Marhuenda-Egea F.C., Piera-Velazquez S., Cadenas C., Cadenas E. An extreme halophilic enzyme active at low salt in reversed micelles. // J. Biotechnol. 2002. V. 93. P. 159 164.

120. Piera-Velazquez S., Marhuenda-Egea F.C., Cadenas E. The dependence of a halophilic malate dehydrogenase on wn and surfactant concentration in reverse micelles. // J. Mol. Catal. B. 2001. V. 13. P. 49 55.

121. Piera-Velazquez S., Marhuenda-Egea F.C., Cadenas E. Increased solubility of malate dehydrogenase at low salt concentration in reverse micelles. // Extremophiles. 2002. V. 6. P. 407 412.

122. Ono T., Kawakami K., Goto M., Furusaki S. Catalytic oxidation of o-phenylendiamine by cytochrome c encapsulated in reversed micelles. // J. Mol. Catal. B. 2001. V. 11. P. 955-959.

123. Huang S.Y., Chang H.L., Goto M. Preparation of surfactant-coated lipase for the esterification of geraniol and acetic acid in organic solvents. // Enzyme Microb. Techn. 1998. V. 22. P. 552 557.

124. Okazaki S., Goto M., Furusaki S., Wariishi H., Tanaka H. Preparation and catalytic performance of surfactant—manganese peroxidase-Mn(II) ternary complex in organic media. // Enzyme Microb. Techn. 2001. V. 28. P. 329 332.

125. Kamiya N. Inoue M., Goto M., Nakamura N., Naruta Y Catalytic and structural properties of surfactant-horseradish peroxidase complex in organic media. // Biotechnol. Prog. 2000. V. 16. P. 52 58.

126. Michizoe J., Uchimura Y., Maruyama T., Kamiya N., Goto M. Control of water content by reverse micellar solutions for peroxidase catalysis in a water-immiscible organic solvent. // J. Biosci. Bioeng. 2003. V. 95. P. 425 -427.

127. Michizoe J., Uchimura Y, Ichinose II, Maruyama T., Kamiya N., Wariishi II, Furusaki S., Goto M. Activation of manganese peroxidase in an organic medium using a mediator. // Biochem. Eng. J. 2004. V. 19. P. 43 46.

128. Bindhu L.V., Abraham T.E. Preparation and kinetic studies of surfactant-horseradish peroxidase ion paired complex in organic media. // Biochem. Eng. J. 2003. V. 15. P. 47-57.

129. Jene Q., Pearson J.C., Lowe C.R. Surfactant modified enzymes: solubility and activity of surfactant-modified catalase in organic solvents. // Enzyme Microb. Techn. 1997. V. 20. P. 69-74.

130. Takahashi K., Nishimura H., Yoshimoto T., Saito Y., Inada Y. A chemical modification to make horseradish peroxidase soluble and active in benzene. // Biochem. Biophys. Res. Com. 1984. V. 121. P. 261 -265.

131. Ferjancic A., Puigserver A., Gaertner H. Unusual specificity of PEG-modified thermolysin in peptide synthesis catalyzed in organic solvents. // Biotechnol. Lett. 1988. V. 10. P. 101 106.

132. Reviejo A.J., Fernandez C., Lui F., Pingarron J.M., Wang J. Advances in amperometric enzyme electrodes in reversed micelles. // Anal. Chim. Acta. 1995. V. 315. P. 93-99.

133. Morales M.D., Morante S., Escarpa A., Gonzalez M.C., Reviejo A.J., Pingarron J.M. Design of a composite amperometric enzyme electrode for the control of the benzoic acid content in food. // Talanta. 2002. V. 57. P. 1189 1198.

134. Morales M.D., Gonzalez M.C., Serra B., Reviejo A.J., Pingarron J.M. Composite amperometric tyrosinase biosensors for the determination of the additive propyl gallate in a reversed micellar medium. // Sens. Act. B. 2005. V. 106. P. 572-579.

