Пероксидазные и холинэстеразные сенсоры на основе модифицированных графитовых электродов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

СУПРУН ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ПЕРОКСИДАЗНЫЕ И ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫЕ СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ГРАФИТОВЫХ ЭЛЕКТРОДОВ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Казань - 2004

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Казанский государственный университет им.В.И.Ульянова-Ленина" Министерства образования и науки Российской Федерации

/

Научный руководитель: доктор химических наук

Евтюгин Геннадий Артурович

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Евгеньев Михаил Иванович

(Казанский государственный технологический университет)

доктор химических наук,

ст.н.с. Карякин Аркадий Аркадьевич

(Московский государственный университет им.М.В.Ломоносова, химический факультет)

Ведущая организация: .. Научно-исследовательский институт безопасности жизнедеятельности Республики Башкортостан (г.Уфа)

Защита диссертации состоится 9 декабря 2004 г. в 14 ч. на заседании диссертационного совета К 212.081.04 при Казанском государственном университете по адресу: г.Казань, ул.Кремлевская, 18, Химический институт им.А.М.Бутлерова, Бутлеровская аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного университета

Отзывы на автореферат просим присылать по адресу: 420008, г.Казань, ул.Кремлевская, 18, КГУ, Научная часть.

£

Автореферат разослан " У " ноября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Л.Г.Шайдарова

49286

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ*' Актуальность работы. Применение ферментов с целью идентификации и количественного определения биологически активных соединений позволяет достичь уникальной селективности и чувствительности их определения, в том числе, с использованием стандартной измерительной аппаратуры и по месту пробоотбора. Недостатки применения ферментов в рутинном анализе - низкая устойчивость при .хранении и высокая стоимость - могут быть компенсированы путем их иммобилизации на, нерастворимых носителях. При этом особое значение приобретает способ введения иммобилизованного фермента в состав специализированного аналитического устройства - биосенсора, поскольку именно характеристики контакта биокомпбнента и преобразователя определяют способ регистрации сигнала и его селективность. Это особенно важно при проведении измерений в матрицах сложного состава, в присутствии электрохимически активных примесей, органических растворителей и т.д.

В этой связи актуальным является исследование новых способов модификации графитовых электродов, отличающихся разнообразием сйойств'.' простотой введения дополнительйыХ!компонентов в состав электроДйОгЬ вещества и воспроизводимостью характеристик при массовом производстве с использованием технологий струйной печати (напыления) и микролитографии.

Целью настоящей работы явилось создание амперометрических перок-сидаддах и ходинэстеразных сенсоров на основе модифицированных графитовых электродов и установление влияния модификаторов на операционные и аналитических характеристики определения субстратов и ингибиторов ферментов. Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи: разработать методы модификации графитовых тонко- и толстопленочных электродов нафионом, полианилином, политирамином, в том числе путем электрополимеризации, производными каликс[4]резорциноларенов и антителами против нонилфенола и цефтазидима; установить характер влияния ; модификаторов в соответствии с механизмом их действия; - выбрать урлодая-иммобилизации пероксидазы и холинэстеразы, обеспечивающие наиболее устойчивый воспроизводимый сигнал и высокую чувствительность определения их субстратов (пероксидаза) и ингибиторов (хо-линэстераза);

•> Научным консультантом работы является завкафедрой аналитической химии Казанского государственного университета, д.х.н., проф. Будников Герман Ко» стантинович

изучить влияние гетерогенных медиаторов электронного переноса (полианилин, берлинская лазурь) на условия регистрации сигнала и аналитические характеристики пероксидазных и холинэстеразных сенсоров; установить возможность повышения чувствительности определения и расширения круга определяемых соединений (цефтазидим, нонилфенол) с помощью пероксидазных сенсоров и модификаторов, обеспечивающих накопление субстратов на поверхности электрода;

разработать чувствительные методы определения субстратов пероксидазы и ингибиторов холинэсгеразы с применением модификаторов различного механизма действия.

Научная новизна работы заключаются в том, что:

предложены подходы к модификации пленарных графитовых электродов, позволяющие решать задачи стабилизации ферментов (нафион, политира-мин), снижения рабочего потенциала измерения сигнала (нафион, берлинская лазурь, полианилин) и улучшения аналитических характеристик определения субстратов за счет их селективного накопления на электроде; показана возможность использования берлинской лазури для снижения потенциала окисления тиохолина и регистрации сигнала холинэстеразного сенсора, установлено влияние медиатора и состава иммобилизационной смеси на характеристики определения фосфорорганических и карбаминат-ных пестицидов;

изучено влияние комплексов "гость-хозяин" с участием промазина и хло-ропромазина и каликс[4]резорциноларенов на характеристики их прямого и пероксидазного окисления на электродах, модифицированных полианилином;

предложено использовать совместную иммобилизацию пероксидазы и антител против низкомолекулярных соединений - гаптенов - для регистрации иммунологических взаимодействий на поверхности сенсора по изменению скорости пероксидазного окисления гидрохинона и метиленового синего.

Практическая значимость работы состоит в том, что: - предложены простые и удобные в использовании способы модификации электродов путем электрополимеризации анилина и тирамина с последующей иммобилизацией ферментов и включением дополнительных модификаторов за счет электростатических взаимодействий, физической сорбции и кросс-сшивки глутаровым альдегидом;

разработаны методы определения остаточных количеств пестицидов анти-холинэстеразного действия в зерне; предложено использовать холинэсте-

разный"' сенсор для контроля разложения фосфорорганических и карбаминатных пестицидов при брожении виноградного сока;

- .разработан биферментный сенсор с пероксидазой и холинзстеразой, иммобилизованными аа одном графитовом электроде, модифицированном полиптер амином, для-определения субстратов пероксидазы и ингибиторов холи-нэстеразы.

На защиту выносятся: ,. f

- . результаты изучения влияния нафиона и политиралшна на стабильность и . чувствительность сигнала пероксидазного и холинэстеразного сенсоров

при определении субстратов и ингибиторов ферментов и вывод о стабилизирующем влиянии модификаторов при хранении и использовании биосенсоров;

характеристика влияния компонентов поверхностного слоя (низкомолекулярные модификаторы, глутаровый альдегид, альбумин, нафион) и выбор состава иммобилизационной смеси и условий иммобилизации, обеспечивающих оптимальное сочетание стабильности сигнала и чувствительности определения ароматических субстратов перок'Сйдазы и 'фосфорорганических и карбаминатных пестицидов - ингибиторов холииэстеразы; новый способ регистрации сигаалайолинастёразного сенсора при модификации печатного графитового электрода берлинской лазурью и результаты определения с его помощью ингибиторов холинэстеразы; влияние условий пробоподготовки и проведения измерения на чувствительность определения фосфорганических и карбаминатных пестицидов в зерне и виноградном соке в.процессе брржения и вывод о возможности применения холинэстеразных сенсоров для контроля качества сельскохозяйственной продукции;

влияние модификаторов на аналитические характеристики определения ароматических субстратов пероксидаз с помощью моно- и биферментного сенсора на основе модифицированных преобразователей сигнала, в том числе в присутствии специфических антител и комплексообразователей, и вывод о характере влияния структуры субстрата и механизме действия модификаторов на чувствительность и селективность их определения; Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Всероссийском симпозиуме "Тест-методы химического анализа" (Москва, 2001), Поволжской конференции по аналитической химии (Казань, 2001), Всероссийской конферёнции "Актуальные проблемы аналитической химии" (Москва, 2002 г.),

12 Международной конференции по аналитической химии EUROANALYSIS 12

is * f

(Дортмунд, Германия, 2002), Научной конференции молодых ученых, аспиран-

тов и студентов Научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2003), 17 Международном симпозиуме по биоэлекгрохимии (Флоренция, Италия, 2003), 8 Международном симпозиуме по кинетическим методам анализа КАС-2004 (Рим, Италия, 2004), Всероссийской конференции по аналитической химии "Аналитика России - 2004 (Москва, 2004).

Основные результаты изложены в 4 статьях и 9 тезисах докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 170 страницах машинописного текста, включает 50 рисунка и 10 таблиц. Состоит из введения, 4 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 248 ссылок на отечественные и зарубежные работы.

Диссертация выполнена при поддержке РФФИ (грант № 97-03-33210 "Разработка тестовых методов определения ингибиторов гидролитических ферментов с помощью электрохимических биосенсоров" и № 00-03-32605 "Разработка электрохимических биосенсоров на основе планарных модифицированных электродов для диагностики загрязнения окружающей среды"), научно-образовательной программы CRDF и Минобразнауки РФ (НОЦ КГУ "Материалы и технологии XXI века" REC-007), ИНТАС (грант 00-273 "Создание химических и биохимических сенсоров для контроля продукции виноделия"), программы поддержки научных обменов НАТО (грант PST.CLG.979178).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Литературный обзор

Изложены и систематизированы способы иммобилизации пероксидазы и холинэстеразы, методы определения субстратов и ингибиторов пероксидазы с помощью биосенсоров на основе иммобилизованного фермента. Рассмотрено влияние способа иммобилизации ферментов и регистрации сигнала на аналитические характеристики биосенсоров.

Экспериментальная часть

Использовали бутирилхолинэстеразу (БуХЭ) из сыворотки крови лошади (КФ 3.1.1.8), 610 и 260 Е/мг твердого вещества, ацетилхолинстеразу (АХЭ) из электрического угря (Кф 3.1.1.7), 244 Е/мг производства "Sigma", и пероксидазу из хрена (КФ 1.11.1.7), "Sigma", 250 Е/мг, и "Vitact", 360 IU / мг. Субстратами АХЭ служили ацетилтиохолин хлорид и иодид (АТХХ и АТХИ, "Sigma"), субстратами БуХЭ - АТХХ и бутирилтиохолин иодид (БуТХИ, "Sigma"). Органиче-

скими субстратами пероксидазы служили гидрохинон, 2-амино-4-нитрофенол, п-метоксианилин, анилин, 3,4- дихлорфенол, о-, м-, и и-нитроаншшн, л-хлор-анилин, о- и и-аминопиридин, мэтиленовый синий, промазин и хлоропромазин.

В качестве модельных ингибиторов АХЭ и БуХЭ использовали алдикарб, метаокарб, паратион-метил, хлорпирифос-метил, кумафос ("Riedel-de-Haen", Seelze, Германия) и параоксон ("Sigma").

Антитела против нонилфенола были предоставлены для исследований завлабораторией иммунохимических методов анализа С.А.Ереминым (Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова), против цефтазидима -завлабораторией иммунохимии Школы медицины и фармации Университета г. Сандерленд, Великобритания, проф.Ф.Ровеллом (F.Rowell).

Замещенные каликс[4]резорциноларены были синтезированы в лаборатории супрамолекулярной химии Института органической и физической химии имА.Е.Арбузова КНЦ РАН и предоставлены для исследования д.х.н. Э.Х.Казаковой.

Амперометрические измерения проводили в трехэлектродной ячейке с хлорсеребряным электродом сравнения в режиме линейной и циклической развертки потенциала ("Экотест-ВА", "Эконикс-Эксперт", Москва), а также при постоянном потенциале на вольтймперографах EcoChemie, BAS и ИВА. Для создания ферментных сенсоров использовали толстопленочные эпоксиграфитовые электроды (НПВП "ИВА", Екатеринбург) и тонкопленочные печатные графитовые электроды, изготовленные в университете "Tor Vergata" (Рим, Италия), Центре фитофармации университета г.Перпиньян (Франция) и лаборатории электрохимии UMR-CNR,S 6006 университета г. Нант (Франция) и НПВП "ИВА" (Екатеринбург).

При изучении комплексообразования с участием каликсрезорциноларенов и определении промазина и хлоропромазина с помощью пероксидазного сенсора использовали' проточно-инжекционную систему, состоящую из насоса Ismatec и шестиканального клапана Rheodyne с инжекционной петлей на 100 мкл.

Операционные параметры холинэстеразных сенсоров на основе

• модифицированных пленарных электродов

В качестве сигнала холинэстеразных сенсоров измеряли ток прямого или медиаторного окисления тиохолина, образующегося в реакции ферментативного гидролиза ацетил- или бутирилхолина (1).

(СН3)ХСН2СН28С(0)С3Н7 + Н20 ->(СН3)зН+СН2СН28Н + С3Н,СООН (СН3)3М+СН2СН2ЗН - е* - Н* (СНз^СНгСН^' -> димер

Модификация нафионом. Как было показано, нанесение на графитовый электрод слоя нафиона не только снижает скорость деградации электродного вещества, но и снижает рабочий потенциал окисления тиохолина на 200-250 мВ. Это позволяет исключить параллельное окисление иодид-иона и повысить точность измерения сигнала биосенсора. Изучено влияние способа модификации и продолжительности кросс-сшивки глутаровым альдегидом на характеристики сигнала (рис.1). Присутствие нафиона приводит к некоторому снижению сигнала по сравнению с ^модифицированным сенсором, в то же время, увеличивается его стабильность и время жизни сенсора.

