Поляризационные характеристики синхротронного излучения и развитие методов измерения затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции молекул тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ФИЗИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ им. П.Н.ЛЕБЕДЕВА

На правах рукописи УДК 535.4

Демьянов Георгий Витальевич

Поляризационные характеристики синхротронного излучения и развитие методов измерения затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции молекул

01 04. 35 - оптика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Моыда - 2007

003158537

Работа выполнена в лаборатории электронов высоких энергий Физического института им. П.Н.Лебедова Российской Академии Наук

Научный руководитель:

Кандидат физико-математических наук Сырейщикова Татьяна Ивановна Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук Кудрявцев Евгений Михайлович Кандидат физико-математических наук Колобанов Виталий Николаевич Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт ядерной физики им Д В Скобельцына МГУ им М В Ломоносова

Защита состоится 24 сентября 2007 г. в 12 часов на заседании Диссертационного совета К002 023 02 Физического института им. П Н.Лебедева РАН по адресу 119 991, Москва, Ленинский проспект 53

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Физического института им П.Н Лебедева РАН

Автореферат разослан «_»__2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор физико-математических наук

В А Чуенков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В настоящее время метод флуоресцентной спектроскопии является одним из наиболее информативных методов исследования как биологических структур, так и многих химических соединений Основными преимуществами этого метода при изучении биологических систем являются его высокая чувствительность, отсутствие деструктивного воздействия (сохранение нативности образца во время измерений), а также селективность возбуждения Именно благодаря этому роль метода флуоресцентной спектроскопии в создании современного представлении о структуре и функциях таких биологических структур как липопротеины, альбумины, клетки крови, биологические мембраны и т д, связанных с жизнедеятельностью человека, является общепризнанной Ранние применения флуоресцентной спектроскопии касались, главным образом, исследования влияния микроокружения флуоресцирующего соединения на его спектры испускания и интенсивность флуоресценции Бурное развитие лазерной техники и, в первую очередь, применение ускорителей в качестве специализированных источников синхротронного излучения (СИ) обусловило быстрый прогресс в разработке методов флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением Безусловно, лабораторные источники света являются более доступными, однако, применение ускорителей в качестве специализированных источников СИ обладает рядом несомненных преимуществ - это широкий и непрерывный спектральный диапазон, высокая стабильность временной структуры импульсов, обеспечение низкой мгновенной мощности облучения исследуемого объекта, высокая степень линейной поляризации В последнее время основное внимание уделяется методу флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением, который позволяет получать дополнительную и более детальную информацию об объеме исследования, изучать тонкие механизмы динамики и конформационных перестроек в исследуемых объектах Метод флуоресцентной спектроскопии предполагает использование как природных флуорофоров, так и специально синтезированных флуоресцирующих молекул, обладающих необходимыми свойствами, ковалентно или нековалентно связывающихся с исследуемым

объектом (соогветственно "флуоресцентных меток" и "флуоресцентных зондов") Временные параметры флуоресценции этих молекул сильно зависят от свойств окружения флуорофора Поэтому, точное знание закона затухания флуоресценции может дать детальную информацию об окружении флуорофора и его взаимодействии с этим окружением Такие разрешенные во времени измерения позволяют исследовать сложные гетерогенные системы и следить за популяциями молекул флуорофора, находящимися в различном окружении, или исследовать процессы, протекающие в возбужденном состоянии При возбуждении флуорофора линейно поляризованным светом испускание флуоресцирующей молекулы также поляризовано Со временем поляризация флуоресценции падает по ряду причин Наиболее распространенной из них является вращательная диффузия флуорофора, параметры которой зависят от вязкости растворителя, размеров и формы вращающихся часгиц На величину анизотропии также влияет наличие ограничений на ориентацию флуорофора Зависимость анизотропии флуоресценции от вращательной диффузии излучающей молекулы привела к применению метода измерения затухания анизотропии в биохимических и биомедицинских исследованиях

С учетом выше изложенного являлось актуальным создание рабочей станции в пучке СИ ускорителя С-60 Физического институт им ПН Лебедева РАН (ФИАН), разработка и внедрение различных методик исследований биологических структур флуоресцентными методами с временным разрешением

Цель работы

Целью настоящей работы было создание действующей экспериментальной станции в пучке СИ ускорителя С-60 ФИАН для исследования вращательной динамики биологических структур и молекул, развитие методики флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением, а также изучение поляризационных характеристик синхротронного излучения в неоднородном магнитном поле с использованием метода параметров Стокса, исследование зависимости поляризации СИ от аксиальных бегатронных колебаний ускоряемых электронов и изучение возможности их подавления путем вариации магнитного поля ускорителя,

корректируя при этом поляризационные характеристики излучения Необходимость работы с малыми количествами исследуемых веществ потребовала разработки оригинального метода детектирования флуоресценции, отличающегося от общепринятого

Основные задачи, решаемые в диссертации

В представленной диссертации были поставлены и решены следующие задачи'

Проведено экспериментальное исследование поляризационных характеристик синхрогронного излучения ускорителя С-60 ФИАН Изучено влияние аксиальных бетатронных колебаний ускоряемых электронов на указанные характеристики СИ и исследованы возможности коррекции этих характеристик путем вариации магнитного поля ускорителя Получены формулы, описывающие угловые распределения параметров Стокса и поляризационных характеристик СИ, учитывающие амплитуды бетагронных колебаний ускоряемых электронов

- Разработана и оглажена система детектирования флуоресценции с временным разрешением Для регистрации излучения используется метод счета одиночных фотонов, который является наиболее чувствительным методом, доступным в настоящее время для измерения времен затухания флуоресценции

- Отработан метод флуоресцентных зондов для исследования биологических объектов Этот метод имеет высокую чувсгвигельность, дает возможность проводигь измерения с живыми биологическими системами и, в частности, исследовать структуру живой клетки В отличие от рентгеносгруктурного анализа, мегод позволяет исследовать объекты, не имеющие строго упорядоченной структуры

- Оглажен метод измерения анизотропии флуоресценции с временным разрешением

- Разработан и внедрен ряд различных методик исследований биологических объектов флуоресцентными методами с временным разрешением методика измерения времен затухания интенсивности флуоресценции и методика измерения параметров затухания анизотропии флуоресценции

- Разработан метод анализа измеренных кривых затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции, для чего был создан и отлажен ряд программ для анализа экспериментальных данных, основанных на нелинейном методе наименьших квадрагов

Научная новизна работы

В работе теоретически и экспериментально изучены все основные поляризационные характеристики синхротронного излучения в неоднородном магнитом поле, причем впервые в экспериментальных исследованиях поляризации СИ применен метод параметров Стокса, адекватно отражающий важнейшие характеристики эллиптической поляризации излучения Впервые получены экспериментальные данные измерения угловых распределений параметров Стокса СИ, линейной, циркулярной и полной степени поляризации

Экспериментально подтверждено предсказанное ранее теоретически наличие двух минимумов в угловом распределении степени поляризации СИ, расположенных симметрично относительно плоскости равновесной орбиты электронов Гаким образом, показано, что максимальная деполяризация излучения имеет место не в плоскости орбиты, как считалось ранее, а в направлении некоторою у1ла, величина которого зависит от величины амплитуды аксиальных бетагронных колебаний ускоряемых электронов

Результатом проведенной работы явилось создание на базе синхротрона С-60 ФИЛИ экспериментальной станции предназначенной для исследования затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции биологических структур, находящихся в расгворе и продемонстрированы ее возможности

Практическая значимость работы

В работе развит применительно к СИ метод параметров Стокса, полученные формулы позволяют учесть деполяризацию излучения за счет аксиальных бе тронных колебаний электронов. Показано, что путем вариации машитного поля ускорителя возможно значительно уменьшить амплитуду аксиальных бетагронных колебаний электронов, скорректировав тем самым поляризационные

характеристики излучения, и получить источник практически полностью поляризованного света в широком спектральном диапазоне, при этом степень линейной поляризации излучения в плоскости орбиты электронов приближается к 100%

С созданием экспериментальной станции приобрел новые возможности и стал более эффективным подход к исследованию молекулярной динамики биологических структур, связанный с использованием метода измерения анизотропии флуоресценции с временным разрешением Исследование на данной станции белково-липидных комплексов крови человека с использованием метода разрешенной во времени флуоресцентной спектроскопии открывает совершенно новые возможности для контроля и ранней диагностики ряда серьезных заболеваний человека, например, таких как атеросклероз

Защищаемые положения

- теоретически и экспериментально показано, чго аксиальные бепатронные колебания являются основным деполяризующим фактором относительно СИ,

- доказано, что путем вариации магнитного поля ускорителя можно подавть указанные колебания и значительно увеличить степень поляризации СИ,

- на базе синхротрона С-60 ФИАН с учетом поляризационных характерисшк излучения создана установка для измерения параметров затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции молекул, находящихся в растворе и продемонстрированы ее возможности

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цшируемой литературы Полный объем диссертации составляет 121 страницу машинописного текста Диссертация включает 25 рисунков и 2 таблицы Список цитируемой литературы насчитывает 73 наименования