135. Garcia-Moreno E., Ruiz M.A., Barbas C., Pingarron J.M. Determination of organic peroxides in reversed micelles with a poly-N-methylpyrrole horseradish peroxidase amperometric biosensor. // Anal. Chim. Acta. 2001. V. 448. P. 9 -17.

136. Reviejo A.J., Liu F., Pingarron J.M. Amperometric biosensors in reversed micelles. //J. Electroanal. Chem. 1994. V. 374. P. 133 139.

137. Ortiz G., Gonzalez M.C., Reviejo A.J., Pingarron J.M. Graph ite-poly(tetrafluoroethylene) composite enzyme electrodes as suitable biosensors in predominantly nonaqueous media. //Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 3521 -3526.

138. Репа N., Ruiz G., Reviejo A.J., Pingarron J.M. Graphite-teflon composite bienzyme electrodes for the determination of cholesterol in reversed micelles. Application to food samples. //Anal. Chem. 2001. V. 73. P. 1190 1195.

139. Яцимирский К.Б. Кинетические методы анализа. М.: Химия, 1967. 200 с.

140. Delincee Н., Radola B.J. Fractionation of horseradish peroxidase by preparative isoelectric focusing, gel chromatography and ion-exchange chromatography. // Eur. J. Biochemistry. 1975. V. 52. P. 321 330.

141. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Химия. 1989. 480 с.

142. Кольтгофф И.М., Сендел Е.Б. Количественный анализ. М.: Госхимиздат, 1948. С. 822.

143. Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Макромолекулярный обмен в растворах комплексов глобулярных белков с неприродными полиэлектролитами // Докл. АН СССР. 1984. Т. 275. С. 1120 1123.

144. Кабанов В.А., Мустафаев В.И. Влияние ионной силы и рН среды на поведение комплексов бычьего сывороточного альбумина с поли-4-винил-N-этилпиридинийбромидом в водных растворах // ВМС А. 1981. Т. 23. С. 255-260.

145. Кудряшова Е.В., Гладшин А.К., Левашов А.В. Белки в надмолекулярных ансамблях: исследование структуры методом разрешено-временной флуоресцентной анизотропии. // Успехи биол. хим. 2002. Т.42. С. 257 — 294.

146. Веселова И.А. Иммобилизованные перокеидаза и щелочная фосфатаза в тест-методах определения биологически активных веществ. Дие. канд. хим. наук. М.: МГУ, 2001. 295 с.

147. Kumar M.N.V., Muzzarelli, R.A.A., Muzzarelli С., Sashiwa Н., Domb. A.J. Chitosan chemistry and pharmaceutical perspectives. // Chem. Rev. 2004. V. 104. P. 6017-6084.

148. Скрябин К.Г., Вихорева Г.А., Варламов В.П. Хитин, хитозан. Получение, свойства и применение. М: Наука, 2002. 365 с.

149. Li X.W., Lee D.K.L., Chan A.S.C., Alpar H.O. Sustained expression in mammalian cells with DNA complexed with chitosan nanoparticles. // Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1630. P. 7 18.

150. Лебедева О.В., Угарова Н.Н., Березин И.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидипа перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена. // Биохимия. 1977. Т. 42. С. 1372 1379.

151. Claiborne A., Fridovich I. Chemical and enzymatic intermediates in the peroxidation of o-dianisidine by horseradish peroxidase. 1. Spectral properties of the products of dianisidine oxidation. // Biochemistry. 1979. V. 18. P. 2324 -2329.

152. Foster R. Organic Charge-transfer complexes. New York: Academic Press, 1969. P. 36.

153. Gebicka L., GebickiJ. Dimethyl sulfoxide rather then superoxide is the reactive species in horseradish peroxidase K02/DMS0 system. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1995. V. 37. P. 1021 - 1026.

154. Xu K., Griebenov K., Klibanov A.M. Correlation between catalytic activity and secondary structure subtilisin dissolved in organic solvents. // Biotechnol. Bioeng. 1997. V. 56. P. 485 491.

