Полимерные микросферы для реакции латекс-агглютинации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

О О Ь 3 ' ': .... •

СНОШАЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЭНАШМ ИНСТИТУТ ГОНКОЙ ШуИЩШЖ ТЕШДОШИ Шй И. В. ЛОМО КОСОВА.

Зпоциализироашгакй Совет Л'063.41.05

На ираьох рукописи

Специальность 02.00.06 - Хи'ящ высококолекуллрььсс соединений

АВТОРЕФЕРАТ доссэртацли т ооисясанке ученой степекз кандидата химических наук

/ 'У ¡1

Москва 19Э1

Работа вишлнейа в Мооковаксы ордена "Трудового Красного 'Знамена'' лиот.чтутз тонкой хдшяеокоЯ тахлологм ям. Ы.В.Ломонооова а в,на-учво-^си.юдоЕагельоком звети1<«те: фвздко-хялшчеокоа мадявдш '•• Ш РС«КР. . - • ' 'У У. .:' - ";■.'•

Научаао руководителя: доктор хийачеоках.ьаук, дрофеосор '1

К.А .Грядаоэе '.. V-

, ' . доктор мсдидексках наук

Офивдедыио-ошовевгн: доктор хишчзсних. ¡тук, профессор, '."'

Б.11.Иом£2доЕ,а / ■ ■

'■ '■.. , кандадат химических наук, депонт

Ведущая' органиэацгл: йаучно-Есодедоватадьо'Лйа фязйко-хпютэомй. ; йяотлтут им».¿.Я.КарпоЕа ' •

Защита состоится '¿(г" ИЮКИ 1Р£>1 года;в'

ж.

чзооа в аудиториина ■заседании Саоцлализяроваиного Совета Д 063.41.05•яря МИШ ш. К .Б .Ломоносова до адресу:." 119831,' ГСП, Москва, Г-435, Пироговская уд. д. I. - .

Отзывы направлять до адресу: 117571, I,'со кг а , др. Вернадского, д. 86. •

С диссертацией мокйо ознакомиться в йейлиотеке МИТИ им. В. Ломоносова. Агтореферат разослан 1291 г.

Учедаа с?кретаоь ; . . • • •.

Сдеэдалйэиродаьного Совета . ■ 1 , '.?

Д C83.4I.05, д.::.а», дроф.

(ШЯ лАРАГ^^СГгДСА РАБСИЛ

тгЬи-носгь рзботп определена несб^даиостьч ооэдашш отечо-

от;зншх дпппюстэтескпх тзст-огстом ча ооногв поллморшх ыккоо-с - ¡¡Г) . •

?;еть с-а б от ц состояло в создай'-и яслямсрннх оуспоязкл « иэу-чевап ех т;язпко-хйчрчоокйх о во Летя, соеспечдьа:? мг вдсокую' д:>аг~ нсст::чоску.о гом:;?;'нность тевх-сястом лп ссяорв реакщп катопо-пг-глвтдиаь.ци/

Научная ползла мОстк:

- ¿МЛ2?0п-> ЙОКбОЛвО СОДОТСШШН ШрРМе^Ц, ОЦрв.ЧОЛЛгГЛКО Пригодность »олймерн'п: мчкрооГлр длл ссздояпч лтгенони:; ,т;1вп:слтч:.у-поп;

- уояаионлсна кооадородноогь огрзкг-ури п^л^.стгрольяж и жшшс-

1 у Л О И;; О ЯЧХ ¡•/,"1:'.]!ОС'"вр , обуОЗО£.т<Л1!!ап ОСОбО ЯЙОСТ.'^Я ПрСГОЬ^НГЛ ЯОЛЯ-;ч;р::згга :: родкс.; среде;

~ гс:г.язрл г;ре!::'*щеС'Гя. ц оц-ц.и;:.;-: л:гг-.ко~лг-

гяг>гииги::п даллотцрояьянх•¡пкросг.шр, стг>«?и,л!з.".р'>г.эннцх рчсткорч-ши в угдогодсрсднпл Гяэе Ш|,Н-Д1:'-а»толял~о-1а1)|1яако::01'.>нйлк'.ьбг.-

колмл (дтл);

- уогоаов.чзш заш'о.тлоста количества альбу:,;;,на, удсор^йроьач-ного ¡ш полгс/лрсльгах чссткцсх, от кокао.чтрации слл/а и исход-

нох.: растнорп при пазлячпи'х знччмчй: рН среди:

- определены згаченвк концентраэда .вльСумяна, и.:.,«уноглобул/.-ла & человека о рК среди, аеобходамго для доотягдиш глколмаяьясЛ

ЧУЕСТЕКТсЛЬНООТИ ла^окс-театс^; •

- изучена конкуроитвзя адсорбция белков сиаорот::и /;ропи человека :: показано, что налгЬльшлп сродством к явлкстирояьяоз ло-рэрхноогя обладают р -дляогшотендн.

Ц»актичос1ая ценность шботы. Яа основе подиотирольдах с, ааазйЗ создаш аитательшк» датекс-тасты для кде нтяфйкацад диф1 риансго а стскб^ячйс.о йштексгяа, caj;írep;:ii рода оалмонеяд, к< рыв лрошля шшавния и лаборатория иммунопатологии НШ АЗН о / дояятоаыш результатом. *'. "

Автор заж&ет , 1 , , ..■'.'. .

- " -руг.чуру полимерных суспензий, додучэншос в различных з íiGbiuix , диам^р чаотдц и раапрсделекка яаоящ до размерам для проводвякя реакадй латекс~еггд«тикаода; -;',"."

- зюдщи».я ароввдения адзорС^ш Селков -аяьбушна и, иллуяс глобулина 6 чэлсвекг га политрных шхроойерах для обеспечения сьтлмальйого -прстекзняя реакция латекс-згг/шгишпл. и высокой чуастватедыюсст; > ■ • ■

- п&одедоватеяьноогь ОЕязцванЕЯ белков', сыворотки кроап с л Еврхвоотма содястирольннх частиц;,'.

