Полимеры-носители биологически активных веществ на основе сополимеров 2-деокси-2-метакриламидо-D-глюкозы с N,N-диметил- и N,N-диэтиламиноэтилметакрилатами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

ЗОПОТОВА Юлия Игоревна

ПОЛИМЕРЫ-НОСИТЕЛИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ОСНОВЕ СОПОЛИМЕРОВ 2-ДЕ0КСИ-2-МЕТАКРИЛАМИД0-0-ГЛЮК03Ы С И,Л/-ДИМЕТИЛ- И МИ-ДИЭТИЛАМИНОЭТИЛМЕТАКРИЛАТАМИ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Специальность 02.00.06 - высокомолекулярные соединения

1У АПР 2214

Санкт-Петербург 2014

005547009

005547009

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте высокомолекулярных соединений Российской академии наук (ИВС РАН).

Научный руководитель: Панарин Евгений Федорович,

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор.

Сивцов Евгений Викторович,

доктор химических наук, доцент Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)», факультет химической и биотехнологии, кафедра химической технологии пластмасс, доцент кафедры;

Шамолина Ирина Игоревна

доктор технических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет технологии и дизайна», институт прикладной химии и экологии, кафедра инженерной химии и промышленной экологии, профессор кафедры.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет».

Официальные оппоненты:

Защита диссертации состоится "19" июня 2014 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.229.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте высокомолекулярных соединений Российской академии наук по адресу: 199004, Санкт-Петербург, Большой пр. В.О., д. 31, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте высокомолекулярных соединений Российской академии наук (http://www.macro.ru/council/zolotova_dis.pdf).

Автореферат разослан "03" апреля 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор химических наук Виноградова ЛЬдмила Викторовна

/ ' /

■ *

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В последние десятилетия большое внимание уделяется созданию полимерных производных биологически активных веществ (БАЕ) на основе водорастворимых полимеров-носителей. Свойства полимеров-носителей определяются их составом, архитектурой, гидрофильно-гидрофобным балансом, молекулярно-массовыми и другими характеристиками. В частности, для целей генной терапии большой интерес представляют графт- и блоксополимеры катионных и нейтральных гидрофильных мономеров. Такие сополимеры способны образовывать более стабильные комплексы, чем соответствующие гомополимеры и статистические сополимеры, эффективнее защищать ДНК от действия ферментов. В ряде случаев при их использовании был достигнут более высокий уровень доставки ДНК в клетки.

Одним из способов оптимизации свойств полимеров-носителей является варьирование их гидрофобности, которая влияет на их взаимодействие с клеточными мембранами, с молекулами ДНК, на способность растворять нерастворимые в воде БАВ. Использование рН- и термочувствительных полимеров позволяет создавать системы с контролируемым выделением БАВ.

Перспективными полимерами-носителями являются гликополимеры, в частности, поливинилсахариды - водорастворимые нетоксичные синтетические полимеры, содержащие в боковой цепи остатки Сахаров и способные к биоспецифическим взаимодействиям и направленному транспорту БАВ в определенные органы. При этом одними из наиболее широко изученных поливинилсахаридов являются полимеры 2-деокси-2-метакриламидо-0-глюкозы (МАГ). Поливинилсахариды не содержат групп, обеспечивающих их связывание с ионогенными БАВ, поэтому для использования этих полимеров в качестве полимеров-носителей необходимо введение в их состав функциональных групп.

Особый интерес представляют сополимеры винилсахаридов с аминосодержащими мономерами, в том числе с диалкиламиноэтилметакрилатами. Такие сополимеры способны сочетать свойства, присущие гомополимерзм обоих типов мономеров, например, специфически связываться с имеющимися на поверхности клеточных мембран рецепторами, что характерно для Сахаров, и при этом связывать и компактизовать молекулы ДНК за счет наличия аминогрупп и образования интерполиэлектролитных комплексов.

Среди полидиалкиламиноэтилметакрилатов широкое применение нашли полимеры на основе А/,Л/-диметиламиноэтилметакрилата (ДМАЭМ) и Ы,Ы-диэтиламиноэтилметакрилата (ДЭАЭМ). Они обладают антимикробными, противовирусными свойствами, способны восстанавливать ионы серебра и золота и стабилизировать образующиеся наночастицы металлов, проявляют рН- и термочувствительность, поли-ДМАЭМ является одним из наиболее перспективных полимеров для применения в генной терапии. При этом в литературе отсутствуют сведения о сополимерах диалкиламиноэтилметакрилатов с МАГ, представляющих несомненный интерес для использования их в качестве полимеров-носителей БАВ.

Таким образом, актуальность настоящей работы определяется необходимостью разработки способов получения новых полимеров-носителей, обладающих собственной биологической активностью, - функциональных водорастворимых аминосодержащих поливинилсахаридов, используемых, в частности, для образования интерполиэлектролитных комплексов с ДНК.

Целью работы является разработка методов синтеза водорастворимых полимеров-носителей БАВ - сополимеров МАГ-ДМАЭМ и МАГ-ДЭАЭМ различной

архитектуры, варьируемого состава, молекулярно-массовых параметров, гидрофильно-гидрофобного баланса, исследование их структуры и свойств.

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

- исследование закономерностей радикальной сополимеризации МАГ с ДМАЭМ, ДЭАЭМ: изучение кинетики и определение относительных активностей сомономеров; синтез статистических сополимеров МАГ с диалкиламиноэтилметакрилатами различного состава и молекулярной массы; разработка методов синтеза графт-сополимеров МАГ с диалкиламиноэтилметакрилатами; синтез дифильных сополимеров с регулируемым гидрофильно-гидрофобным балансом;

- изучение конформационных состояний синтезированных полимеров в водных растворах, их иммуномоделирующих, противоопухолевых и антимикробных свойств, восстанавливающей способности и характеристик нанокомпозиций серебра на их основе, исследование свойств комплексов полученных сополимеров с молекулами ДНК.

Методы исследования. В работе использованы современные методы синтеза и анализа, физико-химические методы исследования полимеров (поляризованная люминесценция, ИК, УФ и ЯМР спектроскопия, тонкослойная хроматография, потенциометрическое титрование, вискозиметрия, дилатометрия, атомно-силовая и просвечивающая электронная микроскопия, электрофорез).

Научная новизна работы заключается в следующем:

- разработаны методы синтеза ранее не описанных водорастворимых рН-чувствительных полимеров-носителей БАВ - статистических двойных и тройных сополимеров винилсахарида МАГ с диалкиламиноэтилметакрилатами и их четвертичными аммониевыми солями, а также графт-сополимеров в широком диапазоне составов, молекулярных масс и варьируемой гидрофобности;

- впервые исследован процесс сополимеризации МАГ с ДМАЭМ или с ДЭАЭМ: изучена кинетика и определены относительные активности сомономеров; проведена оценка конформационных состояний синтезированных полимеров в растворах;

- впервые обнаружена способность сополимеров МАГ-ДМАЭМ и МАГ-ДЭАЭМ восстанавливать ионы серебра и стабилизировать образующиеся нанокомпозиции Ад0, ускоряя при этом процесс восстановления по сравнению с восстановлением с помощью соответствующих гомополимеров и их смесей.

Практическая значимость работы состоит в том, что:

- синтезированные сополимеры и нанокомпозиции серебра на их основе перспективны в качестве иммунодепрессантов и антибактериальных веществ;

- синтезированные сополимеры МАГ с диалкиламиноэтилметакрилатами обладают противоопухолевой активностью, могут быть использованы для целей генной терапии.

На защиту выносятся следующие положения:

- радикальная сополимеризация винилсахарида МАГ с диалкиламиноэтилметакрилатами з тзюке последующие полимераналогичные превращения путем алкилирования йодистыми алкилами позволяют получать водорастворимые сополимеры с варьируемым составом, молекулярно-массовыми характеристиками, информационными состояниями, регулируемым гидрофильно-гидрофобным балансом; указанные сополимеры проявляют биологическую активность на молекулярном, клеточном уровне и уровне макроорганизма;

- впервые синтезирован макромономер МАГ, радикальная сополимеризация которого с ДМАЭМ или ДЭАЭМ приводит к получению привитых сополимеров,

основная цепь которых представляет собой полидиалкиламиноэтилметакрилат, а привитые цепи — поли-МАГ;

- использование статистических сополимеров МАГ с диалкиламиноэтил-метакрилатами обеспечивает восстановление ионов серебра и стабилизацию его нанокомпозиций, при этом процесс восстановления идет с более высокой скоростью, чем о случае применения гомополимеров или их смесей;

- комплексообрззование ДНК с графт-сополимерами МАГ-ДМАЭМ приводит к образованию более стабильных и более однородных комплексов меньшего размера по сравнению с комплексами статистических сополимеров.

