Поиск взаимосвязи между структурой веществ и их биологической активностью на примере анализа антибактериального действия бета-лактамных антибиотиков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова Химический факультет

На правах рукописи

ш-5птш зз

Пятраускас Аианас Алано

Понср взаимосвязи между структурой веществ и их биологической активностью на примере анализа антибактериального действия /з-лактанных антибиотиков

(о2.о0.15-химическая кинетика и катализ, оз.оо.о4-биохимия)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВа - 19 92

Работа выполнена в секторе биокинетики института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского и на кафедре химической энзиыологии Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Научный руководитель: -. доктор химических наук В.К.Швядас

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Б.И.Курганов доктор химических наук, профессор О.М.Полторак

Ведущая организация:

Всероссийский научный центр по антибиотикам - Всероссийский научно-исследовательский институт антибиотиков

Защита состоится " 3 " марта 1ээг г. в час, на

заседании специализированного совета Д.053.05.76 в Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: И3899, ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 'чЗ "

19у2 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат химических наук

О.А.Кост

Характеристика работы

Актуальность проблемы. Установление взаимосвязи между структурой и активностью является основным способом поиска новых, лекарственных веществ. Все в настоящее время известные методы'решения этой проблемы, так назывемые хемометрические методы, направлены на установление чисто эмпирических зависимостей конечного биологического эффекта от структуры исследуемых веществ. Однако, в последнее время с накоплением; достаточно большого количества эмпирических данных, становится очевидным, что без установления детального механизма биологического действия исследуемых веществ невозможно найти универсальный алгоритм оптимизации их структуры.

Действительно, руководствуясь традиционными способами поиска новых лекарственных веществ, в среднем из нескольких тысяч новых синтезированных веществ лишь одно оказывается ценным фармацевтическим препаратом. Это в полной мере относится к р-лактамным антибиотикам. К настоящему времени уже синтезировано несколько десятков тысяч представителей этого класса, однако, реально применяется в качестве фармацевтических препаратов лишь несколько десятков.

Цель работы. Целью настоящей работы является разработка общих принципов поиска взаимосвязи между структурой веществ и их биологической активностью на примере анализа антибактериальной активности /з-лактамных антибиотиков. Для этого требовалось:

а) разработать способ выбора оптимальной кинетической модели, описывающей экспериментальные данные по конечным биологическим откликам исследуемых веществ в рамках экспериментальной погрешности,

б) найти достаточно общий способ количественного описания энергий межмолекулярных взаимодействий исследуемых соединений,

в) на основании результатов анализа пунктов (а) и (б) разработать теоретически обоснованную методологию поиска взаимосвязи между экспериментально определенными значениями биологической активности исследуемых веществ и их физико-химическими свойствами,

г) применить эту методологию для количественного описания кинетического механизма бактериостатического действия р-лактамных антибиотиков.

Практическое значение. Работа выполнена в рамках темы 4-306

Г

Государственной приоритетной научно-технической программы "Новейшие метода биоинженерии", раздел "Инженерная энзимология".

Научная новизна. Показано, что энергия межфазового распределения в любых двухвазных гомогенных системах может быть количественно описана линейкой комбинацией четко определенных физико-химических параметров исследуемых веществ. Разработан подход при-, менения этих параметров для количественного описания энергий взаимодействия в исследуемых фермент-субстратных системах б рамках формализма линейных соотношений свободных энергий (ЛССЭ). Предложен способ выбора оптимальной кинетической модели, описывающей экспериментальные данные по конечным биологическим откликам исследуемых веществ в рамках экспериментальной погрешности. Впервые проведен детальный количественный анализ основных элементарных стадий биологического механизма антибактериального действия р-лактамных антибиотиков и выявлены кинетически лимитирующие стадии в ингибировании роста определенных видов бактериальных клеток пенициллинаюг и.цефалоспоринами.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Международной конференции "Физическая химия ферментативного катализа", Таллинн, 1987 г., и Международной конференции молодых ученых "Молекулярные основы биотехнологии", Пущино, 1987 г., Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология", Москва, 1991 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Обьем работы. Диссертационная работа состоит из введения, постановки общей задачи, обзора литературы, экспериментальной части, теоретической части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (268 наименований). Работа изложена на 186 страницах машинописного текста, и включает 22 таблицы и 17 рисунков. г

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ • I. Постановка общей задачи. Пусть существует набор таких параметров субстрата ххк, которые в некоей функциональной зависимости описывают экспериментально определяемое химическое или биологическое свойство этих субстратов у:

У = Лс,.....С2,х1 , . . . ,хк) (I)

где коэффициенты с,.....сг зависят только от свойства у, а параметры .....хк зависят только от структуры исследуемого субстрата, При условии, что активность V.экспериментально померена для достаточно широкого набора субстратов,. для которых все значения х.\к известны, и известен вид функции коэффициенты < п.... могут быть найдены путем многопараметровой нелинейной регрессии. Нашей целью является найти способы определения параметров .....хк и функции

В поиске функциональной зависимости (I) наиболее естественно

за основу взять экстратермодинамический принцип линейных соотно-

аении свободных энергий (ЛССЭ): "к

1о?к - а + ) а..х. , ' (2)

^ 1 '-> и I I »

I«1

где к1 является элементарной костантой 1-го свойства (1-ая элементарная константа скорости), а все ао,а1,... ,ак являются линейными регрессионными коэффициентами. Основная сложность применения принципа ЛССЭ для описания биологическои активности исследуемых соединении заключается в сложности биологических систем. Очевидно, что конечный биологический отклик действия лекарства является результатом множества последовательных или разветвленных элементарных стадии взаимодействия с разными компонентами биосистемы. Каждая из этих стадий может оказаться кинетически определяющей для любой новой структуры лекарства. Поэтому линейные соотношения (2) между конечным биологическим откликом л- и параметрами субстрата • ,.....-ч могут наблюдаться лишь в очень частных случаях.

