Протеолиз, сопряженный с гидролизом АТР. Структурно-функциональное исследование Lon-протеиназы Escherichia coli тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М.ШЕМЯКИНА и Ю.А.ОВЧИННИКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

РОТАНОВЛ Татьяна Васильевна

ПРОТЕОЛИЗ, СОПРЯЖЕННЫЙ С ГИДРОЛИЗОМ АТР. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ Lon-ПРОТЕИНАЗЫ Escherichia coli

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

МОСКВА - 2006

Работа выполнена в лаборатории химии протеолитических ферментов Ордена Трудового Красного Знамени Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук

Официальные оппоненты:

доктор химических наук,

член-корреспондент РАН, профессор Кочетков Сергей Николаевич доктор химических наук,

член-корреспондент РАН, профессор Габибов Александр Габибович

доктор химических наук Руденская Галина Николаевна

Ведущая организация -

ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН

Защита состоится «26» апреля 2006 года в 10 час на заседании специализированного совета Д 002.019.01 по защите диссертаций при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997 ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «24» марта 2006 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор химических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Селективный протеолиз — важнейший механизм поддержания внутриклеточного гомеостаза — осуществляется энергозависимыми протеиназами, относящимися к выявленному в 1990-х г.г. и интенсивно изучаемому суперсемейству ААА+-белков (/4ТР-аз, ассоциированных с различными клеточными активностями). Выполняя функции регуляции клеточного метаболизма и контроля качества внутриклеточных белков, ААА+-протеиназы обеспечивают быстрый обмен короткоживущих регуляторных белков и удаляют мутантные, поврежденные или денатурированные белки и, тем самым, играют ключевую роль в таких жизненно важных процессах, как деление и дифференцировка клеток, ответ на действие стрессогенных факторов и др. В прокариотах ААА+-протеиназы представлены пятью семействами (Lon, FtsH, ClpAP, ClpXP, HslUV), в эукариотах селективный протеолиз осуществляется мультикаталитическими комплексами — 26Б-протеасомами, регуляторные составляющие которых содержат АТР-азы ААА+-типа.

Уникальными свойствами ААА+-протеиназ (или АТР-зависимых протеиназ), отличающими их от классических протеолитических ферментов являются: (1) высокая селективность при отборе мишеней из общего пула внутриклеточных белков, большая часть которых не должна повреждаться; (2) сопряжение протеолитической активности с гидролизом АТР; (3) прогрессивный механизм деградации белков (с образованием 10-15-членных пептидов) при отсутствии выраженной специфичности по отношению к аминокислотам, образующим расщепляемые связи; (4) мулътисубъединичная (гомо- или гетероолигомерная) организация.

Lon (или Ьа)-протеиназа Escherichia coli (ЕС 3.4.21.53), обнаруженная в 1970-х годах, явилась исторически первой АТР-зависимой протеиназой и долгое время служила модельным ферментом для исследования АТР-зависимого протеолиза. Гомоолигомерная Ьоп-протеиназа — редкий представитель ААА+-белков, АТР-азный и функциональный компоненты которых объединены в единой полипептидной цепи. Это обстоятельство значительно осложнило исследование энзиматических свойств и структуры фермента. К настоящему времени больший прогресс достигнут в изучении гетероолигомерных ClpAP, ClpXP и HslUV протеиназ, АТР-азные и протеолитические компоненты которых представляют отдельные субъединицы. Вместе с тем основные проблемы АТР-зависимого протеолиза -механизм высокой селективности ферментов, роль гидролиза АТР в протеолизе и механизм сопряжения гидролиза АТР и процессивного протеолиза — пока остаются не до конца выясненными.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось структурно-функциональное исследование семейства АТР-зависимых Ьоп-протеиназ с использованием в качестве модельного фермента Lon-протеиназы из Е. coli (далее — Lon-протеиназа или £cLon). Для достижения поставленной цели потребовалось решить следующие задачи:

1. Идентифицировать каталитические остатки протеолитического центра Ьоп-протеиназ и выявить клановую и групповую принадлежность семейства Lon (в классификации пептидгидролаз MEROPS).

2. Охарактеризовать доменную организацию Ьоп-протеиназ, изучить междоменные взаимодействия в Ее Lon и исследовать свойства изолированных доменов фермента и их комбинаций.

3. Изучить функционирование АТР-азных и протеолитических центров £cLon, исследовать их взаимовлияние и выявить факторы, определяющие процессивный характер механизма функционирования фермента.

4. Определить пространственную структуру £сЬоп и/или изолированных доменов фермента.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые установлено, что в протеолитических центрах Ьоп-протеиназ функционирует каталитическая диада Ser-Lys. Выявлена уникальность семейства Lon среди серин-лизиновых пептидгидролаз. Обнаружено, что семейство Lon-протеиназ представлено двумя подсемействами (А и В), различающимися окружением каталитических остатков протеолитического центра, структурной организацией АТР-азного домена и общей архитектурой молекулы.

Установлена доменная организация ферментов семейства Lon-протеиназ, подтвержденная получением изолированных N-концевого (N-), АТР-азного (А-), а-спирализованного (а-) и протеолитического (Р-) доменов, а также AP-фрагмента ЕсЬоп с помощью ограниченного протеолиза. В ходе исследования междоменных взаимодействий показано, что изолированные А-и Р-домены фермента, содержащие соответствующие каталитические центры, существуют в растворе как мономеры; Р-домен является низкоэффективной пептидазой, не способной гидролизовать белковый субстрат ни в индивидуальном состоянии, ни в сочетании с А-доменом (АР-фрагмент, тетрамер), протеолитическая активность присуща только полноразмерному ферменту; изолированный А-домен не гидролизует АТР, но проявляет АТР-азную активность в составе полноразмерной Ьоп-протеиназы или ее АР-фрагмента; N-домен, мономерный в индивидуальном состоянии, имеет важное значение как для олигомеризации Lon-протеиназы, так и для проявления ферментом функциональной активности. Выдвинута гипотеза о роли N-домена как интегрированного адапторного белка Lon-протеиназы.

Проведено первое систематическое исследование функционирования АТР-азных и протеолитических центров £сЬоп. Выявлено отсутствие прямой

корреляции между АТР-азной и пептидазной активностями. Показано, что необходимыми факторами реализации процессивного протеолиза служат гидролиз АТР и олигомерность фермента. Обнаружен дополнительный центр связывания белкового субстрата, расположенный в области, включающей N-концевой и АТР-азный домены фермента.

С помощью сайт-направленного мутагенеза выявлен ряд функционально значимых остатков Lon-протеиназ, локализованных в АТР-азном и протеолитическом доменах. Установлено, что функциональная активность мутантных форм £cLon, определенная in vitro, коррелирует с активностью тех же форм in vivo. Методом комплементации мутаций показано существование в нативном ферменте двух путей передачи сигнала от АТР-азных центров к протеолитическим — внутри- и межсубъединичного.

Впервые определена кристаллическая структура протеолитического и а-спирализованного доменов £cLon. Показано, что в то время как структура а-домена соответствует общей топологии ос-доменов ААА+-белков, Р-домен фермента имеет уникальную пространственную укладку. Полученные результаты послужили основанием для выделения Lon-протеиназ в самостоятельное структурное семейство, представляющее индивидуальный клан SJ в классификации пептидгидролаз MEROPS.

Результаты работы способствовали расширению представлений о строении и закономерностях функционирования АТР-зависимых Lon-протеиназ.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: XX конференция FEBS (Будапешт, 1990); Всесоюзный симпозиум "Химия белков" (Тбилиси, 1990); Международный симпозиум «Ферменты в органическом синтезе» (Дели, 1992); II Российско-Израильский симпозиум по пептидам и белкам (Москва, 1992); III, IV и V Симпозиумы «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 1993, 1997, 2002); III Международный симпозиум по биоорганической химии (Дагомыс, 1995); Международная конференция, посвященная памяти академика А.А.Баева (Москва, 1996); Второй съезд Биохимического общества РАН (Москва, 1997); VIII Европейский конгресс по биотехнологии (Будапешт, 1997); Международная конференция «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, 1997); XVII Международный конгресс по биохимии и молекулярной биологии (Сан-Франциско, 1997); Международные конференции «Биокатализ-98 и -2002» (Пущино, 1998; Москва, 2002); XVI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, 1998); IV, V и VII чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 1998, 2000; Москва, 2004); Третий Европейский симпозиум по химии белка (Гармиш-Партенкирхен, 1999); Конференция «Структура и функция протеолитических ферментов», посвященная памяти академика В.Н.

Ореховича (Москва, 2000); Школа-конференция «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000); Всероссийская конференция «Проблемы медицинской энзимологии» (Москва, 2002); III съезд Биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002); V и VI Международные конференции по ААА-белкам (Варрентон, 2003; Грац, 2005); XXI Европейская конференция по кристаллографии (Дурбан, 2003); III научная конференция и школа-семинар для молодых ученых «Белки-маркеры патологических состояний» (Астрахань, 2003); III и IV конгрессы Международного общества по исследованию протеолиза (Нагойя, 2003; Квебек, 2005); Международная конференция «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2004); VII Международная Энгельгардтовская конференция по молекулярной биологии (Москва-Суздаль, 2004); XX конгресс Международного союза по кристаллографии (Флоренция, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 76 работ, в том числе 4 обзора и 23 статьи.

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке и проверке предложенных в работе экспериментальных подходов, обсуждении, оформлении и обобщении полученных результатов. Экспериментальная работа выполнена автором, а также сотрудниками, аспирантами и студентами (под руководством автора). В исследованиях, проведенных в соавторстве с зарубежными коллегами, личный вклад автора заключался в постановке задачи, в непосредственном участии и руководстве при проведении экспериментальной работы, в обсуждении полученных результатов и оформлении их в виде публикаций.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 246 страницах печатного текста и включает 57 рисунков и 33 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы «Ферментные системы внутриклеточной селективной деградации белков», обсуждения результатов (5 глав), экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы (357 наименований) и приложения, содержащего 18 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Общая задача настоящего исследования состояла в выявлении особенностей строения и функционирования протеиназ семейства Lon, которые определяются сопряжением протеолиза и гидролиза АТР и отличают Lon-протеиназы как от "классических" протеолитических ферментов, так и от других АТР-зависимых протеиназ. В качестве модельного фермента была выбрана Lon-протеиназа из Е. coli.

1. Структурная характеристика Lon-протеиназы Е. coli

1.1. Доменное строение Ьоп-протеиназы

Lon-протеиназа Е. coli представляет собой цитоплазматический гомоолигомерный фермент, субъединица которого состоит из 784 а.о. В нашей лаборатории был клонирован ген Ion Е. coli, определена его структура и выведена аминокислотная последовательность фермента (рис. 1). Одновременно строение Ion гена и соответствующая ему альтернативная первичная структура £cLon, отличающаяся от предложенной нами в области остатков 264-317 и 539-563, были определены в лаборатории проф. А. Гольдберга (США) (рис. 1). Истинная структура £cLon была установлена нами с помощью N-концевого секвенирования полноразмерного фермента и его фрагментов.

Для получения препаративных количеств Echón ген Ion, клонированный в векторе pBR327, был экспрессирован в /ол-отрицательных штаммах Е. coli. Схема очистки фермента включает стадии наращивания биомассы клеток, получения бесклеточного экстракта, последовательной хроматографии на фосфоцеллюлозе, DEAE-ToyoPearl или Q-сефарозе, гепарин-сефарозе и гель-фильтрации. Средний выход фермента - около 5 мг/г клеточной биомассы; чистота получаемого препарата .EcLon (по данным гель-электрофореза) превышает 90 %.

Фрагментацию белковой молекулы проводили для получения продуктов, содержащих «спорные» участки аминокислотной последовательности, с целью их последующего N-концевого секвенирования. Ограниченный протеолиз £cLon трипсином, пепсином и дуоденазой не позволил получить подходящие фрагменты, однако химическая фрагментация по остаткам триптофана (Тгр297, 303 и 603) с помощью BNPS-скатола привела к образованию ряда фрагментов фермента, два из которых имели молекулярные массы около 50 кДа. Экспериментально определенные N-концевые последовательности этих фрагментов (MVQVP- и NARSK-) соответствовали участкам 298-302 и 304-308 в первичной структуре фермента, установленной в нашей лаборатории, и не содержали остатков,

i-wers',.-.? tp. 1 l'v;,' lrdvv vytkmviplf vcseksircl eaamdhdkki mlvackeast

pepgvndi.ft vgtva3ilqm ukuwxjtvkv i.veglqkari salsdngehf sakaeylesp

tidereqevl vrtats'qfeg yiklnkki pi? evltsln3id dpariadtia ahmplkladk

osvbemsdvn erlkylmaiim esetdllcve kr irnrvk kq mfksqreyyl negt kaiqke

lgemddapde nealkrkxda akmpkeakek aeaelqklkm msfmsaeatv vrgyidwmvq

*RKRQKRK RTGVAEAEND VSDVGRSDRS AWLYRLDGTG

vpwnarskvk kdlrqaqeil dtdhyglerv kdrileylav qsrvnkikgp ilclvgppgv a veca YEGQK RPASGA-*

gktslgqsia katgrkyvrm alggvrdeae irghrrtyig smpgkliqkm akvgvknplf

lldeidkmss dmrgdpasal levldpeqnv afsdhylevd ydlsdvmfva tsnsmnipap

lldrmevirl SGYTEDEKLN IAKRHLLPKQ IERNALKKGE LTVDDSAIIG IIRYYTREAG

*RA

VRGLEREISK LCRKAVKQLL LDKSLKHIEI NGDNLHDYLG vqrfdygrad nenrvgqvtg CWWSVKSPN CVAKRZSSYC SIT* ~

lawtevggdl ltietacvpg kgkltytgsl gevmqesiqa altwrarae klginpdfye krdihvhvpe gatpkdgpsa giamctalvs cltgnpvrad vamtgeitlr gqvlpigglk ekllaahrgg iktvlipfen krdleeipdn viadldihpv krieevltla lqnepsoíqv vt ak

Рис. 1. Аминокислотная последовательность Lon-протеиназы E. coli (желтым цветом выделен протеолитический домен; звездочками ограничены альтернативные участки структуры).

Подчеркнуты фрагменты, структура которых определена N-концевым секвенированием; красным цветом показаны каталитически активные остатки серина и лизина; фиолетовым -мотивы Уолкера А и В; оранжевым - N-концевой домен, зеленым - а-спирализованный домен ААА+-модуля; синим и крас 111,1м цветом выделены (и подчеркнуты) остатки, подвергнутые сайт-направленному мутагенезу.

которые могли бы принадлежать участку (293—297) альтернативной последовательности (рис. 1). Полученные результаты позволили однозначно решить вопрос о «спорных» участках в структуре Ion гена и сделать выбор в пользу структуры Echón, установленной в нашей лаборатории.

Частичная инактивация под действием диизопропилфторфосфата позволила отнести Ьоп-протеиназу к сообществу сериновых протеиназ. Однако анализ первичной структуры показал отсутствие в молекуле фермента характерных для известных «классических» сериновых протеиназ консервативных фрагментов последовательностей, содержащих каталитически активные остатки серина, гистидина и аспарагиновой кислоты. При этом характерные для ряда АТР-аз консервативные фрагменты последовательности - мотивы Уолкера А и В, содержащие каталитические остатки АТР-азного центра, были обнаружены в центральной части молекулы (рис. 1). Основываясь на строении и размерах молекул известных АТР-аз и «классических» протеиназ, В.К. Антонов и сотр. выдвинули концепцию,

60 120 180 240 300

360

420 480 540

600

660 720 780 784

согласно которой субъединица Ьоп-протеиназы состоит из трех последовательно соединенных функциональных доменов: Ы-концевого (Ы-домен, около 330 а.о.) с невыясненной функцией, центрального, обладающего АТР-азной активностью (А-домен или ААА+-модуль, около 200 а.о.), и С-концевого - протеолитического (Р-домен, около 250 а.о.).

Результаты ограниченного протеолиза позволили получить подтверждение доменного строения Ьоп-протеиназ и уточнить границы доменов (рис. 2): гидролиз ЕсЪоп химотрипсином (как и трипсином) в отсутствие нуклеотидов приводит к образованию стабильных Ы- и С-концевых фрагментов размером около 200 а.о. каждый. Помимо этого при химотриптическом расщеплении наблюдается накопление С-концевого фрагмента ААА+-модуля размером около 100 а.о. (а-домен, Ьоп(491-584)). В

Waker motifs

Л В

GPPGVGK>"T_ LFLLD^E

2?5 (326)

Л*»

491

Я** КРвР8*>*Ав KEK"'LL

ÖTZTZ

I

784

.....'IV

-

N

oc/ß

et

........i I_

13

N + а + P

♦ДТР/ADP. MgiN^ATP/AOP N+AP N+A+P

585

784

эаайжявявд

Рис. 2. Схема фрагментации Ьоп-протеиназы Е. coli при ограниченном протеолизе химотрипсином.

Показана локализация консенсусных фрагментов Ьоп-протеиназ — мотивов Уолкера А и В, включающих остатки К362 и D , остатков sensor-1 (N4 ), "Arg finger" (R484), sensor-2 (R542) и окружения каталитических остатков S679 и К722.

присутствии нуклеотидов (ATP, ADP) и ионов магния преимущественно образуются тот же самый N-концевой домен и фрагмент £cLon, включающий А- и Р-домены (AP-фрагмент, Lon(235-784)). Отсутствие ионов магния при гидролизе EcLon приводит к образованию индивидуального А-домена (Lon(235-584)), включающего два характерных для ААА+-белков структурных домена - a/ß и a (рис. 2). Надо подчеркнуть, что размер получаемого ААА+-модуля £cLon значительно превышает соответствующие модули большинства ААА+-белков (220-250 а.о.) за счет протяженного (около 100 а.о.) N-концевого фрагмента. Можно полагать, что эта область субъединицы Lon-протеиназы представляет отдельный субдомен и имеет собственное значение для функционирования фермента.

Таким образом, вариация условий гидролиза £cLon химотрипсином позволяет получить в индивидуальном состоянии как все три функциональных домена (N-, А- и Р-), составляющие субъединицу фермента, так и структурный a-домен. Следует отметить, что при этом происходит вырезание фрагмента Gln208-Met234, предположительно включенного в область суперспирализации белка, который может играть важную роль при взаимодействии Lon-протеиназы с белковыми мишенями. Эти данные, наряду с анализом вторичной структуры, указывают на высокую вероятность субдоменного строения N-домена £cLon. Обнаруженное влияние нуклеотидов на ферментативную фрагментацию Lon-протеиназы служит прямым доказательством зависимости структурной организации фермента (конформационного состояния или/и степени олигомеризации) от состояния его АТР-азного центра.

Химотриптические фрагменты £cLon были использованы при изучении междоменных взаимодействий в ферменте и исследовании его пространственной структуры. Для этого были разработаны методики препаративного получения N-, A-, а- и Р-доменов, а также АР-фрагмента EcLon с использованием ионообменной, аффинной и эксклюзионной хроматографии.

1.2. Протеолитические центры ферментов семейства Ьоп-протенназ

Идентификация каталитических остатков протеолитического центра Lon-протеиназы явилась одной из главных задач настоящего исследования. Длительное время, пока была известна единственная Lon-протеиназа — фермент из Е. coli, предполагалось, что активный центр фермента может быть представлен классической триадой Ser—His-Asp.

В молекулах классических сериновых протеиназ каталитическому остатку серина обычно предшествует глицин в положении (-2). На этом основании В.К. Антонов и сотр. предположили, что каталитически активным может служить остаток Ser679 (рис. 1). В это же время в литературе на роль каталитически активного был предложен Ser368. Выбор между двумя

Таблица 1. Идентификация каталитшески активных остатков протеолитического центра Ьоп-протеиназы Е. соН с помощью сайт-направленного мутагенеза

Домен АТР-зависимая АТР-азная

№№ Мутация в протеолитическая активность, %

ферменте активность, % базовая + казеин

1 - 100 100 250

2 Ser679Ala P 0 94 175

3 Ser368Ala a/p 100 но.* но.

4 Ser637Ala P 100 но. но.

5 Ser690Ala P 100 но. но.

6 His567Tyr a 100 но. но.

7 His665Tyr P 0 4.4 8.7

8 His667Tyr P 0 3.2 7.4

9 Asp609Asn P 100 но. но.

10 Asp676Asn P 0 6.0 6.4

11 Asp743Asn P 100 но. но.

12 Glu721Gln P 100 но. но.

13 Lys722Gln P 0 90 240

* н.о. - не определяли.

вариантами был сделан после получения соответствующих мутантных форм Echón (табл. 1). Оказалось, что мутант Lon-S368A сохраняет АТР-зависимую протеолитическую активность, a Lon-S679A полностью ее утрачивает. Так было показано, что каталитически активным является остаток Ser679, и вместе с тем получено доказательство справедливости предположения о том, что именно С-концевая часть молекулы Ьоп-протеиназы содержит протеолитический активный центр.

В основу поиска других участников протеолитического центра фермента первоначально был положен фактор удаленности от остатка Ser679 (вдоль полипептидной цепи) предполагаемых каталитически активных остатков His и Asp. По аналогии с химотрипсином в пределах Р-домена ¿TcLon потенциально активными остатками представлялись His567 и Asp609. Однако было установлено, что эти остатки не принадлежат активному центру, так как соответствующие мутантные формы фермента (Lon-H567Y и Lon-D609N) полностью сохраняют АТР-зависимую протеолитическую активность (табл. 1).

Появление данных о более чем 20 аналогах гена Ес-1оп и кодируемых ими ферментах из различных источников (конец 1990-х г.г.) позволило установить, что каталитический остаток серина (S*) локализован в строго консервативном и уникальном для сериновых протеиназ октапептиде P674KDGPS*AG681 (здесь и далее нумерация по последовательности £cLon). Кроме того, дополнительно было выявлено еще два консервативных остатка серина - Ser637 и Ser690, которые также были подвергнуты мутагенезу, и

было установлено, что они не могут входить в состав активного центра, поскольку мутанты Lon-S637A и Lon-S690A не утрачивают АТР-зависимую протеолитическую активность (табл. 1).

Вместе с тем было обнаружено, что в Р-доменах рассматриваемой группы Lon-протеиназ содержится ряд потенциальных участников классической триады — консервативные остатки H¡s665, His667, Asp676 и Asp743, а также альтернативный последним остаток Glu721. Результаты точечного мутагенеза показали, что в то время как остатки Asp743 и Glu721 не существенны для функционирования фермента, остатки His665, His667 и Asp676 важны для проявления активности Lon-протеиназой (мутанты H665Y, H667Y и D676N оказались протеолитически неактивными) (табл. 1).

Тем не менее, заключение о наличии в ферментах семейства Lon каталитической триады представлялось маловероятным, поскольку остатки H¡s665, His667, Asp676 локализованы в непосредственной близости от активного серина (фрагмент HVHVPEGATPKDGPS*, рис. 1), что не соответствует обычному взаиморасположению каталитически активных групп у известных сериновых протеиназ. Кроме того, следует подчеркнуть, что введение мутаций по рассматриваемым остаткам привело к значительному снижению АТР-азной активности фермента (табл. 1). Эти данные свидетельствовали о тесном контакте между АТР-азным и протеолитическим активными центрами в Lon-протеиназе, возможно, на уровне олигомера.

При анализе Р-доменов группы ферментов семейства Lon на этом этапе исследования обнаружилось также два консервативных остатка лизина (675 и 722), что позволило выдвинуть предположение о возможности функционирования диады Ser-Lys в активном центре Lon-протеиназ. При этом, поскольку Lys675 тоже локализован вблизи активного Ser679, в качестве потенциального каталитического остатка, в первую очередь, рассматривался отдаленный Lys722.

Свидетельством в пользу выдвинутого предположения послужили результаты замены остатка Lys722 на Gin. Эта замена привела к полной утрате мутантом Lon-K722Q активности по гидролизу как белкового субстрата (казеин), так и низкомолекулярного тиоэфирного субстрата (Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl), независимо от наличия в реакционной среде АТР и ионов Mg. Вместе с тем мутация практически не повлияла на АТР-азную активность £cLon. Из табл. 1 видно, что характеристики Lon-K722Q совпадают с характеристиками мутанта по каталитически активному остатку серина Lon-S679A.

Окончательным подтверждением наличия каталитической диады Ser-Lys в активных центрах Lon-протеиназ явился сравнительный анализ более чем 100 первичных структур протеиназ семейства Lon, ставших доступными в связи с расшифровкой геномов целого ряда организмов. При этом установлено, что (1) функционирование классической триады в Lon-протеиназах невозможно, поскольку Р-домены ферментов не содержат ни

одного строго консервативного остатка His и Asp; (2) в Р-доменах всех без исключения протеиназ семейства Lon строго консервативным оказался единственный остаток Lys (соответствующий Lys722 в £cLon); (3) окружение каталитического Ser представлено двумя фрагментами: либо PKDGPS*AG, либо XO(E/D)GDS*A(S/T) (Ф — гидрофобный а.о.), при этом консервативный остаток Lys также локализован в одном из двух вариантов фрагментов (соответственно, (К/Я)(Е/0)К*ХФ или (Т/Ы)ХК*ФЕ).

Совокупность данных анализа первичных структур Р-доменов известных Lon-протеиназ и результатов сайт-направленного мутагенеза EcLon явилась убедительным доказательством функционирования каталитической диады Ser-Lys в протеолитических центрах ферментов и позволила предположить наличие двух подсемейств в семействе Lon-протеиназ.

1.3. Подсемейства в семействе Ьоп-протеиназ Из сопоставления консенсусных 66-членных фрагментов последовательностей, включающих окружение активных остатков Ser и Lys в Р-доменах (рис. 3), с очевидностью следует, что семейство Lon представлено двумя подсемействами, большим Lon А и меньшим LonB. Строго консервативными в представленных фрагментах для всего пула ферментов остаются только 10 а.о.; общая степень подобия консенсусных фрагментов составляет примерно 38 %. При этом строгая консервативность для всего семейства остатков Ser (положение +11), Gly (+32, 38, 39) и пары Thr-Gly (+25, 26) позволяет рассматривать эти остатки как потенциально важные для функционирования Lon-протеиназ. Вместе с тем, вариабельность аминокислотных остатков в 26 положениях (рис. 3) может внести существенный вклад в различие протеолитических центров подсемейств LonA и LonB. Особенно важными для проявления активности и специфичности

-10 *0 +10 LonA H<£HXPXGAX£KDGPSAGXXXX ТХФФБХФХХХХХ LonB ХФХФХ QX YXX®£GDSASX5ХХХХФФ SАФХХФРФ

+20 +30 +40 * +50

LonA XXX®^MTGE®XLXGX®XX®GG®KEKX®AñXJRXX LonB ХдХФАФТв5ФХХХСХФХХФ6СФХХКФЕАФХХФС

Рис. 3. Консенсусные фрагменты последовательностей ЬопА- и ЬопВ-протеиназ, включающие каталитически активные остатки серина и лизина (положения 0 и +43, показаны красным цветом).

Ф — остатки гидрофобных аминокислот; X - остатки любых аминокислот; жирным шрифтом выделены остатки, абсолютно консервативные в пределах подсемейства, курсивом — остатки, консервативность которых превышает 90 %.

подсемейств могут оказаться замены вблизи каталитически активных остатков в положениях -1,-4 и +45.

Сравнительный анализ полных аминокислотных последовательностей общего пула Lon-протеиназ приводит к заключению о том, что разделение семейства Lon на два подсемейства отражает не только различие протеолитических центров ферментов, но также и различие их ААА+-модулей и общей архитектуры молекул.

Подсемейство LonA (более 80 % Ьоп-протеиназ) преимущественно составляют ферменты бактерий и эукариот. В архебактериях LonA-протеиназы обнаружены до сих пор только у представителей таксономического семейства Meíhanosarcinaceae. Члены ЬопА-подсемейства организованы подобно «классической» £cLon и содержат в каждой субъединице последовательно соединенные N-, А- и Р-домены (рис. 4). Размер субъединиц LonA-протеиназ колеблется от 772 до 1133 а.о.

Walker moúfs: А В

GPPGTGKT LFLLDE

KDGPS*AG

<КЛ)ХК*ХФ

LonA

N domain

А

ос/р domain

SRH

ос domain

A domain (AAA* module)

А

F domain

А В

GXPG1 GKS Transmembrane segment(s) VLFIDE 4>(E/D)G№*A<S1'T> (ТЩХ/СФЕ

Lon В

oc/p domain

CUE

TM domad»

SRH

ot domain

A domain (AAA* modula)

у/ \ P domain j

Рис. 4. Сравнение строения LonA- и LonB-протеиназ.

Наибольшую вариабельность по величине (220—510 а.о.) и аминокислотной последовательности проявляют Ы-домены ферментов; Р-домены близки по размеру (188-224 а.о.) и обладают высокой степенью гомологии; ААА+-модули (А-домены) проявляют высокую степень подобия в своих Ы-концевых фрагментах (86-94 а.о.) и нуклеотид-связывающих а/р доменах (152-187 а.о.), в то же время их а-домены значительно различаются размером (88-175 а.о.) за счет вставок в С-концевых областях.

ААА+-модули ЬопА-протеиназ содержат целый ряд высокогомологичных фрагментов, характерных для различных белков

суперсемейства ААА+. Наиболее значимыми среди них являются мотивы Уолкера А и В, SRH-область, включающая мотив sensor-1 и «аргининовый палец», а также остаток sensor-2 и его окружение (рис. 2): «аргининовые пальцы» ответственны за межсубъединичное взаимодействие АТР-азных центров в ААА+-белках, остальные фрагменты принимают участие в кооперативном гидролизе АТР.

Подсемейство LonB (менее 20 % Lon-протеиназ) включает только ферменты из архебактерий. Вместе с тем, у некоторых бактерий обнаружены белки, содержащие протяженные последовательности, подобные протеолитическим доменам LonB-типа (LonB-подобные протеиназы), однако в N-концевых фрагментах этих белков не обнаруживаются канонические консервативные фрагменты, характерные для ААА+-модулей Lon-протеиназ.