Обоснованность и достоверность полученных результатов и выводов на их основе подтверждаются хорошей воспроизводимостью и согласованностью результатов, полученных при использовании независимых методов исследований.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на российских и международных конференциях: II, III, IV, VIII, IX Санкт-Петербургская конференция молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 31 января - 2 февраля 2006 г., 1-19 апреля 2007 г., 15-17 апреля 2008 г., 12-15 ноября 2012 г., 11 - 14 ноября 2013 г.), Международная конференция по органической химии «Органическая химия от Бутлерова и Бейльштейна до современности» (Санкт-Петербург, 26-29 июня 2006 г.), 6th International Symposium «Molecular order and mobility in' polymer systems» (St.-Petersburg, June 2-6, 2008), Всероссийская межвузовская научная конференция студентов и аспирантов «XXXVII неделя науки в СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 24 - 29 ноября 2008 г.), Всероссийская конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международн. участием по химии и наноматериалам «Менделеев-2013» (Санкт-Петербург, 2-5 апреля 2013 г.), Шестая Всероссийская Каргинская конференция «Полимеры-2014» (Москва, 27-31 января 2014 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в отечественных и зарубежных журналах и тезисы 12 докладов, получен 1 патент РФ.

Личный оклад автора состоял в участии в планировании работы, в проведении всех экспериментов по синтезу полимеров и в анализе полученных результатов, подготовке публикаций.

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, выводов, списка используемой литературы (155 наименований). Работа изложена на 119 страницах и включает 15 таблиц и 21 рисунок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во ВВЕДЕНИИ обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи работы, основные положения, выносимые на защиту, научная новизна и практическая значимость.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ содержит краткий обзор методов синтеза винилсахаридов и их гомополимеров, аналитическое рассмотрение способов получения гидрофильных статистических, графт-, блок- и звездообразных сополимеров винилсахаридов, в частности МАГ, в том числе сополимеров с аминосодержащими мономерами.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ содержит описание методик синтеза мономера МАГ, линейных и графт-сополимеров МАГ с ДМАЭМ и ДЭАЭМ различного состава, алкилирования статистических сополимеров МАГ-ДМАЭМ йодистыми алкилами с различной длиной углеродной цепи. Рассмотрен способ получения

нанокомпозиций серебра на основе синтезированных (со)полимеров. Приведены методы определения состава сополимеров, относительных активностей сомономеров в процессе сополимеризации, начальных скоростей сополимеризации. Представлен метод определения наносекундных времен релаксации, характеризующих внутримолекулярную подвижность макромолекул.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В данной работе были разработаны методы синтеза сополимеров МАГ-ДМАЭМ и МАГ-ДЭАЭМ с различной архитектурой, составом, молекулярной массой, гидрофильно-гидрофобными свойствами, сведения о которых в литературе отсутствуют. Исследованы закономерности процесса сополимеризации, структура и свойства сополимеров, а также оценены потенциальные области их применения.

3.1. Статистические сополимеры МАГ-ДМАЭМ и МАГ-ДЭАЭМ

Линейные статистические сополимеры получали методом свободнорадикальной сополимеризации МАГ с ДМАЭМ или ДЭАЭМ (инициатор - динитрил азо-бис-изомасляной кислоты (ДИНИЗ), растворитель - Л/,Л/-диметилформамид (ДМФА)) по схеме:

ДИНИЗ ДМФА, 6СГС

=о /=о

но НМ

илг I 1

шг ОН он V

Где К = СН3 [ДМАЭМ), С2Н5 ЩЭАЭМ) к

В литературе нет сведений об относительных активностях сомономеров, кинетике процесса сополимеризации. Вместе с тем реакционная способность сомономеров определяет микроструктуру образующихся сополимеров, которая является важной характеристикой полимеров-носителей, способной оказывать влияние на связывание ими БАВ и на свойства полученных полимерных производных. Поэтому в работе была изучена скорость процессов полимеризации и определены относительные активности сомономеров.

При всех соотношениях мономеров в исходной смеси процесс сополимеризации протекает с высокой скоростью, выход сополимеров за 3 - 4 ч составляет 60 - 80 %, за 24 ч - 90 - 95 %.

В Таблице 1 приведены значения начальных скоростей Уо полимеризации, рассчитанные за время, при котором для всех составов наблюдается линейный ход зависимости конверсии от времени, при [М1+М2] = 0.9 моль/л, [ДИНИЗ] = 0.03 моль/л.

Начальная скорость гомополимеризации МАГ примерно в 2 раза выше скоростей гомополимеризации ДМАЭМ и ДЭАЭМ. Значения начальных скоростей сополимеризации характеризуются величинами, промежуточными между значениями, найденными для гомополимеризации сомономеров, уменьшаясь с увеличением в исходной мономерной смеси доли диалкиламиноэтилметакрилата. Найденные значения \/0 в системах МАГ-ДМАЭМ и МАГ-ДЭАЭМ близки.

На Рисунке 1 приведены зависимости состава сополимера от состава исходной смеси при выходе не более 5 %. Состав сополимеров определяли методом потенциометрического титрования третичных аминогрупп звеньев диалкиламиноэтилметакрилата и методом ЯМР1Н спектроскопии. Значения относительных активностей сомономеров г, и г2 рассчитывали методами Файнемана-

Росса, Келена-Тюдеша приведены в Таблице 2.

и Езрилеева-Брохиной-Роскина, средние значения

Таблица 1 - Значения начальных скоростей гомополимеризации МАГ, ДМАЭМ и

[М,]: [М2], мол.% УохЮ4, моль/лхсек

МАГ-ДМАЭМ МАГ-ДЭАЭМ

100:0 1.67 1.67

90 : 10 1.66 1.54

70 : 30 1.17 1.11

50 : 50 0.93 0.84

30:70 0.89 0.75

10 : 90 0.85 0.73

0 : 100 0.82 0.72

[т2], мол.% 100

[т2], мол. % 1001

100

40 60 [М2], мол.%

100

40 60 [М2], мол.%

Рисунок 1 - Зависимость состава сополимеров МАГ-ДМАЭМ (а) и МАГ-ДЭАЭМ (б) при низких выходах от содержания диалкиламиноэтилметакрилата в исходной смеси (М1 - МАГ, М2 - диалкиламиноэтилметакрилат).

Таблица 2 - Значения относительных активностей мономеров в системах МАГ-

М2 Г\ Гг

ДМАЭМ 0.83 + 0.21 2.37 + 0.26

ДЭАЭМ 0.87 ±0.16 3.93 ± 0.74

Исследованные сомономеры ДМАЭМ и ДЭАЭМ близки по реакционной способности в процессе сополимеризации с МАГ. Для обеих систем Г: < 1, г2 > 1, т.е. растущие цепи преимущественно реагируют с ДМАЭМ или ДЭАЭМ, соответственно.

Исследовано влияние условий синтеза на характеристики сополимеров, полученных за 24 ч. Состав синтезированных сополимеров коррелировал с составом мономерной смеси. Для сополимеров, содержащих менее 20 мол.% звеньев диалкиламиноэтилметакрилата, была проведена оценка значения молекулярной

массы (ММ) по уравнению Марка-Куна-Хаувинка, найденному для гомополимера МАГ. Полученные результаты приведены в Таблице 3.

Таблица 3 - Условия сополимеризации и характеристики полученных статистических сополимеров МАГ с диалкиламиноэтилметакрилатами (М1 - МАГ, М2 - ДМАЭМ или ДЭАЭМ)

Растворитель - ДМФА, [М1 + М2] = 10 масс.%, 60 °С, 24 ч

№ оп Условия сополимеризации Характеристики сополимеров

[М2] [М,]: [М2], мол.% [ДИНИЗ], масс./мол.% от [М1 + М2] [меркаптан], мол.% от [М, + М2] [т2], мол.% [пка. дл/г ММ*10"3 [п]дМФА . дл/г

1* ДМАЭМ 90:10 0.5 / 0.7 — 7.6 0.23 253 не опр.

2 —«»— 90:10 2.0/2.8 — 7.0 0.13 112 не опр.

3 —«»^ 90:10 5.0 / 6.8 ■ — 8.0 0.11 88 не опр.

4 —«»— 90 : 10 0.7/1.0 5 7.9 0.07 46 не опр.

5 —«»— 90: 10 1.4/2.0 10 7.6 0.05 29 не опр.

6 —«»— 90:10 3.4 / 5.0 15 8.2 0.04 21 не опр.

7 —«»— 90:10 3.4 / 5.0 20 8.5 0.02 8 не опр.

8 —«»— 75:25 2.0 / 2.7 — 18.7 0.12 100 не опр.

9 —«»— 50:50 2.0/2.4 — 45.2 0.10 — не опр.

10 —«»— 30:70 2.0/2.2 — 65.1 0.09 — не опр.

