Получение, свойства и применение для определения биологически активных органических соединений пленок тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Мясникова Дина Андреевна

ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ПЛЕНОК {ЦЕЛЛЮЛОЗА-ИОННАЯ ЖИДКОСТЬ}

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

з МАР 2015

Москва-2015 005559828

005559828

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» (МГУ имени М.В. Ломоносова).

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Шеховцова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Бабкина Софья Сауловна, Московский государственный машиностроительный университет доктор фармацевтических наук, доцент Эпштейи Наталья Борисовна, Обнинский институт атомной энергетики Национального исследовательского ядерного университета МИФИ

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» (СГУ).

Защита состоится 26 марта 2015 г. в 11 ч. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.109.01 по аналитической химии и радиохимии при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Ордена Ленина и Ордена Октябрьской Революции Институте геохимии и аналитической химии им. В.И.Вернадского Российской академии наук (ГЕОХИ РАН); 119991, ГСП-1, Москва, ул. Косыгина, д. 19.

Диссертация и автореферат размещены на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Ордена Ленина и Ордена Октябрьской Революции Института геохимии и аналитической химии им. В.И.Вернадского Российской академии наук (ГЕОХИ РАН) (http://intranet.geokhi.ru/) и на сайте ВАК (http://vak.ed.gov.ru). Автореферат разослан 20 февраля 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук Захарченко Е.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одной из очевидных тенденций современной аналитической химии является миниатюризация, автоматизация и упрощение анализа, его ориентированность на «внелабораторные условия». Химические сенсоры, тест-системы, портативные устройства являются удобными средствами такого анализа. Потребность в расширении круга определяемых соединений и объектов анализа обусловливает динамичное развитие сенсорных технологий с привлечением новых индикаторных систем, а также последних достижений в области материаловедения и микроэлектроники. В отличие от электрохимических сенсоров химические оптически прозрачные чувствительные элементы одинаково удобны как для инструментальной. так и визуальной индикации аналитического сигнала. С применением ионных жидкостей (ИЖ) в сенсорных технологиях в качестве растворителей, специальных добавок к полимерным матрицам-носителям и их модификаторов, а также одновременно пластификаторов и распознающих агентов предложены новые оптические материалы. Среди них особое место занимают материалы на основе природных полимеров, в частности целлюлозы. Некоторые гидрофильные ИЖ растворяют целлюлозу, способную в результате регенерации принимать различные тестовые формы: пленки, губки, шарики, гранулы и др. Целлюлоза является гидрофильным, биосовместимым, биодеградируемым, нетоксичным и недорогим полисахаридом. Перечисленные свойства делают ее привлекательным материалом для иммобилизации различных распознающих аналитических агентов, в том числе биокатализаторов.

К настоящему времени показана возможность применения пленок {целлюлоза-гидрофильная ИЖ} для иммобилизации некоторых ферментов класса гидро-лаз и оксидаз; продемонстрированы перспективы использования пленок, полученных методом осаждения-растворения целлюлозы в галогенидных ИЖ и модифицированных органическими реагентами, для определения ионов токсичных тяжелых и переходных металлов, неорганических газов. Однако примеры использования пленок {целлюлоза-ИЖ} для определения органических соединений в литературе отсутствуют. Настоящая работа направлена на получение новых пленок {целлюлоза-ИЖ} и усовершенствование предложенных ранее, а также на изучение их аналитических возможностей в качестве чувствительных и селективных элементов оптических химических сенсоров для определения органических соединений, в частности природного эндопероксида артемизинина (АМ), обладающего антималярийной активностью; некоторых синтетических и природных пищевых красителей. Актуальность определения перечисленных соединений обусловлена их высокой биологической активностью, а также потребностью контроля их содержания в фармацевтических препаратах, биологически активных добавках (БАД), биологических жидкостях; продуктах текстильного, фармацевтического и пищевого производств соответственно.

Автор выражает искреннюю благодарность к.х.н„ доценту C.B. Мугиновой зауча-стие в постановке задач и обсуждении результатов исследований.

Цель работы — создание на основе микрокристаллической целлюлозы путем ее растворения и регенерации в двух гидрофильных ИЖ оптически прозрачных целлюлозных пленок с нековалентно иммобилизованными аналитическими реагентами для определения биологически активных органических соединений различной природы.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• изучить растворимость целлюлозы и выбранных аналитических реагентов в ИЖ (ацетате и хлориде 1-бутил-З-метилимидазолия, [ВМ1т][АсО] и [ВМ1т][С1]), а также влияние ИЖ на каталитические и оптические свойства растворяемых веществ (ферментов, синтетических красителей, флуоресцирующих комплексов);

• установить состав целлюлозных пленок, приготовленных с использованием каждой ИЖ; выяснить условия получения пленок с требуемыми физико-механическими, оптическими и каталитическими свойствами, а также условия получения и измерения аналитического сигнала пленок визуальным и спектроскопическим методами;

• изучить и сравнить физико-механические, оптические, функциональные и сорбционные свойства полученных целлюлозных пленок; исследовать морфологию их поверхностей; выявить наиболее перспективные целлюлозные материалы для определения органических соединений на примере билирубина и артемизини-на;

• предложить флуоресцентные индикаторные системы для определения ар-темизинина, апробировать их в растворе и в составе целлюлозных пленок, а также в анализе реальных объектов.

Научная новизна. Получен и охарактеризован новый целлюлозный материал в виде целлюлозной пленки, приготовленной с использованием [ВМ1ш][АсО], который по прочности, эластичности, устойчивости к влиянию водных растворов различной кислотности, действию полярных органических растворителей, способности к сорбции красителей превосходит известный из литературы прототип, полученный с помощью хлоридной ИЖ. Выявлено ингибирующее действие по неконкурентному механизму ацетатной ИЖ на каталитическую активность нативных пероксидаз хрена и сои в реакции окисления гваякола пероксидом водорода; установлено влияние [ВМ1т][АсО] на оптические свойства индигокармина и пирони-на Б.

На основе пленок {целлюлоза-[ВМ1ш][С1]} созданы новые целлюлозные материалы с включенными в них растительными пероксидазами, сохраняющими свойства нативных биокатализаторов и стабильными при хранении при комнатной температуре. На примере комплексов европия(Ш) с тетрациклином показано, что целлюлозные пленки, приготовленные с использованием хлоридной ИЖ, служат удобной матрицей для иммобилизации флуоресцентных зондов, что открывает широкие возможности их дальнейшего применения для определения билирубина и других органических биологически активных соединений. Показана возможность измерения флуоресцентного аналитического сигнала непосредственно в целлюлозной пленке.

С использованием реакции окисления пиронина Б, катализируемой микропе-роксидазой-11 и комплексом {Мп(П)-додецилсульфат натрия}(известным из литературы миметиком пероксидазы), предложены новые индикаторные системы для чувствительного, селективного и экспрессного определения артемизинина в водных растворах и противомалярийных БАД. Показано, что пленки {целлюлоза-[BMIm][CI]} с включенными в них пиронином Б и синтетическим катализатором {Мп(Н)-додецилсульфат натрия} могут быть успешно применены в качестве чувствительного элемента флуоресцентного химического сенсора для определения артемизинина в противомалярийных БАД.

Практическая значимость. Получены, охарактеризованы и апробированы в различных индикаторных системах оптически прозрачные целлюлозные пленки, полученные с использованием [BMIm][AcO] и [ВМ1т][С1], в отсутствие и в присутствии иммобилизованных в них аналитических реагентов. Показаны перспективы применения пленок {целлюлоза-[ВМ1т][АсО]} в качестве сорбентов синтетических красителей (индигокармина и пиронина Б), а также природных пищевых красителей кармина, куркумина, р-каротина.

Пленки {целлюлоза—[BMIm][Cl]} с включенными в них растительными перок-сидазами и нативные биокатализаторы каталитически активны в реакциях превращения одних и тех же субстратов; пленки сохраняют каталитическую активность на уровне не ниже 50% от их активности в день приготовления в течение 1 месяца; могут быть использованы повторно. Установленные закономерности растворения гемсодержащих белков в растворе {целлюлоза-[ВМ1ш][С1]}, а также данные о механизме действия ацетатной ИЖ на их каталитическую активность позволяют на этапе иммобилизации целенаправленно выбирать биокатализатор.