Апробация работы

Основные результаты диссертации представлены на Международной конференции по синхротронному излучению СИ-90 (Москва, 1990), Международной конференции по люминесценции (Москва, 1994), XIV Российской конференции по использованию синхротронного излучения (Новосибирск, 2002), Третьей международной конференции молодых ученых и специалистов "Оптика-2003" (Москва, 2003), а также докладывались на научных семинарах Лаборатории электронов высоких энергий Отделения ядерной физики и астрофизики ФИАН и Отделения оптики ФИАН

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и задачи работы, кратко описана научная новизна работы, а таюке ее практическая значимость

Первая глава диссертации является обзорной

Первый параграф посвящен рассмотрению работ, связанных с формированием и развитием классической теории синхротронного излучения, рассмотрены основные этапы становления и современное состояние теории СИ Описаны поляризационные свойства СИ и рассмотрены основные теоретические и экспериментальные работы по исследованию поляризационно:угловых свойств излучения Отмечено, что анализ экспериментальных данных, полученных в большинстве этих работ, недостаточно верен с методической точки зрения, так как в них эллиптическая поляризация рассматривалась неадекватными методами, а именно, только с точки зрения либо компонент линейной, либо циркулярной поляризации При удовлетворительном, в целом, согласии теории и эксперимента имеет место расхождение экспериментальных данных с теоретическими, касающиеся отличия о г нуля интенсивности в минимуме тг- компоненты линейной поляризации, вектор электрического ноля которой параллелен направлению внешнего магнитного поля ускорителя

Во втором параграфе рассмотрена динамика электронов в ускорителях в неоднородном слабофокусирующем магнитном поле Приведены основные выводы теории, касающиеся поведения пучка электронов в процессе ускорения, дана сравнительная характеристика различных типов колебаний ускоряемых электронов вблизи равновесной орбиты, их возможного влияния на поляризационные характеристики излучения Проанализированы работы, в которых рассматривались влияния аксиальных бетатронных колебаний на угловые распределения компонент линейной поляризации СИ

Третий параграф посвящен рассмотрению методов описания поляризованного света с помощью формализма вектора Джонса, параметров Стокса и матрицы когерентности. Указанный метод, широко используемый в эллипсомегрии, до последнего времени не использовался в экспериментах с СИ Различные состояния поляризации плоской световой волны можно представить набором четырех величин, называемых параметрами Стокса Экспериментальное определение параметров Стокса основано на выражениях

где параметр Стокса S0 равен полной интенсивности излучения, а через I0,1<ю,1+45, 1.45, Ir и II обозначены интенсивности, прошедшие через поляризаторы, ориентированные под углами 0°, 90°, ±45° к вертикали, и круговые поляризаторы правого и левого вращения соответственно При изучении поляризационных свойств излучения пользуются нормированными (или приведенными) параметрами Стокса £ь Ь, Ь, где — S,/ Sg, i — 1,2,3 , которые несут полную информацию о поляризации. Если рассматривать £|, и £3 как совокупность декартовых координат некой точки, соответствующей данной поляризации, то мы приходим к представлению состояний поляризации в виде сферы Пуанкаре Сферические координаты точки на сфере в этом случае имеют важный физический смысл

(1а) (16) (1в) (1г)

азимутальный угол равен удвоенному углу ф наклона большой оси эллипса поляризации к оси х рассматриваемой системы координат

2 0 = а1с1ё(£2/?|)> (2)

полярный угол равен удвоенному углу эллипгичности 5 - отношению длин малой и большой полуосей эллипса

(

2 5 = а! сет

(3)

3 7

а расстояние точки от начала координат есть степень поляризации Р Линейная, циркулярная и полная степени поляризации определяются через приведенные параметры Стокса

Р|= (4а)

Рс = | {з | (46)

Р = (4в)

Показано, что величины Р| и Рс являются инвариантами относительно вращения системы координат в плоскости ху, перпендикулярной направлению распространения излучения

В четвергом параграфе получены формулы для углового распределения приведенных параметров Стокса СИ в неоднородном магнитном поле, учитывающие амплитуды аксиальных бетатронных колебаний электронов

Вторая глава носвящена экспериментальному исследованию поляризационных характеристик СИ ускорителя С-60 ФИАН в неоднородном магнитном поле

В первом пара!рафе описаны экспериментальные установки, на которых проводились эксперименты по измерению поляризационных характеристик СИ в неоднородном магнитном поле (рис 1а), а также исследования динамики поперечного сечения электронною сгустка в процессе ускорения (рис 16), Описаны основные оптические элементы установки и системы детектирования, отмечены некоторые методические особенности проведения экспериментов При проведении экспериментов особое внимание уделялось следующему аспекту вакуумная система ускорителя имеет масляные диффузионные насосы и если не нришпь специальных мер, пары масла под действием фотонов СИ высокой энериш осядут

Рис 1 (а) - оптическая схема установки для исследования поляризационных характеристик СИ и (б) - ее модификация для исследования динамики поперечного размера электронного пучка

на иллюминатор (И), что может привести к искажению углового распределения и вращению плоскости поляризации излучения Поэтому на время, не занятое измерениями, иллюминатор защищался специальным вакуумно-опгическим затвором (К)

Существенной деталью методики эксперимента по измерению поляризационных характеристик СИ является независимость результатов от начального угла установки поляризатора (Р) Данное обстоятельство чрезвычайно важно с точки зрения процедуры измерений В самом деле, весьма сложно осуществить точную ориентацию поляризатора относительно направления магнитною поля в секторе поворотного магнита в точке генерации наблюдаемого излучения Истинное направление магнитного поля может быгь найдено только с помощью магнит оме фических измерений. Точность эксперимента зависит только от точности последовательных ориентаций поляризатора при измерении угловых распределений компонент поляризации СИ Для подтверждения этого были проведены две серии измерений при начальном угле ориентации поляризатора с% = 0° к вертикали и для произвольно выбранного начального угла13°

Во втором параграфе приведены основные экспериментальные данные но измерению зависимости поляризационных характеристик СИ от амплитуд аксиальных бетатронных колебаний электронов. Исследования проводились на синхротроне С-60, работающем в стандартном режиме, для диапазона энергий электронов 200 - 600 Мэв При этом амплитуда аксиальных бетатронных колебаний элешронов изменялась от 4,9 до 0,6 мм Эти значения определялись по измерениям дисперсии нормального распределения частиц в сечении электронного пучка фотометрическим способом В этом же диапазоне энергий (амплитуд бетатронных колебаний) на длине волны 476 нм для различных углов наблюдения и начальных углов ориентации поляризатора измерялись параметры Стокса, степени линейной, циркулярной и полной поляризации СИ

Результаты измерений приведены на рис 1 и рис 2 Можно констатировать качественное согласие экспериментальных результатов с поведением теоретических кривых Очевидно, что приведенные кривые правильно описывают наблюдаемое в эксперименте отклонение степени поляризации от прямой Р = 1 в однородном поле С другой стороны, наблюдается дополнительная деполяризация излучения, особенно сильная при больших амплитудах колебаний (при энергиях 200 - 300 Мэв) Данное отклонение может объясняться несколькими причинами, в числе которых, MoiyT быть различные погрешности эксперимента - искажающее влияние оптической системы, остаточная масляная пленка на выводном окне

вакуумной камеры ускорителя и т д К возможным отклонениям теоретических и экспериментальных результатов следует, по-видимому, также о гнести отличие

1,0

0,6

0,2

Р.,Рс Ь 1-

; * » «

а) 0 н 0 мрад

3,4

-А.

I Т I I Л

200 400 Е, Мэв 200 400 Е, Мэв 200 400 Е, Мэв

Рис 1 Динамика степени линейной (Р[) и циркулярной (Р0) поляризаций СИ для трех значений угла в в зависимости от энергии Е 1 - Р|, однородное магнитное поле (ОП), ая = 0; 2 - Рь неоднородное магнитное поле (НП), 3 - Рс (ОП), 4 - Р0 (НП), о - Р, (« «0°), Д - Р, (а «22,5°), • - Рс (а «0й), ▲ - Рс (а «22,5°)

1,0 0,6 1,0 0,6

0 = 0 мрад —I-1-1_I-1.