11 ДЭАЭМ 90:10 2.0/2.8 — 9.6 0.13 112 0.15

12 —«»— 70:30 2.0 / 2.6 — 27.2 0.14 — 0.12

13 —«»— 50 : 50 2.0 / 2.4 — 48.2 не опр. •— 0.10

14 —«»— 25:75 2.0/2.1 — 76.3 не опр. — 0.12

* - [М1 + М2] = 20 масс.%

Как можно видеть из данных Таблицы 3, варьирование исходной концентрации мономеров и инициатора позволяет регулировать величину характеристической вязкости [п] и, следовательно, ММ сополимеров (Таблица 3, опыты 1-3). В использованных условиях синтезированы полимеры с ММ = (90-250)*103. Во многих случаях полимеры-носители должны обладать более низкими значениями ММ, не превышающими (20-30)*103. Для снижения величины [п] и ММ полимеров был использован регулятор роста цепи - меркаптан цистеамин гидрохлорид. В результате с выходом 70 — 85 % получены сополимеры с невысокими значениями [п] = 0.02 - 0.07 дл/г, которые зависят от мольного соотношения [меркаптан]: [мономер] и [меркаптан]: [ДИНИЗ] (Таблица 3, опыты 4 - 7). Для нерастворимых в воде сополимеров МАГ-ДЭАЭМ с содержанием звеньев ДЭАЭМ свыше 30 мол.% определение величины [п] проводили в растворе ДМФА (Таблица 3, опыты 13 и 14).

Свойства макромолекул в растворах во многом определяются их конформационными состояниями. Синтезированные сополимеры исследовались методом поляризованной люминесценции в лаборатории люминесценции, релаксационных и электрических свойств полимерных систем ИБС РАН. Были определены наносекундные времена релаксации темп, характеризующие внутримолекулярную подвижность макромолекул. Для проведения этих исследований были синтезированы люминесцентно меченые полимеры методом радикальной сополимеризации соответствующих мономеров с 9-антрилметилметакриламидом:

=о

НО NN О.

ОН

ОН

1М—I*

И

Где К = СН3 (ДМАЭМ), С2Н5 (ДЭЛЭЗД На Рисунке 2 приведены зависимости полученных значений Темп от состава

сополимеров.

т . не

вмп

140-,

120-

100-

80-

60-

40-

20-

Рисунок 2 - Зависимость значений времен релаксации тВмп от состава сополимера:

1 - МАГ-ДЭАЭМ (рН = 8.5),

2 - МАГ-ДМАЭМ (рН = 8.5),

3 - МАГ-ДМАЭМ (рН = 3.0).

0 20 40 60 80 100 Содержание звеньев аминоэтилметарилата

в сополимере, мол.%

Для гомополимера МАГ тВмп = 19 не, что выше значений тВМп для гибкоцепных полимеров и характерно для макромолекул, содержащих в боковой цепи массивные заместители. Для сополимеров тВмп возрастают с увеличением содержания неионизованных звеньев диалкиламиноэтилметакрилата и стремятся к значениям Твмп гомополимеров ДМАЭМ и ДЭАЭМ - 70 и 127 не, соответственно (Рисунок 2, кривые 2 и 1), что намного превышает значения, характерные для. незаряженных макромолекул гибкоцепных полиэлектролитов. По-видимому, это связано с гидрофобными взаимодействиями неполярных метильных групп ДМАЭМ и более сильными гидрофобными взаимодействиями этильных групп ДЭАЭМ, что приводит к уменьшению подвижности участков цепи и компактизации макромолекулярного клубка.

При протонировании звеньев ДМАЭМ в сополимерах времена релаксации уменьшаются и приближаются к значениям тВмп, характерным для ионизованного гомополимера ДМАЭМ - 30 не (Рисунок 2, кривая 3). Это, по-видимому, обусловлено электростатическим отталкиванием протонированных звеньев, в результате чего гидрофобное взаимодействие метильных групп уменьшается, и подвижность участков цепей макромолекулы возрастает.

Для оценки конформационных состояний был также проведен анализ кривых титрования сополимеров в координатах рКкдж(а) (Рисунок 3). Известно, что форма этих кривых отражает состояние молекул в растворе. рКкдж = рН - log(a) / (1-а) (уравнение Хендерсона-Хассельбаха), где а - степень протонирования аминогрупп, рКкдж = рКо + ДрК, рКо - константа ионизации группы в изолированном состоянии, АрК = 2.3 lgRTüG3n характеризует изменение энергии электростатического взаимодействия между заряженными группами цепи и протоном при увеличении заряда на цепи. В случае сополимеров МАГ-ДМАЭМ любого состава (Рисунок За) с увеличением а происходит монотонное, почти линейное снижение значения рКкдж. Такая форма кривых характерна для полиэлектролитов, статистический клубок макромолекул которых набухает в процессе титрования благодаря электростатическому отталкиванию между заряженными группами.

Рисунок 3 - Кривые потенциометрического титрования рКкдж (а):

а) МАГ-ДМАЭМ: 7 (1), 18 (2), 45 (3) и 75 (4) мол.% ДМАЭМ;

б) МАГ-ДЭАЭМ: 18 (1), 68 (2) и 76 (3) мол.% ДЭАЭМ.

В случае сополимеров МАГ-ДЭАЭМ значения рКкдж также монотонно уменьшаются с увеличением а, если содержание звеньев ДЭАЭМ не превышает 60 мол.% (Рисунок 36, кривая 1). При содержании ДЭАЭМ > 60 мол.% в средней части кривой при значениях а от 0.3 до 0.7 наблюдается плато (Рисунок 36, кривая 2, область II), наличие которого может быть объяснено более сильными гидрофобными взаимодействиями неполярных этильных групп звеньев ДЭАЭМ.

Полученные обоими методами (анализом кривых титрования и методом поляризованной люминесценции) результаты показывают, что сополимеры МАГ с ДМАЭМ и ДЭАЭМ являются рН-чувствительными полимерами. Состояния макромолекул этих сополимеров в водных растворах зависят от рН, в неионизованном состоянии внутримолекулярные взаимодействия приводят к формированию более компактных структур по сравнению со структурами в ионизованном состоянии. Это может быть использовано для создания систем с контролируемым снятием БАВ с полимера. При этом конформационные состояния сополимеров МАГ с ДМАЭМ и с ДЭАЭМ различаются. Для более гидрофобных сополимеров ДЭАЭМ в водных растворах формируются более компактные структуры, для которых характерна меньшая внутримолекулярная подвижность.

Варьирование гидрофобное™ полимеров является одним из способов оптимизации их структуры и свойств. Помимо использования мономеров варьируемой гидрофобности (ДМАЭМ и ДЭАЭМ), регулирование гидрофобности полимеров возможно введением в состав полимера с определенными характеристиками групп различной гидрофобности с помощью метода полимераналогичных превращений.

3.2. Синтез сополимеров с регулируемым гидрофильно-гидрофобным

балансом

С целью синтеза сополимеров МАГ с регулируемой гидрофобностью методом радикальной сополимеризации был получен статистический сополимер МАГ-ДМАЭМ (44 мол.% звеньев ДМАЭМ), и далее проводили его апкилирование йодистыми алкилами (К1) с различной длиной углеродной цепи (С2, С3 и С12) по схеме:

ДМФА-

/=°

НО НЫ о

4-4—-Г-ОН ч0—^Л^-ОН

он

Н3С

Где Я = С2Н5. С8Н17, С12Н25

С выходом 85-93 % были получены тройные сополимеры, содержащие наряду со звеньями МАГ и ДМАЭМ звенья четвертичных аммониевых оснований ДМАЭМ-К1, количество которых определяли методом потенциометрического аргентометрического титрования. Условия алкилирования и характеристики сополимеров приведены в Таблице 4.

При содержании алкилирсванных звеньев 30 - 35 мол.% растворимость сополимера в воде зависит от длины алкильного радикала. Так, в случае алкилирования С2Н51 полученный сополимер хорошо растворим в воде (60 масс.%), в случае СзН-Ы растворимость резко падает (5 масс.%), сополимер, алкилированный С12Н251, в воде не растворим. Уменьшение количества алкилированных С12Н251 звеньев до 22 мол.% позволяет получить растворимый сополимер.

И-СН,

НО. НЫ

л-ОН ) -^-ОН /

°Н Н3С

-СН3 д+-сн3 н3с к

Таблица 4 - Условия алкилирования сополимера МАГ-ДМАЭМ различными йодистыми алкилами и свойства полученных сополимеров

Исходный сополимер: [МАГ] : [ДМАЭМ] = 56 : 44 мол.%, иШа2зо,, = 0.09 дл/г

Алкилирование Характеристики алкилированного сополимера

№ оп. 14 [ДМАЭМ] : [И], моль:моль [ДМАЭМ-т], мол.% Степень алкилирования, % Р-римость в воде [п]ыа250„ , дл/г

1 С7Н5 1 :1.1 28.3 64.3 Р не опр.

2 с2н5 1 :1.3 29.8 67.7 Р не опр.

3 С2Н5 1 :1.5 30.3 68.9 Р (60 %) 0.10

4 С8Н17 1 :1.5 38.5 87.5 Р (5 %) 0.03

5 С12Н25 1 :1.5 33.2 75.5 НР не опр.

6 С12Н25 1 :0.75 22.3 50.7 Р (20 %) 0.02

У сополимера, алкилированного йодистым этилом (Таблица 4, опыт 3), [П] = 0.10 дл/г, что практически не отличается от значения [п] исходного неалкилированного сополимера МАГ-ДМАЭМ (0.09 дл/г). С увеличением длины алкильного радикала происходит резкое падения значений характеристической вязкости до 0.2 - 0.3 дл/г, что свидетельствует о компактизации полимерного клубка.