В отличие от LonA-протеиназ представители подсемейства LonB являются мембраносвязанными ферментами и характеризуются отсутствием N-концевых доменов. LonB-протеиназы состоят из ААА+ модулей, соизмеримых с «классическими» ААА+-модулями, и Р-доменов размером в 205-232 а.о. (рис. 4). Трансмембранные сегменты LonB-протеиназ локализованы в крупных вставках (ТМ-домены, 108-128 а.о.), заключенных в а/р-доменах между мотивами А и В Уолкера; в отдельных случаях вслед за ТМ-доменами обнаруживаются дополнительные вставочные фрагменты — интеины (333-474 а.о.). В соответствии с этим размеры субъединиц LonB-протеиназ составляют от 621 до 1127 а.о.

ААА+-модули LonB-протеиназ содержат все характерные для ААА+-белков консенсусные фрагменты, однако по аминокислотной последовательности они заметно отличаются от соответствующих фрагментов ферментов подсемейства LonA. Внутри подсемейства LonB-протеиназы проявляют высокую гомологию (исключая область ТМ-доменов).

Таким образом, А- и В-подсемейства АТР-зависимых Lon-протеиназ различаются как окружением каталитических остатков пептидазного центра и строением консенсусных фрагментов ААА+-модулей, так и структурной организацией АТР-азных доменов и общей архитектурой субъединиц. Предложенная классификация Lon-протеиназ введена в базу данных MEROPS.

1.4. Активные центры Ьоп-протеиназ и других пептидгидролаз с каталитической диадой Ser — Lys

Ферменты, в активных центрах которых функционирует каталитическая диада Ser-Lys, до недавнего времени были объединены в базе данных MEROPS в общий клан (SF), который включал Lon-протеиназы, репрессоры LexA, протеиназы N-концевого процессинга (Ntp-протеиназы или сигнальные пептидазы и сигналазы), а также Ур4-протеиназы бирнавирусов. Определение кристаллической структуры Р-домена £cLon, проведенное в рамках настоящей работы (см. ниже), позволило вывести семейство Ьоп-протеиназ и

родственные им Ур4-протеиназы в индивидуальный клан SJ. В настоящий момент в отдельном «объединенном» клане (SK) наряду с ClpP и tricorn core пептидазами представлены также серин-лизиновые гидролазы, осуществляющие С-концевой процессинг белков (Ctp-протеиназы). Консенсусные фрагменты последовательностей, включающие каталитические остатки различных серин-лизиновых пептидгидролаз, были сопоставлены с соответствующими фрагментами первичной структуры Р-доменов LonA- и ЬопВ-протеиназ.

Оказалось, что в семействе LexA репрессоров, как и в случае Lon-протеиназ, можно выделить два подсемейства (I и II), которые обнаруживают выраженное сходство с LonA и LonB, соответственно (табл. 2). Фрагменты последовательностей при каталитически активных остатках Ctp- и Ntp-протеиназ не выявляют сходства с протеиназами Lon в области каталитического центра (табл. 2).

Из табл. 2 видно, что общими для ферментов кланов SJ, SF и SK являются только каталитически активные остатки. Вместе с тем необходимо отметить как подобие аминокислот, локализованных в положениях (-2 и

Таблица 2. Сопоставление консервативных фрагментов аминокислотных последовательностей серин-лизиновых пептидгидролаз и ряда классических сериновых протеиназ

Фермент Клан -6 -5 -4 -3 -2 -1 * +1 »2 +3 -3 -2 -1 * »1 +2

Пептидгидролазы с каталитической диадой Ser- Lys

Ctp-протеинаэы SK Ф N/D X X S/T A S А S/A E T/S Ф G к G X

Ntp-протеиназы SF X X Ф X S/G X s M X P/X X Ф Ф/С к R/Ф X

LexA 1 SF L R/K V X G Ф s M К D/N V T V к R Ф

LonA SJ X P/S К D G P s А G Ф Ф K/R X к X Ф/Х

Lon В SJ X X Ф E/D G D s А S/T Ф Ф T/N X к Ф Е

LexA II SF L X Ф X G D/E s M X X Ф T Ф к X X

Протеиназы с каталитической триадой Ser -His- ■Asp

Химотрипсин PA/S S с м G D s G G P

Эластаза PA/S s с N G D s G G P

Катепсин G PA/S А F К G D s G G P

Субтилизин SB А Y N G T s M А S

Протеиназа К SB s 1 s G T s M А T

ClpP SK M G Q A А s M G А

* - каталитически активные остатки; Ф - остатки гидрофобных аминокислот; X - остатки любых аминокислот; жирным шрифтом выделены остатки, абсолютно консервативные для каждого подсемейства кланов БЛ, БР и БК; курсивом выделены остатки, консервативность которых превышает 90 %.

+1)5ег*, так и значительное различие остатков в положениях (-1и+2)8ег*. В то же время фрагменты, включающие каталитически активный лизин, не проявляют общего сходства. Можно полагать, что именно остатки, локализованные вблизи от активного серина, являются определяющими при формировании активных центров рассматриваемых ферментов, а окружение активного лизина играет второстепенную роль.

Для сравнения в табл. 2 приведено также строение консервативных серин-содержащих фрагментов ряда «классических» сериновых протеиназ с каталитической триадой Бег-Шз-Аэр. Видно, что характерные для Ьоп-протеиназ мотивы СР8*АС (ЬопА) и СОЗ*А8/Т (ЬопВ) близки к типичному для протеиназ семейства химотрипсина мотиву ООБ^Св. Некоторое сходство просматривается также между ЬехА 1-репрессором и С1рР-протеиназой и субтилизином.

Таким образом, сравнительный анализ первичных последовательностей ферментов различных представителей кланов ББ и БК позволил

охарактеризовать Ьоп-протеиназы как уникальное семейство серин-лизиновых пептидгидролаз, при этом обнаружено определенное сходство между Ьоп-протеиназами и репрессорами ЬехА в областях, включающих каталитически активные остатки серина и лизина.

2. Закономерности функционирования нативной Ьоп-протеиназы Е. coli

Одним из основных направлений данной работы явилось изучение межцентровых взаимодействий, обеспечивающих АТР-зависимое функционирование протеолитических центров в Ьоп-протеиназе по процессивному механизму. Активность АТР-азных центров тестировали по скорости гидролиза АТР. Для оценки эффективности функционирования протеолитических центров использовали белковый субстрат — а- или ß-казеин (далее — казеин), олигопептидный субстрат - мелиттин и низкомолекулярный субстрат -тиобензиловый эфир трипептида, Suc-Phe-Leu-Phe-SBzI (РерТВЕ).

2.1. АТР-азная активность Ьоп-протеиназы in vitro В отсутствие белкового субстрата гидролиз АТР Ьоп-протеиназой («базовая» АТР-азная активность) наблюдается в области pH 7.0-9.0 (с максимумом при pH 8.0-8.2). Присутствие белка-субстрата приводит к активации гидролиза АТР без изменения положения pH-оптимума. Температурная зависимость базовой АТР-азной активности £cbon не носит выраженного характера: различие данных, полученных при 50°С (температурный максимум) и 30°С, не превышает 30 %, однако повышение температуры отрицательно влияет на стабильность фермента. Ьоп-протеиназа

максимально активна при концентрации NaCl от 50 до 150 мМ; высокое содержание соли (1 М) приводит к утрате ферментом способности к гидролизу АТР. На основании представленных данных в качестве стандартных были выбраны следующие условия определения АТР-азной активности: 50 мМ трис-НС1-буфер, рН 8.0, 100 мМ NaCI, 37°С. Базовая удельная активность Lon-протеиназы в этих условиях составляет 20—30 моль-моль"'-мин"' и увеличивается до 50-70 моль-моль"1-мин"1 в присутствии насыщающей концентрации белкового субстрата.

АТР-азная активность Lon-протеиназы и содержание и оное A/g2f

Базовая АТР-азная активность Echón сложным образом зависит от концентрации необходимого активатора ферментативного гидролиза АТР — ионов Mg2+. Установлено, что начальная скорость гидролиза АТР Lon-протеиназой в области миллимолярных концентраций нуклеотида максимальна при эквимольном соотношении ATP:Mg (САтр:СМз 1:1). В этих условиях ¿cat гидролиза АТР составляет 100 мин"1, а Кт 0.54 мМ (рис. 5, /).

Свободный АТР (CMg < Сатр) и свободные ионы магния (CMg > САтр) ингибируют гидролиз АТР. При этом при низких избыточных по отношению к нуклеотиду концентрациях Mg2+ наблюдается бесконкурентное или сопрягающее ингибирование (параллельное уменьшение каталитических констант вплоть до значений кС!Л 46 мин"1 и Кт 0.25 мМ, прямые 2 и 3 на рис. 5), при более высоких концентрациях ионов Mg2+ имеет место ингибирование по конкурентному типу (рис. 5, 4). Переход от бесконкурентного ингибирования к конкурентному (прямая 3) осуществляется при "критической" концентрации свободных ионов Mg2+, близкой к их внутриклеточному содержанию (около 15 мМ).

1 субстрата.

Концентрации. Lon — 0.32 мкМ; Mg2+ - 0 (/), 10(2), 15(3), 30 (4) и (0-40) мМ (5); а-казеин - 0 (1-4) или 1 мг/мл (5).

Условия: 50 мМ трис-НС1-буфер, рН 8.2.

Рис. 5. Влияние свободных ионов Mg2+ на гидролиз АТР Lon-протеиназой в отсутствие (1-4) и в присутствии (5) белка-

-Г-

•4 -3 -2

✓ i ' !

-1

0

2 3 4 [ATP-Mg*]"1. Mfvt1

Схема. Ингибирование ионами Mg2+ гидролиза АТР Ьоп-протеиназой по бесконкурентному типу.

Обозначения. Е — фермент; S — субстрат (комплекс ATP-Mg2"); Рг - продукт реакции (ADP); Р, — неорганический фосфат, Mg (в комплексах) — ионы Mg2+.

Бесконкурентное ингибирование гидролиза АТР свидетельствует о том, что высвобождение продукта гидролиза — ADP - из АТР-азного центра зависит от предшествующего высвобождения ионов Mg2+ (Схема). То есть при относительно невысоких концентрациях свободных ионов Mg2+ происходит ухудшение эффективности нуклеотидного обмена за счет образования комплекса E-ADP-Mg. При высоких концентрациях ионы Mg2+ формально конкурируют с субстратом (комплексом ATP-Mg2") за связывание на ферменте. Не исключено, однако, что истинной причиной изменения характера ингибирующего действия магния на АТР-азную активность служит насыщение фермента аденозиндифосфатом в комплексе E-ADP-Mg, вызывающее возникновение (или изменение) специфических кооперативных взаимодействий между АТР-азными центрами в олигомере Ьоп-протеиназы.

В присутствии белкового субстрата характер влияния свободных ионов Mg2+ на АТР-азную активность £сЬоп кардинально меняется (рис. 5, 5): зависимость, отражающая гидролиз АТР, занимает фиксированное положение (&cat 100 мин*1 и Кт 0.25 мМ) в широком интервале концентраций ионов Mg2+. Поэтому для условий, при которых все ионы Mg2+ находятся в комплексе с АТР (CATP:CMg = 1:1), действие белкового субстрата проявляется в улучшении связывания комплекса ATP-Mg2" (активация по конкурентному типу, ср. прямые 1 и 5 на рис. 5), а для условий изменения типа ингибирования (CMg около 15 мМ) активация белком гидролиза АТР Ьоп-протеиназой (рис. 5, 5 и 5) формально носит неконкурентный характер.

Таким образом, присутствие белкового субстрата приводит к «оптимизации» констант гидролиза АТР, и активирующее влияние белка можно интерпретировать как устранение ингибирующего действия свободных ионов Mg2+ на базовую АТР-азную активность Ьоп-протеиназы при CMg > САтр- При этом сам по себе белковый субстрат не оказывает аллостерического влияния на каталитический аппарат АТР-азного центра, поскольку при САТР = CMg в присутствии белка-субстрата величина А:са, гидролиза АТР не меняется, т.е. активации каталитического центра фермента не происходит.

Влияние аденозиндифосфата на А ТР-азную активность Ьоп-протеиназы

Белок-зависимая активация гидролиза АТР Ьоп-протеиназой может быть обусловлена изменением сродства ADP к АТР-азному центру фермента и, как следствие, повышением эффективности нуклеотидного обмена (то есть замещения ADP на АТР). В таком случае при исследовании ингибирующего действия ADP на базовую и активированную белковым субстратом АТР-азную активность можно ожидать, что в присутствии белка-субстрата обнаружится либо пониженное сродство комплекса ADP-Mg" к ферменту (характеризующееся величиной К,), либо ускорение высвобождения из АТР-азных центров £cLon продукта гидролиза АТР — аденозиндифосфата.

Логично было полагать, что ADP и АТР конкурируют за связывание с Ьоп-протеиназой. Однако неожиданно обнаружилось, что ADP ингибирует базовую АТР-азную активность £cLon неконкурентно и только в присутствии казеина наблюдается торможение гидролиза АТР по конкурентному типу. При этом эффективность ингибирования в обоих случаях оказалась одинаковой (К\ 0.3 мМ), то есть присутствие белкового субстрата не изменяет сродства комплекса ADP-Mg" к ферменту.

Неконкурентное торможение АТР-азной активности £cLon комплексом ADP-Mg" в отсутствие белка-активатора и при параллельно происходящем ингибировании фермента свободными ионами Mg2+ можно объяснить либо проявлением кооперативных взаимодействий между АТР-азными центрами различных субъединиц, либо способностью АТР-азных центров изомеризоваться при связывании комплекса ADP-Mg". Совокупность имеющихся в настоящее время данных не позволяет представить общую картину нуклеотидного обмена в АТР-азных центрах Ьоп-протеиназы, имеющего место в условиях гидролиза АТР. Тем не менее очевидно, что факторами, определяющими закономерности этого обмена, выступают четвертичная структура фермента и кооперативный характер функционирования АТР-азных центров в олигомере, а также белковый субстрат и свободные ионы Mg2+, от содержания которых зависит состояние АТР-азных центров («ADP-» или «ADP-Mg-связанное»).

Дополнительные центры связывания белкового субстрата в структуре Ьоп-протеиназы

Природа селективности Ьоп-протеиназы - одна из центральных проблем исследования фермента. Известно, что отбор белковых мишеней осуществляется АТР-азными модулями ААА+-белков. С целью изучения способности белкового субстрата связываться с участками Ьоп-протеиназы, локализованными вне протеолитического домена, была исследована укороченная в С-концевой области форма фермента (Lon(Metl-Leu544)), содержащая N-концевой домен, и большую часть АТР-азного домена (включая "sensor-2"-остаток Arg542). Препарат Lon( 1-544) был любезно предоставлен д-ром М. Мауризи (Национальный Институт Рака, США). Показано, что в отсутствие белкового субстрата Lon( 1-544) гидролизует АТР с низкой эффективностью (k^t 3 мин'1, Á'm 0.58 мМ); при этом свободные ионы магния не оказывают влияния на скорость гидролиза нуклеотида. В присутствии казеина наблюдается активация гидролиза АТР по бесконкурентному типу (&cat 6 мин , Ám 1.16 мМ).

Низкая АТР-азная активность укороченной формы Echón может быть обусловлена утратой С-концевой части а-домена (остатки Glu545-Phe584), участвующего в гидролизе нуклеотида. Тем не менее, полученные результаты свидетельствуют о способности белкового субстрата специфически взаимодействовать с некоторыми элементами структуры фермента в NA-фрагменте молекулы Ьоп-протеиназы, т.е. являются прямым подтверждением существования дополнительной области связывания белкового субстрата («центр узнавания», аллостерический по отношению к АТР-азному центру). Остается выяснить, локализованы ли эти центры в каждой субъединице Ьоп-протеиназы или аллостерический центр формируется исключительно олигомерной формой фермента.

2.2. Активность протеолитических центров Ьоп-протеиназы

Селективный и процессивный гидролиз белковых мишеней нативной Ьоп-протеиназой осуществляется только в присутствии комплекса АТР—Mg, в отсутствие нуклеотида наблюдается лишь низкоэффективное непроцессивное расщепление тех же мишеней. Гидролиз пептидных субстратов хотя и не требует присутствия нуклеотида, тем не менее также регулируется взаимодействием Ьоп-протеиназы с нуклеотид-магниевыми комплексами. Можно полагать, что для реализации процессивного протеолиза, сопряженного с гидролизом АТР, характерного для функционирования Ьоп-протеиназы, необходимо взаимодействие белка-субстрата с ферментом не только в области каталитического центра. В связи с этим для удобства обсуждения проблем АТР-зависимого протеолиза целесообразно различать в Ьоп-протеиназе пептидазный и протеолитический центры: первый расположен в протеолитическом домене и образован каталитическим центром

и сорбционным участком, взаимодействующим с остатками субстрата, примыкающими к гидролизуемой связи, а второй центр включает, наряду с пептидазным центром, другие участки взаимодействия фермента с белковым субстратом, которые могут локализоваться и вне Р-домена, но быть пространственно сближенными в олигомере фермента. К таким дополнительным участкам взаимодействия Ьоп-протеиназы с белками-мишенями в первую очередь относится центр узнавания или аллостерический центр, выявленный при исследовании АТР-азной активности фермента.

В соответствии с изложенными представлениями для количественной характеристики функционирования пептидазных центров £cLon в качестве субстрата нами был предложен тиобензиловый эфир трипептида Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl (РерТВЕ), функционирование протеолитических центров фермента оценивалось по степени гидролиза а- или Р-казеина; модельным олигопептидным субстратом служил 26-членный токсин мелиттин — GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2. Сравнительное исследование Ьоп-протеиназы с помощью РерТВЕ, мелиттина и казеина позволило выявить некоторые особенности, связанные с пептидазной и протеолитической активностью фермента.

Сравнительная характеристика гидролиза белковых и пептидных субстратов Ьоп-протеиназой в стандартных условиях

Эффективность гидролиза пептидных и белковых субстратов Ьоп-протеиназой зависит от рН. По сравнению с рН-оптимумом гидролиза АТР (8.0-8.2) максимум пептидазной (и протеолитической) активности фермента (рН 9.0) сдвинут в щелочную область, то есть расщепление пептидной связи не связано стехиометрически с гидролизом АТР. Температурный оптимум гидролиза РерТВЕ как в отсутствие, так и в присутствии АТР и ионов Mg2+ совпадает с температурным максимумом АТР-азной активности фермента (50°С). Таким образом, оптимальные для функционирования in vitro пептидазных центров £сЬоп условия (рН 9.0, 50°С) несколько отличаются от условий, выбранных в качестве стандартных (рН 8.0, 37°С, стр. 16).

Данные, характеризующие эффективность функционирования пептидазных центров £cLon, представлены в табл. 3. Видно, что значение Кт, определенное в отсутствие ATP-Mg, практически не меняется в присутствии нуклеотидмагниевого комплекса, однако значение kcal повышается более чем на порядок. Таким образом, взаимодействие с ATP-Mg не влияет на связывание субстрата в сорбционном участке пептидазного центра, но воздействует на каталитический аппарат £cLon, то есть ATP-Mg проявляет свойства неконкурентного аллостерического активатора пептидазных центров фермента.

Деградация РерТВЕ Ьоп-протеиназой в присутствии комплекса негидролизуемого аналога АТР (АМР-СРР) с магнием позволяет

Таблица 3. Кинетические параметры гидролиза РерТВЕ натнвной Ьоп-протеиназон и

мутантом Lon-K362Q

Фермент Кинетические константы Эффектор

— ATP-Mg AMP-CPP-Mg ADP-Mg

Lon-w.t. Кт, мМ 4.4±0.8 3.8±0.7 3.1±0.5 _*

^cats с 4.7±0.4 49±5 42±4

къл1Кт, мМ"1 с"1 1.1+0.3 13±4 13.5±4

Lon-K362Q Кт, мМ 0.55±0.1 0.36±0.07 1.1±0.2 1.010.2

^cats с 0.43±0.04 2.0+0.2 6.110.6 5.310.5

kcJKщ, мМ"' с"' 0.79±0.25 5.6+1.7 5.611.6 5.311.6

* — отсутствие гидролиза субстрата.

Условия: 50 мМ трис-НС1-буфер, рН 8.0, 100 мМ NaCl, 37°С.

Концентрации: Lon - 0.1 мкМ, РерТВЕ - (30-200) мкМ, АТР и ADP - 2.5 мМ, АМР-СРР -0.5 мМ, MgCl2 - 20 мМ, 4,4'-дитиодипиридин - 0.2 мМ, DMSO - 10%.

моделировать функционирование пептидазных центров для случая, когда АТР-азные центры фермента находятся в связанном с ATP-Mg состоянии, но гидролиз нуклеотида не происходит. Значения кинетических констант гидролиза тиоэфирного субстрата в присутствии AMP-CPP-Mg практически совпадают со значениями, полученными в условиях гидролиза АТР (табл. 3). Наличие ADP-Mg приводит к полному ингибированию пептидазных центров £cLon (табл. 3 и рис. 6а, /). Аналогичные эффекты наблюдаются и при гидролизе мелиттина Ьоп-протеиназой (рис. 6а, 2; при этом во всех случаях

Lon-w t. (а)

LorvK362Q (б)

1 1 - в отсутствие нуклеотидов ■ - в присутствии АТР-Мд

t а

222 - в присутствии АМР-СРР-Мд И - в присутствии ADP-Mg

Рис. 6. Влияние нуклеотид-магниевых комплексов на активность нативной ЕсЬоп (а) и мутанта Ьоп-К362С2 (б) при гидролизе РерТВЕ (/), мелиттина (2) и казеина (3). Условия: 50 мМ триоНСЬбуфер, рН 8.0, 100 мМ КаС1, 37°С. Концентрации: нуклеотиды — 2.5 мМ, М§СЬ — 20 мМ.

расщеплению подвергаются одни и те же связи в субстрате: Val8-Leu9, Leu9— Thr10, Thr10—Thr"). Таким образом, именно связывание ATP—Mg вызывает активацию, а связывание ADP—Mg — ингибирование пептидазных центров фермента, то есть комплекс ATP—Mg проявляет свойства модифицируемого аллостерического эффектора по отношению к пептидазным центрам Lon-протеиназы.

Влияние состояния АТР-азных центров £cLon на гидролиз белкового субстрата (т.е. на функционирование протеолитических центров фермента) существенно отличается от влияния на гидролиз РерТВЕ и мелиттина (рис. 6а, 3): казеин эффективно расщепляется ферментом только в условиях гидролиза АТР. Методом масс-спектрометрии MALDI установлено, что продуктами гидролиза казеина нативной £cLon в присутствии ATP—Mg служат исключительно низкомолекулярные пептиды (10—20 а.о., доказательство протекания процессивного протеолиза). В присутствии АМР-СРР—Mg в смеси продуктов обнаруживаются фрагменты субстрата с высокой молекулярной массой — от 5 до 16 кДа (непроцессивный протеолиз). Непроцессивный тип гидролиза характеризует также взаимодействие казеина с ферментом в отсутствие нуклеотида. Таким образом, для реализации процессивного протеолиза необходима не только активация пептидазных центров, но и гидролиз АТР.

Влияние нуклеотидов и ионов магния на функционирование пептидазных иентров Ьоп-протеиназы

Для выявления возможной корреляции между активностью АТР-азных и пептидазных центров в £cLon была изучена пептидазная активность фермента в присутствии различных соотношений нуклеотидов и ионов магния.

Установлено, что в отсутствие нуклеотидов ионы магния являются эффективным активатором пептидазных центров нативной Echón с максимумом в области 20 мМ (рис. 7, кривая 1), то есть роль Mg2+ при функционировании £cLon заключается в участии не только в гидролизе АТР, но и в активации пептидазных центров.

Свободный АТР также активирует гидролиз тиоэфирного субстрата нативной £cLon (рис. 8, кривая /), однако максимальный эффект активации проявляется при весьма низкой концентрации нуклеотида (около 0.01 мМ) и выражен значительно слабее, чем в случае ионов Mg2+. С повышением концентрации АТР до 0.3-0.5 мМ начальная скорость реакции гидролиза снижается до уровня примерно половины от максимальной и далее не меняется. Аналогичное действие на гидролиз РерТВЕ оказывает негидролизуемый нуклеотид АМР-СРР. Полученные результаты можно рассматривать как указание в пользу проявления кооперативных эффектов при функционировании фермента.

Рис. 7. Влияние ионов магния на начальную скорость гидролиза РерТВЕ Ьоп-протеиназой в отсутствие (/) и в присутствии нуклеотидов (2-4) и АТР-азная активность фермента (5). Условия: 50 мМ трис-НС1-буфер, рН 8.2, 100 мМЫаС1,37°С.

Концентрации. Ьоп — 0.1 мкМ, РерТВЕ — 50 мкМ, нуклеотиды - 0 (/), 2.5 (2 и 5) или 0.25 мМ АТР (3), 0.5 мМ АМР-СРР (4).

Рис. 8. Зависимость начальной скорости гидролиза РерТВЕ Lon-протеиназой от концентрации нуклеотида (Nu) — АТР (/) или ADP (2).

Условия: см. в подписи к рис. 7. Концентрации Lon — 0.1 мкМ, РерТВЕ - 50 мкМ.

Связывание ADP при любых концентрациях нуклеотида вызывает ингибирование тиоэстеразной активности нативной £cLon (рис. 8, 2). Эти данные позволяют полагать, что реализация ADP-состояния АТР-азного центра в результате гидролиза нуклеотида (см. Схему, стр. 17) служит одним из этапов регуляции активности протеолитических центров Ьоп-протеиназы.

При одновременном действии АТР и ионов магния EcLon гидролизует РерТВЕ с максимальной скоростью в области концентраций Mg2+ 10-30 мМ (рис. 7, кривые 2 и 3), намного превышающих концентрацию АТР, что не соответствует условиям наиболее активного гидролиза АТР (САтр:СМз = 1:1, рис. 7, 5 и стр. 16). То есть максимальная тиоэстеразная активность достигается ферментом в условиях пониженной АТР-азной активности, и это свидетельствует об отсутствии прямой корреляции между АТР-азной и пептидазной активностями Ьоп-протеиназы.

В присутствии негидролизуемого аналога АТР картина активации протеолитических центров меняется (рис. 7, кривая 4): вплоть до оптимальной концентрации ионов Mg2+ (около 20 мМ) скорость гидролиза РерТВЕ Lon-протеиназой весьма близка к скоростям, измеренным при наличии АТР, однако в области высоких концентраций ионов магния только в присутствии АМР-СРР фермент в значительной степени сохраняет активность. Из

представленных данных следует, что само по себе образование ADP в АТР-азном центре фермента на начальных стадиях превращения субстрата не оказывает выраженного ингибирующего действия на протеолитические центры (ср. кривые 2-4 при [Mg2+] < 20 мМ). Вместе с тем, можно полагать, что с ростом концентрации ионов Mg2+ обмен нуклеотидов в АТР-азном центре фермента замедляется и увеличивается относительное время пребывания £cLon в ADP-связанном (ингибированном) состоянии.

Обобщение данных по Mg-зависимому функционированию пептидазных и АТР-азных центров фермента представлено на рис. 9. Видно, что "оптимальная" концентрация Mg2+, соответствующая наиболее эффективному функционированию пептидазных центров, не определяется ни природой субстрата, ни наличием или отсутствием АТР и соответствует "переходной" концентрации свободных ионов Mg2+ (около 15 мМ), при которой обнаруживается изменение характера ингибирования этими ионами "базовой" АТР-азной активности Echón (см. стр. 16).

Рис. 9. Зависимость относительной активности Ьоп-протеиназы от концентрации ионов Mg2+ при гидролизе казеина (/) и РерТВЕ (2, 3) в присутствии АТР (/, 2) или в отсутствие нуклеотида (3); стрелками показаны тенденции в проявлении АТР-азной активности в присутствии белкового (4) или низкомолекулярного субстратов (5).

Условия: 70 мМ трис-НС1-буфер, рН 8.0, 37°С; 10 % DMSO (для 2 и 5). Концентрации Lon — 0.45 мкМ, РерТВЕ - 50 мкМ, [14С]ацетил-казеин - 0.3 мг/мл, АТР - 5 мМ.

В условиях проявления максимальной АТР-азной активности (См8=Сатр> вертикальная пунктирная прямая), эффективность гидролиза Ьоп-протеиназой и тиоэфирного, и белкового субстратов понижена. При оптимальной для процесса гидролиза РерТВЕ концентрации ионов Mg2+ АТР-азная активность падает (рис. 9, 5), однако она остается максимальной (независимо от содержания ионов Mg2+, 4) при деградации белкового субстрата (/), при этом сохраняется активирующее действие ионов Mg2+ (вплоть до ~20 мМ) на протеолитическую функцию фермента. Дальнейшее увеличение концентрации ионов Mg2+ приводит к снижению эффективности гидролиза как белкового,

сиг*'мМ

так и низкомолекулярного субстрата (рис. 9), вместе с тем, профиль кривых 1 и 2 в этой области различен, что может быть обусловлено различием в способности этих субстратов влиять на эффективность функционирования АТР-азных центров.

Взаимовлияние субстратов протеолитических центров Ьоп-протеиназы

Поскольку и белковые и пептидные субстраты Ьоп-протеиназы расщепляются одними и теми же пептидазными центрами, естественно было предположить, что при одновременном взаимодействии с ферментом субстраты могут вступать в конкурентные отношения, и что в этом случае казеин и мелиттин проявят ингибирующее влияние на гидролиз низкомолекулярного субстрата.

Неожиданно оказалось, что ни мелиттин, ни казеин практически не влияют на тиоэстеразную активность нативного фермента в присутствии как АТР-М^, так и АМР-СРР-М§; в присутствии комплекса АЭР-М§ ЕсЬоп не гидролизует РерТВЕ ни при каких условиях (рис. 10). Более того, в отсутствие нуклеотидов мелиттин (но не казеин) вместо ожидаемого ингибирования активирует гидролиз низкомолекулярного субстрата. Следует подчеркнуть,

\CD-S~

1

I

я

АТР-мд АМР-СРР-ыд АОР-Мд

Г~] - в отсутствие полипептидных эффекторов

. в присутствии казеина в - в присутствии мепиттина

Рис. 10. Влияние полипептидных эффекторов на гидролиз РерТВЕ Ьоп-протеиназой в отсутствие и в присутствии нуклеотид-магниевых комплексов.

