Получение и малоугловое рентгеновское исследование белковых ленгмюровских пленок тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА.ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ КРИСТАЛЛОГРАФИИ им. А.В.ШУБНИКОВА

На правах рукописи

ЕРОХИН ВИКТОР ВАСИЛЬЕВИЧ

УДК 548.737 + 539.333

ПОЛУЧЕНИЕ И МАЛОУГЛОВОЕ РЕНТГЕНОВСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВЫХ ЛЕНГМЮРОВСКИХ ПЛЕНОК

Специальность 01.04.18 - Кристаллография,

физика кристаллов

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1990

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте кристаллографии им. А.В.Шубкикова АН СССР.

Научные руководители:

доктор физико-математических наук Фейгин Л.А.

кандидат физико-ыэтеыагических наук Львов Ю.М.

Официальные опоненты:

доктор физико-математических наук Блинов JI.M.

доктор биологических наук Лазарев П.И.

Ведущая организация: Институт химической физики АН СССР (Москва

Защита диссертации состоится 21 марта 1990 г. в часов на заседании Специализированного совета при Институте кристаллограф» им. А.В.Шубникова Ail СССР по адресу: 117333, г.Москва, Ленински пр., 59.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке • Института кристаллографии АН СССР.

Автореферат разослан " 1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат физикотматематически2 наук

В.М.Каневский

;: ОБЩАЯ' ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕЬИ.

1 •

Актуальность теми. В последние года создается новая технология получения моко- я мультислоевых пленок органических соединение на основе метода Ленгмюра - Блоджетт (ЛБ) (1). Этим методом также могут бить получены мультаслойные пленки из белковых молекул. Исследование структуры таких пленок необходимо для понимания процессов организации и функционирования двумерных белковых систем. Для структурного изучения ЛБ пленок был применен метод малоуглового рентгеновского рассеяния (21.

В качестве основных объектов исследования были выбраны пигмент-белковый мембратшй комплекс (реакционные центры пурпурных бактерий) и иммуноглобулин (глобулярный водорастворимый

белок). Изучение ЛБ пленок из реакционных центров (РЦ) представляется весьма актуальным, ток как этот белок играет основную роль в процессах фотосинтеза. Изготовление я исследование ЛБ пленок иммуноглобулинов необходимо для построения чувствительных элементов биосенсоров.

Цель работы - изучение процессов формирования стабильных белковых монослоев на поверхности вода и нанесения их на твердые подложи, поиск условий улучшения их упорядочения в малоугловое рентгеновское исследование изготовленных ЛБ пленок.

Научная__новизна работы. 1. Для амфпфильнмх молекул с

каекцешшми углеводородными цепями установлены условия реализации упаковки с взаимным проникновением цепей и без него. . Получены промяли электронной плотности таких пленок.

2. С поиоцьо метода- малоуглопого рентгеновского рассеяния определены размеры и форма комплекса ГЦ-дегсргент в растворе.

3. Созданы мультаслойные ЛБ пленки Щ и рада иммуноглобулинов 1501, определены периоды повторяемости слоистых структур, предложены модели упаковки белковых молекул в ЛБ пленках и показано сохранение ими глобулярной структуры.

4. Разработан метод определешю площади, — занимаемой молекулами белка в ЛГ> пленке, оснований на применении пьезоэлектрических резонаторов.

5. Изготовлены и исслсдовшш ЛБ сверхрешетки, состоящие из череду»«чахся могюслоен РЦ и арахиновой кислоты.

6. Изготовлен:) модель иммуносенсорз, активным элементом которого является ЛК пимп:;) иммуноглобулина.

Практическая ценность работа заключается в развитии методам! получения органических сверхтонких упорядоченных плевок и методов их структурного анализа. Изготовленные и исследованные белковые ЛБ пленки ногу? быть использованы для построения биоэлектронных приборов и биосенсоров. Метод определения площади, занимаемой молекулами в ЛБ пленке, может быть применен для пленок из других белков и веществ, образующих недостаточно стабильные мопослои на поверхности води.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Первой Всесоюзной школе: "Ленгмпровские пленки: получение, структруктура, свойства" (1988 .г., Звенигород), молодежном конкурсе научных работ в Институте кристаллографии АН СССР в 1988 г. (премия rai. Н.В.Белова): 7 Всесоюзной конференции по росту кристаллов (1988 г., Москва); Конференции по биоэлектронике (1988 г., Франкфурт на Одере,ГДР); 12 Европейской кристаллографической конференции (1989 г., Москва); -2 Международной конференции по молекулярной электронике и биокомпыотераи (1989 г., Москва), Всесоюзной конференции "Химические сенсоры" (ноябрь 1989 г., Ленинград).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ. Список публикаций приведен в конце автореферата.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов, списка литературы. Она изложена на 150 страницах, содержит 56 рисунков, 10 таблиц. Библиография включает 104 наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Во введении обосновывается актуальность данной работы, формулируются ее цели, кратко излагается содержание.

