Полный химический синтез зервамицинов IIВ, меченных стабильными изотопами, с целью изучения их каналообразующих свойств тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

РГ1

01

РИМАВИ ВАЛИД Х.О.

ПОЛНЫЙ ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ЗЕРВАМИЦИНОВ ИВ, МЕЧЕННЫХ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ, С ЦЕЛЬЮ ИЗУЧЕНИЯ ИХ КАНАЛООБРАЗУЮЩИХ СВОЙСТВ

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

л

\

V'/

V

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва, 2000

Работа проводилась на кафедре биотехнологии Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Швец Виталий Иванович

кандидат химических наук,

старший научный сотрудник Огрель Андрей Адольфович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор кандидат химических наук

Донецкий Игорь Алексеевич Сидорова Мария Владимировна

Ведущая организация

Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится "О " СЙ-Ш^ЬрЯ 2000г в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 063. 41. 01 в Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 117571, Москва, проспект Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М. В. Ломоносова (119831,

Москва, М. Пироговская, 1)

Автореферат разослан "29 " ОеиГ0 2000г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник /? А Лютик Алла Игоревна

¡\<о<С2-.%62.-<{00

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время известно огромное количество антибиотиков различного происхождения и строения. Однако поиск новых антибиотиков и изучение механизмов их действия до сих пор остается акту&тьной задачей. Это связано с тем, что ко многим из них вырабатывается резистентность и требуется их замена на новые, более эффективные. Кроме того, ряд заболеваний по-прежнему не поддается эффективному лечению известными антибиотиками. На основе знаний механизмов действия антибиотиков химикам удается создавать синтетические и полусинтетические производные природных веществ, обладающие более совершенными фармакологическими свойствами.

Одним из основных классов антибиотиков являются пептидные антибиотики. Это очень большая и разнородная группа природных пептидов, различающихся характером строения пептидной цепи (линейные и циклические), нашчием специфических аминокислот сложного и необычного строения и наличием специфических нспептидных фрагментов. Пептидные антибиотики также различают по механизму антибактериального действия. К линейным каналообразующим пептидным антибиотикам относятся пептаиболы.

Зервамицин ИВ представляет собой 16-членный пептаибольный антибиотик (рис.1), выделяемый из культуры клеток ЕтепсеНорБ'к ¡аЫозуппетМа, эффективный против как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, но безопасный для эукариотических клеток. В связи с этим он привлекает внимание исследователей как потенциальный лекарственный препарат.

Н О н О 1 . н О НО(^НО оЧно о* / ^

оу н о ; н с А н о '4 н о '4 Н о '4 но о Ч^.

' он оч и

Ac Trp1 Не Gin D-Iva Не Thr6 Aib Leu Aib Hyp Gin" Aib Hyp Aib Pro Phl'6

Рис. 1. Структура зервамицина IIB.

Зервамицин IIB образует в мембранах бактерий потенциалзависимые многоуровневые

ионные каналы, что приводит к нарушению электрохимического баланса мембраны и как

следствие этого, вызывает гибель клетки. Для конструирования новых аналогов антибиотика,

Список использованных сокращений: Aib - 2-аминоизомасляная кислота; Iva - изовалин; Hyp -гидроксипролии; Phi - фенилаланинол; Fmoc - 9-флуоренилметилоксикарбонил; ВОР - бензотриазол-1-илокси-трис(длметиламино)фосфоний, гексафторфосфат; DEA - диэтиламин; DMAP - 4-диметиламинопиридин; DIPEA - диизопропилэтиламин; HOBT - 1-гидроксибензотриазол; CF3PyBOP - 6-трифторметилбетотриазол-1-илокси-трис(пирролидшю)фосфоьий, гексафторфосфат; РуВгор - бром-трис(пирролидино)фосфоний, гексафторфосфат; CF3HOBT - 1-гидрокси-б-трифторметилбензотриазол; TIPS - триизопропилсилан.

обладающих лучшими свойствами (растворимость, устойчивость и т.д), необходимым является выяснение механизма его антибактериального действия, а также определение структурно-функциональных отношений в его молекуле. Согласно существующим на сегодняшний день моделям каналы формируются из агрегатов молекул антибиотика, стабилизированных водородными связями между остатками Gin" и Hyp13. Однако эти модели, основанные на кристаллической структуре антибиотика и на эмпирических молекулярных расчетах, не дают полных ответов на все вопросы, связанные с функционированием ионных каналов зервамицина ИВ. Исключительно ценную информацию на этот счёт можно получить, исследуя меченные стабильными изотопами образцы антибиотика в фосфолипидных бислоях с помощью изотопно-чувствительной техники, в частности, ЯМР-спектроскопии.

В связи с этим представлялось весьма актуальным синтезировать зервамицин IIB, содержащий стабильные изотопиые метки в различных положениях пептидной цепи с целью изучения его структуры с помощью ЯМР-спектроскопии.

Представленная работа является частью исследований, проводимых в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова на кафедре биотехнологии по теме К» 1Б-22-866 "Разработка методов получения природных и синтетических амфифильных веществ и их использование как компонентов лекарственных средств и инструментов моделирования мембранных биологических процессов", в рамках гранта Минобразования РФ № 1М-131-В66 по программе "Фундаментальные исследования в области химических технологий " по теме "Разработка биохимических методов получения стабильно меченых биологически активных веществ и использование их в исследовании функционирования биологических мембран", а также при участии Лейденского университета (Нидерланды) в рамках проекта Нидерландской организации научных исследований (NWO) № 047.006.009.

Цель работы. Синтез l5N-, 13С- и 2Н-меченых глутаминов, 0-[15М]изовалина и а-[15К]аминоизобутановой кислоты, а также полный химический синтез меченных стабильными изотопами зервамицинов IIB с целью исследования структуру зервамицина IIB с помощью ЯМР-спектроскопии.

Научная новнзна и практическая ценность работы Разработаны подходы к препаративному синтезу изотопно меченых аминокислот, входящих в состав пептаибольного антибиотика зервамицина IIB. Синтезированы глутамины, содержащие l5N-, 13С- и 2Н-изотопные метки, из соответствующих глутаминовых кислот с помощью фермента глутаминсинтетазы с выходами 70-80%. Получены 15Ы-изовалин и а-['5М]аминоизобутановая кислота с выходами 65% и 31%, соответственно.

Впервые получены 3- и (или) 4-13С-меченые глутамины. При анализе спектров 'Н-ЯМР 13С-меченых глутаминов показано, что наличие 13С-изотопа в 3 и 4 положениях Gin приводит к расщеплению сигналов протонов в соответствующих положениях с константой спин-спинового взаимодействия, равной 128 Гц.

Изучен применительно к а-[ьМ]аминоизобутановой кислоте метод получения а,а-диалкилированных аминокислот но Штрекеру. Показано, что при синтезе аминокислот, исходя из смешивающихся с водой кетонов, существенным фактором является наличие органической фазы. Более того, выявлен необычный путь получения аминокислот из кетонов и производных синильной кислоты без добавления соединений аммония.

Оптимизирован трехстадийный метод синтеза £)-['^]изоватана исходя из 2-бутанона через получение промежуточного П,£-аминоизовалерамида с последующим стереоселективным микробиологическим гидролизом с помощью клеток Mycobacterium neoaurum АТСС 25795, содержащих ¿-специфическую аминопептидазу.

Синтезированы зервамицины IIB, содержащие 1гМ-метку в а-положении остатков Gin в 3 или 11 положениях пептидной цепи антибиотика по оригинальной схеме. При этом показано, что в пептидном синтезе с использованием ВОР в качестве активирующего реагента боковая амидная функция Gin не нуждается в защите. Разработана методология для сннтеза С-концевого фрагмента зервамицина IIB, исходя из фенилаланинола со свободной спиртовой функцией. Отработаны условия удаления Fmoc-группы с помощью раствора NaOH в смеси растворителей диоксан/мстанол/вода, при которых не происходит разрушение связи Pro-Phi.

Проведено полное соотнесение сигналов 'Н-ЯМР-спектра синтезированного зервамицина с помощью двумерной корреляционной ЯМР-спектроскопии (COSY и NOESY), в результате чего было показано влияние '"'N-метки на вид сигнала, соответствующего ,5NH-протону остатка Gin ".

В рамках проекта Нидерландской организации научных исследований (NWO) синтезированные |5М-изовалин и а-[|?1Ч]аминоизобутановая кислота были использованы в ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов Складневым Д. А. для микробиологического синтеза меченного зервамицина. С использованием меченых зервамицинов проводятся исследования с целью изучения их кан&лообразующих свойств.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1) Синтез 1SN-, |3С- и 2Н-меченых глутаминов из соответствующих глутаминовых кислот с помощью фермента глутаминсинтетазы.

2) Синтез а-['5М]аминоизобутановой кислоты и 0-[ьЫ]изовалина с использованием химико-ферментативного подхода.

3) Синтез меченных стабильными изотопами зервамицинов IIB по усовершенствованной схеме.

4) Изучение синтезированного меченого зервамицина IIB с помощью двумерной корреляционной ЯМР-спектроскопии.

Публикации. По результатам диссертационной работы опубликованы 2 статьи и тезисы двух докладов. Две статьи находятся в печати.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на 4-ой Всероссийской (международной) научной конференции "Физико-химические процессы при селекции атомов и молекул" (Звенигород, 1999) и на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000).

Объём работы. Диссертационная работа изложена па страницах машинописного текста, содержит/¿з рисунков, б таблиц, схем и состоит из следующих разделов: введение, литературный обзор, обсуждение результатов, экспериментальная часть, выводы, список литературы, включающий Ц.1&ссылок.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Синтез меченных стабильными изотопами аминокислот, входящих в состав зервамицина IIB

• Получение меченных стабильными изотопами аминокислот является необходимым шагом на пути проведения исследований пептаиболов с помощью изотопно чувствительной техники в фосфолипидных мембранах. В данной работе были разработаны подходы к препаративному синтезу аминокислот (¿-Gin, Aib и £>-Iva), меченных изотопами 2Н, ,5N и 13С в различных положениях с целью введения их в молекулу зервамицина IIB.