в = 1 мрад I ... I_I_и

а)

б)

1,0 0,6

1 А . • • . . * А *

А л

О в 2,5 мрад J_1_I_

в)

200 400 Е, Мэв

Рис 2 Динамика полной степени поляризации СИ, • - а «0°, ▲ - а «22,5°

закона, по которому происходят реальные бетатронные колебания, от простого гармонического Ангармонизм бетатронных колебаний связан с конструктивными особенностями синхротрона, а именно, с наличием прямолинейных промежутков, и должен являться предметом самостоятельного исследования

В параграфе три описана сущность метода магнитной коррекции степени поляризации излучения, которая заключается в подавления аксиальных бетатронных колебаний электронов путем вариации магнитного поля ускорителя В момент достижения электронами определенной энергии в обмотки коррекции медианной магнитной поверхности и показателя спада магнитного поля подавались одновременно корректирующие импульсы тока длительностью порядка 400 мс Ускоритель работал в режиме с «плато» в магнитном поле, величина которого соответствовала энергии электронов 570 Мэв и длительность которого составляла 500 мс В результате осуществлялось значительное уменьшение амплитуды аксиальных бетатронных колебаний электронов (с 1,22 мм до 0,50 мм) и достигалось сжатие электронного сгустка почти в 2,5 раза в вертикальной плоскости при заметном (в 1,2 раза) сжатии в плоскости орбиты

В четвертом параграфе приведено сравнение экспериментальных и теоретических данных для угловых распределений интенсивностей компонент поляризации, приведенных параметров Стокса и степеней линейной, циркулярной и полной поляризации СИ для различных начальных углов ориентации поляризатора, а также для стандартного режима работы ускорителя и режима коррекции Отмечено хорошее совпадение экспериментальных и теоретических данных, полученных с учетом влияния аксиальных бетатронных колебаний на поляризационные характеристики СИ, как в отсутствие корректирующих импульсов, гак и в режиме коррекции Таким образом, полностью подтверждена теория, объясняющая деполяризацию СИ наличием аксиальных бетатронных колебаний ускоряемых электронов Как следует из рис 3, в результате магнитной коррекции степень поляризации СИ в среднем увеличена с 81% до 98%, что подюерждаег высокую эффективность предложенного метода коррекции В частности, в плоскости равновесной орбиты электронов степень линейной поляризации СИ повышена с 82% до 99% Таким образом, в этой плоскости СИ практически полностью линейно поляризовано Теоретические кривые 1

(стандартный режим работы ускорителя) и 2 (режим коррекции) на рис 3 рассчитаны с учетом аксиальных бетатронных колебаний электронов, кривая 3 -для однородного магнитного поля

Интересным результатом является предсказанное ранее теоретически и экспериментально подтвержденное в данной работе наличие двух минимумов в угловом распределении степени поляризации СИ (см кривые 1 и 2 на рисЗ), расположенных симметрично относительно плоскости равновесной орбиты электронов Следовательно, максимальная деполяризация излучения имеет место не в плоскости орбиты, как считалось ранее, а в направлении некоюрого у1ла 0С Качественный расчет показывает, что величина этого угла обусловлена значениями амплитуд аксиальных бетатронных колебаний и, вероятно, соответствует моментам прохождения электронов через равновесное положение, в котором поперечная составляющая скорости достигает своего максимума

Основные выводы работы, посвященной исследованию поляризационных характеристик СИ синхротрона С-60 ФИАН и возможностй их коррекции, приведены в пятом параграфе Здесь отмечено, что впервые для описания

Р

0,6

6 -4 2 0 2 4 ирод

Рис 3 Угловое распределение полной степени поляризации СИ Экспериментальные данные • - в стандартном режиме для а = 0°, А - в стандартном режиме для а = +13°, о-в режиме коррекции а - 0°, Д - в режиме коррекции для а. = +13"

,о

поляризации СИ был использован метод параметров Стокса, адекватно отражающий все важнейшие характеристики эллиптической поляризации Получены формулы для угловых распределений приведенных параметров Стокса СИ в неоднородном магнитном поле, выражения для линейной, циркулярной и полной степеней поляризации

Экспериментальные данные находятся с соответствие с теоретическими кривыми, рассчитанными по формулам, учитывающим аксиальные бетатронные колебания электронов Показано, что методом вариации магнитного поля возможно значительно увеличить степень поляризации СИ, что дает возможность получить источник практически полностью поляризованного излучения в широком спектральном диапазоне

Третья глава посвящена теории затухания анизотропии флуоресценции В первом параграфе рассмотрено явление фотоотбора (селективного возбуждения частично ориентированного набора флуорофоров), имеющее место при возбуждении флуорофоров линейно поляризованным светом В результате этого явления испускание флуорофора частично поляризовано Анизотропия флуоресценции определяется через компоненты линейной поляризации согласно следующему выражению

где /0 - полная интенсивность флуоресценции 1Н и I,- интенсивности, полученные при прохождении света через поляризаторы, ориентированные параллельно и перпендикулярно плоскости поляризации возбуждающего излучения соответственно Показано, что величина анизотропии является мерой среднего значения cos2 в, где# - угол ориентации диполя возбужденной молекулы по отношению к оси, вдоль которой поляризовано возбуждающее излучение Надежные измерения затухания анизотропии флуоресценции возможны только в том случае, когда времена вращательной корреляции находятся в диапазоне 0,1 г < ф < Ют, где т - время затухания интенсивности флуоресценции Максимальное

значение анизотропии флуоресценции равно 0,4 и соответствует случаю изотропного раствора, когда диполи поглощения и испускания флуорофора параллельны и нет процессов, приводящих к деполяризации Минимальное значение анизотропии равно -0,2 и имеет место в случае, когда диполи возбуждения и испускания перпендикулярны друг другу Полное исчезновение анизотропии имеет место при так называемом "магическом угле" в = 54,7°.

Во втором параграфе более подробно рассмотрены вопросы деполяризации флуоресценции. Отмечено, что одним из основных факторов деполяризации флуоресценции является вращательная диффузия молекулы флуорофора Приведены выражения для затухания анизотропии флуоресценции сферической молекулы флуорофора в случае ее изотропного вращения, а также дня сложных молекул, имеющих различные скорости вращения относительно различных осей Кроме того, рассмотрены случаи затухания анизотропии флуоресценции для изотропно вращающихся молекул, находящихся в анизотропном окружении, при котором угловой диапазон вращательно1 о движения ограничен В заключение параграфа рассмотрен случай се1 ментальной подвижности молекулы флуорофора в предположении, что движение части макромолекулы происходит независимо от вращения молекулы в целом

В четвертой главе рассмотрены различные применения метода измерения параметров затухания анизотропии флуоресценции в исследованиях биоло! ических систем Метод затухания анизотропии флуоресценции позволяет получать уникальную информацию об их молекулярной динамике, микровязкости, вращательной диффузии, сегментальной подвижности, вращении групп и тд Потенциальные применения метода включают исследования на молекулярном уровне текучести и жесткости мембран, локальной микровязкости в жидкостях и полимерах, протеин-протеиновые взаимодействия

В первом параграфе дан обзор работ, посвященных исследованиям биол01 ических мембран и липопротеинов с использованием метода измерения параметров затухания анизотропии флуоресценции Рассмотрен ряд работ посвященных исследованию мембран с применением зонда 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен (ОРИ), в результате которых удалось определить их специфическую

пространственную структуру В частности исследования тилакоидных мембран показали, что большие плоские области этих мембран соединены между собой сильно искривленными частями Метод измерения затухания анизотропии широко используется и в исследованиях адаптации мембран к изменению температуры и гидростатического давления, в исследованиях структуры и динамики мембран, локальной микровязкости липосом, клеточных мембран и целых клеток Метод хорошо зарекомендовал себя в изучении фосфагидилхолинов - наиболее трудно исследуемых фосфолииидов, входящим в состав большинства биологических мембран В ряде работ проведены исследования вратцательнот о и тансляционного движения тришофановых остатков в торопине С* с применением метода измерения затухания анизотропии флуоресценции

Метод измерения затухания анизотропии флуоресценции успешно был применен в исследованиях влияния этанола на текучесть биологических мембран Было выявлено разжижающее ("флюидизирующее") действие этанола на полярную и ¡идрофобную части мембран клеток печени крыс Известно, что текучесть мембран во мноюм определяется степенью ненасыщенности жирнокислотных остатков в молекулах фосфолшшдов и содержанием холестерина Это позволяет рассматривать увеличение содержания холестерина и уменьшение количества ненасыщенных жирных кислот в мембранах при воздействии алкоголя как один из адаптивных механизмов, позволяющих повысить толерантность мембран к "флюидизирующему" действию этанола В результате этого воздействия меняется жидкокристаллическое состояние мембран, в которых возрастает подвижность молекул липидов и белков Разжижающее действие этанола на мембраны объясняется его внедрением в поверхность мембран между полярными группами фосфолипидов Установлено, что при длительном воздействии этанола в мембранах клеток происходит уменьшение степени ненасыщенности липидов, увеличение содержания холестерина Эти физико-химические процессы позволяют компенсировать "флюидизирующее" действие этанола

Рассмотрены таюке работы, посвященные применению метода в исследованиях подвижносш белков, а также изучению их взаимодействия с водой Ряд работ посвящен исследованиям локальной динамики белков, что необходимо для понимания многих процессов, в частности, процесса свертывания

Метод деполяризации анизотропии используется и в работах по исследованию сегментальной подвижности молекул Взаимный поворот фрагментов возбужденного флуорофора сопровождается поворотом диполя молекулы Поэтому это внутримолекулярное движение может быгь зарегистрироватно на фоне более медленной деполяризации флуоресценции за счет теплового вращения молекулы в целом Эта особенность внутримолекулярной динамики широко используется в исследовании информационной гибкости протеинов и других молекул

Приведенный обзор литературы свидетельствует о широком использовании метода затухания анизогропии флуоресценции и доказывает актуальность внедрения этого метода в пучке синхротронного излучения для его использования в медицинских, биохимических и химических исследованиях

Во втором параграфе описана экспериментальная установка, предназначенная для измерения параметров затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции на ускорителе С-60 ФИАН, приведены ее основные технические характеристики Оптическая схема установки приведена на рис 4 Установка обеспечивает исследование растворов объемом до 200 мкл При этом диапазон длин волн возбуждающего излучения 200 - 1000 нм обеспечивается сменными дифракционными решетками, характеристики которых приведены в таблице 1.