ГлаваПленки Ленгмюра-Влоджетт: изготовление и структура.

В главе приводится обзор литературных данных по вопросам изготовления ЛБ пленок, методам исследования структуры ЛБ пленок, особенностям нанесения белковых ЛБ пленок.

Возрастающий интерес к ленгмлровским пленкам объясняется пригодностью ЛБ технологии для создпния сверхтонких органических пленок (толщиной до мономолекулярного слоя). Процесс происходит при комнаткой температуре и атмосферном давлении, что делает его пригодным для получения белковых пленок. Кроме того, метод позволяет конструировать двух- и многокомпонентные пленки (ЛБ сверхрешетки) с задашым порядком чередования молекулярных слоев

разных веществ.

Для анализа упорядочения ЛБ слоев наиболее перспективен метод малоуглового рентгеновского рассеяния, который позволяет определять период повторяемости пленки в направлении, перпендикулярном плоскости монослоя, и в ряде случаев рассчитать профиль электронной плотности в этом направления.

Далее приводится обзор особенностей формирования белкой« ЛБ пленок, дается список белков, с которыми проводились ' работы по изготовлении ЛБ пленок. Более подробно рассмотрены данные по создают и исследованию ЛБ пленок из РЦ и иммуноглобулинов.

До настоящего времени рентгеновские метода для изучения структуры белковых ЛБ пленок не применялись. Структурная информация извлекалась из косвенны! (электрических, оптических) измерений. В литературе иет данных о встраивании белковых мояослоев в ЛБ сверхрешетки.

Таким образом, изучение формирования и исследования структуры белковых Л5 пленок представляется своевременной и актуальной задачей. Залетим, что важно сравнивать структурные параметры белковых молекул в пленке с размерами молекулы в растворе, тек как на основании этого можно делать вывода о сохранении молекулой исходной структуры, о денатурации белка (разворачивании полипептидных цепей).

Глава 2. Методики и аппаратура для изготовления и исследования ЛБ пленок.

Во второй главе дано описание ленгмюровской установки, методов подготовки подложек, режимов формирования и переноса пленок, рентгеновского дифршстометра, методов малоуглового исследования слоистых ЛВ структур, мплоуглонсц-о pUIITlfHUIlCKOrO исследования белков в растворах, измерения площади, занимаемой молекулой в монослое на подложке, с использованием пьезоэлектрических резонаторов.

Плеш:и получали на установке Xangmuir Trough 4 фирмн Joyce Loebl (Англия), которая была дополнена устройством, позволяющим прерывать на заданное время нанесете слоев для просушивания образцов.

Малоугловое рентгеновское исследование проводилось на автоматическом малоугловом дифрактоыетре с позициошго чувствительным детектором (АМУР-К). (Разработан а изготовлен в Институте кристаллографии АН СССР.) К дифрактометру била изготовлена приставка для качания плоских образцов относительно пядапцего рентгеновского пучка.

Для определения размеров и формы белковых молекул в растворе применялись метода рентгеновского малоуглового рассеяния 13].

Стенд измерения площади, приходящейся на молекулу, состоял из источника питания, генератора, кварцевого резонатора и частотомера.

ЛБ пленки переносились на кремниевые, стеклянные и кварцевые подложки. Методы подготовки подложек, обеспечивали чистоту поверхности и при необходимости позволяли придать ей гидрофобные свойства.

Пленки солей лирных кислот переносились при поверхностном давлении тс = 27 - 28 мН/м. Скорость нанесения первых 4-6 монослоев составляла 0,5 ми/мин, затем она увеличивалась до I см/мин. При нанесении йокплекскых солей жирных кислот в объем водной субфазы добавлялось М TaOF5. Белковые ДБ пленки переносились на подложки в диапазоне поверхностных давлений • х = 20 - 50 ыН/м методом Ленгмюра - Шефера. После переноса каждого последующего монослоя остатки воды удалялись с помощью сильной струи аргона.

Профили электронной плотности р(х) в направлении х, перпендикулярном плоскости подложки, рассчитывались по формуле:

р(х) = F<0)/D + 2/D 5] i |F(h/D)|cos(2xhx/D) (1) где D - период повторяемости, h - номер рефлекса. Модули структурных амплитуд |F|.вычислялись из интенсивносей брегговских рефлексов. Для ценгросиммегричных пленок (У-гип) фазовая задача сводится к знаковой 12J. При расчете постулировался участок постоянной электронной плотности, соответствующий упаковке углеводородных цепей молекул. На ЭВМ рассчитывались все варианты профиля электронной плотности, а наилучший отбирался по минимуму отклонения от постоянной плотности.