- антяталхшв датеко-теот« на основе х.ояилеряых оуспеяэдИ ддя иденти^кацаЕ дифтеря;Шого и отолбнячного анатоксина.

Апробация работы • ' : ,'■•'■■

Оскоэкие результаты работы. быял дояохены е обсуждены • ва; X 1 союзной конференции "Радикальная подшериэавдл'',. Горький,- 1989 не У1 Всесоюзно;! яонферевдаа «олсдих ученое п слецаалксгов по с эичеокоЗ химйй "Физическая хшяя-W, Москва„ í990 г...

Публикации. По tx лдьтатам дйссертавдокко.! работа олублдког но 4 работи.

Структура и объем диссертации. Дяосертадая яаложеааке IOS отрадицах да та ноп ж кого текста и состоит из. следующих разделов: введение, литературный обзор, Доходный недестЕа и катода послед вания, результаты и ах обсуждение, вывода, включает 13 таблиц 18 рисунков. Библиография содержат 129 кашеаований.

^Уг-и.'-Й&годше вещества. Стлрол и акролеин :.яркл "ч" очищали от отабй/лзатора лс лзвестяо;! методика. СыоороточшЯ альбумин человека очищали методом гзль-хроматографаи на ноодтеяэ Sepharoee CI-6B. Ишуяоглобудин S человека и мовоодевдфаческяе сыворотки едотяв альбумина я якмуноглобуллша G чело зка применяли б«з дополнительной очистки. Дягптонян, поливиниловый ошфт, оксйэтили-рованше цегаловый олдрт а'Лодяяродядангтшкодь, злкидсулырояат натрия, дя-п-тодйл-о-уаобадкзкойфвкялкарйинод, дагидроосафат натрия, гядрофосфат натрия , ацетон и другие реагенты марки "хч" а "ч" использовали без допсшитедььоа очистки. Дяопбрсиовная среда -года дйотиллбг.

Метода доследования. Кондерояю моношра оценивала катодом гравиметрия. Размеры чао тмц полимерных дисдероий определяли wîo-до'> скакирувдс.! электронной микроскопии на пркбэре " S-57Ù" ("Hitachi, уло'лия). Структуру частиц шширнк;; суспензий иссле-" довели методом локного тр^лешя на установке хЕ-З ( iiiko Кгsine-eriiu;, ,-]:1снйл). Количество бедка, адсорбированного t'a долисткроъ-v.dx чяотидах, слредел/'л!' по методу , основанному нп кз;:.иренн.; убыли коыентраст болт лз рзствора в р^гуд^таге адсорбции. Кояце.чт-рош-чо растчероз 40 А определяли ю с^^зстрофогометрс W _ vi3 " Soеcord Ь 40" (ГДР) при длаяв водны 273 ям. Реакцию датеко-ог-

гдйтяиацяя вабгвдаяй йизуаль :ыг.! слособои ira стЬклуньоЛ пл:> иояд-

«

стчралыю;? плаг.тинке чордего тяга.

хЪЗ&'Ы'АТа ÎÏ СБСЯВДБШю

1. Пссло.узнавве своей«! суодснзаЯ различно;, цот.'е^яоа природп

'..'з мтературш:: додык гз«с«т:>о, что дяя при гот os та ¡ия летв:»-i'OGTOS обычно' дслользурт Ч?вШД1 :'.0,i:ii.:ûfH0j ОуОИОВЗШ с Д.;Г.Г.8'Ф0М .•екоо I ;■.!-">.

S .

Препарата ьг основе таких суспензий выпускают мзогде эаруйек-лые iT>i)pi'u, однако, отечественного производства полимерных суспензий подобного гида наг г. в настоящее время реакция латекс-агглютинации обычно доводят о использованием зарубежных диагноотикумо! Это делает потребность в создавай отечественных диагностических • теот-окстем на основа долшершх кякроофор чрезвычайно актуальней.

Б не с сщей работе ода да fia попытка, по пользуя моде л ыыо о н-стеш аатагеивого и антитедьного диагноста кумов, отработать опти-мадьше условия приготовления тест-систем на оовово дояимерннх суспензий и постановка реакций" латако-штлготннащш для яиявяенш возможности лооледукща!'. апробации этого метода на экстримоигольном к клиническом материале с точки эреидя оценки его диагноста-, ческой ьффзктивноста. . '

Создание лзтеканнх тест-систем для диагностики различиях заболеваний, работающих.но матэду. датокс-аггдвтишиш, включает в себя насколько этапов:

С—13 этап состоит в выбора природа полимера суспензии, диаметра частиц, рятрвдэлеяия частиц по диаметрам;

2-й этад - в шбора полимерных суспензий, устойчивых в растворах солей низкой концентрации и при хранении;

3—il этап - исследование адсорбция балка на поверхности частиц полимерной суспензии с целью нахождения условий проведения адсорбции и выбора концентрации бздка, необходимой длл обеспечения оптимального дротбкааая реакция лагокс-ахтлютинацкя и высокой ее чувствительности.

Исследований били начата с синтеза и лредвардгеяьного дслыта-икя двух типов ао'мшршх оусиеязиЗ, лоапот.чредьнол а мншакроя&и-йевол, с разный размером частиц.-Чабер:природы яэдыизра одредалял-

оя цсласообразноотш испытания частиц, способных физически сорбировать болок (полистдролвнав ) я копалептло ого связывать (по-лиакролеиновш).

ДолЕстирольныз суспензии получали методами змульо;юнно.1 и суспензионной полимеризации. Эмульсионную по..жсрязацвю проводили п присутствии яояогенншс (алкилсульфонат матрдя, Е-ЗО) и цепочных (оксиэтиллрокэншз цетилсшй спирт и лолвцропиленгляколь, длгято-нин) эмульгаторов, а тага® в отсутствие эмульгатора. Условия проведения полимеризаций (концентрации ашщиаторс я эмульгатора, температура) выбирали '-'скш.; оЗразо*,'., чтоба получении;! лето ко содержал частицы о узким распределением но размерам. Выбор объемного :осхно>яен;ш мономер/годная $аза, концентрации инициатора п ПАВ определялись условиями получения стабильных п процесс« синтеза )уолензи>Ь

Суспензионную кол^меризацив стирола проводила в црпсугстш'н ¡табнлизатороп - аолызпннлового спирта и дн-ц-толт-о-карба.п.ок-•^аянлг.ярбплола (Д1К). В отом случае тлкяз енбирал;! уелгшм про->er»fti!?a нолц/.ерцзацы!. обоспечиваетиз получечке суопоазии о узком (яспроделеьпсм ¡.инфосфер i,o размерам.