Выделение компонент линейной поляризации флуоресценции осуществляется призмой Глана Диапазон длин волн флуоресценции, при коюрых призма Глана осуществляет полное пространственное разделение выходных пучков с взаимно ортогональной поляризацией - 250 - 700 нм Минимальное измеряемое на данной установке время затухания интенсивности флуоресценции составляет 0,5 не и связано с конечной длительностью возбуждающею импульса СИ (7 не) и его временной стабильностью, а максимальное время затухания определяется периодом повторения возбуждающих импульсов СИ и составляет 50 не Описаны основные принципы юстировки оптических элементов установки и измерения кривых затухания

Одним из основных требований при создании станции была возможность работы с малыми количествами исследуемых веществ Это потребовало

Рис 4 Схема экспериментальной установки С - камера ускорителя, ЗМ - затвор монохроматора, Д - дифракционная решетка, П - поляроид, Л - линзы, К - кювета, СФ - светофильтр, Г - призма

Глана, Ф 1, 2 - ФЭУ

№ Число Рабочая Область Обратная Рабочий

штрихов/мм область, максимальной линейная порядок

нм концентрация дисперсия,

энергии, нм нм/мм

1 1200 200-500 250 1,3 Первый

2 1200 350-1000 500 1,3 Первый

Таблица 1 Характеристики сменных решеток монохроматора МДР-23

разработку оригинального метода детектирования флуоресценции, характерной особенностью которого является регистрация флуоресценции с передней грани кюветы, в отличие от общепринятой схемы, в которой регистрация осуществляется с боковой I рани Угол падения возбуждающего излучения на кювету составляет 40°, а наблюдение ведется в вертикальной плоскости нормально к поверхности выходной грани кюветы, что необходимо для сохранения соотношения между компонентами линейной поляризации флуоресценции при ее прохождении через грань Перед изготовлением кюветы были проведенные тестовые измерения спектра собственной флуоресценции кварцевых пластины, из которых эту кювету

предполагалось изготовить Полученные данные показали, что в диапазоне длин волн 250 - 700 нм кварцевые пластины не обладают заметной флуоресценцией Данному аспекту уделялось особое внимание, так как в противном случае необходимо было учитывать собственную флуоресценцию кюветы в измерениях затухания интенсивности флуоресценции образцов

Для измерения времен затухания интенсивности и параметров затухания анизотропии флуоресценции используется метод счета фотонов, являющийся одним из наиболее чувствительных методов Приведена блок-схема системы счета фотонов, которая осуществляет измерение распределения во времени одиночных фотонов флуоресценции двух взаимно перпендикулярных компонент линейной поляризации, соответствующих одиночному импульсу возбуждения Измерение времени затухания компонент поляризации флуоресценции осуществляется с помощью двух 2048-канальных время-цифровых преобразователей Временной интервал, соответствующий одному каналу равен 0,05 не Максимальная скорость счета фотонов регистрирующей системой ограничена величиной 104 имп/сек Это ограничение объясняется следующими причинами

1 Для правильной регистрации временного распределения фотонов флуоресценции необходимо, чтобы каждому возбуждающему импульсу соответствовало не более одного зарегистрированного ФЭУ фотона В противном случае все фотоны, соответствующие одиночному импульсу возбуждающего света, будут зарегистрированы как один Потеря последующих фо гонов приведен к искажению временного распределения за счет искусственного увеличения малых времен и закон затухания искусственно сдвинется в сторону коротких времен Это происходит потому, что система, из-за «мертвого» времени время-цифрового преобразователя, регистрирует только первый из пришедших фотонов флуоресценции

2. Увеличение скорости свыше счета 104 имп/сек нежелагельно из-за роста числа просчетов, тк «мертвое» время время-цифрового преобразователя составляет порядка 100 мке Оптимальная величина скорости счета регулируется путем изменения ширины выходной щели монохроматора

Количество фотонов с горизонтальной поляризацией и длиной волны 500 нм в спектральном интервале 1 нм, падающих на образец, составляет 10' фот/с

В трегьем параграфе описана методика измерения затухания анизотропии флуоресценции Проведено сравнение двух методов регистрации затухания анизотропии однолучевой (Ь- формат) и двухлучевой (Т- формат). Обоснован выбор однолучевого метода регистрации для данной установки Описана процедура калибровки чувствительности канала регистрации в двух положениях Такая калибровка производилась с помощью двух зондов растворенных в этаноле МБА (3-метоксибензантрон) (г0 = 13 лс, Хт = 340>ш,Лфч = 420».«) и пирена (г0 -26не,Хт =400иМуХф, =500км) Быстрое вращение указанных флуорофоров приводит к полной потере первоначальной ориентации за время жизни возбужденного состояния и к полной потере поляризации флуоресценции, что дает возможность определить относительную чувствительность канала регистрации флуоресценции в двух положениях, соответствующих измерению двух взаимно перпендикулярных компонент линейной поляризации флуоресценции.

Четвертый параграф посвящен вопросам обработки полученных экспериментальных данных Значения параметров затухания анизотропии флуоресценции рассчитываются методом наименьших квадратов в два этапа На первом этапе определяются параметры затухания интенсивности флуоресценции в предположении, что это затухание происходит по закону /(I) = I, е~'"' + 1г е '"' + /,, где величина /, описывает рассеянный свет На втором этапе из измеренных кривых /д(0 и /„(/) определяется функция £>(0 = /л(0-/„(0. из которой рассчитываются параметры затухания анизотропии флуоресценции I (0 = /, е'"п + >\ + /3 с учетом известных /,, /2, /3, г, и г2

В пятой главе приведены экспериментальные данные, полученные на установке и подтверждающие ее работоспособность Были проведены измерения параметров затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции ряда образцов В частности, были измерены параметры затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции наиболее часто используемого в подобных экспериментах зонда 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен (БРИ) в глицерине последовательно двумя каналами регистрации Полученные результаты приведены в таблице 2 и находятся в

хорошем согласии друг с другом и данными, полученными из литературы, что подтверждает их надежность и работоспособность установки

Сегментальная подвижность флуорофоров исследовалась на примере конформационного анализа нейтральной и заряженной молекул из серии 2(3'-пиридил)оксазолов Исследуемые объекты принадлежат к ряду гетероциклических органических соединений, характеризующихся собственной флуоресценцией Была поставлена цель исследовать структурную релаксацию (взаимный поворот фрагментов флуорофора) катиона в возбужденном электронном состоянии

Канал г, НС <р, НС

1 10,2 ± 0,5 0,39 ± 0,03 11,1 ± 0,9

2 9,8 ±0,4 0,40 ± 0,04 10,4 ± 0,8

Литературн ые данные 10,5 0,37 9,8

Таблица 2 Параметры флуоресценции зонда ПРИ в глицерине.

Измерения стационарной и разрешенной во времени анизотропии флуоресценции проводились для нейтральной молекулы 3-(5-фенил-оксазол-2-ил)пиридин (соединение 1) и заряженного катиона 1-этил-3-(5-фенил-оксазол-2-ил)-пиридиниум, толуен-4-сульфонат (соединение 1а) в глицерине. Расчеты зависимости энергии образования указанных соединений о г углов скручивания пиридильных фрагментов молекул показали, что для обоих соединений в основном состоянии наиболее устойчивыми являются плоские молекулы В возбужденном состоянии преимущественная конфигурация нейтральной молекулы продолжает оставаться плоской, для катиона же она переходит в скрученную под углом около 90° конфигурацию Кинетика деполяризации флуоресценции нейтральной молекулы содержит два времени релаксации <р{ =2,6 не, <рг =1,7 не Кинетика деполяризации флуоресценции катиона содержит кроме двух времен релаксации близких по значению к соответствующим временам нейтральной молекулы и быструю компоненту (порядка 0,5 не), наблюдаемую в первые 1,5 - 2,2 не после

возбуждения, которая может отражай изменение конформации молекул, те поворот фрагмента <рх = 0,55нс, <рг = 5,67не, <рг= 3,1нс Угол поворота диполя, рассчитанный из данных затухания анизотропии флуоресценции, составляет 40°, чго согласно расчетам на основе квантовой химии, выполненным сотрудниками химического факультета МГУ, соответствует углу поворота фрагмента равному 88°, что находится в хорошем согласии с величиной 90° Приведенные данные подтверждают возможность использования установки для исследования фрагментарных вращений молекул

Основные выводы

Проведено теоретическое и экспериментальное исследование влияния аксиальных бетагронных колебаний электронов в слабофокусирующем неоднородном магнитном поле на поляризационные характеристики СИ.