Для определения площади, приходящейся на одну молекулу в пленке, использовалось свойство кварцевых резонаторов " уменьшать частоту собственных колебаний при нанесении на их поверхность дополнительной массы вещества. Величина сдвига частоты определяется формулой 14):

Af/i0 = - Am/Apl , (2)

где f0 - исходная частота резонатора, Af - сдвиг частоты, вызванный переносом ыонослоя, Am - масса перенесенного монослоя, А - покрываемая площадь, р - плотность кварца, 1 - толщина резонатора.

Изучалось изменение частоты резонаторов, вызванное переносом монослоев арахидата свинца. Вид зависимости относительного сдвига частоты (Ai/Afe) от номера перенесенного ыонослоя представлен на

рис.1. Видно, что воспроизводимые изменения частоты наступают после перенесения 10-12 ыонослоев арахидата свинца. Разброс величины сдвига частоты в начальной части графика обусловлен неоднородностями поверхности подложки. Эти неоднородности выравниваются переносимыми слоями. Для проведения численных оценок площади, приходящейся на молекулу, и для количественного описания

1.С

о,

5

II

15

15 N

Рис.1. Зависимость кварцевого-.резонатора арахидата свинца (Л).

относительного от номера измеиение

(ЛГ/ЛГа)

(Л18 -

изменения частоты перенесенного слоя частоты резонатора,

вызванное перенесением монослоя в стационарной области.)

прохождения реакции антиген - антитело поверхности кварцевых резонаторов покрывались предварительно 15 монослоями арахидата свинца.

ГлаваЗ. Получение и малоугловое рентгеновское исследование соединений жирных кислот

Жирные кислоты и их соединения - основные модельный системы ЛБ технологии. Для создашя высокоупорядоченных белок содержащих ЛБ пленок оказалось целесообразным вводить в них прослойки молекул жирных кислот. Это послужило одной из причин исследования свойств пленок жирных кислот и их соединений.

В главе описаны процессы изготовления и исследования строения ЛБ пленок соединений миристиповой, пальмитиновой, стеариновой, пряхинопой, бегеновой и лигноцериновой кислот с двухвалентными металлами и с ТаОРд, в также с МЬОРд, Рассчитана профили

электрошгай плотности на бнслоях этих соединений. Било установлено, что наилучшее упорядочение наблвдпется в ЛБ пленках

из соединений пальмитиновой, стеариновой, врахиновой и бегеновой кислот.

В случае комплексных солей жирных кислот с ТаОК5 наблвдалось изменение характера профиля электронной плотности при увеличении длины углеводородной цепи. Зависимости значения периодов повторяемости солей жирных кислот с двухвалентными металлами и комплексных солей с ТвО?5 от длины углеводородной цепи приведены на рис.г.

Как видно из рис.2 для комплексных солей с ТаО?5 наблюдается уменьшение периода повторяемости по сравнению с периодом повторяемости для солей жирных кислот с двухвалентными металлами. Это • может быть объяснено либо увеличением отклонения углеводородных цепей от нормали к плоскости монослоя, либо возникновением взаимного проникновения углеводородных цепей соседних монослоев. Наличие двух ветвей для случая комплексной соли с ТаОКд позволяет предположить, что наблюдается изменение характера упаковка углеводородных цепей по мере увеличения их длины.

1

60

50

40

50

о

в,А

<

Рис.г.

16

18

РО

??

N

Зависимость периода повторяемости мультислоШгой ленпшровской плешей от числа атомов углерода в цепи амфифнльной молекулы дня солей жирных кислот со свинцом (кривая 1) и для комплексных солей с ТаОР5 (кривая 2).

Анализ электронной плотности серии различных ЛБ пленок позволил сделать вывод, что для кошшгксиих солей арахиновоЯ (0=46,4 А), бегеновой и лигноцериновой кислот набладается увеличение наклона углеводородных цепей. Длл комплексных солей

миристиновой, пальмитиновой, стеариновой и арахиновой <0=42,0 А) кислот нвблпдается упаковка с взаимным проникновением углеводородных цепей соседних монослоев (рис.3).

На основании этого сделан выпод, что характер упаковки определяется соотношениями размеров "головки" молекулы и длиной углеводородной цепи. Для оценки возможной упаковки в ЛБ пленках различных соеданешгй было выбрано отношение этих размеров. Граничным условием реализуемости той или иной упаковки будет значение этого отношения для комплексной соли арахиновой кислоты, для которой наблюдается две системы рефлексов, отвечающих разному типу упаковки. Значение отношешя размера "головки" к длине углеводородной цепи комплексной соли арахиновой кислота составляет О,г.

Определение граничного условия возникновения той или иной упаковки позволит предсказывать характер упаковки насыщенных углеводородных цепей в ЛБ пленке соединений с новым! типами "головок". Отметим, что исследованные в 15) и [б] пленки, в которых обнаружено взаимное проникновение углеводородных цепей, удовлетворяют введенному выше критерию (отношение размера "головки" к длине цепи для них больше 0,2).