Практическую значимость имеют разработанные флуориметрические методики чувствительного, селективного и экспрессного определения артемизинина по реакции его взаимодействия с пиронином Б в присутствии микропероксидазы-11 и комплекса {Mn(II)—додецилсульфат натрия}, позволяющие определять артемизи-нин в диапазонах его концентраций 0.1 — 7 и 0.2 — 8 мкМ соответственно. На основе индикаторной системы с пиронином Б и катализатором {Mn(II)— додецилсульфат натрия}, включенной в состав пленки {целлюлоза-[ВМ1ш][С1]}, разработана методика определения 0.25 - 8 мкМ артемизинина. Указанные методики успешно апробированы для определения артемизинина в противомалярийных БАД «BestArtemisinin» и «Artemisia annua intense». Автор выносит на защиту:

• установленные условия приготовления пленок {целлюлоза-[ВМ1ш][АсО]} и {целлюлоза—[BMIm][Cl]} в отсутствие и присутствии нековалентно иммобилизованных реагентов, их состав и условия функционирования в изученных индикаторных системах с визуальной, спектрофотометрической и флуоресцентной индикацией аналитического сигнала;

• сравнительные данные о механической прочности, эластичности, оптической прозрачности пленок двух видов, а также их устойчивости к действию водных растворов различной кислотности (в отсутствие и присутствии буферных рас-

творов), а также полярных молекулярных органических растворителей (ацето-нитрила, ДМСО, ДМФА);

• результаты изучения кинетики реакций окисления гваякола пероксидом водорода, катализируемых нативными пероксидазами хрена и сои, в присутствии различных содержаний [BMIm][AcO]; данные о механизме ингибирующего действия ацетатной ИЖ на каталитическую активность растительных пероксидаз; рекомендации по выбору гидрофильных ИЖ, в среде которых пероксидазы хрена и сои в наибольшей степени сохраняют свои каталитические свойства;

• данные о каталитической активности, субстратной специфичности и стабильности пероксидаз хрена и сои в составе пленок {целлюлоза-[ВМ1ш][С1]} при их хранении;

• результаты сравнительного изучения сорбции анионного красителя индигокар-мина и катионного красителя пиронина Б пленками {целлюлоза-[ВМ1т][С1]} и {целлюлоза-[ВМ1т][АсО]}, а также пленками {целлюлоза-ИЖ-ПАВ};

• новые индикаторные системы для определения артемизинина, основанные на уменьшении флуоресценции пиронина Б вследствие его окисления эндоперок-сидом в присутствии микропероксидазы-11 и комплекса {Mn(II)— додецилсульфат натрия}; кинетические характеристики каталитических индикаторных реакций; данные о механизме тушения флуоресценции пиронина Б ар-темизинином; методики определения артемизинина в модельных растворах и БАД;

• способ флуориметрического определения артемизинина с помощью индикаторной системы {пиронин Б-Мп(П)-додецилсульфат натрия}, включенной в состав пленки {целлюлоза—[ВМ1ш][С1]}, а также результаты определения артемизинина в противомалярийных БАД с помощью предложенной целлюлозной пленки. Апробация работы. Основные результаты работы доложены на 10 международных и всероссийских конференциях, симпозиумах, съездах и форумах, включающих 2nd Russian-Hellenic symposium with international participation and young scientist's school (Ираклион, Крит, Греция, 2011), 16th European conference on Analytical Chemistry «Challenges in modern analytical chemistry», «Euroanalysis-2011» (Белград, Сербия, 2011), 1-ую республиканскую научно-практическую конференцию с международным участием «Зеленая химия - в интересах устойчивого развития» (Самарканд, Узбекистан, 2012), 3rd Symposium on Enzymes & Biocatalysis-2012 (Сиань, Китай, 2012), Всероссийскую конференцию с международным участием по аналитической спектроскопии (Краснодар, Россия, 2012), конференции РХО им. Д.И. Менделеева «Химическая технология и биотехнология новых материалов и продуктов» (Москва, Россия, 2012 и 2014), International conference «Biocatalysis 2013» (Москва, Россия, 2013), II-ой Съезд аналитиков России (Москва, Россия, 2013), международный междисциплинарный форум ученых и инженеров, специализирующихся в области сенсорных технологий «BioTech 2014. Chemical Sensors Forum» (Веденсвиль, Швейцария, 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 10 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 2 глав обзора литературы, 1 главы экспериментальной части, 4 глав обсуждения результатов, выводов, приложений, списка литературы, включающего 250 источников. Работа изложена на 219 страницах машинописного текста, содержит 123 рисунка и 32 таблицы.

Во Введении обоснована актуальность работы, сформулированы ее цели и задачи, научная новизна и практическая значимость.

Обзор литературы включает 2 главы. В первой главе систематизированы и обсуждены различные аспекты использования ИЖ в составе оптических систем и сенсоров, в том числе биосенсоров. Приведены примеры сенсорных материалов, полученных с применением ИЖ, описаны методики их получения, дизайн, структура, принципы работы и условия функционирования. Обсуждены достоинства полученных с помощью ИЖ оптических сенсорных материалов, продемонстрированы их возможности в химическом анализе, намечены пути дальнейшего их усовершенствования и перспективы применения. Во второй главе представлен критический обзор известных колориметрических, спектрофотометрических и люминесцентных методик определения артемизинина и его полусинтетических производных в растительном сырье, фармацевтических препаратах, биологических жидкостях. Обсуждены достоинства и недостатки различных подходов к определению артемизинина и его производных спектроскопическими методами.

Экспериментальная часть работы содержит одну главу (3). В третьей главе перечислены исходные вещества, их характеристики, использованное оборудование; приведены методики приготовления растворов и целлюлозных пленок различного состава, методики проведения индикаторных реакций в растворе и в целлюлозных пленках, а также способы обработки результатов измерений.

Обсуждение результатов представлено в четырех главах (4 — 7). В четвертой главе обоснован выбор целлюлозы как носителя иммобилизованных аналитических реагентов и ИЖ как растворителя целлюлозы, а также индикаторных систем и определяемых соединений. В пятой главе описаны экспериментальные этапы приготовления целлюлозных пленок с использованием [ВМ1ш][АсО] и [ВМ1ш][С1], приведены сравнительные данные об их физико-механических и оптических свойствах, а также устойчивости к действию водных растворов различной кислотности и полярных молекулярных органических растворителей. Приведены результаты изучения морфологии поверхности целлюлозных пленок двух видов. Глава шесть посвящена разработке методик иммобилизации в целлюлозные пленки растительных пероксидаз, синтетических красителей (индигокармина и пиронина Б), а также флуоресцентных зондов, комплексов Еи(Ш) с дипиколиновой кислотой и тетрациклином. Обсуждены специфические экспериментальные особенности иммобилизации в пленки каждого из упомянутых реагентов; описаны характеристические свойства полученных целлюлозных материалов, установлены условия регистрации их сигнала визуальным и спектроскопическими методами в отсутствие и присутствии артемизинина. Приведены результаты кинетических исследований с участием растительных пероксидаз в присутствии ацетатной ИЖ, поясняющие причины потери в ней каталитической активности ферментов. Представлены данные о выявленной сорбционной способности пленок {целлюлоза—[ВМ1ш][АсО]} по отношению к ин-

дигокармину и ряду природных пищевых красителей. В главе семь представлены результаты изучения катализируемой микропероксидазой-11 и комплексом {Мп(П)-додецилсульфат натрия} реакции окисления пиронина Б артемизинином. Они включают данные по выбору условий проведения индикаторной реакции с участием биологического и синтетического катализаторов, результаты расчета кинетических параметров каталитических реакций, данные о механизме тушения флуоресценции пиронина Б, а также аналитические характеристики разработанных методик определения артемизинина в модельных растворах и БАД. Отдельное внимание уделено вопросам подготовки проб БАД к анализу. Экспериментально обоснован выбор состава пленки, полученной с использованием [ВМ1т][С1] с включенной в нее индикаторной системой {пиронин Б—Мп(П)-додецилсульфат натрия} и условий ее функционирования в присутствии артемизинина. Разработан способ флуориметрического определения артемизинина с использованием указанной пленки в модельных растворах и в БАД. Аналитические характеристики определения артемизинина с использованием целлюлозной пленки сопоставлены с таковыми, полученными с помощью разработанной нами методики в растворе и других известных из литературы спектроскопических методик.