155. Zikakis J.P. Chitin, chitosan and related enzymes. N.-Y.: Academic Press, 1984. 393 p.

156. Метелица Д.И., Kapaceea Е.И. Активация пероксидазного окисления 3,3'5,5'-тетрамстилбензидина поли(5-амиподисульфидом салициловой кислоты). //Биохимия. 2002. Т. 67. С. 1265 1272.

157. Самсонов Г.В., Глазова Н.В., Писарев O.A., Гомолицкий В.Н., Пономарева Р.Б. Модификация панкреатической рибонуклеазы декстрансульфатами. // Докл. АН СССР. 1976. Т. 228. С. 985 987.

158. Глазова Н.В., Пономарева Р.Б., Самсонов Г.В. Исследование полимерных комплексов панкреатической рибонуклеазы с декстрансульфатами. // ВМС А. 1976. Т. 18. С. 361 -363.

159. Goldstein L. Microenvironmental effects on enzyme catalysis. A kinetic study of polyanionic and polycationic derivatives of chymotrypsin. // Biochemistry. 1972. V. 11. P. 4072-4083.

160. Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Семенов C.B., Ильина A.B., Варламов В.П. Образование жидкокристаллических дисперсий комплексов двухце-почечной ДНК с хитозаном. // Мол. биол. 2002. Т. 36. С. 532 541.

161. Colowick S., Kaplans N. Methods in Enzymology. N.-Y.: Academic Press, 1955. V. 2. P. 807.

162. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. M.: Мир, 1990. 348 с.

163. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: практический курс. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. 720 с.

164. Стрелырва З.А., Швядас В.К., Максименко A.B., Клесов A.A., Браудо Е.Е., Толстогузов В.Б., Березин И.В. Влияние полиэлектролитов па свойства пенициллинамидазы и щелочной фосфатазы. // Биоорг. химия. 1975. Т. 1. С. 1464- 1468.

165. Стрельцова З.А., Браудо Е.Е., Толстогузов В.Б. Исследование влияния полианионов на каталитические свойства а-химотрипсина. // Биоорг. химия. 1975. Т. 1. С. 267 271.

166. Березин И.В., Клесов A.A. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М.: МГУ, 1976. 320 с.

167. Угарова H.H., Лебедева О.В., Савицкий А.П. Пероксидазный катализ и его применение. М.: МГУ, 92 с.

168. Лебедева О.В., Домбровский В.А., Угарова H.H., Березин И.В. Кинетика и механизм действия пуклеофилов на реакцию окисления о-диапизидина, катализируемую пероксидазой из корней хрена. // Биохимия. 1978. Т. 43. С. 1024- 1033.

169. Khmelnitsky Yn. L., Levashov A.V., Klyachko N.L., Martinek К Engineering bioeatalytie systems in organic media with low water content. // Enzyme Microb. Techn. 1988. V. 10. P. 710 728.

170. Hailing P.J. Thermodynamic predictions for biocatalysis in nonconvential media: theory, tests and recommendations for experimental design and analysis. // Enzyme Microb. Techn. 1994. V. 16. P. 178 206.

171. Levitsky V., Lozano P., Gladilin A., Iborra J.L. Stability of immobilized enzyme-polyelectrolyte complex against irreversible inactivation by organic solvents. // Prog. Biotechnol. 1998. V. 5. P. 417 422.

172. Mozhaev V. V., Kudryashova E. V., Efremova N. V., Topchieva I.N. Stability of a-chymotrypsin conjugated with poly(ethylene glycols) and proxanols at high temperature and in water-cosolvent mixtures. // Biotechnol. Techn. 1996. V. 10. P. 849 854.

173. Shipovskov S., Levashov A. Tyrosinase: polybrene noncovalent complexes in water-ethanol mixtures. // Biotechnol. Bioeng. 2003. V. 84. P. 258 263.