Рисунок 1. Влияние объема 0.5% суспензии нафиона, наносимой на электрод, (1) и продолжительности кросс-сшивки БуХЭ парами глутарового альдегида (2) на сигнал биосенсора на 0.1 мМ БуТХИ

Аналитические характеристики определения пестицидов с помощью хо-. линэстеразного сенсора приведены в табл.1. Для контроля загрязнения пестицидами зерна и сельскохозяйственной продукции предложено проводить экстракцию остаточных количеств пестицидов ацетонитрилом с последующим инкубированием сенсора в разбавленном экстракте без удаления растворителя. Компоненты растительной матрицы уменьшают чувствительность определения пестицидов на 10-20% (рис,2), Холинэстеразный сенсор позволяет проводить определение 0.1-0.5 мг/кг кумафоса, 5-45 мг/кг хлорпирифос-метила и 15-50 мг/кг ме-тиокарба.

Таблица 1. Определение пестицидов с помощью холинэстеразного сенсора на основе печатного графитового электрода, модифицированного нафионом

Пестицид 1,% = а + bx(Ci, мкМ) мкМ Диапазон определяемых концентраций, мкМ

а- b i2

Кумафос -3±1 295±5 0.9982 0.04 0.08-,0.25

Хлорпирифос-метил 1.3±1.1 5.2±0.2 0.9935 1.0 2.0-14.5

Метиокарб -24±12 64.5±7.0 0.9563 0.2 0.8-2.0

Рисунок 2. Определение метиокарба в экстракте из риса и смеси ацетонитрил- вода 1:10

Модификация берлинской лазурью*'. Для более значительного снижения

рабочего потенциала "измеренйя сигнала холинэстеразного сенсора предложено модифицировав' графитовый1 электрод ферроцианидом железа (III) (берлинской лазурью, BJij, медиатором окисления тиохолина (2).

БЛеоо + RSSR + 2Н+

БЛрк + 2RSH

(2)

БЛв0С-2е-БЛ0К участие медиатора в окислении тиола подтверждается характерными изменениями вольтамперогр^мм при внесении в раствор эфиров тиохолина (рис.3). Зависимость сигнала от концентрации субстрата при различных количествах А$Э, взятых; для иммобилизации, приведены на рис.4.

Введение альбумина в состав смеси для иммобилизации, а также дополнительное покрытие электрода нафионом до введения фермента увеличивают и стабилизируют сигнал, особенно в области малых активностей АХЭ.

Исследования проводили в лаборатории биосенсоров университета "Тог Vergata" (зав.лаб. проф.Дж.Паллески (G.Palleschi))

% 2

-0.2

0.0

0.2

0.4 Е,В

| 150 100 50

2 3

[АТХИ], мМ

Рисунок 3. Вольтамперо-грамма, полученная с помощью АХЭ/БЛ сенсора до (1) и через 3 мин. после введения 1.5 мМ АТТХ (2)

Рисунок 4. Зависимость тока окисления от концентрации АТХИ. Для иммобилизации использовали смесь 0.1% альбумина, 1%глутарового альдегида, 0.1% нафиона и 0.02 Е/мкл (а), 0.05 Е/мкл (б), 0.1 Е/мкл (в) и 0.2 Е/мкл (г) АХЭ

Разработанные биосенсоры отличаются очень быстрым откликом - 90% изменения тока происходит в течение 7-8 с, стабилизация сигнала - менее чем за три минуты. Результаты определения пестицидов антихолинэстеразного действия с помощью биосенсора на основе электрода, модифицированного берлинской лазурыо, приведены в табл.2. Биосенсор был использован для контроля процесса распада пестицидов в процессе ферментации виноградного сока. Как оказалось, остаточные количества пестицидов обнаруживаются в сусле в течение 3-4 дней ферментации (рис.5), что согласуется с результатами хроматографиче-ского определения.

Разработанные холинэстеразные сенсоры выгодно отличаются от описанных в литературе низкими рабочими потенциалами измерения сигнала и быстрым откликом, не уступая по чувствительности определения пестицидов антихолинэстеразного действия. Возможно их применение в качестве средства предварительного контроля зерна и виноградного сока на остаточное содержание фосфорорганических и карбаминатных пестицидов.

Таблица 2. Определение пестицидов с помощью ацетилхолинэстеразного сенсора основе печатного графитового электрода, модифицированного берлинской лазурью (инкубирование 10 мин.)

Пестицид I,% = a + bxlg(CbM) cl « Диапазон определяемых концентраций, нМ

а Ъ г2

Алдикарб 62б±б1 94±10 0.9835 160 200-2000

Параоксон 52б±13 70±2 0.9989 40 50-630

Паратион-метил 1054±42 137±7 0.9973 20 25-100

Рисунок 5. Динамика деградации параоксона и алдикарба в белом виноградном соке в процессе его ферментации. Инкубирование 10 мин.

Пероксидазные сенсоры на основе модифицированных графитовых электродов

Пероксидазные сенсоры готовили, иммобилизуя фермент кросс-сшивкой глутаровым альдегидом совместно с желатином. Условия иммобилизации определяли, используя в качестве органического субстрата гидрохинон (рис.б). Максимальный и стабильный сигнал сенсора достигался в фосфатном буферном растворе при pH 5.5. Иммобилизованный фермент сохранял активность в течение полутора-двух месяцев при хранении в сухом виде при 4°С.

В координатах Лайнуивера-Берка зависимость сигнала от концентрации гидрохинона линейна, а значение константы Михаэлиса (6.4 мМ) удовлетворительно совпадает с параметром нативного фермента, определенным в тех же условиях. Это; свидетельствует об отсутствии значительных диффузионных ограничений взаимодействия фермента и субстратов.

Пероксидаза, миг рН

Рисунок б. Зависимость сигнала пероксидазного сенсора от количества перокси-дазы, взятой для иммобилизации, и рН фосфатного буферного раствора (гидрохинон 1.0 мМ, пероксид водорода 3.0 мМ)

Пероксидазный сенсор позволяет определять также замещенные анилины, фенолы и некоторые гетероциклические соединения в милли- и микромолярном диапазоне из концентраций (рис.7). Сигналом служил ток восстановления продуктов пероксидазного окисления, регистрируемый в том же диапазоне потенциалов, что и ток восстановления бензохинона. Предел обнаружения ароматических субстратов (3.3-60 мкМ) меняется симбатно с расчетным значением константы Михаэлиса. Чувствительность определения снижается при переходе от о-и «-изомеров к .«-замещенным анилинам. Наименьшая чувствительность определения с помощью пероксидазного сенсора достигнута для л<-нитроаналина, наибольшая - для и-метоксианилина и 2-амино-4-нитрофенола.

—в— м-нитроанилин —о— п-нитроанилин —л— о-нитроанилин

0.0 0.2

0.4

0.6 0.8 С, мМ

-а— п-хлоранилин —д— м-толуидин —в— 4-аминопиридин —о— 2-амино-4-нитрофонол

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 С, мМ

Рисунок 7. Зависимость сигнала пероксидазного сенсора от концентрации ароматических субстратов. Пероксид водорода 3.0 мМ. Фосфатный буферный

раствор, рН 5.5

Наклон градуировочной зависимости не коррелирует с величиной максимального тока насыщения, который для «аро-замещенных ароматических соединений значительно (иногда в несколько раз) выше. Для других соединений предельные значения тока, соответствующие насыщению поверхностного слоя субстратом, совпадают. По-видимому, это связано с образованием электрохимически активных димеров (олигомеров), активность которых на электроде превышает активность исходных соединений.

При совместном присутствии двух субстратов наблюдается аддитивность сложения сигналов, отвечающих отдельным субстратам. Однако, в узком диапазоне концентраций иногда наблюдались максимумы тока. Более активный компонент синергически ускорял окисление менее активного (рис.8).

Реконструкция сигнала путем интерполяции экспериментальных значений в программе Surfer показала, что максимумы проявляются при кратных соотношениях концентраций субстратов, что, возможно, связано с ростом длины оли-гомерных продуктов окисления, проявляющих свойства медиаторов электронного переноса.

Биферментный сенсор па основе электрода, модифицированного по-литирамином. Учитывая потенциальное применение холинэстеразных и перок-сидазных сенсоров для контроля определенных групп загрязнителей сточных вод, представляло интерес совместить на одном электроде оба фермента. С этой целью нами был разработан способ модификации электрода новой матрицей -политирамином (3), содержащим свободные аминогруппы в боковой цепи заместителей. Полимер получали электрохимически при многократном циклиро-вании потенциала электрода в растворе тирамина в слабокислой среде. После

Рисунок 8. Моделирование сигнала пе-роксидазного сенсора в смеси и- и о-

нитроанилина по 50 экспериментальным значениям отклика. Программа Surfer.

J3

этого его обрабатывали глутаровым альдегидом и последовательно наносили фермента.

Контроль характеристик покрытия осуществлялся путем подбора скорости развертки потенциала и количества циклов. Обратимость электродных реакций и вклад диффузионного торможения переноса вещества на границе электрод/полимер/раствор контролировали по току окисления гидрохинона.

Полученный сенсор позволял проводить определение субстратов и эффекторов пероксидазы и холинэстеразы, при этом выходной сигнал не зависел от последовательности измерений и их числа. Таким образом, пероксидаза и холи-нэстераза в поверхностном слое не влияли друг на друга, и выбор отклика проводили путем наложения соответствующего потенциала и введения в раствор того или иного субстрата.

Чтобы уменьшить погрешность измерения, связанную с необходимостью корректировать рН раствора, не совпадающего для указанных ферментов, сигнал биферментного сенсора измеряли при компромиссном значении рН 7.0, когда активность обоих иммобилизованных ферментов была достаточна для надежного измерения отклика.

Нанесение на электрод политирамина стабилизировало активность ферментов, особенно по сравнению с немодифицированным моноферментным пе-роксидазным сенсором (рис.9).

В то же время, покрытие политирамина несколько снижало рабочие токи и перечень определяемых субстратов пероксидазы по сравнению с моноферментным сенсором. Так, не было обнаружено сигналов пероксидазного окисления анилина, и-хлоранилина, и-аминопиридина и л-нитроанилина. Заметно возросли пределы обнаружения других субстратов, снизились наклоны градуиро-вочных зависимостей (рис.10).

Чувствительность биферментного сенсора к ингибиторам БуХЭ оказалась несколько ниже, чем для нативного фермента и моноферментного сенсора. Для кумафоса и хлорпирифос-метила степень ингибирования 1,%, БуХЭ линейно зависит от логарифма концентрации (4), диапазон определяемых концентраций достаточно узок: 0.2-0.8 мкМ для кумафоса и 0.07-3.0 мкМ для хлорпирифос-метила.

он

(3)

116 12 8 4 О

О 10 20 30 40 Продолжительность хранения, дни

0.15 0.10 0.05

0.00........

0 5 10 15 20 25 30

Продолжительность хранения, дни

Рисунок 9. Изменение сигнала биферментаого сенсора при его хранении в фосфатном буферном растворе. Измерение активности пероксидазы; гидрохинон 1.0 мМ, пероксид водорода 1.0 мМ; измерение активности БуХЭ: АТХХ 3.0 мМ.

^ 25-, = 20 15 10 5 0-!

п-метоксианилин

метиленовый синий

Рисунок 10. Зависимость сигнала биферментаого сенсора от концентрации субстратов пероксидазы. Пероксид водорода 1.0 мМ.

(4)

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

[Субстрат], мМ

Кумафос: 1,% = 349±17 + (53±3)х^ (С,, М), г = 0.9939, п = б Хлорпирифос-метил: 1,% = (242±13)+(31±2)х^(Сь М), г = 0.9917, п= б

Тем не менее, несмотря на некоторую потерю чувствительности определения субстратов и ингибиторов ферментов, использование политирамина в качестве матрицы для иммобилизации ферментов показало ряд преимуществ: высокую технологичность нанесения и возможность осаждения полимера из среды, не снижающей ферментативную активность; достижение высокой стабильности иммобилизованных ферментов: при хранении; использование единого формата измерения активности различных ферментов, иммобилизованных на едином носителе при отсутствии взаимного влияния условий измерения и эффектов "памяти" при смене субстрата.

Определение промазина и хлоропромазинаР К числу субстратов перок-сидазы относятся производные фенотиазина, в том числе лекарственные препараты промазин и хлоропромазин (5). Они необратимо окисляются на графитовых электродах в области +600 мВ.

а л. ^

^ 1 /СНз " (5) СНг-СНг-СНг-мС, НС1 СН2-СН2-СН2-пЧ^ НС1

СНд _ СН3

Хлоропромазин гидрохлорид Промазин гидрохлорид

Для снижения рабочего потенциала сенсора было предложено модифицировать электрод полианилином, получаемым на поверхности путем многократного циклирования потенциала в 0.2 М серной кислоте. На модифицированном электроде удалось снизить рабочие потенциалы до +400 мВ. Пределы обнаружения промазина и хлорпромазина составили 3-5 мкМ, ур.(б). Промазин: ¡, мкА = (0.10±0.03) + (2.12±0.08)х(С, мМ) Я = 0.9959, п=8 Хлоропромазин: ¡, мкА= (0.07±0.02)+(1.63±0.06)х(С, мМ) Я = 0.9964, п=8 ^

На пероксидазном сенсоре на основе электрода, модифицированного полианилином, регистрировали токи восстановления продуктов ферментативного окисления промазина и хлоропромазина. Для повышения чувствительности определения были изучены производные каликс[4]резорциноларена (7), образующие с изученными соединениями комплекс "гость-хозяин".