1.1. Синтез изотопно меченых глу гаминов

Выбор Gin в качестве объекта изотопного мочения основан на предположении, что остаток глутамина играет решающую роль в открытии и закрытии ионных каналов, образуемых молекулами зервамицина ИВ, что связанно с ориентацией в пространстве его боковой цепи.

Для синтеза меченых глутаминов (1)-(8) (табл. 1) нами был использован химико-ферментативный подход. В основе метода лежит конверсия 2H-, 15N-, 13С-мечсных

глутаминовых. кислот в соответствующие глутамины с помощью фермента глутаминсинтетазы (GS, ЕС 6.3.1.2.) (схема 1).

НО

5 ОН

GS, Mg+\pH 7.1, 38°С

но ' : - nh2

nh2

0X8)

n н2

лтр

ADP

Схема 1. Ферментативный синтез меченых глутаминов (1)-(8).

Как известно, глутаминсинтстаза является катализатором АТР-зависимого превращения глутаминовой кислоты в глутамин. Однако образующийся в ходе реакции ADP оказывает конкурирующее ингибиторное действие на активность фермента. Для избежания этого можно было бы применить ADP-зависимое превращение фосфоенолпирувата в пируваг, катализируемое ферментом пируваткиназой. Однако этот приём по экономическим соображениям является, на наш взгляд, нецелесообразным. Поэтому, для подавления ингибиторного действия ADP, мы добавляли АТР в трёхкратном избытке по отношению к аминокислоте. Каталитическая активность глутаминсинтетазы проявляется при наличии в реакционной среде двувалентных катионов металлов. В качестве таковых мы использовали катионы магния (Mg++). Источником азота служил NH4C1 или 15NH4C1 при получении [5-l5N]Gln (6). Реакции проводили а 80 мМ имидазолыюм буфере (рН 7,1) при температуре 38°С в течение 24 ч.

I5N,- "С,- 3,3-2Н2- и 2-2Н-меченые глутаминовые кислоты были предоставлены Лейденским университетом (Нидерланды). [4,4-2H2]Glu (9) была получена из немеченой Glu с помощью реакции химического обмена в 20% 2НС1 в Н20 (схема 2). Реакцию проводили при температуре 100°С в течение 4 суток. Полностью меченая глутаминовая кислота (9) была получена с выходом 75%.

п

п

о

О

H2N

(9) ■

Н2Й

Схема 2. Синтез [4,4-2H2]Glu (9) из немеченой глутаминовой кислоты.

Выделение чистых меченых глутаминов осуществляли с помощью ионообменной хроматографии на кагионообменнике AG 50W-X8 (МЩ^-форма) для удаления всех положительно заряженных ионов, а затем на анионообменнике AGI-X8 (Ас"-форма) для удаления ионов с отрицательным зарядом, а ацетат аммония удаляли промывкой этанолом. Таким образом, в ходе данной работы были разработаны условия, в результате применения которых удалось получить полностью меченые глутамины с выходами от 70 до 80 % (см. табл.1).

Данные спектров 'Н-ЯМР меченых Gin и Glu представлены в табл. 1. Анализ данных спектра соединения (9) по сравнению со спектром немеченой глутаминовой кислоты позволяет заметить исчезновение мультиплета в области 2.5 м. д. и проявление сигнала протонов НЗ в виде дублета, что свидетельствует о замещении протонов Н4 на дейтерий. Аналогичное явление наблюдается при рассмотрении спектра глугамина (1). Исчезновение мультиплета в спектре соединения (2) в области 2.12 м. д., а также проявление сигналов, соответствующих протонам Н2 и Н4, в виде синглетов, подтверждает замещение протона НЗ на дейтерий. В спектре соединения (3) отсутствует сигнал при 3.74 м. д., соответствующий протону Н2.

Таблица 1. Выходы, температуры плавления и данные 'Н-ЯМР-спектров 2H-, 15N- и ЬС-меченых аминокислот (1)-(9).____

N° соединения Соединение Выход, % Т. пл.,°С (вода) Химические сдвиги, 5, м. д.

Н2 НЗ Н4

- Z-глутамин - 185 [1001 3.74 т 2.12 м 2.42 м

(1) 1-[4,4-2Н2]глутамин 75 184-186 3.76 т 2.10 д .

(2) 1-[3,3-^Н2]глутамин 74 183-185 3.74 с - 2.43 с

(3) 1-[2-'!Н]глутамип 79 186-188 - 2.12м 2.44 м

(4) Х-[а-15М]глутамин 71 184-186 3.79 т 2.17м 2.43 м

(5) 1-[5-'3М]глутамин 80 182-184 3.77 т 2.15 м 2.45 м

(6) ¿-[З-'^глутамин 76 185-187 3.73 м 2.10 м 2.43 м

(7) [4-иС1глутамин 74 183-185 3.75 м 2.11 м 2.40 м

(8) Х-[3,4-"С2]глутамин 71 184-186 3.76 м 2.12м 2.43 м

¿-глутаминовая кислота - 226 [100] 3.94 т 2.06 м 2.50 м

(9) £-(4,4-/!Н2]глутаминовая кислота 75 225-227 3.93 т 2.02 д _

На рис. 2 представлены 'Н-ЯМР-спектры полученных 13С-меченых глутаминов. Из рисунка видно, что в области 3.76 м. д., соответствующей сигналу протона Н2, появляется мультиплет вместо триплета. Это вызвано спин-спиновым взаимодействием этого протона с

изотопом ЬС. Более того, наличие изотопа ,3С в положениях 3 и (или) 4 приводит к расщеплению сигналов геминальных протонов НЗ и Н4 с константой спин-спинового взаимодействия 128 Гц.

3,4-3С2 -Gin

-1-1-1-1-1-1-

4 0 3 5 3 0 2.5 2 0 I 5 м. д

Рнс.2. 'Н-ЯМР-спеюры 13С-меченых глутаминов.

1.2. Синтез 15!Ч-меченых а,а-дналкилированных аминокислот (D-нзовалипа н 2-амнноизобутановой кислоты)

Зервамицин IIB содержит четыре остатка а-аминоизобутановой кислоты в положениях 7, 9, 12, и 14 и остаток изовалина в 4 положении. В связи с этим изотопное

мечение зервамицина по этим остаткам позволяет исследовать антибиотик непосредственно в мембранной фазе, а также определить роль данных аминокислотных остатков в формировании и функционировании ионных каналов.

На сегодняшний день известно множество методов синтеза а,сс-диалкилированных аминокислот. Большинство из них основано на промежуточном получении а-аминонитрилов по методу Штрекера. В настоящей работе с применением этого подхода был разработан способ препаративного получения 151Ч-меченых D-Iva (12) и Aib (13), исходя из соответствующих кетонов, 15ЫН4С1 и цианида натрия.

Синтез £>-[15N]Iva (12) осуществляли в три стадии (схема 3). Па первой стадии был получен 0Д,-[а-15Н]аминоизовалеронитрил (10), исходя из 2-бутанона и водного раствора NaCN и 15NH4C1 в мольном соотношении 2:2:1, с количественным выходом. Далее полученный аминонитрил (10) подвергался мягкому гидролизу с помощью муравьиной кислоты, насыщенной HCl, в присутствии эквимолярного количества воды в течение 1 ч, в результате чего образовывался Д1-[а-13Н^мипоизовалерамид (11).

CONH, "NhW/COOH

¿-специф. аминопептидаза {Mycobacterium neoaurum), Катионообмен. хроматог., гидролиз кони. HCl, 100°С

(10) (II) (12)

Схема 3. Химико-ферментативный синтез

Вторая стадия заключалась в стереоселективном микробиологическом гидролизе амида (11) с помощью клеток Mycobacterium neoaurum АТСС 25795, содержащих L-специфическую аминопептидазу, что приводило к образованию L-изомера меченого Iva, в то время как £)-[а-15К)аминоизовалерамид оставался незатронутым. Поскольку выше упомянутая аминопептидаза имеет коэффициент стереоселективности, равный 19. Расчёты показывают, что для получения оптически чистого .D-амида (свыше 99%) с высоким выходом конверсия исходного рацемата должна превышать 66%. После отделения клеток центрифугированием смесь и Д-[а-15М]аминоизовалерамида была разделена с

помощью катионообменной хроматографии на Амберлите (CG 50). На заключительной стадии оптически чистый Д-амид подвергался гидролизу концентрированной НС1, давая продукт (12) с общим выходом 31%. Стереоселективность метода по данным ВЭЖХ составляла свыше 99.5%.

Получение меченой А1Ь (13) з тех же условиях из ацетона оказалось неудачным из-за низкого выхода продукта (20%) и частичной потери метки (степень обогащения изотопом не превышала 75%) (см. рис. 36). Это обстоятельство нуждалось в объяснении, поскольку в реакции использовался 100% меченый хлорид аммония.

Как известно, реакции Штрекера могут протекать по двум основным направлениям: либо через образование основания Шиффа (схема 4а), либо через образование соответствующего ниангидрина (схема 46).

НСЫ +

15КН

(а)

№СМ

О

Л

к я.

15ща

(б)

но сы к^я.

15?чтНкСМ ^_

* *

Схема 4. Синтез аминонитрилов по методу Штрекера.

Однако, как нетрудно заметить, первый путь не может привести к образованию немеченого продукта реакции. Более того, Таилладес с соавт. показали, что в случае использования ацетона реашзуется преимущественно второй механизм с образованием ацетонциангидрина в качестве промежуточного продукта. Поскольку единственным источником немеченого азота могла служить только цианидная группа цианистого натрия, мы предложили следующий механизм «разбавления» метки с участием этой группы (схема

5).

СН3СОСН3 + КаСМ Н;0 » НО_С(СНз)2_СК + №ОН

Н,0

НО-С(СН3)^СОО

N3* N»1 > т2- С(СН3)2-COONa (13)

Схема 5. Образование А1Ь из ацетона и цианида натрия.

Согласно предложенной нами схеме основным фактором, определяющими возможность протекания реакции по этому пути, является высокое значение рН раствора, при котором становится вероятным щелочной гидролиз нитрильной группы с выделением

11

немеченого аммиака в реакционную среду. Действительно, водный раствор ацетона, цианида натрия и хлорида аммония, взятых в мольном соотношении 2:2:1, имеет рН 13.6. Дальнейшие исследования показали, что критическим значением основности раствора можно считать рН 13. Из сказанного выше также следовало, что подобный эффект «разбавления» метки не должен проявляться при изменении соотношений реагирующих веществ, что полностью подтвердилось в ходе наших дальнейших опытов.

