Полисахариды MORUS и их влияние на углеводный обмен тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

u

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ им. академика САДЫКОВА А. С.

На правах рукописи УД К 616.379—008.64 + 616—092.4 + 547.458 САНАВОВА МУКАДДАМ, ХОЛБАЕВНА

ПОЛИСАХАРИДЫ MORUS И ИХ ВЛИЯНИЕ НА УГЛЕВОДНЫЙ ОБМЕН

02.00.10—Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОР ЕФ ЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1998

Работа выполнена в Институте эндокринологии и Институте химии растительных веществ АН РУ.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор А. А. АБИДОВ Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки и техники < РУ, доктор химических наук, профессор А. И. ИСМОИЛОВ

доктор биологических наук Э. И. ИСАЕВ

Ведущее учреждение:

Ташкентский Государственный Университет имени Мирзо Улугбека

оаш^та диссертации состоится «. г.

в $ ° ___ часов на заседании Специализированного Совета

Д. 015.21.01 при Институте биоорганическон химии Академии Наук Республики Узбекистан по адресу: 700143, г. Ташкент, ул. X. Абдуллаева 83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академика А. С. Са-дыкова АН РУ.

Автореферат разослан « б-' »

Ученый секретарь

Специализированного Совета //1Уг доктор биологических наук о. X. САИТМУРАТОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Заболевание сахарным диабетом в последние десятилетия превратилось в медико-социэльную проблему в странах с разным уровнем развития экономики. По данным ВОЗ число больных с установленным диагнозом "сахарный диабет"' составляет порядка 100 млн человек (ВОЗ: Серия технич.докл.. 1987) и имеет тенденцию к увеличению (Балаболкин И.И. и др., 1996: Кайдашев И.П. и др.; Кондратьев Я.Ю. и др., 1998). В списке основных заболеваний, являющихся причиной смертности, сахарный диабет занимает третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний и поэтому является объектом пристального внимания медиков, химиков, фармакологов и биохимиков. Предложенные в конце 50 -х годов сульфаниламиды, бигуанидн и их последующие аналоги остаются основными пероральными средствами их лечения. Но, к сожалению, из-за наличия побочных эффектов. Феномена привыкания и в некоторых случаях - прямой токсичности они имеют ограниченное применение. Все изложенное выше свидетельствует о необходимости поиска новых 'лишенный побочных эффектов средств для лечения сахарного диабета . В народной (восточной, тибетской и др.) медицине известно достаточно средств, используемых для компенсации диабетических состояний. Так, густой сок шелковицы для лечения диабета применял еще Авиценна (Абу Али Ибн,Сино. 1996), известны также работы, в которых водный настои листьев шелковиц белой и черной предложены для лечения диабета средней тяжести (Кит С.М. и др., 1986: Хаджаев Б.Р. и Др., 1989: Блинов В.А., 1993). Существенным недостатком этих средств является низкая концентрация действующего начала и, соответственно, длительный период проявления терапевтического эффекта, по сравнению с синтетическими препаратами -сульфаниламидами или бигуанидами.

Таким образом, поиск, выделение и характеристика гипоглике-мически действующего начала' из растений с целью создания на его основе Фармакологического средства представляется бесспорно актуальными, особенно в условиях Узбекистана, где имеется научно-материальная база для их исследования. Изучение растительных полисахаридов в этом отношении представляется весьма актуальным. Водорастворимые действующие вещества шелковицы (род Morus) сем. тутовых (Могасеае) практически не изучены, не известно также, какое вещество или группа веществ являются действующим началом отваров и экстрактов. Большим пробелом в химии шелковицы является также отсутствие полных сведений об углеводном составе этого лекарственного сырья.

- г -

Но,пь и залами исследования. Целью исследования явилась разработка метода выделения различных групп полисахаридов из трех видов шелковицы, произрастающих в Республике Узбекистан, изучение их физико-химических и гипогликемических свойств.

'Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

- разработать методику выделения полисахаридов из листьев трех видов Morus: М. alba L.. М. nigra L. и М. rubra;

- изучить моносахаридный состав полисахаридов;

- подобрать модель и условия тестирования, провести скрининг их гипогликемической активности и выбрать полисахарид с максимальной сахароснижающей активностью;

- охарактеризовать его физико-химические свойства и биологическую активность на различных моделях гипергликемии:

- разработать лабораторный регламент получения полисахарида с гипогликемической активностью.

Научная новизна. Впервые дана характеристика углеводного комплекса трех видов Morus. Разработана схема выделения различных групп углеводов шелковицы. Изучен моносахаридный состав. Получены данные по распространению водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ и гемицеллюлоз в листьях шелковицы и изменению их содержания в зависимости от периода вегетации.

По данным биологических исследований полисахаридный препарат Мал из M.alba L. характеризуется выраженным сахароснижающим эффектом.

Установлено, что снижение уровня глюкозы в крови протекает с одновременным увеличением запаса гликогена в печени и мышцах, увеличением потребления глюкозы мышечной и эпидидимальной жировой тканями, возрастающее в присутствии инсулина, стимулированием активности гексокиназы, торможением глюконеогенеза, а также снижением количественного содержания свободных жирных кислот и торможением липолиза. Доказаны нетоксичность полисахарида и отсутствие его побочных эффектов. Показано, что по эффективности сахаросни-жающего действия на модели алиментарной гипергликемии Мал не уступает известным синтетическим препаратам - манинилу и адебиту.

Практическая ценность работы. Результаты химического исследования использованы для контроля при наработке препарата для биологических испытаний, а также при разработке нормативно-технической документации на полисахаридный препарат Мал. Разработан лабораторный регламент получения Мал из отечественного сырья. По-

лисахаридный комплекс Мал, выделенный из листьев шелковицы белой, может послужить основой при создании эффективного препарата для лечения диабета в легкой форме и средней тяжести.

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения углеводов трех видов шелковицы: M.alba L., К.nigra L. и М. rubra, содержащих водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества, гемицеллюлозы и разработка схем их выделения.

- разработка лабораторного регламента получения полисахарид-ного препарата Мал.

