Применение хлординитрозамещенных бенз-2,1,3-оксадиазола в проточном анализе аминосоединений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

РГ5 ОД

2 О иУ>1 На правах рукописи

•УДК 543.42.063.

ГАРМОНОВ Сергей Юрьевич

ПРИМЕНЕНИЕ ХЛ0РДИНИТР03АМЕЩЕННЫХ БЕНЗ-2Д,3-0КСАДИА30ЛА В ПРОТОЧНОМ АНАЛИЗЕ АМИНОСОЕДИНЕНИЙ

02.00.02 — аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

КАЗАНЬ — 1995

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Казанского государственного университета и кафедре аналитической химии Казанского государственного технологического университета

академик МАВШ, член-корр. РАЕН, доктор химических наук, профессор Г.К.БУДНИКОВ,

кандидат химических наук, доцент М.И.ЕВГЕНЬЕВ

доктор химических наук, профессор Ю.М.КАРГИН

кандидат химических наук С.Г.СЕЛЯНИНА

Центр химии лекарственных средств -Российский научно-исследовательский химико-фармацевтический институт, г.Москва

Защита состоится С/е ^с'сТр </ 1995 г.

на заседании диссертационного Совета К 053.29.02 по химическим наукам Казанского государственного университета, ул. Ленина, 18, химический факультет, Бутлеровская аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.ИЛобачевского Казанского государственного университета.

Отзывы на автореферат просим присылать по адресу: 420008, г.Казань, ул. Ленина, 18, 'КГУ^научная часть. Автореферат разослан " ° " /Уо Я с р> Я_1995 г.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного Совета,

кандидат химических наук "д'^^Л^С'ТТ'р Н.Р.Федотова

Актуальность темы: Аминосоединения представляют собой важнейшие классы органических соединений, широко распространены в живой природе и находят разностороннее применение в химической технологии, медицине и технике. Многие из аминосоединений являются высокотоксичными веществами и их содержание ]ребует контроля как в технологических смесях, так и в промышленных экосистемах.

Современный уровень развития аналитического контроля на основе доступных приборов и лабораторных устройств позволяет создавать системы мониторинга, к числу которых относятся проточно-инжекционный анализ (ПЙА) и тест-методы. Простота принципов и исполнения, экономичность и высокая производительность определяют их основные достоинства.

Существует ряд факторов, усложняющих разделение и определение аминосоединений биогенного и антропогенного характера в различных объектах. Это связано с высокой полярностью молекул аминосоединений, слабо выраженными для них хромофорными, электрофорными и флуорофорными свойствами. Вышеперечисленные факторы, а также низкое содержание определяемых веществ в анализируемых объектах затрудняет их высокочувствительное детектирование в проточных методах анализа без предварительной модификации аминосоединений. Кроме того, большая часть реакций получения производных этих вещестз малоспецифична, особенно при анализе матрицы сложного состава, к которой можно отнести биологические жидкости, воздушные среды, промышленные смеси, производственные и сточные воды.

В то же время существует потребность в использовании таких реакций модификации определяемых веществ, которые благодаря хромофорным свойствам соответствующих производных можно использовать в проточных методах анализа для селективных определений веществ в сложных по составу смесях без их разделения.

Целью работы явилось изучение условий проведения реакций химической модификации определяемых аминосоединений хлординитрозамещенными бенз-2,1,3-оксадиазола в проточных системах для использования их в системе проточно-инжекционного анализа, создания тест-систем и разработка методик селективного и чувствительного определения веществ в сточных и производственных водах, воздушных средах, биологических субстратах и непрерывном газовом анализе.

Научная новизна. Впервые хлординитрозамещенные бенз-2,1,3-оксадиазола использованы в проточных системах для химической модификации определяемых аминосоединений. Выявлены рабочие условия проточно-инжекционных определений гидразина и его замещенных по составу реакционных сред. Установлены условия иммобилизации и оптимизированы условия определений ароматических аминов

тест-методами (индикаторные трубки, тест-полоски) с использованием хромогенных реагентов. Предложены хемосорбциокные пробоотборники на основе индикаторньс трубок для концентрирования и анализа смесей ариламинов. Найдены рабоч» условия хромато1рафического разделения ариламинов и гидразидов кислот Показана возможность использования хлординитрозамещенных бенз-2,1,3 оксадиазола для непрерывного газового анализа ароматических аминов. Впервьи разработаны методики определения фосфабензида в биологических субстратах.

Практическая значимость работы. Предложены методики проточно инжекционного, хроматографического и спектрофотометрического определени аминосоединений в промышленных и модельных смесях, содержащих близкие п< свойствам компоненты. Разработаны методики с использованием индикаторных тест систем на основе нековалентно иммобилизованных реагентов дд колористического, спектрофотометрического и хроматографического анализ воздушных сред и сточных вод. Методики отличаются экспрессностью и высоко; чувствительностью определений.