Таким образом, для образования аминокислот по методу Штрекера нет необходимости добавлять соединение аммония (или аммиак) как обязательный компонент таких реакций. Для подтверждения этого вывода мы провели реакцию между ацетоном и цианидом натрия в воде в герметичных условиях в течение 12 ч. После окончания реакции качественный тест показал присутствие аммиака в реакционной среде при рН раствора 13.3. По данным ТСХ в реакционной массе присутствовали вещества, которые были идентифицированы как а-аминоизобутановая кислота и а-аминоизобутиронитрил. Более того, аналитическая ВЭЖХ подтвердила присутствие в реакционной массе а-аминоизобутановой кислоты. После проведения кислотного гидролиза и использования ионообменной хроматографии, нами была выделена А1Ь в чистом виде с выходом 15%.

Тот факт, что ацетон полностью смешивается с водой, в то время как 2-бутанон образовывает вторую фазу в реакционной среде, позволило предположить, что наличие двух фаз является существенным фактором для этой реакции. Действительно, при проведении реакции с ацетоном в присутствии несмешивающегося с водой растворителя мы получали полностью меченый продукт (13) (рис.За). При этом было отмечено, что выход продукта зависит от полярности растворителя, добавляемого в качестве второй фазы. Наилучшие результаты были получены при добавлении дихлорметана. Это привело к получению полностью меченой с выходом 65%.

Синтезированные '^-меченые аминокислоты были охарактеризованы с помощью *Н-ЯМР-спектроскопии (рис. 3 и 4). Наличие ъЫ-метки было доказано с помощью 15М-ЯМР-спектроскопии, а степень обогащения изотопом (>98%) была подтверждена с помощью масс-спектрометрии. Как видно из рис. 3, 4, в области 1.57 м. д. появляется дуплет вместо синглета, что вызвано спин-спиновым взаимодействием протонов а-метильных групп с 15Ы-изотопом Рснз-15Ы 2.8 Гц для Ь-а (12) и 2.6 Гц для АНз (13)).

Анализ спектра соединения (12) (рис. 4) позволяет также отметить наличие двух мультиплетов при 2.00 и 1.90 м. д., соответствующих сигналам протонов метиленовой группы. Более того, константы спин-спинового взаимодействия этих протонов с |5Ы-изотопом отличаются друг от друга и составляют 2.1 и 3.6. Такой характер расщепления

говорит о неэквивалентности этих протонов, что может косвенно свидетельствовать о конформационной жёсткости молекулы Iva.

! î

и

■Ii!

Рис.3. 'Н-ЯМР-спектры [l5N]Aib, полненной в двухфазной (а), однофазной (б) системе растворителей, и немеченой Aib(b).

/H'N]ivj

„«ШИЛА*.

dUliu.

>1

19 la il

15 1 I 1.3 1 1 11

Рис.4. 'Н-ЯМР-спектры немеченого и 15Ы-меченого £>-изовалина. Таким образом, в результате данной работы с использованием современного ферментативного и химико-ферментативного подходов были получены в препаративном

масштабе и охарактеризованы различные меченные стабильными изотопами аминокислоты (Gin, Aib, Iva). [a-15NJGln был нами успешно встроен в молекулу зервамицина ИВ, a 1SN-Aib и l5N-Z)-Iva были использованы Складневым Д. и сотр. для микробиологического синтеза меченого зервамицина.

2. Синтез изотопно меченых зервамнцинов

Изотопно меченые пептаиболы можно получать как микробиологически, так и химически. Однако лишь химический путь синтеза позволяет селективно вводить метку по любому аминокислотному остатку пептидной цепи антибиотика. В связи с этим в нашей работе синтез зервамицина, меченного по остаткам глутамина, был осуществлен химическим путём.

Общая стратегия пептидного синтеза зервамицина была разработана ранее Ал. Огрелем с соавт. Она основывалась на конденсации двух деблокированных фрагментов (1-9) и (10-16). В свою очередь, фрагмент (1-9) синтезировался из тетрапептида (1-4) и частично деблокированного пентапептида (5-9) (схема 6). Такой выбор фрагментов позволяет избежать риска рацемизации при фрагментной конденсации, так как в качестве С-концевых аминокислот используются а,а-диалкилированные аминокислоты (Aib, Iva).

1 4 5

h

(18)

I

I

9 10

(25)

h

Зервамицин IIB

Схема 6. Общая стратегия синтеза зервамицина ИВ.

Для синтеза отдельных фрагментов применялась Ршос-стратегия с максимальной защитой боковых функций Ртос-аминокислот кислотолабильными защитными группами (Т«, Ви1, Вое). В связи с тем, что в молекуле зервамицина содержатся кис лото лабильные связи (А1Ь-Рго и А^Ь-Нур), то применение Вос-стратегии оказалось неприемлемым, так как

14

многократное удаление Вос-группы в кислых условиях приводило бы к разрушению этих связей. Удаление Fmoc-зашиты осуществлялось в основных условиях, а кислотная обработка проводилась лишь на конечной стадии удаления боковых защитных групп с С-концевого фрагмента. Как известно, Fmoc-зашиту снимают с помощью вторичных аминов (пиперидина, диэтиламина). При этом возникает необходимость отделять N-свободный пептид от остатков нуклеофильных аминов, что является достаточно сложной задачей в условиях ступенчатого синтеза в растворе. В связи с этим для удаления Fmoc-группы мы применяли раствор NaOH в системе растворителей диоксан/метанол/вода. В качестве конденсирующего реагента использовался ВОР, а в реакциях с участием Fmoc-Aib-OH применялся ВОР в присутствии DMAP. Все реакции проводились при комнатной температуре в течение 40 мин в присутствии DIPEA в качестве слабого основания.

Для синтеза С-концевого фрагмента зервамицина (10-16) Ал. Огрелем была предложена оригинальная схема, основанная на получении гексапептида (10-15) с последующей конденсации его со свободным Phi. То есть, синтез фрагмента (10-16) начинался с /гс/>ея1-бутилового эфира пролина, получение которого является сложным процессом и проходит с весьма низким выходом при том, что трет-Ъутлоъът эфир пролина используется лишь однажды на данной стадии синтеза зервамицина. Такой выбор схемы был обоснован тем, что связь Pro-Phi является чувствительной к условиям удаления Fmoc-защитной группы раствором 0.1 М NaOH.

При сохранении основной методологии пептидного синтеза в нашей работе мы внесли некоторые изменения в стратегию синтеза отдельных фрагментов, что позволило упростить и удешевить синтез зервамицина IIB.

Фрагмент (1-4) синтезировали, исходя из С-концевого трет-бутшюъого эфира £>-Iva (14) (схема 7). Эфир (14) получали из Z)-Iva с использованием смеси mpem-бутилацетат/треиг-бутанол (1/1) в присутствии серной кислоты с выходом 56%.

На стадии получения дипептида (16+) в качестве карбоксикомпонента вводили Fmoc-[a-,sN]Gln-OH (15*). Здесь следует заметить, что глутамин может вступать в побочные реакции с участием его свободной боковой амидной группы. Среди этих реакций наиболее известна реакция дегидратации амидной группы с образованием нитрила. Блокирование амидной функции глутамина позволяет избежать подобной побочной реакции, но введение защитных групп (например, тритильной) в боковую группу глутамина является долгам и трудоемким процессом и проходит с низкими выходами. Однако ранее было показано, что при конденсации аминокислот с помощью ВОР-реагента амидная группа глутамина не

он н ■ ВОР

.OBu' Fmoc.

ОН II •

о,р» пор

--ов«' (21)

.он н ВОР/ОМАР

ВОР-

.СИ-ОН _П!Д>1!

_сн,он

_ГН,ОН _( Н.ОН _i Н jOH

„сн.он _с н,он

Схема 7. Синтез меченого зервамицина IIB.

а) AcOBu'/Bu'OH/i^SO^ (15/15/2); Ь) 0.04 М NaOH в системе растворителей диоксан/метанол/вода, (30/9/1); с) AC2O/CH2CJ2, (1/10); d) TFA/H2O/TIPS, (90/5/5); е) TFA/CH2CI2, (1/1); 0- 40% DEA в DMF. Звездочками отмечены соединения содержащие а-15К-меченые остатки глутамина. (36*) - зервамицин ИВ, меченный по остатку Gin11, а (37*) -по остатку Gin3.

■. 4

Gin D-ivs

Leu

Aib

Gin

Alb

r/D MAP

подвергается дегидратации. На этом основании в реакциях пептидного синтеза мы вводили меченый Ртос-глутамин с незащищенной боковой амидной функцией. При таком подходе отпала необходимость в введении, а затем удалении защитной группы на конечной стадии, что позволило уменьшить потерю дорогостоящего меченого глутамина и упростить синтез фрагмента (1-4).

Ртос-[а-15Ы]01п-С)Н мы получали из меченого глутамина и Ртос-СЖБи в смеси растворителей вода/ацетонитрил (1/1) в присутствии 'ГЕА при рН 8-9 в течение 30 мин с выходом 97%. Для синтеза зервамицина, меченного по остатку глутамина в 11 положении в качестве карбоксикомпонента использовался, соответственно, Ртос-С1п-ОН (15).

В процессе синтеза фрагмента (1-4) боковая функция Тгр была защищена кислотолабилыюй Вос-группой. Тетрапептиды (19) и (19*) мы получали из М-свободных пептидов (18) и (18*), соответственно, и уксусного ангидрида в тридцатикратном избытке с целью достижения максимального выхода продукта. Реакцию проводили в дихлорметане в присутствии 01РЕА в течение 20 мин при рН 9-10. Выходы продуктов (19) и (19*) составляли 89 и 91%, соответственно. При кислотном деблокировании Тгр-содержащих пептидов с помощью ТРА возможна реакция трет-бутилирования индольного кольца Тгр через карбокатионы, образующиеся в ходе деблокирования. Поэтому удаление кислотолабильных защитных групп с тетрапептидов (19) и (19*) мы осуществляли, используя смеси ТРА/вода/триизопропилсилан (90/5/5), т.к. триизопропилсилан препятствует протеканию данной побочной реакции. Выделение деблокированных тетрапептидов (20) и (20*) осуществляли с помощью гель-фильтрации на сефадексе ЬН-20.