- фракция водорастворимых полисахаридов' листьев шелковицы M.alba L. (Мал) при введении крысам per os в дозе 100 мг/кг массы демонстрирует гипогликемические свойства, сравнимые в модельных экспериментах синтетическими сахароснижающими препаратами - мани-нилом (сульфаниламид) и адебитом (бигуанид);

- гипогликемический эффект полисахарида Кал реализуется посредством увеличения ^потребления глюкозы периферическими тканями и потенцирования действия инсулина;

Апробация работы. Материалы диссертации-доложены на Втором Международном симпозиуме по химии природных соединений (Эскише-хир, Турция, 1996), заседании лаборатории химии углеводов и растительного белка ИХРВ АН РУ (Ташкент, 1997), Юбилейной конференции. посвященной 60-летию Ташкентского Фармацевтического института (Ташкент, 1997) и Республиканской научной конференции, посвященной памяти академика Садыкова A.C. в связи с 85-летием со дня рождения (Ташкент, 1998).

Публикации. Материалы диссертационной работы опубликованы в 7 научных статьях и тезисах 3 докладов.

Структура и обьем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, описания результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 151 наименований. Работа изложена на 120 страницах компьютерного текста и содержит 10 рисунков, 23 таблицы и 1 схему.

В приложении дана нормативно-техническая документация (лабораторный регламент).

Благодарность. Бьрата» глубокую благодарность академику ял-КИНУ ХАЛМАТОВИЧУ ТУРАКУЛОВУ за помощь и поддержку при выполнении данной работы. Такге Быракав огромную признательность за содейо-

твие при планировании и проведении химической .части экспериментор д.х.н.. проф., зав. лаборатории химии углеводов и растительного-белка ИХРВ ДИЛШОДУ АХМЕДОВИЧУ РАХИМОВУ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Во главе приводится сравнительный анализ гипогликемкческих препаратов синтетического и растительного происхождения, а также полисахаридов, влияющих на углеводный обмен.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы. Листья разных видов шелковицы собирали в Ботаническом саду АН РУ в мае - августе 1993-96 гг, сушили при комнатной температуре до воздушно-сухого состояния (3-4% влажности; сырье). Фармакологические опыты проводили на 496 белых крысах-самцах массой 130-200 г. Животные были разделены на: 1 - ин-тактные; 2 - алиментарная гипергликемия;' 3 - адреналиновая гипергликемия; 4 - аллоксановый диабет: 5 - контрольные, соответствующие каждой модели. Опытные животные получали изучаемый препарат (100 мг/кг) перорально 1 раз в сутки, а также в течении 3 и 7 дней. Контрольные•группы содержались в одинаковых усг ловиях с опытными только без введения Мал. В работе также использованы отечественные и импортные реактивы соответствующей квалификации.

2.2. Методы.

Углеводы из листьев выделяли по схеме I.

Водорастворимые полисахариды экстрагировали из сырья. после обработки спиртом водой (1:5 w/v) в течение 5 часов, фильтровали и остаток экстрагировали водой (1:5 w/v) в течение 16 часов. Экстракты объединяли, упаривали и осаждали 96°-ным этанолом (1:2 v/v), фильтровали, промывали этанолом 70*96° для обезвоживания!! высушивали. Полученные водорастворимые полисахарида (в'ыход-4,6Я) использовали в работе.

Выделение пектинорых веществ. Остаток после выделения водорастворимых полисахаридов экстрагировали дважды смесью (1:1 v/v). 0.5Я-ных" растворов щавелевой кислоты и оксалата аммония при 70-85°С в течение 2 часов. Первая экстракция 1:1и. вторая - 1:5 (w /V). Экстракты диализовали против дистиллированной воды, упаривали и осаждали спиртом (1:2 v/v). Внпавшшг омжж пектиновых веществ обрабатывали как описано иыие (еиход

• Выделение гемииеллюлоз. Остаток сырья после выделения пектиновых веществ обрабатывали последовательно КОН (5 и 10%. 1:5 w/v, 20°С). Экстракты нейтрализовали СНэС00Н и диалпзовали. Выпавший осадок гемицеллюлоз-А обрабатывали как описано выше. Диализат после отделения гемицеллюлоз-А (выход 1.7%) упаривали, гемицеллю-лозы-Б осаждали спиртом (выход 2,8%).

Выделение полисахаридов горячей эктракцией проводили после обработки спиртом водой дважды (1:10; 1:5 w/v) при 95°С в течении 2,5 часов. Полисахарид осаждали 96%-ным этанолом (1:2 v/v). Осадок обрабатывали как описано выше. Выход Мал составил 4-6%.

Галактуроновую кислоту определяли колориметрически (Шелухина Н.П. и др.. 1987).

■ ИК-спектры образцов снимали на однолучевом ИК-Фурье спектрометре фирмы Perkln-Elmer FT-IR система 2С00, в пластинках, спрессованных с КВг.

Бумажную хроматографию проводили нисходящим методом на бумаге Flltrak-FN 11 в системе растворителей бутанол-1-пиридин-Бода (6:4:3 v/v), 'сахара проявляли кислым фталатом анилина и мочевиной, подкисленной HCl.

Электрофорез уроновых кислот проводили, на бумаге FN-7 в 1%-ной уксусной кислоте (ПО В. 7 мА. 4 часа).

Полисахариды гидролизовали в 2ы серной кислоте на кипящей водяной бане в течение 8-48 часов.

Газо-жидкостную хроматографию Сахаров проводили на хроматографе Chrom-5 (колонка 0.4x100 сш: хроматоном N-AW-DMCS 0,16-0,20 мм) с 5%-ным ХЕ-60, температура термостата колонки 200°С, скорость газа-носителя 60 мл/мин. Моносахариды анализировали в виде ацетатов альдононитрилов (Оводов Ю.С.. 1970). Содержание Сахаров определяли по площадям пи:сов на хроматограмме.

Вязкость растворов измеряли вискозиметром Оствальда (d= 0.75 мм) при 20+2°С.

Содержание азота в образцах проводили по Дюма (Нидерль Д. и др.. 1949).

Свободные и метоксилированные (Кс) определяли титрометричес-ки (Арасимовнч В.В. и др.. 1970).