Полипкролеяяошз суспензии с узитл распределением частиц по (аз,мерам получали ж год см аняошю;! ссадптодьнол полимеризации*'

с присутствие полимерного стайимзатора-сололшеоа виштацета-а, схрилооо-! кчелогц и тчл^инплэткналгидролерокгаиг (вАП.

Все синто зированше подш-ернив оусивнзш очивдли от примесей -езаполлморизоидвиегося мономера, остатков инициатора и змульга-

) Эта ис следования вшюлнеш совестно о сотрудников коЬ. СП РИТХТ i.ii. ГиЗ .Ломоносова, м.н.о. Е.Бзхаревым.

, а • ..•-.• \ ■ .■•■ к-тора путем удьтрафидьтоациа. ■ ' .'. /■ >,:" •

Известно» что доламерные части1&-кссителк биодогйчаошх Молекул, долчш отвечать комплексу треАованиЛ," а лмешо:,'

- размер ^литерках щкросфер менее I мил .' (для"слайдовых агглюгияацаошых тестов); . /, ' •• . ; . •

- уекоо распределение чаооед но разборам; ' ; . ;

- агр' "ати.адач устойчивость частиц в 0,1-0,15 М селевых" растворах; • > - .'

- устойчивость полимерных кйкросфер к:процедуре очистки методом центрифугирования или ультрзфешьтрацяя;' ' • . ..

- устойчивость чаотац яуи хранении'. ■ ' . .'•.* ■

- обеспечено я о обратимой «»мобилизаций белков с максимальным сохранением лх активности, ' ''" .' ,

Размеры: доявот^рогьвкх ¡шкросфор,...полученных дотодашг экуль-, елейной и оусаойаиошой аолякери.шадя', изл'.е^ялиоь л иврокок два-, вазоне значений: от 0,12 до 0,9 ш<м.г Частицы полимерных суспензия • с диаметрам« »шизе 0,2 мкм в согдайия'латекс-тестов'ве применяла из-за оломлосад их очистки. •

Частив даяиакролаановше оусшшзиЯ имели "диаметры 0,2; 0,6; 0,7 л 1,5 ыкм. ■ . "

Для слайдовых тестов рекомендуется использование частод о диаметрами, не лревшшщивд 0,8-и,9 мим, так как крупные частицы быстро сед.чмелтируют на слайдовоЛ лласгаино, затрудняя учет результатов реакции ла текс-агглюти нации, поэтому испытывали чдети-пд с дилметрамв 0.2; и,6 и 0.7 ккм.

■ Так как реакция антиген-антитело, которая иддлется основой Р'шкд.ш латека-агглюташиши, протекает только в присутствии соло а, тс лреяде всего .необходимо било изучить агрэхгггявну» устойчивость суслиизИ" '> оолешх растворах.

Б результате пропела чину лоследопаниЛ оказалось, что шлистя-ольвке чэсинш, получовяыа я яриоутстппя -эмульгаторов - ¿-3U, -2С, ДГТ, 2 отсутствие эмульгатора :> в лр псу тот иди стабилязато--а - ПВО, а такха дол.чакролеяяояго чаотядц обладает нодостаточ-ой згрогаткЕКо:! устойчивостью в эдоктродя~зх (ü,OÍ :.'.-u,U5 1,1) для с пользования'дх в ддаунохаиячеоках исследованиях, где лрямзня-1тся буферные раотяорн с концентрацией ü,X-ü,15 1.1. Полистирольне i.i4i<po<}'íepfí, стабили зкровашше ДТК, балл устолчхш в солешх тстнооах (U,15-0,2 М). Устойчивость лсликортсс суспензий, как ■казивалооь вше, долхша сохраняться и при хранения в течение не шнае 2-х месяцев.

Стабильность полжервих ичнросфер определяется миопш факторами, е лораую очьредь, раологдчеокиш сдоЛотвааи межфазяых ад-горбцконшх слоев ПАВ, ь которые сущзстпэншй вкпал вносит при-зодэ лодетера, лз которого соотолг частша. Англяэ данных по yc?oi!~ ííibootü частиц по.тазрных суспензий я процессе хранения покапал, «го iix стабильность so ррсиеки на одиршеооа. ¿оли долиотврольико зуелвнзиа оохраг-ятог свг>н овдлства в течение несяцои, то г.о-лиакролеиношс теряют jo:, черев 2 суток»

Было высказано лредюдо'-ение, что отличие свойств аолшершх оуояонзиЯ определяется р.?зиш.*л ^олошадя язг <}оршшоващгд. Еоля част иод полистяродыш оуалоизяя, образухдаося-аря оуодгнзлониед и эмульсионной л.эллмеряйоциЕ стирола, формируются яз капель мономера разного-размера, то чаогьод яоллакроденноаой оусшяэдл ..армируются из ассоодатоз или клубков олягомеров акролеина, клавших в водяую Лзэу, в результате протекания полимеризации. Потеря устойчивости таках частиц может бить визвана постепенным растворением в вода олагомеров акролэака, из которых "построены" частицы.