Синтез фрагмента (5-9) мы осуществляли по методике, описанной выше для синтеза фрагмента (1-4), начиная с С-концевого трет-бутлоъото эфира А1Ь (21), синтез которого был осуществлен аналогично синтезу эфира (14). Спиртовая функция Ршос-ТЬг-ОН защищалась треот-бутильной группой (схема 7).

Для получения С-концевого фрагмента зервамицина ПВ (10-16) нами была предложена классическая, упрощённая схема, при которой пептидный синтез начинался с С-концевого РЫ (схема 7). Как известно, в реакциях пептидного синтеза с участием аминокомпонентов со свободной гидроксильной группой существует опасность частичного О-ацилирования при использовании избытков карбоксикомпонентов. Для избежания протекания такой побочной реакции по остатку РЫ мы применяли 20% избыток аминокомпонеита для получения дипептида (29) и эквимолярные количества амино- и карбоксикомпонентов для синтеза остальных пептидов этого фрагмента.

На стадии синтеза дипептида (29) в качестве карбоксикомпонента мы использовали доступный Вос-Рго-ОН. Реакция проходила в течение 40 мин с выходом продукта (29) 92%. Вое группу уд&тяли с помощью 50% ТЕА в дихлорметане в течение 20 мин.

Поскольку фрагмент (10-16) зервамицина ПВ содержит две кислотолабильные связи (АШ-Рго и А1Ь-Нур), использование Вос-аминокислот для наращивания пептидной цепи было неприемлемо по причинам, упомянутым ранее. Поэтому в дальнейшем мы применяли Ртос-стратегию.

При синтезе трипептида (30) и пентапептида (32) с участием в качестве карбоксикомпонента стерически затруднённой Ртос-АЛ-ОН, применение стандартной методики, в которой все реагирующие вещества вводятся в реакционную массу одновременно, приводило к получению продуктов (30) и (32) с очень низкими выходами. Поэтому для достижения более высоких выходов мы осуществляли предактивацию Ртос-А1Ь-ОН с помощью ВОРЛЭМАР в течение 10 мин. После чего добавляли эквимолярное количество аминокомпонента и проводили реакцию в течение 30 мин. Немаловажным условием для достижения максимальных выходов является использование тщательно очищенных БМР и 01РЕА, которые могут содержать вторичные амины. В целом, разработанный нами подход позволил в максимальной степени ограничить протекание возможных побочных реакций и получить соединения (30) и (32) с выходами 80 и 72%, соответственно.

Ранее указывалось на неустойчивость связи Рго-РЫ в условиях удаления Ртос-группы с помощью раствора 0.1 М ЫаОН. Однако нами было показано, что разрушение связи Рго-РЫ можно избежать, используя для удаления Ртос-группы 0.04 М раствор ЫаОН в системе растворителей диоксан/метанол/вода (30/9/1). Такая система применялась нами для удаления Ртос-группы в процессе синтеза данного фрагмента. В ходе получения фрагмента (10-16) гидроксильная группа К-защищённого остатка Нур была блокирована трет-бутильной защитной группой. Соединения (31) и (34) были получены с выходами 85 и 71%, соответственно. При выделении чистых гептапептидов (34) и (34*) после применения адсорбционной колоночной хроматографии на силикагеле 60А нами также использовалась гель-фильтрация на сефадексе Ш-20.

На стадии получения гексапептидов (33*) и (33) в качестве карбоксикомпонета использовался Рт0с-[а-"М]-О1п-ОН (15*) при синтезе зервамицина, меченного в 11 положении, и Ршос-ОЬ-ОН (15) для синтеза зервамицина, меченного по остатку 01п в 3 положении.

Удаление трет-Ъутлътй защитной группы в остатках Нур осуществляли с помощь 50% ТРА в СНгСЬ- При этом по данным ТСХ было установлено, что полное удаление

кислотолабильных групп проходит в течение 20 мин при комнатной температуре без заметного разрушения связей Aib-Pro и Aib-IIyp. Из-за плохой растворимости частично деблокированного гептапептида в растворе 0.04М NaOH в смеси растворителей диоксан/метанол/вода (30/9/1), Fmoc- группу с N- конца удаляли с помощью 40% DEA в DMF в течение 20 мин. Следует отметить, что удаление трет-бутильных и Fmoc- защитных групп проводили последовательно без промежуточной очистки, в результате чего полиостью деблокированные гептапептиды (35) и (35*) были получены с выходами 71 и 75%, соответственно.

Применение классической схемы синтеза С-концевого фрагмента в значительной степени упростило синтез, а именно, отпала необходимость в наличии дорогостоящего трет-бутилового эфира пролина, а также в дополнительной очистке на сефадексе деблокированного гексапептида (10-15) перед его конденсацией с Phi. Более того, заключительная стадия удаления защитных групп (ггсре/я-бутильной и Fmoc-группы) одна за другой без промежуточной очистки позволило уменьшить потерю конечного продукта. При этом было показано, что гидроксильная группа Phi не нуждается в дополнительной защите.

Наиболее сложным этапом в синтезе зервамицина ИВ является конденсация фрагментов. Конденсация N-ацетилированного фрагмента (1-4) с mpem-бутиловым эфиром пентапептида (5-9), а также N-ацетилированного нонапетида со свободным гептапептидом с помощью системы BOP/DMAP, а также DCC оказалась неудачной. Для этой цели мы использовали конденсирующий реагент CF3PyBOP, который, как известно, успешно используется для связывания остатков Aib со стерически затрудненными N-алкилированными аминокислотами в растворе. Этот реагент был получен из РуВгор и CF3HOBT в смеси растворителей дихлорметан/ацетон (1/1) с выходом 85%. Используя этот реагент, нонапептиды (27) и (27*) были получены из фрагментов (1-4) и (5-9) с выходами 48 и 50%, соответственно, а меченые зервамицины IIB (36*) и (37*) были получены из деблокированных нонапепгидов (1-9) и гептапептидов (10-16) с выходом 30%. Реакции фрагментной конденсации проводили в DMF в присутствии DIPEA в теченне 24-48 часов при рН 9-10. Выделение нонапептидов, а также меченых зервамицинов осуществляли с помощью препаративной ВЭЖХ.

Гомогенность синтезированных пептидов была показана с помощью ВЭЖХ. Структура синтезированных промежуточных пептидов была подтверждена с помощью |3С-Я.МР-спектроскопии. Структура синтезированных зервамицинов (36*) и (37*) была доказана данными масс-спектрометрии и 'Н-ЯМР-спектроскопии. Наличие изотопа lfN было продемонстрирована с помощью ''К-ЯМР спектроскопии. Степень обогащения |5Ы-изотопом (98+2%) была определена с помощью FAB-масс спектрометрии.

3. Изучение 15М-меченого зервамицина IIB с помощью ЯМР-спектроскопии

На Рис. 5 представлены 'Н-ЯМР-спектры природного (а) и синтезированного нами (б) зервамицинов IIB. Из рисунка легко заметить, что 'Н-резонансные сигналы в спектрах этих двух соединений с довольно высокой точностью совпадают. Различие в положении и интенсивности некоторых сигналов, соответствующих амидным и гидроксильным протонам, может быть обусловлено концентрационными эффектами или наличием различных количеств воды в образцах.

JMILLJAW

UP

Рис.5. 'Н-ЯМР спектры природного (а) и [а-'5М]01п"-меченого (б) зервамицинов НВ, зарегистрированные при частоте 600 МГц при температуре 4°С в дейтеродиметилсульфоксиде.

Стратегия соотнесения сигналов спектра Н-ЯМР синтезированного нами [[а-]зервамицина IIB базируется на применении корреляционной двумерной спектроскопии (COSY и NOESY), в которой химические сдвиги одних ядер определяются путём их корреляции с химическими сдвигами других на основании взаимодействия между ними. При проведении экспериментов COSY корреляция осуществляется между ядрами за счёт спин-спинового взаимодействия между ними через химические связи. В случае NOESY регистрируется сигналы, проявляющиеся в результате взаимодействия между ядрами через пространство (ядерного эффекта Оверхаузера).

Поскольку из литературы известно, что амидный протон остатка Тгр1 имеет сигнат при 8.08 м. д., мы имеем опорную точку для отслеживания NH; -ЫН,+1-взаимодействий, в

молекуле синтезированного зервамицина. На растянутом регионе спектра NOESY (рис. 6) проиллюстрирована схема отслеживания NHi -"ЫН,+,-взаимодействий, стартующая от сигнала NH остатка Тгр1. Наличие единственного кросс-пика между NH сигналами Тгр'и Ile2 позволяет определить сигнал Не2 при 7.92 м.д. Продолжение отслеживания кросс-пиков по указанной схеме приводит к соотнесению сигналов амидных протонов остатков Gin3, Iva4, Ile5, Thr6, Aib7'9 и Leu8.

NH-Trp1

1 AJli Л AI

VJ_Àj

.üliiL

JUL

q

• > I 0

1 i / i л

i jjy* 9 V

t 1 ; ,о « 0 ÇfW • I G

• là f»* ' . • ( с > 1

9

рра 8.5 8.0 7.5

Рис. 6. Слабопольная область КОЕЗУ-спектра [[а-15М]01п"]зервамицина ПВ, зарегистрированного при частоте 600 МГц при температуре 4°С в дейгеродиметилсульфоксиде

Из-за отсутствия в остатках Hyp и Pro амидного протона для продолжения соотнесения NH-сигналов мы воспользовались сигналами протонов в 5-положении Нур1С, которые определяются по их взаимодействию с NH-протоном Aib9 при 3.61 и 4.05 м. д. (двз кросс-пика показаны на рис. 7). Далее сигнал NH-протона Gin" при 8.26 м. д определяется по кросс-пикам между ним и 5-протонами остатка Hyp10 (рис. 6), а сигнал NH-протона Aib12 определяется по его взаимодействию с амиднным протоном остатка Gin". Аналогичным

образом были соотнесены сигналы амидных протонов Aib14 и Phi16, а также 5-протонов Hyp13 и Pro15.