Величина [г)] зависит не только от длины гидрофобного алкильного радикала, но и от содержания апкилированных звеньев. В Таблице 5 приведены результаты по влиянию состава тройного сополимера МАГ-ДМАЭМ-ДМЛЭМ-С^Нгб' на [п]- Как можно видеть, с увеличением содержания гидрофобных групп в сополимере его [г|] уменьшается, и, следовательно, происходит компактизация макромолекул.

Таблица 5 - Влияние степени алкилирования йодистым додецилом сополимера МАГ-ДМАЭМ на его характеристическую вязкость

Исходный сополимер: [МАГ|: [ДМАЭМ] = 55.5 :44.5 мол.%, [п]нсьмза = °-28 Д"/г

№ оп. Исходное соотношение [ДМАЭМ]: [С12Н251], мол.% Характеристики сополимеров

[ДМАЭМ'РЯ], мол.% Степень алкилирования, % ЫнСШаС!. ДЛ/Г

1 1 :0.25 4.8 10.8 0.18

2 1 :0.5 14.1 31.7 0.08

3 1 : 1 25.9 58.2 0.03

Таким образом, реакциями 8 цепях - алкилированием звеньев ДМАЭМ сополимера МАГ-ДМАЭМ - синтезированы тройные сополимеры МАГ-ДМАЭМ-ДМАЗМ-И!, различающиеся количеством четвертичных аммонийных групп, длиной алкильного радикала, гидродинамическими характеристиками, гидрофильно-гидрофобным балансом.

3.3. Графт-сополимеры

Большой интерес, в частности, для целей генной терапии представляют графт- и блоксополимеры на основе катионных и нейтральных гидрофильных мономеров, способные образовывать более стабильные комплексы с ДНК, чем соответствующие гомополимеры и статистические сополимеры, и эффективнее защищать ДНК от действия ферментов.

В данной работе с целью получения графт-сополимеров МАГ-ДМАЭМ был использован метод сополимеризации диалкиламиноэтилметакрилата с макрономером МАГ. Для синтеза макромономера - гомололимера МАГ с концевой двойной связью - на первой стадии получали поли-МАГ с одной концевой аминогруппой (поли-МАГ-Ж^НО). Выл использован регулятор роста цепи, функциональный меркаптан цистеамин гидрохлорид - НЗ-СНг-СНг-ЫНг'НС!, реакция протекала по схеме:

ДИНИЗ, HSCH2CH2NH2'HCI

ДМФА, 60°С

=0

NH2'HCI

НО НЫ Но нм

он он

Содержание аминогрупп в полимерах оценивали слектрофотометрически по поглощению комплекса, образуемого первичными аминами и их солями с 2,4,6-тринитробензолульфокислотой, Хтах = 420 нм.

Условия синтеза и характеристики полученных полимеров представлены в Таблице 6.

Таблица 6 - Условия синтеза и характеристики поли-МАГ с концевой ЫН2-фуппой

Условия синтеза Свойства поли-МАГ

№ оп. [МАГ], моль/л [ДИНИЗ], мол.% / масс.% от мономера [меркаптан], мол.% от мономера Выход, масс.% [п]ыа2Б04 , дл/г Содерж. ЫИг-групп масс.%

1 0.39 3.2/5.0 15.3 73 0.03 3.1

2 0.61 1.61 2.5 7.7 67 0.07 2.1

3 0.61 3.2/5.0 15.3 47 0.05 0.9

4 0.61 2.6 / 4.0 15.3 55 0.06 0.6

Варьирование концентраций мономера, инициатора и агента переноса цепи в исходной смеси позволило получить содержащие аминогруппы полимеры с [р] 0.03 - 0.07 дл/г (Таблица 6).

Далее для получения макромономера проводили ацилирование поли-МАГ-ЫНг-НС! активированным Л/-гидроксифталимидным эфиром акриловой кислоты:

HONH

ОН

На следующей стадии для синтеза графт-сополимеров с основной целью поли-ДМАЭМ и привитыми цепями поли-МАГ проводилась радикальная сополимеризация диалкиламиноэтилметакрилата с синтезированным макромономером:

НО

Нами было показано, что гомополимеры ДМАЭМ и МАГ имеют различную растворимость: гомополимер ДМАЭМ растворим в спиртах, гомополимер МАГ - нет. Следовательно, сополимер, содержащий преимущественно звенья ДМАЭМ, должен растворяться в спирте, сополимер, содержащий преимущественно звенья МАГ - нет. Для подтверждения образования целевых графт-сополимеров было проведено разделение полученных продуктов на растворимую и нерастворимую в метаноле части. Условия синтеза и характеристики полимеров приведены в Таблице 7.

Таблица 7 - Условия синтеза и характеристики графт-сополимеров МАГ-ДМАЭМ (М, - МАГ, М2-ДМАЭМ)___

Условия синтеза Характеристики сополимера

№ Исходи. поли-МАГ (Ыа оп. в табл. 6) [Мг] мол.% Выход, нерастворимая в метаноле часть растворимая в метаноле часть

оп. масс.% Содерж., масс.% [Мг!, мол.% [п]ма,50, дл/г Содерж., масс.% [Мг], мол.% [п]ма2504 дл/г

1 1 60 77 56 25 0.08 44 67 0.06

? 1 20 56 95 2 0.04 5 не опр. не опр.

3 1 80 68 0 — — 100 66 0.09

4 2 60 69 45 26 0.12 55 60 0.1

5 2 50 69 57 27 0.10 43 69 0.08

В случае опыта 1, для синтеза которого было использовано мольное соотношение [звено МАГ макромономера]: [ДМАЭМ] = 40 : 60 мол.%, нерастворимая и растворимая в метаноле части составляют 56 и 44 масс.% от массы полученного полимера, соответственно. Нерастворимая часть сипьно обогащена звеньями МАГ (75 мол.%) по сравнению с исходной смесью, а растворимая - немного обогащена звеньями ДМАЭМ (67 мол.%). Однако, нерастворимая в спирте часть содержит значительное количество ДМАЭМ (25 мол.%), а в состав растворимой части входит 33 мол.% МАГ (Таблица 7). Полученные результаты свидетельствуют ^ об образовании целевого сополимера, что подтверждено также данными тонкослойной хроматографии и ЯМР 'Н спектроскопии. Характеристические вязкости обеих фракций (Таблица 7) превышают [п] исходного макромономера (Таблица 6).

Таким образом, осуществлен синтез графт-сололимеров МАГ-ДМАЭМ различного состава с основной цепью поли-ДМАЭМ и привитыми цепями поли-МАГ.

3.4. Свойства сополимеров МАГ с диалкиламиноэтилметакрилатами

С целью определения областей применения синтезированных полимеров для биомедицинских целей были проведены исследования их способности восстанавливать ионы серебра, изучены биологические свойства на молекулярном уровне (взаимодействие с молекулами ДНК), на клеточном уровне (антимикробная активность), на уровне макроорганизмов (токсичность, иммуномодулирующие свойства, противоопухолевая активность).

3.4.1. Нанокомпозиты серебра на основе сополимеров МАГ с диалкиламиноэтилметакрилатами

Серебро является биологически активным металлом, оно обладает широким спектром противомикробного действия, в том числе в отношении антибиотикоустойчивых штаммов. Большой интерес в связи с этим вызывают водорастворимые нанодисперсные системы серебра на основе синтетических полимеров, в которых полимер обычно выполняет функцию стабилизатора, а в качестве восстановителей используют, например, боргидрид натрия.

Установлено, что при смешении водных растворов гомополимеров МАГ, ДМАЭМ или сополимеров МАГ-ДМАЭМ/ДЭАЭМ с раствором АдЫОз восстановление ионов серебра и образование наночастиц нуль-валентного серебра происходит без использования дополнительных восстанавливающих агентов. При этом в спектрах поглощения появляется характерная полоса плазмонного резонанса с Яли» = 405 -420 нм. В Таблице 9 представлены данные, демонстрирующие влияние химического строения полимеров на способность восстанавливать ионы серебра.

Таблица 9 - Нанокомпозиции серебра

диалкиламиноэтилметакрилзт

№ оп. Характеристики исходного полимера Реакция восстановления ионов серебра

полимер М2, мол.% Индукционный период, ч Время окончания реакции, ч нм

1 поли-МАГ 0 12 24 420

2 поли-ДМАЭМ 100 1 12 417

3 МАГ-ДМАЭМ 18.2 0 3 405

4 МАГ-ДМАЭМ 47.3 0 3 405

5 МАГ-ДМАЭМ 94.9 0 3 410

6 МАГ-ДЭАЭМ 37.1 0 4 417

При использовании гомополимеров МАГ или ДМАЭМ наблюдается индукционный период после смешения реагентов (12 и 1 ч, соответственно). В случае использования сополимеров индукционный период отсутствует реакция протекает быстрее. Для смеси гомополимеров МАГ и ДМАЭМ подобного эффекта не наблюдается, процесс характеризуется индукционным периодом 1 ч. По-видимому, в случае сополимеров более высокие скорости реакции по сравнению со скоростями реакций соответствующих гомополимеров и их смесей обусловлены не только восстановлением ионов Ад* звеньями МАГ и диалкиламиноэтимэтметакрилатов, но и оптимальными условиями протекания процесса, обеспеченными микроструктурой сополимеров.