°Ма°033 ^аЪзБ. О О

м []

КО «1 И=СН3,КЗ К=С5Н11,К4

Добавление каликс[4]резорциноларенов в раствор снижало сигнал перок-сидазного окисления хлоропромазина (рис.11). Введение каликсаренов в состав поверхностного слоя не привело к заметному увеличению аналитического сигнала. Но комплексообразование проявляется при регистрации медиаторного переноса электрона на пероксидазу. Биокаталитический ток на электроде, модифицированном полианилином и каликсареном, наблюдается при введении в раствор пероксида водорода в отсутствие органических субстратов при 0.0 В.

* Исследование частично проводили в лаборатории электрохимии университета г.Нант, Франция (зав.лабораторией др.М.Буйтита (М.Вщ'Ша))

■ 75-

25

50

1

Рисунок 11. Влияние каликс[4] резорциноларенов К.1 (1), КЗ (2) и К4 (3) на сигнал пероксидаз-ного сенсора на основе пленарного эпоксиграфитового электрода. Хлоропромазин 0.7 мМ, Н2021.0 мМ

0+0.01

0.1

1

[К], мМ

Если элеклрод инкубировать 10 мин в растворе промазина или хлоропро-мазина, наблюдается увеличение сигнала, особенно заметное в области малых концентраций пероксида водорода. По-видимому, влияние фенотиазинов можно отнести к их включению в медиаторный перенос электрона с активного центра фермента на электрод, протекающий в слое полианилина.

Иммуносенсоры с пероксидазной индикаторной реакцией. Чувствительность сигнала пероксидазного сенсора к поверхностным процессам позволила предложить вариант иммуносенсора, не требующий конъюгации определяемого компонента с индикаторным ферментом. Для этого проводили совместную иммобилизацию пероксидазы и специфических антител и регистрировали активность фермента (сигнал на специфический субстрат) как меру концентрации иммунореагента, присутствующего в растворе.

На рис.12, представлена зависимость сигнала иммуносенсора от концентрации цефтазидима и его аналога - цефиксима. В наномолярном диапазоне концентраций наблюдается прогрессирующее снижение сигнала пероксидазного окисления гидрохинона. По-видимому, комплекс антиген-антитело замедляет ферментативный процесс за счет стерического блокирования иммобилизованного фермента либо в результате аллостерической регуляции его активности.

Иммуносенсор позволяет проводить определение цефтазидима в диапазоне его концентраций от 0.3 до 1 нМ. Для аналога цефтазидима - цефиксима -уменьшение сигнала имуносенсора происходит при концентрациях гаптена, 1001000 раз превосходящих концентрации цефтазидима. Еще выше действующие концентрации сульфонамидных препаратов. При включении в состав поверхностного слоя антител против нонилфенола использование гидрохинона в качестве субстрата ферментативной реакции оказалось невозможным. По-видимому, за счет взаимодействия с антителами происходило увеличение сигнала иммуносенсора в серии повторных измерений из одного раствора субстрата.

о 10л

10"2 Ю-' 10° 101

Рисунок 12. Определение цефтазидима с помощью иммуносенсора, на основе антител против цефтазидима. Пунктиром обозначен сигнал иммуносенсора на цефиксим

10* ю1

[Ад],ИМ

Среди других потенциальных субстратов пероксидазы был выбран мега-леновый синий. Зависимость тока его восстановления окисленной формы мети-ленового синего от концентрации нонилфенола имеет сигмоидный вид (¡5ис.13).

Рисунок 13. Влияние нонилфенола на сигнал иммуносенсора на основе антител против нонилфенола и перок-сидазной индикаторной реакции. Метиленовый синий 2.0 мкМ

Линейный участок кривой отвечает диапазону концентраций ¡хЮ'^х^"4 М. Чувствительность определения нонилфенола с помощью иммуносенсора с пероксидазной индикаторной реакцией согласуется с аналитическими характеристиками других вариантов иммуноанализа, в том числе с использованием аналогичных антител. Таким образом, предлагаемый способ регистрации иммунных взаимодействий носит универсальный характер и может быть использован в сочетании с антителами к различным гаптенам.

ВЫВОДЫ

1. Обосновано использование модификации графитовых электродов как способа улучшения операционных и аналитических характеристик ферментных сенсоров на основе пероксидазы и холинэстеразы для определения специфических субстра-

[Нонилфенол], мкМ

тов и ингибиторов. Установлено влияние условий иммобилизации и состава им-мобилизационной среды на сигнал биосенсоров и их устойчивость при хранении и эксплуатации.

2. Покрытие электродой нафионом и политирамином, а также включение в состав поверхностного слоя альбумина увеличивают время жизни и воспроизводимость сигнала ферментных сенсоров, в том числе при хранении в сухом виде и при иммобилизации ферментов на едином носителе. Разработанные сенсоры могут быть использованы дяя определения окисляющихся ароматических соединений, фос-форорганических и карбаминатных пестицидов в микро- и наномолярном диапазоне концентраций, соответственно.

3. Предложен новый способ регистрации сигнала холинэстеразного сенсора при модификации печатного графитового элеюрода берлинской лазурью, отличающийся низким рабочим напряжением измерения сигнала, быстрым и устойчивым откликом и высокой чувствительностью в отношении ингибиторов фермента.

4. Разработаны методики определения остаточных количеств пестицидов антихо-линэстеразного действия в растительной продукции, а также контроля разложения пестицидов в процессе сбраживания виноградного сока.

5. Изучение влияния полианилина и каликс[4]резорциноларенов на окисление промазина и хлоропромазина на модифицированном полимером электроде и пе-роксидазном сенсоре выявило вклад образования комплексов "гость-хозяин" в процесс медиаторного переноса электрона и формирование аналитического сигнала. Разработан -метод определения указанных препаратов с пределами обнаружения 3 и 5 мкМ, соответственно.

6. Совместная иммобилизация пероксидазы и специфических антител против цеф-тазидима и нонилфенола позволяет регистрировать иммунные реакции на поверхности сенсора за счет изменений аллостерической регуляции активности фермента или стерического контроля доступа субстрата к ферменту. Пределы обнаружения цефтазидима и нонилфенола составили 0.1 нМ и 1 мкМ, соответственно. Оценена селективность сигнала иммуносенсора на цефтазидим в присутствии антибиотиков сульфонамидного и цефаллоспоринового ряда.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Габсабирова P.P. Экспресс-оценка органического загрязнения с помощью пе-роксидазного сенсора / Р.Р.Габсабирова, Е.В.Супрун, Г.А.Евтюгин, Г.К. Будни-ков //Поволжская конференция по аналитической химии. Тез.докл. Казань, 20-22 ноября 2001 г. С.58.

2, Будников Г.К. Обобщенная оценка загрязнения сточных вод на основе перок-сидазных и холинэстеразных одноразовых сенсоров / Г.К.Будников, Е.В.Супрун,

Р.Р.Габсабирова, Г.А-Евтюгин, Ж.-Л.Марти, В.Г:Винтер //Всероссийский симпозиум "Тест-методы химического анализа". Москва, 28-30 ноября 2001 г. С64.

3. Гоголь Э.В. Определение остаточных количеств пестицидов в растительном материале с помощью пленарных холинэстеразных сенсоров, модифицированных нафионом / Э.В.Гоголь, Г.А.Евтюгин, Е.В.Супрун, Г.К.Будников, В.Г.Винтер // Журн.аналит.химии. 2001.- ТЙё, № 10.- С. 1097-1105.

4. Евтюгин Г.А. Одноразовые амперометрй'ческие биосенсоры в эколого-аналитическом контроле / Евтюгин Г.А:, Будников Г.К., Иванов А.Н., Супрун

E.В // Микросистемная техника. 2001. №7.- С.56-59.

5. Супрун Е.В. Оценка загрязнения сточных вод с помощью комбинированных ферментных сенсоров на основе печатных углеродных электродов / Е.В.Супрун, Р.Р.Габсабирова, Г.А.Евтюгин, Г.К.Будников //Всерос. конф. "Актуальные про-' блемы аналитической химии". Москва,<1145 марта 2002 г. М. Т.2. С.168-169.

6. Suprun E.V. Bi-enzyme amperometric sensors for the monitoring of environmental pollution/E.V.Suprun, R.R.Gabsabirova, G.A-Evtugyn, H-.C.Budnikov// Euroanalysis 12. Dortmund Sept.8-13.2002. Book of Abstracts. P. 308.

7. Стойкова E.E. ДНК-сенсоры с электрохимически активными индикаторами -производньми фенотиазина / Стойкова Ё.Е., Гольдфарб О.Э., Белякова С.В., Евтюгин Г.А., Будников Г.К., Супрун Е.В. //Вестник ТО РЭА.- 2003.- Т.З.- С.51-55.

8. Супрун Е. В. Пероксидазные сенсоры на основе модифицированных графитовых материалов / Е. В. Супрун, О. Э. Гольдфарб, С. В. Белякова, Р. Р. Габсаби-рова // III Научн.конф. мол. ученых, аспирантов и студентов НОЦ КГУ "Материалы и технологии XXI века. Тез.докл. Казань, 14-15 февраля 2003 г. С.83.

9. Budnikov Н.С. Phenothiazine derivatives'as electrochemical indicators for DNA sensors /H.C.Budnikov, O.E.Goldfarb, S.V.Beljakova, G.A.Evtugyn, E.V.Suprun, A.V.Porfirieva, V.G.Vinter //17 Intern. Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics. Florence, Italy, June 19-24,2003.- P.198.

10. Suprun E.V. Two-enzyme sensors based on screen-printed carbon electrodes covered with electropolymerised tyramine / E.V.Suprun, H.C.Budnikov, G.A.Evtugyn // 7 Intern: Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics. Florence, Italy, June 19-24,2003. P.199.

11. Suprun E.V. Bi-enzyme sensor based on thick-film carbon electrode modified with electropolymerized tyramine / E.V.Suprun; H.C.Budnikov, G.A.Evtugyn, Kh.Z.Brainina // Bioelectrochemistry.- 2,004.- V.63.- P.281-284.

12. Suprun E. Prussian Blue modified acetylcholinesterase sensor for the detection of organphosphorus and carbamate pesticides '/ E.Suprun, G.Evtugyn, H.Budnikov,

F.Ricci, D.Moscone, G.Palleschi // 8th Intern. Symposium on Kinetics in Analytical Chemistry, Book of Abstracts July 8-10,200,4, P.40-41.

13. Евтюгин Г.А. Амперометрические иммуносенсоры для определения сульфа-метоксазола и цефтазидима / Г.А.Евтюгин, Г.К.Будников, С.А.Еремин, Е.В.Супрун, А.Р.Исмагилова // Всерос.конф. "Аналитика России" 27 сентября -1 октября 2004 г. С. 193. - ■

Отпечатано в ООО «Печатный двор». Казань, ул. Журнапистов, 1/16, оф.207 Тел.72-74-59, 41-76-41, 41-76-51. Лицензия ПД№7-02i5 от 01.11.01 Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 04.11.2004 г. Усл. п.л 1,5. Заказ № К-2180. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать -ризография.

I

I

I

I

I

РНБ Русский фонд

2007-4 19886

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ФЕРМЕНТНЫЕ СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ И ПЕРОКСИДАЗЫ (Литературный обзор).И

1.1. Методы иммобилизации холинэстеразы и пероксидазы для создания электрохимических ферментных сенсоров.

1.1.1. Способы иммобилизации холинэстеразы.

1.1.2. Иммобилизация пероксидазы.

1.2. Пероксидазные электрохимические сенсоры.

1.2.1. Прямой перенос электрона с участием пероксидазы.

1.2.2.Использование медиаторов электронного переноса.

1.3. Аналитическое применение пероксидазных сенсоров.

1.3.1. Определение субстратов пероксидаз.

1.3.2. Определение эффекторов пероксидаз.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы и реагенты.

2.2. Приборы и оборудование.

2.3. Изготовление ферментных сенсоров.

2.3.1. Ферментные сенсоры на базе печатных электродов, изготовленных в университете г. Перпиньян (Франция).

2.3.2. Ферментные сенсоры на основе планарных графитовых электродов производства НПВП "ИВА".

2.3.3. Модификация печатных электродов, изготовленных в университете "Тог Уег£аШ", г. Рим.

2.3.4. Изготовление пероксидазных сенсоров на основе печатных электродов, изготовленных в университете г. Нант

2.4. Определение пестицидов.

3. ОПЕРАЦИОННЫЕ ПАРАМЕТРЫ ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫХ СЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПЛАНАРНЫХ ЭЛЕКТРОДОВ.

3.1. Холинэстеразные сенсоры на основе печатных электродов, модифицированных нафионом.

3.2. Холинэстеразный сенсор на основе печатных электродов, модифицированных берлинской лазурью.

3.2.1 Влияние условий иммобилизации на характеристики сенсора.

3.2.2. Определение пестицидов с помощью АХЭ/БЛ сенсора.

4. ПЕРОКСИДАЗНЫЕ СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПЛАНАРНЫХ ЭЛЕКТРОДОВ.

4.1. Определение органических субстратов ПХ.

4.1.1. Иммобилизация ПХ на немодифицированных электродах и выбор рабочих условий измерения сигнала биосенсора.

4.1.2. Определение фенолов и ароматических аминов.

4.2. Биферментные сенсоры на основе толстопленочных угольных электродов, модифицированных политирамином.

4.2.1. Определение субстратов ПХ и БуХЭ.