например, когда активность всех исследуемых субстратов определяется одной и той же кинетически лимитирующей стадией.

С другой стороны, механизм действия субстратов на любой сложный биологический объект, равно как и любая сложная чисто химическая реакция, может быть описана адекватно сложной кинетическом схемой. При условии, что детальный механизм исследуемого процесса известен, или существует достаточно общая его модель, экспериментально наблюдаемая константа у может быть выражена в в;:де кинетического уравнения:

' у = К(Х, (О! , . . .X (О) , к .....к ) ;3)

1 II 1 ш

■Здесь к, (о I,.. .хп (о) представляют собой начальные концентрации кинетически важных компонент общей . кинетическои схемы, а

о

к.....кт - элементарные константы. Считая, что мы имеем полный

набор параметров субстрата х,.....хк, которые з линейной комбинации описывают любые элементарные константы к ...,к , после вы-

к -

ражения каждой к , через ехрЦа}0 + £ aj .х. )1п10} мы

1 • 1

получим необходимую количественную взаимосвязь структура - активность (I).

3. Описание свойств общей кинетической модели. Пусть молекулярный механизм биологического действия ряда исследуемых веществ описывается какой-то кинетической схемой, включающей т элементарных реакций, протекающих между п внутренних частиц хг,х2.....хп.

Зги частицы могут представлять как разные формы молекул субстрата (например, молекулы субстрата в фазах внеклеточной среды, мембраны или органеллы, связанные ковалентно или нековалентно с рецептором, и т.д.), так и разные кинетически важные компоненты биологической системы (например, ключевые рецепторы, ферменты, катализирующие деградацию молекул субстрата, и т.д.). 1-ая элементарная реакция представляет собой реакцию между молекулами вещества Х1' "¡г молекулами вещества х2, и т.д., с образованием молекул вещества х1, р молекул вещества х2, и т.д.:

" к "

I "¡А ~~^ I рихк' 1=1,2.......

к■1 к-1

Здесь «1к, р1к являются неотрицательными целыми числами. Пусть скорость биологического отклика ию определяется скоростью образования п-ого вещества, т.е. u(t)=axn(t)/вt. Тогда кинетический закон скорости биологического отклика будет определяться системой дифференциальных уравнений:

п

па

аак(1)/а! = 2 (Р1к-о1к)к4 П к=1,2,...,п (4)

в я 1

Считая, что все элементарные константы к. формально могут' быть выражены через параметры субстрата уравнением ЛССЭ (2), в общем случае решение системы (4) будет зависеть от ххк и Однако, в литературе общепринято биологическую активность вещества считать "не зависящей от времени", и характеризовать начальной его концентр>ацией, вызывающей стандартный биологический отклик при фиксированном моменте времени. Такие экспериментальные

данные являются достаточно информативными, если vtt,t2e(0;+i>) выполняется неравенство t, )-u< t2) | <£ (здесь с. есть экспериментальная погрешность). По крайней мере, это неравенство должно выполняться для t,,t2e[tQ;+®). Другими словами, это означает, что экспериментальные данные должны были быть получены в условиях, близких к стационарным. В математическом смысле это неравенство выполнимо, если существует предел цш u(t)=<A а следовательно, и

t-MD

пределы

lim X (t)=X* i=l,2...,n-l (5)

Легко показать, что для таких кинетических схем ненулевое решение и* существует только тогда, когда дополнительно к системе дифференциальных уравнений (4) существует хотя бы одно уравнение материального баланса. Кроме того, очевидно, что искомые соотношения структура - активность могут быть получены в виде явных алгебраических выражений только в- тех случаях, когда общая кинетическая схема включает лишь реакции первого.или псевдопервого порядков.

Анализ таких кинетических схем, включающих лишь реакции (псевдо)первого порядка и удовлетворяющих условию (5), привел к следующим выводам:

1) Все кинетические схемы, включающие не больше чем п компонент х1,...,хп, могут быть подразделены лишь на ограниченное число классов в зависимости от вида уравнения материального баланса. Внутри каждого класса кинетических схем существует такая общая кинетическая схема (т.н. завершенная кинетическая схема), что все остальные схемы являются ее частными случаями.

2) Для всех возможных завершенных кинетических схем легко получить соответствующее кинетическое уравнение, а, следовательно, и необходимую функциональную зависимость структура - активность (I).

Каким образом можно найти "минимальную" кинетическую схему и, следовательно, наиболее простую взаимосвязь структура - актив-, ность, которая описала бы биологическую активность исследуемых веществ в рамках экспериментальной погрешности? В литературном обзоре показано, что до сих пор полученные экспериментальные зависимости конечного биологического отклика от структурных пара-

метров субстрата описываются двух-четырех-фазовыми кривыми. Следовательно, разумно предположить, что большинство типов биологической активности можно моделировать кинетическими схемами. Включающими не более четырех элементарных стадий. Идеальный алгоритм поиска оптимального уравнения должен включать последовательный регрессионный анализ всех возможных уравнений структура - активность с последующим сравнением полученных статистических результатов. Принципиальная схема такого алгоритма приведена на схеме I. Здесь и* обозначает г-тую завершенную функцию структура - ак-

дп .