Условия: 50 мМ трис-НС1-буфер, рН 8.0, 100 мМ ЫаС1, 10 % ЭМБО, 3ГС. Концентрации. Ьоп — 0.10 мкМ, РерТВЕ - 50 мкМ, АТР и АОР - 2.5 мМ, АМР-СРР - 0.5 мМ, МёС12 - 20 мМ, Р-казеин - 0.5 мг/мл, мелиттин -0.5 мг/мл.

что в этих условиях наблюдается достаточно эффективный гидролиз мелиттина Ьоп-протеиназой (при этом расщепление белкового субстрата выражено очень слабо). Полученные результаты являются еще одним аргументом в пользу существования кооперативных взаимодействий между пептидазными центрами £сЬоп.

3. Мутантные формы Lon-протеиназы и их характеристика

Важным направлением в структурно-функциональном исследовании Lon-протеиназы является изучение сопряжения гидролиза АТР и протеолиза, которое, как можно полагать, в значительной степени определяется междоменными взаимодействиями в ферменте. При исследовании подобного рода взаимодействий перспективно изучение мутантных форм EcLon, утративших сопряжение между АТР-азным и протеолитическим доменами, которые могут быть получены направленным мутагенезом остатков, вовлеченных в «систему передачи сигнала между центрами». Под системой передачи сигнала следует понимать совокупность тех областей АТР-азного и протеолитического доменов, которые претерпевают конформационные изменения в ответ на изменение состояния АТР-азного центра фермента, приводящее к реализации протеолитическим центром способности к процессивному гидролизу белковых субстратов. Необходимыми компонентами этой системы следует считать активные центры фермента — АТР-азный и протеолитический (донор и акцептор сигнала, соответственно), а также области непосредственного контакта между доменами.

Мутантные формы £cLon, несущие замены в протеолитическом домене, получали, главным образом, в целях поиска каталитически активных остатков фермента. Характеристика этих мутантов представлена в табл. 1. Исследование мутантов с заменами в ААА+-модуле £cLon позволило сделать ряд заключений об особенностях функционирования фермента.

3.1. Мутантные формы Loti-протеиназы, несущие замены в ААА+-модуле

Получение мутантов Ьоп-протеиназы

На основе представления о сходной топологии АТР-триггерных белков в литературе была предложена гипотеза, согласно которой ключевую роль в катализе гидролиза нуклеотидов наряду с аминокислотными остатками мотивов Уолкера играет остаток дикарбоновой аминокислоты, локализованный между мотивами А и В (Asp387 для £cLon). Кроме того, постулировалось существование на расстоянии приблизительно 50 а.о. от мотива В в направлении С-конца молекулы остатка тирозина или глутамина, ключевого для передачи сигнала от нуклеотид-триггерного центра к функциональному (в случае £cLon - протеолитическому). В указанной области £cLon не содержит ни глутамина, ни тирозина; при этом ближайший консервативный остаток тирозина (Туг493) локализован в регуляторном а-домене ААА+-модуля фермента, который, как полагают, опосредует передачу энергии гидролиза АТР на субстрат у ААА+-белков.

Для исследования функциональной роли остатков К362 и Т363 (мотив A), D423 (мотив В), потенциального каталитического остатка D387 и возможного участника системы передачи сигнала Y493 были получены соответствующие мутантные формы Lon-протеиназы. Введение в ген Ion нуклеотидных замен, приводящих к заменам K362Q, Т363А, D423N, D387N и Y493F в аминокислотной последовательности £cLon, осуществлено с использованием четырехпраймерного метода мутагенеза, основанного на ПЦР, и подтверждено секвенированием. Выделение мутантных форм £cLon проводили по методике, разработанной для нативного белка.

Энзиматические свойства мутантных форм Lon-протеиназы in vitro

Сравнительные результаты по характеристике в стандартных условиях АТР-азной и АТР-зависимой протеолитической активностей £cLon и ее мутантных форм приведены в табл. 4. Видно, что введение любой из рассматриваемых мутаций в АТР-азный домен £cLon вызывает изменение базовой АТР-азной активности фермента. Значительное снижение активности мутантов Lon-K362Q, -Т363А, -D387N и -D423N по сравнению с активностью нативного фермента свидетельствует о важности мутированных

Таблица 4.Энзиматические свойства Ьоп-протеиназы E.coli и ее мутантных форм

Фермент Локализация мутации АТР-азная активность АТР-за-висимая протеол. ак-ть, % ФСС*

Базовая В присутствии казеина

¿cat > мин"1 Km , мМ ¿cat/ ^"m i мМ'1 мин'1 ¿cat г мин"1 кт, мМ ¿cat/ ^m , мМ"' мин'1

Lon-w.t. - 19 0.20 95 48 0.18 267 100 +

Lon-K362Q а/р-домен (мотив А) 3.8 0.35 11 3.5 0.30 12 0 —

Lon-T363A а/р-домен (мотив А) 3.5 0.44 8.0 3.2 0.45 7.0 0 —

Lon-D423N а/р-домен (мотив В) 3.6 0.45 8.0 3.5 0.40 9.0 30 ±

Lon-D387N (х/р-домен 4.5 0.65 7.0 25 0.60 42 80 +

Lon-Y493F а-домен 48 0.20 240 48 0.20 240 50 ±

*ФСС — функционирование системы сопряжения

Кинетические параметры определены с погрешностью 10 %для к са, и 25 % для Кт. Условия-. 50 мМ трис-НС1-буфер (рН 8 при 25'С); 100 мМЫаС1; 3ГС. Концентрации, ферменты-(0.2-1.0) мкМ; АТР-М§2"-(0.3-3.0) мМ; М§2+- 10 мМ; дефосфорилированный а-казеин или [14С]ацетил-а-казеин —0.3 мг/мл.

остатков для функционирования АТР-азного центра. Вместе с тем предположение о роли D387 как каталитически активного остатка не нашло подтверждения, поскольку АТР-азная функция Lon-D387N активируется казеином — эффект, отсутствующий у мутантов по мотивам Уолкера. Неожиданно высокое значение базовой АТР-азной активности мутанта Lon-Y493F, сопоставимое с активностью нативной £cLon в присутствии казеина, позволяет полагать, что мутация остатка Y493 до некоторой степени «имитирует» эффект взаимодействия фермента с белком-мишенью.

Среди рассматриваемых мутантов только Lon-D387N сохраняет высокий уровень АТР-зависимой протеолитической активности. Мутанты по мотиву А утрачивают способность к гидролизу белка. Интересно, что Lon-D423N и Lon-Y493F, значительно различающиеся по АТР-азной активности, проявляют сходные свойства при гидролизе казеина, что можно рассматривать как дополнительное подтверждение положения о том, что эффективность АТР-зависимого протеолиза не определяется уровнем гидролиза АТР.

Представленные данные позволили выявить значимость мутированных остатков для функционирования £cLon: остатки мотивов Уолкера (К362, Т363 и D423) участвуют в катализе гидролиза АТР, при этом К362 и Т363 являются необходимыми компонентами системы передачи сигнала сопряжения на протеолитический центр, a D423 хотя и вовлечен (как и Y493) в систему сопряжения, но не играет в ней существенной роли. С учетом олигомерной организации фермента можно предположить существование двух вариантов передачи сигнала: как в пределах одной субъединицы, так и на уровне олигомера £cLon (сопряжение АТР-азного и протеолитического доменов разных субъединиц).

Функциональная активность in vivo мутантных форм Lon-протеиназы

Результаты исследования функционирования in vitro мутантных форм £cLon хорошо коррелируют с данными, полученными в системе in vivo. Активность EcLon и ее мутантов in vivo оценивали с помощью предложенного ранее биолюминесцентного метода (Lux-тест), основанного на способности EcLon специфически деградировать белок LuxR — положительный активатор транскрипции оперона /uxICDABE морских бактерий Vibrio fischeri. Продуктами экспрессии оперона /zuICDABE являются люцифераза (LuxAB) и ее субстрат, взаимодействие которых определяет интенсивность биолюминесценции. Понижение интенсивности биолюминесценции коррелирует с уровнем содержания активной Echón в клетках, что свидетельствует об участии фермента в негативной регуляции транскрипции /шг-регулона.

За функциональной активностью мутантных форм EcLon следили по содержанию LuxAB (т.е. по биолюминесценции) в клетках Е. coli штамма AB 1899 (/ол "-штамм), содержащих плазмиду рАС16, несущую /мх-регулон, и

трансформированных соответствующей плазмидной конструкцией на основе pBR327-lon.

По результатам Lux-теста (рис. 11) £cLon и ее мутантные формы можно разделить на три группы. К первой группе относятся нативный фермент и мутант Lon-D387N, почти полностью сохраняющий АТР-зависимую протеолитическую активность in vitro (табл. 4). Из рис. 11 видно, что интенсивность биолюминесценции клеток контрольного штамма АВ1899 (рАС16, pBR327) (кривая 1) на несколько порядков выше, чем у клеток, содержащих плазмиду pBRlon с геном активной £cLon, в которых эффект lorí-мутации полностью снимается (положительный контроль, кривая 2). К подобному результату приводит также экспрессия гена /o«-D387N (кривая 5).

Рис. 11. Кинетика биолюминесценции клеток Е.соП К12 АВ18991оп\ (рАС16), содержащих плазмиды: рВЯ327 (/ - отрицательный контроль) рВШоп (2 - положительный контроль) рВЯ1оп-0387Ы (5); рВШоп-0423Ы (4) рВИоп-У493Р (5); рВЯ1оп-К3620 (6) рВЮоп-ТЗбЗА (7); рВЯ1оп-Н667У (8) рВШоп-8679А (9) и рВЯ1оп-Н665У (10).

Вторую группу образуют мутанты Lon-D423N и Lon-Y493F, протеолитическая активность которых составляет соответственно 30 и 50 % активности нативной £cLon (табл. 4). Для них характерны некоторый лаг-период и увеличенная примерно на порядок по сравнению с положительным контролем интенсивность биолюминесценции в поздней области развития процесса (рис. 11, 4 и 5).

Наиболее выраженная биолюминесценция наблюдается при накоплении в клетках представителей третьей группы - протеолитически неактивных по результатам тестирования in vitro форм £cLon с заменами как в АТР-азном (K362Q, Т363А), так и в протеолитическом (H665Y, H667Y и S679A) доменах (табл. 1 и 4, рис. 11). При этом общий вид соответствующих кривых (6-10)

оказывается сходным с видом кривой (/) для контрольного штамма. Следует заметить, что в области плато интенсивность биолюминесценции суспензий клеток, содержащих мутантные формы £cLon, примерно на порядок ниже таковой для контрольного штамма. Этот феномен можно объяснить эффектом "секвестрирования" (лишенная протеолитической активности мутантная £cLon сохраняет способность связывать белок-субстрат и тем самым уменьшает внутриклеточное содержание активных молекул LuxR).

3.2. Уникальные свойства мутанта Lon-K362Q Мутации в ААА+-модуле Echón в ряде случаев изменяют характер действия эффекторов на АТР-азные и пептидазные центры мутантов, приводят к изменению температурной и рН-зависимостей реакций гидролиза АТР и РерТВЕ. В частности, у Lon-K362Q и Lon-ТЗбЗА не обнаружены эффекты ингибирования ионами Mg2+ базовой АТР-азной активности, а рН-зависимость в области 8.0—9.5 оказалась невыраженной; рН-оптимум реакции гидролиза АТР мутантами Lon-D423N и Lon-D387N смещается примерно на 1 ед. в щелочную область и т.д.

Однако самые непредсказуемые свойства обнаружились у мутанта Lon-K362Q, несущего замену в Р-петле АТР-азного центра. Ряд характеристик Lon-K362Q выявляет кардинальные отличия этого мутанта как от нативного фермента, так и от других полученных и исследованных мутантных форм £cLon.

Влияние нуклеотидов на пептидазную активность мутанта Lon-K362Q

По рН-зависимости скорости гидролиза РерТВЕ мутант Lon-K362Q не отличается от нативной Echón (максимум в области рН 9.0 как в отсутствие, так и в присутствии АТР—Mg). Однако температурные зависимости эффективности функционирования пептидазных и АТР-азных центров обнаруживают различия между нативным и мутантным ферментами: мутация практически не влияет на оптимум (50°С) активности АТР-азных центров, но значительно понижает (до 37°С) оптимум функционирования пептидазных центров, оставшихся интактными.

Выше было показано (табл. 4), что Lys362 представляет собой остаток АТР-азного центра £cLon и является участником системы межцентровой передачи сигнала. Обладающий весьма низкой АТР-азной активностью мутант Lon-K362Q сохраняет тем не менее способность гидролизовать пептидные субстраты, однако, протеолитическая активность утрачивается им абсолютно.

Исследование кинетики гидролиза РерТВЕ обнаруживает заметное сходство между нативным ферментом и Lon-K362Q (табл. 3): в отсутствие нуклеотидов мутант и нативная £cLon гидролизуют РерТВЕ с близкой эффективностью (значения kcJKm), несмотря на то, что введение мутации

серьезно влияет на функционирование каталитического аппарата пептидазного центра (константа ксШ, характеризующая мутант, ниже соответствующей константы для нативной £cLon более чем на порядок), однако константа Кт, отражающая взаимодействие субстрата со связывающей областью пептидазного центра, оказывается более предпочтительной в случае Lon-K362Q. Комплексы ATP-Mg и AMP-CPP-Mg в одинаковой степени увеличивают тиоэстеразную активность мутанта аналогично действию на нативный фермент.

Уникальным свойством Lon-K362Q оказалось то, что ADP-Mg, ингибитор АТР-азной, протеолитической и пептидазной активности нативной £cLon, оказывает активирующее действие на гидролиз мутантом как низкомолекулярного субстрата (РерТВЕ), так и олигопептида (мелиттин). При этом активирующий эффект ADP-Mg практически эквивалентен эффектам ATP-Mg и AMP-CPP-Mg (табл. 3, рис. 66). Таким образом, можно констатировать, что в присутствии ионов Mg2 f связывание любого нуклеотида активирует пептидазные центры мутанта Lon-K362Q. Еще одно отличие Lon-K362Q от нативной £cLon заключается в ингибировании базовой пептидазной активности мутанта любыми свободными нуклеотидами (АТР, ADP, АМР-СРР). Полученные результаты позволяют сделать заключение о кардинальном различии взаимодействий, имеющих место между АТР-азными и пептидазными центрами в нативной Ьоп-протеиназе и ее мутантной форме.

Комплементация мутаций Lon-K362Q и Lon-S679A

Как отмечалось выше (стр. 28), функционирование Ьоп-протеиназы как гомоолигомера позволяет предполагать существование двух вероятных вариантов междоменной передачи сигнала: в пределах одной субъединицы и/или на уровне олигомера (сопряжение АТР-азного и протеолитического центров разных субъединиц). Проверка реализации второго варианта была осуществлена путем исследования свойств смешанного олигомера Lon-K362Q/S679A, образованного мутантами, несущими замены по каталитически активным остаткам разноименных центров: Lon-K362Q (обладает пептидазной активностью) и Lon-S679A (не имеет пептидазной активности). Следует подчеркнуть, что гидролиз РерТВЕ смешанным мутантом может быть обусловлен исключительно функционированием пептидазных центров мутанта Lon-K362Q.

Установлено, что Lon-K362Q/S679A не гидролизует РерТВЕ в отсутствие нуклеотида, но проявляет повышенную по сравнению с мутантом Lon-K362Q тиоэстеразную активность в присутствии ATP-Mg (табл. 5). Связьрание комплекса ADP-Mg с Lon-K362Q/S679A, в противоположность действию на Lon-K362Q, приводит к ингибированию гидролиза РерТВЕ -эффект, аналогичный действию ADP-Mg на нативный фермент. Следовательно, в смешанном олигомере Lon-K362Q/S679A

Таблица 5. Гидролиз Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl смесью мутантов Lon-K362Q и Lon-S679A

(комплементация мутаций)

Эффекторы Фе рмент

Lon-S679A Lon-K362Q Lon-K362Q + Lon-S679A Lon-w.t.

- 0 2 0 10

2.5 мМ АТР, 20 мМ MgCl2 0 20 33 100

2.5 мМ ADP, 20 мМ MgCl2 0 20 2 0

Приведены относительные скорости гидролиза субстрата; погрешность определения 10%. Условия: 50 мМ трис-НС1-буфер, pH 8.0, 0.1 М NaCl, 3ГС, 10% DMSO, 0.2 мМ 4,4'-дитиодипиридин.

Концентрации-. Lon-w.t. и Lon-K362Q - 0.06 мкМ, Lon-S679A - 0.4 мкМ, субстрат — 100 мкМ.

восстанавливаются межсубъединичные взаимодействия, характерные для нативного фермента, то есть наблюдается эффект комплементации мутаций. Эти результаты служат доказательством наличия взаимодействий протеолитических и АТР-азных центров различных субъединиц в молекуле Echón и показывают, что ингибирующее действие ADP—Mg на пептидазные центры действительно осуществляется из соседних субъединиц (межсубъединичная передача сигнала).

В таком случае активация пептидазных центров мутанта Lon-K362Q при связывании ADP—Mg может быть обусловлена только действием нуклеотида из АТР-азного центра собственной субъединицы (внутрисубъединичная передача сигнала). Эти результаты позволяют сделать следующее заключение: либо в олигомере мутанта Lon-K362Q нарушены межсубъединичные взаимодействия, либо мутант функционирует как отдельная субъединица. Выбор между этими возможностями может быть сделан после сравнительного изучения олигомерного состояния £cLon и ее мутанта Lon-K362Q при различных условиях.

Гель-фильтрация и скоростная седиментация Lon-K362Q обнаруживают снижение степени его олигомеризации по сравнению с нативным ферментом. Влияние нуклеотидов на олигомерное состояние функциональных форм £cLon и Lon-K362Q было исследовано методом «седиментации активного фермента» с использованием в качестве индикатора седиментирующей зоны низкомолекулярного субстрата РерТВЕ.

В отсутствие нуклеотидов и ионов Mg2+ активными оказались агрегаты нативной £cLon, а в условиях функционирования АТР-азного центра — тетрамеры фермента (табл. 6). Следовательно, либо наличие ATP—Mg

Таблица 6. Определение четвертичной структуры нативной Ьоп-протеиназы и мутанта Ьоп-К362С? методом седиментации активного фермшта

Lon-w.t. Lon-K362Q

Эффектор коэффициент количество коэффициент количество

седиментации, S субъединиц седиментации, S субъединиц

- >30 агрегаты 7.3 2

ATP-Mg 12.3 4 4.6 1

AMP-CPP-Mg >50 агрегаты 4.1 1

ADP-Mg Нет гидролиза РерТВЕ 12.6 4

Условия: 50 мМ трис-НС1-буфер, рН 8.0, 100 мМ NaCl, 10% DMSO, 2 мМ 4,4'-дитиодипиридин.

Концентрации. Lon или Lon-K362Q - (0.1-1) мг/мл, РерТВЕ- 0.5 мМ, АТР и АМР-СРР - (0.1-1) мМ. ADP - 1 мМ, Mg2+ -1-10 мМ.

приводит к дезагрегации Lon-протеиназы, либо только тетрамеры фермента обладают способностью к активации пептидазных центров при связывании с ATP-Mg. Тот факт, что в присутствии комплекса AMP-CPP-Mg активная £сЬоп проявляется как высокоагрегированный фермент (табл. 6), позволяет предположить, что функционированию Ьоп-протеиназы как тетрамера способствует образование в АТР-азных центрах фермента продукта гидролиза АТР - аденозиндифосфата.

Четвертичная структура мутанта Lon-K362Q кардинально отличается от структуры нативной ZscLon (табл. 6): 1) ни при каких условиях не зафиксировано агрегированного состояния мутанта; 2) в отсутствие эффекторов основная тиоэстеразная активность принадлежит димеру Ьоп-K362Q; 3) введение в систему ATP-Mg или AMP-CPP-Mg приводит к обнаружению активных мономеров фермента; 4) в присутствии ADP-Mg активными в отношении гидролиза РерТВЕ являются тетрамеры мутанта.

Таким образом, можно полагать, что в зависимости от состояния АТР-азных центров мутант Lon-K362Q функционирует либо как индивидуальная субъединица, либо как тетрамер, в котором нарушены межсубъединичные взаимодействия, а в условиях гидролиза АТР мутантная форма Ьоп-протеиназы Lon-K362Q может служить моделью отдельной субъединицы фермента.

Совокупность представленных данных свидетельствует о реализации в Ьоп-протеиназе обоих вероятных путей передачи сигнала от АТР-азных центров к пептидазным: и внутрисубъединичного и межсубъединичного. При этом можно полагать, что независимо от природы нуклеотида его комплекс с магнием активирует пептидазный центр собственной субъединицы (внутрисубъединичное взаимодействие АТР-азного и пептидазного центров), а эффект ингибирования олигомерной нативной Ьоп-протеиназы аденозиндифосфатом (и, возможно, наряду с этим эффект активации

аденозинтрифосфатом) обусловлен межсубъединичными взаимодействиями АТР-азных и пептидазных центров, причем межсубъединичные взаимодействия превалируют над внутрисубъединичными. Упрощенная схема, иллюстрирующая пути передачи сигнала в Ьоп-протеиназе на примере одной пары субъединиц фермента, приведена на рис. 12.

(а) (б)

Рис. 12. Внутрисубъединичный (а) и межсубъединичный (б) пути передачи сигнала от АТР-азных центров к пептидазным в Ьоп-протеиназе.

Р+ и Р- — активированные и дезактивированный пептидазные центры, соответственно, АХР — АТР или АЭР.

Межсубъединичные взаимодействия в Ьоп-протеиназе не являются неожиданными: такой тип взаимодействий реализуется во всех гетероолигомерных ААА+-протеиназах, АТР-азая и протеолитическая функция которых локализованы в разных субъединицах (С1рАР-, С1рХР- и ЬЫУи-протеиназы прокариот и протеасомы эукариот). Роль же внутрисубъединичных взаимодействий АТР-азных и пептидазных центров в функционировании Ьоп-протеиназы еще предстоит выяснить.

4. Укороченные формы Ьоп-протеиназы и их характеристика

В целях исследования роли междоменных отношений при функционировании Ьоп-протеиназы была изучена энзиматическая активность укороченных фрагментов фермента, представляющих индивидуальные домены или их сочетания. Необходимые для исследования фрагменты £сЬоп (табл. 7) были получены как методами генной инженерии, так и ограниченным протеолизом полноразмерного фермента или его мутантных форм.

Таблица 7. АТР-азная и протеолитическая активность укороченных и модифицированных форм Lon-протснназы Е. coli

№ № Форма фермента АТР-азная активность Протеолитическая активность, %

без эффекторов + казеин -ATP-Mg +ATP-Mg

кем, мин"1 А'гп, мМ kcAt./ мМ"1- мин"'

1 Lon-vv.t. 19 0.20 95 активация 0" 100

2 GST-//-Lon( 1-784) 22 0.23 96 активация О' 100

3 tp-Lon( 1-784) 20 0.21 95 активация 0' 100

4 Lon(l-544) 3 0.58 5.2 активация гидролиз казенна невозможен

5 GST-//-Lon( 108-784) 3 0.36 8.3 не опр. 0* <5

6 tp-Lon( 108-784) - - <5 не опр. 0' < 1

7 GST-í/-Lon(567-784) гидролиз ATP невозможен 0'

8 tp-Lon(567-784) гидролиз АТР невозможен 0'

9 AAA+-модуль, Lon(23 5-584) 0 0 гидролиз казенна невозможен

10 АР-фрагмент, Lon(235-784) 40 % от активности Lon-w.t. нет активации 0 (автолиз) 0 (автолиз)

11 Р-домен, Lon(585-784) гидролиз АТР невозможен 0 0

Кинетические параметры определены с погрешностью 10 %для kiM и 25 % для Кт. * - Данные для препаратов, не прошедшах стадию очистки на гепарин-сефарозе. GST — глутатион-Б-трансфераза, tl — гидролизуемый тромбином линкер -Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-, tp - тетрапептид Gly-Ser-Pro-Gly (фрагмент линкера).

Рекомбинантные укороченные формы Echón получали с использованием плазмидного вектора pGEX-KG, позволяющего экспрессировать гибридные белки (№ № 2, 5 и 7 в табл. 7), состоящие из глутатион-8-трансферазы (GST, белок-носитель, 222 а.о.) и целевого белка, соединенных линкером -Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly- (tl), который гидролизуется тромбином по связи -Arg-Gly-. Целевыми белками служили соответственно: полноразмерная EcLon, фрагмент Lon( 108-784), содержащий С-концевую часть N-домена, ААА+-модуль и Р-домен, а также фрагмент Lon(567-784), образованный Р-доменом и восемнадцатью предшествующими ему остатками а-домена. Выделение гибридных белков проводили из бесклеточных экстрактов либо по стандартной методике выделения EcLon, либо аффинной хроматографией на глутатион-агарозе. В результате гидролиза гибридных форм EcLon тромбином получали целевые белки, содержащие на N-концах молекул дополнительный тетрапептид Gly-Ser-Pro-Gly- (tp) (№№ 3, 6 и 8 в табл. 7).

Продукты ограниченного протеолиза £cLon химотрипсином, включающие АТР-азный и/или протеолитический центры фермента (фрагменты (9-11) в табл. 7), получены как описано в разделе 1.1 (стр. 7-8) и очищены с помощью хроматографии на гепарин-сефарозе, Q-сефарозе и гель-фильтрации.

АТР-азная и протеолитическая активность укороченных и модифицированных форм Ьоп-протеиназы Из данных табл. 7 (№№ 2 и 3) видно, что удлинение N-концевой части £cLon не влияет на энзиматические характеристики фермента: оба варианта £cLon полностью сохраняют АТР-зависимую протеолитическую активность; кинетические константы, характеризующие АТР-азную активность этих форм фермента, практически не отличаются от констант для нативного фермента. Добавление казеина приводит к стимуляции гидролиза АТР обеими модифицированными формами, что также согласуется с результатами, полученными для нативной £cLon.

С другой стороны, удаление N-домена фермента влечет за собой радикальное изменение свойств Echón: АР-фрагмент (табл. 7, № 10) хотя и проявляет около 40 % АТР-азной активности нативной £cLon, однако теряет способность активироваться в присутствии белкового субстрата; собственно гидролиз казеина также полностью элиминируется, при этом АР-фрагмент проявляет выраженную склонность к автолитическому расщеплению. Вместе с тем АР сохраняет пептидазную активность, а олигопептидный субстрат мелиттин активирует гидролиз АТР АР-фрагментом так же, как и нативной £cLon. Таким образом, потеря N-домена Ьоп-протеиназой приводит к утрате или нарушению аллостерического центра связывания белковой мишени. Полученные результаты позволяют выдвинуть гипотезу о роли N-домена Ьоп-протеиназы как интегрированного адапторного белка, обеспечивающего взаимодействие фермента с белками-мишенями.

Следует отметить, что рекомбинантный фрагмент tp-Lon( 108-784) (№ 6), лишенный лишь части N-домена £cLon, практически полностью теряет и АТР-азную и протеолитическую активность. Модифицированная форма EcLon с заменой утраченной части N-домена на белок-носитель (GST-tl-Lon(108-784), № 5) проявляет незначительную активность обоих видов. Заметное снижение АТР-азной активности рассматриваемых форм (№№ 5 и 6) по сравнению с активностью АР-фрагмента (№ 10) может быть связано с нарушением вторичной и/или пространственной структуры у рекомбинантных белков (при этом центр узнавания белковой мишени может сохраниться полностью или частично).

Приведенные данные позволяют констатировать, что N-концевой домен £cLon играет весьма важную роль в проявлении ферментативной активности обоих видов — как АТР-азной, так и, в особенности, протеолитической.

Поскольку в укороченных в области N-домена фрагментах £cLon оба активных центра остаются интактными, можно предположить, что описанные выше изменения активности обусловлены изменениями в третичной и/или четвертичной структуре фермента.

Указанием в пользу справедливости выдвинутого предположения служит факт различия степени олигомерности (данные гель-фильтрации) нативной £cLon (8 или 12 субъединиц) и АР-фрагмента (4 субъединицы), при этом изолированный N-домен является мономером. Представленные данные свидетельствуют, что N-домен ответствен за олнгомерное состояние фермента, которое, в свою очередь, определяет способность Lon-протеиназы к проявлению протеолитической активности.

Изучение ААА+-модуля EcLon (№ 9), т.е. формы фермента, лишенной в результате ограниченного протеолиза обоих концевых доменов, неожиданно показало, что ААА+ -модуль абсолютно неспособен к гидролизу нуклеотида. Поскольку в противоположность ААА+-модулю АР-фрагмент гидролизует АТР, формально влияние Р-домена на ААА+-модуль в £cLon можно рассматривать как «активирующее», и оно кардинально отличается от влияния протеолитических компонентов на функционирование АТР-азных составляющих в гетероолигомерных ААА+-протеиназах, которое, наоборот, приводит к снижению АТР-азной активности. Здесь необходимо подчеркнуть, что взаимодействующие компоненты протеиназ ClpAP, ClpXP и HslUV представляют собой сформированные циклические гекса- или гептамеры, обладающие собственной пептидазной или АТР-азной активностью. В то же время оказалось, что ААА+-модуль £cLon в растворе в стандартных условиях (рН 8.0, 150 мМ NaCl) существует как мономер (данные гель-фильтрации), несмотря на то, что в нем сохранены все характеристические признаки АТР-азных модулей ААА+-белков. Суммируя изложенное, можно полагать, что активирующее действие Р-домена £cLon обусловлено тем, что в составе АР-фрагмента ААА+-модуль приобретает олигомерную (тетрамер) структуру.

Таким образом, можно считать, что влияние и N-концевого и протеолитического доменов на функционирование ААА+-модуля EcLon заключается в способствовании образованию «правильной» олигомерной структуры, необходимой для проявления АТР-азной активности.