ю

Высказанную гипотезу подтверждали результатами анализа отр

I

турц частяц методом травдавня образцов ионизировавши воздухом Били исследованы ¡юн ¡тарольные частида, полученные методами эмульсионной и суспензионной лолдмерлзацяа стирола, икициирова] персульфатом кадия, в присутствии доверхностяо-актийдах вевесп различной природы: неиошшх - дйгитонада, диаметр частиц »0,12 ь оксиэтадированного долдшойяльвгддколя, ллюроакка, 3~С8, дяамез чаоткг ,25 мнм; ди-а-тояид-о-адрбалкохсв&енйдкарбийода, ДТК, д еметр частиц 0,5 и 0,9 мкм; д ионогенного - адкиясульбоната на рпн, ¡¿'-30, диаметр чаотиц 0,5 и 0,15 мкм,. а .такие гояястиролыш частицы, синтезированные в отсутствие ПАВ, диаметр которых был равен 0,5 мкм. Вади исследоваш и доддакролезиоше ¡астицц с ди метрами 0,2; 0,6; С,? д 1,5 ыки, полученные анионной дотшердэа-циой акролеина, как в отсутствие стабилизатора, так и в лраоутс: 1з и а полимерного стабилизатора - сошшшвра амилацетата, акриловой кислоты я метидвивадзтдкйдгйдродеро^сида (ВАГ).

Носив ионного травления образцы напыляли золотом и поверх-лос ть полимерных часздц изучала о'помощь» электронного мякроскс-па 3 -570 ("шлаоЫ", Япония).■

Анализ результатов эяектронношкроокодичоского исследования показал, что в качественном отношении травление всех чаотиц происходит одинаково. Вое иссдадоьаавые пол.и.*.ирше микросферы неоднородны и состоят №1 ри из набора субъодишц, которые про.чвля-ются после разрушения внааяел ободочки чаотиц а течение перш:-: минут полного травления. С увеличидкэ:: врег.аш травления наблюдаем д тзквкнодешо значительных дуст от а дошке до« рахлостя упаковки суоьодпнвд, которое завершается ¡шторе.') с^ричуоко/ г.оргх: чэоткц. Сяоиует, однако, оииЛоть, что полкакрсдоавов-дв чзотавд:

ест болов рыхлую структуру и поэтому разрушаются за более ко-ткое время ионаэирувдого излучения.

Дополнительные эксперименты (разрушение частиц механически и непроизвольное разрушение полиакролеиновых частиц при хранении) дтверздагат достоверность полученных картин травления.

Таким образом, анализ полученных картин травления показал, о все исследованные микросферы характеризуются неоднородной руктурой, независимо от механизма их образования. Можно ггред-лоаить, что неоднородность структуры частиц обусловлена особен-стяш протекания полимеризации в водной среде и вызвана захва-м воды полимера зуетцимися. частицами. Естественно ожидать, что оооб проведения подииеризацая, определявдий размер частиц (сус-нзионный илч эмульсионный), должен влиять на количество воды, »горой захватывается полимера зуодляся частицами, и еоответст-нно на их внутреннюю структуру. Эты можно, по-видимому, ебьяс-;ть более рыхлую, чзм в иоллстирольнцх частицах, упаковку субъ-В»1шц в шлиакролеиновых чаотицпх, образованна которых происхо-и в воде по механизму гомогенной нуклеациа.

Приведенные выае факты зредставлявтся интересными и полезны-[ как для уточнения механизма формирования, частиц, так к для :ратогин выбора полимерии?: макросфер, дал ишукологичоскях пссле->ваш2 в зависимости от условий раооты с ниш:, в виде полимерное гепенэии или в виде лиофилизованных микросфер, использование кс-зрих предполагает их редаспергирозаннэ в водной среде.

На основании полученных данных по структуре частиц полимерных гепенэай а их устойчивости в солевых растворах и при хранении щ решения задач, поставленных в работе, были выбраны полисти-хльные микросферы, стабилизованные ДГК.

П. Адсорбция белков га по лис тирольцах ыикросферах

и постановка реакции латекз-агглютишцш! В данной работа язучали адсорбцию альбумина я ишуногдобули на 8 человека только на лолжерных мжрооферах, иригодких для а мунолотачеоких исследований. ' - . , '

Учдтавая, что основная идея дрсводлшго исследования заключается и разработке принципов создания латексных дна гнести кумов необходимо било сопоставить количественные закономерности адсор ции бел^ив на поверхности частиц о параметрами, . характеризующим роботу диагностических тест-систем. Аиалиэ литературных довшх показал, что подебше сравнитедьшо исследования отсутствуют.

Исследование адсорбция белка яо поверхности частг-ц долимерш суспензии с целью нахождения условий, необходимых для обеспечен! оптимального протекания реакции латекс-агглютинации, проводили 1 йодистирольных частицах, синтезированных в присутствии стабилизг тора ди-а-топил-о-карбалкохеи^нплиарбикола и имвпщих средний диаметр 0,55 мкм. Суспензия содержала чаотицы с узкий распределением по размерам.

Такая однородность частиц по размерам дает определенное пре имущество для использования их в диагностических реакциях, так * позволяет достаточно точно определить площадь поверхности носите дя белковых молекул ц установить степень се покрытия антигеном или антитез дом.Кроме то^о, однородность частиц обуславливает схол нуН характер их поведения во время агглютинации, что облегчает ''прочтение" результатов реакции латокс-аплютинащш.

На основании дитературшх дашшх зыбраня концентрация с.усаеь эди иедшершх частиц, рашня 2-2,6 %. Адсорбцию оелков ка открольних кякрооферах изучал« , дспользуд »еловечеокий сиьороточ

1!Ий альбумин (ЧСА). Выбор в качестве исследуемого белка - ЧСА определяется его доступность® я наибольшей охаракуврцзованиостью.

Болск подвергали очлотке от диюра и ккзкокодекулярных веществ я использовали препарат ЧСА практически не содержащий црп-месеЗ.

Адсорбции ЧСА «з лолксмрольшх чзстинах исследовали как функция рН среды. Для »того применял,« ОД М буферные аютаорн со оледу водами значениями рК: 7.7 ; 6,8; 5,8; 5,0; 4,0. После сме.'шванля и инкубдровткяя роиних объемов суспензии лоли.'.'.зр.чых частиц и растворов белков различной концентрация в точение 16-18 часов несвязавшиеся с частацаш белок удаляла удьтрэфаль-трацивЯ или центрифугированием с последующей промывкой суспензии иолииершх МД1ф0Сфер СООТВеТОТЕуХНШ.! буЙСрОП.