Молекулярную массу Мал определяли методом вискозиметрии (Коваленко С.Л. и др.. 1965) и седиментациошшго (Боузн Т.. 1973) анализа.

О-ацетильные группы в полисахариде Мал определяли титрованием 0. 1 н раствором NaOH (Шелухина Н.П. и др.. 1972).

Алиментарную Ш1ШЖШЙШ вызывали скармливанием глюкозы в лозе 9 г/кг массы с помощью желудочного катетера.

Адреналиновую гищ.'ргликпнию вызивали введением адреналина (50 мкг/кг в/бр.) за 1 ч до взятия крови (Баранов В.Г.- и др.. 1983).

Модель п.млокг.анопогп диабета вызывали общепринятым методом (170 мг аллоксангидрата/кг массы) (Саранов В. Г. и др..1983). Развитии диабета оценивали по уровню сахара в крови (на 10-е сутки не менее 15 ммоль/л).

ММ (100 мг/кг) растворяли в Физрастворе и вводили с помощью катетера в сроки, указанные в подписях к таблицам.

Глюкозу в крови и в инкубационных средах определяли ортото-луидшювим методом (Hyvarlnen A. etal., 190Я), гликоген по Seiner S. (1050), гексокиназу - модифицированным методом по Ней-фаху (Нейфах С.А, и др., 1969), липолитическую активность жировой ткани определяли по Gordon А. (1930), свободные жирные кислоты ,-по Duncombe W.С. (1963), триглицериды измеряли по Fletcher M.J. (196Ü), холестерин определяли с реактивом Либермана-Бурхарда (Колб В.Г.. 1985).

Статистическая обработку результатов проведена по Фишеру Стьюденту (Каминский Л.С,, 1964).

В лаборатории ранее были получены предварительные данные, свидетельствующие о том, что полисахариды шелковицы (Могиз) проявляют гипогликемическую активность. Нашей задачей являлось выделение, изучение Физико-химических свойств полисахарида и его биологической активности на разных моделях гипергликемии.

В целях выявления действующего начала мы изучали более детально углеводы листьев шелковицы белой - Morus alba L.

Воздушно-сухое сырье измельчали и предварительно обрабатывали этанолом для удаления низкомолекулярных соединений. Общая процедура проведенных нами экспериментов по выделению водорастворимых полисахаридов холодной экстракции, водорастворимых полисахаридов горячей экстракции, пектиновых веществ и гемицеллю-лоэ представлена в схема I. Для извлечения полисахаридов остаток

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

растения обрабатывали последовательно водой, оксалатннм буфером " щелочью. Полисахариды из экстракта осаждали спиртом. В результате из водного экстракта выделяли водорастворимые полисахариды, из буферного раствора пектиновые вещества и из щелочного экстракта -гомицеллюлозы -А и -Б.

Качественный и количественный составы выделенных полисахаридов устанавливали после полного кислотного гидролиза с помимо хроматографии на бумаге и газожидкостпой хроматографией в виде ацетатов альдононитрилоп. Данные моносахаридного состава приведены в табл.1.

Таблица 1.

Содержание и моносахаридный состав гидролизатов полисахаридов, выделенных из листьев Morus alba L.

1— 1 N 1..... 1 Тип уг-| Выхол, ........ Соотношение моносаха ридов " 1 1

1левода f 1

/и i 1 1 ...... 1 .......... 1

1 .1 1 Gal 1 сю I 1 1 ''an 1 Xyl 1 А га 1 Rh am | 1

1 1 1 1 ВРПС 4,6 6.0 1 1 1 9,7 1,3 | 1 1.0 1 1 4.4 1 5.3 1

1 2 1 пв 7, В 112,6 1 7.4 | 1,6 1 1,0 1 5.0 4.2 |

1 3 1 ГЩ-А 1.7 ИЗ, 9 1 4.9 I 2,0 1 5,7 1 1,1 1,0 |

1 4 1 ;,.. 1 ГКЦ-Б 2.8 116,5 1 123,6' I 1,0 116. 1 i . 113,3 | 20,6 | i

Количественно преобладающими полисахаридами в листьях являются пектиновые вещества. Образны полисах;).ридов не дают цветной реакции с йодом, что указывает на отсутствие глгс'лна типа крахмала. Как видно;из таблицы 1, все выделенные полисахариды имеют практически одинаковый качественный моносахаридный состав и отли- • чаются их количественным соотношением. В продуктах гидролиза водорастворимых полисахаридов обнаружили рамназу, арабипозу, .ксилозу, маннозу, галактозу и (о преобладанием) глюкозу в следующих соотношениях: 5.3:4 ,-4:1,0; 1, П: 0,0: •). 7 соответственно. Выделенный пектин-порошок кремового цвета, растворимый в воде, обладающий высоким полопичглмп.'м вращением. В его состав входят нгйтральные сахара: галактоза, глюкоза, машюза. ксилоза, орабккоза, ртиян в соотношениях 12.0:7.4:1.6:1.0:5,9:4/2 соответственно и 'таланту-роновал кислота, которая идентифицирована электрофорезом и составляет 53,67,.

•Схема I

ВЫДЕЛЕНИЕ ПОЛИСАХАРИДОВ ИЗ MORUS.

Растительный материал (воздушно-сухой)

IСпиртовый экстракт I(пигменты, моносахариды. олигосахарнды)

82°-ный спирт-

I Экстракт Ь |-,-1

I Осаждение СгН50Н 96°

I-1-1

I Осадок (водораство-| |римый полисахарид) |

I_I

IОсадок (пектиновые вещества)

I Остаток сырья

I-1

I Остаток сырьяЬ

I Остаток сырья Ндля экстракции I полисахаридов

Ч Вода, 20° С

I Остаток сырья

|0,5%-ные р-ры ЧНгС204 и (ЫН4)2С204 I (1:1)

I Экстракт!-1

1-1-1

11)Диализ

|2)Осаждение СгН50Н 96°

I Остаток сырья

11)5% NaOH |2)105S NaOH

i--1

—I Экстракт I

Ч-1

I1)Нейтрализация, I диализ

|2)Осаждение СгН50Н 96°

Н-1

I Осадок (re- I |мицеллюлозы)I

195° С

Ч Экстракт |-

Осаждение СгН50Н 96°

I I-1

J—I Осадок. Мал| 1--,-i

Физико-химическое изучение

Фармакологические испытания

■ Щелочерастворимые полисахариды (гемицеллюлозы-А и -Б,, выход в суммарном виде 4,5%) различаются содержанием моносахаридов. 'В состав гемицеллюлоз-А входят преимущественно галактоза и ксилоза, а в гемицеллюлоз-Б - глюкоза и рамноза.