В клинических условиях апробированы методики определения изониазидг фосфабензида и ксимедона в различных фиосубстратах (кровь, моча, слюна, эякулят фекалии), полученных у пациентов при фармакокинетических исследованию Использование изониазида в качестве фармакогенетаческого маркера позволяе диагностировать фенотип ацетилирования в терапевтическом мониторинг лекарственных средств. Результаты работы используются в фармакокинетически исследованиях (КГМУ) и внедрены в лечебную практику Казанской городско клинической больницы № 6.

Методика определения содержания гидразина в водных теплоносителях ТЭ' 1 утверждена в качестве стандарта предприятия и рекомендована для использования системе предприятий "Татэнерго".

На защиту выносится:

- результаты изучения и подбор оптимальных условий протекания реакци гидразина и его замещенных, ароматических аминов в проточных системе ■ (проточно-инжекционный анализ, индикаторные трубки, тесг-системь высокоэффективная жидкостная и тонкослойная хроматография);

- составы и способы приготовления селективных слоев индикаторных трубо] тест-систем;

- способы колористического, линейно-колористического, хроматографическо! определения замещенных гидразина и ариламинов в воздушных и водных средах, также в автоматическом газовом анализе;

- чувствительные и избирательные методики проточно-инжекционно] определения гидразина и его замещенных в модельных смесях и биологически

-4-

субстратах;

- методики хроматографического и . спектрофотометрического определения лекарственных веществ (фосфабензид, изониазид, апрессин, ксимедон) в биологических субстратах; метод • определения фенотипа ацетилирования для терапевтического мониторинга лекарственных средств.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международной конференции "Sensor Techno" (С.-Петербург, 1993), Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-94" (Краснодар, 1994), Симпозиуме по проточному анализу (Москва, 1994), II Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1995), Международной конференции "Ленинские горы-95" (Москва, 1995),. 5 Международном симпозиуме "Kinetics in Analytical Chemistry" (Москва, 1995), 1-м Съезде Российского научного общества фармакологов "Фундаментальные исследования • как основа создания лекарственных средств" (Волгоград, 1995), итоговой научной конференции КГУ (Казань, 1995), итоговых научных конференциях КГТУ (Казань, 1994, 1995).

Публикации По материалам диссертации опубликовано б статей и 8 тезисов докладов.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, заключения и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 162 страницах, содержит 30 рисунков, 23 таблицы и библиографию 217 наименований. В первой главе предстаален обзор литературы, посвященный использованию химической модификации при определении аминосоединений в экологических и биологических объектах, проточно-инжекционному анализу аминосоединений, свойствам нитрозамещенных бенз-2,1,3-оксадиазола и их аналитическому использованию. Во второй главе описана постановка задачи, аппаратура, объекты и техника эксперимента. В последующих трех главах изложены результаты с их обсуждением. В приложении к диссертации представлены акты использования аналитических методик.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с Координационным планом РАН по теме 2.20.1 и в рамках РНТП "Университеты России".

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Проточно-инжекционный анализатор собран на базе перистальтического насоса Zalimp (тип 4) (или плунжерного насоса ММС типа 3 Д), ручного дозирующего крана (Microtechna) с калиброванной петлей регулируемого объема, проточной кюветы объемом 6 мкл (1=0,5 см) (Lachema). В качестве детекторов использованы- 5-

спектрофотометр Specol-210 и фотометрический блок от аминокислотного анализатора Т339 (Lachema), совмещенные с самописцем К-100 (Carl Zeiss Jena). Проточные коммуникации выполнены из тефлоновых трубок с внутренним диаметром 0,6 мм.

Жидкостную хроматографию проводили на хроматографе Милихром 1 (колонки Силасорб С18 и Силасорб 600, 2x120 мм) со спектрофотометром Specol-210 в качестве детектора. Тонкослойная хроматография выполнена на пластинках Силуфол УФ-254.

Стандартные газовые смеси ариламинов готовили статистическим способом в боксе объемом 90 л. Для изготовления индикаторных трубок использовали стеклянные трубки (диаметр 2 мм) заводского изготовления. В качестве побудителей расхода воздуха использованы электроаспиратор ЭА-30 и газосигнализатор полуавтоматический ГСП-11.

Спектрофотометрические измерения проведены на приборах СФ-26, Specord

а

М-40, Specol-210. С использованием масс-, ПК-спектрального (ИК. Фурье спектрометр IFS-113V), элементного анализа, потенциометрического титрования (рН-милливольтметр MV-87S) и вольтамперометрии (полярограф ПУ-1, потенциостат ПИ-50-1.1) установлен состав некоторых синтетически выделенных производных и изучены их свойства.

В качестве объектов исследования в диссертации использованы ароматические амины, гидразин и его замещенные, которые были очищены по стандартным методикам. Лекарственные вещества, а также их формы - фармакопейной чистоты. При работе с биологическими субстратами использовались их интактные образцы. Апробация разработанных методик при анализе биосубстратов практически здоровы» людей и больных проводилась в клинических условиях в процессе разовой и курсовой терапии.

ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННЫЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИДРАЗИНА И ЕГО ЗАМЕЩЕННЫХ

Использование химических реакций для получения производных определяемы; веществ в проточных методах, при которых полнота протекания химической реакции, диффузионные процессы не завершены и детектирование проводится' i динамических уславиях, требует оптимизации условий взаимодействия реагента < определяемыми веществами. При подборе условий проточно-инжекционны: определений выявлен сложный характер влияния состава реакционной среды, pH i других химических и физических переменных на величину аналитического сигнала.