174. Веселовский В.П., Богоявленский И.Ф., Сергеев В.П. Применение димексида в медицине. М: Медицина, 1998. 150 с.

175. Griebenov К., Klibanov A.M. Can conformational changes be responsible for solvent and excipient effects on the catalytic behavior of subtilisin Carlsberg in organic solvents? // Biotechnol. Bioeng. 1997. V. 53. P. 351 362.

176. Грититейн С.В., Кост О.А. Структурно-функциональные особенности мембранных белков. // Успехи биол. химии. 2001. Т. 41. С. 77 104.

177. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина, 1972. Т. 1. С. 40-57.

178. Рогоэюин В.В. Пероксидаза как компонент антиоксидантиой системы живых организмов. СПб.: ГИОРД, 2004. 240 с.

179. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. М.: Высшая школа, 1985. 768 е.

180. Pola A., Michalak K., Burliga A., Motohashi N. Kawase M. Determination of lipid bilayer/water partition coefficient of new phenothiazines using the second derivative of absorption spectra method. // Eur. J. Pharm. Sci. 2004. V. 21. P. 421-427.

181. Gordeliy V.I., Kiselev M.A., Pole A. V, Teixeira J. Lipid membrane structure and interactions in DMSO/water mixture. // Biophys. J. 1998. V. 75. P. 2343 -2351.

182. Рогожина Т.В., Рогожин В.В. Стационарная кинетика индивидуального и совместного окисления фенотиазинов в присутствии пероксидазы хрена. // Электронный журнал "Исследовано в России". 2002. С. 767 — 780.

183. Vazquez A., Tudela J., Varon R., Garcia-Canovas F. Determination of hemoglobin through its peroxidase activity on chlorpromazine. // J. Biochem. Biophys. Meth. 1991. V. 23. P. 45 52.

184. Piette L.H., Bulow G., Yamazaki I. Electron paramagnetic resonance studies of the chlorpromazine free radical formed during enzymic oxidation by peroxidase hydrogen peroxide. // Biochim. Biophys. Acta. 1964. V. 88. P. 120 - 129.

185. Nakano M., Sugoika K., Nakano H., Takyu C., Inaba H. Generation of electronically exited species during enzymatic oxidation of chlorpromazine and related compound. // Biochem. Biophys. Res. Com. 1985. V. 3. P. 952 956.

186. Hemmerich O., Parker V.D. The kinetics and mechanisms of the reactions of cation radicals of phenothiazine derivatives with acetate ion and water in acetonitrile. //Acta Chem. Scand. B. 1983. V. 37. P. 303 -311.

187. Cheng H.Y., Sackett P.H., McCreery R.L. Kinetics of chlorpromazine cation radical decomposition in aqueous buffers. // J. Am. Chem. Soc. 1978. V. 100. P. 962-967.

188. Basavaiah K., Swamy J.M. Titrimetric and spectrophotometry determination of some phenothiazine psychotropics in pure form and in pharmaceutical formulations with metavanadate. // Mikrochim. Acta. 2001. V. 137. P. 75 80.

189. Mohamed A.I. Utility of diphenylamine and 7V-bromosuccinimide for colorimetric determination of certain phenothiazine drugs. // Talanta. 1997. V. 44. P. 1173-1182.

190. Revanasiddappa H.D., Ramappa P.G. Spectrophotometric determinations of some phenothiazine drugs. // Talanta. 1996. V. 43. P. 1291 1296.

191. Eghbal M.A., Tafazoli S., Pennefather P., O'Brien P.J. Peroxidase catalyzed formation of cytotoxic prooxidant phenothiazine free radicals at physiological pl-l. // Chemico-Biological Interactions. 2004. V. 151. P. 43 51.

192. Vandemark F.L., Adams R.F., Schmidt G.J. Tricyclic antidepressants. // Clin. Chem. 1978. V. 24. P. 190-213.

193. Aly F., Alarfaj A., Alwarthan A. Flow-injection chemiluminometric determination of some phenothiazines in dosage forms and biological fluids. // Anal. Chim. Acta. 1998. V. 358. P. 255 262.