4.3. Определение промазина и хлоропромазина при помощи модифицированного полианилином электрода и пероксидазного сенсора.

4.4. Иммуносенсоры с индикаторной пероксидазнойреакцией.

4.4.1. Определение цефтазидима.

4.4.2 Определение нонилфенола.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АХЭ - ацетилхолинэстераза

АТХХ - ацетилтиохолин хлорид

АТХИ - ацетилтиохолин иодид

БСА - бычий сывороточный альбумин

БуТХИ - бутирилтиохолин иодид

БуХЭ - бутирилхолинэстераза

БЛ - берлинская лазурь

ПХ- пероксидаза из хрена

ХЭ - холинэстераза

I - степень ингибирования, %

1 - катодный или анодный ток, мкА

Кт - константа Михаэлиса, М

Актуальность работы.'* Методы ферментативного анализа - одна из динамично развивающихся областей аналитической химии. Интерес к применению ферментов с целью идентификации и количественного определения биологически активных соединений обусловлен возможностью достижения уникальной селективности и чувствительности их определения, а так же простотой аппаратурного оформления, позволяющего проводить измерения по месту пробоотбора. В ряде областей (определение глюкозы, мочевины, лак-тата, других метаболитов) ферментативные методы успешно конкурируют с традиционными инструментальными (хроматография, спектральные методы) [1,2]. Недостатки использования ферментов в рутинном анализе - низкая устойчивость при хранении и высокая себестоимость - могут быть компенсированы благодаря их иммобилизации на различных носителях. Помимо многократности использования иммобилизованных ферментов и стабилизации их активности при хранении, иммобилизация упрощает включение препарата фермента в специализированное измерительное устройство - биосенсор, что важно в свете возможной коммерциализации результатов исследований [3].

Новый импульс развитию биосенсоров и ферментативных методов анализа дали технологии получения тонко- и толстопленочных электродов, изготавливаемых методом струйной печати и фотолитографии. Появились дешевые и удобные в работе планарные электроды с устойчивыми воспроизводимыми электрохимическими характеристиками. Технология их получения позволяет варьировать состав и свойства графитовых материалов, вводить в них медиаторы электронного переноса, а в ряде случаев - и сами биологические компоненты. Возможность получения электродов произвольной геометрии и толщины электропроводящего слоя облегчает создание интегрированных аналитических устройств и включения биосенсоров в существующие системы автоматического и полуавтоматического контроля. Этим объясняется внимание к разработке новых амперометриче Научным консультантом работы является д.х.н., проф.Будников Г.К. ских сенсоров, в том числе в крупнейших кампаниях, производящих аналитическое оборудование (BioAnalytical Systems, Metrohm, EcoChemie и др.).

Сочетание планарных электродов с направленной модификацией их поверхности и стабилизацией биологических компонентов в процессе иммобилизации позволяют решить одну из основных проблем биосенсорики - нестабильность сигнала сенсоров при их хранении и эксплуатации. Контакт биокомпонента и преобразователя определяет способ получения аналитического сигнала и его селективность, что особенно важно при проведении измерений в матрицах сложного состава, в присутствии поверхностно-активных веществ, электрохимически активных примесей и т.д. Поэтому требуются исследования, направленные на поиск оптимальных сочетаний модификаторов и биологических компонентов, на установление механизма влияния модификаторов на характеристики иммобилизованного фермента.

Особый интерес представляет исследование ферментных сенсоров, отличающихся широкой субстратной и ингибиторной специфичностью, поскольку для них вклад модификатора поверхности преобразователя сигнала связан еще и с варьированием специфичности сигнала за счет направленного изменения электростатических и стерических факторов, определяющих доступ субстратов и эффекторов, гидрофильно-гидрофобного баланса поверхности. Появляется возможность расширения спектра задач биосенсоров за счет введения в состав поверхностного слоя компонентов, обеспечивающих селективное накопление определенных соединений и таким образом возможность их селективного определения в присутствии других субстратов/ингибиторов.

В этой связи актуальным является изучение возможностей модификации при создании ферментных сенсоров на основе пероксидаз и холинэстераз. Пероксидазы отличаются широкой субстратной специфичностью, что, в частности, используется при контроле фенольного загрязнения промышленных сточных вод [4]. В сочетании с достаточно высокой устойчивостью и наличием чувствительных способов измерения активности это делает данный фермент весьма привлекательным для включения в состав биосенсоров для измерения содержания легко окисляющихся органических соединений. Холинэстераза обладает широкой ингибиторной специфичностью [5], что в сочетании с глубокой изученностью данного фермента, в том числе в составе биосенсоров, позволяет выделить вклад модификации в характеристике биосенсора.

Целью настоящей работы явилось создание амперометрических пероксидазных и холинэстеразных сенсоров на основе модифицированных графитовых электродов и установление влияния модификаторов на операционные и аналитические характеристики определения субстратов и ингибиторов ферментов в составе биосенсоров.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- разработать методы модификации графитовых тонко- и толстопленочных электродов нафионом, полианилином, политирамином, в том числе путем электрополимеризации, производными каликс[4]резорциноларенов и антителами против нонилфенола и цефта-зидима; установить характер влияния модификаторов в соответствии с механизмом их действия;

- выбрать условия иммобилизации пероксидазы и холинэстеразы, обеспечивающие наиболее устойчивый воспроизводимый сигнал и высокую чувствительность определения их субстратов (пероксидаза) и ингибиторов (холинэстераза);

- изучить влияние гетерогенных медиаторов электронного переноса (полианилин, берлинская лазурь) на условия регистрации сигнала и аналитические характеристики пероксидазных и холинэстеразных сенсоров;

- установить возможность повышения чувствительности определения и расширения круга определяемых соединений (цефтазидим, нонилфенол) с помощью пероксидазных сенсоров и модификаторов, обеспечивающих накопление субстратов на поверхности электрода;

- разработать чувствительные методы определения субстратов пероксидазы и ингибиторов холинэстеразы с применением модификаторов различного механизма действия.

Научная новизна работы заключаются в том, что:

- предложены подходы к модификации планарных графитовых электродов, позволяющие решать задачи стабилизации ферментов (нафион, политирамин), снижения рабочего потенциала измерения сигнала (нафион, берлинская лазурь, полианшшн) и улучшения аналитических характеристик определения субстратов за счет их селективного накопления на электроде; V

- показана возможность использования берлинской лазури для снижения потенциала окисления тиохолина и регистрации сигнала холинэстеразного сенсора, установлено влияние медиатора и состава иммобилизационной смеси на характеристики определения фосфорорганических и карбаминатных пестицидов;

- изучено влияние комплексов "гость-хозяин" с участием промазина и хлоропромазина и каликс[4]резорциноларенов на характеристики их прямого и пероксидазного окисления на электродах, модифицированных полианилином;

- предложено использовать совместную иммобилизацию пероксидазы и антител против низкомолекулярных соединений - гаптенов - для регистрации иммунологических взаимодействий на поверхности сенсора по изменению скорости пероксидазного окисления гидрохинона и метиленового синего.

Практическая значимость работы состоит в том, что:

- предложены простые и удобные в использовании способы модификации электродов путем электрополимеризации анилина и тирамина с последующей иммобилизацией ферментов и включением дополнительных модификаторов за счет электростатических взаимодействий, физической сорбции и кросс-сшивки глутаровым альдегидом;

- разработаны методы определения остаточных количеств пестицидов ангихолинэстераз-ного действия в зерне; предложено использовать холинэстеразный сенсор для контроля разложения фосфорорганических и карбаминатных пестицидов при брожении виноградного сока;

- разработан биферментный сенсор с пероксидазой и холигостеразой, иммобилизованными на одном графитовом электроде, модифицированном политирамином, для определения субстратов пероксидазы и ингибиторов холинэстеразы.

На защиту выносятся:

- результаты изучения влияния нафиона и политирамина на стабильность и чувствительность сигнала пероксидазного и холинэстеразного сенсоров при определении субстратов и ингибиторов ферментов и вывод о стабилизирующем влиянии модификаторов при хранении и использовании биосенсоров;

- характеристика влияния компонентов поверхностного слоя (низкомолекулярные модификаторы, глутаровый альдегид, альбумин, нафион) и выбор состава иммобилизацион-ной смеси и условий иммобилизации, обеспечивающих оптимальное сочетание стабильности сигнала и чувствительности определения ароматических субстратов пероксидазы и фосфорорганических и карбаминатных пестицидов - ингибиторов холинэстеразы;

- новый способ регистрации сигнала холинэстеразного сенсора при модификации печатного графитового электрода берлинской лазурью и результаты определения с его помощью ингибиторов холинэстеразы;

- влияние условий пробоподготовки и проведения измерения на чувствительность определения фосфорорганических и карбаминатных пестицидов в зерне и виноградном соке в процессе брожения и вывод о возможности применения холинэстеразных сенсоров для контроля качества сельскохозяйственной продукции;

- влияние модификаторов на аналитические характеристики определения ароматических субстратов пероксидаз с помощью моно- и биферментного сенсора на основе модифицированных преобразователей сигнала, в том числе в присутствии специфических антител и комплексообразователей, и вывод о характере влияния структуры субстрата и механизме действия модификаторов на чувствительность и селективность их определения/ Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Всероссийском симпозиуме "Тест-методы химического анализа" (2001), Поволжской конференции по аналитической химии (Казань, 2001), Всероссийской конференции "Актуальные проблемы аналитической химии" (Москва, 2002 г.), 12 Международной конференции по аналитической химии EURO ANALYSIS 12 (Дортмунд, Германия, 2002), Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" (Казань 2003), 17 Международном симпозиуме по биоэлектрохимии (Флоренция, Италия, 2003), 8 Международном симпозиуме по кинетическим методам анализа КАС-2004 (Рим, Италия, 2004), Всероссийской конференции по аналитической химии "Аналитика России-2004"(Москва). Основные результаты изложены в 4 статьях и 9 тезисах докладов. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 170 страницах машинописного текста, включает 50 рисунков и 9 таблиц. Состоит из введения, 4 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 248 ссылок на отечественные и зарубежные работы.

1. Обосновано использование модификации графитовых электродов как способа улучшения операционных и аналитических хараю-еристик ферментных сенсоров на основе пероксида зы и холинэстеразы для определения специфических субстратов и ингибиторов. Установле но влияние условий иммобилизации и состава иммобилизационной среды на сигнал био сенсоров и их устойчивость при хранении и эксплуатации.2. Покрытие электродов нафионом и политирамином, а тшсже включение в состав поверх ностного слоя альбумина увеличивают время жизни и воспроизводимость сигнала фер ментных сенсоров, в том числе при хранении в сухом виде и при иммобилизации фермен тов на едином носителе. Разработанные сенсоры могут быть использованы для определения окисляющихся ароматических соединений, фосфорорганичесюос и карбаминатных пести цидов в микро- и наномолярном диапазоне концентраций, соответственно.3. Предложен новый способ регистрации сигнала холинэстеразного сенсора при модифика ции печатного графитового элеюрода берлинской лазурью, отличающийся низким рабочим напряжением измерения сигнала, быстрым и устойчивым откликом и высокой чувствитель ностью в отношении ингибиторов фермента.4. Разработаны методики определения остаточных количеств пестицидов антихолиюсте разного действия в растительной продукции, а таюке контроля разложения пестицидов в процессе сбраживания виноградного сока.5. Изучение влияния полианилина и каликс[4]резорциноларенов на окисление промазина и хлоропромазина на модифицированном полимером электроде и пероксидазном сенсоре вы явило вклад образования комплексов "гость-хозяин" в процесс медиаторного переноса элек трона и формирование аналитического сигнала. Разработан метод определения указанных препаратов с пределами обнаружения 3 и 5 мкМ, соответственно.6. Совместная иммобилизация пероксидазы и специфических антител против цефтазидима и нонилфенола позволяет регистрировать иммунные реакции на поверхности сенсора за счет изменений аллостерической регуляции активности фермента или стерического кошро ля доступа субстрата к ферменту. Пределы обнаружения цефтазидима и нонилфенола со ставили 0.1 нМ и 1 мкМ, соответственно. Оценена селективность сигнала иммуносенсора на цефтазидим в присутствии антибиотиков сульфонамидного и цефаллоспоринового ряда.

1. Mikkelsen S.R. Bioanalytical Chemistry / S.R.Mikkelsen, E.Corton // J.Wiley andSons, Inc., Hoboken, New Jersey.- 2004.- 361 p.

2. Prange A. Focus on bioanalysis / A.Prange, B.Neidhart, G.Gauglitz // Anal.Bioanal.Chem.- 2003.-V.377.-P.383-385.

3. Кулис Ю.Ю. Аналитических системы на основе Ихммобилизованных ферментов. Вильнюс: Мокслас, 1981.- 200 с.

4. Baeumner A.J. Biosensors for environmental pollutants and food contaminants // Anal. Bioanal. Chem.- 2003.- V.377.- P.434-445.

5. Бресткин А.П. Холинэстеразы наземных животных и гидробионтов / А.П.Бресткин, Л.П.Кузнецова, Н.Моралев, Е.В.Розенгарт, Л.М.Эпштейн // Владивосток: Изд-во ТИНРО-центр, 1997.- 466 с.

6. Кларк Л.С. Ферментный электрод. / В кн. Биосенсоры (под ред.Э.Тернера, И.Карубэ, Дж.Уилсона). М.: Мир, 1992.- 11-19.