После соотнесения сигналов, соответствующих NH-протонам Тгр1, Ilc2,s, Gln3'",Thr6, Leu8 и Phi16, а также 5-протонам Hyp 10,13 и Pro15,становится возможным соотнесение сигналов остальных протонов этих аминокислотных остатков по их спин-спиновым взаимодействиям, которые определяются по двумерному спектру (COSY).

Сигналы при 7.46, 6.45, 6.92 и 6.30 м. д. были однозначно соотнесены с протонами боковых амидных групп остатков глутамина. Это обусловлено расширением этих сигналов при повышении температуры. Более того, из литературы известно, что протоны Gin3 и Gin", находящиеся в трале-положении к карбонилу, имеют резонансные частоты 7.46 и 6.92, а уыопротоны - 6.46 и 6.30 м. д., соответственно.

Результаты полной расшифровки спектра синтезированного зервамицина представлены в табл. 2.

Таким образом, с помощью 'Н-ЯМР-спектроскопии нам удалось доказать идентичность синтезированного нами меченого зервамицина природному, а с помощью экспериментов COSY и NOESY провести соотнесение сигналов спектра 'Н-ЯМР синтезированного нами антибиотика.

Таблица 2. Результаты соотнесения сигналов спектра 'Н-ЯМР [[а-1 sN]Gln'' 1зервамицина IIB.__

Остаток Протон Химические сдвиги, м. д..

Ас СН3 2.03

Тгр' nh 8.08

nhvihtonbhuif. 10.60

C°H 4.31

СрН2 3.20

СНаром 2' 7.25

4' 7.50

5' 7.02

6' 7.11

Т 7.38

Не2 n11 7.92

СаН 3.81

СрН 1.75

С'Н2 1.40, 1.07

С'Нз 0.84

СЕН3 0.83

Gin3 nh 8.45

СаН 3.85

chh 2.04,2.85

сгн2 2.42

neh2 транс 7.46, цис 6.45

Iva4 nh 8.02

CßH, 2.22, 2.01

CßH3 1.44

СНз 0.75

Не5 nh 7.81

с°н 3.78

срн 1.90

CrH2 1.34, 0.96

стн3 0.84

С6Нз 0.81

Thr6 nh 7.71

СаН 3.72

С8Н 4.21

cßoh 4.72

cvh3 1.18

Aib7 nh 7.57

2хСрНз 1.51, 1.43

Leu8 nh 7.33

С°Н 4.15

срн2 1.82, 1.55

сун 0.84

2хС5Н3 1.79, 1.65

Aib9 n11 8.10

2хСрН3 1.62, 1.51

НуР1Ь сан 4.62

СРН2 2.35,1.84

СТН 4.41

СОН 5.00

01п" СёН2 4.05,3.61

ИН 8.26

с°н 4.39

СрН2 2.30,2.11

сгн2 2.35

№Н2 транс 6.92, цис 6.30

АШ12 N11 7.87

2хСрН3 1.61, 1.50

Нур" СаН 4.65

СрН2 2.32, 1.74

СГН 4.35

СтОН 4.99

С5Н: 3.82,3.50

АШ14 N11 8.13

2хСеН3 1.48,1.37

о_ СаН 4.32

срн2 2.08, 1.49

сун2 1.80, 1.74

с5н2 3.91,3.65

РЫ!6 N11 7.39

ссн 4.03

с3н2 2.84

с3н2он 3.61,3.52

срон 4.20

СНаром. 4' 2'.3'.5\6' 7.14 7.3.-7.23

Положение 15М-метки можно определить при сравнении области ЫН-сигналов (6.0-8.5 м.д.) природного и меченого зервамицинов НВ. Как видно из рис. 8, на месте дублета в области 8.20 м.д., соответствующей сигналу протона а-№1-01п" природного зервамицина (а), появляется новый сигнал этого протона (дублет дублетов) в области 8.26 м.д., что и следовало ожидать в результате дополнительного расщепления этого протона от 15М-изотопа.

1

и

u_

TS 7 С 65

Рис. 8. Область NH-сигналов Н-ЯМР спектра природного (а) и [a-bN]Gln"-Me4eiioro (б) зервамицинов IIB.

Выводы

1. Разработаны условия для ферментативного синтеза изотопно меченых глутаминов с помощью глутаминсинтетазы, исходя из соответствующих меченых глутаминовых кислот. Синтезированы с выходами от 70 до 80% и охарактеризованы с помощью ЯМР-спектроскопии 15N-, 2Н- и 13С-меченые глутамины.

2. Изучена реакция получения а,а-диалкилированных аминокислот по методу Штрекера. Синтезированы '^-меченые Aib и D-Iva с общими выходами 65 и 31%, соответственно.

3. Разработана новая упрощенная схема синтеза антибиотика зервамицина IIB. Синтезированы зервамицины IIB, содержащие а-15М-меченый остаток глутамипа в положениях 3 или 11 пептидной цепи.

4. Структура синтезированных зервамицинов была доказана с помощью масс-спектрометрии и 'Н-ЯМР-спектроскопии. Проведено полное соотнесение сигналов 'Н-ЯМР-спектра [a-15N]Gln11-Nfe4enoro зервамицина с помощью двумерной корреляционной ЯМР-спектроскопии (COSY и NOESY).

Основные результаты работы были изложены в следующих публикациях: 1. Швец В. И., Раап Я., Огрель А. А., Римави В. X. Полный химический синтез изотопно меченого пентаибола - антибиотика зервамицина IIB. // Учёные записки МИТХТ. -1999. -Вып. 1. -С. 45-52.

2. Огрель А. А., Рпмави В. X., Швец В. И., Раал Я. Модификация реакции Штрекера на примере синтеза а-аминоизобутановой кислоты. // ЖОРХ,- 2000. -Т. 36. -Вып. 8. -С. 12591261.

3. Римави В. X., Огрель А. А., Раап Я., Швец В. И. Введение изотопных меток в молекулу зервамицина IIB с целью изучения механизма его антибактериального действия. // Тезисы докладов 4-ой Всероссийской (международной) научной конференции "Физико-химические процессы при селекции атомов и молекул". -Звенигород.. -1999. -С. 75.

4. Римави В. X., Огрель А. А., Раап Я., Швец В. И. Синтез стабильно изотопно-меченых аминокислот для их включения в молекулу зервамицина IIB. // Тезисы докладов школы-конференции "Горизонты физико-химической биологии". -Пущино. -2000. -С. 101.

5. Римави В. X., Огрель Ан. А., Раап Я., Швец В. И. .Химический синтез '^-меченых зервамицинов 11В. // Биоорган, химия. -2000. -Т. 26. -№ 11. -С. 808-816 (принята к печати 13.07.2000).

6. Огрель А. А., Римави В. X., Швец В. И., Раап Я. Синтез изотопно меченых аминокислот, входящих в состав антибиотика зервамицина IIB. // ЖОРХ. -2000 (в печати).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР "ПЕПТАИБОЛЫ"

2.1. Общая характеристика пептаиболов

2.2. Выделение пептаиболов из культур продуцентов и определение их аминокислотных последовательностей

2.3. Методы получения модифицированных пептаиболов

2.3.1. Микробиологическое получение пептаиболов

2.3.2. Химический синтез пептаиболов

2.3.3. Химико-ферментативный способ получения пептаиболов

2.4. Вторичная структура пептаиболов и образование их молекулами ионных каналов в мембранах бактерий

2.5. Роль некоторых аминокислотных остатков в функционировании пептаиболов

2.6. Зервамицины

2.6.1. Гипотезы о моделях ионных каналов, образуемых молекулами зервамицина IIB

2.6.2. Методы получения изотопно меченых зервамицинов

2.6.2.1. Микробиологический синтез меченых зервамицинов

2.6.2.2. Химический синтез меченых зервамицинов

3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Синтез меченных стабильными изотопами аминокислот, входящих в состав зервамицина IIB

3.1.1. Синтез изотопно меченых глутаминов.

3.1.2. Синтез 15Ы-меченых а,а-диалкилированных аминокислот (/)-изовалина и 2-аминоизобутановой кислоты)

3.2. Синтез изотопно меченых зервамицинов

3.3. Изучение 1 ^-меченого зервамидина IIB с помощью ЯМР-спектроскопии

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1. Синтез меченных стабильными изотопами аминокислот, входящих в состав зервамидина IIB

4.2. Синтез изотопно меченых зервамицинов

5. ВЫВОДЫ

Актуальность работы. В настоящее время известно огромное количество антибиотиков различного происхождения и строения. Однако поиск новых антибиотиков и изучение механизмов их действия до сих пор остается актуальной задачей. Это связано с тем, что ко многим из них вырабатывается резистентность и требуется их замена на новые, более эффективные. Кроме того, ряд заболеваний по-прежнему не поддается эффективному лечению известными антибиотиками. На основе знаний механизмов действия антибиотиков химикам удается создавать синтетические и полусинтетические производные природных веществ, обладающие более совершенными фармакологическими свойствами.

Одним из основных классов антибиотиков являются пептидные антибиотики. Это очень большая и разнородная группа природных пептидов, различающихся характером строения пептидной цепи (линейные и циклические), наличием аминокислот сложного и необычного строения и специфических непептидных фрагментов. Пептидные антибиотики также различают по механизму антибактериального действия.

К линейным каналообразующим пептидным антибиотикам относится большая группа линейных пептидных антибиотиков, называемых пептаиболами. Они содержат от 12 до 24 аминокислотных остатков. Для них характерно наличие в пептидной последовательности остатков небелковых а,а-диалкилированных аминокислот, в частности, а-аминоизомасляной кислоты (Aib) и изовалина (Iva), и N-концевого аминоспирта. В связи с этими структурными особенностями они и получили название "пептаиболы" (от английского слова "peptaibols", где aib - от "Aib" и -ol от "alcohol"). Пептаиболы продуцируются в основном микроскопическими грибами различных видов, штаммов и мутантов рода Trichoderma, Hypocrea, Emericellopsis и др. Пептаиболы способны образовывать потенциалзависимые каналы в цитоплазматических мембранах бактерий, что приводит к нарушению электрохимического баланса мембраны и, как следствие этого, вызывает гибель клетки.