Протеолитическую активность проявляют исключительно нативная £cLon и те ее формы, которые включают полноразмерный фермент (табл. 7, №№ 1-3). Поскольку удаление уже N-концевого домена приводит к утрате Lon-протеиназой протеолитической активности, неудивительно, что ни индивидуальный протеолитический домен (№ 11), ни более протяженные структуры, содержащие Р-домен (№№ 7 и 8), не гидролизуют белковый субстрат.

Пептидазная активность укороченных и модифицированных форм

Ьоп-протегшазы

Олигопептидный субстрат мелиттин с близкой эффективностью гидролизуется гибридным белком GST-//-Lon(567-784), фрагментом tp-Lon(567-784) и нативной £cLon (в отсутствие АТР). Оказалось, что при этом сайты преимущественного расщепления олигопептида различны: под действием tp-Lon(567-784) гидролизу, главным образом, подвергается связь а под действием £cLon — Val8-Leu9 (показано N-концевым аминокислотным секвенированием). То есть £cLon и ее фрагмент tp-Lon(567-784) проявляют отличающуюся специфичность при гидролизе мелиттина.

Индивидуальный протеолитический домен £cLon (табл. 8, № 3), как и ожидалось, способен гидролизовать РерТВЕ, однако, с весьма низкой эффективностью (¿cat понижена примерно на два порядка по сравнению с соответствующей константой для нативного фермента). Значительно более высокая пептидазная активность наблюдается у фрагмента АР (№ 2), при этом последний сохраняет способность нативного фермента гидролизовать пептидные субстраты по АТР-зависимому механизму. Надо отметить, что, несмотря на различие в функционировании каталитических центров (kcal) в 5-8 раз, эффективность гидролиза РерТВЕ (в терминах k^/Km) фрагментом Lon-АР и нативной Ьоп-протеиназой можно считать сопоставимой (табл. 8).

Таблица 8. Пептидазная активность укоршенныхформ Lon-протенназы Е. coli

(субстрат - РерТВЕ)

- АТР—Mg + ATP-Mg

№ № Форма фермента ¿cat, с' мМ ¿cat/ Кт, мМ"'- С 1 ¿cat, с"1 мМ ¿cat/ мМ"'с'

1 Lon-w.t. 4.7 4.40 1.07 49 3.80 13.0

2 АР-фрагмент, Lon (235-784) 0.57 0.36 1.57 10.5 0.42 25.0

3 Р-домен, Lon(585-784) 0.048 0.31 0.154 Не определяли

Кинетические параметры определены с погрешностью 10 % для к^ и 25 % для Кт.

Из приведенных данных следует, что протеолитический домен Ьоп-протеиназы содержит сформированный пептидазный активный центр, однако, для проявления им максимальной пептидгидролазной активности требуется, как минимум, взаимодействие с ААА+-модулем фермента.

5. Кристаллическая структура индивидуальных доменов Ьоп-протеиназы

Поскольку кристаллизацию полноразмерной Ьоп-протеиназы осуществить до настоящего времени не удалось, для исследования структуры фермента были использованы фрагменты ЕсЬоп. Пространственная структура протеолитического и а-спирализованного доменов, полученных ограниченным протеолизом мутантной формы Ьоп-5ег679А1а, определена с разрешением 1.75 А для Р-домена и 1.9 А для а-домена. Работа выполнена совместно с лабораторией кристаллографии макромолекул Национального Института Рака (Фредерик, США).

Протеолитический домен Ьоп-протеиназы (Ьоп(585-784)) имеет уникальную пространственную укладку, не обнаруженную ранее среди известных белковых структур. Р-домен состоит из пяти а-спиралей, одной спирали Зю и десяти р-тяжей, локализованных в первичной структуре в последовательности 8зН82Н83Н8Н28Н, где Н - спираль, а Б - Р-тяж (рис. 13а и б). Шесть Р-доменов (молекулы А-Р) образуют в кристалле кольцеобразный гексамер (рис. 13в).

Рис. 13. Структура протеолитического домена Ьоп-протеиназы Escherichia coli.

(а) - ленточная диаграмма строения Р-домена (в цветах видимого спектра: от синего (N-конец) к красному (С-консц); показано положение остатков каталитической диады);

(б) — топология Р-домена (красным цветом показаны ß-тяжи, голубым - а-спирали, светлоголубым - спираль Зю);

(в) - гексамер Р-домена (куполообразная структура с отверстием в центре, вид сверху).

*' ¿Л, . > .1 <' -

(б)

(в)

N-Концевой (5-тяж 1 (остатки 594-605) и антипараллельный ему Р-тяж 2 (607-619) образуют длинную р-шпильку (рис. 136). Эта шпилька и параллельные Р-тяжи 3 (621-628) и 4 (661-670), соединенные а-спиралью 1 (632-649), образуют первый большой Р-слой. Тяж 5 (673-678) перпендикулярен плоскости этого р-слоя и связан со спиралью 2 (681-693) петлей, в которой локализован каталитически активный остаток Ser679 (замещенный в рассматриваемой структуре на Ala). Спирали 1 и 2 взаимодействуют с первым р-слоем, образуя относительно компактный субдомен-1.

На дистальной (удаленной от ААА+-модуля) поверхности Р-домена тяж 5 формирует второй Р-слой путем образования четырех водородных связей: двух с остатком ТгрбОЗ Р-шпильки и двух — с сегментом (629-631), соединяющим тяж 3 и спираль 1. Этот малый Р-слой расположен на поверхности неглубокой щели в центре дистальной поверхности кольца. Обнаружен дисульфидный мостик между остатками Cys617 и Cys691, связывающий С-концевые участки тяжа 2 и спирали 2 и, тем самым, стабилизирующий субдомен-1 (рис. 136). Такая необычная экспонированная в растворитель дисульфидная связь уникальна для EcLon и может присутствовать только у тех Ьоп-протеиназ, которые имеют гомологичные остатки цистеина (менее 10 % известных ЬопА-протеиназ).

Следующая за спиралью 2 неупорядоченная петля (695-699) (рис. 136) образует мостик ко второму субдомену. Короткий р-тяж 6 (700-705) ведет ко второй Р-шпильке (706-714), образованной антипараллельными тяжами 7 и 8, и к следующей за ними спирали 3 (719-730). Спираль 3 расположена практически параллельно дистальной поверхности и включает остаток Lys722. Таким образом, каталитические остатки Ser679 и Lys722 локализованы в разных субдоменах протеолитического домена EcLon.

За тяжом 9 (732-737), вытянутым вдоль спирали 3, следуют короткая Зю-спираль 4 (738-747), а-спираль 5 (748-755) и параллельный тяж 10 (756761). Тяжи 6, 9 и 10 формируют третий р-слой, который заключен между спиралью 3 и С-концевой спиралью 6 (762-772), расположенной вдоль внешней поверхности кольца параллельно проксимальной (обращенной к ААА+-модулю) поверхности Р-домена.

а-Спирализованный домен ААА+-модуля EcLon непосредственно предшествует протеолитическому домену и представляет фрагмент (491-584) первичной структуры фермента. Структура а-домена (рис. 14) соответствует общей топологии а-доменов ААА+-белков: HSHHSH.

Первая спираль (остатки 494-514), в которой обнаруживается слабый изгиб в области остатка His505, соединена петлей с Р-тяжом 1 (517-521), за которым следует спираль 2 (524-535). Короткий поворот соединяет спираль 2 с длинной спиралью 3 (540-563), в начале которой локализован

Рис. 14. Структура а-домена Ьоп-протеиназы Е. coli (в цветах видимого спектра: от синего (N-конец) к красному (С-конец); показано положение остатка Arg542).

консервативный для а-доменов остаток "sensor-2" — Arg542. Второй р-тяж (2, 566-570) расположен параллельно первому и образует с ним р-слой. За спиралью 4 (571-580) следует развернутый С-концевой фрагмент (581-584), имеющий тем не менее выраженную электронную плотность, что свидетельствует о том, что отсутствие вторичной структуры у этого фрагмента является характеристикой строения Ьоп-протеиназы, а не следствием ограниченного протеолиза в этой области молекулы.

Наложение структур а- и Р-доменов £cLon на соответствующие области пространственной структуры гетероолигомерной протеиназы HslUV позволило воспроизвести локализацию девяти линкерных остатков (585-593), не видимых в структуре Р-домена. При этом обнаружено подобие регионов, в которых осуществляется взаимодействие АТР-азных и протеолитических модулей HslUV- и Ьоп-протеиназ.

Протволитический центр Ьоп-протеиназы

В кристаллической структуре Р-домена £cLon каталитический остаток Ser679 замещен на Ala, однако известно, что такое замещение не приводит к значительному изменению конформации остатка. Второй каталитический остаток — Lys722 — образует водородную связь с карбонильным кислородом строго консервативного остатка Gly717, локализованного в положении (+38)Ser*, потенциальная значимость которого была отмечена в разделе 1.3 (стр. 11), и кроме того, может взаимодействовать с С-концевым фрагментом другого мономера. Постулирование наиболее вероятных взаимодействий для гидроксильной группы Ser679 приводит к двум альтернативным моделям строения протеолитического центра £cLon (рис. 15): в одном случае (зеленый цвет) остаток Lys722 взаимодействует с остатками Ser679, Thr704 (важная роль которого для функционирования фермента также постулировалась выше, см. стр. 11) и Gly717; в другом (голубой цвет) — связь Lys722 с остатком глицина отсутствует.

S679

Рис. 15. Альтернативные модели активного центра Lon-протеиназы Escherichia coli.

V %

I

G717

Анализ кристаллической структуры Р-домена ЕсЬоп позволил также выявить причины потери протеолитической активности мутантами Ьоп-Н665У, -Н667У и -0676Ы (см. табл. 1 и стр. 10). Оказалось, что подвергнутые мутации остатки вовлечены в разветвленную сеть внутри- и межсубъединичных взаимодействий, реализующихся в гексамере Р-домена и влияющих как на формирование олигомерной структуры Р-домена, так и на функциональную активность самого Р-домена и полноразмерной Ьоп-протеиназы.

Сопоставление протеолитического домена Ьоп-протеиназы Е. coli и ряда сернн-лнзановых пептидгидролаз Структура протеолитического домена Echón была сопоставлена со структурами четырех серин-лизиновых пептидгидролаз (репрессора LexA, бактериальной сигнальной пептидазы 1 типа, UmuD' и репрессорного белка cl фага А,), принадлежащих согласно классификации MEROPS к клану SF. При этом выявленное выше различие фрагментов последовательностей, включающих каталитические остатки (табл. 2), не повлияло на общее сходство укладки структур в области активных центров этих ферментов. И несмотря на уникальность типа пространственной структуры Р-домена Echón, последовательность его остатков, включающая ß-тяж 5 и начало спирали 2 с расположенным между ними каталитическим остатком Ser679, хорошо совпадает с соответствующими сегментами четырех других структур (рис. 16а). Проведенное выравнивание приводит, кроме того, к однозначному наложению каталитических остатков Lys (рис. 16б) для всех ферментов.

При сравнительном анализе активных центров оказалось, что все рассматриваемые пептидазы содержат остаток серина или треонина, уО-атом которого локализован на расстоянии водородной связи от каталитического остатка лизина (Thr704 для £cLon) (рис. 166). В литературе выдвинуто

Рис. 16. Сопоставление протеолитического домена Lon-протеиназы и других серин-лизиновых пептидгидролаз в области их активных центров.

(а) - наложение структур Р-домена Lon (серый цвет) и LexA (голубой цвет) (выделены каталитические остатки серина и лизина);

(5) - сравнение взаиморасположения остатков в активных центрах Р-домена Lon, LexA и бактериальной сигнальной пептидазы (зеленый цвет); цифрами отмечены атомы, потенциально вовлеченные в образование оксианионной полости в активном центре Lon-протеиназы (1), сигнальной пептидазы (2) и LexA (3).

предположение, что такой остаток может содействовать функционированию каталитического центра серин-лизиновых пептидгидролаз. Однако, с помощью сайт-направленного мутагенеза показана несостоятельность этой гипотезы в отношении Lon-протеиназ (£cLon-T704A сохраняет значительную часть протеолитической активности). Таким образом, роль этого строго консервативного для обоих подсемейств Lon-протеиназ остатка треонина предстоит выяснить в дальнейших исследованиях.

Характерной особенностью сериновых протеиназ является существование так называемой «оксианионной полости», стабилизирующей образование тетраэдрического промежуточного производного в процессе катализа. В структуре LexA эта полость образуется двумя амидными атомами азота основной цепи, принадлежащими каталитическому остатку Serl 19 и предыдущему Metí 18. В тех структурах LexA, в которых петля, включающая гидролизуемую связь Ala84-Gly85, находится в конформации, затрудняющей протекание процесса саморасщепления, положение карбонильного О-атома остатка А1а84 занято молекулой воды. В структуре Р-домена £cLon, а также UmuD' и X cl-белка обнаружена эквивалентная вода, которая образует

дополнительную водородную связь с карбонильным О-атомом остатка, занимающего положение (-3) относительно каталитического серина (в случае EcLon это — Asp676). В отличие от рассмотренных ферментов сигнальная пептидаза не содержит консервативной молекулы воды, а в образовании ее оксианионной полости принимают участие амидный азот каталитического остатка Ser90 и гидроксил боковой цепи Ser88 (рис. 166).

Исходя из сходства конфигурации активных центров Р-домена EcLon и обсуждаемых серин-лизиновых пептидгидролаз, можно было бы ожидать, что оксианионная полость EcLon также образована амидными атомами азота Ser679 и предшествующего ему остатка. Однако такой вариант представляется сомнительным, поскольку в положении 678 EcLon локализован остаток пролина, участия которого в активных центрах других ферментов до настоящего времени не отмечалось. Из рентгеноструктурных данных следует, что единственным альтернативным кандидатом на участие в образовании оксианионной полости в Echón мог бы служить амидный азот высококонсервативного (более чем на 90 %) в подсемействе LonA остатка ТгрбОЗ, локализованного в рассматриваемой области Р-домена. Однако окончательное подтверждение этого предположения требует дополнительного исследования.

Таким образом, кристаллографическое изучение индивидуальных доменов EcLon позволило получить подтверждение существования каталитической диады в активном центре фермента и установить, что протеолитический домен EcLon имеет уникальный тип пространственной структуры. На основании полученных результатов Ьоп-протеиназы были выделены в самостоятельное структурное семейство, представляющее индивидуальный клан SJ в классификации пептидгидролаз MEROPS.

выводы

1. Проведено структурно-функциональное изучение АТР-зависимых Lon-протеиназ с использованием в качестве модельного фермента Lon-протеиназы из Escherichia coli (£cLon). Сопоставлением первичных структур ферментов семейства Lon выявлена их доменная организация, подтвержденная получением индивидуальных N-концевого, АТР-азного, а-спирализованного и протеолитического доменов EcLon с помощью ограниченного протеолиза.

2. Анализом аминокислотных последовательностей ферментов семейства Lon и сайт-направленным мутагенезом £cLon установлено, что в протеолитических центрах Lon-протеиназ функционирует каталитическая диада Ser-Lys. Выявлена уникальность семейства Lon среди серин-лизиновых пептидгидролаз.

3. Установлено, что семейство Lon-протеиназ состоит из двух подсемейств (LonA и LonB), различающихся окружением каталитических остатков протеолитического центра, структурной организацией АТР-азного домена и общей архитектурой молекулы (наличие N-концевого домена у LonA-протеиназ и вставочного трансмембранного домена в ААА+-модуле LonB-протеиназ).

4. Изучены особенности функционирования АТР-азных и протеолитических центров EcLon. Установлено, что необходимыми факторами реализации процессивного протеолиза являются гидролиз АТР и олигомерность фермента. Выявлено отсутствие прямой корреляции между АТР-азной и пептидазной активностями. Обнаружен дополнительный центр связывания белкового субстрата, расположенный в области, включающей N-концевой и АТР-азный домены.

5. Для идентификации функционально значимых остатков Lon-протеиназы получено и охарактеризовано 17 точечных мутантов фермента с заменами в АТР-азном и протеолитическом доменах. Установлено, что функциональная активность мутантных форм Lon-протеиназы, определенная in vitro, коррелирует с активностью тех же форм in vivo (биолюминесцентный Lux-тест).

6. Охарактеризован уникальный мутант Lon-K362Q с заменой в Р-петле ААА+-модуля, взаимодействие которого с комплексом ADP—Mg — ингибитором нативной Lon-протеиназы - вызывает активацию

пептидазного центра. Показано, что свойства Lon-K362Q обусловлены нарушением межсубъединичных взаимодействий, характерных для нативного фермента. Комплементацией мутаций (Lon-K362Q и Lon-S679A) показано существование в нативной Lon-протеиназе двух путей передачи сигнала от АТР-азных центров к протеолитическим — внутри-и межсубьединичного.

7. Для исследования междоменных взаимодействий получены и охарактеризованы укороченные формы Lon-протеиназы, представляющие индивидуальные домены фермента и их комбинации. При этом установлено, что

• изолированные протеолитический и АТР-азный домены фермента существуют в растворе в форме мономеров (в отличие от каталитических субъединиц гетероолигомерных АТР-зависимых протеиназ, образующих циклические гекса- или гептамеры);

• протеолитический домен проявляет исключительно пептидазную активность как в изолированном состоянии, так и в сочетании с АТР-азным доменом (AP-фрагмент); только в составе полноразмерного фермента протеолитический домен приобретает способность к гидролизу белкового субстрата;

• АТР-азный домен не обладает ферментативной активностью, но способен гидролизовать АТР в составе как полноразмерной Lon-протеиназы, так и ее АР-фрагмента;

• N-концевой домен важен для олигомеризации Lon-протеиназы и имеет ключевое значение для проявления ферментом протеолитической активности. Выдвинута гипотеза о роли N-концевого домена как интегрированного адапторного белка Lon-протеиназы.

8. Впервые определена кристаллическая структура протеолитического и а-спирализованного доменов, полученных ограниченным протеолизом Lon-протеиназы Е. coli. Подтверждено наличие каталитической диады Ser-Lys и выявлен ряд остатков, участвующих в формировании активного центра фермента. Показано, что структура а-домена соответствует общей топологии а-доменов ААА+-белков.

9. Установлено, что протеолитический домен Ьоп-протеиназы Е. coli имеет уникальный тип пространственной структуры, что позволило выделить Ьоп-протеиназы в самостоятельное структурное семейство, представляющее индивидуальный клан SJ в классификации пептидгидролаз MEROPS.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях: Обзоры:

1. Романова Т. В. Структурно-функциональные особенности АТР-зависимой Lon-протеиназы из Escherichia coli. Биоорган, химия, 25 (12), 883-891 (1999).

2. Старкова Н.Н., Королева Е.П., Ротанова Т. В. Внутриклеточный протеолиз. Сигналы селективной деградации белков. Биоорган, химия, 26 (2), 83-97 (2000).

3. Ротанова Т.В. Энергозависимый селективный внутриклеточный протеолиз. Строение, активные центры и специфичность АТР-зависимых протеиназ. Вопросы мед. химии, 47(1), 3-19(2001).

4. Rotanova T.V.. Starkova N.N. ATP-dependent protease Lon from Escherichia coli. Structure, active site, coupling of proteolysis to ATP hydrolysis. In: Protein Structures. Kaleidoscope of Structural Properties and Functions (Ed. Uversky V.N.), Research Signpost, 2003. P. 579-592.

Статьи:

5. Америк А.Ю., Антонов В.К, Остроумова П.И., Ротанова Т.В.. Чистякова Л.Г. Клонирование, структура и экспрессия полноразмерного гена lon Escherichia coli, кодирующего АТР-зависимую Ьа-протеиназу. Биоорган, химия, 16 (7), 869-880 (1990).

6. Amerik А.Уи.у Antonov V.K., Gorbalenya А.Е., Rotanova Т. V.. Kotova S.A., Shimbarevich E. V. Site-directed mutagenesis of La protease. A catalytically active serine residue. FEBS Lett., 287, 211-214 (1991).

7. Ротанова Т.В., Котова С.А., Америк А.Ю., Лыков И.П., Гинодман Л.М., Антонов В.К АТР-зависимая протеиназа La из Escherichia coli. Биоорган, химия, 20 (2), 114-125(1994).

8. Starkova N.N., Koroleva Е.Р., Rumsh L.D., Ginodman L.M., Rotanova T.V. Mutations in proteolytic domain of Escherichia coli protease Lon impair the ATPase activity of the enzyme. FEBS Lett., 422, 218-220 (1998).

9. Rasulova F.S., Dergousova N.I., Starkova N.N., Melnikov E.E., Rumsh L.D., Ginodman L.M., Rotanova Т. V. The isolated proteolytic domain of Escherichia coli ATP-dependent protease Lon exhibits the peptidase activity. FEBS Lett., 432, 179-181 (1998).

10. Мельников Э.Э., Цирульников КБ., Гинодман Л.М., Ротанова Т.В. Сопряжение гидролиза АТР и протеолиза при функционировании in vitro мутантных по АТР-азному центру форм Lon-протеиназы Е. coli. Биоорган, химия, 24 (4), 293-299 (1998).

М.Расулова Ф.С., Дергоусова Н.И., Мельников Э.Э., Гинодман Л.М., Ротанова Т.В. Получение и исследование модифицированных в области N-концевого домена форм АТР-зависимой Lon-протеиназы из Escherichia coli. Биоорган, химия, 24 (5), 370-375 (1998).

12. Мельников Э.Э., Цирульников КБ., Расулова Ф.С., Гинодман Л.М., Ротанова Т.В. Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl — новый субстрат для исследования функционирования АТР-зависимой Lon-протеиназы Е. coli и ее модифицированных форм. Биоорган, химия, 24(8), 638-640(1998).

13. Овчинникова Т.В., Мартынова Н.Ю., Потапенко Н.А., Васильева О.В., Голикова Н.Ю., Гинодман Л.М., Ротанова Т.В. Изучение бактериальных белков теплового шока: ограниченный протеолиз АТР-зависимой Lon-протеиназы Е. coli. Биомед. технологии, (труды ВИЛ АР), вып. 8, 62-65, (1998).

14. Манухов И.В., Ерошников Г.Е., Завильгельский Г.Б., Гинодман Л.М., Мельников Э.Э., Старкова ll.ll., Ротанова Т.В., Цирульников КБ. Тест-система на основе Lux-

регулона Vibrio fischeri при исследовании функциональной активности мутантных форм Lon-протеиназы Escherichia coli. Биоорган, химия, 25 (5), 371-374 (1999).

15. Завильгельский Г.Б., Ерошников Г.Е., Манухов И.В., Расулова Ф.С., Гинодман JI.M., Мельников Э.Э., Старкова Н.Н., Ротанова Т.В. Анализ in vivo протеолитической активности и эффектов «секвестрирования» и негативного доминирования Lon-мутантов Escherichia coli с помощью /мх-регулона Vibrio fischeri. Молекулярн. биология, 33 (5), 797-802 (1999).

16. Мельников Э.Э., Цирульников КБ., Ротанова Т.В. Сопряжение протеолиза и гидролиза АТР при функционировании Ьоп-протеиназы Escherichia coli. I. Кинетические аспекты гидролиза АТР. Биоорган, химия, 26 (7), 546-554 (2000).

17. Мельников Э.Э., Цирульников КБ., Ротанова Т.В. Сопряжение протеолиза и гидролиза АТР при функционировании Ьоп-протеиназы Escherichia coli. И. Гидролиз АТР и активность пептидгидролазных центров фермента Биоорган, химия, 27 (2), 124-133 (2001).

18. Ротанова Т.В. Пептидгидролазы с каталитической диадой Ser-Lys. Сходство и различия активных центров АТР-зависимых Ьоп-протеиназ, репрессоров ЬехА, сигнальных пептидаз и протеиназ С-концевого процессинга. Вопр. мед. химии, 48 (6), 541-552(2002).

19. Ротанова Т.В., Цирульников КБ., Мельников Э.Э. Каталитическая диада Ser - Lys в активном центре АТР-зависимой Ьоп-протеиназы Escherichia coli. Биоорган, химия, 29(1), 97-99 (2003).

20. Цирульников КБ., Мельников Э.Э., Ротанова Т.В. Протеолиз, сопряженный с гидролизом АТР. Регуляция активности протеолитических центров Ьоп-протеиназы Escherichia coli. Биоорган, химия, 29 (5), 486-494 (2003).

21. Botos /., Melnikov Е.Е., Cherry S., Tropea J., Khalatova A.G., Rasulova F.S., Dauter_Z., Maurizi M.R., Rotanova T.V., Wlodawer A., Gustchina A. The catalytic domain of E. coli Lon protease has a unique fold and a Ser — Lys dyad in the active site. J. Biol. Chem., 279 (9), 8140-8148 (2004).

22. Botos I., Melnikov E.E., Cherry S., Khalatova A.G., Rasulova F.S., Tropea J., Maurizi M.R., Rotanova Т. V. Gustchina A., Wlodawer A. Crystal structure of the AAA+ a domain of E. coli Lon protease at 1.9 A resolution. J. Struct. Biol., 146 (1-2), 113-122 (2004).

23. Rotanova T.V.. Melnikov E.E., Khalatova A.G., Makhovskaya O.V., Botos I., Wlodawer A., Gustchina A. Classification of ATP-dependent proteases Lon and comparison of the active sites of their proteolytic domains. Eur. J. Biochem., 271 (23-24), 4865-4871 (2004).

24. Ротанова Т.В.. Абрамова Е.Б., Шарова Н.П. От парадокса - к Нобелевской премии. Биология, мембраны, 22 (2), 151-156 (2005).

25. Маховская О.В., Мельников Э.Э., Ротанова Т.В. Структурная организация и функционирование in vitro АТР-зависимой LonB-протеиназы из Archaeoglobus fulgidus. В сборнике: «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов». Петрозаводск, 2005. С. 131-138.

26. Botos /., Melnikov Е.Е., Cherry S., Kozlov S., Makhovskaya О. V., Tropea J., Gustchina A., Rotanova Т. V, Wlodawer A. Atomic-resolution crystal structure of the proteolytic domain of Archaeoglobus fulgidus Lon reveals the conformational variability in the active sites of Lon proteases. J. Mol. Biol., 351(1), 144-157 (2005).

27. Li M., Rasulova F., Melnikov E.E., Rotanova Т. V. Gustchina A., Maurizi M.R., Wlodawer A. Crystal structure of the N-terminal domain of E. coli Lon protease. Protein Sci., 14(11), 2895-2900 (2005).

Тезисы докладов:

28. Ротанова Т.В.. Михайлов А.П., Чистякова Л.Г., Игнатов К.Б., Антонов В.К. АТР-Зависимая протеиназа и кодирующий ее ген в Pseudomonas putida Всесоюз. симп. "Химия белков", 1990, Тбилиси. Тез. Докл., С. 14.

29. Roianova T.V.. Mikhaylov А.P., Chistyakova L.G., Antonov V.K. ATP-Dependcnt proteinase and its coding gene in Pseudonnnas putida 20 FEBS Meeting Abstr., 1990, Budapest. NP-Tu 456, P. 198.

30 .Roianova Т. V., Chistyakova L.G., Mikhaylov A.P., Amerik A.Yu., Kotova S.A., Shimbarevich E.V., Antonov VK. ATP-dependent proteinases of microorganisms. Structure and application. IUPAC-NOST Int. Symp. Enzymes in Org. Synth., 1992, Dehli, India Abstr.

31. Amerik A.Yu., Lykov I.P., Gorbalertya A.E., Kotova S.A., Roianova T.V., Antonov V.K. Investigation of the E.coli ATP-dependent La protease by site directed mutagenesis. II Russian-Israel Symp. Pept. Prot., 1992, Moscow. Abstr., P. 28.

32. Ротанова T.B., Котова C.A., Америк А.Ю., Лыков И.П., Гинодман Л.М., Антонов В.К. АТР-зависимая протеиназа La из Escherichia coli. III Симп. "Химия протеол. ферм.", 1993, Москва. Тез. докл. и стенд, сообщ., С. 10.

33. Михайлов А.П., Ротанова Т.В., Гинодман Л.М., Антонов В.К. АТР-зависимая протеиназа из Pseudomonas putida III Симп. "Химия протеол. ферм.", 1993, Москва. Тез. докл. и стенд сообщ., С. 59.

34. Roianova Т. V. Dergousova N.I., Starkova N.N., Melnikov Е.Е., Ginodman L.M., Rumsh L.D. Does the catalytic site of ATP-regulated serine protease Lon represent the "classic" triad? 3rd Int. Symp. Bioorg. Chem., 1995. Dagomys, Russia. Abstr. P. 105.

35. Америк А.Ю., Лыков И.П., Дергоусова Н.И., Старкова H.H., Ротанова Т.В.. Гинодман Л.М. Модификация АТР-зависимой Lon-протеиназы методом направленного мутагенеза. II Всерос. пл.-отч. конф. по напр. «Белковая инженерия», 1994, Москва. Тез. докл., С. 59 (1995).

36. Расулова Ф.С., Дергоусова H.H., Гинодман Л.М., Ротанова Т.В. АТР-регулируемый протеолиз. Клонирование и экспрессия доменов Lon-протеиназы Е. coli. Межд. конф. памяти акад A.A. Баева, 19%, Москва Тез. докл., С. 98.

37. Старкова H.H., Мельников Э.Э., Дергоусова H.H., Гинодман Л.М., Ротанова Т.В. АТР-регулируемый протеолиз. Идентификация каталитических остатков Lon-протеиназы Е. coli и функциональное разобщение доменов методом направленного мутагенеза. Межд. конф. памяти акад. A.A. Баева, 1996, Москва. Тез. докл., С. 102.

38.Ротанова Т.В. АТР-регулируемая Lon-протеиназа из Е. coli. IV Симп. "Химия протеол. ферм.", 1997, Москва. Тез. докл. и стенд, сообщ., С. 8.

39. Старкова H.H., Королева Е.П., Гинодман Л.М., Ротанова Т.В. Сопряжение гидролиза АТР и протеолиза при функционировании Lon-протенназы Е. coli. Исследование протеолитического центра фермента методом сайт-направленного мутагенеза. IV Симп. "Химия протеол. ферм.", 1997, Москва. Тез. докл. и стенд, сообщ., С. 64.