-6.-

Гак, при выборе реагентов в системе ПИА было обнаружено, что в реакциях с гидразином и его замещенными 7-хлор-4,6-динитробензофуроксан (БФО) образует «устойчивые из-за редокс реакций производные, поэтому для модификации этих зеществ в ПИА использовали 4-хлор-5,7-динитробензофуразан (БФЗ). Аналитические длины волн для детектирования в системе ПИА осуществляли на зеновании спектров синтетически выделенных производных (рис.1). Наибольшая гувствительность определений гидразина достигается в нейтральных средах при рН 5,5-7,5, что согласуется и с результатами, полученными в равновесных условиях. _В >олее кислых и щелочных средах наблюдается резкое снижение интенсивности шгнала. При этом, так же как и в равновесных условиях, наблюдается 1увствительность скорости образования производного к составу буферных сред. 5олее высокая интенсивность сигнала при постоянстве значений рН достигается в юратном и фосфатном буферных растворах. На реакцию замещенных гидразина арилгидразиды, 1-гидразинофталазин) с БФЗ в системе ПИА изменение рН в нгтервале 4,5-7 уже не оказывает влияния. Это связано с тем, что в отличие от •идразина взаимодействие БФЗ с замещенными гидразина завершается практически 1ри смешении растворов и влияние конкурентных реакций (в том числе гидролиза ¡еагента) на аналитическую реакцию незначительно.

Состав реакционной среды в потоке носителя, природа растворителя для тжектируемого в поток реагента также сильно влияет на полноту завершения >еакции и интенсивность сигнала в ПИА гидразина и его замещенных. Выбор гастворителя для инжектируемых реагентов определяется их возможным гидролизом, I также растворимостью реагента, продуктов взаимодействия и обеспечением юлноты завершения аналитической реакции. Использование в качестве >астворителей спиртов, диметилсульфоксида (ДМСО), тетрагидрофурана, диоксана 'казалось неприемлемым из-за малой устойчивости реагента в них вследствие идролиза. В то же время в ацетонитриле • реагент оказался устойчивым длительное ремя и обеспечивал постоянство интенсивности сигнала при многократном вводе его поток носителя. По-видимому, такое поведение БФЗ связано с описанным в лите-атуре для смесей ацетонитрил-вода проявлением микрогетерогенности смеси астворителей при сохранении макрогомогенности среды. Чувствительность пределений зависела и от концентрации реагента в инжектируемом растворе и в рисутствии мешающих компонентов поддерживалась равной 0,02-0,03 моль/л. )птимальный объем инжектируемого раствора реагента при этом составлял ПО мкл. ипичное влияние состава потока носителя на проточно-инжекционные определения идразина приведены в табл.). Как видно, наибольшая чувствительность определений степень завершения реакции достигается в спиртово-водных средах и

- 7 -

Рис, 1.Спектры поглощения динитробензофуразановых производных (2-10 "5 моль/л) в ДМСО: 1 - гидразида изоникотиновой кислоты; 2 - гидразида ди-фенидфосфинилуксусной кислоты; 3 - гидразин офталазина; 4 - гидразина. 5 - поглощение реагента.

Рис. 2. Зависимость высоты пика от соотношения концентраций амин-гидразин (8-10"6 моль/л) в ПИА. Состав смесей: 1 -метиламин-гидразин, 2 - диметиламин-гидразин, 3 - триметиламин-гидразин, 4 - диметиламин-гидразин, триметиламин (4-Ю"4 моль/л), 5- аммиак-гидразин. Поток этанол-вода (30:70, об.), скорость потока 1,5 мл/мин. "

оптимальный поток соответствует этанольно-водной смеси. В потоке такого состава сохраняется и гомогенность среды.. В тоже время добавление к водным потокам ацетонитрила, ДМСО и других растворителей или при проведении определений в неводных средах наблюдается понижение чувствительности определений и полноты протекания реакции. Эти -акспеоиментальные данные, очевидно, связаны со стадийностью образования бис-производного гидразина в условиях детектирования, которое протекает через первоначальное образование монозамещенного продукта (схема). Если последний образуется количественно в аце-тонитриле и других средах практически в момент смешения реагирующих веществ (^„,=520 нм), то последующее образование бис-производного в равновесных условиях из-за уменьшения основности аминогруппы протекает во времени (15-20 минут). Образование аналитического продукта при этом сопровождается уменьшением интенсивности поглощения при 520 нм, появлением полосы поглощения с Хщ=635 нм и ростом ее интенсивности.

Влияние растворителя на высоту пика в ПИА гидразина ( 8-Ю"6 моль/л, рН=6,84; скорость потока 1,9 мл/мин., 1=635 им).