Одним из наиболее изученных представителей пептаиболов является зервамицин IIB. Он представляет собой 16-членный антибиотик, выделяемый из культуры клеток Emericellopsis salmosynnemata, эффективный как против грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, но безопасный для эукариотических клеток. В связи с этим он привлекает внимание исследователей как потенциальный лекарственный препарат.

Ac Trp1 lie Gin D-Iva He Thr6 Aib Leu Aib Hyp Gin11 Aib Hyp Aib Pro Phi16

Структура зервамицина ИВ

Зервамицин IIB, как и все пептаиболы, образует в мембранах бактерий потенциалзависимые ионные каналы. Однако механизм действия этих каналов до конца ещё не ясен. Для конструирования новых аналогов антибиотика, обладающих улучшенными свойствами (растворимость, устойчивость и т.д), необходимым является выяснение механизма его антибактериального действия, а также определение структурно-функциональных отношений в его молекуле. Согласно существующим на сегодняшний день моделям каналы формируются из агрегатов молекул антибиотика,

11 13 стабилизированных водородными связями между остатками Gin и Hyp . Однако эти модели, основанные на кристаллической структуре антибиотика и на эмпирических молекулярных расчетах, не дают полных ответов на все вопросы, связанные с функционированием ионных каналов зервамицина ИВ. Исключительно ценную информацию на этот счёт можно получить, исследуя меченные стабильными изотопами образцы антибиотика в фосфолипидных бислоях с помощью изотопно-чувствительной техники, в частности, ЯМР-спектроскопии.

В связи с этим представлялось весьма актуальным синтезировать зервамицин IIB, содержащий стабильные изотопные метки в различных положениях пептидной цепи с целью изучения его структуры с помощью ЯМР-спектроскопии.

Представленная работа является частью исследований, проводимых в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова на кафедре биотехнологии по теме № 1Б-22-866 "Разработка методов получения природных и синтетических амфифильных веществ и их использование как компонентов лекарственных средств и инструментов моделирования мембранных биологических процессов", в рамках гранта Минобразования РФ № 1М-131-В66 по программе "Фундаментальные исследования в области химических технологий" по теме "Разработка биохимических методов получения стабильно меченых биологически активных веществ и использование их в исследовании функционирования биологических мембран", а также при участии Лейденского университета (Нидерланды) в рамках проекта Нидерландской 6 организации научных исследований (NWO)№ 047.006.009.

Цель работы. Синтез 15N-, 13С- и 2Н-меченых глутаминов, 15М-£>-изовалина и 15N-2-аминоизобутановой кислоты, а также полный химический синтез меченных стабильными изотопами зервамицинов IIB с целью исследования структуры зервамидина IIB с помощью ЯМР-спектроскопии.

Научная новизна и практическая ценность работы Разработаны подходы к препаративному синтезу изотопно меченых аминокислот, входящих в состав пептаибольного антибиотика зервамидина IIB. Синтезированы глутамины, содержащие 15N-, 13С- и 2Н- изотопные метки из соответствующих глутаминовых кислот с помощью фермента глутаминсинтетазы с выходами 70-80%. Получены |5Ы-изовалин и 15N-2-аминоизобутановая кислота с выходами 65% и 31%, соответственно.

Впервые получены 3- и 4- С-глутамины. При анализе спектров 'Н-ЯМР Немеченых глутаминов показано, что наличие 13С-изотопа в 3 и 4 положениях Gin приводит к расщеплению сигналов протонов в соответствующих положениях с константой спин-спинового взаимодействия, равной 128 Гц.

Изучен применительно к а-[15Н]аминоизобутановой кислоте метод получения а,а-диалкилированных аминокислот по Штрекеру. Показано, что при синтезе аминокислот, исходя из смешивающихся с водой кетонов, существенным фактором является наличие органической фазы. Выявлен необычный путь получения аминокислот из кетонов и производных синильной кислоты без добавления соединений аммония.

Оптимизирован трехстадийный метод синтеза 1)-[15]\Г]изовалина исходя из 2-бутанона через получение промежуточного ДХ-аминоизовалерамида с последующим стереоселективным микробиологическим гидролизом с помощью клеток Mycobacterium neoaurum АТСС 25795, содержащих X-специфическую амидазу.

Синтезированы зервамицины IIB, содержащие 15N-MeTKy в а-положении остатков Gin в 3 и 11 положениях пептидной цепи антибиотика по оригинальной схеме. При этом показано, что в пептидном синтезе с использованием ВОР в качестве активирующего реагента боковая амидная функция Gin не нуждается в защите. Разработана методология для синтеза С-концевого фрагмента зервамидина IIB, исходя из фенилаланинола со свободной спиртовой функцией. Отработаны условия удаления Fmoc-группы с помощью раствора NaOH в смеси растворителей диоксан/метанол/вода, при которых не происходит разрушение связи Pro-Phi.

Проведено полное соотнесение сигналов 'Н-ЯМР-спектра синтезированного зервамидина, меченного по остатку Gin", с помощью двумерной корреляционной ЯМР-спектроскопии (COSY и NOESY), в результате чего было показано влияние 15Ы-метки на вид сигнала, соответствующего 15]ЧН-протону остатка Gin 11.

В рамках проекта Нидерландской организации научных исследований (NWO) синтезированные 151Ч-изовалин и а-[|51Ч]аминоизобутановая кислота были использованы в ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов Складневым Д. А. для микробиологического синтеза меченного зервамицина С использованием полученных меченых зервамицинов проводятся исследования с целью изучения их каналообразующих свойств.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1) Синтез 15N", 13С- и 2Н-меченых глутаминов из соответствующих глутаминовых кислот с помощью фермента глутаминсинтетазы.

2) Синтез а-[15"кг]аминоизобутановой кислоты и £)-[151Ч]изовалина с использованием химико-ферментативного подхода.

3) Синтез меченных стабильными изотопами зервамицинов IIB по усовершенствованной схеме.

4) Изучение синтезированного меченого зервамицина IIB с помощью двумерной корреляционной ЯМР-спектроскопии.

5. ВЫВОДЫ

1. Разработаны условия для ферментативного синтеза изотопно меченых глутаминов с помощью глутаминсинтетазы, исходя из соответствующих меченых глутаминовых кислот. Синтезированы с выходами от 70 до 80% и охарактеризованы с помощью ЯМР-спектроскопии I5N-, 2Н- и 13С-меченые глутамины.

2. Изучена реакция получения сс,а-диалкилированных аминокислот по методу Штрекера. Синтезированы 1 ^-меченые Aib и /)-Iva с общими выходами 65 и 31%, соответственно.

3. Разработана новая упрощенная схема синтеза антибиотика зервамицина IIB. Синтезированы зервамицины IIB, содержащие а-15]\Г-меченый остаток глутамина в положениях 3 или 11 пептидной цепи.

4. Структура синтезированных зервамицинов была доказана с помощью масс-спектрометрии и 'Н-ЯМР-слектроскопии. Проведено полное соотнесение сигналов 'Н-ЯМР-спектра [a-I5N] Gin11-меченого зервамицина с помощью двумерной корреляционной ЯМР-спектроскопии (COSY и NOESY).

1. Lipmann F, Gevers W, Kleinkauf H, Roskoski R. // Polypeptide synthesis on protein templates: the enzymatic synthesis of gramicidin S and tyrocidine. // Adv. Enzymol. Relat. Areas. Mol. Biol., 1971;V. 35, Pl-34.

2. Kubesch P., Boggs J., Luciano L., Maass G., Tummler B. // Interaction of Polymyxin В nonapeptide with anionic phospholipids. // Biochemistry, 1989, V. 26, P. 2139-2149.

3. Lipmann F. // Bacterial biosynthesis of peptide antibiotics gramicidin S and tyrocidins. // Accountchem. Res., 1978, V. 6, P. 361-365.

4. Reisenger P. , Seidal H. // Structure and mechanism of action of Nizin antibiotic from Streptococcus lactic. // Arch. Microbiol., V. 127, P. 187-193.

5. Kondo S., Shibahara S., Takahachi S. // Novel linear peptide antibiotics, structural analysis and activity. // J. Amer. Chem. Soc., 1977, P. 6305-6312.

6. Gursky G. Y., Zasedatelev A. S., Zhure A. L. // DNA- dependent RNA synthesis inhibitor-Antibiotic tripeptide netropsin. // Cold spring Harbor Sympos on Qualitative Biol., 1983, P. 367-375.

7. Shoji J., Kato T. // Cerexin peptide antibiotics isolated from Bacillus cereus, structural analysis. // J. Antibiot., 1979, V. 32, P. 313-316.

8. Penco S., Redaelli S., Arcamone F. // Dystamicin a novel peptide showing antibacterial action, a linear peptide antibiotic with modified C- and N-terminus. // Gazz Chem. Ital., 1974, V. 97, P. 1110-1116.

9. Bodanszky M., Sigler G. F., Bodanszky A. // Structural elucidation of amfomicin, peptide antibiotic from streptomyces Canus. // J. Amer. Chem. Soc., 1976, V. 95, P. 2352-2358.

10. Allen J. G., Hughes J., Rocmer G. // Peptide antibiotic from Basius licheniformis, mechanism of antibacterial action. // Nature, 1978, V. 56 ,P. 272-280.

11. Kempf C., Klausner R. D., Weinstein J. N., Van Renswonde J., Pincus M., Blumenthal J. // Voltage-dependent trans-layer orientation of melittin. // J. Biol. Chem., 1982, V. 257, P. 24692474.

12. Овчинников Ю. А. Биоорганическая химия. M.: Просвещение. 1987.

13. Zidovetzki R, Banerjee U, Harrington D. W, Chan S. I. // NMR study of the interactions of polymyxin B, gramicidin S, and valinomycin with dimyristoyllecithin bilayers. // Biochemistry, 1988, V. 27, P. 5686-5692.