Исследования на гипогликемическую активность пектиновых веществ, гемицеллюлоз, водорастворимых полисахаридов холодной и водорастворимых полисахаридов горячей экстракции из М.alba показали, что наибольшим сахароснижающим эффектом обладает полисахарид, экстрагированный горячей водой (табл.2). Приведенные в таблице данные, свидетельствуют, что горячая экстракция водорастворимых полисахаридов позволяет получить из растения гипогликемически действующую фракцию.

Таблица 2.

Сравнительная гипо'гликекическая активность полисахаридов, выделенных из лнстьс-в Morus alba (модель алиментарной гкпергликгмпи, полисахаридов вводили за 4 часа до взятия крови)

1Г- II II Глюкоза, м ■ЮЛЬ/'Л Ii II —Ii

!i , I Контроль II II '1 ГМЦ I ПЗ 1 1 ВРПС хол. 1 1 Ii 1 ВРПС гор. II 1 11

l! 1 II 8; 72±0. 19 II II ' (8) II II Р II II эффект, % II [|- " 8, 27J.0, 23 (6) > 0,2 5, 16 ' 1 1 7,50+0,6 1 (6) 1 <0,05 1 14,0 1 1 7,01 + 0,2 1 (3) 1 < 0,01 1 19,61 1 1 N 1 6,29+0,13 || 1 (6) ü 1 < 0,01 ¡1 1 27.87 ü -;-Ii

Примечание: Здесь и 'далее полисахариды при однократном и многократном введениях использовались в дозе 100 мг/кг; глюкоза крови приведена в мполь/л; в скобках указано число тавотных.

В связи с этим детальному изучению вышеуказанной активности подвергали полисахариды, полученные из трех видов Morus экстракцией водой при 95°С.

3^_2^_3ыделеиие и изучение полисахаридов из трех видов Morus

Образцы полисахаридов из трех видов Morus выделяли по схеме I. экстракцией водой при 95°С, общую характеристику которых иллюстрирует табл. 3.

В продуктах полного кислотного гидролиза полисахаридов со-

деркатся гадактоза, глюкоза, манноза, ксилоза,- арабиноза и рамно-за. Преобладающим моносахаридом во всех случаях была рамноза, в Morus nigra отсутствовала ксилоза.

Таблица' 3.

Содержание полисахаридов Morus, полученных методом горячей экстракции и их моносахаридный состав

1 1 N 1 1 Источник 1 полисаха-1 рида 1 Выход, % i I Соотношение моносахаридов | i 1 1

1 I Gal 1 Glc I 1 Man Xyl Ara i 1 iRham 1 1 i

1 1 1 1 M.alba L. 6.1 1 1 7.1 7.1 1 1.0 1.3 6,2 1 1 1 10.71

1 2 |М. nigra L. 3,6 1 5.0 5.0 | 1,0 - 3,1 1 10,91

1 3 i, ... |M. rubra t 2.4 1 4.3' 1 . . . 4.6 I i 1.0 1.7 3.3 f*5 CD

Установлено, что по сравнению с контролем полисахарид из M.alba L. (условно названное Мал) более эффективен. Исходя из этого в дальнейшем исследовали физико-химические свойства и биологическую активность полисахарида Мал.

3.3 Исследование Физико-химических свойств полисахарида Мал

Мал представляет собой аморфный порошок светло-серого цвета, без запаха. Результаты исследований физико-химических свойств приводятся в табл.4.

Мал дает отрицательную реакцию с йодом, что свидетельствует об отсутствии гликанов типа крахмала. Из данных табл. 4 видно, что Мал представляет собой гетерополисахарид. состоящий из кислых (галактуроновая кислота) и нейтральных Сахаров.

В ИК-спектре Мал (рис.1) имеются полосы поглощения при 3460 см"1, характерные для свободных гидроксильных групп. Полосы поглощения при 1745 и 1750 см"1 отнесены к валентным колебаниям кар-бонилов карбоксильных и сложноэфирных групп. При 1640 и 1420 см"1 проявляются интенсивные полосы колебаний ионизированного карбоксила. В области 1000-1200 см"1 группа интенсивных полос отнесена к' валентным колебаниям пиранозных и эфирных мостиков.

Сравнение образцов полисахарида Мал, полученных в разные годы были идентичными и полисахарид не претерпевает существенных изменений при выделении (качественный состав, ИК-спектр).

' Исследование динамики накопления Мал в листьях М. alba для определения .сырьевых ресурсов показало его максимальное содержание в конце срока вегетации, т. е. заготовку сырья целесообразно проводить в августе; в отдельной серии экспериментов показано, что хранение сырья на протяжении 5-6 месяцев не сказывается на его гипогликемических свойствах.

Таблица 4.

Физико-химические свойства полисахарида Мал'

I-i-1-1-1

(Показатели I Результаты

|Молекулярная масса 130500 (вискозиметрия) | " 137500 (седиментация)

IМетоксильные группы I 2.0 % |Ацетильные группы I 0,3 % IСвобод, карбок. группы! 6,0 % !Выход I 4,0-6,0 %

I Влажность I I. 6-8 %

|Относительная вязкость! 1; 1.5 и 2% - 1.79; 2,57 и 5,16 ню I- ■ . I (с 15?, 0.01 н НаОН-) ,

|Азот I 1,84 % '

I ПК-спектр 13460 см"1. 1745-1750 см"1,

I ' 11640-1420 см"1. 1000-1200 см'1

|Моносахаридные ком- Юа1:С1с:Мап:ХуГ: Ага:Ютт |поненты ' 17.1:7.1:1.0:1.3:6,2:10.7

IГалактуроновая кис-та 1 4,8 %

3.4 Изучение гппоглииемизкруюмего эффекта полисахарида на разных моделях гипергликении

Для оценки степени сахароснижавщего действия полисахаридов и их влияния на утилизацию глюкозы в тканях использовали три экспериментальные модели: 1 - алиментарную. 2 - адреналиновую гипергликемию и 3 - аллоксановкй диабет.