На Рисунке 4 приведена электронная микрофотография наночастиц серебра, полученных в присутствии сополимера МАГ-ДМАЭМ (18.2 мол.% ДМАЭМ). Размеры полученных частиц составляют от 4 до 25 нм, средний размер - 13 нм.

Образующиеся нэночастицы стабильны. Агрегативная устойчивость в воде сохраняется в течение 12мес. После высушивания растворов и повторного растворении сухого остатка в воде происходит диспергация частиц с сохранением их исходных характеристик.

Рисунок 4 - Электронная микрофотография наночастиц Ад0, полученных в присутствии сополимера МАГ-ДМАЭМ (18.2 мол.% звеньев ДМАЭМ). Масштаб 50 нм.

Таким образом, впервые обнаружена способность сополимеров ДМАЭМ и ДЭАЭМ и винилсахарида МАГ при комнатной температуре восстанавливать ионы серебра, стабилизировать образующиеся нанодисперсии Ад и ускорять процесс восстановления по сравнению с соответствующими гомополимерами и их смесями.

3.4.2. Взаимодействие сополимеров МАГ-ДМАЭМ о ДНК

Молекулы ДНК способны взаимодействовать с гомополимером ДМАЭМ с образованием интерполиэлектролитных комплексов. В результате происходит компактизация ДНК, в составе комплекса ДНК проникает в клетки.

Исследования, проведенные на кафедре молекулярной биофизики физического факультета ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет», показали, что все синтезированные сополимеры способны взаимодействовать с ДНК с образованием интерполиэлектролитных комплексов.

На Рисунке 5 приведена зависимость отношения приведенной вязкости раствора (ДНК + полимер) к приведенной вязкости раствора ДНК (п'пр / ПлР) от количества присутствующего в растворе статистического сополимера МАГ-ДМАЭМ-ДМАЭМ-СаНи, содержащего 38.5 мол.% алкилированных звеньев (Таблица 4, опыт 4,), т.е. от мольного соотношения ионогенных групп в полимере и в ДНК, способных образовывать между собой комплексы (N : Р). При добавлении поликатиона к раствору ДНК происходит снижение величины п'пр / Ппр, что свидетельствует о компактизации молекул ДНК. При соотношении N: Р - 1.3 происходит полная компактизация молекул ДНК.

На Рисунке 6 представлены изображения плазмидной ДНК и ее комплексов с графт-сополимером МАГ-ДМАЭМ (69 мол.% ДМАЭМ, растворимая в метаноле часть опыта 5 Таблицы 7). полученные методом атомной силовой микроскопии (АСМ). При отсутствии полимера в системе, т.е. при N : Р = 0, наблюдаются молекулы свободной ДНК (Рисунок 6а). С увеличением соотношения N : Р происходит связывание ДНК, и при N:P=1.4 наблюдаются только дискретные компактные частицы с размером 50 ± 25 нм, свободная ДНК в системе отсутствует.

ИР ч4

Рисунок 5 - Изменение отношения приведенной вязкости раствора (полимер + ДНК) к приведенной вязкости раствора ДНК (п'пр / Ппр) в зависимости от мольного соотношения ионогенных групп сополимера МАГ-ДМАЭМ-ДМАЭМ-С8Н17 (38.5 мол.% звеньев ДМАЭМ-С8Н17) и ДНК (М : Р).

Сднк = 0.008 масс.%.

Рисунок 6 - АСМ изображения плазмидной ДНК pFL 44 (а) и ее комплексов с графт-сополимером МАГ-ДМАЭМ (69 мол.% ДМАЭМ) при N : Р = 0.56 (б), 0.98 (в), 1.4 (г). Размер изображений - 1 (б, в) и 3 мкм (а, г).

На Рисунке 7а приведено АСМ-изображение комплекса тимусной ДНК с тем же графт-сополимером. Свободной ДНК не наблюдается при соотношении N : Р = 1.2.

Размеры комплексов составляют 95 ± 35 нм. В случае же образования комплекса со статистическим сополимером МАГ-ДМАЭМ (60 мол.% ДМАЭМ) при низком мольном соотношении N : Р = 0.25 наблюдаются комплексы с размером порядка 200 нм, а также отдельные молекулы ДНК (Рисунок 76). При увеличении соотношения N : Р происходила агрегация образующихся комплексов до агрегатов с размерами порядка 1000 нм и выпадение их из раствора. При использовании графт-сополимеров образующиеся комплексы стабильны, агрегации не наблюдается.

Рисунок 7 - АСМ-изображения комплексов тимусной ДНК с: а) графт-сополимером МАГ-ДМАЭМ (69 мол.% ДМАЭМ) при |\1:Р = 1.2 (рзмер изображения 4 мкм); б) статистическим сополимером МАГ-ДМАЭМ (60 мол.% ДМАЭМ) при N : Р = 0.25 (размер изображения 1.3 мкм).

По данным ФГБУ НИИ гриппа Минздрава РФ комплекс того же графт-сополимера МАГ-ДМАЭМ (69 мол.% ДМАЭМ) с плазмидной ДНК, содержащей ген /3-галакгозидазы, способен проникать в клетки глиобластомы человека Т-98С. При этом введенный ген сохраняет свои свойства, участвуя в синтезе белка.

Таким образом, можно заключить, что синтезированные сополимеры МАГ-ДМАЭМ перспективны для целей генной терапии.

3.4.3. Определение токсичности сополимеров МАГ с диалкиламиноэтилметакрилатами

Для полимеров-носителей важной характеристикой является токсичность. По данным ФГБУ НИИ Гриппа Минздрава РФ поли-МАГ не обладает цитотоксичностью. Сополимеры МАГ-ДМАЭМ и МАГ-ДЭАЭМ характеризуются низкой цитотоксичностью, которая зависит от состава сополимера, уменьшаясь с увеличением содержания звеньев МАГ. Так, для сополимеров МАГ-ДМАЭМ, содержащих 35 и 93 мол.% МАГ (Таблица 5, опыты 10 и 2), значение 1С5о (количество полимера, при котором погибает 50 % клеток) составляет 30 и 1000 мкг/мл, соответственно.

3.4.4. Иммуномодулирующие свойства

В работах лаборатории гидрофильных полимеров ИВС РАН было установлено, что некоторые гомо- и сополимеры винилсахаридов обладают иммуномодулирующими свойствами, т.е. способны усиливать или ослаблять иммунный ответ организма на введенные антигены.

В ФГБУ НИИ онкологии им. H.H. Петрова Минздрава РФ для сополимеров МАГ-ДМАЭМ/ДЭАЭМ и нанокомпозиции серебра на основе сополимера МАГ-ДМАЭМ был определен коэффициент иммунного ответа (КИО). КИО - это отношение числа клеток в организме, ответственных за выработку антител, при введении антигена вместе с полимером к числу таких клеток при введении антигена без полимера. Найдено, что полученные сополимеры обладают слабо выраженными иммунодепрессантными свойствами. Значение КИО сополимеров в зависимости от их состава и использованной дозы составляет порядка 0.7-0.9, нанодисперсии серебра - 0.6 - 0.7. Такие полимеры могут быть использованы в случаях, когда требуется подавление иммунного ответа организма.

3.4.3. Антимикробная активность

Известно, что полимеры, несущие аминные группы, а также нанокомпозиции серебра обладают антибактериальными свойствами.

В Таблице 10 приведены данные по исследованию антимикробной активности в отношении золотистого стафилококка и кишечной палочки сополимеров МАГ-ДМАЭМ, а также нанокомпозиции серебра на основе сополимера МАГ-ДМАЭМ и МАГ-ДЭАЭМ. Исследования проводились в ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия». Определены минимальная бактериостатическая (МБсК) и минимальная бактерицидная (МБцК) концентрации полимеров.

Таблица 10 - Антимикробная активность препаратов

№ Полимер Кишечная палочка Золотистый стафилококк

МБсК, мкг/мл МБцК, мкг/мл МБсК, мкг/мл МБцК, мкг/мл

1 МАГ-ДМАЭМ 30 : 70 мол.% [njNaNQ = 0.11 ДЛ/Г 220.0 900.0 30.0 110.0

2 полимер 1+6.1 масс.% Ад — 7.9 — 15.7

3 МАГ-ДЭАЭМ 63 : 37 мол.% [nk2so4 = 0.08 дл/г + 5.2 масс.% Ад 2.0 4.0 15.7 31.3

Как можно видеть, сополимер МАГ-ДМАЭМ обладает антибактериальной активностью, однако, характеризуется высокими значениями МБсК и МБцК в отношении обоих микроорганизмов. Нанокомпозиции серебра обладают гораздо более выраженными антимикробными свойствами.