40. Мельников Э.Э., Цирульников КБ., Гинодман Л.М., Ротанова Т.В. Сопряжение гидролиза АТР и протеолиза при функционировании Lon-протеиназы Е. coli. Исследование АТРазного центра фермента методом сайт-направленного мутагенеза. IV Симп. "Химия протеол. ферм.", 1997, Москва. Тез докл. и стенд, сообщ., С. 65.

41. Расулова Ф.С., Дергоусова H.H., Гинодман Л.М., Ротанова ТВ. Исследование роли N-концевого домена в функционировании АТР-регулируемой Lon-протеиназы Е. coli. IV Симп. "Химия протеол. ферм.", 1997, Москва. Тез. докл. и стенд, сообщ., С. 66.

42. Овчинникова Т.В., Мартынова Н.Ю., Потапенко Н.А., Леонова Ю.Ф., Эссел Э.К., Гинодман J1.M., Ротанова Т. В. Ограниченный протеолиз АТР-регулируемой Lon-протеиназы Е. coli. IV Симп. "Химия протеол. ферм.", 1997, Москва. Тез. докл. и стенд, сообщ., С. 67.

43. Ротанова Т.В. АТР-зависимая Lon-протеиназа Escherichia coli. Второй съезд Биохим. общ-ва РАН, 1997, Москва. Тез. симп. докл., С. 6.

44. Мельников Э.Э., Цирульников КБ., Ротанова Т.В. Исследование АТРазного центра Lon-протеиназы Е. coli методом сайт-направленного мутагенеза Второй съезд Биохим. общ-ва РАН, 1997, Москва. Тез стенд, сообщ. Ч. 1, С. 49-50.

45. Расулова Ф.С., Дергоусова Н.И., Ротанова Т.В. Получение и исследование фрагмента Ьоп-протеиназы Е. coli, включающего АТР-азный и протеолитический домены фермента. Второй съезд Биохим. общ-ва РАН, 1997, Москва. Тез. стенд, сообщ. Ч. 1, С. 58-59.

46. Старкова Н.Н., Королева Е.П., Ротанова Т.В. Исследование протеолитического центра Ьоп-протеиназы Е. coli методом сайт-направленного мутагенеза. Второй съезд Биохим. общ-ва РАН, 1997, Москва. Тез. стенд, сообщ. Ч. 1. С. 69-70.

47. Rotanova Т.. Starkova N., Melnikov Е., Rasulova F., Koroleva E., Tsirulnikov K., Ginodmcm L. Escherichia coli protease Lon: Role of domains in catalytic activity. VIII Eur. Congr. Biotech., 1997, Budapest Abstr., P. 145.

48. Ротанова Т.В. ATP-регулируемый протеолиз как фактор пост-стрессовой реабилитации. Межд. конфер. «Нов. информац. технол. в мед. и экологии», 1997, Гурзуф. Тез. докл., С. 39-40.

49. Starkova N.. Melnikov Е., Rasulova F., Ginodman L., Rotanova T. Escherichia coli protease Lon: Role of domains in enzyme functioning. 17th Int. Congr. Biochem. Mol. Biol., San Francisco. FASEB J., 11, 861 (1997).

50. Starkova N.N., Rasulova F.S., MelnikovE.E., TsirulnikovK.B., Ginodmcm L.M., Rotanova Т. V. Interactions between proteolytic and ATPase domains in E. coli protease Lon. Int. Conf "Biocatalysis-98: Fund and Appl", 1998,Pushchino, Russia. Abstr., P. 4.

51. Ротанова Т.В. Междоменные взаимодействия при функционировании АТР-зависимой Lon-протеиназы Е. coli. XVI Менделеев, съезд по общей и приют, химии, 1998, Санкт-Петербург. Реф. докл. и сообщ., № 4 «Химия живого», С. 135.

52. Мельников Э.Э., Расулова Ф.С., Старкова Н.Н., Цирульников КБ., Гинодман Л.М., Ротанова ТВ. Сопряжение АТР-азной и протеолитической активностей у мутантных и укороченных форм Lon-протеиназы Е. coli. XVI Менделеев, съезд по общей и прикл. химии, 1998, Санкт-Петербург. Реф. докл. и сообщ., № 4 «Химия живого», С. 101.

53. Мельников Э.Э., Цирульников КБ., Старкова Н.Н., Гинодман Л.М., Ротанова ТВ. Закономерности функционирования АТР-зависимой Lon-протеиназы Е. coli и ее мутантных форм. IV чтения, поев, памяти акад. Ю.А.Овчинникова, 1998, Москва-Пущино. Тез. докл., С. 13.

54. Расулова Ф.С., Гинодман Л.М., Ротанова Т.В.. Васильева О.В., Мартынова Н.Ю., Овчинникова Т.В. Получение и исследование свойств протеолитического домена АТР-регулируемой Ьоп-протеиназы Е. coli. IV чтения, поев, памяти акад. Ю.А.Овчинникова, 1998, Москва-Пущино. Тез. докл., С. 14.

55. OvchimikovaT.V., VasifyevaO.V., Potapenko N.A., Rasulova F.S., Rotanova Т. V. Studies of a proteolytic domain of the E.coli ATP-dependent protease Lon produced by limited proteolysis and molecular cloning techniques. Third Eur. Symp. Prot. Chem. Germany. Protein Science, 8, SuppL 2, 1 242 (1999).

56. Цирульников КБ., Мельников Э.Э., Ротонова Т.В. Субстраты АТР-зависимон Lon-протеиназы Escherichia coli и регуляция функциональной активности фермента. Школа-конф. «Горизонты физ.-хим. биологии», 2000, Пущино. Тез. стенд, сообщ., С. 108.

57. Ротанова ТВ. Энергозависимый селективный внутриклеточный протеолиз. Материалы конф. «Структура и функция протеол. ферментов», поев, памяти акад. В.Н. Ореховича, Москва. Вопр. мед. химии, 46 (5), 479 (2000).

58. Цирульников КБ., Мельников Э.Э., Гинодман Л.М., Ротанова Т.В. Сопряжение протеолиза и гидролиза АТР при функционировании Ьоп-протеиназы Е. coli. Материалы конф. «Структура и функция протеол. ферментов», поев, памяти акад. В.Н. Ореховича, Москва. Вопр. мед. химии, 46 (5), 479-480 (2000).

59. Цирульников КБ., Мельников Э.Э., Гинодман Л.М., Ротанова Т.В. Ьоп-протеиназа Escherichia coli: олигомерное состояние и сопряжение протеолиза с гидролизом ATP. V чтения, поев, памяти акад. Ю.А.Овчинникова, 2000, Москва-Пущино. Тез. докл., С. 34.

60. Ротанова Т.В.. Гинодман Л.М., Мельников Э.Э., Цирульников КБ. Протеолиз, сопряженный с гидролизом АТР. Протеолитическин центр Ьоп-протеиназы Е. coli и пути его аллостерической регуляции. V Симп. "Химия протеол. ферм.", 2002, Москва. Тез. докл. и стенд, сообщ., С. 21.

61. Цирульников КБ., Маховская О.В., Мельников Э.Э., Морозкин А.Д., Ротанова Т.В. АТР-зависимая Lon-протеиназа Escherichia coli. Олигомерное состояние и функциональная активность фермента и его мутантных форм. V Симп. "Химия протеол. ферм.", 2002, Москва. Тез. докл. и стенд, сообщ., С. 67.

62. Мельников Э.Э., Халатова А.Г., Серова О.В., Цирульников КБ., Ротанова Т.В. Сравнительное исследование функциональной активности АТР-зависимой Ьоп-протеиназы Escherichia coli и ее фрагментов, полученных ограниченным протеолизом. V Симп. "Химия протеол. ферм.", 2002, Москва. Тез. докл. и стенд, сообщ., С. 68.

63. Ротанова Т.В. Селективный внутриклеточный АТР-зависимый протеолиз и его биологическая функция. Всерос. конф. «Проблемы мед. энзимологии», 2002, Москва. Тез. докл. и стенд, сообщ. Вопр. мед. химии, 48 (4), 404 (2002).

64. Rotanova Т. V. Coupling of proteolysis to ATP hydrolysis. Structural and functional study of E. coli Lon protease. Int. conf. "Biocatalysis-2002: Fundamentals and Applications",

2002. Moscow. Abstr., P.27.

65. Ротанова Т.В. Протеолиз, сопряженный с гидролизом АТР. Ьоп-протеиназа Escherichia coli. Ill Съезд Биохим. общ-ва России, 2002, Санкт-Петербург. Тез. науч. докл., С. 603.

66. Botos I., Melnikov Е.Е., Cherry S., Khalatova A.G., Rasulova F.S., Tropea J., Maurizi MR., Rotanova Т. V., Gustchina A., Wlodawer A. Crystal structure of the SSD domain of E. coli Lon protease at 1.9 A resolution. 5th Inter. Conf. on AAA Proteins, 2003, Warrenton, DC, USA Abstr., A-69.

67. Botos /., Melnikov E.E., Cherry S., Khalatova A G., Rasulova.F.S., Tropea J., Maurizi M.R., Rotanova Т. V., Gustchina A., Wlodawer A. Crystal structure of the SSD domain of E. coli Lon protease at 1.9 A resolution. The 21st European Crystallographic Meeting,

2003, Durban, South Africa. Abstr., fl.m8.pl 0.

68. Ротанова Т.В. Селективный АТФ-зависимый протеолиз и его роль при различных патологических состояниях. 3-я Науч. конф. и школа-семинар для молодых ученых «Белки-маркеры патологических состояний», 2003, Астрахань. Материалы, С. 21-27.

69.Botosl., Melnikov E.E., Cherry S., Tropea J., Khalatova A.G., Rasulova F.S., Dauter Z, Maurizi M.R., Rot an ova Т. V.. Wlodawer A., Gustchina A. Slicing a protease: crystallographic investigations of individual domains of the E. coli ATP-dependent protease Lon reveals a novel fold. 3rd General Meeting of the Int. Proteolysis Soc., 2003, Nagoya, Japan. Abstr. PI8-15, p. 340.

70. Маковская O.B., Халатова А.Г., Мельников Э.Э., Ротанова ТВ. Структурная организация и функционирование in vitro АТР-зависимой ЬопВ-протеиназы из Archaeoglobus fulgidus. Межд. конф. «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов», 2004, Петрозаводск. Материалы, С. 88-89.

71. Халатова А.Г., Мельников Э.Э., Ротанова Т.В. Структурно-функциональное исследование изолированных доменов АТР-зависимой Ьоп-протеиназы Escherichia coli, полученных методом ограниченного протеолиза химотрипсином. Межд. конф. по физ.-хим. биологии, поев. 70-летию со дня рождения акад. Ю.А.Овчинникова (VII чтения), 2004, Москва. Тез. докл. и стенд, сообщ., С. 74.

72. Маковская О.В., Мельников Э.Э., Ротанова Т.В. Исследование АТР-зависимой ЬопВ-протеиназы из Archaeoglobus fulgidus. Межд. конф. по физ.-хим. биологии, поев. 70-летию со дня рождения акад. Ю.А.Овчинникова (VII чтения), 2004, Москва. Тез. докл. и стенд сообщ., С. 75.

73. Botos /., Ziolkowska N.. Melnikov Е.Е., Cherry S., Kozlov S„ Khalatova A.G., Makhovskaya O.V., Tropea J., Gustchina A., Maurizi M.R., Rota nova Т. V., Wlodawer A. Conservation of the overall fold and variability of the active sites of isolated proteolytic domains of Lon proteases. 6th Int. Conf. on AAA Proteins, 2005, Schloss Seggau, Austria. Abstracts. P. 65.

74. Khalatova A.G., Melnikov E.E., Rotanova Т. V. The role of the individual domains of the Escherichia coli ATP-dependent protease LonA in oligomerization and function. 6th Int. Conf on AAA Proteins, 2005, Schloss Seggau, Austria. Abstracts. P. 104.

75. Makhovskaya О. V., Melnikov E.E., Botos I., Kozlov S., Gustchina A., Wlodawer A., Rotanova Т. V. Archaeoglobus fulgidus LonB protease: conformational variability of the active site and biochemical studies of the wild type enzyme and its several mutants. 6th Int. Conf. on AAA Proteins, 2005, Schloss Seggau, Austria. Abstracts. P. 105.

76. Ziolkowska N.. Botos I., Melnikov E.E., Gustchina A., Rasulova F., Maurizi M.R., Rotanova T.V.. Wlodawer A. Comparisons of the structures of isolated proteolytic domains of Lon proteases. 4th General Meeting of the Int. Proteolysis Society, 2005, Quebec City, Canada. Abstr. РП1 59 p. 296.

Сокращения:

a.o. — аминокислотный остаток;

ADP — аденозин 5'-дифосфат,

ADP-Mg - комплекс ADP-Mg';

AMP-CPP - аденозин 5 '-(а,р-метилен)-трифосфат;

AMP-CPP-Mg - комплекс AMP-CPP-Mg2";

ATP - аденозин 5'-трифосфат;

ATP-Mg - комплекс ATP-Mg2";

BNPS-скатол - 2-(2'-нитрофенилсульфенил)-3-метил-3'-броминдоленин;

Lon-w.t. — нативная Lon-протеиназа;

SBzl — тиобензиловый эфир;

Sue — сукцинил;

РерТВЕ — Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl;

о.е. — единица оптического поглощения.

к исполнению 17/03/2006 Исполнено 20/03/2006

Заказ № 168 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru

ВВЕДЕНИЕ

РАЗДЕЛ 1. ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ

СЕЛЕКТИВНОЙ ДЕГРАДАЦИИ БЕЛКОВ (Обзор литературы)

Введение

Глава 1. ААА+-белки

1.1. Строение и классификация ААА+-белков

1.2. ААА+-АТР-азы и контроль качества внутриклеточных белков

1.2.1. Шапероновые системы бактерий

1.2.2. Широкая специфичность и высокая селективность AAA'-АТР-аз

1.2.3. Адапторные белки

Глава 2. Протеолитические системы, осуществляющие селективную деградацию внутриклеточных белков

2.1. А TP-зависимая деградация белков у эубактерий 2.2. А TP-зависимая деградация белков у эукариот

2.3. АТР-зависимая деградация белков в архебактериях

2.4. Общие характеристики функционирования энергозависимых протеиназ и протеолитических комплексов

2.4.1. Общий моторный модуль AAA -протеиназ

2.4.2. Связь между АТР-азными и пептидазными составляющими

ААА+-протеиназ

2.4.3. Общая стратегия узнавания мишеней А TP-зависимыми протеиназами

2.4.4. Катализ процесса механического разворачивания белков ААА+-АТР-азами

2.4.5. Энергетическая цена селективного протеолиза

2.4.6. Энергозависимое разрушение стабильных белковых комплексов

Селективный протеолиз - важнейший механизм поддержания внутриклеточного гомеостаза - осуществляется энергозависимыми протеиназами, относящимися к выявленному в 1990-х г.г. и интенсивно изучаемому суперсемейству ААА+-белков (ЛТР-аз, ассоциированных с различными клеточными активностями). Выполняя функции регуляции клеточного метаболизма и контроля качества внутриклеточных белков, ААА+-протеиназы обеспечивают быстрый обмен короткоживущих регуляторных белков и удаляют мутантные, поврежденные или денатурированные белки и. тем самым, играют ключевую роль в таких жизненно важных процессах, как деление и дифференциация клеток, ответ на действие стрессогенных факторов и др. В прокариотах ААА+-протеиназы представлены пятью семействами (Lon, FtsH, ClpAP, ClpXP, HslUV), в эукариотах селективный протеолиз осуществляется мультикаталитическими комплексами - 265-протеасомами, регуляторные составляющие которых содержат АТР-азы АААт-типа.

Уникальными свойствами ААА+-протеиназ, отличающими их от классических протеолитических ферментов служат: (1) высокая селективность при отборе мишеней из общего пула внутриклеточных белков, большая часть которых не должна повреждаться; (2) сопряжение протеолитической активности с гидролизом АТР; (3) процессивиый механизм деградации белков (с образованием 10-15-членных пептидов) при отсутствии выраженной специфичности по отношению к аминокислотам, образующим расщепляемые связи; (4) мулътисубъединичная (гомо- или гетеролигомерная) организация.

Lon (или Ьа)-протеиназа Escherichia coli, обнаруженная в 1970-х годах, явилась исторически первой АТР-зависимой протеиназой, и долгое время служила модельным ферментом для исследования АТР-зависимого протеолиза. Гомоолигомерная Ьоп-протеиназа - редкий представитель ААА+-белков, АТР-азный и функциональный компоненты которых объединены в единой полипептидной цепи. Это обстоятельство значительно осложнило исследование энзиматических свойств и структуры фермента. К настоящему времени больший прогресс достигнут в изучении гетероолигомерных ClpAP, ClpXP и HslUV протеиназ, АТРазные и протеолитические компоненты которых представляют отдельные субъединицы. Вместе с тем основные проблемы АТР-зависимого протеолиза - механизм высокой селективности ферментов, роль гидролиза АТР в протеолизе и механизм сопряжения гидролиза АТР и процессивного протеолиза - пока остаются не до конца выясненными.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось структурно-функциональное исследование семейства АТР-зависимых Ьоп-протеиназ с использованием в качестве модельного фермента Ьоп-протеиназы из Е. coli (далее - Ьоп-протеиназа или £cLon). Для достижения поставленной цели потребовалось решить следующие задачи:

1. Идентифицировать каталитические остатки протеолитического центра Ьоп-протеиназ и выявить клановую и групповую принадлежность семейства Lon (в классификации пептидгидролаз MEROPS).

2. Охарактеризовать доменную организацию Ьоп-протеиназ, изучить междоменные взаимодействия в £cLon и исследовать свойства изолированных доменов фермента и их комбинаций.

3. Изучить функционирование АТР-азных и протеолитических центров £cLon, исследовать их взаимовлияние и выявить факторы, определяющие процессивный характер механизма функционирования фермента.

4. Определить пространственную структуру £cLon и/или изолированных доменов фермента.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые установлено, что в протеолитических центрах Ьоп-протеиназ функционирует каталитическая диада Ser-Lys. Выявлена уникальность семейства Lon среди серин-лизиновых пептидгидролаз. Обнаружено, что семейство Ьоп-протеиназ представлено двумя подсемействами (А и В), различающимися окружением каталитических остатков протеолитического центра, структурной организацией АТР-азного домена и общей архитектурой молекулы.

Установлена доменная организация ферментов семейства Ьоп-протеиназ. подтвержденная получением изолированных N-концевого (N-), АТР-азного (А-), а-спирализованного (а-) и протеолитического (Р-) доменов, а также АР-фрагмента EcLon с помощью ограниченного протеолиза. В ходе исследования междоменных взаимодействий показано, что изолированные А- и Р- домены фермента, содержащие соответствующие каталитические центры, существуют в растворе как мономеры; Р-домен является низкоэффективной пептидазой, не способной гидролизовать белковый субстрат ни в индивидуальном состоянии, ни в сочетании с А-доменом (АР-фрагмент, тетрамер), протеолитическая активность присуща только полноразмерному ферменту; изолированный А-домен не гидролизует АТР, но проявляет АТРгазную активность в составе полноразмерной Ьоп-протеиназы или ее АР-фрагмента; N-домен, мономерный в индивидуальном состоянии, имеет важное значение как для олигомеризации Ьоп-протеиназы, так и для проявления ферментом функциональной активности. Выдвинута гипотеза о роли N-домена как интегрированного адапторного белка Ьоп-протеиназы.

Проведено первое систематическое исследование функционирования АТР-азных и протеолитических центров £cLon. Выявлено отсутствие прямой корреляции между АТР-азной и пептидазной активностями. Показано, что необходимыми факторами реализации процессивного протеолиза служат гидролиз АТР и олигомерность фермента. Обнаружен дополнительный центр связывания белкового субстрата, расположенный в области, включающей N-домен и АААт-модуль.

С помощью сайт-направленного мутагенеза выявлен ряд функционально значимых остатков Ьоп-протеиназ, локализованных в АТР-азном и протеолитическом доменах. Установлено, что функциональная активность мутантных форм £cLon. определенная in vitro. коррелирует с активностью тех же форм in vivo. Методом комплементации мутаций показано существование в нативном ферменте двух путей передачи сигнала от АТР-азных центров к протеолитическим - внутри- и межсубъединичного.

Впервые определена кристаллическая структура протеолитического и а-спирализованного доменов £cLon. Показано, что в то время как структура а-домена соответствует общей топологии а-доменов ААА+-белков, Р-домен фермента имеет уникальную тип пространственной структуры. Полученные результаты послужили основанием для выделения Ьоп-протеиназ в самостоятельное структурное семейство, представляющее индивидуальный клан SJ в классификации пептидгидролаз MEROPS.

Результаты работы внесли вклад в расширение представлений о строении и механизме действия Ьоп-протеиназ как внутриклеточных «машин селективной деструкции белков» и могут способствовать углубленному пониманию общих закономерностей функционирования АТР-зависимых протеолитических ферментов.

выводы

1. Проведено структурно-функциональное изучение АТР-зависимых Ьоп-протеиназ с использованием в качестве модельного фермента Ьоп-протеиназы из Escherichia coli (£cLon). Сопоставлением первичных структур ферментов семейства Lon выявлена их доменная организация, подтвержденная получением индивидуальных N-концевого, АТР-азного, а-спирализованного и протеолитического доменов £cLon с помощью ограниченного протеолиза.

2. Анализом аминокислотных последовательностей ферментов семейства Lon и сайт-направленным мутагенезом EcLon установлено, что в протеолитических центрах Lon-прртеиназ функционирует каталитическая диада Ser-Lys. Выявлена уникальность семейства Lon среди серин-лизиновых пептидгидролаз.

3. Установлено, что семейство Lon-протеиназ состоит из двух подсемейств (LonA и LonB), различающихся окружением каталитических остатков протеолитического центра, структурной организацией АТР-азного домена и общей архитектурой молекулы (наличие N-концевого домена у LonA-протеиназ и вставочного трансмембранного домена в ААА+-модуле LonB-протеиназ).

4. Изучены особенности функционирования АТР-азных и протеолитических центров EcLon. Установлено, что необходимыми факторами реализации процессивного протеолиза являются гидролиз АТР и олигомерность фермента. Выявлено отсутствие прямой корреляции между АТР-азной и пептидазной активностями. Обнаружен дополнительный центр связывания белкового субстрата, расположенный в области, включающей N-концевой и АТР-азный домены.

5. Для идентификации функционально значимых остатков Lon-протеиназы получено и охарактеризовано 17 точечных мутантов фермента с заменами в АТР-азном и протеолитическом доменах. Установлено, что функциональная активность мутантных форм Lon-протеиназы, определенная in vitro, коррелирует с активностью тех же форм in vivo (биолюминесцентный Lux-тест).

6. Охарактеризован уникальный мутант Lon-K362Q с заменой в Р-петле ААА+-модуля, взаимодействие которого с комплексом ADP-Mg - ингибитором нативной Lon-протеиназы - вызывает активацию пептидазного центра. Показано, что свойства Lon-K362Q обусловлены нарушением межсубъединичных взаимодействий, характерных для нативного фермента. Комплементацией мутаций (Lon-K362Q и Lon-S679A) показано существование в нативной Ьоп-протеиназе двух путей передачи сигнала от АТР-азных центров к протеолитическим - внутри-и межсубъединичного.

7. Для исследования междоменных взаимодействий получены и охарактеризованы укороченные формы Ьоп-протеиназы, представляющие индивидуальные домены фермента и их комбинации. При этом установлено, что

- изолированные протеолитический и АТР-азный домены фермента существуют в растворе, соответственно, в форме мономеров (в отличие от каталитических субъединиц гетероолигомерных АТР-зависимых протеиназ, образующих циклические гекса- или гептамеры);

- протеолитический домен проявляет исключительно пептидазную активность как в изолированном состоянии, так и в сочетании с АТР-азным доменом (АР-фрагмент); только в составе полноразмерного фермента Р-домен приобретает способность к гидролизу белкового субстрата;

- АТР-азный домен не обладает ферментативной активностью, но способен гидролизовать АТР в составе как полноразмерной Ьоп-протеиназы, так и ее АР-фрагмента;

- N-домен важен для олигомеризации Ьоп-протеиназы и имеет ключевое значение для проявления ферментом протеолитической активности. Выдвинута гипотеза о роли N-домена как интегрированного адапторного белка Ьоп-протеиназы.

8. Впервые определена кристаллическая структура протеолитического и а-спирализованного доменов, полученных ограниченным протеолизом Ьоп-протеиназы Е. coli. Подтверждено наличие каталитической диады Ser-Lys и выявлен ряд остатков, участвующих в формировании активного центра фермента. Показано, что структура а-домена соответствует общей топологии а-доменов ААА+-белков.

9. Установлено, что протеолитический домен Lon-протеиназы Е. coli имеет уникальный тип пространственной структуры, что позволило выделить Lon-протеиназы в самостоятельное структурное семейство, представляющее индивидуальный клан SJ в классификации пептидгидролаз MEROPS.

Автор считает своим долгом выразить глубокую признательность своему научному руководителю чл.-корр. РАН, профессору Владимиру Констатиновичу Антонову (19271992), инициировавшему исследования в области АТР-зависимого протеолиза в лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ РАН.

Автор приносит искреннюю благодарность своим коллегам - А.Ю.Америку, Л.Г.Чистяковой и Н.И.Дергоусовой, в совместной работе с которыми начиналось изучение Ьоп-протеиназы из Escherichia coli.

Автор выражает глубокую благодарность С.А.Котовой, М.Н.Сизой, Н.Н.Старковой, Ф.С.Расуловой, Э.Э.Мельникову, К.Б.Цирульникову, О.В.Маховской, А.Г.Халатовой, А.А.Степнову - сотрудникам и аспирантам, изучение которыми различных аспектов АТР-зависимого протеолиза способствовало накоплению фактического материала, лежащего в основе данной работы.

Особую благодарность автор приносит д.х.н. Л.М.Гинодману за активное участие в обсуждении направлений исследования, полезные дискуссии, ценные практические рекомендации и критические замечания.

Искренняя благодарность всем сотрудникам лаборатории химии протеолитических ферментов и особенно - заведующему лабораторией, профессору Л.Д.Румшу, за доброжелательный интерес и внимание к работе, полезные советы, безотказную помощь и поддержку.

заключение)

Проведенное в настоящей работе структурно-функциональное исследование АТР-зависимых Ьоп-протеиназ позволило идентифицировать каталитическую диаду Ser-Lys в активных центрах ферментов и при этом выявить уникальность семейства Lon среди серин-лизиновых пептидгидролаз. Внутри семейства Lon-протеиназ обнаружено два подсемейства, различающихся доменной организацией и строением консенсусных фрагментов. На примере Lon-протеиназы из Е. coli исследовано функционирование АТР-азных и протеолитических центров ферментов LonA-подсемейства и изучены межцентровые взаимодействия. Установлено, что необходимыми факторами реализации процессивного протеолиза служат гидролиз АТР и олигомерность Lon-протеиназы. Получены сведения о междоменных взаимодействиях в Lon-протеиназе и охарактеризованы свойства изолированных доменов фермента и некоторых их комбинаций. Определена кристаллическая структура протеолитического и а-спирализованного доменов Lon-протеиназы. Тем самым получена существенная информация о строении и функционировании внутриклеточных АТР-зависимых Lon-протеиназ.

Вместе с тем до последнего времени остаются неисследованными многие аспекты функционирования Ьоп-протеиназ. Например, неясно, как Lon-протеиназы узнают свои белковые мишени, как взаимодействие с АТР влияет на конформационные изменения ферментов и на активность их протеолитических центров, каково олигомерное состояние функциональной формы Lon-протеиназ и конформационное состояние отдельных субъединиц в олигомере фермента и, наконец, какова пространственная структура полноразмерных ферментов. Получение ответов на эти и многие другие вопросы составляет программу дальнейшего изучения Lon-протеиназ.

Обнаружение двух подсемейств в семействе Ьоп-протеиназ предопределяет в качестве одного из основных направлений сравнительное исследование представителей подсемейств ЬопА и LonB с целью получения данных о влиянии выявленных между ними различий на свойства и механизм функционирования ферментов. Работа в этом направлении уже проводится. В частности, проведено выделение LonB-протеиназы из Archaeoglobus fulgidus (Д/LonB) и начато изучение свойств фермента [349]. Ограниченным протеолизом получен протеолитический домен AfLonB и определена его кристаллическая структура, отличающаяся по ряду параметров от структуры соответствующего домена

ЬопА-протеиназы из Е. coli при сохранении общего уникального типа пространственной укладки, описанной в Главе 5 [35°].

Продолжается исследование пространственного строения Ьоп-протеиназы Е. coli. Определена кристаллическая структура 119-членного N-концевого субдомена фермента, представляющая новый уникальный тип белковых структур [351]. Проводятся эксперименты по кристаллизации как полноразмерного фермента, так и его фрагментов, содержащих АТР-азный домен.

Выявленная ключевая роль олигомеризации Ьоп-протеиназы для реализации процессивного протеолиза ставит задачи определения олигомерного состояния LonA- и ЬопВ-ферментов на разных стадиях их функционирования, а также выявления роли отдельных доменов в поддержании олигомерной стр^тстуры. Кроме того, требует определенности предположение о существовании Ьоп-протеиназы в виде динамической совокупности ряда форм различной степени олигомерности.

Можно полагать, что дальнейшее продолжение исследования Ьоп-протеиназ послужит основой создания феноменологической схемы функционирования этих ферментов.