Предварительно проводили эксперименты, ставившие своей целью определение токсичности (острой) вводимого препарата. Введение Мал мышам (per os, 500-5000 мг/кг массы) не вызвало гибели животных в течение всего периода наблюдений (10 дней). Это дает осно-

I Ч-Л

\/

%-Т

60 -

50 1

40 -

30 J

20 л

j и ! ! , j !-!---!-[-j--т--f---

3800 3500 3000 2500 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400

Рис. 1. ИК-спектр полисахарида Мал

вание утверждать, что испытуемое вещество не обладает острой токсичностью. • Препараты из растений, не вызывающие симптомов токсического действия в дозе 2000 мг/кг и выше в течение 72 часов, относят к нетоксичным веществам (Айзиков М.И..1975; Noreen W. et al. 1988). Следовательно. Мал.не обладал токсичностью в условиях нашего опыта.

Динамику гипогликемического эффекта Мал исследовали на моделях гипергликемии с однократным введением препарата и непрерывной регистрацией содержания сахара с интервалом 1 час в течение 24-х часов (рис.2). Показано достоверное снижение глюкозы к исходу второго часа после приема препарата, причем эффект сохранялся в течение 6-ти часов. Минимальный уровень сахара в крови зарегистрирован через 4 часа. т.е. максимум действия препарата при приеме per os проявляется через четыре часа и продолжается в течение 2 часов.

Таким образом. Мал не обладает гипогликемической активностью в норме и демонстрирует максимальный гипогликемический эффект порядка 30% На Моделях алиментарной гипергликемии и аллоксанового диабета. Сходное'снижение сахара с другими растительными полиса-

харидами при алиментарной гипергликемии в вышеуказанных дозах отмечают др. авторы (НШпо Н. е1 а1., 1986 ;ТаКаЬаз1И М.е1 а1.. 1986). Эффект водных экстрактов растений, применяемых традиционной медициной, проявляется ко 2-7 часу (способ введения - в/бр) при использовании тех же концентраций (3-100мг/кг) (Н1к1по Н. ег а1.. 1988:1989; Тошоба М. ег а1., 1990; КШо Т. е1а1.. 1994).

Глюкоза, ммоль/л ю|-

■ I'.

I-!-1-1-1-1-1-1-1-1—| | I |—>

01 2 3 4 5 6 7 8 9 23 24

Время, часы

Рис.2. Динамика гипогликемического действия Мал —о— опыт: —х— контроль Сравнительная оценка гипогликемической активности Мал и применяемых в клинике пероральных сахароснгакающих препаратов - манинила и адебита' показала, что на модели алиментарной гипергликемии Мал не уступает по активности указанным препаратам (30.52; 32.37; 30,82% соответственно). При аллоксановом диабете однократное вряцэчяс Мал продемонстрировал эффект, равный таковому на модели алиментарной гипергликемии (снижение уровня глюкозы на зо^ь При многократном введении снижение уровня глюкозы под влиянием. Мал было значительно выше (45 против 9,4%).

Известно, что у голодных крыс почти полностью расходуется гликоген, и'вызванная введением адреналина гипергликемия обуслов-

лена активацией глюконеогенеза с параллельным ингибированием гли-когенсинтетазы (Баранов В.Г. и др.. 1983). Сахароснижающий эффект Мал на этой модели обусловлен, по-видимому, ингибированием процесса глюконеогенеза. Также не исключена стимуляция гликолиза или накопление гликогена в печени. Эти исследования позволят выяснить особенности механизма действия Мал. Эффективность Мал на модели аллоксанового диабета оценивали в опытах с однократным и многократным его введением (Табл.5). Известно, что даже при диабете

Таблица 5.

Гипогликемическая активность Мал при аллоксановом диабете

1 I Вариант 1 групп 1 1 1 1 1 Введение Мал 1

1 1 однократное 1 1 1 1 трехкратное I 1 | семикратное |

1 1 Контроль |0пыт |Р IГипоглик. I эффект (%) I 1 125.35+1.69 (12) 117. 88+1,01 (12) 1 <0,01 1 1 29.47 ■ 1 1 1 20.88+0,7 (6)| 1 11.41+1,5 (6)1 1 < 0.001 | 1 1 1 31.00 | л ....... 1 18.86+1,2 (12)1 10.55+0.7 (11)| < 0,001' . | 44.0 | .. .... 1

экспериментальные животные быстро приспосабливаются к условиям опыта, следствием чего й отмечается устойчивое во времени снижение содержания глюкозы в крови (табл.5). Даже на этом фоне в группе животных, получавших Мал одно- и семикратно, содержание глюкозы снизилось достоверно на 29 и 44% соответственно.

Предпологается, что в ранние сроки аллоксанового диабета действие Мал не опосредовано увеличением секреции инсулина, а является следствием использования глюкозы в окислительном обмене. Это допущение подтверждается еще и тем, что эффект Мал проявляется в присутствии адреналина, ограничивающего синтез гликогена в мышцах. Следовательно, полученные результаты позволяют заключить, что в основе гипогликемического действия Мал лежит не только ин-гибирование глюконеогенеза. но и стимуляция гликолитического обмена глюкозы в тканях.

- 15 -

3.5.-Влияние Нал на содержание гликогена, активность гексокиназы печени и мыши у крыс с аллоксановьм диабетом Было установлено, что снижение уровня глюкозы крови аллок-сандиабетических крыс под действием Мал сопровождается достоверным увеличением'гликогена в печени и мышцах (табл.6). Накопление

Таблица 6.