Х1 отн.ед.

Рис.3. Профиль электронной плотности бислоя комплексной соли стеариновой кислоты с ТаОР5,

и ?0 40

Отметим, что перенос монослосв комплексных солей жирных кислот с Тл0?5 па твердую подложку пленки осуществлялся только при движении подложки через моиослой вперх. При движении В1тз с малыми скоростями (менее 0,1 ш/шш) перенос монослоя не происходил. При движении же вниз с болшей скорости), более того, "слезала" часть монослоя перенесенного при движении вперх (при скорости 1 см/маи

"сползало" 1/3 перенесенного, ранее ыопослоя). Такой характер переноса позволяет предположить, что в данной случае при движении подложки с нонослоем вниз через ионослой на поверхности вода происходит переориентация нанесенного до этого ионослоя в СислсЯ. Эта переориентация происходит в нениске жидкости.

ГМё?_4л Белковые ионослой на поверхности вода

Данная глава посвящена сравнительному изучении поведения различных белковых молекул на поверхности водной субфазы.

Для анализа состояния белковых молекул в монослое на поверхности воды был применен следующий метод. Исследовалась заиюшлость от времени отношения площади, занимаемой белковой пленкой (Б), к первоначальной площади,ограниченной барьером (50), а режиме автоматического поддержания заданного поверхностного давления %. Такая зависимость для трех белков - РЦ (кривая 1), цитохрома с (кривая 2) и иммуноглобулина 1^1 (кривая 3) -приведена на рис.4. Для всех трех белков поддерживалось тс=20 мН/м.

Как видно из рис.4, эти зависимости для всех трех белков различии. РЦ - мембрашшй белок, имеющий значительные гадрофэбные области. Для него наблюдается некоторое уменьшение площади внутри барьера в начальный момент времени. Это связано с

Рис.4. Временная зависимость изменения относительной площади (Б/Б0), ограшченной барьером,в режиме автоматического поддержания л, для монослоев РЦ (1), цитохроыэ с (2) и иммуноглобулина 1ЕС1 (3).

тен, что в начале процесса молекулы белка, солюбилизнровашые в процессе выделения из мембран детергентом, являются гидрофильные И иогут тонуть. Однако на границе раздела фаз детергент частично

отделяется от белковой молекулы и переходит на родную поверхность, превращая молекулу РЦ в "поплавок". В дальнейшей утечка белкогых молекул .с поверхности вода в объем субфази практически прекращается.

Цитохрон с - глобулярный водорастворишй белок (кривая 2 на рис.4). Увеличение площади, ограниченной барьером, указывает на то, что на поверхности вода происходят разворачивание полипептидшх цепей белка, т.е. его денатурация.

Иммуноглобулин 1{5$» также является глобулярный водорастворимым белком, но его поведение на поверхности вода (кривая 3 па рис.4) существенно отличается от поведения цитохрома с. В данном случае наблюдается уход части препарата в объем водной субфазы, что связано с существенной гидрофильностьп белковой глобулы. Увеличения площади, указываадего на денатурацию белка, в данном случае не набвдалось. Это, по-видимому, связано с тем, что в отличие от цитохрома с, структура которого стабилизируется за счет гидрофобных и полярных взаимодействий, сравнимых по величине с силами поверхностного натяжения, структура молекул иммуноглобулина более стабильна, главным образом, благодаря в-8 связям.

Чтобы убедиться в том, что водорастворимые белки действительно' могут сохранять первоначальную структуру, а следовательно, и функциональную активность был выполнен следующий эксперимент. В качестве объекта была выбрана бвктериолюцифераза, которая участвует в создании цепи гядрооксилирования гидрофобшх соединений при активации молекулярного кислорода флавином, связанным с белком (препараты бактериолюциферазы были предоставлены П.И.Белобровом и В.А.Воеводиным, Институт биофизики СО АН СССР).

На поверхности водной субфазы формировался молекулярный слой бактериолюциферазы (71=25 мН/м). С помощьо микрошприца производился отбор проб по 50 мкл с разной глубины ванны. Пробы отбирались как внутри площади, ограниченной барьером, так и за ее пределами. Шприц двигался как сверху вниз, так и снизу вверх. Пробы помещались в измерительную кювету, содержанию избыточное количество альдегида и флавинмононуклеотидв. Количество активной бактериолюциферазы в пробе оценивалось по интенсивности зарегистрированного с помощью ФЭУ сигнала. Било установлено, что внутри барьера бактериолюцифераза сконцентрирована на поверхности, хотя имеется и некоторое распределение препарата по глубине впнш (уменьшение концентращш при движении в глубь ваянн). За пределами барьера на поверхности года преппратл практична!® ¡'.от. таким

образом, ясно, что бактериолюцифераэа не потеряла функциональной активности в монослое.