РАЗДЕЛ 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. МАТЕРИАЛЫ 3.1.1. Реактивы

В работе были использованы: дрожжевой экстракт, триптон, бакто-агар ("Difco", Англия); агароза ("Bio-Rad", США); трис-(гидроксиметил)-аминометан (Tris), 3-(N-морфолино)-пропансульфоновая кислота (MOPS), Ы-(2-гидроксиэтил)пиперазин-К'-(2-этансульфоновая кислота) (HEPES), этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), додецилсульфат натрия (SDS), (3-меркаптоэтанол, М,М,М',М'-тетраметилэтилендиамин (TEMED), персульфат аммония (PSA), кумасси R-250, дитиотреитол (DTT), глицерин, бычий сывороточный альбумин (BSA), а-казеин, (3-казеин, дефосфорилированный казеин, бромистый этидий, фенилборная кислота (PheB(OH)2), фенилметилсульфонилфторид (PMSF). 4,4'-дитиодипиридин (DTDP), Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl (РерТВЕ), ADP, <х,р-метилен-АТР (АМРСРР), изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид (IPTG) ("Sigma", США); аллил(55.65)-6-[(11)-ацетоксютил]-пенем-3-карбоксилат (ААРС) (Англия); АТР ("Boehringer Mannheim", Германия); 2'-дезоксирибонуклеозид-трифосфаты (dNTPs) ("Reanai", Венгрия); акриламид, метиленбисакриламид ("Bio-Rad", США); ампициллин, нитроцеллюлоза, сцинтиллятор ("Serva", Германия); бромфеноловый синий ("Koch Light", Англия); глицин, глюкоза, трихлоруксусная кислота (ТХУ), трифторуксусная кислота (TFA), гуанидин гидрохлорид, мочевина, ацетат натрия, ацетат цинка дигидрат, молибдат аммония ((NH4)6Mo7024 х 4Н2О), фенол, метанол, этанол, изопропанол, хлороформ, ацетонитрил, диметилсульфоксид (ДМСО), мочевина, дигидрофосфат калия, тригидрат гидрофосфата калия, хлорид магния, хлорид натрия, гидроксид натрия, соляная кислота ("Реахим", Россия), голубой декстран и белковые стандарты для электрофореза ("Pharmacia", Швеция); нитроцеллюлозные мембраны NA-45 ("Schleicher & Schuell", Германия),

В качестве компонентов буферов использовали соли фирмы "Мегк"(Германия) и отечественного производства квалификации "ос.ч." или "х.ч."

Для выделения белков использовали сорбенты: фосфоцеллюлоза Р-11 ("Whatman", Англия); DEAE-Toyopearl, DEAE-Sephacel, Q-сефароза, гепарин-сефароза, Superose-6, Sephacryl S-300, Superdex 75 ("Pharmacia", Швеция), глутатион-агароза ("Sigma", США).

3.1.2. Ферменты

Эндонуклеазы рестрикции - фирм "MBI" (Литва) и "Boehringer Mannheim" (Германия); ДНК-лигаза фага Т4, РНКаза А - фирмы "Boehringer Mannheim" (Германия); фрагмент Кленова ДНК-полимеразы E.coli, Klen-Taq-полимераза, бактериальная щелочная фосфотаза (ВАР), SequenaseTM v.2.0 ("USB", США); лизоцим яичного белка ("Реахим", Россия).

3.1.3. Штаммы Е. coli

АВ 1899 [ F-, recA99, thr-1, leu-6, thi-1, lacYl, galK2, ara-12, xyl-5, mtl-1, proA2, his

4, argE3, str-31, tsx-33, lon-100 ]

HB 101 [ F-, hsdS20 (rb-,mb+), recA13, ara-14, proA2, lacYl, galK2, rpsL20 (Smr), xyl

5, mtl-1, surE44 ]

MH-I [araD139, lacX74, galU, galK, hsr-, hms, strA]

BL21(DE3) [F", ompT, hsdSB (rb", mb"), gal, dcm, lacYl, (DE3)]

Rosetta(DE3)pRARE [F, ompT, hsdSB (V, mb"), gal, dcm, lacYl, (DE3) pLys SRARE2,

Cmr)]

3.2. МЕТОДЫ

3.2.1. Сопоставление аминокислотных последовательностей белков

Первичные структуры Ьоп-протеиназ из различных источников и других ферментов получены из баз данных MEROPS и SwissProt. Сравнение аминокислотных последовательностей проводили с использованием программы MULTIALIGN программного пакета DNASTAR.

Ъ.2.2. Процедуры, использованные при работе с клетками

Клонирование гена lon Е. coli, а также его модифицированных форм, приводящих к образованию мутантных или укороченных форм Ьоп-протеиназы проводили в штаммах Е. coli АВ 1899/pBR/cw и BL 21. Получение компетентных клеток Е. coli АВ 1899 и трансформацию их плазмидной ДНК проводили по стандартным методикам, описанным в руководстве [j52]. Экспрессию гена lon или его модифицированных форм проводили согласно методам, описанным в [270].

3.2.3. Сайт-направленный мутагенез гена lon

Материалом для проведения мутагенеза служила векторная конструкция pBR-lon, полученная в результате клонирования гена lon с собственной регуляторной областью в плазмиде pBR327 [ ]. Аминокислотные замены произведены с учетом частоты ого встречаемости естественных мутаций в белках [ ]. Мутации, приводящие к заменам K362Q, S679A были введены методом геп-дуплексного мутагенеза, описанным в работе [276]. Введение других мутаций было осуществлено при использовании четырехпраймерного метода мутагенеза (SOE, splicing by overlapping extension), основанного на полимеразной цепной реакции (ПЦР) [j21]. Нуклеотидную последовательность полученных мутантов подтверждали секвенированием по методу Sanger.

3.2.4. Выделение и очистка Ьоп-протеиназы, ее мутантных и укороченных форм

Для выделения и очистки Ьоп-протеиназы, ее мутантных, модифицированных и укороченных форм применяли стандартные методы белковой химии с использованием ряда стадий ионообменной, аффинной и эксклюзионной хроматографии [270, Зз4]. На начальных этапах выделения форм фермента, содержащих ААА+-модуль, в качестве необходимой стадии использовали хроматографию на фосфоцеллюлозе Р-11. Содержание белка определяли по методу Бредфорд f55], белковый состав препаратов анализировали с о помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS [ ].,

Для примера ниже приведена методика выделения полноразмерной нативной Ьоп-протеиназы.

Буферные растворы: 50 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA (А); 20 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 5 мМ EDTA (В); 50 мМ К-фосфат, рН 6.8, 10 % (v/v) глицерин, 1 мМ EDTA (С); 300 мМ К-фосфат, рН 6.8, 10 % (v/v) глицерин, 1 мМ EDTA (D); 50 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 10 % (v/v) глицерин, 1 мМ EDTA (Е); 50 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 0.25 М NaCl (F); 50 мМ Tris-HCl, рН 7.3,10 % (v/v) глицерин (G); 20 мМ К-фосфат, рН 8.0, 0.3 М NaCl (Н); 20 мМ К-фосфат, рН 8.0, 1 мМ DTT (I); 20 мМ HEPES. рН 7.0. 1 мМ DTT (J); 20 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 0.15 М NaCl, 1 мМ DTT (К); 50 мМ Tris-HCl, рН 8.0 (L); 20 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 0.15 М NaCl (М); 50 мМ HEPES, рН 7.0~(N).

Получение бесклеточного экстракта

Клетки /о/7-дефицитного штамма BL21, трансформированные плазмидой pBR-lon, выращивали в течение ночи при 37 °С на среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина; осаждали центрифугированием, дважды промывали буфером А и хранили при -80 °С. 40 г размороженных клеток суспендировали в 140 мл буфера В и обрабатывали 2 часа лизоцимом (конечная концентрация 0.1 мг/мл, 4 °С). Частично лизированные клетки разрушали с помощью ультразвука (4 °С, 15 кГц, 3x1 мин, дезинтегратор УЗДН-4А), образовавшийся гомогенат центрифугировали (3 ч; 40000 х g), получали бесклеточный экстракт.

Хроматография на фосфоцеллюлозе Р-11

Бесклеточный экстракт разбавляли в 5 раз буфером С и наносили на колонку с фосфоцеллюлозой Р-11 (150 мл), уравновешенной буфером С, со скоростью 1 мл/мин. Колонку промывали 1 л того же буфера с и элюировали белок 600 мл буфера D со скоростью 3 мл/мин, фракции, содержащие целевой белок, хранили при 4°С не более ночи и использовали далее для хроматографии на DEAE-Toyopearl или Q-сефарозе.

Хроматография на О-сефарозе

Объединенные фракции разбавляли в 4 раза охлажденным до 4°С буфером Е, фильтровали через целлюлозный мембранный фильтр (0.2 мкм) и наносили на три последовательно соединенных колонки (по 5 мл) с Q-сефарозой HP, уравновешенной тем же буфером, со скоростью 1 мл/мин; промывали 150 мл буфера Е и элюировали связавшиеся белки 225 мл линейного градиента концентрации NaCl (0 -1.0 М) в буфере Е. Фракции, десорбировавшиеся в области 0.2 - 0.5 М NaCl, объединяли, и использовали для дальнейшей очистки или добавляли глицерин до 50% концентрации и хранили при -20 °С.

Хроматография на гепарин-сефарозе

Объединенный элюат после хроматографии на Q-сефарозе наносили со скоростью 1 мл/мин на колонку с гепарин-сефарозой (HiTrap Heparin-Sepharose HP, 5 мл), уравновешенной буфером Е, содержащим 300 мМ NaCl; промывали 50 мл буфера Е; связавшиеся белки элюировали в условиях линейного градиента концентрации NaCl (0.3 -1 М) в буфере Е. Фракции, десорбировавшиеся в области 0.4 - 0.7 М NaCl, объединяли, и использовали для дальнейшей очистки или добавляли глицерин до 50 % концентрации и хранили при -20 °С.

Гель-фильтрация на Сефакриле

Объединенный элюат после хроматографии на гепарин-сефарозе концентрировали с помощью мембранных фильтров Centriprep 50 и хроматографировали на колонке со смолой HiPrep 26/60 Sephacryl S-300, уравновешенной буфером F.

Выход Ьоп-протеиназы составляет около 100 мг из 40 г сырых клеток. Чистота препарата около 95 %.

Выделение гибридных форм Ьоп-протеиназы с использованием аффинной хроматографии на глутатион-агарозе

Ночную культуру трансформированных соответствующей плазмидой бактерий (среда LB, содержащая 100 мкг/мл ампициллина) разбавляли в соотношении 1:100 этой же средой с добавлением антибиотика и наращивали биомассу при 37°С и интенсивной аэрации до достижения оптического поглощения Абоо =0.3-0.5. Добавляли IPTG до конечной концентрации 0.5 мМ. Индукцию проводили в течение 3-4 часов, затем клетки осаждали центрифугированием. Осадок клеток, полученный из 200 мл культуры, ресуспендировали в 5 мл охлажденного 50 мМ трис-НС1-буфера (рН 7.3), содержащего 10% глицерин (буфер G). Полученную суспензию обрабатывали с помощью ультразвукового дезинтегратора, разбавляли до 10 мл тем же буфером и центрифугировали (30 мин, 40 000g). Полученный бесклеточный экстракт наносили со скоростью 3 мл/ч на колонку (1x3 см) с глутатион-агарозой, предварительно уравновешенной буфером А. Элюцию белка осуществляли буфером G, содержащим 5 мМ восстановленный глутатион.

Гидролиз гибридных белков тромбином проводили 2 ч при 25°С в 1.5 мл реакционной смеси, содержащей 0.5 мг гибридного белка и 6 мкл тромбина (330 ед. акт./мл) в буфере G.

3,2.5. Ограниченный протеолиз Ьоп-протеиназы и ее мутантных форм.

Выделение фрагментов фермента

Протеолитический домен. 100 мг мутанта Lon-S679A инкубировали 2 ч при 30°С с 250 мкг а-химотрипсина в 50 мл буфера Н, добавляли PMSF до 1 мМ, разбавляли в 4 раза (при 4°С) буфером I, фильтровали через мембранный фильтр (0.45 мкм) и наносили на колонку с HiTrap Heparin-Sepharose HP (5 мл), уравновешенной буфером I, несвязавшиеся фракции, содержащие целевой белок, концентрировали с помощью мембранных фильтров YM-10, разбавляли в 10 раз буфером J и хроматографировали на

HiTrap Q-Sepharose HP (5 мл) в буфере J, белки элюировали 100 мл линейного градиента концентрации NaCl (0 - 1 М) в буфере J. Фракции, десорбировавшиеся в области 0.1 - 0.2 М NaCl, объединяли, концентрировали с помощью мембранных фильтров Centriprep 10 и хроматографировали на колонке HiLoad 26/60 Superdex 75 в буфере К. а-Спирализованный домен. 100 мл реакционной смеси, содержащей 0.5 мг/мл Lon-S679A и 20 мкг/мл а-химотрипсина, инкубировали 3 ч при 37°С в буфере L, добавляли [3-меркаптоэтанол до 1 % (v/v) и хроматографировали на HiTrap Q-Sepharose HP (5 мл) в том же буфере, несвязавшиеся фракции, содержащие целевой белок, концентрировали с помощью мембранных фильтров Centriprep 10 и хроматографировали на колонке HiLoad 26/60 Superdex 75 в буфере М.

Получение N-домена, AAA*-модуля и АР-фрагмента EcLon проводили в среде, содержащей 1 мМ ADP и 20 мМ MgCb (только при получении АР).

100 мг очищенного препарата £cLon обрабатывали 0.5 мг а-химотрипсина (2 ч при 30°С) в 50 мл буфера F, добавляли PMSF до 1 мМ, фильтровали (при 4°С) через мембранный фильтр (0.2 мкм) и хроматографировали на HiTrap Heparin-Sepharose HP (5 мл) в том же буфере, элюция 50 мл линейного градиента концентрации NaCl (0.2 - 1 М) в буфере F. Несвязавшиеся фракции разбавляли в 6 раз буфером N и концентрировали с помощью мембран 10 000 MWCO до 50 мл, процедуру повторяли трижды, затем белковый раствор хроматографировали на HiTrap Q-Sepharose HP (5 мл) в буфере N, белки элюировали 50 мл линейного градиента концентрации NaCl (0 - 0.5 М) в буфере N. Фракции, десорбировавшиеся в области 0.2 - 0.3 М NaCl, объединяли, концентрировали и хроматографировали на колонке HiLoad 26/60 Superdex 75 в буфере N, выделяли N-домен.

Фракции элюата после хроматографии на HiTrap Heparin-Sepharose HP (0.4 - 0.8 М NaCl) разбавляли в 3 раза 50 мМ трис-НС1-буфером, рН 7.5 и хроматографировали на HiTrap Q-Sepharose HP (5 мл) в последнем буфере. Несвязавшиеся фракции, содержащие ААА+-модуль, концентрировали и хроматографировали на колонке HiLoad 26/60 Superdex 75. Элюат с HiTrap Q-Sepharose HP (20 мл 50 мМ трис-НС1-буфера, рН 7.5, 0.4 М NaCl) концентрировали с помощью Amicon Ultra 10 000 MWCO и хроматографировали на HiPrep 26/60 Sephacryl S-300, уравновешенной буфером F, получали АР-фрагмент.

Средний выход очищенных препаратов фрагментов из 100 мг полноразмерной .EcLon составляет 20 мг для N-домена, 30 мг для ААА+-модуля, 40 мг для АР-фрагмента и 15 мг для Р-домена.

3.2.6. Исследование смешанных олигомеров Ьоп-протеиназы

Для обеспечения диссоциации на субъединицы мутантные формы Ьоп-протеиназы

Ser679Ala и Lys362Gln инкубировали в присутствии 1 М NaCl в течение 2 ч, затем смешивали в эквимолярных количествах и подвергали диализу против 50 мМ Tris-HCl (рН 7.5) в течение ночи. Протеолитическую активность полученных препаратов оценивали по гидролизу [14С]-ацетил-а-казеина.

3.2.7. Тестирование ферментативной активности

При обработке данных использовали программу "Origin".

АТР-зависимый гидролиз [14С1-ацетил-а-казеина

Протеолитическую активность нативной и мутантных форм фермента тестировали по радиоактивности кислоторастворимых продуктов деградации ацетилированного казеина в присутствии и в отсутствие АТР.

Реакцию проводили при 37°С в 1000 мкл реакционной смеси состава: 50mM Tris-HCl, рН 8.0; 20 мМ MgCb; 5 мМ АТР; 5 % глицерин, 0.1 М NaCl; 0.3 мг/мл [|4С]-ацетил-сх-казеина; 10-40 мкг/мл Ьоп-протеиназы.

В контрольном опыте для учета АТР-независимого протеолиза аликвоту АТР заменяли аликвотой 50 мМ Tris-HCl- буфера, рН 8.0.

Реакционную' смесь параллельно с контрольной (аликвоты по 150 мкл) через равные интервалы времени (15 мин) отбирали в пробирки, содержащие 50 мкл 5% BSA, встряхивали, добавляли 500 мкл 15% ТХУ, встряхивали и осаждали при 4°С. Через 60 мин после отбора аликвоты суспензию белка центрифугировали на миницентрифуге (10 мин, 12000 об./мин). Отбирали 600 мкл надосадочной жидкости в сцинтилляционный флакон, содержащий 5 мл сцинтилляционной жидкости (СЖ), и измеряли уровень радиоактивности.

По значениям счета как функции от времени, определяли скорость гидролиза казеина Vo, выраженную в условных единицах (cpm/min).

Удельную АТР-зависимую активность фермента рассчитывали по формуле: А = Cs AV0 / (О.С. - Ф.С.) / СЕ, {моль / (моль х мин)}, где

AV0 {cpm/min} - разность скоростей гидролиза казеина в присутствии и в отсутствие АТР; О.С. и Ф.С. {срт} - общий и фоновый счет препарата казеина при стандартизованной процедуре осаждения в отсутствие фермента; Cs и Се {М} - молярная концентрация субстрата (казеина) и фермента (в расчете на субъединицу) соответственно.

Реакцию проводили при разных концентрациях фермента, и полученные значения i удельной активности усредняли.

Определение протеолитической и автолитической активностей Ьоп-протеиназы с помощью диск-электрофореза

Активность Ьоп-протеиназы при гидролизе (3-казеина определяли электрофоретически.

200 мкл 50 мМ Tris-HCl-буфера, рН 8.0, содержащего 20 мМ MgCh, 5 мМ АТР или АМРСРР, 0.5 мг/мл казеина и 75 мкг/мл Ьоп-протеиназы, инкубировали при 37°С. Из реакционной смеси через равные промежутки времени (10-30 мин) отбирали аликвоты (по 20 мкл) в пробирки, содержащие по 7 мкл лизирующего буфера (4х) для образцов, денатурировали кипячением, наносили по 20 мкл на гель и проводили электрофорез. Активность фермента определяли по убыли полосы, соответствующей р-казеину.

При исследовании автолитической активности Ьоп-протеиназы из смеси, содержащей 50 мМ Tris-HCl-буфер, рН 8.0, различные эффекторы (5 мМ АТР, 20 mM MgCl2, 0.5 мг/мл мелиттина) и 0,5 мг/мл фермента, через равные промежутки времени (60 мин) отбирали аликвоты (20 мкл), добавляли лизирующий буфер для образцов, кипятили и проводили электрофорез. Эффективность автолиза детектировали по убыли полосы, соответствующей Ьоп-протеиназе.

Гидролиз мелиттина

Продукты гидролиза мелиттина Ьоп-протеиназой и ее модифицированными формами детектировали с помощью масс-спектрометрии. Состав реакционной смеси: 200 мкл 50 мМ Tris-HCl-буфера, рН 8.0, 20 mM MgCl2, 5 мМ АТР или АМРСРР, 0.5 мг/мл мелиттина и 75 мкг/мл Ьоп-протеиназы, инкубация при 37°С. Из реакционной смеси отбирали аликвоты по 20 мкл и добавляли раствор 2 для обессоливания образцов для масс-спектрометрии.

Приготовление образцов для масс-спектрометрии

К 20 мкл реакционной смеси добавляли 5 мкл раствора, содержащего 8 М гуанидин гидрохлорид и 2.5 % TFA, и наносили на микроколонки ZipTip (Millipore) С4 или С18 (смола помещена в наконечник для автоматической пипетки), промытые раствором 50 % ацетонитрилом и уравновешенные 0.1 % TFA. Смолу промывали 2-3 раза 0.1 % TFA и 2 раза раствором тем же раствором, но содержащим 5 % метанол (для полного обессоливания образца), смесь пептидов и белков элюировали 2 раза по 10 мкл раствора, содержащего 50 % ацетонитрил и 0.1 % TFA.

Масс-спектрометрический анализ проводили на приборе MALDI-MS Vision 2000 (Thermo BioAnalysis, США) в линейном режиме с использованием в качестве матрицы раствора 2% 2,5-дигидроксибензойной кислоты.

Гидуолиз Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl

Гидролиз тиоэфира регистрировали спектрофотометрически [ ] по величине оптического поглощения 4-тиопиридона (£324 = 19800 М"1 х см"1), образующегося в результате взаимодействия продукта гидролиза (бензилтиолата, Bzl-S") с 4,4'-дитиодипиридином (DTDP), используя либо непрерывную регистрацию сигнала, либо метод отбора проб. В первом случае DTDP содержался в реакционной смеси (условия приведения реакции - см. "Гидролиз АТР") в концентрации 1 мМ; во втором случае - в "остановочном" реагенте (50 мМ Tris-HCl, рН 8; 8 М мочевина; 2 мМ DTDP).

При тестировании "методом отбора проб" реакцию проводили в 3 мл реакционной смеси. Аликвоты по 400 мкл отбирали в кварцевые кюветы, содержащие равный объем "остановочного" реагента, встряхивали и определяли оптическое поглощение раствора.

Гидролиз АТР

Гидролиз АТР тестировали по накоплению в реакции неорганического фосфата [304]. Реакцию проводили при 37°С в 1500 мкл реакционной смеси состава: 50 мМ Tris-HCI-буфер, рН 8; 0.3 - 3 мМ АТР; 15 мМ MgCl2; дефосфорилированный казеин - 1 мг/мл; 0.1 М NaCl, 5% глицерин; фермент - 20 - 100 мкг/мл. В контрольном опыте аликвоту фермента заменяли аликвотой 50 мМ Tris-HCl-буфера, рН 8; 1 М NaCl, 50 % глицерин.

При определении начальных скоростей реакционную смесь (аликвоты по 200 мкл), параллельно с контрольной, через равные промежутки времени отбирали в кварцевые кюветы, содержащие 600 мкл реагента для определения неорганического фосфата, встряхивали и определяли оптическое поглощение при длине волны 350 нм (£350= 7800 М"1 х см"1).

3.2.8. Исследование олигомерного состояния нативной Lon-протеиназы

Аналитическое ультрацентрифугирование

Эксперименты проводили в аналитической ультрацентрифуге модель Е (Beckman, США, серийный номер 11243 MFG),снабженной УФ-сканером, монохроматором с ксенон-ртутной лампой, мультиплексором и модифицированным однокоординатным самописцем (Recorder 110710-10005, Houston Instrument) с отклонением пера до 20 см при оптическом поглощении 0,2 и общем увеличении по радиусу 16 раз. Графически сглаженные седиментограммы для разных моментов времени сводили на один кадр для точной идентификации положения и формы границ седиментации отдельных компонентов в разные моменты времени.

Скоростную седиментацию проводили в двухсекторных угольных кюветах (номер по каталогу Beckman 306493) при температурах, близких к 20°С. Концентрация ферментов составляла 0.5-1.0 мг/мл.

Зональную седиментацию активного фермента проводили в двухсекторной кювете тип 1 (номер по каталогу Beckman 331359). Раствор фермента (0.1-0.5 мг/мл) в 20 мМ Tris-HCl-буфере, рН 8.0, объемом 5-7 мкл, наслаивали на 0.42 мл растворителя, содержащего 50 мМ Tris-HCl-буфер, рН 8.0, 0.1 М NaCl, 10% DMSO, 2 мМ DTDP, 1 мМ Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl, 0.2-2.0 мМ АТР, ADP, АМРСРР, 1-20 мМ MgCb. Температура экспериментов 26-28°С. Наслоение происходило при 2000-5000 об/мин. На этой скорости центрифугирование вели 10-15 мин, затем скорость вращения ротора ступенчато увеличивали до 11000, 22000, 34000 об./мин (60, 30, 60 мин, соответственно). Регистрацию оптического поглощения по радиусу проводили при длинах волн 324 или 340 нм с максимальной скоростью сканирования.

Эксклюзионная хроматография

Четвертичная структура Ьоп-протеиназы была исследована с использованием гель-фильтрации методом FPLC на колонке Superose-б. Регистрация веществ на выходе из колонки осуществлялась с помощью ультрафиолетового детектора при Х=254 нм. Для определения олигомерного состояния Ьоп-протеиназы использовали калибровочн\то зависимость коэффициента удерживания Kav от логарифма молекулярной массы белка. Для построения этой зависимости проводили гель-фильтрацию белков-стандартов с известной молекулярной массой (тироглобулин, 669 кДа; апоферритин, 443 кДа; каталаза, 240 кДа; альдолаза, 160 кДа).

Исходные образцы центрифугировали (5 мин, 12000 об./мин). 220 мкл образца i наносили на колонку объемом 24 мл. Гель-фильтрацию проводили в 50 мМ Трис-НС1-буфере, рН 7.5, содержащем 0.15 М NaCl и 1 мМ DTT при скорости потока 0.33 мл/мин и рабочем давлении 0.6 МПа. Элюат фракционировали, определяли концентрацию белка. Основные фракции анализировали с помощью диск-электрофореза и использовали для определения ферментативной активности в реакции гидролиза Р-казеина.

3.2.9. Кристаллизация индивидуальных доменов Ьоп-протеиназы

Кристаллизацию фрагментов Ьоп-протеиназы проводили методом висячей капли, содержащей одинаковые количества белкового и резервуарного растворов. В случае а-домена белковый раствор концентрировали до 10 мг/мл; резервуарный раствор содержал 30 % PEG 3000 (или 20 % PEG 8000), 0.1 М CHES, рН 9.5. В течение 14 дней при комнатной температуре кристаллы достигали размера 0.4 х 0.1 х 0.05 mmj. Затем кристаллы переносили в криозащитный раствор, состоящий из 80 % маточного раствора и 20 % этиленгликоля.

В случае Р-домена белковый раствор содержал от 18 до 24 мг/мл; резервуарный раствор содержал 2 М (NH^SO^ 0.1 М PIPES, рН 6.5. Типичные кристаллы размером 0.2 х 0.1 х 0.1 mmj вырастали за 5-10 дней при комнатной температуре. Кристаллы хранили в криозащитном растворе, состоящем из 80 % маточного раствора и 20 % этиленгликоля.

1. Alberts В. (1998) The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell, 92(3), 291-294.

2. Horwich A.L. (1995) Molecular chaperones. Resurrection or destruction? Curr. Biol, 5(5), 455458.

3. Gottesman S., Wickner S., Maurizi M.R. (1997) Protein quality control: triage by chaperones and proteases. Genes Dev., 11(7), 815-823.

4. Suzuki C.K., Rep M., van Dijl J.M., Suda K, Grivell L.A., Schatz G. (1997) ATP-dependent proteases that also chaperone protein biogenesis. Trends Biochem. Sci., 22(4), 118-123.

5. Hurtley S.M., Helenius A. (1989) Protein oligomerization in the endoplasmic reticulum. Annu. Rev. Cell Biol, 5, 277-307.

6. Wickner S., Maurizi M.R., Gottesman S. (1999) Posttranslational quality control: folding, refolding, and degrading proteins. Science, 286(5446), 1888-1893.

7. Iyer L.M., Leipe D.D., Koonin E.V., Aravind L. (2004) Evolutionary history and higher order classification of AAA+ ATPases. J. Struct. Biol, 146(1-2), 11-31.

8. Confalonieri F., Duguet M. (1995) A 200-amino acid ATPase module in search of a basic function. Bioessays, 17(7), 639-650.

9. Beyer A. (1997) Sequence analysis of the AAA protein family. Protein Sci., 6(10), 2043-2058.

10. Patel S., Latterich M. (1998) The AAA team: related ATPases with diverse functions. Trends Cell. Biol., 8(2), 65-71.

11. Lupas A.N, Martin J. (2002) AAA proteins. Curr. Opin. Struct. Biol, 12(6), 746-753.

12. Frickey T, Lupas A.N. (2004) Phylogenetic analysis of AAA proteins. J. Struct. Biol., 146(1-2), 2-10.

13. Zhang X, Shaw A, Bates P.A., Newman R.H, Gowen В., Orlova E, Gorman M.A, Kondo H., Dokumo P., Lallv J., Leonard G, Meyer H, van Heel M, Freemont P.S. (2000) Structure of the AAA ATPase p97. Mol. Cell, 6(6), 1473-1484.

14. Lenzen C.U., Steinmann D, Whiteheart S.W, Weis W.I. (1998) Crystal structure of the hexamerization domain of N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein. Cell, 94(4), 525-536.

15. Yu R.C, Hanson P.I, Jahn R. Brunger A.T. (1998) Structure of the ATP-dependent oligomerization domain of N-ethylmaleimide sensitive factor complexed with ATP. Nat. Struct. Biol., 5(9), 803-81 1.

16. Supp D.M, Witte D.P, Potter S.S, Brueckner M. (1997) Mutation of an axonemal dynein affects left-right asymmetry in inversus viscerum mice. Nature, 389(6654), 963-966.

17. Neuwald A.F.-Aravind L, Spouge J.L, Koonin E.V. (1999) AAA+: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res., 9(1), 27-43.

18. Guenther B, Onrust R„ Sali A, O'Donnell M, Kuriyan J. (1997) Crystal structure of the 5' subunit of the clamp-loader complex of E. coli DNA polymerase III. Cell, 91(3), 335-345.

19. Bochtler M, Hartmann C, Song H.K, Bourenkov G.P, Bartunik H.D, Huber R. (2000) The structures of HslU and the ATP-dependent protease HsIU-HsIV. Nature, 403(6771), 800-805.

20. Li J, Sha B. (2002) Crystal structure of£. coli HsplOO ClpB nucleotide-binding domain 1 (NBD1) and mechanistic studies on ClpB ATPase activity. J. Mol. Biol, 318(4), 1127-1137.