Содержание глюкозы крови, гликогена (мг%) и активности гексокиназы (МЕ) в печени и мышцах аллоксандиабетических крыс после 7-дневного введения Мал

1 г I Показатели 1 Варианты групп Г 1 1 1 |Гипо- I

1 1->- Ч |глик. 1

I 1 Контроль | Опыт 1 1 1 1 Р |Эфф-Т I 1 1 |

1 1 1 IГлюкоза, ммоль/л. (15) 121,45+0,77 Ц2.15+0.43 1 1 1 КО. 001143, 36% |

1 Гликоген в печени, I I 1 1 1

|мг/й, (16) |237,04+9,72(1451,00+21,62|<0. ООН I

I Гликоген в мышцах. 1 1 1 1 !

1 МГ/%, (15) 192,17+1,63 1200,32+4,69 Ко. ооН ' |

1 Активность гексокиназы! - I 1 1 1

| в печени. МЕ, (12) 129.00+0,71 139,20+1,29 1 <о,оо1! 1

1 Активность гексокиназы| I 1 1 1

1 в мышцах. МЕ. (12) 112.16+0.32 117.44+0.49 1 ,1------- .и. Ко, ооН 1 1 1 1

гликогена является прямым результатом стимулирования гликогенсин-тетазы в изучаемых тканях. В этих условиях парал'лельно наблюдается ингибирующее влияние Мал на активность фосфорилазы. Обнаруженный нами эффект можно рассматривать как инсулиноподобное действие препарата, которое опосредовано, возможно, путем повышения чувствительности тканей к имеющемуся инсулину в данных условиях.

Вступление глюкозы в реакции энергетического обмена клетки осуществляется в виде ее фосфорилированной формы с участием глю-кокиназы в печени и гексокиназы в мышцах. При диабете, вследствие недостатка инсулина, контролирующего синтез этих ферментов, их содержание резко снижено, что приводит к торможению анаэробного гликолиза и стимуляции глаконеогенеза (Блинов В.А., 1993). Поэтому для выяснения механизма действия Мал представлялось необходимым изучить состояние гексокиназной системы на вышеуказанных моделях. При этом у животных, которые многократно получали Мал,

- 16 -,

обнаружено достоверное повышение активности гексокиназы в печени и мышцах до 135.2 и 143,4% от контроля, соответственно (табл.6). Этот факт хорошо коррелирует с возрастанием количества гликогена и позволяет признать, что снижение уровня глюкозы под влиянием Кал является результатом ее включения в'состав гликогена. Аначо-гичные результаты были получены при изучении механизма действия бигуанидов (Мазовецкий А. Г. и др.. 19S7). а также некоторых препаратов из растений (Кит С.М. и др., 1986).

В последнее время выяснилось, что обладавший гипогликемичес-ким действие;-', ванадзт (Косовский М.И. и др.. 1994) блокирует де-фосфорилпропанпе рецепторов инсулина на мембране и. тем самым, 'повышает чувствительность ткани к гормону (У.-К.Kim et al, 1995). Не исключено аналогичное увеличение физиологически активного инсулина в циркуляции и/или повышения чувствительности -тканей к гормону при длительном использовании отвара из листьев шелковицы с образованием de novo панкреатических островков (Шеремет И.П. и др., 1991).

3.6. Слияние Нал на потребление глюкозы мышечной тканью

Интенсивность и направленность гликолиза в тканях лимитируется транспортом глюкозы через клеточную мембрану. Скорость поглощения глюкозы препаратом изолированной диафрагмы крыс может служить показателем ее транспорта в условиях неравновесного процесса (Ныосхолм Э. и др.. 1977). Для выяснения влияния Мал на уровень потребления глюкозы мышечной тканью аллоксандиабетических животных провели опыты in vitro с добавлением в инкубационную среду инсулина и Мал. Мал в дозе О,01 мг/мл не оказывал влияние на потребление глюкозы мышечной тканью диабетических животных (1,45 и 1.48 мкмоль/л в присутствии Мал). Инсулин в аналогичных условиях стимулировал поглощение глюкозы в контроле и в опыте (1,75 и 1,77 мкмоль/л соответственно). Отсюда следует заключить, что Мал в опытах in vitro не обладает гипогликемичеекпм эффектом, т.е. его влияние сходно с действием препаратов сульфонилмочевины (Баранов В.Г. и др.. 1983; Мазовецкий А.Г. и др.. 1987).

Из цифровых данных табл. 7 нетрудно заметить, что кормление Мал аллоксандиабетических крыс приводит практически к двухкратному увеличению потребления глюкозы препаратом диафрагмы (96.7 и 109% соответственно). Кроме того, из данных таблицы 7 вытекает,

нто Мал потенцирует эффект инсулина, они оба действуют однонзп-равленно т. е. 26 и 35% соответственно в отсутствии и присутствии инсулина. Какой из участков регуляции транспорта глюкозы в мышечную клетку - увеличение физиологически активного инсулина в циркуляции, возрастание сродства рецепторного аппарата клетки к ин-

Таблица 7.

Потребление глюкозы (мкмоль/г сырой ткани) мышечной тканью аллоксаидиабетических крыс получавших Мал в течение 7 дней

I-1--1--1

I группы I без инсулина | с инсулином |

IКонтроль (8) I 1,50+0,2 | 1,90+0,25 |

Юпыт (8) I 2,95+0.3 | 3.97+0,3 |

|Р I <0,001 | < 0,001 |

¡Эффект (%) | 96,67 | 108.95 I

I_I__|--1

сулину, или последовательности внутриклеточных реакций восстанавливает Мал в условиях эксперимента, не представляется возможным. Однако сравнение в опыте действия добавленного инсулина на фоне Мал показывает примерно равную стимуляцию транспорта глюкозы. Этот экспериментальный факт, несомненно, свидетельствует о выраженном усилении действие инсулина Мал при аллоксановом диабете. Аналогичный эффект восстановления отмечается под влиянием галеги-на - увеличение содержания гликогена в печени и объема поджелудочной железы (Матковская А.Н. и др..1991). Стимулирующий эффект на утилизацию глюкозы периферическими тканями проявил также поли-, сахарид. выделенный из ганодермы блестящей (Н1К1по Н. е1 а1.1989).