14. Kim K. S., Vercauteren D. P., Welti M., Chin S., Clementi E. // Interaction of K+ ion with the solvated gramicidin A transmembrane channel // Biophys. J., 1985, V. 47, P. 327-335.

15. Jung G., Bruckner H., Smitt H. // Structure and activity of natural peptides // Eds. Voelter W.,1. Weitzel G., Berlin, 1981.

16. Katz E., Aydin M., Lucht N., Konig W., Jung G. // The C-terminal heptapeptides of suzukacillin and alamethiein sequence, conformation and synthesis. // Leibigs Ann. Chem., 1985, P. 365-372.

17. Jung G., Konig W., Leibfritz D., Katz E., Aydin M. // Isolation of Suzukacillin Antibiotic from Trichoderma viride // Biochem. Biophys. Acta., 1976, V. 433, P. 164-181.

18. Katz E., Aydin M., Lucht N., Konig W. Jung G. // Sequence and conformation of suzukacillin A//leibigs Ann. Chem., 1985, P. 1041-1062.

19. Pandey R., Carrer Cook J., Rinehart K. // Alamethiein I, channel forming peptide antibiotic .// J. Am. Chem. Soc. ,1977,V. 99, P. 8469-8483.

20. Ginis B. F., Davis D. G., Borowska Z. K., Hall J. E., Kobayashi S. // Synthesis of major component of alamethiein // J. Am. Chem. Soc., 1981, V. 103, P. 6373-6377.

21. Pandey R. C., Cook J. C., Renihart K. L. // High resolution and field desorption mass spectrometry studies and revised structures of alamethicins I and II. // J. Am. Chem. Soc., 1977, V. 99, P. 8469-8480.

22. Davis D. G., Ginis B. F. // 600 MHz proton magnetic resonance studies of natural and synthetic alamethiein // FEPS Letters, 1981, V. 133, P. 247-260.

23. Balasubramanian Т. M., Kendrick N. C. E„ Taylor M., Marshal G. R., Hall J.E.Yodyanoy I., Resser F. // Synthesis and characterization of the major component of alamethiein. // J. Am. Chem. Soc., 1981, V. 103, P. 6127-6132.

24. Argoudelis A. D., Dietz A., Jhonson L. E. // Zervamicins I and II, polypeptide antibiotics produced by Emericellopsis salmosynnemata. // The Journal of Antibiotics, 1974, V. 27(5), P. 321-327.

25. Krishna K., Sukumar M., Balaram P.// Structural chemistry and membrane modifying activity of the fungal polypeptides zervamicins, antiamoebins and efrapeptins. // Pure Appl. Chem., 1990, V. 62, P. 1417-1420.

26. Argoudelis A. D., Jhonson L. E. // Emerimicins II, III and IV, antibiotics produced by Emericellopsis microsporain in media supplemented with /ram'-4-n-propyl-l-proline. // The Journal of Antibiotics, 1974, V. 27(4), P. 274-277.

27. Das M. K., Raghothama S., Balaram P. // Membrane channel forming polypeptides. Molecular conformation and mitochondrial uncoupling activity of antiamoebin, an a-aminoisobutyric acid containing peptide. // Biochemistry, 1986, V. 25, P. 7110-7117.

28. Jaworski A., Brucker H. // New sequences and new fungal producers of peptaibol antibiotics antiamoebins// J. Pept. Sci., V. 6, P. 149-167.

29. Brucker H. // Chemical synthesis of trichotoxin A, membrane active polypeptide mycotoxin. //

30. Peptides, 1986, P. 230-235.

31. El Hajji M., Rebuffat S., Lecommandeur D., Bodo B. // Isolation and sequence determination of trichorzianines A antifungal peptides from trichoderma harzianum. II Int. J. Protein. Res., 1987, Y. 29(2), P. 207-215.

32. Rebuffat S., Bodo B. // Tricholongins I and II: isolation and amino acid sequence determination. // Peptides, 1988, P. 351-358.

33. Rebuffat S., Prigent Y., Auvin-Guette C., Bodo B. // Tricholongins BI and BII, 19-residue peptaibols from Trichoderma longibarachiatum. Solution structure from two-dimensional NMR spectroscopy.//Eur. J. Biochem., 1991, Y. 201(3), P. 661-674.

34. Auvin-Guette C., Rebuffat S., Prigent Y., Bodo B. // Trichogins A IV, an 11-residue lipopeptaibol from Trichoderma longibrachiatum. // J. Am. Chem. Soc., 1992, V. 114, P. 2170-2174.

35. Wada S., Iida A., Akimoto N., Kanai M., Toyama N., Fujita T. // Structural elucidation of channel-forming peptides, trichorovins, I—XIV from Trichoderma viride. // Chem. Pharm. Bull., 1995, V. 43 (6), P. 910-915.

36. Grigoriev P., Schlegel R., Dornberger K., Grafe U. // Formation of membrane channels by chrysospermins Ia-d, new peptaibol antibiotics. // Biochem. Biophys. Acta., 1995, V. 1237(1), P. 1-5.

37. Anders R., Wenschuh H., Soskis V., Fischer-Fruhhols S., Ohlenschlager O., Dornberger K., Brown L. R. // A solution NMR study of the selectively 13C, 15N-labeled peptaibol chrysospermin С in methanol. // J. Pept. Res., 1998, V. 52(1), P. 34-44.

38. Hulsmann H., HeinseS., RitzauM., Schlegel R., Grafe U. // Isolation and structure of peptaibol , a new peptaibol from sepedonium strains. // Journal of antibiotics, 1998, V. 51(11), P. 10551058.

39. Leclerc G., Rebuffat S., Bodo B. // Directed biosynthesis of peptaibol antibiotics in two trichoderma strains. II. Structure and elucidation. // J. Antibiotic (Tokyo), 1998, V. 51(2), P. 178-183.

40. Goulard C., Hlimi S., Rebuffat S., Bodo B. // Trichorzins HA and MA, antibiotic peptides from trichoderma harzianum. I. Fermentation, isolation and biological properties. // The Journal of antibiotics, 1995,48(11), 1248-1253.

41. Duval D., Ridell F. G., Rebuffat S., Platzer N., Bodo B. // Ionophoric activity of the peptaibol trichorzin PA IV: a 23Na- and 35C1-NMR study. // Biochem. Biophys. Acta., 1998, V. 1372(2), P. 370-378.

42. Chikanishi Т., Hasumi K., Karada Т., Kawasaki N., Endo А. П Clonostachin: a novel peptaibol that inhibits platelet aggregation. // The Journal of Antibiotics, 1197, V. 50(2), P. 105-110.

43. Rebuffat S., Conraux L., Massias M., Auvin-Guette C., Bodo B. // Sequence and solution conformation of the 20-residue peptaibols, saturnisporins SA II and SA IV. // Int. J. Pept. Protein Res., 1993, V. 41(1), P. 74-84.

44. Lee S. J., Yeo W. H., Yun B. S., Yoo I. D. // Isolation and sequence of new peptaibol, boletusin, from Boletus spp. //Journal of Peptide Science, 1999, V. 5(8), P. 374-378.

45. Leclerc G., Rebuffat S., Bodo B. // Directed biosynthesis of peptaibol antibiotics in two trichoderma strains I. Fermentation and isolation. // J. Antibiotic (Tokyo), 1998, V. 51(2), P. 170-177.

46. Castro В., Dormoy J.-R., Evin G., Selve C. // Synthesis and application of BOP: a rabid acting coupling reagent for one-stage peptide condensation. // Tetrahedron letters, 1975, V. 15, P. 1219-1223.

47. Frerot E., Coste J., Pantaloni A., Dufour M.-N., Jouin P. // PyBOP and PyBrop: Two reagents for the difficult coupling of the a,a-dialkyl amino acid, Aib. // Tetrahedron, V. 47(2), P. 259270.

48. Ogrel A., Bloemhoff W., Lugtenburg J., Raap J. // Synthesis of the isotopically labelled C-terminal fragment of zervamicin: Approach to the synthesis of Aib-containing peptides. // Liebigs Ann. Chem., 1997, V. 12, P.41-47.

49. Ogrel A., Bloemhoff W., Lugtenburg J., Raap J. // Total synthesis of zervamicin IIB and its deuterium-labelled analogues. //J. Pept. Sci., 1997, V. 3(3), P. 193-208.

50. Akaji K., Tamai Y., Kiso Y. // Efficient synthesis of peptaibol using a chloroimidazolidium coupling reagent, CIP. .// Tetrahedron, 1997, V. 53, P. 567-584.

51. Altherr W., Heimgartner H. // Synthesis of segments of the peptaibol trichotoxin A-50 (G). // Peptides, 1990, P. 107-113.

52. Slomczynska U., Zabrocki J., Kaczmarek K., Leplawy M. Т., Beusen D. D., Marshal G. R. // Facilitated synthesis of peptaibols: alamethicin via enzymatic segment condensation. // Biopolymers, 1992, Y. 32(11), P. 1461-1470.

53. Slomczynska U., Beusen D. D., Zarbocki J., Kociolek K., Redlinski A., Reusser F., Hutton W.10

54. S., Leplawy M. Т., Marshal G. R. 11 Emerimicins III and IV and their Ethylalanine epimers. Facilitated chemical-enzymatic synthesis and qualitative evaluation of their solution structures.// J. Am. Chem. Soc., 1992, V. 114, P. 4095-4106.

55. Mathew M. K., Balaram P. // Alamethicin and related membrane channel forming polypeptides // Molecular and Cellular Biochemistry, 1983, V. 50, P. 47-64.

56. Esposito G., Carver J., Boyd J., Campbell I. D. // High-resolution 'H-NMR study of the solution structure of alamethicin. // Biochemistry, 1987, V. 26, P. 1043-1050.

57. North C. L., Barranger-Mathys M., Cafiso D. S. // Conformational analysis of the peptaibol antibiotic, alamethicin, in solution and model membranes using NMR spectroscopic data. // Biophysical J., 1995, V. 69, P. 2392-2397.

58. Dempsey С. E., Handcock L. J. // Interactions of alamethicin molecules with lipid bilayers. conformation changes of a-Helical structure: H-bonds and parameters. // Biophysical J., 1996, V. 70, P. 1777-2788.