Глава 5. Получение и исследование ЛБ пленок из реакционных центров

Растворы РЦ были предоставлены сотрудниками Биологического факультета Московского государственного университета Н.И.Захаровой, А.А.Кононенко, П.П.Ноксом,. А.Б.Рубинам.

В данной главе рассмотрены вопросы получения и исследования ЛБ пленок РЦ из бактерий двух видов - ШюйоЬа^ег ерйаего1с1е5 и СКготаиит т1пиивв:1тит.

Для определения размеров и формы молекул РЦ из бактерий ШюйоЬа^ег ер!тего1с!ез в растворе -"злсиентарного блока" ЛБ пленки - было проведено малоугловое рентгеновское исследование. При структурном исследовании необходимо было учесть наличие "пояса" детергента вокруг белковой молекулы. Этот пояс возникает в результате выделения белка из мембраны, и электронная плотность в нем меньше, чем электрошгая плотность вода. Значение радиуса инерции комплекса РЦ-детергент в растворе составило 24,5»1,0 А. Затем по соответствию экспериментальной и расчетных крлгых малоуглового рассеянии,моделировалась форма молекулы. Наилучшее соответствие с экспериментальными данными показала модель комплекса, в которой белковая глобула представлена цилиндром с диаметром 30 А и высотой 77 А. Детергент окружает белковую глобулу поясом с радиусом 24 А и высотой 48 А, закрывая центральную часть белковой глобулы (предположительно погруженную в мембрану).

В качестве субфазы для нанесения ЛБ пленок использовался 0,005 М фосфатный буфер <рН 6,8). Вид тс-А изотермы монослоя РЦ приведен на рис.5. Так как уход белка в объем водной субфазы в данном случае незначителен, то площадь, занимаемую молекулой, можно оценить непосредственно из и.-А изотерм. Эта площадь составила 2500 А2. И(.

Перенос пленки на подложки осуществлялся методом Ленгмюра -Шефера.

Рентгенограмма ЛБ пленки, содержащей 50 моноиэлекуляршх слоев РЦ, содержала один рефлекс, соответствующий периоду

30 \ зг,мН/м

о 5000 10000

Рис.5. 11-А изотерма монослоя

повторяемости 11=86 А. Сопоставлений размеров молекулп с велггпшпЛ периода повторяемости и площади, приходящейся из одну молекулу, позволило сделать вывод о сохранении глобулярной структуры молекулами РЦ в ЛБ пленке и предположить, что белковые глобулы ориентированы длинной осьс перпендикулярно плоскости ионослоя. Некоторое увеличеше периода повторяемости по сравнению с максимальным размером белковой глобулы можно объяснить проникновением воды в область контакта гидрофильных областей молекул в соседних монослоях.

Были изготовлены и исследованы ЛБ пленки из более анизотропного в смысле расположения гидрофильных и гидрофобных облайтей белка - РЦ с ассоциированным с ним цитохромом выделенного из бактерий СЬгошаНш т1тК1ся1тет. Эта система -сложное белковое образование, где отдельные составные части работают в комплексе, осуществляя электронный транспорт.

Проведенное малоугловое рентгеновское исследовв1ше позволило определить размеры белкового комплекса в растворе. Радиус инерщш молекулы составил 36± 1,0 А. Максимальный размер молекулы равен 110 ± 10 А.

При попытках получеш!я многослойшх ЛБ пленок ГЦ из СИгогааПит т1пиИ881тпт мы натолкнулись на ряд трудностей. При использовании метода Лопгмюра - Блоджетт коэффициент переноса оказался ранним нулю. При испольпопятга метола Ленгмтра-Шефсра при переносе монослоя на подложку вместе с монослоем РЦ захватывалось некоторое количество воды и при извлечении на воздух нэ подложке образовывалась капля. При высушивании струей аргона капля вместе с монослоем легко сдувалась с подложки. При высушивании образца в комнатных условиях, образуется неупорядоченная пленка. В случае нанесения пленок ГЦ из ПНо(1оЬпс1рг ярИчегоМеР таглх трудностей не било. Это указывает на то, что добавочная субьедтпща- цитохрон с - притягивается к воде существенно сильнее, чем весь белок к подложке.

Создание многослойной пленки цигохромсодпрж^щрго ГЦ удаплось осуществить путем сложной многоступенчатой процедуры. Ирм нормальных значениях рН (7,0) цитохром с несет положительшй заряд, равный восьми зарядлм электрона 17!. Следовательно, чтСы перенести монослой цитохромсодрржацгч-о ГЦ необходима зарядить подложку отрицательно. Схематично процесс нанесения изображен из рис.6.

Гидрофзбизировлпн.-'я подложка двигалась первоначально монослой арахингпей кислоты, сфсрмирогпшшй нп н^-перигести •п;-.тсС1

вода (pH 7tü) - голов131 кислоте в этих условиях находятся в депротошфованиоы состоянии и несут отрицательный заряд). В

•О

SO

i&ooi

Рис.6. Схема процесса выращивания ЛБ сверхрешетки с чередованием монослоев реакционных центров из Chromatium miiiutißslnum п арахиновой кислоты.