В Заключении обобщены результаты сравнительного изучения физико-механических, оптических и функциональных свойств пленок, приготовленных методом растворения-осаждения целлюлозы в ацетатной и хлоридной ИЖ, в отсутствие и в присутствии включенных в них аналитических реагентов. Обсуждены результаты применения полученных целлюлозных материалов в реакциях с участием растительных пероксидаз для сорбции синтетических и природных красителей и определения артемизинина. Высказаны соображения о дальнейших путях усовершенствования предложенных пленочных материалов в качестве чувствительных элементов оптических химических сенсоров и перспективах их использования в химическом анализе для определения биологически активных органических соединений.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В качестве матрицы для иммобилизации аналитических реагентов выбрали микрокристаллическую целлюлозу, что связано с ее способностью к сорбции и более высокой по сравнению с необработанной целлюлозой реакционной способностью, благодаря чему ее можно легко модифицировать для достижения определенных функциональных свойств. Кроме того, препарат микрокристаллической целлюлозы коммерчески доступен, имеются литературные сведения о ее растворении в различных растворителях, в том числе ИЖ.

Применение ИЖ в качестве растворителя микрокристаллической целлюлозы (далее просто целлюлозы) позволяет придавать ей практически любую желаемую тестовую форму, что открывает возможность получения новых материалов для сенсорных технологий. В современной литературе наилучшими растворителями целлюлозы признаны гидрофильные хлоридные и ацетатные ИЖ на основе катиона имидазолия. Мы выбрали [ВМ1т][С1] и [ВМ1т][АсО], поскольку методики и причины растворения целлюлозы в этих ИЖ наиболее изучены, а их препараты дешевле других ИЖ не менее, чем в 3-7 раз. Пленки на основе целлюлозы, реге-

нерированной из ацетатной ИЖ, никто ранее не получал, лишь изучали процесс растворения в ней целлюлозы.

Для выяснения перспектив применения ИЖ в сенсорных биотехнологиях, в частности для разработки оптических химических сенсоров на основе растительных пероксидаз, выбрали коммерческие, высокоактивные и стабильные перокси-дазы, выделенные из корней хрена (ПХ) и шелухи сои (ПС). Литературные сведения об иммобилизации растительных пероксидаз в целлюлозные пленки, приготовленные с помощью ИЖ, отсутствовали.

Для создания пленок с иммобилизованными красителями в качестве модельного анионного красителя выбрали индигокармин, который растворим в воде, интенсивно окрашен, обладает восстановительными свойствами и является субстратом ПХ и ПС. Индигокармин (рис. 1а) — наиболее распространенный синий краситель хлопка и шерстяных волокон вследствие его сродства к целлюлозным волокнам. В фармацевтической промышленности индигокармин применяют для придания товарного вида таблеткам и драже, в медицинской диагностике — для подкрашивания живых тканей и определения концентрации пероксидазы в крови. Индигокармин является канцерогеном, вызывает серьезные аллергические реакции, провоцирует проблемы с сердцем и приступы удушья, поэтому контроль содержания этого красителя в продуктах питания, лекарственных препаратах, косметических средствах чрезвычайно важен. Мы предполагали, что на основе целлюлозных пленок с иммобилизованными растительными пероксидазами нам удастся создать материалы для определения индигокармина в продукции кондитерских, фармацевтических и текстильных производств.

В качестве модельного катионного красителя использовали ксантеновый краситель пиронин Б, который так же, как индигокармин растворим в воде и интенсивно окрашен, но помимо этого обладает интенсивной флуоресценцией в водных и спиртовых растворах. Выбор пиронина Б (рис. 16) обусловлен, прежде всего, тем, что явление тушения флуоресценции именно этого красителя было положено в основу ряда известных из литературы чувствительных методик определения АМ в сыворотке крови с использованием некоторых гемсодержащих биокатализаторов (Гб, ПХ, цитохрома с, тирозиназы). Из литературы известно, что синтетические аналоги оксидоредуктаз, например комплекс Мп(И) с анионным ПАВ додецил-сульфатом натрия (ДЦС), катализирует реакцию окисления ПБ пероксидом водорода. По мере протекания реакции интенсивность флуоресценции красителя уменьшается пропорционально концентрации Н2О2. Поскольку АМ содержит пе-роксидный мостик в своей структуре (рис. 1в), можно было ожидать проявления подобного эффекта при замене Н2О2 на АМ.

Рис. 1. Структурные формулы индигокармина (а), пиронина Б (б) и АМ (в).

о

а

б

в

Кроме ферментов и красителей в целлюлозные пленки можно импрегнировать комплексы лантаноидов (Еи3+ и ТЬ3+) с органическими лигандами, например с ди-пиколиновой кислотой (ДПК). Практическая значимость пленок {целлюлоза-[ВМ1т][С1]} с иммобилизованными в них комплексами Еи(ДПК)з-2НгО и ТЬ(ДПК)з-2НгО продемонстрирована в литературе на примере селективного определения ионов Си(П), основанного на эффекте тушения ими сенсибилизированной флуоресценции указанных хелатов лантаноидов. Целлюлозные пленки такого вида ранее не использовали для определения органических соединений.

Иммобилизация в целлюлозные пленки второго флуоресцентного зонда, комплекса {Еи(Ш)-ТЦ}, открывает возможности определения и артемизинина, и билирубина. Комплекс {Еи(Ш)-ТЦ} используют для определения низких концентраций Н2О2. Определение основано на увеличении интенсивности флуоресценции комплекса {Еи(Ш)—'ГЦ} вследствие образования тройного комплекса {Еи(Ш)-ТЦ-Н2О2}. Следовало ожидать проявления подобного действия при замене пероксида водорода на АМ. Щелочной раствор билирубина, согласно литературным данным, напротив, способен гасить флуоресценцию комплекса {Еи(Ш)-ТЦ}.

Получение целлюлозных пленок с использованием ИЖ

Основная задача первого этапа исследования состояла в выяснении условий получения целлюлозных пленок с помощью ацетатной ИЖ. Методика приготовления пленок {целлюлоза-[ВМ1т][С1]} была известна из литературы, однако для сравнения условий получения целлюлозных пленок с использованием ацетатной и хлоридной ИЖ и, что особенно важно, их функциональных характеристик и перспектив применения для определения органических соединений, что не было известно из литературы; эксперименты проводили параллельно с двумя ИЖ.

Методика получения целлюлозных пленок включала растворение целлюлозы в ИЖ, раскатку пленок, их охлаждение, промывание антирастворителем для осаждения целлюлозы и вымывания избыточных количеств ИЖ, разрезание пленки на тест-формы, размер которых зависел от используемого в дальнейшем способа индикации аналитического сигнала пленки (визуального, спектрофотометрическо-го или флуоресцентного). Толщина полученных целлюлозных пленок, измеренная микрометром в разных местах, составляла 150-200 мкм. Схема подготовки целлюлозных пленок к работе приведена на рис. 2.

Раскатка пленки на горячем стекле, охлаждение и промывание антирастворителем

_. □□

□ □

[ВМ1ш][АсО] или [BMIm][Cl]

85/50°

Разрезание пленки на тест-формы

Микрокристаллическая целлюлоза в отсутствие и присутствии фермента или красителя и/или комплексов Рис. 2. Схема подготовки целлюлозных пленок к работе.

Установили, что пленки приемлемой прочности и плотности, необходимой для последующей иммобилизации реагентов, получаются из растворов целлюлозы в [ВМ1ш][АсО] и [ВМ1ш][С1] при ее содержаниях 14 и 4% масс, соответственно. Температура растворения целлюлозы в ацетатной ИЖ и природа антирастворителя, как мы показали, влияют на прозрачность и прочность полученных пленок (табл. 1, 2). Наиболее прозрачными и одновременно прочными являются пленки {целлюло-за-[ВМ1т][АсО]}, приготовленные из раствора, нагретого до 50°С, при использовании в качестве промывной жидкости этанола. Для пленок [целлюлоза-ВМ1ш][С1]} наиболее подходящей промывной жидкостью была признана вода.