Пзотерш адсорбции ЧСА аа аолксгяродьных частицах, приведенные на рис. I, били полуцени прк значениях рН среда, соответствующих области выше изоэлоктрической точки ЧСА (рН 5,8; 6,8; 7,7), вблизи ее (рН 5,0) н ниже изоэлектрпческоЛ точки ЧСА (рН 4,0). Получить изотерму адсорбции человеческого сывороточного альбумина на полнота рольных макросферах при рН среды 5,0 не

с '

удалось, так как через:16 часов после смешивания суспензии полимерных микросфер с растворами ЧСА наблюдали осаддениа полимерных частиц', покрытых белком. Это объясняется, по-видимому, тем, что в дзозлокгричоской области молекула ЧСА практически электрокейт-рэтып ?! «веет компактиув структуру. 3 этзх условиях макромолекулы ОКЯОПШ к агрОХ'ДЦйИ. что, ВОЗМОЖНО. к ПМНОДСТ 1С Иар:'ШйИЮ устоп-'П'ьоси; по тетрглй оуой«з;:эяи.

Иг монах, сдояйкх на р,\с. I, видно, что дрр увпллчешш доиичи'.ргшка чзлсшечссяохо оцворогсчвого альбумина до ьт/мл

езбя-дается возрастете геазчглй» «дсорбцвя, а пой даяьйезчом росте кои^ектргцяи ЭДА - со на ¡¡лото.

При увелпчовпя еодцччш ря сред:-: млн честно адсорбированного ЧСЛ чл дсеерхност:: 1яотг.ц падает, сто у::е:шпенке, ао-вздимоиу.

■::п, порехддэ:.' ое е бодро развернутое состояние вследствие оттал-кгванпя од2юп:.:огг1шс зар;иов. Упелпче:?;:е размера молекулы Белове-' ческог«. сквороточксго альбушиа с возрастанием рН среди приводят к yr.'.QHjucHH» члела i.-.одикуд, адсорбируемых на поверхности частиц.

G увеличением рК среда уменьшается л ¡:а:слой начального .участ-т.а изотермы, который позволяет «удить о степени сродства мо;кду бзлком и по;ш:.'.еряо.) поверхностью. Уменьшение наклона начального участка язотериы иьняо объяснить те:.;, «то с переходом в более щелочную область звачегай pli увеличивается отрицательно заряд молекулы белка, что связано о возрастанием диссоциации карбоксильных групп ЧОА, которые ориентируется по направлению к поверхности сорбента, затрудняя процеоо адсорбции белка.

¡¿акромолехула альбумина предотавляет собол же откую глобулу в форме, эллипсоида вращения о осями 40x40x140 Â, и если предположить что при адсорбции большая ось макромолекулы белка располагается

параллельно поверхности сорбента, то площадь шоекцад к о леку ли оо-

ог,

ставят 44Ш А . Расчеты определенных экспериментально значений длощадей долямершй поверхности частиц, приходящихся на одну адсорбированную молекулу 40А, при различных значениях рН среды по-кэзаля, что значениям предельной адсорбции (плато изотерма) соответствует заполнение белком поверхности шжз г/сносложного, за исключением величины предельно?. адсорбция, полученной прк рН среды 4,0, В этом случае экспериментальное значение плоэди полиморноЯ поверхности чаотдц, лриходящезоя на одну адсорбяроьзинуу» молекулу ЧСл, дочтя совпадает с теоретическим значением площади проекция молекулы ЧСА, предполагая тем озим образование мо.чослоя бедка с упаковкой, плотность которой максимальна.

Итак, а результате проведенных икслеригантов било установлено, что связываний человеческого сывороточного альбумина о лодиета-рольными ма крое.¿.ерами максимально при рН среди 4,0 я минимально -дря рН 7,7. для образования монослоя белка с максимальноЗ плотностью упаковка на поверхности яолиыерннх частиц необходимо проводить адсорбцию белка при значениях рН среда, лекааях вблизи язо-электрическо;5 точки человеческого сывороточного альбумина.По мере удаления от изозле'^трическоа точка ЧСА (яра смещения рП среды в щелочную область) количество адсорбированного на частицах белка уменьшается. Адоорбцдя человеческого енвороточного альбумина на полис тарольнях частицах яри рН среди 5,0 приводят к потере устой-чивизтя системы. Со смещение« рН среды в щелочную область уменьшается я сродство мэзду молекулами белка я полимернол поверхность*) частиц.

1!ДЯ)Шйе условк!} иамойшэацяа белка на яоляотярольяух мокро-сферах .ча чув с ? е яте ль ноот ь получаемого латекс-тесте оценивали методам РЛА. Суосогоия лелдморяих частиц, покрытых 40 А, моту паклим

в данном случае l рол;; антигена, агглютинировали'коноопецийачес-KOii сиг:Оротко2, детству ¡дам начала.; которой являются антитола к п::.;.;обимзоЕакда»;у белку (ЧСА), специфически связнпажшеся только с гтп:.' белком. Чувствительность .'.¡итода РЕА оценивали ас мвксяшл но;.:у разнодонаю авткпивороткд, глрй котором реакция лзтекс-агглют нацпк еде учитывается:. lia ркс, 2 лрьдстазлеш зависимости чувств тельной та Р.1А (:,:якс;:мадьного разведения антдоиьоротхя) при разли i:i;x значениях pH сред;; от кон..ситроцкд человеческого сьзороточно

го альбу/.лкь в раствоое,

Тч|

?.;е. ¿. Зависимость чувстви-* то;.1,ксстп РЛА от коядонтраща 2 белуя и растворе прл различии pH ире,;:: 5,Б (I), 0,8 0>); ('-•); ...ü (4).