Для описания поляризационных свойств СИ впервые применен метод параметров Стокса, адекватно описывающий все основные характеристики эллиптически поляризованного излучения Получены формулы, описывающие угловые распределения приведенных параметров Стокса СИ, а также выражения для линеиной, циркулярной и полной степеней поляризации, учитывающие влияние аксиальных бетатронных колебаний электронов

Приведены впервые полученные экспериментальные результаты измерений угловых распределений приведенных параметров Стокса СИ, линейной, циркулярной и полной степеней поляризации Указанные данные находятся в хорошем согласии с теоретическими расчетами

Создана экспериментальная установка, учитывающая поляризационные характеристики ускорителя С-60 ФИАН, предназначенная для измерения параметров затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции биоло! ических структур и молекул, находящихся в растворе Приведены экспериментальные данные тестовых измерений затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции, подтверждающие работоспособность установки

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах

1 Г В Демьянов, В А Орлов, А В Титов, К H Шорин, А С Яров, Поляризация синхротронного излучения в неоднородном магнитном поля, Краткие сообщения по физике, ФИАН, 1988, 1,21

2 G V Demyanov, N К Kurek, Е N Lapshin, ТI Syrejshchikova, M N Yakimenko, Protein fluorescence decay of human serum VLDL exposed to synchrotron radiation, Nucl Instruin AndMeth, Phys Res , Sect A 308 (1991) 215-218

3 Г В Демьянов, С И Исакова, H К Курек, Е H Лапшин, А И Рухтин, Т И Сырейщикова, M H Якименко, Исследование кинетики за1ухания флуоресценции липидного зонда в липопротеинах крови человека при возбуждении синхротронным излучением, Тезисы Международной конференции по люминесценции, Москва, 1994

4. А В Акимов, Г В Демьянов, H К Курек, С С Молчанов, Г С Пащенко, Т И Сырейщикова, Р В Федорчук, M H Якименко, Установка для исследования кинетики затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции биологических объектов, Тезисы Международной конференции по люминесценции, Москва, 1994

5 AVAkimov, GVDemjanov, NKKuiek, S S Molchanov, G S Pashhenko, T1 Syrejshchikova, R V Fedorchuk,M N Yakimenko, Station for the investigation of the decay kinetics of the fluorescence anisopropy of biological objects, Nucl Ins And Meth , Phys Res , Sect A 359 (1995) 345-347

6 А В Акимов, Г В Демьянов, H К Курек, С С Молчанов, Г С Пащенко, 1 И Сырейщикова, Р В Федорчук, M H Якименко, Установка для исследования кинетики затухания анизотропии флуоресценции биологических объектов, Оптика и спектроскопия, 1995, 78,2, 254-256

7 G V Demyanov, M Yu Zabazarnych, S I Isakova, N К Kuiek, E N Lapshin, TI Syiejshchikova, M N Yakimenko, Characteristic of moleculat fluorescence of a lipid probe in human blood lipoproteins exposed to synchrotron radiation, Nucl Ins And Meth , Phys Res , Sect A 359 (1995) 342-344

8 G V Demyanov, S I Isakova,N К Kurek, TI Syrejshchikova, M N Yakimenko, The measurements of the fluorescence anisotropy decay of the lipid probe

in the liposomes, Bulletin of the Lebelev Physical Institute (Russian Academy of Science) N11-12(1995) 15-19

9 T И Сырейщикова, С К Гуларян, В Ю Светличный, Г Е Добрецов, С И Исакова, Г В Демьянов, Лейкоциты крови человека, исследование ме годом разрешенной во времени флуоресцентной спектроскопии, Материалы XIV Российской конференции по использованию синхротронного излучения, Новосибирск (2002) 29

10 В В Волчков, Г В Демьянов, МВРусалов, Т И Сырейщикова, Затухание анизотропии флуоресценции нейтрального и заряженного 2-(3'-пиридил)оксазола, Материалы XIV Российской конференции по использованию синхротронного излучения, Новосибирск (2002) 31

11 С С Алексеев, В.В Волчков, Г В Демьянов, Т И Сырейщикова, Измерения затухания анизотропии флуоресценции в пучке синхротронного излучения, Труды третьей международной конференции молодых ученых и специалистов "0птика-2003", под редакцией проф С А Козлова, 250-251

12 А Н Литвинов, Г В Демьянов, Т И Сырейщикова, Г Е Добрецов, Использование метода разрешенного во времени резонансного переноса энергии между липофильными флуоресцентными зондами для исследования пространственной структуры биологических объектов, Труды третьей международной конференции молодых ученых и специалистов "Оптика-2003", под редакцией проф С.А. Козлова, 290-291.

13 В В Волочков, Г В Демьянов, М В Русаков, Т И Сырейщикова, Кинетика деполяризации флуоресценции нейтрального и заряженного 2-(3'-пиридил) оксазола, Журнал общей химии, 2005,75, 6, 836

Подписано в печать <*-,ае 2007 г. Формат 60x84/16. Заказ № Ч » Тираж ?о экз П.лИ,? Отпечатано в Родакционно-издательской и информационной службе Физического инсти гута им ПН Лебедева РАН с оригинал-макета заказчика 119991 Москва, Ленинский проспекч, 53 Тел 132 51 213

Введение

Цель и задачи работы

Научная новизна работы

Практическая значимость работы

Глава 1. Свойства синхротронного излучения

§1. Классическая теория синхротронного излучения

§2. Влияние динамики электронов в ускорителях на характеристики СИ

§3. Параметры Стокса в исследовании поляризации СИ

§4. Параметры Стокса в неоднородном магнитном поле

Глава 2. Экспериментальное исследование параметров Стокса синхротронного излучения

§1. Экспериментальная установка

§2. Исследование зависимости поляризационных характеристик

СИ от амплитуд бетатронных колебаний

§3. Сущность метода магнитной коррекции поляризации СИ

§4. Сравнение экспериментальных и теоретических данных

§5. Выводы

Глава 3. Теория затухания анизотропии флуоресценции

§1. Фотоотбор

§2. Кинетика затухания анизотропии флуоресценции

Глава 4. Исследования флуоресценции биологических объектов

§1. Метод разрешенной во времени анизотропии флуоресценции обзор литературы) п. 1.1 Исследование биологических мембран и протеинов п. 1.2 Исследование белков п. 1.3 Исследования в биохимии п. 1.4 Сегментальная подвижность молекул антител

§2. Экспериментальная установка п. 2.1 Расчет отдельных элементов установки п. 2.1.1 Двухзеркальная фокусирующая система п. 2.1.2 Призма Глана п. 2.2 Схема экспериментальной установки п. 2.3 Система детектирования п. 2.3.1 Кювета п. 2.3.2 Регистрация флуоресценции п. 2.3.3 Система счета фотонов п. 2.4 Юстировка системы

§3. Измерение анизотропии флуоресценции

§4. Анализ кривых затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции

§5. Оценка ошибок измерения анизотропии

Глава 5. Экспериментальные данные

§1. Измерения затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции зонда DPH в глицерине

§2. Измерение затухания анизотропии флуоресценции липидного зонда в искусственных мембранах

§3. Кинетика деполяризации флуоресценции нейтрального и заряженного 2-(3'-пиридил) оксазола

§4. Измерения затухания собственной флуоресценции липопротеинов очень низкой плотности

§5. Выводы

Метод флуоресцентной спектроскопии является одним из наиболее высокочувствительных и информативных методов исследования в биологии, химии и медицине. За время жизни возбужденного состояния в образце происходит множество молекулярных процессов, влияющих на его флуоресцентные характеристики, что дает возможность изучения возбужденных состояний молекул, фотохимических реакций, динамики быстрых молекулярных процессов, структуры и свойств сложных химических и биологических систем. Основными преимуществами метода при исследовании биологических систем являются его высокая чувствительность и возможность работы с живыми объектами при минимальных возмущениях последних. Именно благодаря этому роль метода флуоресцентной спектроскопии в создании современного представлении о структуре и функциях таких биологических структур как липопротеины, альбумины, клетки крови, биологические мембраны и т.д., связанных с жизнедеятельностью человека, является общепризнанной. Ранние применения флуоресцентной спектроскопии касались, главным образом, исследования влияния микроокружения флуоресцирующего соединения на его спектры испускания и интенсивность флуоресценции. Бурное развитие лазерной техники и особенно применение ускорителей как специализированных источников синхротронного излучения (СИ), обусловило быстрый прогресс в разработке методов флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением. Безусловно, лабораторные источники света являются более доступными, однако применение ускорителей в качестве специализированных источников синхротронного излучения обладает рядом несомненных преимуществ - это широкий и непрерывный спектральный диапазон, высокая стабильность временной структуры импульсов, обеспечение низкой мгновенной мощности облучения исследуемого биологического объекта, высокая степень поляризации излучения. Несмотря на то, что стационарная флуоресцентная спектроскопия все еще остается важным методом исследования, основное внимание в последнее время уделяется методу флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением, который позволяет получать дополнительную и более детальную информацию об объекте исследования, изучать тонкие механизмы динамики и конформационных перестроек в этих объектах, сохраняя при этом все возможности стационарной спектроскопии. Хотя детальную и точную информацию о структуре макромолекул могут дать данные по рентгеноструктурному анализу кристаллов, получаемая информация является статической. Кроме того, не все биологические объекты могут подвергаться кристаллизации. Для изучения соотношения между структурой и функцией в любой биологической макромолекуле необходимо оценить динамику как отдельных молекул, так и всей системы в целом. Спектроскопическая техника, которая обеспечивает получение как структурной, так и динамической информации, становится чрезвычайно полезной при анализе таких объектов. Флуоресцентная спектроскопия с временным разрешением является одним из таких методов, который находит широкое применение в исследованиях большинства биологических систем.