7. Forzani E.S. Amperometric determination of dopamine on vegetal tissue enzymatic electrodes. Analysis of interferences and enzymatic selectivity / E.S.Forzani, CA.Rivas, V.M.Solis // J.Electroanal.Chem.-1997.-V.435,№ 1-2.-P.77-84.

8. Андреева B.A. Фермент пероксидаза. М.: Наука, 1988.- 128 с.

9. Diehl-Faxon J. Direct electron transfer based tri-enzyme electrode for monitoring of organophosphoras pesticides / J.Diehl-Faxon, A.L.Ghindilis, P.Atanasov, E.Wilkins // Sens.Actuators. В.- 1996.- V.36, № 1-3.- P.448-457.

10. Ghindilis A.L. Potentiometric biosensors for cholinesterases inhibitor analysis based on mediatorless bioelectrocatalysis / A.L.Ghindilis, T.G.Morzunova, A.V.Barmin, I.N.Kurochkin // Biosens.Bioelectron.- 1996.- VI1, № 9-. P.873-880.

11. Биосенсоры: основы и приложения / Под ред. Тернера Э., Карубэ И., Уилсона Дж. М.: Мир, 1992.-615 с.

12. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы. / Под ред. И.В. Березина, В.К. Антонова, К. Мартинека-М.: Изд-во МГУ, 1976.-Т.2.-358с.

13. Bonnet С Adsorption: an easy and efficient immobilisation of acetylcholinesterase on screen-printed electrodes/ C, Bonnet, S. Andreescu, J-L. Marty // Anal.Chim.Acta.-2003,-V.481.-P.209-211.

14. Rodrigues T.C. An immobilized acetylcholinesterase flow-injection conductimetric system for the determination of paraoxon/ T.C Rodrigues, M Tubino., O.E.S. Godinho, G.D. Neto // Anal.Sci.- 1997.- V.13, № 3,- P.423-427.

15. Goodson J.H. An immobilized cholinesterase product for use in the rapid detection of enzyme inhibitors in air and water/ J.H. Goodson, W.B. Jacobs, A.W Davis // Anal.Biochem.-1973.-V.51,№2.-P.362-367.

16. Goodson J.H. Stabilization of cholinesterase detector kit using stabilized cholinesterase, and methods of making and using the same./ J.H. Goodson, A Goodman.// Патент США A-4324858. Опубл. 13 апреля 1982.

17. Ristori Potentiometric detection of pesticides in water samples/ С Ristori, C. Del Carlo, M. Martini, A. Barabaro, A. Ancarani // Anal.Chim.Acta.- 1996.- V.325.- P.151-160.

18. Roda A. Chemiluminescent flow sensor for the determination of Paraoxon and Aldicarb pesticides/ A. Roda, P. Rauch, E. Ferri, S. Girotti, S. Ahini, G. Carrea, R. Bovara // Anal. Chim. Acta.- 1994.- V.294.- P.35-42.

19. Kok F.N. Construction of an acetylcholinesterase-choline oxidase biosensor for aldicarb determination / F.N.Kok, F.Bozoglu, V.Hasirci // Biosens. Bioelectron.- 2001.-V.17.-P.531-539.

20. Turdean G. An acetylcholinesterase amperometric microbiosensor for the detection of dipterex / G.Turdean, I.Peter, I.C.Popescu, L.Oniciu // Rev.Roumane de Chimie.- 1997.- V.42, № 9.- P.879-883.

21. Montesinos T. Disposable cholinesterase biosensor for the detection of pesticides in water- miscible organic solvents/ T.Montesinos, S.Perez-Monguia, F.Valdes, J.-L.Marty // Anal. Chim. Acta.-2001.-V.431.-P.231-237.

22. Campanella L. A new organic phase enzyme electrode for the analysis of organophosphorus pesticides and carbamates / L.Campanella, S.De Luca, M.P.Sammartino, M.Tomassetti // Anal. Chim. Acta.- 1999.- V.385.- P.59-71,

23. Campanella L. Analysis of several real matrices using new mono-, bi-enzymatic, or inhibition organic phase enzyme electrodes/ L.Campanella, G.Favero, M.P.Sammarintino, M.Tomassetti // Anal.Chim.Acta.- 1999.- V.393.- P.109-120.

24. Bucur B. Versatile method of cholinesterase immobilisation via affinity bonds using Concanavalin A applied to construction of a screen-printed biosensor/ B. Bucur, A. F. Danet, J-1.. Marty// Biosens. Bioelectron.- 2004.- V.20.- P.217-225.

25. Игнатов В.В. Углеводузнающие белки - лектины // Соросовский образовательный журнал. - 1997.- № 2.-С.14-20.

26. Rogers К. Light addressable potentiometric biosensor or the detection of anticholinesterases/ K. Rogers, M. Foley, S.Alter, P. Koga, M. Eldefrawi // AnaLLetters.- 1991.- V.24, № 2.- P.191-198.

27. Beybier K. The use of polyethyleneimine for fabrication of potentiometric cholinesterase biosensors / K.Reybier, S.Zairi, N.Jaffrezic-Renauh, B.Fahys // Talanta.- 2001.- V.56.- P.1015-1020.

28. Hart A. L. Stability and function of screen printed electrodes, based on cholinesterase, stabilized by a co-polymer/ sugar alcohol mixture / A.L. Hart, W.A. Collier // Sensors Actuators B.-1998.-V.53.-P.111-115.

29. Кузнецова Л.П. Каталитические свойства .чолинэстераз, иммобилизованных в желатиновой мембране / Л.П. Кузнецова, Л.И. Кугушева, Е.Б. Никольская // Ухф. биохим. журн.-1990.-Т.62,№6.-С.42-48.

30. Бресткин А.П. Применение фермент-ингибиторных систем для определения микроколичеств обратимых ингибиторов холинэстераз/ А.П. Бресткин, Е.Б. Никольская, Л.П. Кузнецова, В.М. Кострова, Н.А. Тулина // Журн.анал.химии - 1989.- Т.44, № 9.- 1666-1670.

31. Кугушева Л.И. Применение ферментсодержащих мембран для определения органических соединений/ Л.И. Кугушева, Л.П. Кузнецова, Е.Б, Никольская, О.В. Ягодина // Журн.анал.химии.- 1992.-Т.47,№ 8.-СЛ478-1483.

32. Кугушева Л.И. Стабилизация холинэстеразы голов мух, иммобилизванной в желатиновой мембране/ Л.И. Кугушева, Е.Б. Никольская // Укр.биохим.журн.- 1989.- Т.61, № 6.-С.92-94.

33. La Rosa Amperometric flow-through biosensor for the determination of pesticides/ С La Rosa, F. Pariente, L. Hernandez, E. Lorenzo//Anal.Chim.Acta.- 1995.- V.308.- P. 129-136.

34. Ivanov A. Cholinesterase sensors based on screen-printed electrodes for detection of organophosphorus and carbamic pesticides / A. Ivanov, G. Evtugyn, H. Budnikov, F. Ricci, D, Moscone, G. Palleschi//Anal.Bioanal.Chem. - 2003.-V.377.- P.624-631.

35. Skladal P. Performance of the amperometric biosensor with immobilized butyiylcholinesterase in organic solvents/ P. Sklddal, J. Krejci // Coll. Czech.Chem.Commun.-1996.-V.61,№7.-P.985-991.

36. Rippeth J. J. Flow-injection detector incorporating a screen-printed disposable amperometric biosensor for monitoring organophosphate pesticides/ J.J. Rippeth, T.D. Gibson, J.P. Hart, LC. Hartley, G. Nelson// Analyst.-1997.- V.122.- P.1425-1429.

37. Kok F.N. Determination of binary pesticide mixtures by an acetylcholinesterase-choline oxidase biosensor / F. N.Kok, V. Hasirci // Biosens. Bioelectron.- 2004.-V.19.-P.661-665.

38. Sun D. Direct electrochemistry and bioelectrocatalysis of horseradish peroxidase immobilized on active carbon / D.Sun, C.Cai, X.Li, W.Xing, T.Lu // J.Electroanal. Chem.-2004.-V.556.-P.415-421.

39. Ruzgas Т. The development of a peroxidase biosensor for monitoring phenol and related aromatic compounds / T. Ruzgas, J. Emneus, L. Gorton, G. Marko-Varga // Anal.Chim.Acta.-1995.-V311.-P.245-253.

40. Gavalas V.G. Improved operational stability of biosensors based on enzyme-polyelectrolyte complex adsorbed into a porous carbon electrode / V.G.Gavalas, N.A Chaniotakis, T.D.Gibson // Biosens. Bioelectron.-1998.-V.13.- P.1205-1211.

41. Zeravik J. A highly sensitive flow-through amperometric immunosensor based on the peroxidase chip and enzyme-channeling principle / J.Zeravik, T.Ruzgas, M.Franek // Biosens. Bioelectron.- 2003.- V.18.- P.1321-1327.

42. Zhao J. Direct electron transfer at horseradish peroxidase-colloidal gold modified electrode / J.Zhao, R.W.Henkens, J.Stonehuemer, J.P.O'Daly, A.L.Crambliss // J. Electroanal. Chem.-1992.-V.327.-P.109-119.

43. Wang L. A novel hydrogen peroxide sensor based on horseradish peroxidase immobilized on colloidal Au modified ITO electrode / L. Wang, E. Wang // Electrochem.Commun.- 2004.- V6.-P.225-229.

44. Xu S. A novel method to construct a third-generation biosensor: self-assembling gold nanoparticles on thiol-flinctionalized poly(styrene-co-acrylic acid) nanospheres / S. Xu, X. Han //Biosens.Bioelectron.- 2004.- V.19.- P.Ill7-1120.

45. Sun C. Fabrication of muhilayer films containing horseradish peroxidase based on electrostatic interaction and their application as a hydrogen peroxide sensor / C.Sun, W.Li, Y.Sun, X.Zhang, J.Shen // Electrochim.Acta.- 1999.- V.44.- P.3401-3407.

46. Bagirova N.A. Enzymatic determination of phenols using peanut peroxidase / N.A.Bagirova, T.N.Shekhovtsova, R.B. van Huystee//Talanta.- 2001.- V.55.- P.1151-1164.

47. Volotovsky V. Cyanide determination by an ISFET-based peroxidase biosensor / V. Volotovsky, N.Kim//Biosens.Bioelectron.-1998.-V. 13.-P. 1029-1033.

48. Campanella L. Determination of hydrogen peroxide in disinfectant solutions using a biosensor with two antagonist enzymes / L. Campanella, G. Favero, D. Giancola, M. Tomassetti // J.Phann.Biomed.Anal.- 2003.- V.32.- P.737-751.

49. Willner I. Integration of layered redox proteins and conductive supports for bioelectronics applications / I.Willner, E.Katz // Angew, Chem. Int.Ed.- 2000.- V.39.- P.l 180-1218.

50. Cosnier S. Biomolecule immobilization on electrode surfaces by entrapment or attachment to electrochemically polymerized films. A review // Biosens.Bioelectron.- 1999.- V.14.- P.443-456.

51. Mulchandani A. Ferrocene conjugated m-phenylenediamine conducting poljmier- incoфOгated peroxidase biosensors / A.Mulchandani, S.Pan // Anal.Biochem.- 1999.- V.267.-P.141-147.

52. Deng Q. Mediatorless hydrogen peroxide electrode based on horseradish peroxidase entrapped in poly(o-phenylenediamine) / Q.Deng, S.Dong // J.Electroanal.Chem.-1994.- V.377.-P.191-195.

53. Nakabayashi Y. Amperometric biosensors for sensing of hydrogen peroxide based on electron transfer between horseradish peroxidase and ferrocene as mediators./ Y.Nakabayashi, RYoshikawa // Anal.Sci.- 2000.- V.16.- P.609-613.

54. Xiao Z. A reagentless hydrogen peroxide sensor based on incorporation of horseradish peroxidase in poly(thionine) film on a monolayer modified electrode / Z.Xiao, H.-XJu, H.Y.Chen//Anal.Chim.Acta.- 1999.- V.391.- P.299-306.

55. Yang R. A H2O2 biosensor based on immobilization of horseradish peroxidase in electropolymerized methylene green film on GCE //R.Yang, C.Ruan, J.Deng // J.Appl. Electrochem.- 1998.- V.28.- P. 1269-1275.

56. Lomillo M.A.A. HRP-based biosensor for monitoring rifampicin / M.A.A.Lomillo, J.M. Kauffinann, M.J.A.Martinez // Biosens.Bioelectron.- 2003.- V.18.- P.l 165-1171.

57. Bartlett P.N. An enzyme switch employing direct electrochemical communication between horseradish peroxidase and a poly(aniline) film / P.N.Bartlett, P.R.Birkin, J.H.Wang // Anal. Chem.- 1998.. V.70.- P.3685-3694.

58. Iyengar S. Frequency domain selection of the peroxidase signal for amperometnc biosensors / S.Iyengar, E.A.H.Hall, N.G.Skinner, J.J.Gooding // Electroanalysis.- 1998.- V.IO.- P.1089-1095.

59. Tatsuma T. Peroxidase incoфorated sulfonated polyaniline-polycation complexes for electrochemical sensing of H2O2 / T.Tatsuma, T.Pgawa, R.Sato, N.Oyama // J.EIectroanal. Chem.-2001.-V.501.-P.180-185.