.-з данннх, л: лллле л^лл; лл р::с. ллл^с, что лр,: знлчлллял р.; сродн 5,{.; й/. 7,7 а у:ълзчог.'даг jvk лптл'лд:' -;влс.г"ч-с;::огс с;!пороточього а-т.б:.:п:Е'! г ; ticwo.'ß до b г.г/г.л ^чсоходдт «штлв:» лллсглл^лплксогл . лА, ,";з л_ллл;;л«и::: ,;>лллп; лл л.л„ следует, что

f;".a •»!:::& in? г область, д.гке-

. ли? л сип.si:::«;- •¡увстчл'к-зйосг.: что, с-ч:"!:,-,йо, с.-.лзого о го: рлегагллл.: сг'рллл леллл;'"!1 ¡.е;лл:. .лл: р.; ■ л:: л,с чугетллллльлог Л':ЛучЗй:Л'Х Г^ТиКО-'Jjf лол СЛЛЛ'Л . ¡ллл, а л. л лолллллтлл: ■ 7J.'. л г^лтл л; л, улгшх 2,5-'J,b ; .Г1/лл, : •„•■¡л.ллг: ллл-лл'-лгллл ллл'л л . л.е ,<л лл^'Л-Стлл л ос 1>лг;. -то с :ол л'лл1 сл елл' " :гл , ч?'- л:, л слл:лл-1лл PJI.'i i -лобл'с ллло, ллгк: л<) лрл лл:ллсл, л лл • . "лллулл л "ллгл-

лобуляна 9 прореагировала с двумя модакуламл ЧСА, ирннаялс^авд-и'разным полииернак частицам. При поЕШяеики величина Адсорбции озрастаот вероятность реакции молекулы иммуноглобулина 9 о мочо-улклп ЧСА, принадлежащими одно Л частице, что .ч& сопровождается еа кода й- латзко-агглптннадии.

Итак, л результате проведенного исследования биле установлено, то существует саадсимооть чунствите яьпости получаемых лг/.оекс-тс-тов от количества белка, адсорбированного на пелкмерних микромерах, которое и оаою очередь, опредсляэтся условиями проведения дсорбцяи. На и ¿од жую чувствительность РЯА удастся получить при злячинах адсорбции,не достигши своего продельного значения и эотавлямэдх 0,3-0,5 от Гг.ако Это соответствует концентрациям злгл в растворе менее I иг/ап. Выбор рН среды для проведения цсорбции белка л постановки реакции латекс-агглютинации та зеке гтредсляется максимальной чувотвитадьностыо латекс-тестов, кото-ая достигается при рН среды 5,8. В ртом случае молекулы белка ^еюг небольшой отрицательный заряд, который достаточен для отаба-азоцпи частиц л не препятствует проведению РЯД.

Таким образом, максимальная чувствительность латеко-то'ста на гьбумян была получена чрп концентрациях белка в растворе менее мг/ил, рН среды 5,8 а ионной сила 0,1 М.'

" Для проверки специфичности дзяноа РДя 1в случае ее маколмаль-зл чувствительности) была проведена реакция латекс-тестов, полу-¡шыг при рП среды 5,8, о нормальной кроличьей сывороткой (ИКС)-)лученчне результаты показали, что при концентрациях чаловечес-М'о сывороточного ельбуглааа в растворе яч«в 0,8 мг/т габле-I с тс д иесяечя$счеокая реакция с нормально!! кроличьей сывороткой »агньчзние ко 1/102-1), А качнкзя с глвцентрация ЧСА в раст-

ге

норе 0,8-1,0 мг/>.!.л неспещцмческая агглытинаЦкя прекращается полностью. Степень юсьадзния поверхности полимерных частиц белю соответствующая ко|Щентраияй ЧСА в растзоро 0,6 мг/мл при рН ор< ды 5,8, равна 48,7 %, то есть специфичность РДА, по-видимому, ог1роп',тястс11, степенью покрытия 'частиц белком.

Для создания модельной знтитедьиой тест-сяотегш необходимо ¿нло1 изучит* адсорбцию человеческого иммуноглобулина б (1^6) ш полгетирольнше частицах. При выборе концентрации было обна-рушено, что при емсоивании ра'стЕоров Солка, в которых его концеь трацця составляла 3. кг/ил :: ш:хв , с 2,"»-ной сус^кчзке^ полимерных частиц Ийолрдается потеря стабильности полимерно,! суспензии. Потеря устойчивости полимерно.! суспензии дли явленно "спонтанной аг-'лютпнщии", проявляемое в появлении видимых глазом агрегатов, везколшо, оо'.яснязтся недостаточно:-'! назищонностыо поверхности "а г:л; белком, нрнподядеи к аграггадп "пстнц при их столкновении. Тс кос объяснение лодтверц'"лется тс«, что при увеличении концентрации с«лка ло Ь их Алл и ма:о ил;! угоиьиен.".: копш.-гряцйК оуог.в! з;:п лоьдаерьих частиц до I % (т.е. ук;иьиевии чолг.чоства аолдоед-¡ш\- ччетпц) питечскзиость спонтанной агглютинации существенно сш дастся, шшоть до ее исчсзнорешя. Кро;,;о этого аа;:денн и дрз гие возаокгьге способы устранения слоптзйяо,: '-итльтикацни, которые заключаются я сиеншя рН ср^дн и полочную область, приводящим к значительному возрастанию эарадэ колекуяьг н'-чуноглобулина 5 (нзо-элег.три чсская точча волоку да 1д 6 , рН 7,В) и, вследствие итого,

и

зарыта ислн..;ерньк частиц с белком не поверхности,, что уаемьиавт воройтпость их столкновения; и пркченешш полимерных ыпсрос.оер, ррвдвчрии-лько яссритых бочком А, спевд-лческг. реагпругди:.: о им— ¡/.упоглоб.'.'ликаии человека.

ír-

ирг. подучзнпи riíTtVi'cPbfic.: r&CT-r.:.o'ret"', or о!'Г.чсг. с.ютлс.поЛ tu*-r.-i:rr;.ii3it:io-i. /»п.- о.го'гча-.^лл-чого л :t.;op i о.ч» д;г. пропо.-'.оппп сорб.ущ iï.i...yi!or.ifiL)y;'i::;;î У U'l'^o л'>'"..:;::л у ; : ipi с .■ : ¡да иупот-

Г'ягьодювп, получае^'.^ £чли:£-5есто1«. Ái. t-rom. с..:-;г:Л'Г.дд cúí»cn- '.юетьороэ (о ;u,/üc с гг/;:*) о й, -.'¡о. сус.»tipne j

яода.-. ОПЬ.'З ЧР.СТГ.Ц I Р.ОГТЯО o y. ">';.>'! y. : : в те-

ЧОКйе чзса пр:- 2 сус; :: Г .ч: г/..-,:■_!;:

0- аеокя&Л'сс«;. . Сод:» С'tri :>:~t: дз-'о '.с-г.т'.гл'зл:-

ИГ?'и?. с гояссяс'.; ОЕГ.И':ЙО?ОКХ., ••. ::¡ ".лукi;r::of>;-л.':ьу S че-

тозего» ¿'сз;'зьта аг з:;сяс;«'. h о I.