3.7. Влиянне Мал на содержание нейтральных липидов. уровня.холестерина. СЖК в плазме кповн и потребление глюкозы жировой тканью аллоксанлчабетическнх крыс

Введение животным Мал в течение 7 дней, заметно сглаживало имеющиеся сдвиги показателей обмена липидов путем значительного снижения уровня СЖК и холестерина (23.17% и 6% соответственно) в крови, уровень триглицеридов оставался без изменений. В литературе описываются растительные экстракты, нормализующие при многократном введении наблюдаемые при диабете изменения липидного обмена' :(К1тига М. е1 а1.. 1931).

- 18 -,

Снижение уровня свободных жирных кислот в крови под действием Кал на Фоне постоянного уровня триглицеридов может свидетельствовать о вовлечении СЖК в обменные процессы. Изменение содержания СКК могут быть обусловлены использованием их в окислительных процессах, или же их интеграцией в ' многокомпонентные липиды (нейтральные липиды и фосфолипиды). Для проверки высказанного предположения были проведены исследования действия Мал на окислительный обмен жирных кислот.

Опыты с опидидимальной жировой тканью, взятой у крыс с ал-локсановым диабетом, показали, что после многократного введения Мал достоверно повышалось потребление глюкозы жировой тканью (табл.8). Нал-в сочетании с инсулином увеличивает поглощение глюкозы почти в два раза (3.57 против 1,9 мкмоль/г в контроле). ЭтоТ факт как и в мышечной ткани, говорит об усилении эффекта инсулина в жировой ткани при их совместном введении.

Интересными представляются также данные, полученные при действии адреналина на жировую ткань (табл.8). Адреналин, как и

Таблица 8.

Потребление глюкозы опидидимальной жировой тканью аллоксан-диабетических крыс до и после введения Мал в течении 7 дней (инсулин добавляли в 0.1 мед/мл, адреналин 5 мкм/мл)

1 ■■■■ 1 I группы I 1 без инсу- | 1 с инсули- I 1 с адрена- | 1 с адреналином!

1 1 1 1 ляпа I 1 ном I лином I 1 и инсулином I

1 1 |Контроль (8)| 1 1,27+0,15 1 1 1 1 1,90+0.23 I : 1 ! 0,59±0,54 | 1 1 1 0.72+0,06 I

!Опыт (7) | 1,54+0,19 1 1 3.57+0.75 1 1 0,51+0.04 1 1 1,75+0,34 |

|Р 1 > 0,2 1 <0,05 ' 1 >0,5 1 <0,02 |

I Эффект. % | | 21,2 1 88,0 I 1 1 243,0 ¡1 1 11

следовало ожидать тормозил за счет блока гликолиза на уровне три-озофосфатоз (Баранов В.Г. и др.. 1983), потребление глюкозы в условиях эксперимента. Инсулин на этом фоне увеличил транспорт незначительно: аналогично проявил себя и адреналин. Однако, когда на фоне семидневного скармливания Мал были вьедены адреналин инсулин - скорость потребления глюкозы увеличивалась более чем в 2 раза и практически не отличалась от таковой в контроле при добавлении инсулина. Эти данные также свидетельствуют о однонаправленном влиянии Мал и инсулина е плане нормализации обмена глюкозы

при диабете. Сходный эффект стимуляции экзогенного инсулина описан для экстракта заманихи, демонстрирующего удовлетворительное действие при диабете средней тяжести; он оказался малоэФФектипным при тяжелых Формах диабета, однако заметно стимулировал экзогенный инсулин, что позволило снизить его дозу больным на 10-20 Ь'Д (Кит С.М. и др.. 1986).

Представило также интерес оценить слияние инсулина, Мал и их сочетания на некоторые параметры обмена липидов. После многократного введения Мал наблюдалось торможение лииолиза в жировой ткани крыс с аллоксановым диабетом (3,9-1 мкэкв/г в контроле и 1,91 - в опыте). Инсулин, тормозящий лмполиз снижал концентрацию СЯК крови, Мал на этом Фоне недостоверно снижал уровень СМ. Уьеличо-ние концентрации СЖК при аллоксановом диабете призвано обеспечить использование жира как источника энергии при недостаточности утилизации углеводов (Баранов В.Г, и др.. 1983). Предпологается. что торможение липолиза в жировой ткани в условиях нашего опыта связано со стимуляцией потребления глюкозы, вызванной активацией гексокиназы.

Таким образом, в опытах In vivo Мал стимулирует периферическое использование глюкозы, активирует гексокиназу, подавляет глюконеогенез. способствует накоплению гликогена в печени и мышцах и ингибирует липолиз. Все эти эффекты проявляются при наличии в организме определенного количества инсулина, опосредующего ин-сулиноподобное действие Мал, или же Мал восстанавливает чувствительность тканей к инсулину. Эти предположения не противоречат установленному основному действию препарата -'. снижению сахара крови.

ВЫВОДЫ

1. Проведено исследование химического состава и биологической активности полисахаридов трех видов растения рода Morua; М.alba L., М.nigra L. и М.rubra сем, Могасеае, Разработана комплексная схема выделения водорастпоримых полисахаридов, пектиновых веществ и гемицеллюлоз. Изучено их количественное содержание, качественный состав.

2. Полисахаридний 'комплекс Мал, выделенный из листьев м,alba L. (белая шелковица)' охарактеризован по биологической активности. Физико-химическим свойствам и количественному моносахарид-ному составу. Он состоит из нейтральных и кислых моносахаридов.

- 20 - ,

По периодам вегетации максимальное количество полисахарида Мал в листьях содержится в августе.

3. Доказано, что скармливание Мал аллоксандиабетических крыс в течение семи дней повышает потребление глюкозы мышечной тканью, приводит к увеличению гликогена в печени и мышцах, стимулирует активность гексокиназы и приводит к достоверному снижению содержания СЖК в сыворотке крови, что свидетельствует о стимуляции Мал анаэробного обмена глюкозы и торможении липолиза.

4. Мал осуществляет свой гипогликемический эффект путем потенцирования действия инсулина или восстанавливает чувствительность периферических тканей к гормону и, таким образом, стимулирует утилизацию глюкозы.