Состав потока

Объемные соотношения

Высота пика, мм

компонентов

Вода

100 95:5 90:10 80:20 70:30 60:40 70:30 70:30 70:30 70:30

35 55 85

105 114 114 98

106 24 14

Вода-этанол Вода-этанол Вода-этанол Вода-этанол Вода-этанол Вода-метанол

Вода-пропанол-2

Вода-ацетонитрил

Вода-ДМСО

В ПИА замещенных гидразина, для которых возможно образование только монозамещенных продуктов, напротив, лучшей средой для определений служат смеси ДМСО-вода. Характер влияния растворителей на ПИА гидразина, как видно, определяется полярными свойствами и основностью среды. Введение в поток растворителей с основными свойствами приводит к резкому увеличению интенсивности сигнала, что свидетельствует о проявлении основного катализа растворителем. Проявление основного катализа наблюдается и при рассмотрении влияния алкиламинов, алкилзамещенных гидразинов на интенсивность аналитического сигнала (рис.2). Добавление в поток носителя такого основания, как триметиламин, не образующего производных с БФЗ, вызывает резкое возрастание интенсивности сигнала. В тоже время добавление метиламина, диметиламина, в тех же условиях образующих производные, вначале вызывают увеличение интенсивности сигнала. При высоких концентрациях оснований происходит уменьшение сигнала, что уже связано с протеканием конкурирующих реакций реагента с ними, которые

Таблица 2.

Результаты определения гидразина и его замещенных в системе ПИА в модельных и промышленных смесях (п= 4 ).

Компонент Анализируемые Введено, Найдено,

смеси (мкг/мл) соединения мкг/мл мкг/мл

Фосфабензид (21.9) Гидразин 0,256 0,26010,017 0,04

Фенол (18,75) Гидразин 0,256 0,260±0,021 0,05

Анилин (7.44) Гидразин 0,256 0,264±0,021 0,05

Ацетон (4.60) Гидразин 0,256 0,262±0,025 0,06

Хлорид калия (0.59 г/л ) Гидразин 0,256 0,253+0,016 0,04

Фосфат натрия (1.31 г/л)

Метиламин (1,50,буфер Гидразин ' 0,256 0,264±0,021 0,05

триметиламин- Н С1)

1,1 - Диметилгидразин Гидразин 0,256 0,247±0,019 0,05

(4,80, рН=7,38)

Анилин ( 18,6, рН=7;38) Гидразин 0,256 0,263*0,021 0,05

Стандарт аминокислот (6,11 г/л) Изониазид 1,0 1,04±0,06 0,05

Салициловая кислота Гидразид 1,0 1,03±0,06 0,05

(100), метиламин салициловой

(50), диметиЛамин кислоты

(50), аммиак (20)

Воды парогенераторов1' Гидразин 0,052+0,003 '0,04

- 10 -

приводят к снижению эффективной концентрации БФЗ в потоке. Каталитическое влияние триметиламина обнаружено нами и в равновесных условиях, но при этом наблюдалось увеличение скорости реакции без изменения интенсивности сигнала. Этот эффект использован для повышения чувствительности определений и устранения мешающего влияния компонентов анализируемой матрицы.

При выборе рабочих условий гидродинамические параметры оказались оптимальными с точки зрения интенсивности и формы пиков при скорости потока в интервале 1,2-2 мл/мин., при этом аналитический сигнал не зависит от природы вещества. Длина реактора свыше 90 см не оказывала влияния на интенсивность сигнала.

Было исследовано влияние различных компонентов, сопутствующих определяемым веществам (табл.2). Мешающее влияние основных компонентов матрицы можно исключить при использовании своеобразных каталитических буферов, в качестве которых можно использовать триметиламин и другие основания, не образующие производных с БФЗ. На основании проведенных исследований разработаны методики проточно-инжекционного определения гидразина и его замещенных, аналитические характеристики которых представлены в табл.3. Предел обнаружения, рассчитанный по ЗЯ-кригерию, составил для гидразина и его замещенных 12 и 80-160 нг/мл, соответственно. Полученные результаты использованы для разработки методики определения гидразина в производственных водах ТЭС . Таблица 3.

Аналитические характеристики ПИЛ гидразина и его замещенных (п=30)

Соединение* Уравнение Линейный интервал регрессии, концентраций, мкг/мл мкг/мл Коэффициент корреляции Производительность, проб/час

ГИНК Н(мм)=73,7 С-0,7 0,1-2,5 0,9986 32

ГДФУК Н(мм)=28,5 С-0,7 0,17-3,5 0,9993 28

ГГФ Н(мм)=58,2 С-0,8 0,1-2,5 0,9991 30

ГБК Н(мм)=41,2 С+0,5 0,1-2,5 0,9987 30

гск Н(мм)=35,6 С-0,8 0,2-4,0 0,9992 28

ФГ Н(мм)=28,3 С-0,9 0,2-4,0 0,9986 26

Гидразин Н( мм)=445 С +0,4 0,015-0,4 0,9991 45

Тидразиды изоникотиновой (ГИНК), дифенилфосфинилуксусной (ГДФУК), бензойной(ГБК), салициловой (ГОК) кислот, 1-гидразинофталазин (ГГФ), фенилгидразин (ФГ).