3.4.5. Противоопухолевая активность

В ФГБУ НИИ онкологии им. H.H. Петрова Минздрава РФ была определена противоопухолевая активность сополимера МАГ-ДМАЭМ (75 мол.% ДМАЭМ) в отношении опухоли Эрлиха, перевитой мышам, которым через 3 дня после перевивки опухоли ввели раствор сополимера. Было показано, что в зависимости от времени, прошедшего с момента перевивки, процент торможения роста опухоли составлял порядка 35 - 50 %.

Таким образом, синтезированные водорастворимые полимеры-носители обладают низкой токсичностью. Они характеризуются иммунодепрессантными свойствами, противоопухолевой активностью, способны образовывать полиэлектролитные комплексы с молекулами ДНК. Сополимеры МАГ с диалкипаминоэтилметакрилзтами восстанавливают ионы серебра, причем скорость восстановления выше, чем у гомополимеров МАГ и ДМАЭМ и их механических смесей, образующиеся нанокомпозиции Ад0 характеризуются высокой стабильностью в водных растворах. Синтезированные сополимеры и нанокомпозиции серебра на их основе обладают антибактериальными свойствами.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы синтеза новых водорастворимых дифильных полимеров-носителей биологически активных веществ на основе винилсахарида 2-деокси-2-метакриламидо-О-глюкозы (МАГ) и аминоэтилметарилатов W.N-диметиламиноэтил-метакрилата (ДМАЭМ) и Л/,Л/-диэтиламиноэтилметакрилата (ДЭАЭМ), различающихся составом, вязкостными и конформационными характеристиками,

архитектурой, гидрофильно-гидрофобным балансом.

2. Впервые исследована кинетика радикальной сополимеризации МАГ с ДМАЭМ и ДЭАЭМ и установлено, что значения начальных скоростей процесса уменьшаются с повышением содержания диалкиламиноэтилметакрилата в исходной смеси. Проведена оценка относительных активностей сомономеров, найдено, что диалкиламиноэтилметакрилаты являются более активными мономерами в процессе радикальной сополимеризации с МАГ.

3. Методом полимераналогичных превращений - злкилированием звеньев ДМАЭМ йодистыми алкилами с различной длиной углеродной цепи - впервые синтезированы водорастворимые сополимеры МАГ с регулируемым гидрофильно-гидрофобным балансом - тройные сополимеры, содержащие третичные и

четвертичные аминогруппы.

4. Разработаны методы синтеза новых графт-сополимеров, основная цепь которых представляет собой поли-ДМАЭМ, а привитые цепи - поли-МАГ. Установлено, что графт- и линейные сополимеры МАГ-ДМАЭМ способны образовывать комплексы с ДНК, перспективные для целей генной терапии, при этом комплексы графт-сополимеров характеризуются меньшими размерами, большей однородностью и более высокой стабильностью в водных растворах по сравнению с комплексами статистических сополимеров.

5. Впервые обнаружена способность статистических сополимеров МАГ-ДМАЭМ и МАГ-ДЭАЭМ не только восстанавливать ионы серебра и стабилизировать образующиеся нанокомпозиции, но и ускорять процесс восстановления по сравнению с соответствующими гомополимерами и их смесями.

6 Установлено, что синтезированные сополимеры и нанокомпозиции серебра на их основе проявляют антибактериальную активность, иммуномодулируюшие свойства, противоопухолевые свойства.

Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:

1. Назарова, О.В. Сополимеры 2-деокси-2-метакриамидо-0-глюкозы, содержащие третичные и четвертичные аминогруппы / О.В. Назарова, Ю.И. Золотова, A.B. Добродумов, И.И. Малахова, E.H. Власова, Е.Ф. Панарин Ii Журнал прикладной химии.-2009.-Т. 82.-№9.-С. 1500-1505.

2. Ершов, Д.Ю. Структурно-конформационные характеристики комплексов ДНК с поликатионами различного строения / Д.Ю. Ершов, А.И. Киппер, C.B. Валуева, О.В.

Назарова, Ю.И. Золотова, Е.Ф. Панарин // Журнал физической химии. - 2010. - Т. 84. - № 5. - С. 932-935.

3. Касьяненко, НА ДНК-полимерные комплексы для генной терапии I Н.А. Касьяненко, Л.А. Лысякова, Б.А. Дрибинский, Ю.И. Золотова, О.В. Назарова, Е.Ф. Панарин II Высокомолекулярные соединения. - 2012. - Т. 54. - № 7. - С. 1023-1035.

4. Некрасова, Т.Н. Нанокомлозиты серебра на основе (со)полимеров 2-деокси-2-метакриламидо-О-глюкозы, N-виниламидов и аминоакрилатов / Т.Н. Некрасова, Ю.И. Золотова, О.В. Назарова, М.Л. Левит, Е.И. Суворова, А.К. Сироткин, Ю.Г. Баклагина, Е.В. Диденко, В-Д. Паутов, Е.Ф. Панарин // Доклады академии наук. - 2012. - Т. 446. - № 5. - С. 527-529.

5. Nazarova, O.V. Copolymers of 2-deoxy-2-methacrylamido-D-glucose with aminoacrylates and allylamine hydrochloride / O.V. Nazarova, E.A. Leontyeva, T.N. Nekrasova, A.V. Dobrodumov, Y.I. Zolotova, A.V. Slita, E.N. Sushchenko, I.I. Malakhova, N.N, Zelenko, E.F. Panarin II J. Carbohydrate Chem. - 2009. - V. 28. - N. 1. - P. 37-50.

6. Патент РФ № 2485051 C1. Способ получения нанокомлозиций серебра на основе синтетических водорастворимых полимеров / Некрасова Т.Н., Золотова Ю.И., Назарова О.В., Левит М.Л., Суворова Е.И., Сироткин А.К., Баклагина Ю.Г., Диденко Е.В., Паутов В.Д., Панарин Е.Ф.; заявитель и патентообладатель Учреждение Российской академии наук Институт высокомолекулярных соединений РАН (RU).-Заяв.: 2011146245/04, 16.11.2011. - Опубл.: 20.06.2013. - Бюл. №17.

7. Леонтьева, Е.А. Сополимеры N-метакрилоиламиноглкжозы с катионными мономерами / Е.А. Леонтьева, Е.Н. Сущенко, Ю.И. Золотова, М.Л. Левит, О.В. Назарова II Тез. докп. II С.-Петербургской конф. Молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах». - СПб, 2006. - С. 17.

8. Леонтьева, Е.А. Влияние природы катионных мономеров на микроструктуру их сополимеров с N-метакрилоиламиноглюкозой / Е.А. Леонтьева, Ю.И. Золотова, М.Л. Левит, О.В. Назарова II Тез. докл. Международн. конф. по органической химии «Органическая химия от Бутлерова и Бельштейна до современности». - СПб, 2006 г. С. 126.

9. Золотова, Ю.И. Графт-сополимеры на основе катионных мономеров и п-метакрилоиламиноглюкозы / Ю.И. Золотова, Е.А. Леонтьева, О.В. Назарова II Тез. докл. Ill С.-Петербургской конф. молодых ученых с межународн. участием «Современные проблемы науки о полимерах». - СПб, 2007. - С. 130.

10. Zolotova, Yu.l. Synthesis of graft-copolymers of N-methacryloylaminoglucose and amino-containing monomers I Yu.l. Zolotova, O.V. Nazarova il Abstr.of 4th S.-Petersburg Young Scientists Conf. with Int. Participation «Modern problems of polymer science». -St.-Petersburg, 2008. - P. 48.

11. Perthoo, P. A study of cationic polymers as non-viral vectors for gene delivery / P. Perthoo, S. Pershina, J. Zolotova II Abstr.of 4th S.-Petersburg Young Scientists Conf. with International Participation «Modem problems of polymer science». - St.-Petersburg, 2008. - P. 48.

12. Zolotova, Yu. I. Statistical and graft copolymers of aminocontaining monomers and N-methacryloylaminoglucose / Yu.l. Zolotova, O.V. Nazarova, E.F. Panarin // Abstr. 6th Int. Symp. «Molecular order and mobility in polymer systems». - St.-Petersburg, 2008. -P-094.

13. Slita, A.V. Study of biological properties of DNA complexes with statistical or graftOcopolymers of cationic monomers I A.V. Slita, S.S. Peshina, P. Pertu, Yu.l. Zolotova, O.V. Nazarova, T.D. Smirnova, O.I. Kiselev, E.F. Panarin // Abstr. 6th Int. Symp. «Molecular order and mobility in polymer systems». - St.-Petersburg, 2008. - P-124.

14. Mukhin, D. DNA complexes with polycations as a nonviral gene vectors / D. Mukhin,

B.A. Dribinsky, O.V. Nazarova, Yu.l. Zolotova, E.F. Panarin, N.A. Kasyanenko // Abstr. 6th Int. Symp. «Molecular order and mobility in polymer systems». - St.-Petersburg, 2008. -P-168.

15. Золотова, Ю.И. Аминосодержащие сополимеры N-метакрилоиламиноглюкозы / Ю.И. Золотова, O.B. Назарова, Е.Ф. Панарин // Тез. докл. Мат. Всеросс. Межвузовской конф. студентов и аспирантов «XXXVII неделя науки в СПбГПУ». -СПб, 2008. - С. 58-59.