тивность, характеризующую кинетические схемы с п компонентами и зависит от п и меняется от 1 до р<п)-1, где Р(п) - некая функция, хорошо известная в теории чисел). Так как нашей целью является найти "минимальную" кинетическую модель, разумно начать анализ с п=2 (р|2 >-1=1). Оптимизируемую функцию следует усложнять до тех пор, пока она не будет соответствовать следующим критериям:

1) стандартная ошибка предсказанных активностей (с.о.) не должна превышать экспериментальной погрешности (О;

2) оптимизированные коэффициенты {а.} должны иметь разумные величины; в идеальном случае возможные интервалы варьирования

Схема I. Принципиальный алгоритм поиска, взамосвязи структура-активность .

этих коэффициентов следует определить в отдельных экспериментах, каждый раз описывая все предполагаемые элементарные стадии уравнениями (2).

3. Определение структурных параметров субстрата {х): анализ межмолекулярных взаимодействий. В настоящее время в фармацевтической химии межмолекулярные взаимодействия общепринято количественно выражать всего лишь одним параметром субстрата - "гидрофоб-ностью". Количественной мерой гидрофобности считарт энергию распределения в разных водно-органических системах. Например, считается, что в системе вода/н-алканы лучше всего моделируются грг полярные взаимодействия, в системе вода/трихлорэтан - полярные, а в систсме вода/октанол - специфические. Естественно, возникает вопрос: можно ли распределение в этих многообразных водно-органических системах описать при помощи единого для всех случае]} подхода? С этой целью мы проанализировали литературные данные по энергиям межфазового распределения для 5-ти тысяч веществ ,в 39-ти водно-органических системах, а также данные по параметрам растворимости Оствальда, Гильденбрандта и параметрам Генри. 1

Следуя теории Периотти, общую энергию перехода м!элекулы субстрата из одной конденсированной фазы в другую можно рассматривать в виде суммы энергий двух последовательных процессов: на первой стадии - образование полости в конденсированной фазе (дос); на второй стадии - перенос частицы в полость и осуществление непосредственных взаимодействий между фазой и частицей (Дб,): Дото1«1=Дас+л<311 Энергию образования полости можно представить как степенную функцию от радиуса сферы молекулы: лсс=|1ггэр+4пг2т(1-— ). Здесь Р обозначает давление, у - поверхностное натяжение, б - поправочный коэффициент, отражающий зависимость поверхностного натяжения от кривизны поверхности полости. Первое слагаемое представляет работу объемного вытеснения жидкости, а второе слагаемое - работу поверхностного натяжения при образовании полости. В случае, когда молекула исследуемого вещеСта представляет собой несимметричное тело, параметры г, г2 и г3 можно заменить соответсвуицими степенными функциями общей площади поверхности и/или молекулярного обьема.

Энергию взаимодействия молекулы и фазы можно представить/ как сумму полярных, дисперсионных и специфических взаимодействий.

Здесь представлена одна из возможных записей общей энергии межмолекулярных взаимодействий в виде комбинации классических уравнений London'a, Debye, Keesom'a, а ТЭКЖе КОМбИНЭЦИИ СОЛЬВЭТОХрОМНЫХ

параметров кислотности-основности, моделирующих специфические взаимодействия:

3 ItI2ei(X2 2 »гУг ^«VzV ....

AG ---—---——2_!_+а 'в'+ав.

Т°1" 2 (I, + I2)r6 3 кТг6 г6 12 21

Здесь к, Т, Г, 11(2). ki(2), а1(2), «*1(2). э;(2). представляют, соответственно,.константу Больцмана, температуру, эффективный радиус взаимодействия, первый потенциал ионизации, дипольный момент, среднюю поляризуемость, параметры кислотности и основности взаимодействующих молекул. Все параметры с индексами i характеризуют свойства молекулы распределяемого вещества, а параметры с индексами г - разность свойств конденсированных гомогенных фаз.

Понятно, что при постоянстве свойств гомогенных фаз и варьи-роровании молекулы субстрата доГо1л1 должна описываться линейной комбинацией поляризуемости, квадрата дипольного момента и параметров кислотности и основности. Сложность заключается в том, что существует великое множество способов количественно выражать каждый из этих типов взаимодействия. Анализ всех нами собранных данных по энергиям межфазовых распределений показал, как представ-ленно в табл. I, что, в общем случае, для описания поведения исследуемых веществ необходимо использовать линейную комбинацию следующих сруктурных параметров: молекулярного объема v , дисперсионных взаимодействий vx*pf, возбужденной поляризуемости s, кислотности а, основности э и параметром 5, учитывающим степень ко-валентности водородной связи.

4. Установление взаимосвязи между структурой р-лактамных антибиотиков и их антибактериальными свойствами. В настоящей главе продемонстрировано реальное применение вышеизложеного алгоритма установления взаимосвязи структура-активность на примере анализа антибактериальной активности р-лактамных антибиотиков. Для этого, по аналогии с постановкой глобальной задачи, необходимо решить следующие проблемы:

I) параметризовать способность р-лактамных антибиотиков вступать в межмолекулярные взаимодействия (т.е. найти те структурные параметры х, которые в рамках уравнения (I) описывают

ю

Таблица I. Репрезентативные результаты описания энергий межфазного распределения в водно-органических системах уравнением

1овР=а0+а1Уя+а2У|РР+аэ«+аХ+а5а^+а(.Э" + а7<;.