60. Yang Y. Bioelectrochemical responses of the polyanline horseradish peroxidase electrodes / Y.Yang, S.Mu//J.Electroanal.Chem.- 1997.-V.432.- P.71-78.

61. Garcia-Moreno E. Determination of organic peroxides in reversed micelles with a poly-N- methylpyrrole horseradish peroxidase amperometric biosensor / E. Garcia-Moreno, M. A. Ruiz, С Barbas, J. M. Pingarron // Anal.Chim.Acta.- 2001.- V.448.- P.9-17.

62. Cosnier S. Electropolymerization of amphiphilic monomers for designing amperometric biosensors// Electroanalysis.-1997.- V.9.- P.894-902.

63. Tatsuma T. Peroxidase-incorporated polypyrrole membrane electrodes / T.Tatsuma, M.Gondaira, T.Watanabe // Anal.Chem.- 1992.- V.64.- P.l 183-1187.

64. Tian F. Hydrogen peroxide biosensor with enzyme entrapped within electrodeposited polypyrrole based on mediated sol-gel derived composite carbon electrode / F.Tian, B.Xu, 1..Zhu, G.Zhu // Anal.Chim.Acta.- 2001.- V.443.- P.9-16.

65. Razola S.S. Hydrogen peroxide sensitive amperometric biosensor based on horseradish peroxidase entrapped in a polypyrrole electrode / S.S.Razola, B.L.Ruiz, N.M.Diez, H.B.Mark, J.-M. Kaufftnann// Biosens.Bioelectron.- 2002.- V.17.- P.921-928.

66. Belanger D. Electrochemistry of the polypyrrole glucose oxidase electrode / D.Belanger, J.Nadreau, G.Fortier//J.Electroanal.Chem.-1989.- V.274.- V.143-155.

67. Rajendran V. Amperometric peroxide sensor based on horseradish peroxidase and toluidine blue 0-acrylamide polymer in carbon paste / V.Rajendran, E.Csoregi, Y.Okamoto, L.Gorton // Anal.Chim.Acta.- V.373.- P.241-251.

68. Prada G.-V.A. Amperometric multidetection with composite enzyme electrodes / A, Guzman-Vazquez de Prada, N. Pena, C. Parrado, A. J. Reviejo, J.M. Pingarron // Talanta.-2004.-V.62.-P.896-903.

69. Liu B. An amperometric biosensor based on the coimmobilization of horseradish peroxidase and methylene blue on a a-type zeolite modified electrode / B.Liu, Z.Liu, D.Chen,J.Kong,

70. Deng // Fresenius J.Anal.Chem.- 2000.- V.367.- P.539-544.

71. Liu B. A reagentless amperometric biosensor based on the coimmobilisation of horseradish peroxidase and methylene green in a modified zeolite matrix / B.Liu, F.Yan, J.Kong, J.Deng // Anal.Chim.Acta.- 1999.- V.386.- P.31-39.

72. Fern T. Direct electrochemistry of membrane-entrapped horseradish peroxidase. Part II: Amperometric detection of hydrogen peroxide / T. Fem, A. Poscia, R. Santucci // Bioelectrochem. Bioenerg.- 1998.-V.45.- P.221-226.

73. Huang R. Direct electrochemistry and electrocatalysis with horseradish peroxidase in Eastman AQ films / R. Huang, N. Hu // Bioelectrochem.- 2001.- V.54.- P.75-81.

74. Wang B. Acid-Stable Amperometric soybean peroxidase biosensor based on a self- gelatinizable grafting copolymer of polyvinyl alcohol and 4-vinylpyridine / B. Wang, B. Li, G. Cheng, S. Dong// Electroanalysis.- 2001.- V.13.- P.555-558.

75. Ferri T. Direct electrochemistry of membrane-entrapped horseradish peroxidase. P.I. A vohammetric and spectroscopic study / T.Ferri, A.Poscia, R.Santucci // Bioelectrochem. Bioenerg.- 1998.- V.44.- P.177-181.

76. Dong S. A novel enzyme electrode for the water-lree organic phase / S.Dong, Y.Guo // J.Electroanal.Chem.- 1994.- V.375.- P.405-407.

77. Yuqing М. Using electropolymerized non-conducting polymers to develop enzyme amperometric biosensors / M. Yuqing, С Jianrong, W. Xiaohua // Trends Biotechnol- 2004.-V.22.-N0.5.-P.227-231.

78. Palmisano F. Correlation between permeselectivity and chemical structure of overoxidized polypyrrole membranes used in electroproduced enzyme biosensors / F.Palmisano, C.Malitesta, D.Centonze, P.G.Zambonin // Anal.Chem.-1995.- V.67.- P.2207-2211

79. Miao Y. Amperometric hydrogen peroxide biosensor with silica sol-gel/chitosan film as immobilization matrix./ Y.Miao, S.N.Tan // Anal.Chim.Acta.- 2001.- V.437.- P.87-93.

80. Park T.-M. Development of sol-gel enzyme inhibition based amperometric biosensor for cyanide/ T.-M.Park, E.I.Iwuoha, M.R.Smyth// Electroanalysis.- 1997.- V.9, №14.- P.1120-1123.

81. Pandey P.C. An ormosil-based peroxidase biosensor - a comparative study on direct electron transport from horseradish peroxidase / P.C.Pandey, S.Upadhyay, I.Tiwari, V.S.Tripathi // Sensors Actuators В.- 2001.- V.72.- P.224-232.

82. Wang B. Sol-gel-derived amperometric biosensor for hydrogen peroxide based on methylene green incorporated in Nafion film / B.Wang, S.Dong // Talanta.- 2000.- V.51.- P.565-572.

83. Li J. Silica sol-gel immobilized amperometric biosensor for hydrogen peroxide / J. Li, S. N. Tan,H. Ge//Anal.Chim.Acta.- 1996.-V.335.-P. 137-145.

84. Wang G. Amperometric hydrogen peroxide biosensor with sol-gel/chitosan network-like film as immobilization matrix / G. Wang, J.-J. Xu, H.-Y. Chen, Z.-H. Lu // Biosens.Bioelectron.-2003.-V.18.-P.335-343.

85. Adeyoju О. Determination of kinetic parameters for the inhibitory effects of organic sulphides on an amperometric peroxide biosensor in non-aqueous media / O.Adeyoju, E.I.Iwuoha, M.R.Smyth // Talanta.-1994.- V.41, № 9.- P.1603-1608.

86. Adeyoju O. Reactivities of amperometric organic phase peroxidase-modified electrodes in the presence and absence of thiourea and ethylenethiourea as inhibitors /O.Adeyoju, E.I.Iwuoha, M.R.Smyth//AnaI.Chim.Acta.- 1995.- V.305.- P.57-64.

87. Qian J. Immobilization of horseradish peroxidase with a regenerated siLk fibroin membrane and its application to a tetrathiafulvalene-mediating H2O2 sensor / J.Qian, Y.Liu, H.Liu, T.Yu, J.Deng//Biosens.Bioelectron.-1997.-V.12.-P.1213-1218.

88. Chen X. Amperometric biosensor for hydrogen peroxide based on sol-gel/hydrogel composite thin film / X. Chen, B. Wang , S. Dong // Electroanalysis- 2001.- V.13.- P.l 149-1152.

89. Rosatto S.S. Biosensor for phenol based on the direct electron transfer blocking of peroxidase immobilising on silica-titanium/ S.S.Rosatto, L.T.Kubota, G. de Oliveira Neto // Anal.Chim.Acta.-1999.- V.390.-P.65-72.

90. Rosatto S.S. Effect of DNA on the peroxidase based biosensor for phenol determination in waste waters / S.S.Rosatto, G. di Oliveira Netto, L.T.Kubota // Electroanalysis.- 2001.- V.13, №6.- P.445-450.

91. Xu X. Ti02 sol-gel derived amperometric biosensor for H2O2 on the electropolymerized phenazine methosulfate modified electrode / X.Xu, J.Zhao, D.Jiang, J.Kong,-B.Liu, J.Deng //Anal.Bioanal.Chem.-2002.- V.374.- P. 1261-1266.

92. Zhang Y. Horseradish peroxidase immobilized in TiOinanoparticle films on pyrolytic graphite electrodes: direct electrochemistry and bioelectrocatalysis // Y. Zhang, P. He, N. Hu // Electrochim. Acta.- 2004.- V.49.- P. 1981-1988.

93. Huang W. Hydrogen peroxide biosensor based on microperoxidase-11 entrapped in lipid membrane / W.Huang, J.Jia, Z.Zhang, X.Han, J.Tang, J.Wang, S.Dong, E.Wang // Biosens. Bioelectron.- 2003.- V.18.- P.1225-1230.

94. Tang J. Lipid membrane immobilized horseradish peroxidase biosensor for amperometric determination of hydrogen peroxide / J.Tang, B.Wang, Z.Wu, X.Han, S.Dong, E.Wang // Biosens. Bioelectron.- 2003.- V.18.- P.867-872.

95. Cosnier S. Poly(pyrrole-biotin): a new polymer for biomolecule grafting on electrode surfaces / S.Cosnier, A.Le Pellec // Electrochim. Acta.- 1999.- V.44.- P. 1833-1836.

96. Cosnier S. Electrogcneration of biotinylated functionalized polypyrroles for the simple immobilization of enzymes / S. Cosnier, B. Galland, С Gondran, A. Le Pellec// Electroanalysis.- 1998.- V.IO.- P.808-813.

97. Torres-Rodriguez L. M. Polypyrrole-biotin based biosensor: elaboration and characterization // L. M. Torres-Rodriguez, M. Billon, A. Roget, G. Bidan //Synthetic Metals.-1999.-V.102.-P.1328-1329.

98. Stiene M. Electrochemical characterization of screen-printed carbonaceous electrodes for the determination of peroxidase activity in novel screen-printed flow-through modules / M. Stiene, U. Bilitewski // Anal.Bioanal.Chem.- 2002.- V.372.- P.240-247.

99. Jin Z. A novel method for polyaniline synthesis with the immobilized horseradish peroxidase enzyme / Z.Jin, Y.Su, Y.Duan // Synth.Metals- 2001.- V.122.- P. 237-242.

100. Han S. A methylene blue-mediated enzyme electrode for the determination of trace mercuiy(II), mercury(I), methylmercury, and mercury-glutathione complex / S.Han, M.Zhu, Z.Yuan, X.Li // Biosens.Bioelectron.- 2001.- V.16.- P.9-16.

101. Razola S.S. Reagentless enzyme electrode based on phenothiazine mediation of horseradish peroxidase for subnanomolar hydrogen peroxide determination / S.S.Razola, E.Aktas, J.-C.Vire, J.-M.ICauffmann// Analyst.- 2000.- V.125.- P.79-85.

102. Danilowicz An Os(byp)2ClPyCH2NH poly(allylamine)hydrogel mediator for enzyme wiring at electrodes / С Danilowicz, E. Corton, F. Battaglini, E. J. Calvo // Electrochim.Acta.-1998.-V.43.-P.3525-3531.

103. Caspar S. Biosensors based on novel plant peroxidases: a comparative study / S.Gaspar, I.C.Popescu, I.G.Gazaryan, A.G.Bautista, I.Yu.Sakharov, B.Mattiasson, E.Csoregi // Electrochim. Acta.- 2000.- V.46.- P.255-264.

104. Buck S. Use of a peroxidase reactor in flow injection analysis for the determination of chloramine and the inhibition kinetics / S.Buck, K.Stein, G.Schwedt // Anal. Chim. Acta.- 1999.-V.390.-P.141-146.

105. Iwuoha E.I. Reactivities of organic-phase biosensors. 1. Enhancement of the sensitivity and stability of amperometnc perxidase biosensors using chemically modified enzymes / E.I.Iwuoha,

106. Leister, E.Miland. M.R.Smyth, C.O.Fagain // Anal.Chem.- 1997.- V.69.- P.1674-1681.

107. Smit M.H. Cyanide detection using a substrate-regenerating peroxidase based biosensor/ M.H.Smit, A.E.G.Cass // Anal.Chem.- 1990.- V.62.- P.2429-2436.

108. Darder M, Dithiobissuccinimidyl propionate as an anchor for assembling peroxidases at electrodes surfaces and its application in a H2O2 biosensor // M.Darder, K.Takada, F.Pariente, E.Lorenzo, H.D.Abmna // Anal.Chem.- 1999.- V.71, № 24.- P.5530-5537.

109. Kong Y.-T. Direct electrochemistry of horseradish peroxidase bonded on a conducting polymer modified glassy carbon electrode / Y.-T. Kong, M. Boopathi, Y.-B. Shim // Biosens. Bioelectron.- 2003.- V.19.- P.227-232.

110. Sergeyeva T. A. Hydrogen peroxide - sensitive enzyme sensor based on phthalocyanine thin film/T.A.Sergeyeva, N.V.Lavrik, A.E.Rachkov, Z.I.Kazantseva, S.A.Piletsky, A.V. El'skaya// Anal.Chim.Acta.- 1999.- V.391.- P.289-297

111. Stefan R.-I. Electrochemical sensors in bioanalysis // R.-I. Stefan, J. F. van Staden, H.Y.Aboui-Enein, Marcel Dekker, New York, Basel, 2001.- 311 p.