I.

Б1Д: иле :ü opa;,:; ш nyzw?» гдаьносгь ЛЗ'ГО'Х-'ЛО'Рй

Кодяг.'нтряцяч Ig 6 чел., f.'iv : 'Л ! !r>:: cpe.'Cí г i jiTi3£P—"¡KííO ! i (г ÖbTr.ya) !

6 и, 6 7,2 ' 1:8 LiC-l +

Гл 0,5 £i,2 Г: 2 i:5i2

S 0, о v,G . X : lo :

î.'3 ншмъттг. j.anim:-: следует, чтс oioyvö^i» Р2А алд со шз-KUÍÍ чуксгвлкгдьюзя» Í2 СЛ/Ч8о' ÍCJ 6 - ô К.Г'/пЛ) i'¡0-

f.ii t б гтд, одуодоБПйй» ;:ло?яо.1 утк<то2 гхдикуг. на и.-,иорхко-отя час-л: а. Ирг роьцачарагяи Ig 3, длиной U,o ит/ки, чунствдтель-кооть p;iA ûVù.iiCTtua'io узедвчапасчпл г доосягает каибо.идгго tria-

чикня поя pri 8,2. .:сн:ч)0д:5 рзакцип латекскоД агглютинации, поста: лоннне на наличие сг.сктанноЛ агглютинации (латакс-тоит с буфером) балл па са-эдо достаточно чаткши я отрлцогельншш. Улучивяие контроля'РЛА происходит ¡юл смсщрш::: píí средь' (7,2 8,6) а шелоч-ную сблпть. ото связало, по-вэддйому, о тем, что вблизи азоэлккт ричоско,; течки иммуноглобулина 6 - молекулы белка електронеЗтраль ни и, следокатальво, агрегэтивно неустойчивы,- что приводит к нестабильности полимерной суспензия . При смещении рН среды в ще-лечяу-о область происходит увелй'чекиб заряда молекулы белка я, вследствие этого, певпаекде агрегат-яг ной устойчивости частиц, по-критпх молекулами иммуаоглсбупияа 6.

Та';-м образом, для получения стабильных и высокочувствительных актитёльшх латекс-тостов адсорбцию человеческого иммуноглобулина 6 слъду зт проводить в цзлочной облаем значений рН и при г.ов..снтрацця бвлха, выбравно» таким образом, чтоби стабильность латекс-„зста сочеталась с ъиюкон чуне тпктг ль костью.

РасомотреЕ адсорбцчи альбум;;на и д-муногдлбуллна G человека аз пслистпролькзд: частицах с 1шт создана-! МОДЙЛЬНМХ дцагьоотд-чесчзх тост-систем, мо;:мо заключить. что а какдом отдельном случае имегстся свои осог>ниооти, определяемые, в огненном, природой белка. Но существуют а общие закономерности, присуще процессу адсорбции белков на полимерных частицах, Ео-первнх, 1.ри увеличении концентрации белка, исас,изуемо2 при адсорбц,"'', чувствительность РЛА падает ; во-вторы::, при проседании адсорбции лри значениях píi среди, блазккх к яэоэлекгркчосхоЯ точке белка, поллкернля суспснй/л теряет стабильность; в третьи::, специфичность латекс-теста • определяется стсаскгю неевд. яш лолемзрноЛ поверхности белком.

Ерезде чем от адсорбции индивиду а ль ш;х бвлксв в i/одслыых системах дереЛтя к реальным теотт-елстемам, необходимо рассмотреть адеорбцию емвед белков. Это связано с тем, что с&лчпо получить достаточно чгстке йодкя не удается и всегда цряходотоя ш-еть дело со смесью белкой. Ь момент сорбции возникает конкуренция белков за места связывания. Для изучения конкурентно;» адсорбции е качестве смеои белков моасет бта использована сыворотка крови человека. Конкурентной адсорбция белков была изучена .ча яолистирольнах частицах со средним диаметром и,6 мкм (коэффициентом цудздисдзро-ности К = I,ö05) с использованием мокосяецимичеоких антисиворо-ток к иядиведуальшм белкам сывороети крова чало века, для разве- . дзния антисивероток к индивидуальны белкам я приготовлении ла~ теко-теотсв Ьрдмоняли фосфат но-физкодогически.! раствор (FBS ), pH 7,4..

Пр;: изучении адсорбции балков на полистиролыых .'.инфосферах кг алаоя (дальняя сыворотка) оказалось, что удается зарегистрировать овяэыаанме с шверхноогь» частдц только J> -лпгюдротппдов (J) -ЛП)..Зто'Г факт 'может свидетельствовать о том, что прочность й скорость связывания о поверхностью шкросфар у Jb —Л1£ значительно выше, чем у кэех Стальных белков. Кроле того, поскольку раз-герп молекулч р - лияопротзвдов зтчптзльяо больше, чем у других белков, есть оснононя/: лр.едлолоклть, что JJ-ЛИ могут лиоо акрени-ровать, другга абсорбированные оелкд и предотвращать их ьзашо-дсас-таде с aiiT::cu2opoTKcil, П}13о оугдестиекио уЕвдачямть расстояние, к*! которое сдсаобш облквауьоя хюЕорхноста гакрсс^ср, л тек аредсувраг^ь их ci>,о пленяв с ао«от,ы> антител. Доело нн-¿убодш гакроп^ср с сниероткол, кокоре.! чредваргтедьно yum.': ли ^-n:::ic:.poTf.;-.iH, дггдумияцп вабкщаатоя с ытпыиор

22 : • • камл к иммуноглобулину 6 и альбумину. Это означает, чт; после'

удаления -jb-Ш из сшоротки крови из поверхности шкросфер адсорбируются альбумин и иммуноглобулине. ,'

¡Ipi" создании актителхНых лаазке-теотоа на j¿e конкретные забо лояания, например; дифтерию, учитывая влияние ^-лиаопрогеадов нь процесс адсорбции, па по дисшрагшшх частицах била пммебйли- . зогрг.а ке ьельная сиьоротка, а выделенная из сыворотку булинопая (Гракцил с предварительным удалением из оцворотвл ^З-ли пог.рстеидоЕ.