наиболее погруженной состоянии движение подложки прерывалось. Монослой арахиновой кислоты удалялся с поверхности пошил. На его месте формировался свежий монослой РЦ. который при движении подложи вверх переносился па заряженные головка арахиновой кислоты. Отлетим, что в данном случае принцип зарядового взаимодействия был дополнен принципом молекулярной архитектуры. При многократном повторении процесса была изготовлена ЛБ сверхреЕетка, элементарная ячейка которой состояла из монослоя врахинсвой кислоты и монослоя цитохромсодержащих РЦ. Рентгенограмма саерхрешетки из 15 элементарных ячеек содержала 7 порядков отражения, угловое положение которых соответствовало межсловному расстоянью D=115 А. Отметим, что это первый и пока единственна случай, когда рентгенограмма от Селоксодержащей ЛБ пленки дает Солее одного порядка отражения.

Гжава_6. Получение и исследование ЛБ пленок из

сьм i пегдомуджа

Е г-то2 ггаг-е cascaao изготовление и исследование ЛБ пленок из Создан а исследован макет нмауносенсора, «зрзхепет vosESfiaffl Сажа в пленках функциональной

В работе использована препарата иммуноглобулинов, предоставленные нам О.В.Рохлиным, Е.Л.Арсеньевой, Г.Т.Богачепсй и Д.Р.Ибрагимовым (Институт экспериментальной кардиологии АМН СССР), В.И.Ратнерои (Институт биофизики АН СССР) и А.Л.Каюгашнм (Ветеринарная академия).

По г-А изотерме иммуноглобулина на поверхности вода было рассчитано значение площади, приходящейся на одну молекулу, А = 1200 А^. Такое низкое значеш!е этой величины не соответствует ни одному из сечений молекулы [81. При использовании метода определения площади с использованием кварцевых резонагорсз была получена величина А = 3200 А, что может соответствовать преимущественному вертикальному расположению молекул 1£С1 в монослое (длинная ось перпендикулярна подложке). На рентгенограмма от полученной методом Ленгмюра - Шефера пленкки, содержащей 50 нонослоев 1£С1, имелся максимум, соответствующий периоду 0=108 А, это подтверждает вертикальное расположение молекул в пленке.

Для придания ЛБ пленке из Г£С1 больней механической прочности было выполнено химическое сшивание молекул белка в коносдое глутаровым альдегидом. Доя этого под сформированный монослой иммуноглобулина при тс=20 мН/н вводился раствор глутарового альдегида, осуществлявший попарное связывание молекул 1^1 в области аминных остатков. Перед переносом сформированный белкоЕый монослой подвергался взаимодействию с глутаровым альдегидом в течение 1 часа. На 'рентгенограмме от мультислойной пленки, изготовленной путем последовательного глутаровым альдегидом монослоев 1§С1 рефлекс, отвечавший ¡>=70 А. Уменьшение периода повторяемости в данном случае связано с отклонением от нормали положения молекул в монослое под действием глутарового альдегида.

Была твкже сделана попытка использования гидрофобизированных фрагментов 1(г£. Сотрудниками Института Сиоорганической химии АН БССР (Минск) И.В.Турко, И.Л.Пику левой, В.Л.Чзциным были предоставлены гидрофобизировагаше РаЬ - Рис.7 фрагменты 1^1 :

(СН? )2-С0-КН- (СН2 )}5-С»3

переноса

наблвлалсл ¡Г, мН/м

обработанных один острый

600 т?оо , 71-а изотер:«! фрзг-

келга (1) п гядрс^сб:1з:госЕз:г-

нсго 1*рзг?.:э!гга (2) 1гЯ1

Вид х-А изотерм FQt) фрагмента и гидрсфобизированного Fab фрагмента приведен но рис.7. Анализ изотерм показывает, что использование гидрсфобизированного FRb фрагмента приводит к практически полному прекраиенню утечки препарата в объем субфазы.

Для проверки сохранения функциональной активности молекул IgGI в JE пленке бил применен гравиметрический метод, основашшй на использовании г-варцевих резо!!аторов. На поверхность кварцевого резонатора, покритого 15 монослоями арзхидата свинца, наносился иокослоЯ иммуноглобулина IgGI (антитело или антиген). Кзготовле1шый тякяи образом чувствительный элемент иимукосенсора погружался в исследуемый растиор на различное время. После кахдого погружения в исследуемой раствор чувствительный элемент иинуносексора отмывался в триады дистиллиропшшой воде. Капли сдувались струей аргона. Для контрольшх измерений на другой резонаатор наносилась пленка иммуноглобулина, не являющегося специ$мч1ым к исследуемым молекулам.