- и -

ПРОТОЧНЫЕ ИНДИКАТОРНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ МОНИТОРИНГА АМИНОСОЕДИНЕНИЙ В ВОЗДУШНЫХ И ВОДНЫХ СРЕДАХ

Модификация аминосоединений до их динитробензоксадиазольных произвол ных была использована при разработке тест-методов, позволяющих количественн оценивать содержание токсикантов в воздушных и водных средах. В качестве инди каторных систем были использованы индикаторные трубки для анализа воздушны и тест-полоски для анализа водных сред. Селективными слоями служили неко валентно иммобилизованные в твердый носитель реагенты (БФЗ, БФО). Пр] выборе реагентов для определения ариламинов исходили из данных, полученных равновесных условиях по реакционной способности реагентов в реакциях с арома тическими аминами различной степени замещения, а также по контрастности поло поглощения соответствующих производных. БФО более эффективен при коло ристических определениях первичных ариламинов, а БФЗ обеспечивал более высоку» скорость образования окраски селективных слоев и ее повышенную устойчивост при модификации ГЧ-замещенных ариламинов, а также замещенных гидразина.

При разработке индикаторных средств изучена зависимость аналитическог сигнала (контрастность, интенсивность и четкость границы раздела изменившег окраску селективного слоя) от ряда физико-химических параметров: природы ■ ] структуры носителя, размера его зерен, способа иммобилизации, состав растворителей использованных для формирования селективных слоев. На основани; проведенных исследований найдены оптимальные условия, "при которых наблюдаете линейно-колористическая зависимость окрашенной зоны от концентраци: токсикантов. Формирование селективных слоев проводилось пропиткой растворам! реагентов (индикаторные трубки) или отливом пленок с последующим испарение1 растворителей в вакууме (тест-полоски). При этом выдерживалось соотношени между массой носителя, объемом раствора и концентрацией реагента в последов Испытания индикаторных трубок показали, что они позволяют определят ариламины после аспирирования через них анализируемого воздуха на уровне 0,1 0,5 ПДК в воздухе рабочей зоны для различных токсикантов (табл.4). Первичнь1 ариламины образуют при этом контрастные слои красного цвета в- момен аспирации воздуха, для вторичных и третичных аминов окраска синего цвет развивается за 2-3 мин. Следует отметить, что в растворах реакции бензофуразанов бензофуроксанов с такими соединениями, как дифениламин, трифенилами протекают достаточно медленно и завершаются за час и более. На силикагеле, нитроцеллюлозной пленке и ацетилцеллюлозной пленке те же реакции завершаютс за 2-3 минуты с образованием контрастного слоя. Для силикагеля известно проявле ние каталитических свойств, влияющих на скорость гетерофазных реакций, связанно!

- 12 -

Таблица 4.

Индикаторные трубки для определения ариламинов в воздушной среде (У=1 л/мин., 1=10 мич., 0,5 % реагента по массе на силикагеле)

Токсикант

ПДК р.з., мг/м3

Предел обнаружения, мг/м3

Дифениламин N, N - Д и метиланилин

Анилин

п-Хлораншшн о-Хлоранилин о-Нитроанилин п-Толуидин

0,10 0,05 0,30 0,50 3,00

10,0 (ОБУВ) 0,20

0,05 0,05 0,075 0,20 0,15 0,25 0,05

с образованием я-комплексов с ароматическими соединениями. По-видимому, такой же эффект наблюдается и в нитро(ацетил)целлюлозной матрице.

Скрининг водных сред на содержание токсикантов проводили не только визуально по развитию окраски в тест-системе, но и при последующем фотометрировании пленок. Аналитические длины волн были выбраны исходя из светопоглощения тест-пленок после контакта с соответствующими веществами. Величина светопоглощения тест-системы линейно связана с концентрацией токсикантов:

анилин А=3,37 С(мг/л) + 0,04; г=0,992; >.=510 нм;

фенилгидразин А=0,49 С(мг,/л) - 0,01; г=0,990; Я=510 нм;

Ы,К-диметиланилин А=0,14 С(мг/л) - 0,01; г=0,987; Х=640 нм; ЧЫ-диэтиланилин А=0,18 С(мг/л) - 0,01; г=0,986; Я=660 нм; 2,2,4-триметил-1,2- А=0,16 С(мг/л) + 0,01; г=0,991; Х=630 нм. дигидрохинолин

Индикаторные трубки оказались эффективными и как хемосорбционные пробоотборники для анализа воздушных сред, содержащих смеси аминосоединений. Экспериментально установлены условия пробоотбора по степени поглощения токсикантов селективным слоем. При скорости аспирации 2 л/мин и ниже не наблюдается проскока определяемых веществ через селективный слой. Степень поглощения анилина при этих условиях, например, составляла 92-95 %. Состав и содержание компонентов воздушных сред определяли после элюирования продуктов хемосорбции растворителями-экстрагентами (ацетонитрил, метанол) с силикагеля методом ВЭЖХ (табл.5). При этом потенциальные компоненты промышленных экосистем не влияют на результаты определений (табл.6).

Таблица 5.

Результаты определения анилинов индикаторными трубками с последующим детектированием методом ВЭЖХ в виде динитробензофуроксановых производных (объем пробы 10 л, экстрагент - метанол, п=4, элюэнт метанол -0,05 М фосфорная кислота (70:30, об.), длина волны 510 нм).