Таблица 1. Величины прозрачности целлюлозных пленок, полученных из растворов целлюлозы в [ВМ1т][АсО] при разных температурах с использованием разных промывных жидкостей (350-700 нм; п = Ъ,Р= 0.95)

Промывная Т, % пленок,

жидкость полученных при различной температуре (°С) растворения

50 60 66

Вода 5.7±0.5 3.6±0.1 2.8±0.1

Этанол 87.0±0.3 76.1±0.3 69.8±0.1

Ацетонитрил 5.8±0.7 6.7±0.8 71.1±0.5

Прозрачность материала {целлюлоза-ВМ1ш][С1]} на 7% выше, чем у пленок на основе ацетатной ИЖ (табл. 2), тем не менее, существенным преимуществом пленок {целлюлоза-[ВМ1ш][АсО]} является их прочность и эластичность, количественные характеристики которых превышают эти величины для пленок {цел-люлоза-ВМ1т][С1]} в 2.5 и 9.5 раз соответственно.

Выбранные нами условия получения целлюлозных плёнок с помощью ацетатной и хлоридной ИЖ систематизированы в табл. 3.

При изучении влияния растворов различной кислотности на функциональные свойства полученных пленок (рис. 3) выяснили, что они наиболее прочные и эластичные в водных нейтральных растворах и наименее прочные (прочность в 6 раз ниже, чем в фосфатном буферном растворе, ФБР) — в ацетатном буферном растворе (АБР) с рН 3.8. Прочность пленок целлюлоза-[ВМ1т][АсО]} в боратном буферном растворе (ББР) с рН 8.9 сопоставима с таковой в 0.1М растворе НС1.

Таблица 2. Зависимость оптических и механических свойств пленок от температуры расплава {целлюлоза-ИЖ} (п = 3, Р = 0.95)_

1, °С Прозрачность, % Прочность, Эластичность

МПа (относительное удлинение, %)

Пленка, приготовленная из расплава {целлюлоза-[ВМ1т][АсО]}

50 87.0±0.3 12.47 19.22

60 76.1±0.3 4.39 21.80

66 69.8±0.1 4.20 11.99

Пленка, приготовленная из расплава {целлюлоза-ВМ1ш][С1]}

85 94±3 7.86 1.31

Таблица 3. Выбранные условия получения пленок {целлюлоза-[ВМ1т][АсО] | и {целлюлоза-[В Mim] [С1]}

Параметр Выбранное значение

[ВМ1ш][АсО] [ВМ1ш][С1]

Содержание целлюлозы, % масс, по от- 14 4

ношению к ИЖ

Время растворения, ч 7

Нагрева, °С 50 85

Антирастворитель Этанол Вода

Объем антирастворителя, мл 15

Время промывания, мин 15

Тестовая форма при индикации сигнала

■ визуальным и спектрофотометриче- Квадрат размером 1x1 см2

ским методами

■ флуоресцентным методом Прямоугольник размером 1 х2 см2

Полярные молекулярные органические растворители, такие как ацетонитрил, ДМСО и ДМФА, примерно в 5 раз уменьшают прочность пленок {целлюлоза-[ВМ1т][АсО]} по сравнению с ее величиной в ФБР (рН 7.0), в то время как эластичность в их присутствии снижается всего лишь в 1.5 раза. Интересно, что разрушающее действие органического растворителя на целлюлозную пленку ослабляется с повышением его полярности в ряду ДМФА < ДМСО < ацетонитрил. Еще одна особенность целлюлозных пленок, полученных с применением ацетатной ИЖ: при выдерживании в течение 3 мин в ДМСО или ДМФА их прозрачность возрастала с (87±3)% (табл. 2) до (93±3)% и (92.9±0.2)% соответственно (п = 3,Р = 0.95), то есть становилась практически такой же. как у пленок {целлюлоза— [ВМ1т][С1]}. Однако при использовании в качестве промывной жидкости не этанола. а ДМСО или ДМФА, пленка не формируется.

£ 4

Z

I 2

а. с

1 О

ш

0.1MHCI 0.1М NaOH

АБР 3.8 ББР 8.9 ФБР 7.0

Эластичность а)

Эластичность б)

Рис. 3. Влияние природы и рН водных растворов в отсутствие (а) и в присутствии буферных растворов (б) на прочность и эластичность пленок {целлюлоза-[ВМ1т][АсО]}. Прочность пленок в воде составляет 17 МПа.

Результаты изучения морфологии полученных целлюлозных пленок методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) показали, что поверхность обеих пленок, в основном, ровная, за исключением некоторых дефектов, которые, как правило, возникают из-за раскатывания пленок вручную (рис. 4). Можно предполагать, что обе целлюлозные пленки могут служить хорошей матрицей для физической иммобилизации аналитических реагентов, а также, возможно, будут проявлять сорбционные свойства из-за большой площади их поверхности и внутреннего объема.

а) б)

Рис. 4. СЭМ фотографии пленок, полученных из растворов {целлюлоза— [ВМ1ш][АсО]} (а) и {целлюлоза-[ВМ1т][С1]} (б).

Создание пленок с иммобилизованными аналитическими реагентами

На следующем этапе исследования выбрали условия иммобилизации в целлюлозные пленки, приготовленные с помощью ацетатной и хлоридной ИЖ. аналитических реагентов - компонентов индикаторных систем. Методика иммобилизации отличалась тем, что реагенты иммобилизовали не в готовую матрицу (пленку), а добавляли в смесь для иммобилизации в процессе создания целлюлозного материала (рис. 2).

ПХ и ПС, иммобилизованные в пленки, полученные растворением-осаждением целлюлозы в [ВМ1т][АсО], обладали слабой каталитической активностью; значительно более высокую каталитическую активность они проявляли при иммобилизации в пленки, полученные из раствора {целлюлоза-[ВМ1т][С1]}, хотя температура раствора в этой ИЖ была на 35°С выше, чем в растворе в ацетатной ИЖ (табл. 3). Очевидно, причина потери активности пероксидазами состояла в различном по степени инактивирующем действии ацетатной и хлоридной ИЖ.

Изучив влияние [ВМ1т][АсО] на каталитическую активность нашивных ПХ и ПС, обнаружили, что при введении в реакционный раствор даже 10 об.% 0.5 М [ВМ1т][АсО] скорость реакции пероксидазного окисления гваякола резко уменьшалась по сравнению с таковой в отсутствие ИЖ. при этом каталитическая активность ПХ была выше, чем у соевого фермента в 1.7 раза. С повышением содержания [ВМ1т][АсО] остаточная каталитическая активность ПС убывала в меньшей степени, чем у ПХ. Например, при увеличении содержания ацетатной ИЖ от 10 до

25 об.% величина я,/яо" для ПХ понижалась более, чем в 30 раз, а для ПС — всего в 1.5 раза. При замене ФБР на воду с таким же значением рН обнаружили, что в отсутствие буфера в реакционном растворе в присутствии изученных содержаний [ВМ1т][АсО] соевый фермент еще проявляет 10% активности от ее величины в водной среде, в то время как ПХ инактивирована практически полностью уже при 25 об.% ИЖ. Для ПХ величины константы ингибирования, К,-, рассчитанные для установленного неконкурентного механизма, в системах [ВМ1ш][АсО] : ФБР и [ВМ1т][АсО] : НгО (10:90 об.%) составили соответственно (159 ± 6) и (21.2 ± 0.8) мМ; а для ПС - (80 ± 3) и (295 ± 10) мМ (п = 3, Р = 0,95). Очевидно, что при использовании ФБР в качестве сорастворителя ИЖ соевый фермент более чувствителен к действию ИЖ, чем ПХ, поскольку величина /0 для ПС в 7.5 раз меньше таковой для ПХ. Таким образом, каталитическая активность растительных перокси-даз зависит от природы фермента и сорастворителя ИЖ.

В дальнейших исследованиях применяли ферментсодержащие пленки, приготовленные с помощью хлоридной ИЖ.

Установили, что время (ч) растворения фермента/белка в расплаве {целлюлоза-[ВМ1ш][С1]} возрастало в ряду: 6 (ПХ) < 7 (Гб) < 10 (ПС) < 96 (пероксидаза арахиса), в котором убывали величины их р1: 8.2-9.0 > 7.0 > 4.1 > 3.89. Таким образом, катионные пероксидазы, как оказалось, растворяются быстрее анионных ферментов, кроме того, проявляют в целлюлозных пленках более высокую активность и стабильность.