194. Madej K., Kala M., Wozniakievicz M. LC and non-aqueous CE determination of phenothiazines in autopsy samples. // Chromatographia. 2005. V. 62. P. 533 -535.

195. Milhaud G., Courtot D. Current techniques and recent advances in veterinary drug analysis with special reference to anthelmintics and tranquilizers. // Vet. Res. Commun. 1983. V. 7. P. 107 112.

196. Яцгширский A.K. Химические реакции в мицеллярных системах. // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. 1987. Т. 4. С. 6 85.

197. UditA.K., Hill M.G., Gray Н.В. Electrochemistry of cytochrome P450 BM3 in sodium dodecyl sulfate films. // Langmuir. 2006. V. 22. P. 10854 10857.

198. Kamau G.N., Guto M.P., Munge В., Panchagnula V., Rusling J.F. Myoglobin coadsorbed on electrodes from microemulsions provides reversible electrochemistry and tunable electrochemical catalysis. // Langmuir. 2003. V. 19. P. 6976 6981.

199. Song Ch., Pehrsson P.E., Zhao W. Recoverable solution reaction of HiPco carbon nanotubes with hydrogen peroxide. // J. Phys. Chem. 2005. V. 109. P. 21634 -21639.

200. Thongngam M., McClements D.J. Characterization of interactions between chitosan and an anionic surfactant. // J. Agrie. Food. Chem. 2004. V. 52. P. 987 -991.

201. Clausse M., Heil J., Zrabda A. Comunicaciones 16 Jornadas Com. Esp. Deterg. Barcelona, 1985. P. 497 543.

202. Tamamushi В., Watanabe N. The formation of molecular aggregation structures in tarnary system AOT/water/isooctane. // Colloid. Polymer. Sci. 1980. V. 258. P. 174- 178.

203. Березин И.В. Действие ферментов в обращенных мицеллах. 39-е Баховс-кое чтение. М.: Наука, 1985. 40с.

204. ЖолиМ. Физическая химия денатурации белков. М.: Мир, 1968 364 с.

205. Wang Z.-F., Huang M.-Q., Zou X.-M., Zhou H.-M. Unfolding, conformational change of active sites and inactivation of creatine kinase in SDS solutions. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1251. P. 109 114.

206. Moosavi-Movahedi A.A., Nazari K., Saboury A.A. Thermodynamics of denaturation of horseradish peroxidase with sodium dodecyl sulphate and dode-cyl trimethylammonium bromide. // Colloids Surf. B. 1997. V.9. P. 123-130.

207. Moosavi-Movahedi A.A., Charmani J., Gharanfoli M., Hakimelahi G.H. Differential scanning calorimetric study of the molten globule state of cytochrome с induced by SDS. // Thermochim. Acta. 2004. V. 409. P. 137 144.

208. Josephy P.D., Eling Т., Mason R.P. Co-oxidation of benzidine by prostaglandin synthase and comparison with the action of horseradish peroxidase. // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 5561 5569.

209. Almeida L.E., Imasato H., Tabak M. Enzymatic oxidation of dipyridamole in homogeneous and micellar solutions in the horseradish hydrogen peroxide system. // Biochim. Biophys. Acta. 2006. V. 1760. P. 216 - 226.

210. Oldfield L.F., Bockris J.O.M. Reversible oxidation-reduction reactions of aromatic amines. //J. Phys. Coll. Chem. 1951. V. 55. P. 1255 1274.

211. Josephy P.D., Eling Т., Mason R.P. The horseradish peroxidase-catalyzed oxidation of 3,3 ',5,5 -tetramethylbenzidine. // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 3669- 3675.

212. Marquez L.A., Dunford H.B. Mechanism of the oxidation of the 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine by myeloperoxidase determined by transient- and steady-state kinetics. //Biochemistry. 1997. V. 36. P. 9349 9355.