Метод флуоресцентной спектроскопии предполагает использование как природных флуорофоров, таких как хлорофилл, ароматические соединения и т.д., так и специально синтезированных флуоресцирующих молекул, обладающих необходимыми свойствами, ковалентно или нековалентно связывающимися с исследуемым объектом (соответственно "флуоресцентных меток" и "флуоресцентных зондов"). Временные параметры флуоресценции этих молекул сильно зависят от свойств окружения флуорофора. Поэтому, точное знание закона затухания флуоресценции может дать детальную информацию об окружении флуорофора и его взаимодействии с этим окружением. Такие разрешенные во времени измерения позволяют исследовать сложные гетерогенные системы и следить за популяциями молекул флуорофора, находящимися в различном окружении или исследовать процессы, протекающие в возбужденном состоянии. Основной целью подобных исследований является установление определенной связи между кинетическими параметрами флуоресценции и структурой и функцией исследуемых объектов.

При возбуждении флуорофора поляризованным светом испускание флуоресцирующей молекулы также поляризовано. Однако со временем поляризация флуоресценции падает по ряду причин. Одной из основных причин деполяризации является вращательная диффузия флуорофора, которая зависит от вязкости растворителя, размеров и формы вращающихся частиц. Зависимость поляризации и анизотропии флуоресценции от вращательной диффузии излучающей молекулы привела к применению метода измерения затухания анизотропии в биохимических и биомедицинских исследованиях.

С учетом выше изложенного является актуальным создание рабочей станции в пучке СИ ускорителя С-60 ФИ РАН, разработка и внедрение различных методик исследований биологических систем флуоресцентными методами с временным разрешением. Основные усилия автора были направлены на исследование поляризационных свойств синхротронного излучения ускорителя С-60 и их использование для разработки методики измерения затухания анизотропии флуоресценции. Необходимость работы с малыми количествами исследуемых веществ (например, с сыворотками крови человека) потребовала разработки оригинального метода детектирования флуоресценции, отличающегося от общепринятого. На первой стадии работы была поставлена задача исследовать поляризационные свойства пучка синхротронного излучения, в котором предполагалось разместить рабочую станцию. Эта задача представляет самостоятельный научный интерес. Изученные особенности поляризации СИ использовались на втором этапе работы при конструировании новой станции.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Основная цель работы состояла в создании действующей экспериментальной станции на базе синхротрона С-60 ФИ РАН для исследования вращательной динамики биологических систем и молекул (и их фрагментов), находящихся в растворе, а также в развитии методики флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением. Наряду с этим, были проведены исследования поляризационных характеристик синхротронного излучения ускорителя С-60 в неоднородном магнитном поле с использованием метода параметров Стокса, исследования зависимости поляризационных характеристик СИ от бетатронных колебаний ускоряемых электронов и возможности их подавления путем вариации магнитного поля ускорителя, корректируя при этом поляризационные характеристики излучения. Поляризационные свойства СИ учитывались при создании экспериментальной станции.

Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

Проведено экспериментальное исследование поляризационных характеристик синхротронного излучения ускорителя С-60 с использованием параметров Стокса. Изучено влияние бетатронных колебаний электронов на указанные характеристики СИ и исследованы возможности коррекции этих характеристик путем вариации магнитного поля ускорителя. Получены формулы, описывающие угловые распределения параметров Стокса и поляризационных характеристик СИ с учетом амплитуды бетатронных колебаний ускоряемых электронов.

- Разработана и отлажена система детектирования флуоресценции с временным разрешением. Для регистрации излучения используется метод счета одиночных фотонов, который является наиболее чувствительным методом, доступным в настоящее время для измерения времен затухания флуоресценции.

- Отработан метод флуоресцентных зондов для исследования биологических объектов. Этот метод имеет высокую чувствительность, дает возможность проводить измерения с живыми биологическими объектами и, в частности, исследовать структуру живой клетки. В отличие от рентгеноструктурного анализа метод позволяет исследовать объекты, не имеющие строго упорядоченной структуры.

- Разработан и внедрен ряд методик исследований биологических объектов флуоресцентными методами с временным разрешением: а) методика измерения времен затухания интенсивности флуоресценции, б) методика измерения параметров затухания анизотропии флуоресценции.

- Разработан и отлажен метод анализа измеренных кривых затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции для извлечения физических данных об исследуемых объектах, для чего был создан ряд специальных программ, основанных на нелинейном методе наименьших квадратов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Теоретически и экспериментально изучены все основные поляризационные характеристики синхротронного излучения в неоднородном магнитном поле, причем впервые в экспериментальных исследованиях поляризации СИ применен метод параметров Стокса, адекватно отражающий важнейшие характеристики эллиптической поляризации. Впервые получены экспериментальные данные измерения линейной, циркулярной и полной степеней поляризации СИ с использованием метода параметров Стокса.

Экспериментально подтверждено предсказанное ранее теоретически наличие двух минимумов в угловом распределении полной степени поляризации СИ, расположенных симметрично относительно плоскости равновесной орбиты электронов. Таким образом, показано, что максимальная деполяризация излучения, обусловленная бетатронными колебаниями электронов, имеет место не в плоскости орбиты ускоряемых электронов, как считалось ранее, а в направлении некоторого угла вс.

Результатом проведенной работы явилось создание на базе синхротрона С-60 ФИ РАН экспериментальной станции, разработка методик для исследования временного затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции биологических систем и демонстрация их возможностей.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Развит применительно к СИ метод параметров Стокса, полученные формулы позволяют учесть деполяризацию излучения за счет бетатронных колебаний электронов. Показано, что путем вариации магнитного поля ускорителя возможно скорректировать поляризационные характеристики излучения и получить источник практически полностью поляризованного света в широком спектральном диапазоне, при этом степень линейной поляризации излучения в плоскости орбиты ускоряемых электронов приближается к 100%.

Создание экспериментальной станции, разработка и внедрение новых методик временных измерений позволяет получить ранее недоступную информацию о свойствах биологических объектов. Исследование на данной станции белково-липидных комплексов крови позволяет изучать тонкие механизмы динамики и конформационных перестроек этих объектов и открывает совершенно новые возможности для контроля и ранней диагностики ряда серьезных заболеваний человека.

Использование метода анизотропии флуоресценции с временным разрешением делает более эффективными исследования молекулярной динамики биологических объектов.

Основные результаты исследований опубликованы в следующих работах:

1. Г.В.Демьянов, А.В.Титов, К.Н.Шорин, А.СЛров, Коррекция степени поляризации синхротронного излучения, Краткие сообщения по физике, ФИАН, 1986,11,50.

2. Г.В.Демьянов, В.А.Орлов, А.В.Титов, К.Н.Шорин, А.С.Яров, Поляризация синхротронного излучения в неоднородном магнитном поля, Краткие сообщения по физике, ФИАН, 1988, 1,21.

3. G.V.Demyanov, N.K. Kurek, E.N.Lapshin, T.I.Syrejshchikova,M.N. Yakimenko, Protein fluorescence decay of human serum VLDL exposed to synchrotron radiation, Nucl.Instrum. And Meth., Phys. Res., Sect.A 308 (1991) 215-218.

4. A.V.Akimov,G.V.Demjanov,N.K.Kurek, S. S .Molchanov,G.S .Pashhenko, T.I.Syrejshchikova, R.V.Fedorchuk,M.N.Yakimenko, Station for the investigation of the decay kinetics of the fluorescence anisopropy of biological objects, Nucl. Ins. And Meth., Phys. Res., Sect.A 359 (1995) 345347.

5. А.В.Акимов, Г.В.Демьянов, Н.К.Курек, С.С.Молчанов, Г.С.Пащенко, Т.И.Сырейщикова, Р.В.Федорчук, М.Н.Якименко, Установка для исследования кинетики затухания анизотропии флуоресценции биологических объектов, Оптика и спектроскопия, 1995,78,2,254-256.

6. G.V.Demyanov, M.Yu. Zabazarnych, S.I.Isakova, N.K.Kurek, E.N.Lapshin, T.I.Syrejshchikova, M.N. Yakimenko, Characteristic of molecular fluorescence of a lipid probe in human blood lipoproteins exposed to synchrotron radiation, Nucl. Ins. And Meth., Phys. Res., Sect.A 359 (1995) 342-344.

7. G.V.Demyanov, S.I.Isakova,N.K. Kurek, T.I.Syrejshchikova, M.N.Yakimenko, The measurements of the fluorescence anisotropy decay of the lipid probe in the liposomes, Bulletin of the Lebelev Physical Institute (Russian Academy of Science) N11-12(1995) 15-19.