Компоненты Введено компонента, Найдено, Sr

газовой смеси мг/м3 мг/м3

Анилин 0,10 0,12±0,02 0,10

.м-Хлоранилин 0,05 0,05±0,01 0,10

Анилин 0,20 0,21±0,03 0,09

м-Хлоранилин 0,45 0,44±0,05 0,07

Таблица 6.

Результаты определения ариламинов тест-методами в воздухе О и воде в присутствии различных соединений (п=4, Р=0,95)

Состав смесей (мг/л, *мг/м3)

Определяемое Введено, Найдено, вещество мг/л(*мг/м3) мг/л (*мг/м3)

St

'Ацетон (400), хлорофррм (500) 'Метанол (600), Гексан (300) 'Метиламин (2), HCL (20), 'Аммиак (20)

'Аммиак с поглотительной трубкой (150) Фенол (2,0)

Уксусная кислота (300) Аммиак (0,5) Метиламин (0,1) Диметиламин (0,1) Гидросульфит

аммония (5000), Анилин (2) Метиламин (10) Аммиак (1) Диметиламин (0,5)

Анилин

Анилин Анилин

Анилин Анилин Анилин Фенилгидразин

1Ч,Ы-диметил-анилин

0,5*

0,5* 0,5*

0,5* 0,2 0,1 0,2

0,48±0,04 0,06

0,7

0,46±0,06 0,48±0,05

0,48±0,05 0,22+0,03 0,13±0,03 0,21±0,03

0,09 0,07

0,07 0,09 0,10 0,11

0,72±0,08 0,07

Благодаря высокой реакционной способности реагентов в неравновесных условиях и спектральным характеристикам производных осуществлен непрерывный проточный анализ ариламинов в воздушных средах с помощью автоматического газосигнализатора ГСП-11, (фотоколориметрическое детектирование производных на хлопчатобумажной ленте). Оптимизация условий определений (скорость воздушного потока 1 л/мин., растворитель рабочего раствора дибутилфталат, его объем при дозировании 0,025 мл, изменения в электронной схеме прибора) позволила приблизить чувствительность определений ариламинов к чувствительности ферментативной реакции, используемой в ГСП-11. При превышении предельно допустимых концентраций ариламинов наблюдается автоматическое срабатывание звуковой'и световой сигнализации прибора после аспирации воздуха в течении 3-15 минут.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ, ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННОЕ, СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СУБСТРАТАХ

Химическая модификация хлординитрозамещенными бенз-2,1,3-оксадиазола была использована для мониторинга лекарственных веществ (изониазид, фосфабензид, ксимедон, апрессин) в биологических субстратах человека. Взаимодействие БФЗ. с лекарственными веществами в водных и водно-органических средах протекает с образованием интенсивно окрашенных в' красный цвет производных, являющихся NH-кислотами. Изменение кислотности среды ' выше значений рН=4 не влияет на их спектральные характеристики. В более кислых растворах длинноволновые полосы NH-кислот претерпевают типсохромный сдвиг. Подобные равновесия в спектрах поглощения наблюдаются и при изменении полярности реакционных смесей при добавлении малополярных растворителей. Это ограничивает возможности использования нормально-фазного варианта ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием в анализе лекарственных веществ.

Возможность спектрофотометрического детектирования лекарственных веществ в виде производных была проверена с учетом сложного компонентного состава биологической матрицы. Взаимодействие реагента с биогенными компонентами мочи, слюны, сыворотки крови, эякулята и воднорастворимой частью фекалий здорового человека приводит к образованию интенсивно окрашенных в области 480630 нм растворов, что мешает определению лекарственных веществ. В то же время исследование реакций отдельных компонентов биологических жидкостей показали, что они не образуют с реагентом производных, поглощающих в этой области спектра. Обнаружено, что изменение пробоподготовки биосубстратов за счет предва-

- 15- .

рительной обработки их трихлоруксусной кислотой и последующем возвращении рН до исходных значений можно исключить влияние компонентов матрицы на результаты определений. По-видимому, наблюдаемый эффект связан с кооперативными взаимодействиями биогенных соединений биосубстратов с реагентом. Элиминирование влияния матрицы на результаты определений позволяет проводить прямые определения лекарств в биосубстратах в системе ПИ А, методе спектрофотометрии с чувствительностью до 0,2 мкг/мл. Подобная избирательность и чувствительность определений важны для клинической практики, поскольку изучение экстракционных характеристик лекарственных веществ показало неэффективность этого приема при извлечении их из биосубстратов.

Предколоночная модификация лекарственных веществ в нормально-фазной ВЭЖХ показала преимущества перед описанными в литературе приемами, поскольку она приводит к упрощению хроматограмм мочи и стабилизации во времени определяемых

Таблица 7.