112. Yamamoto K. Stady of carbon nanotubes-HRP modified electrode and its application for novel on-line biosensors / K. Yamamoto, G. Shi, T. Zhou, F. Xu, J. Xu, T. Kato, J.-Y. Jin, L. Jin //Analyst- 2003.- V.128.- P.249-254.

113. Akyilmaz E. A biosensor based on urate oxidase-peroxidase coupled enzyme system for uric acid determination in urine / E. Akyilmaz, M. K. Sezginturk, E. Dinckaya // Talanta.- 2003.-V61.-P.73-79.

114. Pena R. M. Sequential injection analysis-based flow system for the enzymatic determination of aspartame / R. M. Pena, Jose L. F. С Lima, M. L.M. F. S. Saraiva // Anal.Chim.Acta.- 2004.-V.514.-P.37-43.

115. Pham M.C. Voltammetric and XPS analysis of metal-complexed polytyramine films: geometry-dependent electron transfer therein / M.-C.Pham, P.-C.Lacaze, J.-E.Dupois // J.Electrochem. Soc-1984.- V.131, № 4.- P.777-784.

116. Situmorang M. Immobilisation of enzyme throughout a polytyramine matrix: a versatile procedure for fabricating biosensors / M.Situmorang, J.J.Gooding, D.B.Hibbert // Anal. Chim. Acta.- 1999.- V.394.- P.211-223.

117. Femandes К. F. Properties of horseradish peroxidase immobilised onto polyaniUne / K. F. Femandes, С S. Lima, F. M. Lopes, C, H. Collins // Process Biochem.- 2004.- V.39.- P.957-962.

118. Shukla S. P. Covalent coupling of peroxidase to a copolymer of acrylamide (AAm)-2- hydroxyethyl methaacrylate (НЕМА) and its use in phenol oxidation / S. P. Shukla, S. Devi // Process Biochem.- 2004.- V.40.- P.147-154.

119. Rahman Md. A. A performance comparison of choline biosensor: anodic or cathodic detections of H2O2 generated by enzyme immobilized on a conducting polymer / Md. A. Rahman, D.-S. Park, Y.-B. Shim// Biosens.Bioelectron.- 2004.- V.19.- P.1565-157L

120. Yu X. Peroxidase activity of enzymes bound to the ends of single-wall carbon nanotube forest electrodes / X. Yu, D. Chattopadhyay, L Galeska, F. Papadimitrakopoulos, J. F. Rusling // Electrochem.Commun.- 2003.- V5.- P.408-411

121. Azevedo A. M. Operational stability of immobilised horseradish peroxidase in mini-packed bed bioreactors / A.M.Azevedo, V.Vojinovic', J.M.S.Cabral, L.P.Fonseca // J.Mol.Catalysis B.-2004.-V.28.-P.121-128.

122. Li J. Viologen-thiol self-assembled monolayers for immobilized horseradish peroxidase at gold electrode surface / J.Li, J.Yan, Q.Deng, G.Cheng, S.Dong // Electrochim.Acta.- 1997.-V.42.- P.961-967.

123. Ledm S. Electrocatalytic oxidation of ascorbate by heme-Fe™/heme-Fe" redox couple of the HRP and its effect on the electrochemical behaviour of an L-lactate biosensor / S.Ledru, M.Boujtita // Bioelectrochemistry.- 2004.- V.64.- P.71-78.

124. Gamburzev S. Bifunctional hydrogen peroxide electrode as an amperometric transducer for biosensors / S.Gamburzev, P.Atanasov, A.L.Ghindilis, E.Wilkins, A.Kaisheva, Llliev// Sensors Actuators B. -1997.- V.43, № 1-3.- P.70-77.

125. Chaubey A. Mediated biosensors / A. Chaubey, B. D. Malhotra // Biosens.Bioelectron.- 2002.-V. 17.-P.441-456.

126. Ferapontova E.E. Direct electron transferin the system gold electrode - recombinant horseradish peroxidases / E.E.Ferapontova, V.G.Grigorenko, A.M.Egorov, T.BOrchers, T.Ruzgas, L.Gorton//J. Electroanal. Chem.- 2001.- V.509.- P. 19-26.

127. JOnsson G. An electrochemical sensor for hydrogen peroxide based on peroxidase adsorbed on a spectrographic graphite electrode / G.Jonsson, L.Gorton // Electroanalysis. 1989. V.I.-P.465-468.

128. Presnova G. Direct heterogeneous electron transfer of recombinant horseradish peroxidase on gold / G.Presnova, A.Egorov, T.Ruzgas, A.Lindgren, L.Gorton, T.Borchers // Faraday Discuss.- 2000.- V.l 16.- P.281-289.

129. Ferapontova E. Effect of pH on direct electron transfer between graphite and horseradish peroxidase / E.Ferapontova, E.Puganova // J.EIectroanal.Chem.- 2002.- V.518.- P.20-26.

130. Li J. The electrochemical study of oxidation-reduction properties of horseradish peroxidase / J.Li, S.Dong // J.EIectroanal.Chem. - 1997.- V.431 - P. 19-22.

131. Варфоломеев Д. Конверсия энергии биокаталитическими системами.- М.: Изд-во МГУ, 198L-C.256.

132. Кулис Ю.Ю., Разумас В.Й. Биокатализ в элеюрохимии органических соединений/ Ю.Ю.Кулис, В.Й.Разумас. Вильнюс: Мокслас, 1981.-168 с.

133. Ryabov А. Steady-state kinetics, micellar effects, and the mechanism of peroxidase- catalyzed oxidation of n-alkylferrocenes by hydrogen peroxide / A.D.Ryabov, V.N.Goral // JBIC- 1997.- V.2.- P. 182-190.

134. Sanchez P.D. Peroxidase-ferrocene modified carbon paste electrode as an amperometric sensor for the hydrogen peroxide assay / P.D.Sanchez, J.M.Ordieres, A.C.Garcia, P.T.Blanco / Electroanalysis.- 1991.- V.3, № 9.- P.281-287.

135. Zhang J.Z. Functionalized inorganic-organic composite material derivated by sol-gel for construction of mediated amperometric hydrogen peroxide biosensor / J.Z.Zhang, B.Li, Z.X.Wang, G.J.Cheng, S.J.Dong //Anal.Chim.Acta.- 1999.- V.388.- P.71-78.

136. Ferapontova E. Adsorption of differently charged forms of horseradish peroxidase on metal electrodes of different nature: effect of surface charges / E.Ferapontova, E.Dominguez // Bioelectrochem.- 2002.- V.55.- P.127-130.

137. Wollenberger U. Enzyme electrodes using bioelectrocatalytic reduction of hydrogen peroxide / U.Wollenberger, V.Bogdanovskaya, S.Bobrin, F.Scheller, M.Tarasevich // Anal. 1.etters.- 1990.- V.23.- P. 1795-1808.

138. Sadeghi S.J., Mediated electrochemistry of peroxidases - effect of variations in protein and mediator structures / S.J.Sadeghi, G.Gilardi, A.E.G.Cass // Biosens.Bioelectron.- 1997.- V.12.-P.1191-1198.

139. Pandey P.C. Peroxide biosensors and mediated electrochemical regeneration of redox, enzymes / P.C.Pandey, S.Upadhyay, B.Upadhyay // Anal.Biochem.- 1997.- V.252.- P.136-142.

140. Wang B. Sol-gel thin-film immobilized soybean peroxidase biosensor for the amperometric determination of hydrogen peroxide in acid medium / B.Wang, B.Li, Z.Wang, G.Xu, Q.Wang, S.Dong//Anal.Chem.-1999.-V.71.-P.1935-1940.

141. Yan F. A reagentless amperometric biosensor based on the coimmobilization of horseradish peroxidase and methylene green in a modified zeolite matrix / F. Yan, B. Liu, J. Deng, J. Kong / Anal.Chim.Acta.-1999.-V.386,№ 1-2.-P.31-39.

142. Mizutani F. Amperometric measurement of ds-DNA content using a peroxidase-modified electrode / F. Mizutani, S. Yabuki, Y. Sato, S. lijima // Bioelectrochemistry.- 2004.- V.63.-P.257-259.

143. Kulys J. Kinetics and thermodynamics of peroxidase- and laccase-catalyzed oxidation of N- substituted phenothiazines and phenoxazines / J. Kulys, K. Kxikstopaitis, A. Ziemys // JBIC-2000.- V.5.- P.333-340.

144. Sun W. Electrochemical ELISA for the detection of cucumber mosaic virus using 0- pheneylenediamine as substrate / W.Sun, K-Jiao, S.Zhang//Talanta.- 2001.- V.55.- P.1211-1218.

145. Jiao K. Application of p-phenylenediamine as an electrochemical substrate in peroxidase- mediated voltammetric enzyme immunoassay / K.Jiao, W.Sun, S.-S.Zhang, G.Sun // Anal.Chim. Acta.- 2000.- V.413.- P.71-78.

146. Ruzgas T. Kinetic models of horseradish peroxidase action on a graphite electrode / T. Ruzgas, L. Gorton, J. Emneus, G. Marko-Varga // J.Electroanal.Chem. - 1995.- V.391 - P. 41-49.

147. Volpe G. 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine as electrochemical substrate for horseradish peroxidase based enzyme immunoassays. A comparative study / G. Volpe, D. Compagnone, R. Draisci,G.Palleschi//Analyst- 1998.-V. 123.-P. 1303-1307.

148. Kadnikova E. N. Oxidation of ABTS by hydrogen peroxide catalyzed by horseradish peroxidase encapsulated into sol-gel glass, effects of glass matrix on reactivity / E. N. Kadnikova, N.M.Kostic//J.Mol.Catalysis В.-2002.-V. 18.-P. 39-48.

149. Park T.-M. Sol-gel based amperometric biosensor incorporating an osmium redox polymer as mediator / T.-M.Park, E.I.Iwuoha, M.R.Smyth, R.Freaney, A.J.McShane // Anal.Commun.-1996.-V.33.-P.271-273.

150. Courteix A. Horseradish peroxidase catalyzed hydroxylation of phenol: I. Termodynamic analysis / A.Courteix, A.Bergel // Enzyme Microb.Technol.- 1995.- V.17.- P. 1087-1093.

151. Courteix A. Horseradish peroxidase catalyzed hydroxylation of phenol: II. Kinetic model / A. Courteix, A. Bergel // Enzyme Microb. Technol.- 1995.- V.17.- P.1094-1100.

152. Mathebe N. G. R. Electrochemistry and scanning electron microscopy of polyaniline /peroxidase-based biosensor / N. G. R. Mathebe, A. Morrin, E. I. Iwuoha // Talanta.- 2004.-V.64.-P.115-120.

153. Palecek E. Past, present and future of nucleic acids electrochemistry // Talanta.- 2002.- V.56.-P.809-819.

154. Cheng X. Spectroelectrochemical investigation of direct electron transfer between resting horseradish peroxidase and its oxidation states promoted by DNA / X/Chen, C.Ruan, J.Kong,

155. Deng // Fresenius J.Anal.Chem.- 2000.- V.367.- P.172-177.

156. Ghindilis A. L. Potentiometric immunoelectrode for fast assay based on direct electron transfer catalyzed by peroxidase / A.L.Ghindilis, P.Atanasov, E.Wilkins // Sensors Actuators B.-1996.-V.34.-P.528-532.

157. Marko-Varga G. Development of enzyme-based amperometric sensors for the determination of phenolic compounds / G.Marko-Varga, J.Emneus, L.Gorton, T.Ruzgas / Trends AnaLChem.- 1995.- V.14.- P.319-328.

158. Serra В. Graphite-Teflon-peroxidase composite electrochemical biosensors. A tool for the wide detection of phenoHc compounds / B.Serra, B.Benito, L.Agiii, A.J.Revielo, L.M.Pingarron // Electroanalsis.- 2001.- V.13, №3-4.- P.693-700.

159. Yu J. Phenol conversion and dimeric intermediates in horseradish peroxidase-catalyzed phenol removal from water / J.Yu, K.E.TayIor, H.Zou, N.Biswas, J.K.Bewtra // Environ.Sci. Technol.- 1994.- V.28.- P.2154-2160.

160. Юibanov A.M. Enzymatic removal of toxic phenols and anilines from wastewater / А.М.Ю1Ьапоу, B.N.Alberti, E.D.Morris, L.M.Felshin // J.Appl.Biochem.- 1980.- V.2.- P.414-421.

161. Klibanov A.M. Horseradish peroxidase for the removal of carcinogenic aromatic amines from water / A.M.Klibanov, E.D.Morris // Enzyme Microb.Technol.- 198L- V.3.- P.119-122.

162. Ganjidoust H. Role of peroxidase and chitosan in removing chlorophenols from aqueous solution / ILGanjidoust, K.Tatsumi, S.Wada, M.Kawase // Water Sci.TechnoL- 1996.- V.34.-P.151-155.

163. Arseguel D. Removal of phenol from coupling of talc and peroxidase. Application for depollution of waste water containing phenolic compounds / D.Arseg;uel, M.Baboulene // J. Chem. Technol.Biotechnol.- 1994.- V.61.- P.331-335.

164. Kanungo M. Studies on electropolymerization of aniline in the presence of dodecyl sulfate and its application in sensing urea / M.Kanungo, A.Kumar, A.Q.Contractor // J.Electroanal. Chem.- 2002.- V.528.- P.46-56.