8. В.В.Волочков, Г.В.Демьянов, М.В.Русаков, Т.И.Сырейщикова, Кинетика деполяризации флуоресценции нейтрального и заряженного 2-(3'-пиридил) оксазола, Журнал общей химии, 2005,75,6, 836, и представлены на следующих конференциях:

1. Г.В.Демьянов, С.И.Исакова, Н.К.Курек, Е.Н.Лапшин, А.Н.Рухтин, Т.И.Сырейщикова, М.Н.Якименко, Исследование кинетики затухания флуоресценции липидного зонда в липопротеинах крови человека при возбуждении синхротронным излучением, Тезисы Международной конференции по люминесценции, Москва, 1994.

2. А.В.Акимов, Г.В.Демьянов, Н.К.Курек, С.С.Молчанов, Г.С.Пащенко, Т.И.Сырейщикова, Р.В.Федорчук, М.НЛкименко, Установка для исследования кинетики затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции биологических объектов, Тезисы Международной конференции по люминесценции, Москва, 1994.

3. Т.И. Сырейщикова, С.К. Гуларян, В.Ю. Светличный, Г.Е. Добрецов, С.И Исакова, Г.В. Демьянов, Лейкоциты крови человека: исследование методом разрешенной во времени флуоресцентной спектроскопии, Материалы XIV Российской конференции по использованию синхротронного излучения, Новосибирск, 2002.

4. В.В. Волчков, Г.В.Демьянов, М.В. Русалов, Т.И. Сырейщикова, Затухание анизотропии флуоресценции нейтрального и заряженного 2-(З'-пиридил)оксазола, Материалы XIV Российской конференции по использованию синхротронного излучения, Новосибирск, 2002.

5. С.С. Алексеев, В.В.Волчков, Г.В. Демьянов, Т.И. Сырейщикова, Измерения затухания анизотропии флуоресценции в пучке синхротронного излучения, Труды третьей международной конференции молодых ученых и специалистов "0птика-2003", под редакцией проф. С.А. Козлова, 250-251.

6. А.Н. Литвинов, Г.В Демьянов, Т.И.,Сырейщикова, Г.Е. Добрецов, Использование метода разрешенного во времени резонансного переноса энергии между липофильными флуоресцентными зондами для исследования пространственной структуры биологических объектов, Труды третьей международной конференции молодых ученых и специалистов "0птика-2003", под редакцией проф. С.А. Козлова, 290291.

БЛАГОДАРНОСТИ

В заключении считаю своим долгом выразить глубокую благодарность научному руководителю к.ф.-м. н. Т.И.Сырейщиковой, а также д.ф.-м.н.

М.Н.Якименко|, за внимание, помощь и личное участие на всех этапах работы.

Хочу также поблагодарить весь коллектив лаборатории электронов высоких энергий Физического института им. П.Н.Лебедева РАН за поддержку и помощь в работе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведенная работа состоит из двух частей. Первая часть посвящена исследованию поляризационных характеристик СИ одного из каналов синхротрона С-60 ФИ РАН. Основные данные, полученные в результате этих исследований, были затем использованы для создания в этом канале установки для измерения интенсивности и анизотропии флуоресценции. Вторая часть работы посвящена созданию станции для исследований биологических систем методом флуоресцентной спектроскопии.

1. При исследовании поляризационных характеристик использован метод параметров Стокса, адекватно отражающий все важнейшие характеристики эллиптической поляризации излучения. Показаны преимущества этого метода, состоящие в том, что величина измеренной степени поляризации не зависит от начального положения поляроида, а определяется только точностью установки последовательных ориентаций поляроида.

Получены формулы для параметров Стокса СИ в неоднородном магнитном поле и выражения для линейной, циркулярной и полной степеней поляризации.

Приведены впервые полученные экспериментальные результаты измерений параметров Стокса, степеней линейной и циркулярной поляризации СИ, а также полной степени поляризации. Экспериментальные данные находятся в хорошем согласии с теоретическими расчетами, полученными с учетом влияния бетатронных колебаний на поляризационные характеристики СИ.

Показано, что методом вариации магнитного поля возможно значительно увеличить степень поляризации СИ, что дает возможность получить источник практически полностью поляризованного излучения в широком спектральном диапазоне.

2. На базе синхротрона С-60 ФИ РАН создан экспериментальный канал для измерения времен затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции биологических объектов и молекул, находящихся в растворе, во временном интервале 0,5 - 50 не при возбуждении в диапазоне длин волн 200- 1000 нм.

Разработана и отлажена система детектирования флуоресцентного сигнала с временным разрешением. Для регистрации был использован метод счета одиночных фотонов как наиболее чувствительный.

Отлажена система измерения и анализа кривых затухания интенсивности и анизотропии флуоресценции. На основе нелинейного метода наименьших квадратов создан ряд программ для анализа экспериментальных данных.

Проведены тестовые эксперименты, демонстрирующие возможности новой установки при измерении времен затухания флуоресценции и вращательной корреляции макромолекул и их фрагментов.

Внедрение методик флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением оказалось возможным благодаря работе синхротрона в "однобанчевом" режиме (ускоряется один сгусток электронов). Однако длительность импульса СИ составляет 7 не и это накладывает ограничения на минимальные времена затухания флуоресценции, измеряемые на данной установке. Тем не менее, временные измерения, выполненные в данной работе, подтвердили надежность разработанных методик.

1. G.A.Schott, Electromagnetic radiation, Cambridge University Press, Cambridge, 1912.

2. D.D.Ivanenko, I.Pomeranchuk, On the Maximal Energy Attainable in a Betatron, Phys. Rev, 1944, 65, 343.

3. J.Schwinger, Quantum Electrodynamics. Vacuum Polarization and Self-Energy, Phys. Rev, 1946, 70, 798.

4. А.А.Соколов, И.М.Тернов, Релятивистский электрон, М., «Наука», 1974.

5. Синхротронное излучение в исследовании твердых тел, Сборник статей. Под ред. А.А.Соколова, М., «Мир», 1970.

6. Синхротронное излучение. Свойства и применения. Сборник статей. Под ред. К.Кунца, М., «Мир», 1981.

7. И.М.Тернов, В.В.Михайлин, В.Р.Халилов, Синхротронное излучение и его применение, М., Изд. МГУ, 1985.

8. И.М.Тернов, В.В.Михайлин, Синхротронное излучение: теория и эксперимент, М., «Энергоатомиздат», 1986.

9. В.Н.Байер, В.М.Катков, В.С.Фадин, Излучение релятивистских электронов, М., «Атомиздат», 1973.

10. М.Борн, Е.Вольф, Основы оптики, М., «Мир», 1975.

11. Р.Аззам, Н.Башара, Эллипсометрия и поляризованный свет, М., «Мир», 1981.

12. Ф.А.Королев, О.Ф.Куликов, А.СЛров, Эллиптическая поляризация излучения релятивистских электронов в магнитном поле, Оптика и спектроскопия, 1968, 24, 316.

13. А.А.Коломенский, А.Н.Лебедев, Теория циклических ускорителей, М., Физматгиз, 1962.

14. Дж. Ливингуд, Принципы работы циклических ускорителей, М., ИЛ, 1963.

15. Л.Д.Ландау, Е.М.Лифшиц, Теория поля, М., Наука, 1973.

16. А.С.Яров, Автореферат диссертации, М., МГУ, 1966.

17. К.Н.Шорин, А.С.Яров, В.А.Орлов, Магнитная коррекция поляризации синхротронного излучения, Оптика и спектроскопия, 1981,51, 855.

18. В.Ч.Жуковский, О.Е.Шишанин, Свойства синхротронного излучения электронов, движущихся в слабофокусирующем магнитном поле, Оптика и спектроскопия, 1971, 31, 857.

19. В.Ч.Жуковский, О.Е.Шишанин, Влияние бетатронных колебаний электронов на свойства синхротронного излучения, ЖЭТФ, 1971, 61, 1371.

20. О.Е.Шишанин, Зависимость синхротронного излучения от линейной связи бетатронных колебаний, Изв. вузов, Физика, 1979, 8, 82.

21. Г.В.Демьянов, А.В.Титов, К.Н.Шорин, А.СЛров, Коррекция степени поляризации синхротронного излучения, Краткие сообщения по физике, ФИАН, 1986, 11, 50.

22. Г.В.Демьянов, В.А.Орлов, А.В.Титов, К.Н.Шорин, А.С.Яров, Поляризация синхротронного излучения в неоднородном магнитном поле, Краткие сообщения по физике, ФИАН, 1988, 1, 21.

23. G.V.Demyanov, V.A.Orlov, A.V.Titov, K.N.Shorin, A.S.Yarov, Dynamics of the Stokes parameters of synchrotron radiation, Nucl. Ins. And Meth., Phys. Res., Sect.A, 1991, 308, 149.

24. К.Н.Шорин, А.С.Яров, В.А.Орлов, Метод регулирования сечения сгустка электронов в синхротроне, Краткие сообщения по физике, ФИАН, 1984, 5,49.

25. И.С.Гук, П.И.Гладких, Вопросы атомной науки и техники, сер ТФЭ, 1981, 3(9), 64-66.26. .Weber, Biochem. J., Polarization of the fluorescence of macromolecules. Theory and experimental method. 1952, 51,145.

26. G.Weber, Polarization of the fluorescence in solution, in: Fluorescence and phosphorescence analysis, John Wiley & Sons, N.Y., 1966,217.