21. Krzywda S., Brzozowski A.M., Verma C., Karata K., Ogura Т., Wilkinson A.J. (2002) The crystal structure of the AAA domain of the ATP-dependent protease FtsH of Escherichia coli at 1.5 A resolution. Structure (Camb), 10(8), 1073-1083.

22. Niwa H., Tsuchiya D., Makyio H., Yoshida M., Morikawa K. (2002) Hexameric ring structure of the ATPase domain of the membrane-integrated metal loprotease FtsH from Thermus thermophilus HB8. Structure (Camb), 10(10), 1415-1423.

23. Liu J., Smith C.L., DeRyckere D., DeAngelis K., Martin G.S., Berger J.M. (2000) Structure and function of Cdc6/Cdcl8: implications for origin recognition and checkpoint control. Mol. Cell, 6(3), 637-648.

24. Hattendorf D.A., Lindquist S.L. (2002) Analysis of the AAA sensor-2 motif in the C-terminal ATPase domain of Hspl04 with a site-specific fluorescent probe of nucleotide binding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(5), 2732-2737.

25. Ahmadian M.R., Stege P., Scheffzek K., Wittinghofer A. (1997) Confirmation of the arginine-finger hypothesis for the GAP-stimulated GTP-hydrolysis reaction of Ras. Nat. Struct. Biol., 4(9), 686-689.

26. Babor S.M., Fass D. (1999) Crystal structure of the Secl8p N-terminal domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(26), 14759-14764.

27. May A.P., Misura K.M., Whiteheart S.W., Weis W.I. (1999) Crystal structure of the amino-terminal domain ofN-ethylmaleimide-sensitive fusion protein. Nat. Cell. Biol., 1(3), 175-182.

28. Yu R.C., Jahn R., Brunger A.T. (1999) NSF N-terminal domain crystal structure: models ofNSF function. Mol. Cell, 4(1), 97-107.

29. Castillo R.M., Mizuguchi K, Dhanaraj V., Albert A., Blundell T.L., Murzin A.G. (1999) A six-stranded double-yP barrel is shared by several protein superfamilies. Structure Fold Des., 7(2), 227236.

30. Ogura Т., Whiteheart S.W., Wilkinson A.J. (2004) Conserved arginine residues implicated in ATP hydrolysis, nucleotide-sensing, and inter-subunit interactions in AAA and AAA+ ATPases. J. Struct. Biol., 146(1-2), 106-112.

31. Hartl F.U., Hayer-Hartl M. (2002) Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. Science, 295(5561), 1852-1858.

32. Лузиков B.H. (2002) Контроль качества: белки и органеллы. Биохимия, 67(2), 205-219.

33. Wong P., Houry W.A. (2004) Chaperone networks in bacteria: analysis of protein homeostasis in minimal cells. J. Struct. Biol, 146(1-2), 79-89.

34. Maurizi M.R. (2002) Love it or cleave it: tough choices in protein quality control. Nat. Struct. Biol., 9(6), 410-412.

35. Dougan D.A., Mogk A., Bukau B. (2002) Protein folding and degradation in bacteria: to degrade or not to degrade? That is the question. Cell. Mol. Life Sci., 59(10), 1607-1616.

36. Matouschek A. (2003) Protein unfolding~an important process in vivo? Curr. Opin. Struct. Biol, 13(1), 98-109.

37. Hengge R., Bukau B. (2003) Proteolysis in prokaryotes: protein quality control and regulatory principles. Mol. Microbiol., 49(6), 1451-1462.

38. Weibezahn J., Bukau В., Mogk A. (2004) Unscrambling an egg: protein disaggregation by AAA+ proteins. Microb. Cell. Fact., 3(1), 98-109.

39. Flanagan J.M., Bewley M.C. (2002) Protein quality control in bacterial cells: integrated networks of chaperones and ATP-dependent proteases. Genet. Eng. (NY), 24, 17-47.

40. Gottesman S., Maurizi M.R., Wickner S. (1997) Regulatory subunits of energy-dependent proteases. Cell, 91(4), 435-438.

41. Schirmer E.C., Glover J.R., Singer M.A., Lindquist S. (1996) HSPlOO/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions. Trends Biochem. Sci., 21(8), 289-296.

42. Mogk A., Dougan D, Weibezahn J., Schlieker C., Turgay K., Bukau B. (2004) Broad yet high substrate specificity: the challenge of AAA+ proteins. J. Struct. Biol., 146(1-2), 90-98.

43. Lee S., Sowa M.E., Choi J.M., Tsai F.T. (2004) The ClpB/Hspl04 molecular chaperone a protein disaggregating machine. J. Struct. Biol., 146(1-2), 99-105.

44. Mogk A., Bukau B. (2004) Molecular chaperones: structure of a protein disaggregase. Curr. Biol, 14(2),"R78-80.

45. Beuron F., Maurizi M.R., Belnap D.M., Koesis E., Booy F.P., Kessel M., Steven A.C. (1998) At sixes and sevens: characterization of the symmetry mismatch of the CIpAP chaperone-assisted protease. J. Struct. Biol., 123(3), 248-259.

46. Tomoyasu Т., Mogk A., Langen H., Goloubinoff P., Bukau B. (2001) Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol. Microbiol., 40(2), 397-413.

47. Martin J., Gruber M., Lupas A.N. (2004) Coiled coils meet the chaperone world. Trends Biochem. Sci., 29(9), 455-458.

48. Lee S, Sowa M.E., Watanabe Y.H., Sigler P.B., Chiu W., Yoshida M., Tsai F.T. (2003) The structure of ClpB: a molecular chaperone that rescues proteins from an aggregated state. Cell, 115(2), 229-240.

49. Keiler K.C., Waller P.R., Sauer R.T. (1996) Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science, 271(5251), 990-993.

50. Gottesman S., Roche E., Zhou Y„ Sauer R.T. (1998) The ClpXP and CIpAP proteases degrade proteins with carboxy-terminal peptide tails added by the SsrA-tagging system. Genes Dev., 12(9),1338-1347.

51. Flynn J.M, Levchenko I., Seidel M., Wickner S.H., Sauer R.T., Baker T.A. (2001) Overlapping recognition determinants within the ssrA degradation tag allow modulation of proteolysis. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 98(19), 10584-10589.

52. Varshavsky A. (1992) The N-end rule. Cell, 69(5), 725-735.

53. Flynn J.M., Neher S.B., Kim Y.I., Sauer R.T., Baker T.A. (2003) Proteomic discovery of cellular substrates of the ClpXP protease reveals five classes of ClpX-recognition signals. Mol. Cell, 11(3), 671-683.

54. Lo J.H., Baker T.A., Sauer R.T. (2001) Characterization oftheN-terminal repeat domain of Escherichia coli ClpA-A class I Clp/HSPlOO ATPase. Protein Sci., 10(3), 551-559.

55. Singh S.K, Rozycki J., Ortega J., Ishikawa T, Lo J, Steven A.C, Maurizi M.R. (2001) Functional domains of the ClpA and ClpX molecular chaperones identified by limited proteolysis and deletion analysis. J. Biol. Chem., 276(31), 29420-29249.

56. Тек V., Zolkiewski M. (2002) Stability and interactions of the ami no-terminal domain of ClpB from Escherichia coli. Protein Sci., 11(5), 1192-1198.

57. Barnett M.E., Zolkiewski M. (2002) Site-directed mutagenesis of conserved charged amino acid residues in ClpB from Escherichia coli. Biochemistiy, 41(37), 1 1277-1 1283.

58. Banecki В., Wawrzynow A., Puzewicz J., Georgopoulos C., Zylicz M. (2001) Structure-function analysis of the zinc-binding region of the Clpx molecular chaperone. J. Biol. Chem., 276(22), 18843 18848.

59. Wojtyra U.A., Thibault G., Tuite A., Houry W.A. (2003) The N-terminal zinc binding domain of ClpX is a dimerization domain that modulates the chaperone function. J. Biol. Chem., 278(49), 48981-48990.

60. Song H.K., Hartmann C., Ramachandran R., Bochtler M., Behrendt R., Moroder L., Huber R. (2000) Mutational studies on HslU and its docking mode with HslV. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(26), 14103-14108.

61. К won A.R., Kessler B.M., Overkleeft H.S., McKay D.B. (2003) Structure and reactivity of an asymmetric complex between HslV and I-domain deleted HslU, a prokaryotic homolog of the eukaryotic proteasome. J. Mol. Biol., 330(2), 185-195.

62. Roudiak S.G., Shrader Т.Е. (1998) Functional role of the N-terminal region of the Lon protease from Mycobacterium smegmatis. Biochemistiy, 37(32), 11255-11263.

63. Ebel W., Skinner M.M., Dierksen K.P., Scott J.M., Trempy J.E. (1999) A conserved domain in Escherichia coli Lon protease is involved in substrate discriminator activity. J. Bacterioi, 181(7),2236-2243.

64. Dougan D.A., Mogk A., Zeth K., Turgay K., Bukau B. (2002) AAA+ proteins and substrate recognition, it all depends on their partner in crime. FEBSLett., 529(1), 6-10.

65. Levchenko I., Seidel M., Sauer R.T., Baker T.A. (2000) A specificity-enhancing factor for the ClpXP degradation machine. Science, 289(5488), 2354-2356.83

66. Wah D.A., Levchenko I., Baker T.A., Sauer R.T. (2002) Characterization of a specificity factor for an AAA+ ATPase: assembly of SspB dimers with ssrA-tagged proteins and the ClpX hexamer. Chem Biol, 9(11), 1237-1245.

67. Wah D.A., Levchenko I., Rieckhof G.E., Bolon D.N., Baker T.A., Sauer R.T. (2003) Flexible linkers leash the substrate binding domain of SspB to a peptide module that stabilizes delivery complexes with the AAA+ ClpXP protease. Mol Cell, 12(2), 355-363.

68. Dougan D.A., Weber-Ban E., Bukau B. (2003) Targeted delivery of an ssrA-tagged substrate by the adaptor protein SspB to its cognate AAA+ protein ClpX. Mol Cell, 12(2), 373-380.

69. Song H.K., Eck M.J. (2003) Structural basis of degradation signal recognition by SspB, a specificity-enhancing factor for the ClpXP proteolytic machine. Mol. Cell, 12(1), 75-86.

70. Muffler A., Fischer D., Altuvia S., Storz G., Hengge-Aronis R. (1996) The response regulator RssB controls stability of the sigma(S) subunit of RNA polymerase in Escherichia coli. EMBOJ., 15(6), 1333-1339.

71. Zhou Y., Gottesman S., Hoskins J.R., Maurizi M.R., Wickner S. (2001) The RssB response regulator directly targets sigma(S) for degradation by ClpXP. Genes Dev., 15(5), 627-637.

72. Tang M., Shen X., Frank E.G., O'Donnell M., Woodgate R., Goodman M.F. (1999) UmuD'(2)C is an error-prone DNA polymerase, Escherichia coli pol V. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(16), 89198924.

73. Gonzalez M. Rasulova F., Maurizi M.R., Woodgate R. (2000) Subunit-specific degradation of the UmuD/D' heterodimer by the ClpXP protease: the role of trans recognition in UmuD' stability. EMBOJ. 19(19). 5251-5258.

74. Kuroda A., Nomura K., Ohtomo R., Kato J., Ikeda Т., Takiguchi N., Ohtake H., Kornberg A. (2001) Role of inorganic polyphosphate in promoting ribosomal protein degradation by the Lon protease in E. coli. Science, 293(5530), 705-708.

75. Dougan D.A., Reid B.G., Horwich A.L., Bukau B. (2002) ClpS, a substrate modulator of the ClpAP machine. Mol. Cell, 9(3), 673-683.

76. Zeth K„ Ravelli R.B., Paal K., Cusack S., Bukau В., Dougan D.A. (2002) Structural analysis of the adaptor protein ClpS in complex with the N-terminal domain of ClpA. Nat. Struct. Biol, 9(12),906.911.

77. Schlothauer Т. Mogk A., Dougan D.A., Bukau В., Turgay K. (2003) MecA, an adaptor protein necessary for ClpC chaperone activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(5), 2306-2311.

78. Persuh M., Turgay K., Mandic-Mulec I., Dubnau D. (1999) The N- and C-terminal domains of MecA recognize different partners in the competence molecular switch. Mol. Microbiol., 33(4), 886894.

79. Persuh M., Mandic-Mulec J„ Dubnau D. (2002) A MecA paralog, YpbH, binds ClpC, affecting both competence and sporulation. J. Bacteriol., 184(8), 2310-2313.

80. Kondo H., Rabouille C, Newman R., Levine T.P., Pappin D, Freemont P., Warren G. (1997) p47 is a cofactor forp97-mediated membrane fusion. Nature, 388(6637), 75-78.

81. Hetzer M, Meyer H.H., Walther T.C., Bilbao-Cortes D., Warren G., Mattaj l.W. (2001) Distinct AAA-ATPase p97 complexes function in discrete steps of nuclear assembly. Nat. Cell. Biol., 3(12), 1086-1091.

82. Koegl M., Hoppe T, Schlenker S., Ulrich H.D., Mayer T.U., Jentsch S. (1999) A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell, 96(5), 635-644.

83. Rouiller 1., Butel V.M., Latterich M., Milligan R.A., Wilson-Kubalek E.M. (2000) A major conformational change in p97 AAA ATPase upon ATP binding. Mol Cell, 6(6), 1485-1490.

84. Meyer H.H., Shorter J.G., Seemann J., Pappin D., Warren G. (2000) A complex of mammalian ufdl and npl4 links the AAA-ATPase, p97, to ubiquitin and nuclear transport pathways. EMBO J., 19(10), 2181-2192.

85. Van Melderen L., Gottesman S. (1999) Substrate sequestration by a proteolytically inactive Lon mutant. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(11), 6064-6071.

86. Старкова H.H., Королева Е.П., Ротанова T.B. (2000) Биоорган, химия, 26(2), 83-96.

87. Gottesman S. (2003) Proteolysis in bacterial regulatory circuits. Annu. Rev. Cell Dev. Biol, 19, 565-87.

88. Gottesman S., Maurizi M.R. (1992) Regulation by proteolysis: energy-dependent proteases and their targets. Microbiol. Rev., 56(4), 592-621.108

89. Maurizi M.R. (1992) Proteases and protein degradation in Escherichia coli. Experientia, 48(2), 178-201.

90. Gottesman S. (1996) Proteases and their targets in Escherichia coli. Amu. Rev. Genet., 30, 465506.

91. Goldberg A.L. (1992) The mechanism and functions of ATP-dependent proteases in bacterial and animal cells. Eur. J. Biochem., 203(1-2), 9-23.

92. Goldberg A.L., Moerschell R.P., Chung C.H., Maurizi M.R. (1994) ATP-dependent protease La (lon) from Escherichia coli. Methods Enzymol, 244, 350-375.

93. Chung C.H., Goldberg A.L. (1982) DNA stimulates ATP-dependent proteolysis and protein-dependent ATPase activity of protease La from Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79(3), 795-799.

94. Charette M.F., Henderson G.W., Markovitz A. (1981) ATP hydrolysis-dependent protease activity of the lon (capR) protein of Escherichia coli K-12. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78(8), 47284732.

95. Fu G.K., Smith M.J., Markovitz D.M. (1997) Bacterial protease Lon is a site-specific DNA-binding protein. J. Biol. Chem., 272(1), 534-538.

96. OguraT., Wilkinson A.J. (2001) AAA+ superfamily ATPases: common structure-diverse function. Genes Cells, 6(7), 575-597.

97. Tomoyasu Т., Yamanaka K., Murata K., Suzaki Т., Bouloc P., Kato A., Niki H., Hiraga S., Ogura T. (1993) Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli. J. Bacteriol., 175(5), 1352-1357.

98. Akiyama Y., Yoshihisa Т., Ito K. (1995) FtsH, a membrane-bound ATPase, forms a complex in the cytoplasmic membrane of Escherichia coli. J. Biol. Chem., 270(40), 23485-23490.

99. Akiyama Y, Kihara A, Tokuda H, Ito K. (1996) FtsH (HflB) is an ATP-dependent protease selectively acting on SecY and some other membrane proteins. J. Biol. Chem., 271(49), 3119631201.

100. Herman C, Lecat S, D'Ari R, Bouloc P. (1995) Regulation of the heat-shock response depends on divalent metal ions in an hflB mutant of Escherichia coli. Mol. Microbiol, 18(2), 247-255.1. P3

101. Makyio H, Niwa H, Motohashi K, Taguchi H, Yoshida M. (2002) Stabilization of FtsH-unfolded protein complex by binding of ATP and blocking of protease. Biochem. Biophys. Res. Commun.,2%(\), 8-12.

102. Bruckner R.C, Gunyuzlu P.L, Stein R.L. (2003) Coupled kinetics of ATP and peptide hydrolysis by Escherichia coli FtsH protease. Biochemistiy, 42(36), 10843-10852.

103. Yamada-lnagawa T, Okuno T, Karata K, Yamanaka K, Ogura T. (2003) Conserved pore residues in the AAA protease FtsH are important for proteolysis and its coupling to ATP hydrolysis. J. Biol Chem., 278(50), 50182-50187.

104. Saikawa N, Akiyama Y, Ito K. (2004) FtsH exists as an exceptionally large complex containing HflKC in the plasma membrane of Escherichia coli. J. Struct. Biol, 146(1-2), 123-129.

105. Okuno T, Yamada-lnagawa T, Karata K, Yamanaka K, Ogura T. (2004) Spectrometric analysis of degradation of a physiological substrate sigma32 by Escherichia coli AAA protease FtsH. J. Struct. Biol, 146(1-2), 148-154.

106. Nixon P.J, Barker M, Boehm M, de Vries R, Komenda J. (2005) FtsH-mediated repair of the photosystem II complex in response to light stress. J. Exp. Bot., 56(411), 357-363.

107. Hwang B.J, Woo K.M, Goldberg A.L., Chung C.H. (1988) Protease Ti, a new ATP-dependent protease in Escherichia coli, contains protein-activated ATPase and proteolytic functions in distinct subunits. J. Biol Chem., 263(18), 8727-8734.

108. Maurizi M.R., Clark W.P., Kim S.H, Gottesman S. (1990) Clp P represents a unique family of serine proteases. J. Biol. Chem., 265(21), 12546-12552.

109. Thompson M.W., Maurizi M.R. (1994) Activity and specificity of Escherichia coli CIpAP protease in cleaving model peptide substrates. J. Biol. Chem., 269(27), 18201-18208.

110. Maurizi M.R., Thompson M.W., Singh S.K., Kim S.H. (1994) Endopeptidase Clp: ATP-dependent Clp protease from Escherichia coli. Methods Enzymol., 244, 314-331.

111. Hoskins J.R., Рак M., Maurizi M.R., Wickner S. (1998) The role of the ClpA chaperone in proteolysis by CIpAP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(21), 12135-12140.

112. Beuron F., Maurizi M.R., Belnap D.M., Kocsis E., Booy F.P, Kessel M., Steven A.C. (1998) Ai sixes and sevens: characterization of the symmetry mismatch of the CIpAP chaperone-assisted protease. J. Struct. Biol, 123(3), 248-259.

113. Wang J., Harding J.A., Flanagan J.M. (1998) Crystal structure determination of Escherichia coli ClpP starting from an EM-derived mask. J. Struct. Biol, 124(2-3), 151-163.

114. Weber Ban E.U.,-Reid B.G., Miranker A.D., Horwich A.L. (1999) Global unfolding of a substrate protein by the HsplOO chaperone ClpA. Nature, 401(6748), 90-93.

115. Hoskins J.R., Singh S.K., Maurizi M.R., Wickner S. (2000) Protein binding and unfolding by the chaperone ClpA and degradation by the protease CIpAP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(16), 88928897.

116. Hoskins J.R., Kim S.Y., Wickner S. (2000) Substrate recognition by the ClpA chaperone component of CIpAP protease. J. Biol. Chem., 275(45), 35361-35367.

117. Reid B.G., Fenton W.A., Horwich A.L., Weber-Ban E.U. (2001) ClpA mediates directional translocation of substrate proteins into the ClpP protease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(7), 37683772.

118. Ishikawa Т., Beuron F., Kessel M., Wickner S., Maurizi M.R., Steven A.C. (2001) Translocation pathway of protein substrates in CIpAP protease. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 98(8), 4328-4333.

119. Hoskins J.R., Yanagihara K., Mizuuchi K., Wickner S. (2002) CIpAP and ClpXP degrade proteins with tags located in the interior of the primary sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(17), 11037-11042.

120. Xia D., Esser L., Singh S.K., Guo F., Maurizi M.R. (2004) Crystallographic investigation of peptide binding sites in the N-domain of the ClpA chaperone. J. Struct. Biol, 146(1-2), 166-179.

121. Piszczek G., Rozycki J., Singh S.K., Ginsburg A., Maurizi M.R. (2005) The molecular chaperone, ClpA, has a single high affinity peptide binding site per hexamer. J. Biol. Chem., 280(13), 12221-12230.

122. Gottesman S, Roche E., Zhou Y., Sauer R.T. (1998) The ClpXP and ClpAP proteases degrade proteins with carboxy-terminal peptide tails added by the SsrA-tagging system. Genes Dev., 12(9), 1338-1347.

123. Grimaud R., Kessel M., Beuron F., Steven A.C., Maurizi M.R. (1998) Enzymatic and structural similarities between the Escherichia coli ATP-dependent proteases, ClpXP and ClpAP. J. Biol. Chem., 273(20), 12476-12481.

124. Kim Y.I., Burton R.E., Burton B.M., Sauer R.T., Baker T.A. (2000) Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpXP degradation machine. Mol. Cell, 5(4), 639-648.

125. Singh S.K., Grimaud R, Hoskins J.R., Wickner S., Maurizi M.R. (2000) Unfolding and internalization of proteins by the ATP-dependent proteases ClpXP and ClpAP. Proc. Natl Acad. Sc<. USA, 97(16), 8898-8903.

126. Kim Y.I., Levchenko I., Fraczkowska K., Woodruff R.V., Sauer R.T., Baker T.A. (2001) Molecular determinants of complex formation between Clp/Hspl 00 ATPases and the ClpP peptidase. Nat. Struct. Biol, 8(3), 230-233.

127. Flynn J.M., Neher S.B., Kim Y.I., Sauer R.T., Baker T.A. (2003) Proteomic discovery of cellular substrates of the ClpXP protease reveals five classes of ClpX-recognition signals. Mol. Cell., 11(3), 671-683.

128. Wojtyra U.A., Thibault G., Tuite A., Houry W.A. (2003) The N-terminal zinc binding domain of ClpX is a dimerization domain that modulates the chaperone function. J. Biol. Chem., 278(49), 48981-48990.

129. Kim D.Y., Kim K.K. (2003) Crystal structure of ClpX molecular chaperone from Helicobacter pylori. J. Biol. Chem., 278(50), 50664-50670.

130. Sharma S., Hoskins J.R., Wickner S. (2005) Binding and degradation of heterodimeric substrates by ClpAP and ClpXP. J. Biol. Chem., 280(7), 5449-5455.

131. Kenniston J.A., Baker T.A., Sauer R.T. (2005) Partitioning between unfolding and release of native domains during ClpXP degradation determines substrate selectivity and partial processing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102(5), 1390-1395.

132. Yoo S.J., Shim Y.K., Seong I.S., Seol J.H., Kang M.S., Chung C.H. (1997) Mutagenesis of two N-terminal Thr and five Ser residues in HslV, the proteolytic component of the ATP-dependent HslVU protease. FEBSLett., 412(1), 57-60.

133. Rohrwild M., Pfeifer G., Santarius U., Muller S.A., Huang H.C., Engel A., Baumeister W., Goldberg A.L. (1997) The ATP-dependent HslVU protease from Escherichia coli is a four-ring structure resembling the proteasome. Nat. Struct. Biol., 4(2), 133-139.

134. Yoo S.J., Seol J.H., Seong I.S., Kang M.S., Chung C.H. (1997) ATP binding, but not its hydrolysis, is required for assembly and proteolytic activity of the HslVU protease in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun., 238(2), 581-585.

135. Sousa M.C., Kessler B.M., Overkleeft H.S., McKay D.B. (2002) Crystal structure of HslUV complexed with a vinyl sulfone inhibitor: corroboration of a proposed mechanism of allosteric activation of HslV by HslU. J. Mol. Biol., 318(3), 779-785.

136. Seong I.S., Kang M.S., Choi M.K., Lee J.W., Koh O.J., Wang J., Eom S.H., Chung C.H. (2002) The C-terminal tails of HslU ATPase act as a molecular switch for activation of HslV peptidase. J. Biol. Chem., 277(29), 25976-25982.

137. Ramachandran R., Hartmann C., Song H.K., Huber R, Bochtler M. (2002) Functional interactions of HslV (ClpQ) with the ATPase HslU (ClpY). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(11), 7396-7401.

138. Kuo M.S., Chen K.P, Wu W.F. (2004) Regulation of RcsA by the ClpYQ (HslUV) protease in Escherichia coli. Microbiology', 150(Pt 2), 437-446.

139. Kwon A.R., Trame C.B., McKay D.B. (2004) Kinetics of protein substrate degradation by HslUV. J. Struct. Biol., 146(1-2), 141-147.

140. Burton R.E., Baker T.A., Sauer R.T. (2005) Nucleotide-dependent substrate recognition by the AAA+ HslUV protease. Nat. Struct. Mol. Biol., 12(3), 245-251.

141. Azim M.K., Goehring W., Song H.K., Ramachandran R, Bochtler M., Goettig P. (2005) Characterization of the HslU chaperone affinity for HslV protease. Protein Sci., 14(5)6 1357-1362.

142. Kang M.S., Lim B.K., Seong I.S., Seol J.H., Tanahashi N., Tanaka K. Chung C.H. (2001) The ATP-dependent CodWX (HslVU) protease in Bacillus subtilis is an N-terminal serine protease. EMBOJ., 20(4), 734-742.

143. Kang M.S., Kim S.R., Kwack P., Lim B.K., Ahn S.W., Rho Y.M., Seong I.S., Park S.C., Eom S.H., Cheong G.W., Chung C.H. (2003) Molecular architecture of the ATP-dependent CodWX protease having an N-terminal serine active site. EMBOJ., 22(12), 2893-2902.

144. Goldschmidt R. (1970) In vivo degradation of nonsense fragments in E. coli. Nature, 228(277), 1151-1154.

145. Kanemori M., Nishihara К., Yanagi H., Yura Т. (1997) Synergistic roles of HslVU and other ATP-dependent proteases in controlling in vivo turnover of ст32 and abnormal proteins in Escherichia coli. J. Bacteriol., 179(23), 7219-7225.

146. Liu J., Cosby W.M., ZuberP. (1999) Role of Lon and ClpX in the post-translational regulation of a a subunit of RNA polymerase required for cellular differentiation in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol., 33(2), 415-428.1 or

147. Mizusawa S., Gottesman S. (1983) Protein degradation in Escherichia coli: the lon gene controls the stability of sulA protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80(2), 358-362.

148. Canceill D., Dervyn E., Huisman 0. (1990) Proteolysis and modulation of the activity of the cell division inhibitor SulA in Escherichia coli lon mutants. J. Bacteriol, 172(12), 7297-7300.

149. Sonezaki S„ Ishii Y., Okita K., Sugino Т., Kondo A., Kato Y. (1995) Overproduction and purification of SulA fusion protein in Escherichia coli and its degradation by Lon protease in vitro. Appl. Microbiol Biotechnol, 43(2), 304-309.

150. Frank E.G., Ennis D.G., Gonzalez M., Levine A.S, Woodgate R. (1996) Regulation of SOS mutagenesis by proteolysis. Proc. Nail. Acad. Sci. USA, 93(19), 10291-10296.

151. Gonzalez M., Frank E.G., Levine A.S., Woodgate R. (1998) Lon-mediated proteolysis of the Escherichia coli UmuD mutagenesis protein: in vitro degradation and identification of residues required for proteolysis. Genes Dev., 12(24), 3889-3899.

152. Torres-Cabassa A.S., Gottesman S. (1987) Capsule synthesis in Escherichia coli K-12 is regulated by proteolysis. J. Bacteriol, 169(3), 981-989.

153. Dierksen K.P., Marks J., Chen D.D., Trempy J.E. (1994) Evidence for structural conservation of Lon and Res A. J. Bacteriol, 176(16), 5126-5130.

154. Summers M.L., Botero L.M., Busse S.C., McDermott T.R. (2000) The ++Sinorhizobium meliloti Lon protease is involved in regulating exopolysaccharide synthesis and is required for nodulation of alfalfa. J. Bacteriol., 182(9), 2551-2558.

155. Gottesman S. Gottesman M., Shaw J.E., Pearson M.L. (1981) Protein degradation in E. coli: the Lon mutation and bacteriophage A,N and ell protein stability. Cell, 24(1), 225-233.

156. Maurizi M.R. (1987) Degradation in vitro of bacteriophage A,N protein by Lon protease from Escherichia coli. J. Biol Chem., 262(6), 2696-2703.

157. Leffers G.G., Jr, Gottesman S. (1998) Lambda Xis degradation in vivo by Lon and FtsH. J. Bacteriol, 180(6), 1573-1577.

158. Derbyshire K.M., Kramer M., Grindley N.D. (1990) Role of instability in the cis action of the insertion sequence IS903 transposase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87(11), 4048-4052.

159. Van Melderen L., Thi M.H., Lecchi P., Gottesman S., Couturier M., Maurizi M.R. (1996) ATP-dependent degradation of CcdA by Lon protease. Effects of secondary structure and heterologous subunit interactions. J. Biol. Chem., 271(44), 27730-27738.198

160. Gronlund H., Gerdes K. (1999) Toxin-antitoxin systems homologous with relBE of Escherichia co//plasmid P307 are ubiquitous in prokaryotes. J. Mol. Biol., 285(4), 1401-1415.

161. Smith A.S., Rawlings D.E. (1998) Efficiency of the pTF-FC2 pas poison-antidote stability system in Escherichia coli is affected by the host strain, and antidote degradation requires the Lon protease. J. Bacteriol., 180(20), 5458-5462.

162. Johansson J., Uhlin B.E. (1999) Differential protease-mediated turnover of H-NS and StpA revealed by a mutation altering protein stability and stationary-phase survival of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(19), 10776-10781.