Результаты измерений представлены на рис.8. В данном случае на поверхность резонаторов наносились антитела, а в растворе

Fv.n.O. Зпзм-имог.ть гпяппиной иимуносснсор^м масси лга от i j'i!ei;K гогружснил v, мсслг-д7 ашЯ раотгор. На подложке IgGI Fc (антитело) - 1, i{i;i 13Е4 <<(ои) - г. В рясиюре IgGI ) Dol ¡Mirareii к 1 ?„).

»:.ипд«/.:(.:!. araiit ia. Релмт.пт и хпракте} i$î."KT.i oiinrviitmum ¿ля t liuîU'.'iC.r-oitorc /.элмюд' îistiwk ;;rx.i::'VTi f от

неслецкфгсеского. Это указывает ня сохранение функциональной активности IgG в ЛБ пленке. Проделаны тепе исследования и в том случае, когда на резонатор наносились пленки антигена, а в растворе находились антитела.

Вывода:

1. Усоверяенствована методика получения белковых пленок Леягавра -Блоджотт. Исследованы характеристики белковых ионослоеа ва поверхности воды. Впервые получека и исследована ЛБ сверхреяетка, состоящая из чередующихся монослоев реакционных центров и арахяновой кислоты.

2. Иетодом малоуглового рентгеновского рассея)шя была получена модель комплекса реакционный центр (из Rhodobactcr r.phaeroldes) -детергент' в раствора: белковая глобула в виде цилиндра высотой 75 А и диаметром 30 А, окруженная поясом детергента с внешним диаметром 45 к и высотой 50 К. Определены инварианты малоуглового рентгеновского рассеяния молекулы реакционных центров яз ChromatIura minutiBBiraum з растворе.

3. Проведено малоугловое рентгеновское исследование белковых пленок Леипдара - Бяодяетт. Предложены модели расположения белковых молекул в пленках.

4. Изготовлены и исследованы пленки Ленгмвра - Блоджетт соединений =иршх кислот с двухвалентными металлами и с TaOFg. На основании рентгеновских исследований комплексных солей лирных кислот с TaOF^ показана возможность возникновения в ЛБ пленках упаковки с взаимным протнсновеиием углеводородных цепей прилегающих монослоев. Экспериментально установлены условия возникновения такой упакоЕки. Предложен критерий оценки возможной упаковки в пленках Ленгмюра - Блоджетт из ямфифыышх молекул с насыщенными углеводородами цепями.

5. Разработана методика измерения площади, приходящейся на одну молекулу в белковых ЛБ плепках. Методика основана на юшровзвепивакии с помощью пьезоэлектрических резонаторов.

6. С использованием микровзветивяпия экспериментально показано различие в характере укладки первых и последугщих молекулярных слоев в ЛБ пленке.

Т. Используя гравиметрический метод было показано сохранение функциональной эктнрности молекулами ю-иуноглобулинз IgC1 в пленке Леш.гюра - Блоджетт. Изготовлена и ясследовянз экспериментальная модчль икмуносонсора. основанная на использовании реакция гятагел-антитело.

Материалы диссертации опубликованы в следувдих работах:

1. БедоСрраП.В., Воеводин В.Д., Ерохин В.В., Львов DM., Петушков В.Н., Пузырь А.П., Родионова Н.С. //Взаимодействие' бактериальной ЛЕЦйферазы с амфифялыпаю молекулами в растворе, на поверхности воды и в плевках Ленгмпра - Блодаетт.//Препринт 92 Б, Институт фззмки ш. Л.В.Кяренского СО АН СССР, Красноярск, (988.

2. Фейпш Л.А., Кагашш Р.Л., Львов D.M., Ерохин В.В., Нокс П.П., Кошшекко А.А. // Ленгмюровские пленки мембранных фотосянтетических реакционных центров пурпурных бактерий// Тезисы докладов 5 Советско - Швейцарского симпозиума "Биологические кеыбраш: структура и функции". Рига, апрель 1988, с.152.

3. Ерохия В.В., Львов O.K., Могилевский Л.Ю., Фейгин Л.А., Зозулин А.Н., Ильин Б.Г. // Об упаковке углеводородных целей лекгиюровских клевок// Тезисы докладов 7 Всесоюзной конференции по росту кристаллов, Москва, ноябрь 1988, т.2, с.274 - 275.

4. Ерохин В.В., Катина Р.Л., Львов D.M., Захарова Н.И., Кононенко А.А., Нокс П.П., Рубин А.В. // Получение ленгмвровских пленок фагосшггетическях реакционных центров пурпурных бактерий// ДАЛ ССХР, 1988. т.299, Н.5, с.1262-1266.

5. Erokhin V.V.. Felgln L.A., Kayuahlna R.L., Lvov Уи.И., Kononen-ko A.A.. Knox P.P., Zakftarova H.I. //Langraulr rilms oi photosynthetlc reaction centreo from purple bacteria// Studla blophysica, 1937, v.122, n.1-3, p.231-236.