ирганичес-кая фаза ао а1 »2 аэ а4 а5 аб а7 ж Г ' ь п

п-октанол 0.12 0.38 0.02 -0.1 .005 -0.4 -4.9 0.8 0.98 101

¡.-бутанол 0.41 -1.4 6.25 -2.6 0.02 -1.2 0.14 -0.7 0.99 11

бензол 0.13 0.04 1.45 -0.5 0.04 -3.7 -4.7 0.18 0.97 24

ц-гексан 0.28 0.46 0.04 -0.6 0.01 -5.4 -6.8 1.66 0.98 17

п-гексан 0.15 0.41 0.14 -0.2 -.02 -4.3 -6.9 1.24 0.98 109

оливк.масло -0. 78 0.47 -0.2 0.48 0.-05 -1.6 -5.1 0. 04 0.96 28

хлороформ -0. 53 0.59 -0.5 0.58 0.01 -3.6 -3.3 0.65 0.99 29

СС14 0. 73 0.34 0.36 0.43 0.06 -3.7 -7.3 0. 59 0.99 27

а Коэффициент корреляции. ь Количество точек.

все элементарные стадии биологического действия субстратов);

2) выделить ключевые стадии механизма антибактериального действия исследуемых веществ, и описать эти стадии уравнениями (2);

■ 3) сравнить результаты анализа в пункте (2) с результатами анализа конечного биологического отклика.

4.1. Гидрофобность р-лактамных антибиотиков: объяснение и предсказание их поведения в разных водноорганических системах и обращеннофазовой хроматографии. Большинство представителей Р-лактамных антибиотиков обладают сложными, малохарактеризован-ными химическими структурами, для которых отсутствуют интересующие нас количественные параметры {х}. Поэтому в настоящей работе были собранны и проанализированны все в литературе доступные данные по энергиям межфазового распределения в разных водноорганических системах и системах обращеннофазовой хроматографии. Оказалось, что для описания склонности исследуемых антибиотиков вступать в разного рода межмолекулярные взаимодействия достаточно лишь одного параметра дисперсионных взаимодействий, э все проанализированные реакционные серии между собой линейно связанны. Поэтому энергии межфазового распределения р-лактамных антибиотиков в

разных системах были приведены к единой шкале дисперсионных взаимодействий / . , основой которой послужил! значения iogp в

Common ,

водно-октанольной системе для амидов С6(7)-ациламидных фрагментов пенициллинов и цефалоспоринов. Было показано, что для многих /з-лактамных антибиотиков значения f иогут -быть точно поде-

Common

читаш применяя простое правило аддитивности:

^Сотюоп"^С6 (С? ) +^Nuc Ik I *

где fChV п представляет инкремент С6(7)-радикала, а /Иис1е) -ядра антибиотика. На первый взгляд может показаться странной такая простота соблюдения однопараметровых линейных зависимостей в ряду р-лактамных антибиотиков, в то время как в общем случае для описания энергий межфазового распределения требуется учет сразу нескольких параметров структуры субстрата.' Более того, оказалось, что энергии межфазного распределения д-л'актамов строго зависят от эксперимертальных условий (например, концентрации антибиотика в органической фазе) (см. табл. 2). 1акое аномальное поведение исследуемых антибиотиков было.количественно обьяснено простои тер-модинамическси моделью, учитывающей ассоциацию молекул антибиотика. На рис. I. показано, что из-за противоположного направления дипольных моментов и взаимного нивелирования кислотных и основных свойств молекул ассоциирующихся антибиотиков, димерные аддукты неспособш вступать,в разного рода.полярные и специфические взаимодействия, и, т. о.. становится понятным простота соблюдения вышеупомянутых однопараметровых соотношении.

«¿»-О н-0-soCv H-O-wCv ¿-JOC*

;я.ииия ;-.;«кгг*ков: нивелирование склонности к поляр- :• •; иавдическин Бзс-имодеаствиям.

Таблица 2•

Зависимость наклона « в. уравнении ic^p =.т +.«, j. от

* г ^ ubi; 41 1 . 2 t iMiimun

условий межфазного распределений р-лактамов.

Орг. фаза Ионная форма Диапазон изменения Jog Р к о b s Наклон Предсказанная величина

IX . 1 а,

/5-лакт. ■ антибиот. Инертные" соединения

п-Октанол Нейтр. 1-3 О.838 1 .000 0.838 0.8

п-Октанол Нейтр. 1-3 0 . 772 1.000 ' 0 7 7 2 0.8

п-Октанол Нейтр. 1 - 3 0.751 1 .000 0. 751 а. 8

п-Октанол Нейтр. 0 + 4 . 0.725 1 .000 0. 72 5 0.8

п-Октанол Анион 0*4 0". 731 . 1 .ООО 0.731 0.8

1-Бутанол Анион -2.0* -0.2 1 .263 0.697 1.812 1 .6

1-Бутанол Анион 0-4 0.557 0.697 0. 799 0.8

1-Бутанол Анион 0 - 1 0.512 0.697 0. 735 0.8

п-Бутанол Анион 0-2 0. 465 0.697 0.667 0.8

Хлороформ Анион 1 + 3 1. 306 1 .276 . 1.02-1 1 .0

Хлороформ Нейтр. 1+3 1.208 1 .276 0.947 1 .0

Хлороформ Анион + N811* 1 + 3 1 . 266 1 .276 0.992 ' 1.0

а Для не ' р-лактамных соединений, энергия межфазового

распределения которых описывается всего лишь одним параметром. ь Величина, предсказанная исходя из термодинамической модели межфазного распределения, учитывающей ассоциацию молекул Э-лактамов.