Прозрачность целлюлозных плёнок (Т,%) оценивали спектрофотометри-ческгш методом в видимой области спектра. Для этого набухшую плёнку располагали на поверхности стекла, на котором она удерживалась силами адгезии. Стекло, размер которого соответствовал размеру кюветного отделения спектрофотометра, помещали в спектрофотометр «ЗЫтаски НУ гшт-1240А», измеряли поглощение плёнки относительно стекла, а затем рассчитывали её прозрачность. Прозрачность пленок, раскатанных из одного расплава составила (94±3)% (п=Ъ, Р= 0.95).

Для оценки каталитической активности биокатализаторов в плёнках {целлюло-за-[ВМ1ш][С1]} визуальным методом влажную пленку пинцетом аккуратно размещали на предметном стекле. В одну и ту же точку плёнки микродозатором последовательно наносили раствор арилдиамина (или катехоламина) и раствор пе— роксида водорода. При добавлении Н2Ог включали секундомер и фиксировали время появления в плёнке окраски определённой интенсивности. При проведении контрольного опыта использовали плёнку, не содержащую биокатализатор. В остальном методика эксперимента оставалась прежней.

5 Относительные активности растительных пероксидаз в среде ИЖ-буферный раствор по отношению к активности в водной среде (а,/яо) рассчитывали по формуле:

= , где tga¡ и tga<) - тангенсы угла наклона кинетических кривых в коор-

динатах оптическая плотность (А) - время (/, с) в присутствии и отсутствие ИЖ соответственно.

Пленки {целлюлоза-[ВМ1ш][С1]} не изменяют химизм индикаторных реакций окисления арилдиаминов: 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ), о-дианизидина («-ДА) и о-фенилендиамина (о-ФДА); а также катехоламинов: а-метилдопы, до-памина, адреналина и добутамина и пирокатехина. Скорости индикаторных реакций с участием ПХ возрастали в последовательности, соответствующей рядам субстратной специфичности нативного фермента (в скобках указаны величины \ogPy. о-ФДА (0.32) « о-ДА (1.65) = ТМБ (4.02); адреналин (-1.37) < а-метилдопа (—1.7) < допамин (-0.98) < добутамин (3.6). Аналогичную последовательность наблюдали и для ПС; исключение составляли адреналин и добутамин, которые не превращались соевым биокатализатором. Важно, что нековалентно иммобилизованные в целлюлозные пленки ПХ и ПС сохраняли 54 и 58% исходной каталитической активности соответственно, несмотря на присутствие больших количеств (96% масс.) высоко полярной [ВМ1т][С1] и нагревание смеси до 85°С в течение 7 ч (табл. 3). Мы полагаем, что сохранение каталитической активности растительных пероксидаз в составе пленок {целлюлоза-[ВМ1т][С1]} обусловлено не только уникальной структурой целлюлозных материалов, приготовленных с использованием ИЖ, но и менее выраженным по сравнению с [ВМ1т][АсО] ингибирующим действием хлоридной ИЖ.

Установили, что при хранении полученных ферментсодержащих пленок при комнатной температуре в набухшем состоянии в плотно закрытом контейнере в отсутствие доступа воздуха ПХ и ПС в составе целлюлозных пленок в течение 35 дней сохраняли не менее 80 и 70% каталитической активности соответственно от ее величины в день приготовления пленок. Данные о стабильности других ферментов, иммобилизованных в целлюлозные пленки, в литературе отсутствуют. На примере пленок, содержащих ПХ, показали возможность их повторного использования в реакции окисления ТМБ пероксидом водорода после отмывки продуктов индикаторной реакции водой.

Таким образом, в результате проведенных нами исследований установлено, что ПХ и ПС могут быть эффективно иммобилизованы в оптически прозрачные, гибкие и прочные целлюлозные пленки, полученные путем растворения-регенерации микрокристаллической целлюлозы в [ВМ1т][С1]. Такие целлюлозные пленки с растительными пероксидазами выгодно отличаются от существующих аналогов, особенно от целлюлозных пленок с нековалентно иммобилизованной лакказой, с большей в 3 раза остаточной каталитической активностью, и, следовательно, большей скоростью превращения субстрата (индикаторные реакции протекают в течение 1-2 мин, а не 12 ч и более). Иммобилизованные пероксидазы сохраняют не менее 50% своей первоначальной каталитической активности, что, очевидно, является показателем «дружелюбности» хлоридной ИЖ по отношению к этим ферментам. Напротив, ацетатная ИЖ является эффективным неконкурентным ингибитором растительных пероксидаз как нативных, так и иммобилизованных в целлюлозную пленку. Ингибирующее действие ацетатной ИЖ на каталитическую активность ПХ и ПС обусловлено, главным образом, действием ее аниона. К сожалению, применять пленки {целлюлоза-[ВМ1т][АсО]} для иммобилизации ПХ и ПС невозможно.

Создание пленок {целлюлоза-ИЖ-краситель}

При иммобилизации индигокармина (ИК) и пиронина Б (ПБ) в целлюлозные пленки двух видов установили, что после добавления навесок ИК и ПБ к смесям {целлюлоза-[ВМ1т][С1]} и {целлюлоза-[ВМ1т][АсО]} и при растворении в них анионный и катионный красители ведут себя по-разному. Более того, поведение одного и того же красителя в присутствии хлоридной и ацетатной ИЖ различно.

Анионный ИК растворяется в обеих ИЖ, однако если в [ВМ1ш][С1] оптические и кислотно-основные свойства красителя практически такие же, как в водном растворе, то в [BMIm][AcO] оптические свойства ИК изменяются вследствие химических взаимодействий красителя с растворенным в ИЖ кислородом и целлюлозой. В результате иммобилизованные препараты ИК, приготовленные с помощью ацетатной ИЖ, окрашены в сине-зеленый цвет, а не в синий как пленки {целлюлоза— [ВМ1гп][С1]-ИК}.

Аналогичная ситуация наблюдалась и в случае ПБ: при растворении в [ВМ1ш][С1] краситель сохранял свои оптические свойства, однако при растворении в [BMIm][AcO] его характерная малиновая окраска заметно ослабевала, а пленки {целлюлоза—[ВМ1т][АсО]-ПБ} имели бледно-вишневую окраску, а не малиновую, как пленки {целлюлоза-[ВМ1т][С1]}. В спектре флуоресценции пленок {целлюлоза—[ВМ1ш][АсО]—ПБ} характерный для ПБ максимум флуоресценции при 581 нм (Хвозб= 355 нм) отсутствует, а интенсивность флуоресценции мало отличается от ее фоновых значений (8-9 усл. ед.) в интервале длин волн 540-640 нм.

Для измерения флуоресцентного сигнала пленку размером 1><2 см2 помещали на зеркальную пластину размером 1x2.5 см2, которую использовали в качестве отражающей поверхности. Полученную конструкцию устанавливали в специальное отделение спектрофлуориметра «Agilent Technologies Сагу Eclipse», где закрепляли с помощью зажима, отрегулировав расстояние (самое близкое) и угол (35°) по отношению к источнику возбуждения. Регистрировали спектр флуоресценции целлюлозной пленки при соответствующей длине волны возбуждения флуорофора (пиронина Б, а далее и комплексов Eu(lII) с дипиколиновой кислотой и тетрациклином) или измеряли интенсивность флуоресценции при соответствующей длине волны испускания. Контрольный опыт во всех экспериментах проводили с пленкой без флуорофора, полученной с применением той же ИЖ, что и пленка с флуо-рофором.

Проведенные исследования показали, что хлоридная ИЖ более «дружелюбна» не только к пероксидазам, но и к изученным синтетическим красителям, поскольку их оптические свойства практически не изменяются при иммобилизации в пленки {целлюлоза—[ВМ1т][С1]}.