Антнтелькие латекс-тесты ü:< дифтерлю били получена ¡¡а отече-

/

стнзнных повветиролььцх частицах со средним диаметром u,G мга и полпстпрол:,ш:с частицах с дшкетроч 0,8 ыкм гирг.г "Рон-Иулеьк" (Сранцил). Частицы <'"крш "Гон-Нуле нк-' широко используются зару-боотми :Пр.мг.мн длл приготовления даапюогдчеоках препаратов. Нд частицах была кммоонлигоааиа надело иная и? лошадиной и-^мтаериП-нсЛ з«ворот>в. Р -глсбу дииоеол Араг.ция, диалазосаикая против FES рК 7,0. ^;оорбц"') £ -глобулинов.! ракцда но '¡ретинах мнрмн "Рон-Щлс;;к" выполняли согласно узтодике, яредптавлойио.ч ijupacii, в на.отечественных частицах согласно ..методике, одиоаипоЛ ьышо . J'-гя булввоюя фракция, полученная оечкдзьием сульфатом ажвенм, кошт содержать громе иммуноглобулинов к другие плазменные белки, которое г,:.;гут выступать в роли доколштелыых стабилизаторов суспед-зки полиморнях частиц, покритих ^ -Фракцией, что позволяет про-еодить •'•иоорбцип при рН 7.8 (вблизи пзсздехтрической тачки ко лаку лы 1^6).

Реакцию латекс-згглютпазцип проводили с дкЛдарнинш»: анатоксином. Шли поставлен следуввдпз коитреля i¡lh: аз гекс-тест с б$фо~ р,ом Оговтроль на иоддчче снонтонной агглхиссвацри), латекс-тест о

:••. : ' ?3

онзороткий здорового человека (контроль специфичности). Полученные реэультатм ;предотавдени н таблице 2.

;; , '-' Таблица 2

Чувствительность штательлих латеио-тестоя на дифтерию, лолучешшх ка основе отечественных частиц и ч?стиц ;*армы "Рон-Пулэш"

¡Разведение \ Ковтролд ¡?М

Латекс , . {антигена. ;---г

¡илажедц ■ Гсынэротка здорового

■ ' ! '■УР-'Р ¡человека

Отечественшй ; ' 1:8192 . пЭстааор:' . / . 1:8192

' Из приведенных донннх видно, что по'чувствительности латекс-тест, Полученный при использовании отечественных частиц, не уступает латекс-тесту ,ва основе данортних частиц производства -'ирмы "Рон-Пуленк!', Франции. Отсутствие реакции с сывороткой здорового

человека указывает на высокую еде щгТцчн ость получениях датекс-

í

тестов.

( ■

; ' ВШЮДЫ

I. УстаноБЛвно, что неоднородная структура полистирольнСх и полиакреленг.ошх микроссуер обусловлена особенностями протекания полимеризации в водкой среде.

2. Показали преимущества использования е реакциях латекс-аг-глвтилацш: лоллстирольшх микрос^ер, стабилизированных ди-л-то-лил-о-карЗалкохснйадавдсбанолал,

У. Узтано.тлзн:-: зах-тскмостл количества .зльоумина, адсорбированного на полк!таролькюс частицах,от докцектрации белка г. исходном расч-воре при разлкчшх зы-'.маниях. рЕ срсды,определены условия,

при которых набдвдаетоя максимальная чувствитатьность латекс-тестов.

<1. Изучена конкурентная адсорбция белков риворотка крова человека и доказано, что наибольшие сродство!,i к долистирольной поверхности оавда-ът J^-липонротешш.

5. Создан антитодьняй латекс-тост на оЬкове д'атастдрольних ;лк:срос;рзр, полученных в присутствии да-д-такил-о-ка^ал'кбксвфэншг-карбннола, для идентификации дифтерийного' анатоксина.

Gc-ношое содераалав диссертации опубликовано а следующих ра-' ботах:

1. Еадаяцева Л.И., Крашзнинкикова И.Г., Г/сев С.А., IIobü-лдй Тл';'., Дорохова ¿¡.А., Ьогачева А.Н., Каякян В.Д. Роль природа стабилизатора ирл синтеза монодисперсных дои:стиральных суопен-'з;зй.// I Зсзсеюзная кочЛеренцчя "Радикальная полямориьация": Тезисы./ Горький. - 1989. - 0.218.

2. Дорохова ¿.Д., КрашэяляшиоЕа И.Г., Бахаров В.Н. Исслэдо-галло структур* полн:.:зрикх г.шкрис^ор, используоыых в пшукохимки. // Л Нсоссьзиая ко^ер'с.ада тлодых учошос а специалистов до физически* хкмш "Физическая хь'мия - SO": Тезисы./ LI.: КЖТЗХКМ.-1990. - С,39.

3. Gusev S.A., lovalil i'.I.u, Dorocho/а К.А,, xetrunin D.D., Gr.ickova I.A., KraserJ.nni.kova 1.0. Adsorption of protcins C.t * pclyntyrene microspheren // РоИшеху.-1990.-РОК X::ZV.-i;ß 5.-157-159-'

4-. дардаш Г.И., Ахлетьева ¿.И., Изшникоя А.Л., Грацкова H.A., • Гусев С.А., Дорохова ¿.к. Исследование реакции латексной агашм- -нации методом светорассеяния// Лабораторное дэло.-19УО.~й 5.-0.55-58.

1П'' экэ

Ротаприятная В Ломоносова

Л ~г

9- J-