4.2. Кинетическая модель антибактериального действия р-лактамов. Бактериостатическое действие р-лактамных антибиотиков включает следующие основные стадии: проникновение антибиотика через внешнюю мембрану (в случае а(-)-активности) из внеклеточного пространства в периплазматическую среду, взаимодействие с рецепторами (пенициллин-связыващими белками), взаимодействие с разными р-лактамазами и низкомолекулярными бактериальными компонентами, выступающими в качестве внешних■нуклеофилов и общекислотных катализаторов, приводящее к химической деградаций антибиотика с потерей его бактерицидных свойств.

4.2.1. Химическая деградация антибиотиков. Взаимодействие р-лактамов с внешними нуклеофильнкми агентами можно изобразить реакцией, приведенной на рисунке 2. Анализ показал, что все в литературе доступные данные по константам скорости химической межмолекулярной деградации з-метилензамещенных цефалоспоринов.описываются следующим полилинейным выражением:

з

logk(M"2s"1)=-5.65--Щ- ( 1.57 + 2.0511/2-0.044рКа1-0.49рКаг + -0.048рКа1рКаг-0.0095рКа1рК>2СТ1 ) , n=305, r=0.993, s = 0.06. (7)

Здесь Рка1 и Рка2 представляют собой константы кислотности-основности, соответственно, внешнего нуклеофила и общекислотного катализатора, at - параметр индуктивного влияния СЗ*-заместителя, i - ионную силу, т - температуру. При этом интервалы варьирования УСЛОВИЙ бЫЛИ СЛеДУЮЩИМИ: Т=278-333°К, 1=0.0+1.0МКС1,

pKat = -1.74+15.0, <^ = 0 . 0+1. 05. ВИДНО, ЧТО С7-ЭМИДНЫЙ ЗЭМеСТИТвЛЬ

не оказывает никакого электронного влияния на константу гидролиза пенициллинов и цефалоспоринов. Поэтому уравнение (7) описывает реакционную способность всех iß- и сз'-замещенных цефалоспоринов, Способных к внутримолекулярной деградации. В случае 7-«-замещенных цефалоспоринов в соотношении (7) коэффициенты а., i=i,...,6 сохраняют свои значения, а стерический свободный член ао изменяется ОТ -5.-6 5 до -6.31.

Гидролиз пенициллинов описывается следующим общим соотношением:

logkl М" 2s" 1 ) =-5 . 90- -Мр- ( 1 .3 6 + 2 . 231 1/2-0.032рКа1-0. 51рКа2 + + 0 . 032pKalplva2 ), n=289, г = 0 .995, з = 0.05. (8)

Так как состав биологической системы (т.е. точные концентрации всевозможных нуклеофилов и обцекислотных-общеосновных катали-

Nu, ОН Nu,.

* о ~ R,

Рис. 2. Химическая деградация р-лактамов.

заторов в периплазматической среде) заранее неизвестен, уравнения (7,8) следует рассматривать в рамках соотношения (2), считая, что все регрессионные коэффициенты (а) зависят от свойств биологической системы. Особый смысл соотношений (7,8) состоит в том, что они позволяют определить интервалы изменения этих коэффициентов {а} в (2). Например, полагая, что сколько-нибудь существенный вклад в процессе химической деградации р-лактамов вносится нукле-офилами с Рка1=7-15, 'ркж2=-1.54-9 при з7°с, и полагая, что в среде биологической системы i=o-im, из соотношения (7) получаем, что коэффициент при о( в з-метилензамещенных цефалоспоринах может ¡женятся в интервале а =-0.33-1.13.

I

4.2.2. Транспорт через внешнюю мембрану и диффузионные свойства. Рассматривая возможные пути проникновения молекул антагониста в периплазматическую среду, следует различать пассивный и активный транспорт. В настоящей работе показано, что в случае пассивного транспорта константа скорости диффузии молекул антибиотиков через внешнюю мембрану должна списываться следующим простым выражением:

logl.- =о +alog(V +a,)+o,fr , (9)

' J i Г f U 1 * 2 JCommon

где слагаемое atiog(vx+a2) отражает вклад чисто диффузионной сос-. тавляющей, а а3/С0„„0„ - инкремент энергии межмолекулярных взаимодействий в общую константу скорости диффузии. Сопоставляя результаты обработки литературных данных, приведенные в табл.3, видно, что уравнение (9) описывает проницаемость антибиотиков через мембраны вне зависимости от наличия или отсутствия в них трзнсПортных белков, а относительные зкладк диффузионной составляющей и составляющей энергии межмолекулярных взаимодействий определяются лишь фосфолипидно-липополисахаридным составом мембраны.

Таблица 3. Корреляционные параметры транспортных свойств /з-лактамов (согласно ур.9).