16. Золотова, Ю.И. Синтез и исследование нанокомпозитов серебра на основе водорастворимых полимеров / Ю.И. Золотова, Т.Н. Некрасова, Е.Ф. Панарин II Тез. докл. Всеросс. конф. молодых ученых, аспирантов и студентов с международн. участием по химии и наноматериалам " Менделеев-2013"; секция 1: "Нанохимия и наноматериалы". - СПб, 2013-С. 128-129.

17. Лезов, A.A. Оптические и гидродинамические свойства растворов наночастиц серебра, стабилизированных сополимерами Л/,/У-диметиламиноэтилметакрилата и 2-деокси-2-метакриламидо-0-глюкозы / A.A. Лезов, Т.Н. Некрасова, Л.Н. Андреева, М.А. Безрукова, О.В. Назарова, Ю.И. Золотова, Н.В. Цветков, Е.Ф. Панарин // Сб. тез. докл. Шестой Всеросс. Каргинской конф. «Полимеры-2014». - Москва, 2014 г. -

C.632.

Андреева, Л.Н. Конформационные свойства гомополимеров поли-N.N-диметиламиноэтилметакрилата и его сополимеров с метакрилоиламиноглюкозой в различных растворителях/Л.Н. Андреева,Т.Н. Некрасова, О.В. Назарова, C.B. Бушин, М.А. Безрукова, Р.Т. Иманбаев, В.Н. Паутов, Ю.И. Золотова, Е.Ф. Панарин II Сб. тез. докл. Шестой Всеросс. Каргинской конф. «Полимеры-2014». - Москва, 2014. - С. 500.

Бесплатно

Автореферат отпечатан в ИБС РАН. Ризография. Тираж 100 экз.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201459258

ЗОЛОТОВА Юлия Игоревна

ПОЛИМЕРЫ-НОСИТЕЛИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ОСНОВЕ СОПОЛИМЕРОВ 2-ДЕОКСИ-2-МЕТАКРИЛАМИДО-/>-ГЛЮКОЗЫ С Д,Л-ДИМЕТИЛ- И ТУ,ТУ-ДИЭТИЛАМИНОЭТИЛМЕТАКР ПЛАТАМИ

Специальность 02.00.06 - высокомолекулярные соединения

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: чл.-корр. РАН, д.х.н., проф. Панарин Евгений Федорович

Санкт-Петербург 2014

Список использованных сокращений

ATRP-полимеризации - atom transfer radical polymerization (радикальная

полимеризация с переносом атома) RAFT-полимеризациия - reversible addition fragmentation chain transfer

(полимеризация путем обратимого присоединения и фрагментации) АК - акриловая кислота АСМ - атомная силовая микроскопия АЭАМГ - 2-аминоэтиламид TV-метакрилоилглицина БАВ - биологически активное вещество В А - TV-виниламин гидрохлорид ВМП - внутримолекулярная подвижность ВП - TV-винилпирролидон ВФА - TV-винилформамид ГПМ - 2-гидроксипропилметакрилат ГПМА - тУ-(2-гидроксипропил)метакриламид ГФИАК - TV-гидроксифталимидный эфир акриловой кислоты ДАТ - 2,2'-азобис-(2-метилпропионамидин) дигидрохлорид ДИНИЗ - динитрил азо-бис-изомасляной кислоты ДМАЭМ - TV, TV-диметиламиноэтилметакрилат ДМФА - Л^У-диметилформамид ДЭАЭМ - ДЛ^-диэтиламиноэтилметакрилат ИПЭК - интерполиэлектролитный комплекс КГ - 2-деокси-2-кротоноиламидо-£>-глюкоза КИО - коэффициента иммунного ответа МАА - метакриламид

МАГ - 2-деокси-2-метакриламидо-£>-глюкоза МАК — метакриловая кислота

МанЭМ - 2-(а-1)-маннопираносилокси)этилметакрилат МБсК — минимальная бактериостатическая концентрация

МБцК - минимальная бактерицидная концентрация МВАА - УУ-метил-УУ-винилацетамид МГ-СЗ - З-О-метакрилоил-Л-глюкоза МГ-С6 - 6-0-метакрилоил-/>глюкоза

МИПГП- З-О-метакрилоил-1,2:3,4-ди-0-изопропилиден-1)-галактопираноза

ММ - молекулярная масса

ММА - метилметакрилат

ММР - молекулярно-массовое распределение

ПЛ - поляризованная люминисценция

ТМАЭМ - Л/,Лг,Л'-триметиламиноэтилметакрилат

ТЭА - триэтиламин

ЭА - этилакрилат

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ.........................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................12

1.1. Поливинилсахариды........................................................................................12

1.1.1. Синтез винилсахаридов................................................................................12

1.1.2. Гомополимеры винилсахаридов..................................................................13

1.1.3. Сополимеры винилсахаридов с гидрофильными мономерами.................16

1.2. Аминосодержащие сополимеры винилсахаридов.........................................20

1.2.1. Статистические аминосодержащие сополимеры винилсахаридов............20

1.2.2. Аминосодержащие графт- и блоксополимеры винилсахаридов...............23

1.3. Полимеры 2-деокси-2-метакриламидо-£>-глюкозы.......................................27

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.....................................................34

2.1. Материалы.......................................................................................................34

2.2. Методы синтеза...............................................................................................35

2.2.1. Синтез мономера 2-деокси-2-метакриламидо-/)-глюкозы.........................35

2.2.2. Синтез полимеров.........................................................................................35

2.2.2.1. Синтез линейных (со)полимеров..............................................................35

2.2.2.1.1. Синтез гомополимера МАГ...................................................................36

2.2.2.1.2. Синтез гомополимера ДМАЭМ.............................................................36

2.2.2.1.3. Синтез линейных статистических сополимеров МАГ-ДМАЭМ/ДЭАЭМ...................................................................................................37

2.2.2.1.4. Синтез люминесцентно меченых (со)полимеров.................................37

2.2.2.2. Синтез тройных сополимеров - алкилирование статистического сополимера МАГ-ДМАЭМ йодистыми алкилами...............................................38

2.2.2.3. Синтез графт-сополимеров МАГ-ДМАЭМ.............................................39

2.2.2.3.1. Синтез поли-МАГ с концевыми аминогруппами.................................39

2.2.2.3.2. Синтез поли-МАГ с концевыми двойными связями............................39

2.2.2.3.3. Синтез графт-сополимеров МАГ-ДМАЭМ...........................................40

2.2.3. Синтез нанокомпозиций серебра.................................................................41

2.3. Методы исследования.....................................................................................42

2.3.1. Оборудование...............................................................................................42

2.3.2. Определение состава сополимеров.............................................................43

2.3.3. Измерение величин характеристической вязкости полимеров и оценка значений ММ..........................................................................................................44

2.3.4. Определение относительных активностей..................................................44

2.3.5. Кинетика сополимеризации.........................................................................45

2.3.6. Определение наносекундных времен релаксации......................................45

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ......................................................46

3.1. Статистические сополимеры МАГ-ДМАЭМ и МАГ-ДЭАЭМ.....................46

3.1.1. Кинетика сополимеризации МАГ с ДМАЭМ и ДЭАЭМ...........................51

3.1.2. Относительные активности сомономеров...................................................53

3.1.3. Характеристики сополимеров МАГ с ДМАЭМ и ДЭАЭМ.......................59

3.2. Синтез сополимеров с регулируемым гидрофильно-гидрофобным балансом.................................................................................................................70

3.3. Графт-сополимеры..........................................................................................74

3.3.1. Графт-сополимеры МАГ-ДМАЭМ..............................................................74

3.4. Свойства сополимеров МАГ с диалкиламиноэтилметакрилатами..............82

3.4.1. Нанокомпозиты серебра на основе сополимеров МАГ с диалкиламиноэтилметакрилатами ................................................................................................83

3.4.2. Взаимодействие сополимеров МАГ-ДМАЭМ с ДНК................................87

3.4.3. Определение токсичности сополимеров МАГ с диалкиламиноэтилметакрилатами ........................................................................................................93

3.4.4. Иммуномодулирующие свойства................................................................94

3.4.5. Антимикробная активность.........................................................................95

3.4.6. Противоопухолевая активность...................................................................96

ВЫВОДЫ...............................................................................................................99

ЛИТЕРАТУРА......................................................................................................101

БЛАГОДАРНОСТИ.............................................................................................119

ВВЕДЕНИЕ

Одним из активно развивающихся направлений химии высокомолекулярных соединений является разработка методов синтеза полимеров-носителей биологически активных веществ (БАВ). Использование гидрофильных полимеров-носителей для модификации БАВ позволяет решать такие важные задачи, как снижение токсичности БАВ, пролонгация действия, контролируемое снятие БАВ с носителя и регулирование его содержания в биологических жидкостях и тканях, направленный транспорт активного вещества в требуемый орган-мишень, в некоторых случаях удается повысить эффективность БАВ. В связи с этим вопросы синтеза и изучения свойств новых полимеров-носителей привлекают внимание широкого круга исследователей. К настоящему времени в качестве носителей БАВ нашли применение как синтетические (поливиниловый спирт, полиэтиленгликоль, поливиниламиды и многие другие), так и природные полимеры (полисахариды, белки). К полимерам-носителям предъявляются требования водорастворимости, нетоксичности, биоинертности (т.е. отсутствия антигенности, канцерогенности и т.д.). В последние годы в качестве перспективных носителей БАВ рассматриваются удовлетворяющие всем этим требованиям полимеры на основе винилсахаридов. Вследствие наличия остатков Сахаров в составе этих полимеров они обладают биоспецифичностью, т.е. способны связываться с рецепторами клеток определенной природы, что предполагает возможность их использования в системах целевого транспорта БАВ.