5. Разработан лабораторный регламент получения гипогликеми-ческого полисахарида Мал из местного растения, который может служить основой при создании эффективного препарата для лечения диабета.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Физико-химические свойства и биологическая активность са-хароснижающего вещества из шелковицы/ Р.Т. Рахимджанов, С.П.Каткова. М.Х. Санавова. A.A.Абидов //Кимё'ва фармация.-1994, N4/5. -С. 7-8.

2. Рахимджанов Р. Т., Санавова М.X.. Абидов А. А. Полисахариды листьев Morus а1Ьа//Химия природ, соедин.-1994, N6.-С.820-821.

3. Изменение показателей углеводного обмена у крыс с экспериментальным диабетом под действием препарата из шелковицы/ Я.Х.Туракулов. С.П.Каткова. А.А.Абидов. Р.Т.Рахимджанов, М.Х.Санавова// Узб. биол.журн.-1995. Nl.-C.6-9.

4. Санавова М.X., Туракулов Я.Х. Влияние Мал на некоторые показатели углеводного и липидного обмена у крыс с экспериментальным сахарным диабетом//Докл. АН РУ-1996, N3.-С. 41-43.

5. Санавова М.Х., Туракулов Я.Х. Влияние препарата из шелковицы - Мал на уровень гексокиназы у крыс с экспериментальным сахарным диабетом// Узб.биол.журн.-1996. Н 3.-С.70-71.

6. Санавова М. X., Рахимов Д.А. Изучение полисахаридов Morus и их биологической активности// Химия природ.соедин.-1997, N6.-С. 789-791.

7. Абидов А.А.. Санавова М.Х. Исследование сахароснижающего

свойства полисахаридов, выделенных из листьев шелковицы// Нине' ва ■фармация.-1997-. -115/6. -С. 103-105.

Тезцьн докладов

1. Sanavova М. Kn.. TuraknJov Ya.Kli. Isolation and hypoglloernlc activity of polysaccharide from Morus alba leaves// Abstr. Second International symposium on the chemistry of natural compounds.-22-24 October. 1998.-Esklsehlr, Turkey.-P. 165.

2. Sanavova M.Kh.. Turakulov Ya.Kh., Rakhlrcov D.A. Effect of Hal polysaccharide on some parameters of carbohydrate and lipid metabolism In rats with experimental diabetes mellltus// Abstr. Second International symposium on the chemistry of natural compounds.-22-24 October, 1996.-Esklsehlr,. Turkey.-P. 172.

■3. Санавова M.X.. Абидов А.А. Выделение сахароснижающего полисахарида из листьев шелковицы Morus alba и его химический сос-тав//Перспективы создания лекарственных препаратов на базе сырья Центральной Азии: Тез. докл. Мездунар.науч. конф. -21-23 октябрь, 1998. -Ташкент. -С. 19.

K0RUS ПЛИСАХАРИДЛАРИ ВА УЛАРНИНГ УГЛЕВОД АЛМАШНУВИГА ТАЪСИРИ Санавова Му^ддам Холбаевна

Ок тут (М.alba L.), шотут !Н.nigra L.), кизил тут (М.rubra) баргидан сувда зрийдиган полисахарндлар. пектин моддалар.. геми-целлюлозалар ажратиб олиниб, уларнинг миедори ва моносахарид тар-киби урганилди. H.alba L. баргидан олинган. таркибида -0СН3, гОАс, -СООЙ гурух.лар тут'увчи. ММ 37 500 булган,' сувда эрийднган полисахарид (Мал) гипогликемии фаолликка эга эканлиги ашщланди. Унинг таркибида галактоза, глюкоза, ксилоза, манноза, арабиноза. рамноза ва галактурон кислоталари топилди.

. Мал-нн 500-5000 мг/кг мицдорда оц сич^онлзрга огиз орнам юборилганда за^арлилиги ва салбий таъсири йуклиги анйранди. Мал Канд мивдорини пасайтирувчи Фаоллиги яи^атидаи хорижий антидиабетик препаратлар - напинил ва адебитдан цолиюмаслиги к^рилди. Ал-локсан диабетли каламушларга куп маротаба юборилганда кондаги глюкоза даражаси пясайиши жигар .ва мушакда гликоген мивдорини осиши, гллжозянйнг муиак ра йг' т^цинзларида сарфланиши билан бир вактда'кузати'лди.'• Бу к^рсаткичларни инсулин игатирокида якала ор-тиии,-гексокинаэа йаоллигини кучайиаш, глюконеогенезни секипла'пу-в'и иараб-илари цзхсрида. эркин Йр кислоталарпинг камайиши ва лппо-

лизнинг тормозланиши каби долатларни параллел кечиши бирга бориш аншушди.

Олинган далиллар Мал препаратининг- углевод алмашинувига ижо-бий таъсири туцималарнинг гормон таъсирига сезувчанлиги орпши орцали инсулин фаоллигини кучайтиради, дейишга асос б^ла олади.

MORUS POLYSACCHARIDES AND THEIR EFFECT OH CARBOHYDRATE METABOLISM Sanavova Mukaddam Kholbaevna

Morus polysaccharides of three types, such as M.alba L., M.nigra L. and M. rubra have been studied. They consist o£ water-soluble polysaccharides, pectins and hemlcellyloses. A water-soluble polysaccharides. Isolated from M.alba L. with molecular mass of 37 500. containing -0CH3, -OAc, -C00H possesses hypoglycemic effect. Galactose, glucose, xylose, roannose, arablnose, rhamnose and galacturonlc acid are the constituents of the Mai.

Upon peroral administration of Mai In the amount.of 5005000 mg per kg of white mice body mass non-toxlclty and no side effects have been revealed. As to hypoglycemic effect it does not yield to manlnll and adebit. Repeated administration of Mai to rats with alloxan diabetes resulted in glucose decrease in blood with simultaneous increase of glycogen reserve- in liver and muscles, as well as in Increase of glucose consumption by muscle, and epldldymal fatty tissues, still Increasing with the presence of insulin. At the same time the activity of hexagenase Is found to be stimulated. against the inhibition of llpolysls gluconeogenesls is supressed with the subsequent quantitative reduction of fatty acids.

The results provide the ground to affirm that the favorable effect of Mai on the carbohydrate metabolism Is realized through potentiating the insulin effect on tissues due to the restoration of their sensitivity to the hormone.