165. Widera J. Electrochemical oxidation of aniline in a silica sol-gel matrix / J.Widera, J.A.Cox // EIectrochem.Commun.- 2002.- V.4.- P.l 18-122.

166. Bagirova N. A. Enzymatic determination of a- and P-naphtols using peanut peroxidase / N.A.Bagirova, T.N.Shekhovtsova, E.A.Shopova, R.B. van Huystee // Mendeleev Commun.-1998.-№4.-P.129-168.

167. Шеховцова Т.Н. Ферментативный метод определения ртути в природной воде / Т.Н. Шеховцова, В.Чернецкая, И.Ф.Долманова // Журн.анал.химии.- 1995.- Т.50, №3.- 309-311.

168. Шеховцова Т.Н. Тест-метод определения ртути на уровне ПДК с использованием пероксидазы, иммобилизованной на бумаге / Т.Н.ШехОБЦова, В.Чернецкая, Н.В.Белкова, И.Ф.Долманова// Журн.анал.химии.- 1995.- Т.50, № 5.- 538-542.

169. Шеховцова Т.Н. Тест-метод определения ртути на уровне ПДК с использованием иммобилизованной пероксидазы / Т.Н.Шеховцова, В.Чернецкая, Е.Б.Никольская, И.Ф.Долманова // Журн. анаи.химии.- 1994.- Т.49, № 8.-С.862-867.

170. Shekhovtsova T.N. Determination of mercury at the picogram per milliliter level using immobilized peroxidase / T.N.Shekhovtsova, S.V.Cheraetskaya // Analyt.Let.- 1994.- V.27, № 15.-P.2883-2898.

171. Shekhovtsova T.N. Determination of organomercury compounds and mercury(II) after their separation by thin-layer chromatography on "Silufol" / T.N.Shekhovtsova, S.V.Migunova, N.A.Bagirova // Mendeleev Commun.- 1997.- V.3.- P. 119-120.

172. Shekhovtsova T.N. Determination of organomercury compounds using immobilized peroxidase / T.N.Shekhovtsova, S.V.Migunova, N.A.Bagirova//Anal.Chim.Acta.-1997.-V.344.-P. 145-151.

173. Zhao J.G. Mediator-free amperometric determination of toxic substances based on their inhibition of immobilized horseradish peroxidase / J.G.Zhao, R.W.Henkens, A.L.Crambliss // BiotechnoLProgr.-1996.- V.12, № 5.- P.703-708.

174. Шеховцова Т.Н. Ферментативный метод определения микроколичеств железа (III) и ряда ингибиторов пероксидазы / Т.Н.Шеховцова, В.Чернецкая, И.Ф.Долманова / Журн. аналит. химии.- 1993.-Т.48,№ 1.-С.129-136.

175. Zaton А. М. L. Horserarish peroxidase inhibition by thiouracils / A.M.L.Zat6n, E.G. Aspuru// FEBS Letters.-1995.- V.374.- P.192-194.

176. Adeyoju O. Kinetic study of the inhibitory effects of methyl isothiocyanate on a peroxidase- modified platinum electrode in non-aqueous media / O.Adeyoju, E.I.Iwuoha, M.R. Smyth // Anal. 1.etters.- 1994.-V.27,№ П.-P.2071-2081.

177. Шеховцова Т.Н. Ферментативный метод определения фенолов с использованием пероксидаз различного происхождения / Т.Н.Шеховцова, А.Л.Лялюлин, Е.И.Кондратьева, И.Г.Газарян, И.Ф.Долманова // Журн. анал. химии.- 1994.- Т.49, №12.- 1317-1323.

178. Gazaryan I.G. Determination of phenols using various peroxidases / I.G.Gazaryan, D.B. 1.oginov, A.L.Lialulin, T.N.Shekhovtsova // Anal.Letters.- 1994.- V.27, №15.- P.2917-2930.

179. Goodson L.H. Monitoring of air and water for епгуте inhibitors / L.H.Goodson,.W.B. Jacobs // Methods Enzymol.- 1976.- V.44.- P.647-658.

180. Guilbault G.G. Electrochemical determination of organophosphoras compounds/ G.G.Guilbault, D.N.Kramer, P.L.Cannon//Anal.Chem.- 1962.-V.34.- P.1437-1441.

181. Snejdarkova M. Acetylcholine biosensor based on dendrimer layers for pesticides detection / M. Snejdarkova, L. Svobodova, D.P.NikoleHs, J.Wang, T.Hianik // Electroanalysis.- 2003.-V.15.-P.1185-1191.

182. Gogol E. Amperometric biosensors based on nafion coated screen-printed electrodes for the determination of cholinesterase inhibitors / E.V.Gogol, G.A.Evtugyn, J.-L.Marty, H.C.Budnikov, V.G.Winter// Talanta.- 2000,- V.53.- P.379-389.

183. Jdanova A.S. Conductometric urea sensor. Use of additional membranes for the improvement of its analytical characteristics./Jdanova A.S., Poyard S., Soldatkin A.P., Jaffrezic-Renault N., Martelet С / Anal.Chim.Acta.- 1996.- V.321.- P.35-40.

184. Evtugyn G.A. Amperometric flow-through biosensor for the determination of cholinesterase inhibitors / G.A.Evtugyn, A.N.Ivanov, E.V.Gogol, J.L.Marty, H.C.Budnikov // Anal.Chim.Acta.-1999.-V.385,№ 1-3.-P.13-21.

185. Yang Y. Inhibition biosensor for determination of nicotine / Y.Yang, M.Yang, H.Wang, 1..Tang, G.Shen, R.Yu // Anal.Chim.Acta.- 2004.- V.509.- P. 151-157.

186. Pavlic M. The inhibitory effect of Tris on the activity of cholinesterases.// Biochim. Biophys. Acta.- 1967.- V.139,№1.- P.133-137.

187. Ivanov A.N. Comparative investigation of electrochemical cholinesterase biosensors for pesticide determination / A.N. Ivanov, G.A. Evtugyn, R.E. Gyurcsanyi, K. Toth, H.C. Budnikov //Anal.Chim.Acta.- 2000.-V.404.- P.55-65.

188. Nunes G.S. Determination of carbamate residues in crop samples by cholinesterase-based biosensors and chromatographic techniques /G. S. Nunes, P. Skladal, H. Yamanaka , D. Barcelo //Anal.Chim.Acta.- 1998.-V.362.- P.59-68.

189. Karyakin A. A. Prussian Blue-based 'artificial peroxidase' as a transducer for hydrogen peroxide detection. Application to biosensors / A. A. Karyakin, E. E. Karyakina // Sensors Actuators В.-1999.- V.57.- P.268-273.

190. Ricci F. Characterisation of Prussian Blue modified screen-printed electrodes for thiol detection / F.Ricci, F.Arduini, A.Amine, D.Moscone, G.Palleschi // J.Electroanal.Chem.- 2004.-V.563.- P.229-237.

191. Bucur B. Affinity methods to immobilize acetylcholinesterases for manufacturing biosensors / B.Bucur, S.Andreescu, L-L.Marty // Anal. Letters.- 2004.- V.37, № 8.- P.1571-1588.

192. Kremzner L.T. A partial characterization of acetylcholinesterase / L.T.ICremzner, LB. Wilson//Biochemistry.-1964.-V3, №12.-P. 1902-1905.

193. Evtugyn G.A. The application of cholinesterase potentiometric biosensor for preliminary screening of the toxicity of waste waters / G.A.Evtugyn, E.P.Rizaeva, E.E.Stoikova, H.C. Budnikov // Electroanalysis.- 1997.- V.9, № 14.- P.l 124-1128.

194. Стойкова E.E. Экспресс-определение загрязнителей 01фужающей среды с помощью ферментативных колориметрических тестов / Диссертация ... канд.наук., Казань, 1997. -167 с.

195. Skladal P. Sensitive detection of pesticides using amperometric sensors based on cobalt phthalocyanine-modified composite electrodes and immobilized cholinesterases / P. Sklddal M. Mascini // Biosens. Bioelectron.-1992.- V.7.- P.335-343.

196. Jeanty G. Detection of paraoxon by continuous flow system based enzyme sensor /G. Jeanty, J.L.Marty// Biosens.Bioelectron.- 1998.- V.13.- P.213-218.

197. Fennouh S. Increased paraoxon detection with solvents using acetylcholinesterase inactivation measured with a choline oxidase biosensor /S.Fermouh, V.Casimiri, C.Burstein // Biosens. Bioelectron.- 1997.- V.12.- P.97-104.

198. Dzyadevych S. V. Assessment of the toxicity of methyl parathion and its photodegradation products in water samples using conductometric enzyme biosensors /S. V. Dzyadevych, A. P. Soldatkin and J.-M.Chovelon // Anal.Chim.Acta.- 2002.-V.459.- P.33-41.

199. Bemabei M. Determination of organophosphorus and carbamic pesticides with a choline and acetylcholine electrochemical biosensor / M.Bemabei, C.Cremisini, M.Mascini, G.Palleschi //AnaLLetters.- 1991.-V.24,№ 8.-P.1317-1332.

200. Further analysis on presence of residues and impact of plant protection products in EU. / European Commission and Dutch Ministry for the Environment, 1997.- 307 p.

201. FQPA-targeted pesticide residue study. Michigan University - EPA. Michigan, 1999. 91 p.. Report on integrated pest management and related activities supported by the United States department on agriculture./ USDA NAPIAP Sub-Committee. May 1998. 21 p.

202. Saby С A biosensor system for chlorophenols using chloroperoxidase and a glucose oxidase based amperometric electrode / C.Saby, J.H.T.Luong // Electroanalysis.- 1998.- V.IO, №1.-P.7-11.

203. Kenausis G. Electrochemical glucose and lactate sensors based on "wired" thermostable soybean peroxidase operating continuously and stably at 37 С / G. Kenausis, Q.Chen, A.Heller// AnaLChem.-1997.- V.69, № 6.- P. 1054-1060.

204. Gavalas V.G. Improved operational stability of biosensors based on enzyme-polyelectrolyte complex adsorbed into a porous carbon electrode / V.G.Gavalas, N.A.Chaniotakis, T.D.Gibson // Biosens.Bioelectron.-1998.-V.13,№ 11.-P.1205-1211.

205. Thevenot D.R. Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification / D.R.Thevenot, K.Toth, R.A.Durst, G.S.Wilson//Pure Appl.Chem.-1999.- V.71.- P.2333-2348.

206. Евилевич А.З. Утилизация осадков сточных вод / А.З.Евилевич, М.А.Евилевич. Л.: Стройиздат, 1988.- 248 с.

207. Mantha R. Treatment of wastewaters containing anilines using enzymes: an overview / ILMantha, N.Biswas, K.E.Taylor, J.K.Bewtra // CSCE/EWRI of ASCE Environmental Engineering Conf. Niagara 2002.- P.37-46.

208. Hikuma M. Amperometric estimation of BOD by using living immobilized yeasts / M. Hikuma, H.Suzuki, T.Yasuda, I.Karube, S.Suzuki // Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechn.- 1979.-V.8.- P.289-297.

209. Strand S.E. Rapid BOD measurement for municipal wastewater samples using a biofilm electrode / S.E.Strand, D.A.Carlson // J.Water.Pollut.Control.Fed.- 1984.- V.56.- P.464-467.

210. Situmorang M. Electrodeposited polytyramine as an immobilisation matrix for enzyme biosensors / M.Situmorang, J.Gooding, D.B.Hibbett, D.Bamett // Biosens.Bioelectron.- 1998.-V.13.-P.953-962.

211. Situmorang M. Development of potentiometric biosensors using electrodeposited polytyramine as the enzyme immobilization matrix / M.Situmorang, J.J.Gooding, D.B.Hibbert, D.Bamett / Electroanalysis.- 2001.- V.13.- P. 1469-1474.

212. BCarpinska J. Simultaneous quantification of promazine hydrochloride and its sulfoxide in pharmaceutical preparations // Anal.Sci. - 2001.- V.17.- P.249-253.

213. Leeder J. S. High pressure liquid chromatographic analysis of ceftazidime in serum and urine / J.S.Leeder, M.Spino, A.M.Tesoro, S.M. MacLeod // Antimicrobial Agents Chemother.-1983.-V.24.-P.720-724.

214. Rowell F.J. Rapid immunological assay methods for ceftazidime and alcalase in the workplace atmosphere / F.J.Rowell, C.Farrell, I. Nitescu, R.H.Gumming, I.W.Stewarts // J. Aerosol Sci.- 1997.- V.28, №3.- P.493-499.

215. Estevez-Alberola M.-C. Immunochemical determination of xenobiotics with endocrine disrupting effects / M.-C. Estevez-Alberola, M.-P. Marco // Anal.Bioanal.Chem.- 2004.- V.378.-P.563-575.

216. Mozaz S.R. Biosensors for environmental monitoring of endocrine disruptors: a review article / S.R.Mozaz, M.-P.Marco, M.J.Lopez de Alda, D.Barcelo // Anal.Bioanal.Chem.- 2004.-378.- P. 588-598.

218. Mart'ianov A.A. Preparation of antibodies and development of enzyme-linked immunosorbent assay for nonylphenol / A.A.Mart'ianov, A.V.Zherdev, S.A.Eremin, B.B.Dzantiev // Intem.J.Environ.Anal.Chem.- 2004. DOI: 10.1080/03067310410001729024.