Обнаружили, что ПБ удерживается в пленках двух видов лучше, чем ИК, причем при использовании пленок, приготовленных с помощью хлоридной ИЖ, вымывание ПБ минимально (0.31±0.03%, п = 3, Р= 0.95). Степень вымывания ПБ из пленки {целлюлоза-[ВМ1т][С1]} не изменяется даже после выдерживания пленки в течение суток не только в наилучшем антирастворителе этаноле, но и в воде. Как и в случае растительных пероксидаз, катионный краситель ПБ удерживается пленкой [целлюлоза-[ВМ1т][С1]} лучше, чем анионный. Более того, ПБ в составе этой пленки сохраняет способность поглощать и флуоресцировать в том же диапазоне

длин волн, что и его водный раствор. Эта целлюлозная пленка в дальнейшем была использована для определения АМ.

Проверка сорбционпои способности целлюлозных пленок без красителей по отношению к ИК и ПБ (рис. 4) показала, что степень сорбции ИК пленками {цел-люлоза-[ВМ1т][С1]} не превышает 13%. однако уже через 2 ч выдерживания пленки в растворе красителя он десорбируется. Напротив, степень сорбции ИК пленкой [целлюлоза-[ВМ1ш][АсО]} достигает 71% через 6 ч ее пребывания в водном растворе ИК, и даже через сутки пленка продолжает удерживать краситель. При обработке пленки 0.1 М раствором №ОН сорбированный ИК легко вымывается из нее, что позволяет использовать пленку, по меньшей мере, еще один раз

Для повышения степени сорбции синтетических красителей в целлюлозные пленки в их состав включили ПАВ (анионный додецилсульфат натрия, ДДС, и катионный, цетил-триметиламмония бромида). При этом мы не достигли желаемых результатов, тем не менее выявленная возможность иммобилизации анионного ДДС в пленку {целлюлоза— [ВМ1т][С1]} и сродство к ней ПБ в Рис. 4. Кинетика сорбции ИК из его вод- дальнейшем оказались полезными ного 30 мкМ раствора пленками {целлю- при ИзуЧении возможностей исполь-лоза-[ВМ1т][АсО]} (•) и {целлюлоза- 30Вания системы {ПБ-Мп(П)-ДЦС} [ВМ1ш][С1]} (о). для определения дм.

Поскольку пленки состава {целлюлоза—[ВМ1т][АсО]} оказались хорошими сорбентами для ИК, синтетического производного природного красителя индиго, изучили сорбционные свойства по отношению к другим, природным пищевым красителям различной природы (куркумину, кармину и р-каротину). При комнатной температуре зависимости степени сорбции куркумина и кармина от рН не имели выраженных максимумов, по-видимому, вследствие одновременного присутствия в растворе двух-трех ионных форм из-за небольших различий в величинах их ступенчатых констант кислотности. Напротив, в случае р-каротина наблюдается отчетливый максимум при рН 5.0—5.5. Степени сорбции куркумина, кармина и Р-каротина были наибольшими при рН 4.5; 6.5 и 5.5 соответственно. При повышении температуры растворов красителей их сорбция в целлюлозные пленки увеличивалась. Как при комнатной, так и при повышенной температурах водных и водно-органических растворов степень сорбции возрастала в ряду (1о£Р): р-каротин (17.62) < кармин (0.97) < куркумин (3.29). Проведенные исследования показали, что пленки {целлюлоза-[ВМ1т][АсО]} могут представлять интерес как новый материал для сорбции синтетических и пищевых красителей из их водных и водно-органических растворов.

без существенной потери в ее емкости.

70

55 60 оГ

1 50 I 40

со

г зо

л

5 20

с

£

С ю

0 I

100 ^ мин

200

Изучение возможности применения пленок {целлюлоза-ИЖ} в качестве матрицы для иммобилизации флуоресцирующих комплексов, на примере дипиколината европия(Ш), Еи(ДПК)з, и комплекса {Еи(Ш)-тетрациклин}

Получили оптически прозрачные флуоресцирующие пленки состава {целлюло-за-[ВМ1ш] [ АсО]-Еи(ДПК)з} и {целлюлоза-[ВМ1ш][С1]-Еи(Ш)-тетрациклин (ТЦ)}, которые могут служить потенциальными чувствительными элементами флуоресцентных химических сенсоров. Сопоставление интенсивностей флуоресценции пленок {целлюлоза-[ВМ1т][С1]} с иммобилизованными комплексами Еи(ДПК)з и {Еи(Ш)-ТЦ} при одинаковом их содержании (0.2 мг) показало, что сигнал комплекса с ТЦ при 617 нм (наиболее интенсивная полоса в спектре флуоресценции Еи(Ш) и его комплексов) превышает таковой для дипиколината евро-пия(Ш) в 26 раз. Пленка {целлюлоза-[ВМ1ш][АсО]-Еи(ДПК)з} даже при содержании комплекса 0.7 мг флуоресцирует в 10 раз слабее пленки {целлюлоза-[ВМ1т][С1]-Еи(Ш)-ТЦ} с содержанием флуорофора 0.2 мг.

Изучение в растворе систем {Еи(Ш)-ТЦ} в присутствии АМ и билирубина (БР) показало, что АМ вследствие стерических затруднений не влияет на флуоресцентный сигнал комплекса, а действие БР оказалось более сложным, чем можно было предположить на основании литературных данных. Следовательно, необходимы дальнейшие исследования системы {Еи(Ш)-ТЦ-БР} в растворе, прежде чем ее будет возможно перенести в целлюлозные пленки.

Создание методик определения артемизинина в растворе и с использованием пленок {целлюлоза-[ВМ1т![С1]} с иммобилизованным реагентом

Ранее мы показали, что пленки {целлюлоза-[ВМ1ш][С1]-ПБ} обладают интенсивной флуоресценцией (ХВозб = 355 нм, Лфл = 581 нм), хорошо удерживают катион-ный ксантеновый краситель ПБ и поэтому являются перспективным материалом для использования в сенсорных флуоресцентных системах для определения АМ. На основании литературных данных выбрали две индикаторные флуоресцентные системы для определения АМ, основанные на реакции окисления ПБ в присутствии АМ, только в одной системе катализатором служит МП, а в другой — синтетический аналог ПХ, комплекс {Мп(И)-ДДС}. Действие АМ в указанных индикаторных системах ранее не было изучено, поэтому созданию целлюлозных пленок с включенными в них компонентами указанных индикаторных систем предшествовало изучение реакций в растворе.

В результате изучения влияния многочисленных параметров на величину аналитического сигнала индикаторной системы: рН и природы буферного раствора, концентраций ПБ, МП, {Мп(П)-ДДС} (а также их соотношения), времени регистрации сигнала, природы органического растворителя АМ, выбрали параметры, представленные в табл. 4.

Таблица 4. Условия проявления наибольшего действия АМ в системах ПБ—МП и ПБ—{Мп(П)—ДДС} (универсальный буферный раствор; Хвозб. = 345 НМ, Лфл. = 569 нм, ширины входной и выходной щелей — 5 нм)

Выбранные параметры

Система рН СПБ, мкМ с(катализатора), Время проведения

мкМ реакции, мин

ПБ-МП 5.0-6.2 2 4 1

ПБ-{Мп(Н)—ДДС} 5.9 2 100 2

Выбранные нами условия тушения артемизинином флуоресценции ПБ в изученных системах похожи; различаются между собой, главным образом, концентрации катализаторов. Концентрация МП в 25 раз меньше концентрации комплекса {Мп(П)-ДДС}. Дополнительным преимуществом биокаталитической системы является диапазон в единицу рН, в котором наиболее эффективно действие АМ. В выбранных условиях разработали методики определения АМ (табл. 5).

Таблица 5. Аналитические характеристики разработанных флуориметрических методик определения АМ с использованием индикаторных систем в растворе

Система ДОКа, мкМ Уравнение градуиро-вочной зависимости (и= 8,Р=0.95) г £гПрИ Сн (/7=5) Смин, мкМ

ПБ-МП 0.1-7 / = (0.101 ±0.003)* + (1.060 ±0.010) 0.9970 0.008 0.07

ПБ-{Мп(П)-ДДС} 0.2-8 у= (0.0622 ±0.0009)х+-(1.035 ±0.004) 0.9993 0.007 0.12

"Диапазон определяемых концентраций.

6у — 1о/1, отношение сигнала контрольного опыта к полезному сигналу, х — с, мкМ.

Сопоставление коэффициентов чувствительности и ДОК двух методик показывает, что система с биологическим катализатором позволяет определять АМ с большей чувствительностью практически в том же диапазоне концентраций. Более низкий предел обнаружения АМ с использованием системы ПБ—МП связан, по нашему мнению, с отсутствием влияния МП на сигнал, в то время как комплекс {Мп(П)—ДДС} проявляет слабое собственное тушение.