Вид мембраны Транспортные белки [липополисахариды] ao a2 a3 n г

[(рОСфОЛ1ШИДЫ]

липосомы OmpF 0.09 0.03 0.58 0 -0.35 29 0.966

липосомы OmpC . 0.00 -4 .86 0 0 -0.34 8 0.955

ЛИПОСОМЫ PhoE ' 0.00 . -5.33 0 0 0.28 5 0.939

ЛИПОСОМЫ - 0.00 -4.35 0 0 -0.43 12 0.983

ЛИПОСОМЫ - 0.06 -5.03 0.56 1.5E-4 -0.38 24 0.997

ЛИПОСОМЫ - 0.13 -4.14 0.98 1.3E-4 -0.28 24 0.999

E.coli YA2X OmpF,OmpC -5.97 0.33 0.00 -0.66 14 0.980

E.coli YA21C1 -6.93 0.45 3.4E-4 -0.44 14 0.982

E.coli YA21-6 OmpF,OmpC -5.82 0.37 2.5E-4 -0 . 57 14 0.989

E.coli YA21-6 OmpF,OmpC -5.82 0.35 117 -0.57 14 0.985

P.alcalifaciens IN-06 37K.40K -4 .02 0 0 -0.32 11 0.997

P.rettgeri BE-18 37K.40K -4. 74 0 0 -0.81 11 0.970

P.rettgeri RE-18C1 40K -4.84 0 0 -0.25 11 0.922

P.mirabilis N-51 40K ,41K -5 . 7ô 0 0 -0.29 11 0 . 939

P.mirabilis N-51C1 41K -5.22 0 0 -0.39 11 0. 965

P.vulgaris K22-2 37K.40K -4.55 0 0 -0. 70 11 0.987

P.vulgaris K22-2C1 40K -4.37 0 0 -0.44 11 0.977

H.morganii 1510/9 37K -4 . 28 0 0 -0.39 11 0.95 1

M.morganii 1510/9C1 38K -4.00 0 0 -0.29 11 0.953

B.fragilis G-210 -4.02 0 0 -0.09 5 0. 906

B.fragilis G-237 - -4.17 0 0 -0.18 5 0.928

B.fragilis G-242 -4.19 0 0 -0. 12 5 0 . S33

4.2.3. Взаимодействие с р-лактамазами и пенициллин -связывающими белками. В настоящей работе показано, что экспериментально измеряемые энергии фермент-субстратного взаимодействия можно представить в виде суммы энергии чисто химических межмолекулярных взаимодействий Y Y а, х, и энергии стерического напряжения

L L Jn Jn

( 1 ) (n)

£ ;

S t е г

iogk(K) = Y Y а, X, t Eci . (10)

Lé Ц in Jn Ster

( J) (n)

Здесь k или к представляют собой элементарные кинетические или термодинамические константы (например, каталитическая константа и константа связывания в рамках модели Михаэлиса-Ментен), а все xJn - локальные параметры отдельных типов межмолекулярных взаимодействий. В выражении (10) первое суммирование ведется по всем j-тым типам элементарных взаимодействий, а второе - по всем п-тым локальным центрам взаимодействий в молекуле субстрата.

Параметр стерического напряжения Ester обусловлен чисто геометрическим несоответствием трехмерных структур молекулы субстрата и связывающего центра фермента. В соответствии с теорией Кош-ланда, субстрат, связываясь с глобулой фермента, вызывает соответствующее конформационное изменение глобулы. При этом, как правило, изменяются лишь те подструктуры белка, которые непосредственно участвуют в связывании субстрата. Такое гиперизменение кон-формации не связано с кооперативными явлениями, приводящими к глобальной перестройке всей третичной структуры молекулы фермента, а обусловлено лишь механическим напряжением полипептидной цепи в области связывающего центра. Естественно представить энергию такого механического напряжения в виде закона Гука:

( i )

где rt представляет собой расстояние между координатами i-ro участка полипептидной цепи в состояниях нативной и напряженной глобулы. Очевидно, что радиусы напряжения {г_} определяются трехмерной структурой молекул субстрата. Допустим, что при фермент-субстратном взаимодействии наблюдается существенное механическое напряжение ?о (см. рис.3). Выберем в молекуле субстрата такую' стандартную точку (0,0,0), координаты которой относительно координат ненапряженной части молекулы фермента во всех антибиотиках

Рис.3. Определение радиуса напряжения глобулы фермента, вызванного связыванием субстрата. 1- Положение полжпептидкой цепи до связывания субстрата, 2- после связывания, з- участок связывания, 4-каталитический участок.

постоянны. Наиболее естественно в качестве такой точки избрать электрофильный центр р-лактамного кольца (т.е., карбонильный углерод), так как его локализация в активном центре фермента должна быть всегда одинаковой. Проведем от этой точки (0,0,0) до точки а, лежащей на поверхности молекулы субстрата, вектор ? . Тогда, соответственно теореме косинусов,

го г Г1 + гг " гг^созе.

При этом можно считать, что и е для всех молекул постоянны, так как интервал варьирования г0 не может быть слишком велик (иначе механическое напряжение сопровождалось бы разрывом водородных связей, удерживающих третичную структуру бежа). Следовательно, уравнение (II) можно переписать в виде

где {ь} представляет множество регрессионных коэффициентов. Так как ни направление максимального напряжения, ни ее абсолютная величина заранее неизвестны, теоретически необходимо проварьировать все возможные направления вектора до всех точек поверхности каждого из субстратов. Тогда, при условии, что в уравнении (10) коэффициенты {а) и параметры {х} известны, можно определить сте-рическую поправку £ г. Для этой цели была написана специальная

(12)

(1 >

программа, которая по известным геометрическим координатам варьируемых атомов в молекуле субстрата и заданным их .Ван-дер-Ваальсовским радиусам определяет все возможные .