Результаты определения лекарственных веществ в биологических субстратах и лекарственных формах (п=4;Р=0,95)

Анализируемые Анализируемые Метод Введено, Найдено,

объекты вещества анализа мкг/мл мкг/мл

Гидролизат ■ Фосфабензид ПИА 1,30 1,36±0,13 0,06

белков Изониазид ПИА 2,80 2,87Й,23 0,05

Сыворотка крови Изониазид СФ 5,12 4,80±0,30 0,04

Изониазид ПИА 5,12 4,75±0,37 0,05

Фосфабензид СФ 10,25 9,95±0,63 0,04

Изониазид ПИА 10,25 9,87±0,78 0,05

Моча Фосфабензид СФ 2,04 2,14*0,10 0,03

Фосфабензид ПИА 2,04 2,08±0,17 0,05

Фосфабензид ВЭЖХ 2,04 1,99±0,16 0,05

Изониазид СФ 4,25 4,15±0,20 0,03

Изониазид ПИА 4,25 4,05±0,32 0,05

Изониазид ВЭЖХ 4,25 4,12±0,33 0,05

Эякулят Ксимедон тех 5,10 4,90±0,85 0,11

Фосфабензид СФ 9,55 9,14±0,58 0,04

Слюна Изониазид ПИА 3,10 3,28±0,31 0,06

Таблетки Апрессин ПИА 10,1(Фарм.) 9,8±0,4 0,03

СФ-спектрофотометрия, ПИА-проточно-инжекционный анализ, ВЭЖХ -высокоэффективная жидкостная хроматография, ТСХ-тонкослойная хроматография.

- 16 -

веществ при хранении биологических жидкостей. Хроматографические пики динитробензофуразановых производных лекарственных веществ хорошо разрешены при условиях: для изониазида - ацетонитрил - 0,05 М ацетатный буфер (25:75, об.), Уц=4 мин., для фосфабензида - ацетонитрил - 0,05 М ацетатный буфер-метанол (28:67:5), мин., Зависимости высот пиков от концентрации препаратов в моче

линейны до их содержания 150 ' мкг/мл, охватывая всю область их фармакокинетических концентраций.

В методе ТСХ при использовании БФЗ для обнаружения зон разделенных веществ подобраны условия совместного определения лекарственных веществ, их метаболитов и биогенных компонентов. Значения Яг в смеси ацетон-хлороформ-этанол (6:6:1, об.) составляют для изониазида, фосфабензида, ксимедона, ацетилизониазида 0,3, 0,5, 0,15, 0,1, соответственно. При этом достигается более высокая чувствительность определений, чем при проявлении традиционно используемыми реагентами. Так, предел обнаружения ГИН1^и ГДФУК, ксимедона составляет 0,1, 0,1 и 0,3 мкг, соответственно.

На основании проведенных исследований оптимизированы способы пробоподгото-вки биосубстратов и разработаны проточно-инжекционные, хроматографические, спектрофотометрические методики определения лекарственных веществ в биосубстратах (табл. 7), которые были использованы для изучения типа экскреции препаратов из организма человека, а также анализе лекарственных форм. Сопоставление результатов определений различными методами (ТСХ, ВЭЖХ, ПИА, спектрофотометрия ) показывает хорошее согласование между ними. Разработан экспрессный и простой в экспериментальном отношении метод определения фенотипа биотрансформации по типу ацетилирования аминосодержащих лекарственных средств при использовании изониазида в качестве фармакогенетического маркера ( табл. 7).

Таблица 8.

Фармакокинетические параметры изониазида по данным исследования мочи при пероральном приеме 450 мг однократно (п=22).

Параметр Быстрые ацетиляторы Медленные ацетиляторы

Период

полувыведения, час 2,5 ± 0,5 4,5 ± 0,6

Фракция дозы, % 6,5 ±1,6 16,0 ± 2,4 Константа скорости

элиминации, 1/час 0,277 ± 0,055 0,154 ±0,021

выводы

1. Для химической модификации аминосоединений в проточных системах впервые предложены хлординитрозамещенные бенз-2,1,3-оксадиазола, обеспечивающие высокую чувствительность и избирательность фотометрического детектирования образующихся производных.

2. Установлены рабочие условия для проточно-инжекционных определений гидразина и его замещенных по составу реакционных сред (рН, компоненты потока, природа неводного растворителя) и гидродинамическим характеристикам.

3. Предложены индикаторные трубки, тест-системы для визуального и спектрофотометрического мониторинга аминосоединений в воздушных и водных средах с чувствительностью детектирования токсикантов на уровне их предельно допустимых концентраций.

4. Предложены хемосорбционные пробоотборники для анализа замещенных анилинов в воздушных средах с последующим определением методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием.

5. Установлена возможность использования хлординитрозамещенных бенз-2,1,3-оксадиазола в автоматическом газовом анализе. Оптимизированы условия обнаружения ароматических аминов в воздушных средах в непрерывном режиме с использованием газосигнализатора ГСП-11.

6. Разработаны селективные и чувствительные методики проточно-инжекцион-ного определения гидразина и его замещенных в смесях сложного состава и биологических субстратах с пределом обнаружения гидразина 12 нг/мл. Методика определения гидразина апробирована в анализе вод тепловых электростанций.