59. Sansom P. // Alamethicin and related peptaibols model ion channels // Eur Biophys. J., 1993, V. 22, P. 105-124.

60. He Ke, Ludtke S. J., Huang H. W. // Antimicrobial peptide pores in membranes detected by neutron in-plane scattering. //Biochemistry, 1995, V. 34, P. 15614-15618.

61. Archer Sharon J., Ellena J. F., Cafiso D. F. // Dynamics and aggregation the peptide ion channel alamethicin . Measurements using spin-labeled peptides. // Biochem. Biophys. Acta.,1997, V. 1330(2), P. 103-109.

62. You S., Peng S., Lien L., Breed J., Sansom M. S. P., Woolly G. A. // Engineering stabilized ion channels: Covalent dimers of alamethicin. // Biochemistry, 1996, V. 35, P. 6225-6232.

63. Benedetti E., Bavoso A., Di Blasio В., Pavone V., Pedone C., Toniolo C., Bonora G. M. // Peptaibol antibiotics: a study on the helical structure of the 2-9 sequence of emerimicins III and IV. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, V. 79 ,P. 7951-7954.

64. Condamine E., Rebuffat S., Prgent Y., Segalas I., Bondo В., Davoust D. // Three-dimensional structures of the ion-channel forming peptide trichorzianine ТА VII bound to sodium dodecyl sulfate micelles. // Biopolymers, 1998, V. 46(2), P. 75-88.

65. Le Doan Т., El Hajji M., Rebuffat S., Rajesvari M. R., Bodo B. // Fluoresence studies of the interaction of trichorzianine A III with model membranes. //Biochim. Biophys. Acta, 1986, V. 858(1), P. 1-5.

66. Iqbal I., Balaram P. // Membrane channel forming polypeptides. 270-MHz proton magnetic resonance studies of the of aggregation of the 11-21 fragment of suzukacillin in organic solvents. // Biochemistry, 1981, V. 20, P. 7278-7284.

67. Brachais L., Davoust D., Molle Q. // Conformational study of a synthetic analogue of alamethicin. Influence of the conformation of alamethicin on channel lifetimes.// Int. J. Pept. Protein Res., 1995, V. 45(2), P. 164-172.

68. Breed J, Ken- I. D., Molle G., Duclohier H., Sansom M. S. // Ion channel stability and hydrogen bonding. Molecular modeling of channels formed by synthetic alamethicin analogues. //Biochem. Biophys. Acta., 1997, V. 1330(2), P. 103-109.

69. Molle G., Duclohier H., Julien S., Spach G. // Synthetic analogues of alamethicin: effect of C-terminal residue substitution and chain length on the ion channel lifetimes. // Biochim.

70. Biophys. Acta, 1991, V. 1064(2), P. 365-369.

71. Kaduk C., Duclohier H., Dathe M., Weschuh H., Beyermann M., Molle G., Bienert M. // Influence of proline position upon the ion channel activity of alamethicin. // Biophys. J., 1997, V. 72, P. 2151-2159.

72. Kaduk C., Dathe M., Bienert M. // Functional modifications of alamethicin ion channels by substitution of glutamine 7, glycine 11 and proline 14. // Biochim. Biophys. Acta, 1998, V. 1373(1), P. 137-146.

73. El Hajji M., Rebuffat S., Le Doan Т., et. al. // Interaction of trichorzianines A and В with membranes and with the amoeba Dictyostelium. // Biochim. Biophys. Acta., 1989, V. 978(1), P. 97-104.

74. Mathew M. K., Balaram P. // Alamethicin and related membrane channel forming polypeptides. // Molecular and Cellular Biochemistry, 1983, V. 50, P. 47-64.

75. Isabella L., Karle I., Flippen-Anderson J. L., Agarwalla S. Balaram P. // Crystal structure of Leu'jZervamicin, a membrane ion channel peptide. Implications for gating mechanisms. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1991, V. 88, P. 5307-53011

76. Balaram P., Krishna K., Sukumar M., Mellor I. L., Sansom M. S. P. // The properties of ion channel formed by zervamicins. // Eur. Biophys. J., 1992, V. 21, P. 117-128.

77. Kropacheva T. N., Raap J. // Voltage- dependent interaction of the peptaibol antibiotic zervamicin IIB with phospholipid vescels. //Feps letters, 1999, V. 460(3), P. 500-504.

78. Sanson M. S. P., Balaram P., Karle I. // Ion channel formation by zervamicin IIB. // Eur. Biophys. J.,1993, V. 21 ,,P. 369-383.

79. Nilges M., Brunger A. // Automated modeling of coiled coils: application to the GCN4 dimerization region.//Prot. Engineer., 1997,V. 4, P. 649-659.

80. Isabella L., Judith L., Karle I., Flippen-Anderson J. L., Agarwalla S., Balaram P. // Conformation of the flexible bent helix of Leu1.-Zervamicin in crystal and possible gating action for ion passage. // Biopolymers, 1994, V. 34, P. 721-735.

81. Killian J. A., Taylor M. J., Koeppe R. R. E. // Orientation of the valine-1 side chain of the gramicidin transmembrane channel and implication for channel functioning. A 2H NMR study. //Biochemistry, 1992, V. 31, P. 11283-11290.

82. The NMR solution structure of ion channel peptaibol chrysospermin С bound to dodecylphosphocholine miscelles. // Eur. J. Biochem., 2000, V. 267(6), P. 1784-1794.

83. Рогожкина Е., Складнев Д., Лапшина М., Ерёмин С., Raap J., Швец В. // Биотехнологическое получение стабильно меченых препаратов зервамицина IIB. // Химикофармацевтический журнал, 2000, Т. 34(6), С. 37-40.

84. Matthews Н. R., Matthews К. S., Opella S. J. // Selectively deuterated amino acids analogues, synthesis incorporation into proteins and NMR properties. // Biochim. Biophys. Acta, 1977, V. 497, P. 1-13.

85. Ogrel A., Vaselenko A., Lugtenburg J., Raap J. // Enzymatic synthesis of specifically H-labelled L-glutamic acids, 2H, 15N, 13C-labelled glutamines on a preparative scale. // Reel. Trav. Chim. Pays-Bas., 1994, V. 113, P. 369-375.

86. Cappon J. J., van der Walle G. A. M., Verdegem P. J. E., Raap J., Lugtenburg J. // Synthesis of specifically stable-isotope-labelled L-proline and glutamines via L-glutamic acid. // Reel. Trav. Chim. Pays-Bas., 1992, Y. 113, P. 318-324.

87. Бендер M., Бергерон P., Комияма M. Биоорганическая химия ферментативного катализа. Перевод с английского, М: Мир, 1987.

88. Рабинович В. А., Хавин 3. Я. // Краткий химический справочник, "Химия",, Ленинградское отделение, 1977.

89. Frutos R. P., Spero D. М. // Synthesis of protected, chiral a,a-disubstituted a-amino acids via a Beckmann rearrangement. //Tetrahedron letters, 1998, V. 39, P. 2475-2478.

90. Heydari A., Fatemi P., Alezadeh A. A. // Lithium perchlorate/Diethylether catalyzed aminocyanation of aldehydes. // Tetrahedron letters, 1998, V. 39, P. 3049-3050.

91. Taillades J., Commeyras A. // Systemes de Strecker et apparients I. Edute de la decomposition en solution aqueuse des a-alcoyl-aminonitriles tertiares. Mechanisme d'elimination du groupement nitrile. // Tetrahedron, 1974, V. 30, P. 127-132.

92. Kaptein В., Boesten W. H. J., Broxtermann Q. В., Peters P. J. H., Schoemaker H. E.,

93. Kamphuis J. // Enzymatic resolution of a,a-disubstituted a-amino acid esters and amides. // Tetrahedron: Asymmetry, 1993, V. 4(6), P. 1113-1116.

94. Chen С. H., Fujimoto Y., Girdaukas G., Sih C. J. // Quantitative analysis of biochemical kinetic resolutions of enantiomers. // J. Am. Chem. Soc., 1982, V. 104, P. 7294-7399.

95. Ogata Y., Kawasaki A. // Mechanistic aspects of Strecker aminonitrile synthesis. // J. Amer. Chem. Soc., 1971, V. 93, P. 325-329.

96. VanNispen J. W. F. M., Smeet P. J. H., Poll E. H. A, Tesser G. // Investigation of the role of tryptophan in alfa -MSH replacement by pentamethylphenylalanine and L-phenylalanine. // Int. J. Peptide Protein Res., 1977,V. 9, P. 203-212.

97. Ю9.Якубке X. Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки: перевод с немецкого, М.: Мир, 1985.

98. Le Nguyen D., Nalis D., Castro B. // Peptide synthesis using rabid coupling reagents. Aspects of preparation and application // Int. J. Peptide Protein Res., 1989, V. 33, P. 133-136.

99. Ten Kortenaar P. B. W„ Van Dijk B. G., Petters J. M., Raaben B. J., Adams P. J., Tesser G. I. // Rapid method for the preparation of Fmoc-amino acids starting from 9-fluorenylmethanol. // Int. J. Peptide Protein Res., 1986, V.27, P.398-400.

100. Sieber P. // Modification of tryptophan residues during acidolysis of 4-metoxy-2,3,6-trimethylbenzenesolfonyl groups. Effects of scavengers. // Tetrahedron letters, 1987, V. 28, P. 1637-1640.

101. Pearson D. A., Blanchette M., Baker M. L., Guindon С. H Trialkylsilanes as scavengers for the trifluoroacetic acid deblocking of protecting groups in peptide synthesis. // Tetrahedron letters, 1989, V. 30, P. 2739-2742.

102. Гросс Э., Майенхофер И., Джоунс Дж., Бодански М., Рич Д., Сингх Ж., Кемп Д. Пептиды. Основные методы образования пептидных связей. Перевод с английского, М.: Мир, 1983.

103. Деоум Э. Современные методы ЯМР для химических исследований. Перевод с английского, М.: Мир, 1992.

104. Iqbal I., Balaram P. // Membrane channel forming polypeptides. 270-MHz hydrogen-1 nuclear magnetic resonance studies on the conformation of the 11-21 fragment of suzukacillin. // Biochemistry, 1981, V. 20, P. 4866-4871.