Оказалось, что для описания взаимодействий р-лактэмных антибиотиков с р-лактамазами и пенициллин-связывавдими белками дрста-точно использовать линейную комбинацию "глобальных" характеристик межмолекулярных взаимодействий радикалов r.)t r2 и л^ и параболического выражения всего лишь одного определенным образом заданного геометрического параметра г (табл.4). •

V 2

Результаты, приведенные в табл.4, позволяют оценить интервалы варьирования абсолютных значений свойств связывающих участков в ферментах, специфичных к р-лактамам. Например, обращает на себя внимание отсутствие влияния диполь-дипольных взаимодействии на общую энергию взаимодействия, 'Что полностью подтверждает выводы анализа природы гидрофобных взаимодействий. Выявление таких закономерностей в специфичности ферментов (т.е., оценка интервалов варьирования регрессионных коэффициентов) имеет особое значение, так как они могут позволить оценить свойства тех р-лактамаз и пе-нициллинсвязываюцих белков, которые до сих пор остаются неизвестными, но быть может, играют ключевую роль в механизме действия -р-лактамов.

4.2.4.'Установление взаимосвязи между структурой р-лактамов • и конечным биологическим откликом их антибактериального действия. Как показано выше, для полного описания всех элементарных - стадий бактериостатического действия р-лактамных антибиотиков необходимо учитывать следующий полный набор параметров структуры субстр?та: молекулярный объем vx, параметр поляризуемости vx pf, кислотность а, основность ß, параметр диффузии logv . параметр гидрофобности димерных ассоциатов fcommon> параметры, пропорциональные электро-фильности р-лактамного карбоксильного атома о к и стеричес-кие параметры г, г2.

Обработав литературные данные по средним арифметическим значениям ингибирования роста клеток Shigella sonnei, Esherirhjя

coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter acrogines И Salnrn^lLi

heideiberg с .i-замещенными цефалоспоринами, применяя алгоритм, изображенный на схеме I, получили следующую взаимосвязь структура-активность :

Таблица 4. Количественное описание взаимодействия р-лактайных антибиотиков с р-лактамазами и ПСБ.

Фермент (рецептор) Варьируемая часть молекулы субстрата Корреляционное выражение n r

/з-лактамаза I ИЗ B.Cereus 569/Н/9 цефалоспорины, log(k /К 1=4.86+3.15V PF-0.43V +0.67P + 2.4УЧ, с M X X 1 12 0 9 73 0 11

р-лактамаза И ИЗ B.Cereus 569/Н/Э цефалоспорины, R3 loglk /К 1=4.26+2.36V ^F-1.07V +0.42P+2.55a, с M x x I g 0 968 0 14

р-лактамаза I ИЗ B.Cereus 569/H/9 цефалоспорины, Rt logkb=l.14-0.58rZ+0.ЗОг+2.29\^РР-0. "OV^ + 2.340 36 0 986 0 05

logk =1.08-0.51r2+0.21r+0.73f +0.990 с Common 36 0 981 0 06

logKM = -4.10-0.54r2+0.0 7r+2.93V)(PF-0.8 3V)i + 0.5 9p 3 6 0 983 0 06

logK=-3.83-0.53r2 + 0.18r+0.48/ + 1.760 m Common 36 0 975 0 09

р-лактамаза и из в.сегеиз 569/н/а цефалоспорины, Bl logk = 2.21-0.38r*" + 0.29r+1.38V PF-0.64V +2.78P 19 0 991 0. 04

logk =2.08-0.38rZ + 0.24r+0.51i' +1.06 p с Common 19 0 987 0 05

logKM=-4.4 3-0.59r2+0.11r+2.69VxPF-0.98Vx+0.87p 19 0 988 0 05

logK=-4.34-0.60r2+0.17r+1.08/ +1.06P m Common 19 0 990 0 05

Р-лактамаза I из B.Cereus 569/H/9 пенициллины, r, logk =3.03-0.16r2+0.08r+0.24/„ с Common 10 0 984 0. 05

logK =-4.10-0.23r2+0.17r+0.19/„ M Common 9 0 966 0 18

Транспептидаза ИЗ Streptomyces R61 пенициллины, и, logKM=3.51+0.45VxPF 4 0 988 0. 07

Транспептидаза ИЗ streptomyces К15 пенициллины, r1 logKH=4.90-0.53r2+l.01VxPF 5 0 976 0. 08

Транспептидаза из s.rimosus пенициллины, r4 logKM=5.20+0.62VxPF 4 0 989 0. 07

р-лактамаза ИЗ Е.-cloacae .РЭЭ -пенициллины, r, logk =-2.92-0.49r2+0.25r+2.67V PF 6 0 980 0. 08

log(k /К )=5.25-0.40r2+0.08r+0.88f en Common 6 0 993 0.04

(-0. 2Г-0.30/ -О. 32-0.S2/+3.050 ♦0.41(7°

10 +10 +

♦ io 1 Rj. (13)

Сравнив оптимизированные коеффициенты в полученном > уравнении с линейными коеф$ициентами из уравнений (7-9) и табл. 3 и 4, легко убедиться, что первое экспоненциальное слагаемое соответствует скорости диффузии антибиотиков через внешнюю бактериальную мембрану, второе слагаемое - взаимодействию с ПСБ, третье - химической деградации антибиотиков и/или их взимодействию с /з-лактамазами. Аналогично обработав данные по ингибированию роста клеток s. typhi разными пеницилинами описали уравнением (14):