Данные о влиянии посторонних веществ на результаты определения АМ представлены в табл. 6.

Результаты изучения кинетики индикаторных реакций в присутствии АМ, расчета и сопоставления их кинетических параметров, а также аналитических характеристик методик показали, что для определения АМ использование индикаторной системы ПБ—МП предпочтительнее, чем системы ПБ—{Мп(П)—ДДС}. Кроме того, в присутствии МП эффект установленного нами динамического тушения АМ флуоресценции ПБ выражен в 2 раза сильнее. Селективность определения изученных соединений и экспрессность разработанных методик сопоставимы, что позволяет использовать их для определения АМ в одних и тех же БАД. Единственным

недостатком ферментативной системы можно считать ее большую «уязвимость» к действию этанола.

Таблица 6. Влияние посторонних веществ на результаты определения 1 мкМ АМ с использованием индикаторных систем в растворе

Компонент Система ПБ-МП Система ПБ- 'Мп(11)-ДДС|

Отношение А", % Отношение А, %

£АМ Х'постор в-во сам: Спостор. в-ва

Fe(II) 1 10 +4.8 1 40 +4.9

Fe(III) 1 10 +4.5 1 10 -3.8

Co(II) 1 20 +4.0 1 30 +4.3

Mn(II) 1 20 +4.1 1 10 +4.4

Cu(II) 1 15 +4.9 1 30 +4.0

Mg(II) 1 30 -4.7 1 20 +3.9

Фруктоза 1 50 -4.6 1 70 -4.0

Глюкоза 1:1000 +4.7 1:1000 +4.9

" Относительная погрешность приведена с учетом знака, чтобы показать увеличение/уменьшение сигнала при введении постороннего вещества.

Флуориметрическое определение артемизинина в биологически активных добавках. С целью апробации разработанных методик определения AM с использованием систем ПБ-{Мп(П)-ДДС} и ПБ—МП проанализировали БАД «Best Artemisinin» и «Artemisia annua intense», применяемые для лечения и профилактики малярии. В последнее время лекарственные средства на основе полыни Artemisia annua L. используют также для лечения рака, в особенности рака груди и лейкемии. Результаты флуориметрического определения AM методом добавок в препарате «Best Artemisinin» согласуются с данными производителя. Время анализа, включающего пробоподготовку, не превышает 6 ч.

Полученные на этом этапе результаты служат надежным практическим и теоретическим фундаментом для переведения выбранных индикаторных реакций из раствора в пленку {целлюлоза-[ВМ1т][С1]}.

Изучение выбранной индикаторной системы в целлюлозной пленке

Для переведения изученных нами в растворе каталитических индикаторных систем ПБ-МП и ПБ-{Мп(И)-ДДС} в целлюлозную пленку, приготовленную с помощью хлоридной ИЖ, необходимо было соиммобилизовать в пленку краситель и катализатор; выбрать подходящий состав реагентов в пленке; изучить влияние AM на флуоресценцию пленки с закрепленными в ней ПБ и катализатором, а затем оценить практическую значимость полученного целлюлозного материала при определении концентрации AM в модельных растворах, а также в растворах и экстрактах БАД.

Обнаружили, что иммобилизация в целлюлозную пленку как одного ДДС, так и Мп(П) совместно с ДДС понижает прочность пленки. Приемлемое для работы качество пленки обеспечивает мольное соотношение Мп(П):ДДС =1:1.

При проведении реакции в растворе наибольшее уменьшение сигнала ПБ в присутствии АМ наблюдалось при рН 5.9, при этом эффект тушения флуоресценции усиливался во времени. Однако скорость уменьшения сигнала пленки была заметно выше, чем в растворе. Это обстоятельство связано с частичным, хорошо воспроизводимым вымыванием красителя из пленки (,уг = 0.03, п = 3) в процессе проведения реакции. Во избежание потерь ПБ выбрали время проведения реакции 30 с, при котором вымывание ПБ не превышало 3%.

В выбранных условиях (рН 5.9, время реакции 30 с) изучили зависимость величины 10/1 пленки {целлюлоза-[ВМ1т][С1]-ПБ-Мп(П)-ДЦС} от концентрации АМ в модельных стандартных растворах. В табл. 7 сопоставлены аналитические характеристики определения АМ в пленках и растворе. Методика определения АМ в растворе отличается более низким пределом обнаружения и значительно более высокой воспроизводимостью результатов анализа.

Таблица 7. Аналитические характеристики определения АМ в системе ПБ-Мп(Н)—ДДС с помощью пленок {целлюлоза-[ВМ1т][С1]} и в растворе (для системы в пленки п=3, для системы в растворе п=8, Р = 0.95)

Регистрация сигнала (^возб./ фл.» нм) ДОК, мкМ (ir При Сн) Уравнение градуировочной зависимости 1о/1 = ЯСАМ + b г Смин, мкМ

а ±Д а b ±Д Ъ

мкМ'1

Пленка 0.25-8 (0.2) 0.13 0.02 1.2 0.2 0.9153 0.23

(355/581)

Раствор 0.2-8 (0.007) 0.0622 0.0009 1.035 0.004 0.9993 0.12

(345/569)

Наибольшее мешающее влияние на результаты определения 1 мкМ АМ, как и в случае раствора, оказывали ионы Fe(II), образующие комплекс с АМ, а также Н2О2, который в присутствии комплекса {Мп(Н)-ДДС} окисляет ПБ. В результате сигнал красителя еще больше уменьшался, что приводило к завышенным результатам определения АМ. Однако ионы марганца(П) и глюкоза, которые усиливали эффект тушения флуоресценции при проведении реакции окисления артемизинином ПБ в растворе, в пленке, напротив, его ослабляли.

Для демонстрации практической значимости разработанной нами пленки {цел-люлоза-[ВМ1т][С1]-ПБ-Мп(П)-ДДС} для определения АМ с ее помощью проанализировали те же БАД, в которых содержание АМ ранее установили с использованием индикаторной реакции в растворе (табл. 8). АМ определяли в препаратах «Best Artemisinin» и «Artemisia annua intense» методом добавок. Для подготовки образца «Artemisia annua intense» к анализу использовали экстракцию этанолом в течение 2 ч с последующим фильтрованием.

Таблица 8. Результаты флуориметрического определения AM в противомалярийных БАД «Best Artemisinin» и «Artemisia annua intense» e использованием системы ПБ—{Mn(II)—ДДС} в пленке {целлюлоза-[ВМ1т][С1]} (п = 3, Р = 0.95) и растворе (л = 5, Р = 0.95) методом добавок. Содержание AM в растворе «Best Artemisinin» по данным производителя - 18 мМ, в капсуле - 100 мг

Регистрация сигнала Уравнение градуировочной зависимости 1о/1 = ясам + b г Найдено AM

в экстракте, мМ в капсуле, мг

а ±Ая b ±A¿>

мкМ"1

«Best Artemisinin»

Пленка Раствор 0.35 0.115 0.06 0.003 0.43 1.140 0.1 0.005 0.9774 0.9983 19 ±3 17 ± 1 108±10 99±6

«Artemisia annua intense»

Пленка Раствор 0.59 0.211 0.08 0.004 1.5 1.26 0.4 0.01 0.9863 0.9986 0.7 ± 0.2 0.37 ± 0.02 4.3±0.6 0.96±0.03

Несмотря на то, что методика определения артемизинина с помощью пленок по аналитическим характеристикам несколько уступает методике, проводимой в растворе, полученные нами данные свидетельствуют о целесообразности и перспективности дальнейших исследований по применению пленок состава {целлюлоза-[ВМ1т][С1]} с иммобилизованными реагентами для решения задач химического анализа.

Выводы

1. Методом растворения-осаждения микрокристаллической целлюлозы в гидрофильной ионной жидкости, ацетате 1-бутил-З-метилимидазолия, [ВМ1т][АсО], получены целлюлозные пленки, обладающие высокими оптической прозрачностью ('1-90%), механической прочностью, эластичностью и устойчивостью в растворах различной кислотности (в присутствии и отсутствие буферных растворов) и в молекулярных органических растворителях (ацетонитриле, ДМСО, ДМФА).