7. Разработаны методики определения лекарственных веществ (фосфабензид, изониазид, апрессин, ксимедон) в биологических субстратах (кровь, моча, слюна, эякулят, фекалии) и лекарственных формах в виде их динитробензофуразановьп производных, пригодные для терапевтического мониторинга и фармакокинетическю исследований в клинических условиях. Для фосфабензида методики разработаны впервые. Предложен и апробирован в клинических условиях экспрессный метод определения фенотипа ацетилирования лекарственных средств.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Evgen'ev М. I., Nikolaeva N. G., Evgerfeva I. I., Moskva N. A., Garmonov S. Y Indicating systems for analysis of aromatic amines and hydrazines in different object /, Sensor Techno: proceeding abstr. - St. Petersbyrg, 1993. - P. 88

2. Евгеньев M. И., Гармонов С. Ю., Евгеньева И. И., Будников Г. К Хлординитрозамещенные бенз-2,1,3-оксадиазола в анализе аминосоединений в

- 18 -

точных водах, воздушных средах и биологических жидкостях // Всерос. конф. по нализу объектов окружающей среды "Экоаналитика - 94"; Тез. докл. - Краснодар, 994. - С. 127-128.

. Евгеньев М. И., Гармонов С, Ю., Угрич-Требинский В. В., Будников Г. К. 1роточно-инжекционное определение замещенных гидразина со пектрофотометрическим детектированием // Симпозиум по проточному анализу: Тез. окл. - М. 1994. - С. 34-35.

. Евгеньев М. И., Гармонов С. Ю., Евгеньева И. И., Будников Г. К Определение роматических аминов в воздушных средах индикаторными трубками. // Изв. ВУЗов. Симия и хим. технология. - 1995. - Т.38 , N 1-2. - С. 81-85.

. Евгеньев М. И., Гармонов С. Ю., Евгеньева И. И., Молгачева И. В., Левинсон Р. С. Фотометрическое определение гидразина в водных теплоносителях ТЭС // Изв. !УЗов. Химия и хим. технология. - 1995. - Т. 38 , N 1-2. - С. 85-88.

Валимухаметова Д. А., Погорельцев В. И., Гармонов С. Ю., Трубникова Г. Г., ¡агаутдинова Д. Б., Будников Г. К., Евгеньев М. И. Метод определения фосфабензида биологических жидкостях // Казанск. мед. журн. - 1995. - Т. 76, N 3. - С. 263-265. . Евгеньев М. И., Евгеньева И. И., Николаева Н. Г., Гармонов С. Ю., Самуилов Я. I-, Будников Г. К. Влияние природы среды на спектрально-аналитические свойства ;инитробензофуразанового производного гидразина // Журн. аналит. химии. - 1995. -50, N 6. - С. 642-647.

!. Евгеньев М. И., Гармонов С. Ю., Евгеньева И. И., Будников Г. К. Проточно-[нжекционный анализ лекарственных веществ в биологических жидкостях и [екарственных формах // II Российский нац. конгресс "Человек и лекарство"; Тез. [окл. - М., Фарммединфо. - 1995. - С. 319.

>. Валимухаметова Д. А., Погорельцев В. И., Трубникова Г.Г.; Гармонов С. Ю., евгеньев М. И. Клинико-экспериментальное обоснование терапевтического юниторинга фосфабензида // II Российский нац. конгресс "Человек и лекарство"; "ез. докл. - М., Фарммединфо. - 1995. - С. 26-27.

0. Evgen'ev М. I., Garmonov S. Y., Evgen'yeva I. I., Budnicov H.'C. Determination of lydrazine derivatives by flow-injection analysis with spectrophotometric detection // Talanta.

1995. - V. 42, N 10. - P. 1465-1469.

1. Валимухаметова Д.А., Гармонов С.Ю., Погорельцев В.И., Евгеньев М.И. Экспресс-метод определения фенотипа ацетилирования для терапевтического юниторинга лекарственных средств // 1 Съезд Российского науч. общества фармакологов "Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных :редств": Тез. докл.- Волгоград, 1995,- С.70-71.

12. Евгеньев М. И., Гармонов С. Ю., Трубникова Г. Г., Евгеньева И. И., Погорельцев З.И., Емельянов В. М., Будников Г. К., Валимухаметова Д. А. Спектрофотометричес-

кое определение фосфабензида в биологических жидкостях // Хим.-фарм. журн. 1995. - Т. 29 , N 8 . - С. 59-62.

13. Evgen'ev М. I., Garmonov S. У., Evgen'eva I. I., Budnicov Н. С. Flow-injectio analysis of hydrazine and its substituted as dinitrobenzofurazan derivatives. // 5t International Symp. on Kinetics in Analytical Chemistry: proceedins abstr. - Moscov 1995. - P42.

14. Evgen'ev M. I., Garmonov S. Y., Evgen'eva I. I., Levinson F. S. Detector tubes for tli determination of hazardous arylamines in air // 5th International Symp. on Kinetic i Analytical Chemistry: proceeding abstr. - Moscow, 1995. - P19.

Сдано в набор 24.10.95 г. Подписано в печать 24.10.95 г. Форм*бум. 60 X 84 1/16. Печ.л. 1,25. Тираж 100. Заказ 403.

Лаборатория оперативной полиграфии КГУ 420008 Казань, Ленина, 4/5