6. Erokhin 7.V., Kayvshlna B.L., Lvov Уи.М., Felgln L.A. //Protein Langsulr-Blodgett fllma as sensing elements// Studla blophysica, 1989, v.132, n.1-2, p.97-104.

7. EroJdiln ?.V., Lvov Уи.И., MogllevBkl L.iu., Felgln L.A., Zozulln A.K., IIJin E.G.// X-ray lnventlgatlon oX hydrocarbon chalnn packing In IB films containing W, Nb. Та atama// 12 European Cryst.Beeting, Collected abstracts. Moscow, august 1989, ».3, p.352.

8. Erokhin 7.V., Kayuehlna R.L., Lvov Yu.M., Felgln L.A. //Coaparutlve etructural study oi Langpmlr-Blodgett Illms by csall-angle X-ray acatterlng and piezoelectric resonance// 12 Eur. Crjst. Keeticg, collected abstracts, JIoscow, august 1989, v,3, p.363.

9. Erciiln 7.V., Kajrahlna R.L., ¿тот Yu.U., Felgln L.A.//Protein Jsr^xxli^BIodee11 XIIbb: ctructurc, properties// 12 Eur. Cryst. ttUng. Collectad abstracts. Boscc*. eugust 193Э, ?.C, p.363.

10. Feigin I.A., Lvor Yu.M., Erokhin 7.7.//Structural aspects or molecular engineering// 2 Int.Con!. Molecular Electronics and BlocomputerB, abstráete, Moscow, September 1989,p.33.

11. Turko 1.7., Pikuleva I.A.. Chaechin 7.1., Erokhin 7.7., Lvo» Yu.H. //A hydrophobization of Fab lor LB films// 2 Int.Conl. Molecular Electrónica and Biocorcputers, abstracts',' Hoscow, September 1989, p.139-140.

12. Ерохин В.В., Сабо Я., Захарова Н.И., Кашина Р.Л., Коконенко А.А., Львов Ю.М., Лукашев Е.П,, Ноне П.П. //Получение ленгмюровекмх сверхрешеток па основе цитохромсодержвдях фотосинтетичесхих реакционных центров из chromatium minutiesirom// Биологические меибракы, 1989, т.6, н.11, с.1125 - 1132.

13. Erokhin 7.V., Itov Yu.H., üogileysky L.íu., Zozulin A.II., Ilyin E.G. //ÜFno types of hydrocarbon chain packing in Langrajir -Blodgett films: interdigitated and abutted tails// Thin Solid Films, 1989, v.178, p.153-158.

14. Ерохин В.В., Горкин П.Н., Кашина Р.Л., Курочкин И.Н., Полоз Б.Н., Чернов С.Ф. //Исследование гравиметрических биосенсорор// Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Химические сенсоры" (Ленинград, ноябрь 1989), стр. 22 Q

15. Ерохин В.В., Горкин П.Н., Кагаииа Р.Л., Курочкин И.Н., Попов Б.Н., Чернов С.®., Черченко И.Г. //Безреагентный гравиметрический иммуносенсор// Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Химические сенсоры" (Ленинград, ноябрь 1989), стр. 2&0

Список цитированной литературы:

1. Harmonay Н., Vincent И., Dupeyrat H. //Composition and transfer mechanism of Langmuir-Blodgett multilayers of stearates// Thin Solid Films, 1980, v.68, p.21-31.

2. Львов Ю.М., ®ейгин Л.А. //Ленгмгровские пленки - получение, структура, некоторые применения// Кристаллография, 1987, т.32, выл.З, с.800 - 815.

3. Свергун Д.И., Фейгин Л.А.// Рентгеновское а нейтрспяоэ малоугловое paccenirae // М:"Наука", 1986.

Л. Reichert W.M,, Bruckner С. J., Jor.eph J. //Longnuir - Blodgett films mid black lipid membranes in biospeclfic surface-nelectlTS sensors// Thin Solid Films, 1987, v.152, p.345-376. 5. BelbeochB., Roulliay H. and Tournrie 21. Evidence of chain interdigitation in Langwlr-Blodgett fiIra// Thin Solid . Files, 1935, v.134, p.89 - 99.

6. Vlncett P.S., Barlcw V.A. //Highly organised aromatic molecular eyeless using Langsulr-Blodgett films: structure, optical properties and probable epitaxy of antracene - derivative mlty layers// Thin Solid Films. 1980, v.7l, n.2, p.305 - 326.

7. Kozarac Z. Dfcathathreyan A.,Moblus 0., //Adsorbtlon ol cytochrcoe с to phospholipid monolayers studies by reflection spectroscopy //, FEBS Lett., 1968, v.229, p.372-376.

8. Тернер II. // Структура к фуккдаи юмуноглобулинов // в книге "Структура ■ фукхцнн авттнтел". II.: Мир, 1983.