213. Уотерс У. Механизм окисления органических соединений. М.: Мир, 1966. 176 с.

214. Долманова И.Ф., Шеховгрва Т.Н., Пешкова В.М Каталитическое определение хрома. //Журн. аиалит. химий. 1972. Т. 27. С. 1981 1985.

215. Kawakubo S., Hagihara Y, Honda Y. Speciation of iron in river and tap waters by catalytic spectrophotometry using oxidation of o-phenylenediamine with hydrogen peroxide. // Anal. Chem. Acta. 1999. V. 388. P. 35-43.

216. Дулькис Ю.К. Рекомбипантная и природная пероксидазы хрена в водной среде и в системе обращенных мицелл: стабильность, регуляция структуры и кинетических параметров. Дис. кан. хим. наук. М.: МГУ, 1997. 146 с.

217. Kon-No К., Kitahara A. Classification of solubilization isotherms of water by oil-soluble surfactants in nonaqueous solutions // J. Colloid. Interface Sci. 1971. V. 35. P. 636-642.

218. Ford T.F., Kaufman S., Nichols O.D. Ultracentrifugal studies of barium dinonylnaphthalenesulfonate benzene systems. I. Sedimentation velocity // J. Phys. Chem. 1966. V. 70. P. 3726 - 3732.

219. Burner U., Obinger C. Transient-state and steady-state kinetics of the oxidation of aliphatic and aromatic thiols by horseradish peroxidase. I I FEBS Letters. 1997. V. 411. P. 269-274.

220. Sariri R., R.H. Sajedi R.H., Jafarian V. Inhibition of horseradish peroxidase activity by thiol type inhibitors. // J. Mol. Liquids. 2006. V. 123. P. 20-23.

221. Попова И.М. Ферментативный метод определения физиологически активных веществ с применением пероксидазы. Дис. кан. хим. наук. М.:МГУ, 1981.232 с.

222. Fridovich I. The stimulation of horseradish peroxidase by nitrogeneous ligands. // J. Biol. Chem. 1963. V. 238. P. 3921 3927.

223. Угарова H.H., Лебедева О.В., Куршина Т.А., Березии И.В. Влияние нуклеофилов на кинетику реакций окисления, катализируемых пероксидазой. //Биохимия. 1977. Т. 42. С. 1577 1584.

224. Лебедева О.В., Домбровский В.А., Угарова Н.Н., Березин И.В. Кинетика и механизм действия нуклеофилов на реакцию окисления о-дианизидипа, катализируемую пероксидазой из корней хрена. // Биохимия. 1978. Т. 43. С. 1024- 1033.

225. Gudogan-Paul М., Celebi S.S., Ozyoruk Н., Yildiz A. Amperometric enzyme electrode for organic peroxide determination prepared from horseradish peroxidase immobilized in poly(vinylferrocenium) film. // Biosens. Bioelectron. 2002. V. 17. P. 875 -881.

226. Wang J., Lin Y., Chen L. Organic-phase biosensors for monitoring phenol and hydrogen peroxide in pharmaceutical antibacterial products. // Analyst. 1993. V. 118. P. 277-280.

227. Wang J., Freiha В., Naswr N., Romero E.G., Wollenberger U., Ozsoz M. Amperometric biosensing of organic peroxides with peroxidase-modified electrodes. //Anal. Chim. Acta. 1991. V. 254. P. 81 88.

228. Mailer R., Beckingham C. Testing olive oil quality: chemical and sensory methods. // Premefact. 2006. V. 231. P. 1 5.

229. Seller R.M. Spectrophotometric determination of hydrogen peroxide using potassium titanium(IV) oxalate // Analyst. 1980. V. 105. P. 950 954.

230. European official method. // Official Gazette of European Community L 248. 1991. 15th September.

231. Campanella L., Favero G., Pastorino M., Tamassetti M. Monitoring the rancidification process in olive oils using a biosensor operation in organic solvents. Il Biosens. Bioelectron. 1999. V. 14. P. 179 186.