[0.52«0.91/ 3.50-0.6эЛ

10 + 10 I, (14)

ингибирование роста s. aureus - уравнением (15):

(-0.31+0.72/)

ю I, (15)

а подавление роста е.сои - уравнением (16):

[3.50,0.62/ 4.71-0.33/1

10 +10 . (16)

При этом первые экспоненциальные слагаемые в уравнениях (14-16) соответствуют взаимодействию пенициллинов с ПСБ, а второе слагаемое в уравнениях (14,16) - скорости диффузии через внешнюю бактериальную мембрану.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Показано, что энергии межфазового распределения в любых двухвазных гомогенных системах могут быть количественно описаны линейной комбинацией четко определенных физико-химических параметров исследуемых веществ.

2. Разработан подход применения этих параметров для количественного описания энергий взаимодействия в исследуемых фермент-субстратных системах в рамках представлений о линейных соотношений свободных энергий (ЛССЭ).

3. Предложен способ выбора оптимальной кинетической модели, описывающей экспериментальные данные по конечным биологическим откликам исследуемых веществ в ранках экспериментальной погрешности.

5. На основании вышеприведенных выводов сформулированы основные принципы поиска взаимосвязи между струтурой веществ и их биологической активности. 6. В химических растворителях и в биологических средах, выступающих в качестве потенциальных доноров водородной связи, молекулы /¡-лактамных антибиотиков димеризуются. В следствии этого нивелируется их склонность к полярным и кислотно-основным межмолекулярным взаимодействиям. Свойства . димерных ассоаиациатсв ¡¡-лактамов списываются всего лишь одним параметром ^соттг г * К0Т0РШ легко может быть подсчитан, применяя уравнение

(б'ТГ"

7. Скорость химической деградации р-лактамнсго кольца под действием внешних нуклеотилов не зависит от электронного влияния С6(С7)-амидного заместителя и определяется лишь пространственным положением этого заместителя. Влияние СЗ-заместителя определяется его индуктивным эффектом.

3. Скорость проницаемости ;<-лактамных антибиотиков через бактериальные мембраны не зависит от наличия или отсутствия в них транспортных белков, и определяется в основном их липополисаха-ридно-фосфолипидным сотавом.

9. Взаимодействие с-лактамных антибиотиков с э-лактамазами и пенициллин-связывашими белками определяется пространственным строением Сб(С7.)-амидного заместителя, его склонностью вступать в межмолекулярные взаимодействия, и электронным эффектом СЗ-заместителя.

10. Конечный биологический отклик антибактериального действия и-лактамных антибиотиков, в зависимости от типа бактериальной культуры, может определяться скоростью проницаемости молекул антибиотиков через внешнюю мембрану, их взаимодействием с Р-лактамазами и пенициллин-связываыцими белками и/или их химической деградацией как во внеклеточной, так и во внутриклеточной среде.

Основное содержание диссертации изложено в работах:

X. M.Gololobov, А.Petrauskas, V.Svedas, Nucleophile Reactivity of Amino Acid Derivatives in Peptide Synthesis Catalyzed by a-Chymotrypsin - .Abstracts of International Conference . "Chemical Physics of Enzyme Catalysis", Tallinn, 1987, p.118.

2. М.Гололобов, А.Пятраусксас, В.Швядас, Повышенная нуклеофильная реакционноспособность р-нафтиламидов в реакциях ацильного переноса, катализируемых а-химотрипсином - Тезисы докладов и Международной конференции молодых ученых "Молекулярные основы биотехнологии", Пущино 1987, с.13.

3. М.Гололобов, А.Пятраусксас, В.Швядас, 0 стабильности продукта фэрментативного. пептидного синтеза путем ацильного переноса -Тезисы докладов v Всесоюзной конференции "Пути синтеза и анализа биохимических реактивов", Рига 1987, с.293.

4. Р.Диджяпетрис, И.Шредер, А.Пятраусксас, В.Швядас, Исследование специфичности пенициллинацилазы в реакциях гидролиза n-фенилацетилпептидов - Тезисы докладов vi'i Всесоюзного симпозиума "Инженерная энзимология", Москва 1991, с.70.

5. M.Gololobov, A.Petrauskas, V.Koschke, R.Pauliukonis, V.Svedas, Increased Nucleophile Reactivity of Amino Acid P-Naphthylamides in a-Chymotrypsin-Catalyzed Peptide Synthesis - Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1041, 71-78.

6. A.Petrauskas, V.Svedas, Hydrophobicity of 0-Lactam Antibiotics: Explanation and Prediction of Their Behavior in Various Partitioning and Reversed-Phase Chromatography Systems

J. Chromatogr., 1991, 585, 3-34.

7. A.Dubickas, A.Petrauskas, Application of the linear free energy principle for derivation of nonlinear quantitative structureractivity relationships. A steady state kinetic model

J. Math. Chem., 1992, Accepted for publication. С

Подписано к печати мал.

Формат 60x90/16. Усл. леч, л. Уч.-изд.л,

Тираж -100 экз. Заказ № № Ю

Ордена "Знак Почета* издательство Московского университета. 103009, Москва, ул. Герцена, 5/7. Типография ордена 'Знак Почета* издательства МГУ. 119899, Москва, Ленинские горы.