Создание полимеров-носителей представляет собой комплексную задачу, т.к. способность полимеров связывать БАВ и возможность синтеза полимерных производных с оптимальными свойствами определяются многими факторами, такими как природа функциональных групп, обеспечивающих модификацию БАВ, природу и лабильность связи БАВ-полимер, молекулярная масса полимера, микроструктура и конформация макромолекул, наличие гидрофобных участков для связывания плохо растворимых в воде веществ,

архитектура полимера. Регулирование снятия активного вещества с полимера-носителя может быть достигнуто, в частности, использованием рН- или термочувствительных полимеров.

Особый интерес представляют сополимеры винилсахаридов с аминосодержащими мономерами, в частности с аминоалкилметакрилатами. Такие полимеры способны сочетать свойства, присущие гомополимерам обоих типов, например, специфически связываться с имеющимися на поверхности клеточных мембран рецепторами, что характерно для Сахаров, и при этом связывать и компактизовать молекулы ДНК за счет наличия аминогрупп и образования интерполиэлектролитных комплексов.

Среди полиаминоалкилметакрилатов наиболее широко используются полимеры на основе ЖД-диметиламиноэтилметакрилата (ДМАЭМ) и ЛуУ-диэтиламиноэтилметакрилата (ДЭАЭМ). Они обладают антимикробными, противовирусными свойствами, способны восстанавливать ионы серебра и золота и стабилизировать образующиеся наночастицы металлов, проявляют рН-и термочувствительность. поли-ДМАЭМ является одним из наиболее перспективных полимеров для применения в генной терапии. Вместе с тем, в литературе к началу данной работы отсутствовали сведения о сополимерах одного из наиболее перспективных для синтеза полимеров-носителей винилсахарида 2-деокси-2-метакриламидо-.0-глюкозы (МАГ) с ДМАЭМ и ДЭАЭМ.

Актуальность данной работы заключается в необходимости разработки способов получения новых полимеров-носителей, обладающих собственной биологической активностью, - функциональных водорастворимых аминосодержащих поливинилсахаридов, используемых, в частности, для образования интерполиэлектролитных комплексов с ДНК.

Целью работы является разработка методов синтеза водорастворимых полимеров-носителей БАВ - сополимеров МАГ-ДМАЭМ и МАГ-ДЭАЭМ различной архитектуры, варьируемого состава, молекулярно-массовых параметров, гидрофильно-гидрофобного баланса, исследование их структуры и

свойств.

Поставленная цель достигалась решением следующих задач:

исследование закономерностей радикальной сополимеризации МАГ с ДМАЭМ, ДЭАЭМ: изучение кинетики и определение относительных активностей сомономеров; синтез статистических сополимеров МАГ с диалкиламиноэтилметакрилатами различного состава и молекулярной массы; разработка методов синтеза графт-сополимеров МАГ с диалкиламиноэтилметакрилатами; синтез дифильных сополимеров с регулируемым гидрофильно-гидрофобным балансом;

изучение конформационных состояний синтезированных полимеров в водных растворах, их иммуномоделирующих, противоопухолевых и антимикробных свойств, восстанавливающей способности и характеристик нанокомпозиций серебра на их основе, исследование свойств комплексов полученных сополимеров с молекулами ДНК.

Методы исследования. В работе использованы современные методы синтеза и анализа, физико-химические методы исследования полимеров (поляризованная люминесценция, ИК, УФ и ЯМР спектроскопия, тонкослойная хроматография, потенциометрическое титрование, вискозиметрия, дилатометрия, атомно-силовая и просвечивающая электронная микроскопия, электрофорез).

Научная новизна работы заключается в следующем:

разработаны методы синтеза ранее не описанных водорастворимых рН-чувствительных полимеров-носителей БАБ - статистических двойных и тройных сополимеров винилсахарида МАГ с диалкиламиноэтилметакрилатами и их четвертичными аммониевыми солями, а также графт-сополимеров в широком диапазоне составов, молекулярных масс и варьируемой гидрофобности;

впервые исследован процесс сополимеризации МАГ с ДМАЭМ или с ДЭАЭМ: изучена кинетика и определены относительные активности

сомономеров; проведена оценка конформационных состояний синтезированных полимеров в растворах;

впервые обнаружена способность сополимеров МАГ-ДМАЭМ и МАГ-ДЭАЭМ восстанавливать ионы серебра и стабилизировать образующиеся нанокомпозиции А§°, ускоряя при этом процесс восстановления по сравнению с восстановлением с помощью соответствующих гомополимеров и их смесей.

Практическая значимость работы состоит в том, что:

синтезированные сополимеры и нанокомпозиции серебра на их основе перспективны в качестве иммунодепрессантнов и антибактериальных веществ;

синтезированные сополимеры МАГ с диалкиламиноэтил-метакрилатами обладают противоопухолевой активностью, могут быть использованы для целей генной терапии.

На защиту выносятся следующие положения:

радикальная сополимеризация винилсахарида МАГ с диалкил-аминоэтилметакрилатами, а также последующие полимераналогичные превращения путем алкилирования йодистыми алкилами позволяют получать водорастворимые сополимеры с варьируемым составом, молекулярно-массовыми характеристиками, конформационными состояниями, регулируемым гидрофильно-гидрофобным балансом; указанные сополимеры проявляют биологическую активность на молекулярном, клеточном уровне и уровне макроорганизма;

впервые синтезирован макромономер МАГ, радикальная сополимеризация которого с ДМАЭМ или ДЭАЭМ приводит к получению привитых сополимеров, основная цепь которых представляет собой полидиалкиламиноэтилметакрилат, а привитые цепи - поли-МАГ;

использование статистических сополимеров МАГ с диалкиламино-этилметакрилатами обеспечивает восстановление ионов серебра и стабилизацию его нанокомпозиций, при этом процесс восстановления идет с

более высокой скоростью, чем в случае применения гомополимеров или их смесей;

комплексообразование ДНК с графт-сополимерами МАГ-ДМАЭМ приводит к образованию более стабильных и более однородных комплексов меньшего размера по сравнению с комплексами статистических сополимеров.

Обоснованность и достоверность полученных результатов и выводов на их основе подтверждаются хорошей воспроизводимостью и согласованностью результатов, полученных при использовании независимых методов исследований.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на российских и международных конференциях и симпозиумах: II, III, IV, VIII, IX Санкт-Петербургская конференция молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 31 января - 2 февраля 2006 г., 17-19 апреля 2007 г., 15 - 17 апреля 2008 г., 12 - 15 ноября 2012 г., 11 - 14 ноября 2013 г.), Международная конференция по органической химии «Органическая химия от Бутлерова и Бейльштейна до современности» (Санкт-Петербург, 26 - 29 июня 2006 г.), 6th International Symposium «Molecular order and mobility in polymer systems» (St.-Petersburg, June 2-6, 2008), Всероссийская межвузовская научная конференция студентов и аспирантов «XXXVII неделя науки в СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 24 - 29 ноября 2008 г.), Всероссийская конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматериалам «Менделеев-2013» (Санкт-Петербург, 2-5 апреля 2013 г.), Шестая Всероссийская Каргинская конференция «Полимеры-2014» (Москва, 27 -31 января 2014 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в отечественных и зарубежных журналах и тезисы 12 докладов, получен 1 патент РФ.

Личный вклад автора состоял в участии в планировании работы, в проведении всех экспериментов по синтезу полимеров и в анализе полученных

результатов, подготовке публикаций.

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института высокомолекулярных соединений Российской академии наук по темам: «Синтетические и полусинтетические биологически активные гидрофильные полимеры» (2008 - 2010 гг) и «Полифункциональные, биологически активные полимерные системы» (2011 - 2013 гг) при финансовой поддержке грантов РФФИ № 08-03-00324 «Синтез на основе винилсахаридов полимерных биолигандов для связывания соединений, вызывающих нарушение обмена веществ», № 12-03-00680 «Синтез на основе поливинилсахаридов и поливиниламидов гибридных систем, обладающих полифункциональной биологической активностью».

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, выводов, списка используемой литературы (155 наименований). Работа изложена на 119 страницах и включает 15 таблиц и 21 рисунок.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Поливинилсахариды

Поливинилсахариды - водорастворимые, нетоксичные, синтетические полимеры, содержащие в боковой цепи остатки Сахаров - являются перспективными полимерами-носителями [1—7]. Наличие в их структуре остатков углеводов обусловливает их способность к биоспецифическим взаимодействиям с �