27. S.Kawato, K.Kinosita, A.Ikegami, Dynamic structure of lipid bilayers studied by nanosecond fluorescence techniques, Biochemistry, 1977, 16, 2319.

28. F.Jaehning, Altered Promoter Selection by a Novel form of Bacillus subtilis RNA Polymerase, Proc. Natl. Acad. Sci., 1979,76,6361.

29. Дж.Лакович, Основы флуоресцентной спектроскопии, Пер. с англ., Мир, 1986.

30. U.A. van der Hide, М.A.M.J. Zandvoort, E. van Faassen, G. van Ginkel, Y.K. Levin, On the interpretation of fluorescence anisotropy decays from probe molecules in lipid vesicle systems, Journal of Fluorescence, 1993, 3, 4, 271.

31. G. van Gincel et al, Time-resolved fluorescence depolarization experiments on lipid-lipid and lipid-protein interactions in membranes, Appendix to the Daresbury Annual Report 1990/1991, SERC Daresbury Laboratory, Warrington, UK, p.204,1991.

32. M.Behan, A.R.Cossins, A.G. McDonald, Appendix to the Daresbury Annual Report 1986/1987, SERC Daresbury Laboratory, Warrington, UK, p.122,1987.

33. С.А.Сторожок, Л.Ф.Панченко, Ю.Д.Филиппович, В,С,Глушков, Изменения физико-химических свойств биологических мембран при развитии толерантности к этанолу, Вопросы медицинской химии, 2001,2,7-13.

34. M.R. Kaplan, E.Trubniykov, G.Berke, Fluorescence depolarization as an early measure of T lymphocyte stimulation, J. of Immunological Methods, 1997, 201,15-24.

35. C.S.Lopez, H.A.Garda, E.A.Rivas, The effect of osmotic stress on the biophysical behavior of the Bacillus subtilis membrane studied by dynamic and steady-state fluorescence anisotropy, Archives of Biochemistry and Biophysics, 2002,408, 220-228.

36. J.Szubiakowskj, A.Balter, W.Nowak, K.Wisniewski, K.Aleksandrzak, Substituent-sensitive anisotropic rotations of 9-acetoxy-10-phenylanthracenes: fluorescence anisotropy decay and quantum-mechanical study, Chemical Physics Letter, 1999,313,473-483.

37. D.C.Mitchell, B.J.Litman, Molecular order and dynamics in bilayers consisting of highly polyunsaturated phospholipids, Biophys. J., 1998, 74, 879-891.

38. C.Niebylski, N.J.Salem, A calorimetric investigation of a series of mixed-chain polyunsaturated phosphatidylcholines: effect of sn-2 chain length and degree of unsaturation, Biophys J., 1994,67, 2387-2393.

39. R.L.Thurmound et al., Membrane thickness and molecular ordering in acholeplasma laidlawii strain a studied by 2H NMR spectroscopy, Biochemistry, 1994,33,13178.

40. D.C.Mitchell, B.J.Litman, Effect of cholesterol on molecular order and dynamics in highly polyunsaturated phospholipid bilayers, Biophys J., 1998, 75, 896-908.

41. M.C.Moncrieffe, S.Eaton, Z.Bajzer et al., Rotational and translational motion of Troponin C*, J. Biological Chem, 1999,274, 17464-17470.

42. K.Doring, T.Surrey, P.Nollert, F.Jahnig, Effects of ligand binding on the internal dynamics of maltose-binding protein, Eur. J. Boichem, 1999,266, 477-483.

43. I.Munro, I.Pecht, L.Stryer, Subnanosecond motions of tryptophan residues in proteins, Proc. Natl. Acad. Sci., 1979,76, 56-60.

44. E.John, F.Jahing, A synthetic analogue of melittin aggregates in large oligomers, Biophys. J., 1992, 63, 1536-1543.

45. D.T.F.Dryden, R.H.Pain, P.Varley, Appendix to the Daresbury Annual Report 1988/1989, SERC Daresbury Laboratory, Warrington, UK, p. 127, 1989.

46. G.S.Lakshmikanth, G.Krischnamoorthy, Solvent-exposed tryptophans probe the dynamics at protein surfaces, Biophys. J., 1999, 77, 11001106.

47. J.M.Janot, A.Beeby, P.M.Bayley, D.Phillips, The time resolved fluorescence and anisotropy of subtilisins BPN' and Carlsberg, Biophys. Chem., 1991,41,277-287.

48. A.P. Blokhin, M.F. Gelin, I.I. Kalosha, V.V. Matylitsky, N.P.Erohin, M.V. Barashkov, V.A. Tolkachev, Depolarization of fluorescence of pokyatomic volecules in noble gas solvents, Chem. Phys., 2001, 272, 69-76.

49. N.Ito, O.Kajimoto, K.Hara, Picosecond time-resolved fluorescence depolarization of /?-terphenyl at high pressures, Chem. Phys. Letter, 2000,318, 118-124.

50. Mark Maroncelli and Graham R. Fleming, Picosecond solvation dynamics of coumarin 153: The importance of molecular aspects of solvation, J. Chem. Phys. 1987, 86 (11).

51. I.G. Scheblykin, M.A. Drobizhev, O.P. Varnavsky, M. Van der Auweraer, A. G. Vitukhnovsky, Reorientation of transition dipoles during exciton relaxation in J-aggregates probed by flourescence anisotropy, Chem. Phys. Letter, 1996,261,181-190.

52. S.Tsuneda, T.Endo, K.Saito, K.Sugita, K.Horie, T.Yamashita, T.Sugo, Local mobility of polymer chain grafted onto polyethylene monitored by fluorescence depolarization, Chem. Phys. Letter, 1997,275,203-210

53. S.Jeon, S.C.Bae, J.Turner, S.Granick, Microviscosity of an ion-conducting polymer probed by fluorescence depolarization and dielectric spectroscopy, Polymer, 2003,43, 4651-4655.

54. J. Yguerabide, H. F. Epstein and L Stryer, Segmental flexibility in an antibody molecule, J. Mol. Biol., 1970, 51, 573-590.

55. А.В.Акимов, Г.В.Демьянов, Н.К.Курек и др., Установка для исследования кинетики затухания анизотропии флуоресценции биологических объектов, Препринт ФИАН, № 24, 1994.

56. А.Н.Зайдель, Е.Я.Шрейдер, Спектроскопия вакуумного ультрафиолета, М., Наука, 1967.

57. Ю.М.Александров, М.И.Благов, А.А.Комар и др, Ускоритель электронов С-60- специализированный источник синхротронного излучения, Препринт ФИАН, № 11, 1988.

58. Ю.М.Александров, В.Н.Махов, Т.И.Сырейщикова, М.Н.Якименко, Использование ФЭУ-71 в режиме счета фотонов для исследования временных процессов в наносекундном диапазлне, ПТЭ, №18, 1982.

59. Ю.М.Александров, В.Н.Колобанов, В.Н.Махов, Т.И.Сырейщикова, М.Н.Якименко, Установка для измерения временных характеристик люминесценции в наносекундном диапазоне, ЖПС, №36, 1982.

60. G.V.Demyanov, M.Yu.Zabazarnyh, S.I.Isakova, N.K.Kurek et al., Characteristic of molecular fluorescence of a lipid probe in human blood lipoproteins exposed to synchrotron radiation, Nucl. Ins. And Meth. Phys. Res., Sect.A, 1995,359,342.

61. E.Nishimoto, S.Yamashita, A.G.Szabo, T.Imoto, Internal Motion of Lysozyme Studied by Time-Resolved Fluorescence Depolarization of Tryptophan Residues, Biochemistry, 1998,37, 5599.

62. Ю.А.Владимиров, Г.Е.Добрецов, флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран, М., Наука, 1980.

63. Н.К.Курек, Определение локализации флуоресцентных зондов в липидных объектах, Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук, Мин. Здрав. РСФСР, НИИФХМ, 1991.

64. G.V.Demyanov, M.Yu.Zabazarnyh, S.I.Isakova et al., Characteristics of molecular fluorescence of a lipid probe in human blood lipoproteins exposed to synchrotron radiation, Nucl. Ins. And Meth. Phys. Res., Sect. A, 1995,359,342.

65. G.E.Dobretsov, E.N.Lapshin, N.K.Kurek, V.V.Kosnikov, R.K.Aidyraliev, Sov. Med. Rev. B. Physicochemical, 1991, 3,37.

66. G.V.Demyanov, N.K.Kurek, E.N.Lapshin, T.I.Syrejshikova, M.N.Yakimenko, Protein fluorescence decay of human serum with a very low density of lipoproteins exposed to synchrotron radiation, Nucl. Ins. And Meth. Phys. Res., Sect.A, 1991,308,215.

67. В.В.Волочков, Г.В.Демьянов, М.В.Русаков, Т.И.Сырейщикова, Кинетика деполяризации флуоресценции нейтрального и заряженного 2-(3'-пиридил) оксазола, Журнал общей химии, 2005, 75, 6, 836.

68. А.В.Акимов, Г.В.Демьянов, Н.К.Курек и др., Установка для исследования кинетики затухания анизотропии флуоресценции биологических объектов, Оптика и спектроскопия, 1995, 78,2,254.