2. С использованием [ВМ1т][С1] получены оптически прозрачные и прочные целлюлозные пленки с физически иммобилизованными в них пероксидазами хрена и сои, сохраняющими свойственную нативным ферментам субстратную специфичность и более 50% исходной каталитической активности от ее величины в растворе в течение первой недели хранения. Иммобилизованные препараты можно использовать по крайней мере дважды после простой регенерации.

3. Выявлена зависимость скорости растворения гемсодержащих белков в растворе целлюлоза-ионная жидкость от величины их р1 и показана предпочтительность иммобилизации в целлюлозные пленки катионных гемсодержащих белков перед анионными.

4. Иммобилизация растительных пероксидаз в пленки {целлюлоза— [BMIm][AcO]} сопровождается потерей их каталитической активности вследствие ингибирующего действия ацетатной ИЖ на ферменты по неконкурентному механизму.

5. Пленки, приготовленные с использованием ацетатной ИЖ способны сорбировать синтетические (индигокармин) и природные пищевые (куркумин, кармин и ß-каротин) красители из их водных и водно-органических растворов. Степень сорбции (в %) возрастает в ряду: ß-каротин (21) < кармин (32) < куркумин (36) < индигокармин (71).

6. Показана потенциальная возможность использования комплекса {Eu(III)-тетрациклин}, иммобилизованного в пленку {целлюлоза-[ВМ1т][С1]}, для определения билирубина, способного тушить сенсибилизированную флуоресценцию иона лантанида.

7. На основе реакции окисления пиронина Б артемизинином, катализируемой микропероксидазой-11 и комплексом {Mn(II)—додецилсульфат натрия}, предложены новые индикаторные флуоресцентные системы в растворах и разработаны чувствительные, селективные, простые и экспрессные флуориметрические методики определения артемизинина в диапазонах концентраций 0.1—7 мкМ (sr =

0.008.при Си, п = 5) и 0.2 - 8 мкМ (л = 0.007 при си, и = 5) соответственно. Время анализа не превышает 1 ч.

8. Созданы пленки [целлюлоза-[ВМ1т][С1]-пиронин Б-Мп(П)-додецилсульфат натрия}, установлены условия их функционирования и на их основе разработан чувствительный, селективный и экспрессный способ определения артемизинина в диапазоне концентраций 0.25-8 мкМ (sr = 0.2 при сн, п = 3).

9. Пленки {целлюлоза-[ВМ1ш][С1]} с соиммобилизованными пиронином Б и комплексом {Мп(П)-ДДС} успешно применены для флуориметрического определения артемизинина в противомалярийных БАД «BestArtemisinin» и «Artemisia annua intense».

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих статьях:

1. Muginova S.V., Mvasnikova P.A., PoliakovA.E., Shekhovtsova T.N. Immobilization of plant peroxidases in cellulose-ionic liquid films. // Mendel. Comm. 2013. V. 23. P. 74-75.

2. Мясникова Д.А.. Поляков A.E., Вашкинская O.E., Мугшюеа C.B., Шеховцоеа Т.Н. Влияние природы гидрофильной ионной жидкости на каталитическую активность пероксидаз хрена и сои. // Вест. Моск. Ун-та. Серия 2. Химия. 2014. Т. 55. №2. С. 126-135.

и тезисах докладов:

3. Muginova S.V., Poliakov А.Е., Mvasnikova P.A., Shekhovtsova T.N. Application of hydrophilic ionic liquids for the reactions catalyzed by plant peroxidases, native and

encapsulated in a cellulose matrix. / Abstracts of the 2nd Russian - Hellenic symposium with international participation and young scientist's school. «Biomaterials and bionanomaterials: Recent advances and safety - toxicology issues». Heraklion, Crete, Greece. May 5-12, 2011. P. 43.

4. Muginova S., Poliakov A., Myasnikova P.. Shekhovtsova T. Novel aspects of the application of water-miscible ionic liquids in catalysis by plant peroxidases: formation of the reaction media and supporting material for the enzyme immobilization. / Abstracts of the 16th European conference on analytical chemistry «Challenges in modern analytical chemistry». «Euroanalysis-2011». Belgrade, Serbia. 2011, September 11-15. BC21.

5. Мясникоеа Д.А.. Мугинова С.В., Шеховцова Т.Н. Применение гидрофильных ионных жидкостей для иммобилизации растительных пероксидаз и определения их органических субстратов. / Тезисы докладов 1-ой республиканской научно-практической конференции (с международным участием) «Зеленая химия - в интересах устойчивого развития», г. Самарканд, Узбекистан. 26-28 марта 2012. С. 38.

6. Shekhovtsova Т., Muginova S., Polyakov A., Myasnikova D. Plant peroxidases in the determination of their organic substrates in water, water-organic media, and ionic liquids. / Abstracts of the 3d symposium on Enzymes & Biocatalysis-2012 (SEB-2012). Xi'an, China. 2012, April 25-28. P. 142.

7. Мясникоеа Д.А.. Мугинова С.В., Шеховцова Т.Н. Оптический сенсор на основе композита {пероксидаза-целлюлоза-ионная жидкость} для определения катехоламинов. / Тезисы докладов Всероссийской конференции с международным участием по аналитической спектроскопии. Краснодар, Россия. 23-29 сентября 2012. С. 78.

8. Мясникоеа П.А.. Мугинова С.В., Шеховцова Т.Н. Каталитически активные и стабильные пленки {целлюлоза-ионная жидкость-пероксидаза} как основа оптических биосенсоров. / Тезисы докладов конференции РХО им. Д.И. Менделеева «Химическая технология и биотехнология новых материалов и продуктов». Москва, Россия. 24-25 октября 2012. С. 128-129.

9. Myasnikova D.A.. Poliakov А.Е., Vashkinskaya О.Е., Muginova S.V., Shekhovtsova T.N. The effects of imidazolium and pirydinium hydrophilic ionic liquids on the catalytic activity of horseradish and soybean peroxidases. «Biocatalysis-2013». Moscow, Russia. 2013, July 2-5. P. 81.

10. Мясникоеа ДА.. Мугинова С.В., Шеховцова Т.Н. О возможности использования биокаталитического окисления тетрациклина. /Тезисы докладов 2-го съезда «Аналитики России». Москва, Россия. 23-27 сентября 2013. С. 279.

11. Myasnikova D.A.. Muginova S.V., Shekhovtsova T.N. Optical and performance properties of the cellulose films regenerated from ionic liquids. / Abstracts of

«BioTech 2014. Chemical Sensors Forum». Wadenswil, Switzerland. 2014, September 4-8. P. 65.

12. Мясникова Д.А., Мугинова С.В., Шеховцова Т.Н. Пленка на основе целлюлозы, регенерированной из ацетата 1-бутил-З-метилимидазолия, для сорбции пищевых красителей. /Тезисы докладов конференции РХО им. Д.И. Менделеева «Химическая технология и биотехнология новых материалов и продуктов». Москва, Россия. 23 октября 2014. С. 142-144.

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (госконтракты: №П868 от 25.05.2010 и К»П991 от 27.05.2010) и РФФИ (гранты: №09-03-00823-а, М12-03-00249-а).

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам, аспирантам и студентам лаборатории кинетических методов анализа за постоянное внимание и помощь в получении и обсуждении результатов; к.х.н. Г. В. Колесникову за синтез ионных жидкостей; к.х.и. А.В. Иванову за предоставленный препарат ДАБКО; проф. Л.Г. Томиловой и к.х.н. Т.В. Дубининой кафедры органической химии МГУ за помощь при высушивании ионных жидкостей; доценту Н. II. Ивановой ист. лаборанту Т.В. Красноперовой кафедры коллоидной химии МГУ за помощь в оценке физико-механических свойств целлюлозных пленок; аспиранту кафедры химии нефти и органического катализа химического факультета МГУ А.А. Тепанову, студенту 5 курса кафедры физики полупроводников физического факультета МГУ И. В. Божьеву и к.ф.-м.н., н.с. отдела микроэлектроники НИИЯФ им. Д.В. Скобельцына МГУ С.А. Евлашину за получение СЭМ фотографий целлюлозных материалов.

Подписано в печать 10.02.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 120 Экз. Заказ № 1901-2-15 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39