163. Wang L., Elliott M., Elliott T. (1999) Conditional stability of the HemA protein (glutamyl-tRNA reductase) regulates heme biosynthesis in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol, 181(4), 1211-1219.

164. Wang L., Wilson S., Elliott Т. (1999) A mutant HemA protein with positive charge close to the N terminus is stabilized against heme-regulated proteolysis in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol, 181(19), 6033-6041.

165. Coux О, Tanaka K, Goldberg A.L. (1996) Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem., 65, 801-847.

166. Hilt W., Wolf D.H. (1996) Proteasomes: destruction as a programme. Trends Biochem. Sci., 21(3), 96-102.

167. Hochstrasser M. (1996) Ubiquitin-dependent protein degradation. Annu. Rev. Genet., 30, 405439.

168. Haas A.L., Siepmann T.J. (1997) Pathways of ubiquitin conjugation. FASEBJ., 11(14), 12571268.

169. Pickart C.M. (1997) Targeting of substrates to the 26S proteasome. FASEBJ., 11(13), 10551066.

170. Waxman L., Fagan J.M., Goldberg A.L. (1987) Demonstration of two distinct high molecular weight proteases in rabbit reticulocytes, one of which degrades ubiquitin conjugates. J. Biol. Chem. 262(6), 2451-2457.

171. Hough R., Pratt G., Rechsteiner M. (1987) Purification of two high molecular weight proteases from rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem., 262(17), 8303-8313.

172. Eytan E., Ganoth D., Armon Т., Hershko A. (1989) ATP-dependent incorporation of 20S protease into the 26S complex that degrades proteins conjugated to ubiquitin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(20), 7751-7755.

173. Grziwa A., Baumeister W., Dahlmann В., Kopp F. (1991) Localization of subunits in proteasomes from Thermoplasma acidophilum by immunoelectron microscopy. FEBS Lett., 290(1-2), 186-190.

174. Lowe J., Stock D., Jap В., Zwickl P., Baumeister W., Huber R. (1995) Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science, 268(5210), 533-539

175. Ciaverol S., Burlet-Schiltz O., Girbal-Neuhauser E., Gairin J.E., Monsarrat B. (2002) Mapping and structural dissection of human 20 S proteasome using proteomic approaches. Mol. Cell. Proteomics, 1(8), 567-578.

176. Groll M., Ditzel L., Lowe J., Stock D., Bochtler M., Bartunik H.D., Huber R. (1997) Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature, 386(6624), 463-471.

177. Unno M., Mizushima Т., Morimoto Y., Tomisugi Y., Tanaka K., Yasuoka N., Tsukihara T. (2002) The structure of the mammalian 20S proteasome at 2.75 A resolution. Structure (Camb), 10(5), 609-618.

178. Orlowski M. (1990) The multicatalytic proteinase complex, a major extralysosomal proteolytic system. Biochemistry, 29(45), 10289-10297.

179. Heinemeyer W., Fischer M., Krimmer Т., Stachon U, Wolf D.H. (1997) The active sites of the eukaryotic 20 S proteasome and their involvement in subunit precursor processing. J. Biol. Chem., 272(40), 25200-25209.

180. Arendt C.S., Hochstrasser M. (1997) Identification of the yeast 20S proteasome catalytic centers and subunit interactions required for active-site formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(14), 71567161.

181. Seemuller E., Lupas A., Stock D., Lowe J., Huber R., Baumeister W. (1995) Proteasome from Thermoplasma acidophilum: a threonine protease. Science, 268(5210), 579-582.

182. Kisselev A.F, Akopian T.N, Castillo V, Goldberg A.L. (1999) Proteasome active sites allosterically regulate each other, suggesting a cyclical bite-chew mechanism for protein breakdown. Mol Cell, 4(3), 395-402.

183. Groll M, Huber R. (2003) Substrate access and processing by the 20S proteasome core particle. Int. J. Biochem. Cell Biol, 35(5), 606-616.

184. Dubiel W, Ferrell K, Pratt G, Rechsteiner M. (1992) Subunit 4 of the 26 S protease is a member of a novel eukaryotic ATPase family. J. Biol Chem., 267(32), 22699-22702.

185. Wollenberg K, Swaffield J.C. (2001) Evolution ofproteasomal ATPases. Mol Biol Evol., 18(6). 962-974.

186. Hershko A, Ciechanover A. (1998) The ubiquitin system. Ann. Rev. Biochem., 67, 425-479.

187. Lee D.H, Goldberg A.L. (1998) Proteasome inhibitors: valuable new tools for cell biologists. Trends Cell. Biol., 8(10), 397-403.

188. Ciechanover A, Heller H, Katz-Etzion R, Hershko A. (1981) Activation of the heat-stable polypeptide of the ATP-dependent proteolytic system. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 78(2), 761-765.

189. Hershko A, Ciechanover A, Rose l.A. (1981) Identification of the active amino acid residue of the polypeptide of ATP-dependent protein breakdown. J. Biol. Chem., 256(4), 1525-1528.

190. Chau V, Tobias J. W, Bachmair A, Marriott D, Ecker D.J, Gonda D.K, Varshavsky A. (1989) biquitin chain is confined to specific lysine in a targeted short-lived protein. Science, 243(4898), 1576-1583.

191. Hershko A. (1996) Lessons from the discovery of the ubiquitin system. Trends Biochem. Sci., 21(11), 445-449.

192. Hershko A, Ciechanover A. (1992) The ubiquitin system for protein degradation. Ann. Rev. Biochem., 61, 761-807.

193. Voges D., Zwickl P., Baumeister W. (1999) The 26S proteasome: a molecular machine designed for controlled proteolysis. Ann. Rev. Biochem., 68, 1015-1068.

194. Bachmair A., Finley D., Varshavsky A. (1986) In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science, 234(4773), 179-186.

195. Varshavsky A. (2005) Regulated protein degradation. Trends Biochem. Sci., 30(6), 283-286.

196. Varshavsky A. (2000-2001) Recent studies of the ubiquitin system and the "N-end rule pathway. Han>ey Lect., 96. 93-116.

197. Rogers S., Wells R., Rechsteiner M. (1986) Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science, 234(4774), 364-368.

198. Rechsteiner M., Rogers S.W. (1996) PEST sequences and regulation by proteolysis. Trends Biochem. Sci., 21(7), 267-271.24j GlotzerM., Murray A.W., Kirschner M.W. (1991) Cvclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature, 349(6305), 132-138.

199. Tu G.F., Reid G.E., Zhang J.G., Moritz R.L., Simpson R.J. (1995) C-terminal extension of truncated recombinant proteins in Escherichia coli with a lOSa RNA decapeptide. J. Biol. Chem., 270(16), 9322-9326.

200. Keiler K.C, SilberK.R., Downard K.M., Papayannopoulos LA, Biemann K, Sauer R.T. (1995) C-terminal specific protein degradation: activity and substrate specificity of the Tsp protease. Protein Sci, 4(8), 1507-1515.

201. Maupin-Furlow J.A, Gil M.A, Karadzic I.M., Kirkland P.A., Reuter C.J. (2004) Proteasomes: perspectives from the Archaea. Front. Biosci., 9, 1743-1758.

202. Maupin-Furlow J.A, Wilson H.L, Kaczowka S.J, Ou M.S. (2000) Proteasomes in the archaea: from structure to function. Front. Biosci., 5, D837-865.

203. Groll M., Brandstetter H., Bartunik H., Bourenkow G., Huber R. (2003) Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J. Mol. Biol, 327(1), 75-83.

204. Zwickl P., Ng D., Woo K.M., Klenk H.P., Goldberg A.L. (1999) An archaebacterial ATPase, homologous to ATPases in the eukaryotic 26 S proteasome, activates protein breakdown by 20 S proteasomes. J. Biol Chem., 274(37), 26008-26014.

205. Kenniston J A., Sauer R.T. (2004) Signaling degradation. Nat. Struct. Mol Biol, 11(9), 800-802.

206. Ъ1 Prakash S., Tian L., Ratliff K.S., Lehotzky R.E., Matouschek A. (2004) An unstructured initiation site is required for efficient proteasome-mediated degradation. Nat. Struct. Mol Biol, 11(9), 830837.

207. Kenniston J.A., Baker T.A., Fernandez J.M., Sauer R.T. (2003) Linkage between ATP consumption and mechanical unfolding during the protein processing reactions of an AAA+ degradation machine. Cell, 114(4), 511-520.

208. Burton R.E., Baker T.A., Sauer R.T. (2003) Energy-dependent degradation: Linkage between ClpX-catalyzed nucleotide hydrolysis and protein-substrate processing. Protein Sci., 12(5), 893-902.

209. Barret A.J., Rawlings N.D., O'Brien E.A. (2001) The MEROPS database as a protease information system. J. Struct. Biol, 134(2-3), 95-102.

210. Handbook of Proteolytic Enzymes. (1998) Barrett, A.J., Rawlings, N.D., and Woessner, J.F. (Eds), Acad. Press, London.

211. Америк А.Ю., Чистякова Jl.Г., Остроумова Н.И., Гуревич А.И., Антонов В.К. (1988) Клонирование, экспрессия и структура функционально активного укороченного гена lon Escherichia coli. Биоорган, химия, 14(3), 408-411 .

212. Америк А.Ю., Антонов В.К., Остроумова Н.И., Ротанова Т.В., Чистякова Л.Г. (1990) Клонирование, структура и экспрессия полноразмерного гена lon Escherichia coV кодирующего АТР-зависимую La-протеинэзу. Биоорган, химия, 16(7), 869-880.

213. Chin D.T., GoffS.A., Webster Т., Smith Т., Goldberg A.L. (1988) Sequence of the lon gene in Escherichia coli. A heat-shock gene which encodes the ATP-dependent protease La. J. Biol. Chem. 263(24), 11718-11728.

214. Котова C.A. Выделение и характеристика АТР-зависимой La-протеиназы из Escherichia coli. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, М.1994 г.

215. Ротанова Т.В., Котова С.А., Америк А.Ю., Лыков И.П., Гинодман Л.М., Антонов В.К. (1994) АТР-зависимая протеиназа La из Escherichia coli. Биоорган, химия, 20(2), 114-125.

216. Waxman L., Goldberg A.L. (1982) Protease La from Escherichia coli hydrolyzes ATP and proteins in a linked fashion. Proc. Nail. Acad. Sci. USA, 79(16), 4883-4887.

217. Zehnbauer B.A., Foley E.C., Henderson G.W., Markovitz A. (1981) Identification and purification of the Lon+ (capR+) gene product, a DNA-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78(4), 2043-2047.

218. Waxman L., Goldberg A.L. (1985) Protease La, the lon gene product, cleaves specific fluorogenic peptides in an ATP-dependent reaction. J. Biol. Chem., 260(22), 12022-12028.

219. Антонов В.К. Химия протеолиза. 2-е изд. М.: Наука. 1991. 504 с.t

220. Amerik A.Yu., Antonov V.K., Gorbalenya A.E., Kotova S.A., Rotanova T.V., Shimbarevich E.V. (1991) Site-directed mutagenesis of La protease. A catalytically active serine residue. FEBS Lett., 287(1-2), 211-214.

221. Walker J.E., Saraste M., Runswick M.J., Gay "N.J. (1982) Distantly related sequences in the alpha- and beta-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold. EMBOJ., 1(8), 945-951.278

222. Ротанова T.B. (1999) Структурно-функциональные особенности АТР-зависимой Lon-протеиназы из Escherichia coli. Биоорган, химия, 25(12), 883-891.

223. Patterson J., Vineyard D., Thomas-Wohlever J., Behshad R., Burke M., Lee 1. (2004) Correlation of an adenine-specific conformational change with the ATP-dependent peptidase activity of Escherichia coli Lon. Biochemistiy, 43(23), 7432-7442.

224. Charette M.F., Henderson G.W., Doane L.L., Markovitz A. (1984) DNA-stimulated ATPase activity on the lon (CapR) protein. J. Bacteriol, 158(1), 195-201.

225. Fu G.K., Smith M.J., Markovitz D.M. (1997) Bacterial protease Lon is a site-specific DNA-binding protein. J. Biol. Chem., 272(1), 534-538.

226. Liu Т., Lu В., Lee I„ Ondrovicova G„ Kutejova E., Suzuki C.K. (2004) DNA and RNA binding by the mitochondrial Lon protease is regulated by nucleotide and protein substrate. J. Biol. Chem. 279(14), 13902-13910.

227. Baker M.E. (1989) Location of enzymatic and DMA-binding domains on E. coli protease La. FEBS Lett., 244(1), 31-33.

228. Lee A.Y., Hsu C.H., Wu S.H. (2004) Functional domains of Brevibacillus thermoruber Lon protease for oligomerization and DNA binding: role ofN-terminal and sensor and substrate discrimination domains. J. Biol. Chem., 279(33), 34903-34912.

229. StarkovaN.N., Koroleva E.P., Rumsh L.D., Ginodman L.M., Rotanova T.V. (1998) Mutations in the proteolytic domain of Escherichia coli protease Lon impair the ATPase activity of the enzyme. FEBSLett.,422(2), 218-220.

230. Ротанова T.B., Мельников Э.Э., ЦирульниковК.Б. (2003) Каталитическая диада Ser-Lys в активном центре АТР-зависимой Lon-протеиназы Escherichia coli. Биоорган, химия, 29(1), 9799.

231. Ротанова Т.В. (2002) Пептидгидролазы с каталитической диадой Ser-Lys. Сходство и различия активных центров АТР-зависимых Lon-протеиназ, репрессоров LexA, сигнальных пептидаз и протеиназ С-концевого процессинга. Вопр. мед. химии, 48(6), 541-552.

232. Paetzel M., Dalbey R.E. (1997) Catalytic hydroxyl/amine dyads within serine proteases. Trends Biochem. Sci., 22(1), 28-31.

233. Birghan C., Mundt E. Gorbalenya A.E. (2000) A non-canonical Lon proteinase lacking the ATPase domain employs the Ser-Lys catalytic dyad to exercise broad control over the life cycle of a double-stranded RNA virus. EMBOJ., 19, 114-123.

234. Lejal N., Da Costa В., Huet J.C., Delmas B. (2000) Role of Ser-652 and Lys-692 in the protease activity of infectious bursal disease virus VP4 and identification of its substrate cleavage sites. J. Gen. Virol, 81,983-992.

235. Wagner 1., van Dyck L., Savel'ev A.S., Neupert W., Langer T. (1997) Autocatalytic processing of the ATP-dependent PIM1 protease: crucial function of a pro-region for sorting to mitochondria. EMBOJ., 16(24), 7317-7325.

236. Ward D.E., Shockley K.R., Chang L.S., Levy R.D. Michel IK., Conners S.B., Kelly R.M. (2002) Proteolysis in hyperthermophilic microorganisms. Archaea, 1, 63-74.-)QO

237. Fukui Т., Eguchi Т., Atomi H., Imanaka T. (2002) A membrane-bound archaeal Lon protease displays ATP-independent proteolytic activity towards unfolded proteins and ATP-dependent activity for folded proteins. J. Bacteriol, 184, 3689-3698.

238. Besche H., Tamura N., Tamura Т., Zwickl P. (2004) Mutational analysis of conserved AAA+ residues in the archaeal Lon protease from Thermoplasma acidophilum. FEBS Lett., 574, 161-166.

239. Besche H, Zwickl P. (2004) The Thermoplasma acidophilum Lon protease has a Ser-Lys dyad active site. Eur. J. Biochem, 271(22), 4361-4365.

240. Rawlings N.D, Barrett A.J. (1994) Families of serine peptidases. Methods Enzymol, 244, 19-61.

241. Silber K.R, Keiler K.C, Sauer R.T. (1992) Tsp: a tail-specific protease that selectively degrades proteins with nonpolar С termini. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(1), 295-299.

242. Keiler K.C, Sauer R.T. (1996) Sequence determinants of C-terminal substrate recognition by the Tsp protease. J. Biol. Chem., 271(5), 2589-2593.

243. Bencini D.A, Wild J.R, O'Donovan G.A. (1983) Linear one-step assay for the determination of orthophosphate. Anal. Biochem. 132(2), 254-258.

244. Fischer H, Glockshuber R. (1993) ATP hydrolysis is not stoichiometrically linked with proteolysis in the ATP-dependent protease La from Escherichia coli. J. Biol Chem., 268(30), 22502-22507.

245. Goldberg A.L, Waxman L. (1985) The role of ATP hydrolysis in the breakdown of proteins and peptides by protease La from Escherichia coli. J. Biol. Chem., 260(22), 12029-12034.

246. Lemasters J.J, Hackenbrock C.R. (1977) Kinetics of product inhibition during firefly luciferase luminescence. Biochemistry, 16(3), 445-447.

247. Menon A.S, Goldberg A.L. (1987) Binding of nucleotides to the ATP-dependent protease La from Escherichia coli. J. Biol. Chem., 262(31), 14921-14928.

248. Menon A.S, Goldberg A.L. (1987) Protein substrates activate the ATP-dependent protease La by promoting nucleotide binding and release of bound ADP. J. Biol. Chem., 262(31), 14929-14934.

249. Smith C.K, Baker T.A, Sauer R.T. (1999) Lon and Clp family proteases and chaperones share homologous substrate-recognition domains. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96(12), 6678-6682.

250. Swamy K.H., Goldberg A.L. (1981) £ coli contains eight soluble proteolytic activities, one being ATP dependent. Nature, 292(5824), 652-654.

251. Higashitani A., Ishii Y., Kato Y., Koriuchi K. (1997) Functional dissection of a cell-division inhibitor, SulA, of Escherichia coli and its negative regulation by Lon. Mol. Gen. Genet., 254(4), 351-357.

252. Цирульников К.Б., Мельников Э.Э., Ротанова Т.В. (2003) Протеолиз, сопряженный с гидролизом АТР. Регуляция активности протеолитических центров Ьоп-протеиназы Escherichia coli. Биоорган, химия, 29 (5), 486-494.

253. Luo Y., Pfuetzner R.A., Mosimann S., Paetzel M., Frey E.A., Cherney M., Kim В., Little J.W., Strynadka N.C. (2001) Crystal structure of LexA: a conformational switch for regulation of self-cleavage. Cell, 106(5), 585-594.

254. Paetzel M., Dalbey R.E., Strynadka N.C. (2002) Crystal structure of a bacterial signal peptidase apoenzyme: implications for signal peptide binding and the Ser-Lys dyad mechanism. J. Biol. Chem., 277(11), 9512-9519.

255. Peat T.S., Frank E.G., McDonald J.P., Levine A.S., Woodgate R„ Hendrickson W.A. (1996) Structure of the UmuD' protein and its regulation in response to DNA damage. Nature, 380(6576), 727-730.

256. Bell C.E, Frescura P, Hochschild A, Lewis M. (2000) Crystal structure of the lambda repressor C-terminal domain provides a model for cooperative operator binding. Cell, 101(7), 801-811.

257. Dodson G, Wlodawer A. (1998) Catalytic triads and their relatives. Trends Biochem. Sci., 23(9), 347-352.

258. Kraut J. (1977) Serine proteases: structure and mechanism of catalysis. Annu. Rev. Biochem., 46, 331-358.

259. Frigerio F, Coda A, Pugliese L, Lionetti C, Menegatti E, Amiconi G, Schnebli H.P, Ascenzi P, Bolognesi M. (1992) Crystal and molecular structure of the bovine a-chymotrypsin egiin с complex at 2.0 A resolution. J. Mol. Biol, 225(1), 107-123.

260. Wlodawer A, Li M, Dauter Z, Gustchina A, Uchida K, Oyama H, Dunn B.M, Oda K. (2001) Carboxyl proteinase from Pseudomonas defines a novel family of subtilisin-like enzymes. Nat. Struct. Biol, 8(5), 442-446.

261. Wlodawer A, Li M, Gustchina A, Oyama H, Dunn B.M, Oda K. (2003) Structural and enzymatic properties of the sedolisin family of serine-carboxyl peptidases. Acta Biochim. Pol., 50(I),81-102.

262. James M.N.G. (1994) in Proteolysis and Protein Turnover (Bond J.C. and Barrett A.J, eds). Portland Press, Brookfield, VT, pp. 1-8.

263. Paetzel M, Dalbey R.E, Strynadka N.C. (1998) Crystal structure of a bacterial signal peptidase in complex with a beta-lactam inhibitor. Nature, 396(6707), 186-190.

264. Li M., Rasulova F., Melnikov E.E., Rotanova T.V., Gustchina A., Maurizi M.R., Wlodawer A. (2005) Crystal structure of the N-terminal domain of E. coli Lon protease. Protein Sci., 14(11), 2895-2900.

265. Sambrook J., Fritish E.F., Manniatis T. (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. NY.

266. Dayhoff M.O. (1972) Atlas of protein sequence and structure. Natl. Biom. Res. Foundation. Washington D. C.

267. Зз4 Практическая химия белка. Ред. А. Дарбре. Москва. «Мир». 1989. 621 стр.

268. Bradford М.М. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248-254.

269. J36 Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(5259), 680-685.

270. Aciba Acinetobacter sp. Mycpn - Mycoplasma pneumoniae

271. Agrtu Agrobacterium tumefaciens Myxxa - Myxococcus xanthus

272. Aquae Aquifex aeolicus Nemen - Neisseria meningitidis

273. Azobr Azospirillum brasilense Oceih - Oceanobacillus iheyensis

274. Bacbr Brevibacillus choshinensis Pasmu - Pasteurella multocida

275. Bacsu Bacillus subtilis Psaer - Pseudomonas aeruginosa

276. Bahal Bacillus halodurans Psflu - Pseudomonas fluorescens

277. Borbu Borrelia burgdorferi Pssyr - Pseudomonas syringae

278. Brthe Brevibacillus thermoruber Ralso - Ralstonia solanacearum

279. Bruab Brucella abortus Rhime - Rhizobium meliloti

280. Brume Brucella melitensis Ricco - Rickettsia conorii

281. Brusu Brucella suis Ricpr - Rickettsia prowazekii

282. Bucai Buchnera sp. APS Salen - Salmonella enterica

283. Bucap Buchnera aphidicola Salty - Salmonella typhimurium

284. Camje Campylobacter jejuni Sheon - Shewanella oneidensis

285. Caucr Caulobacter crescentus Shifl - Shigella flexneri

286. Chlmu Chlamydia muridant Thmar - Thermotoga maritima

287. Chlpn Chlamydia pneumoniae Thete - Thermoanaerobacter tengcongensis

288. Chltr Chlamydia trachomatis Ththe - Thermits thermophilic

289. Cloac- Clostridium aceiobut):licum Trepa Treponema pallidum

290. CI ope Clostridium perfringens UrepI - Ureaplasma pannim

291. Derad Deinococcus radiodurans Vibpa - Vibrio parahaemolyticus

292. Ecoli- Escherichia coli Vibch Vibrio cholerae

293. Erwam Erwinia amylovora IVigbr - Wigglesworthia brevipalpis

294. Haein Haemophilus influenzae Xanax -Xanthomonas axonopodis

295. Helpj Helicobacter pylori J99 Xanca - Xanthomonas campestris

296. Helpy Helicobacter pylori Xyfas -Xylella fastidiosa

297. Mezlo Mesorhizobhim loii Yerpe - Yersinia pestis

298. Mycge Mycoplasma geniialium Zymob - Zymomonas mobilis

299. Mycsm Mycobacterium smegmatis1. Архебактерни

300. Metac Methanosarcina acetivorans Metma - Methanosarcina mazei

301. Metba Methanosarcina barkeri1. Эукарноты

302. Arath Arabidopsis thaliana Musmu - Mus musculus

303. Caeel Caenorhabditis elegans Parbr - Paracoccidioides brasiliensis

304. Dichl Dichanthelium lanuginosum Ratno - Rattus norvegicus

305. Drome Drosophila melanogaster Schpo - Schizosaccharomyces pombe

306. Human Homo sapiens Spiol - Spinacia oleracea

307. Maize Zea mays Yeast - Saccharomyces cerevisiae1. Подсемейство LonB1. Архебактерни

308. Arcfu Archaeoglobus fulgidus Metth - Methanobacterium thermoautotrophicum

309. Ferae Ferroplasma acidarmanus Pyrab - Pyrococcus abyssi

310. Halnl- Halobacterium sp. (strain NRC-1) Pyrfu Pyrococcus furiosus

311. Metac Methanosarcina acetivorans Pyrho - Pyrococcus horikoshii

312. Metba Methanosarcina barkeri Pyrko - Pyrococcus kodakaraensis

313. Metja Methanocaldococcus jannaschii Theac - Thermoplasma acidophilum

314. Metma Methanosarcina mazei Thevo - Thermoplasma volcanium1. Бактерии

315. Ecoli Escherichia coli Thete - Thermoanaerobacter tengcongensis

316. Haein Haemophilus influenzae Vibch - Vibrio cholerae |

317. Psaer Pseudomonas aerugenosa Yerpe - Yersinia pestis

318. Thmar Thermotoga maritima |

319. Индексы последовательностей Ьоп-протеиназ в базе данных MEROPS

320. Источник № в MEROPS Ms Источник № в MEROPS j №№ Источник № в MEROPS1. Подсемейство LonA 1. S16.001

321. Ecoli MER00485 19 Bruab MER04081 37 Psaer MER13631

322. Erwam MER01854 20 Brume MER 16826 38 Wigbr MER22332-> j Salen MER15901 21 Rhime MER06310 39 Ricpr MER04853

323. Salty MER19173 22 Mezlo MER13944 40 Myxxa MER00489

324. Shifl MER22207 23 Agrtu MER14845 41 Bacbr MER00486

325. Yerpe MER15528 24 Azobr MER01922 41a Brthe MER28409

326. Pasmu MER14272 25 Nemen MER11561 42 Bacsu MER00487

327. Vibch MER13793 26 Xanax MER19521 43 Aquae MER04291

328. Sheon MER22360 27 Xanca MER 19484 44 Zymob MER06062

329. Vibpa MER02633 28 Derad MER 11632 45 Cloac MER 14 944

330. Haein MER01855 29 Xyfas MER11927 46 Clope MER16919

331. Bucap MER 19922 30 Caucr MER02686 47 Thmar MER05473

332. Bucai MER14152 31 Ththe MER06064 76a Metma MER19389

333. Ralso MER 17422 32 Camje MER04637 76b Metac MER17669

334. Psflu MER06061 л ^ jj Helpy MER03852 I 76c Metba MER25812

335. Pssyr MER03937 34 Helpj MER04637 | 48 Ricco MER15975

336. Aciba MER04647 35 Bahal MER13686 49 Thete MER19291

337. Brusu MER22170 36 Oceih MER219601. S16.002

338. Drome MER11218 55 Yeast MER00496 ! 60 Arath4 MER11057

339. Musmul MER 17095 56 Chlpn MER11660 61 Arath5 MER11056

340. Ratno MER17098 57 Chlmu MER11889 62 Maize2 MER04077

341. Human 1 MER00495 58 Chltr MER04519 63 Schpo MER02048

342. Caeel MER04130 59 Arath2 MER034421. SI 6.003

343. Arathl MER04594 66 Spiol MER03443

344. Maize 1 MER03530 67 Dichl MER 165 821. SI 6.004

345. Urepl MER11088 69 Mycge MER00488 70 Mycpn MER040761. SI 6.006

346. Human2 MER14970 72 Musmu2 MER160851. S16.00X

347. Trepa MER04543 75 Borbul MER02224 78 Parbr MER26305

348. Borbu2 | MER04236 77 Mycsm MER041471. Подсемейство LonB 1. S16.005

349. Pyrab MER06309 6 Thevo MER 13 946 11 Metba MER25817

350. Pyrho MER04506 7 Theac MER13848 12 Metth MER26292-> j Pyrfu MER17402 8 Ferae MER26292 13 Metja MER03359

351. Pyrko MER20049 9 Metma MER19361 14 Halnl MER13822

352. Arcfu MER03868 10 Metac MER176711. S16.00X

353. Thete MER20277 17 Ecoli MER03018 19 Thmar MER05474

354. Haein MER01856 18 Psaer MER13768 20 Vibch MER137991. S16. № Источ- АТ- Сник АК АК

355. Ecoli 1 MNPERSERIE IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIRCL 40

356. Ег warn 1 MNPERSERIE IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIRCL 40

357. Salen 1 MNPERSERIE IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIRCL 40

358. Salty 1 MNPERSERIE IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIRCL 40

359. Shlfl 1 MSSDY LAEIKLRESS MNPERSERIE IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIRCL 55

360. Yerpe 1 MNPERSERIE IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIRCL 40

361. Pasmu 1 MSAKKTQQQS IPVLPLRDVV VFPYMVMPLF VGRPKSIRSL 40

362. Vibch 1 MNLERSERIE IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIQCL 40

363. Sheon 1 MTLEP.EAHIE LPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIRCL 40

364. Vi bp a 1 MNLERSERIE IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSISCL 40

365. Haein 1 MAKNTQRT MPVLPLRDVV VFPYMVMPLF VGRAKSINAL 38

366. Bucap 1 MNSERSERIK IPVLPLRDVV VYPHMVIPLF VGRKKSIHCI 40

367. Bucai 1 MNSERSERIT IPVLPLRDVV IYPHMVIPLF VGRQKSIKCI 40

368. Ralso 1 MSG TQLLPAEQIR LPLLPLRDVV VFPHMVIPLF VGRPKSIKAL 43

369. Psflu 1 MKTTIE LPLLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIEAL 36

370. Pssyr 1 MKTTIE LPLLPLRDVV VYPHMVIPLF VGREKSIEAL 36

371. Aciba 1 MSENIMKV ETLEPQVQSV LPLLALRDVV VYPHMQIALF VGREKSINAV 48

372. Brusu 1 M TGIEQKTPVG GSETGGADGL YAVLPLRDIV VFPHMIVPLF VGREKSIRAL 51

373. Bruab 1 M TGIEQKTPVG GSETGGADGL YAVLPLRDIV VFPHMIVPLF VGREKSIRAL 51

374. Brume 1 MG RKARERTSVM TGIEQKTPVG GSETGGADGL YAVLPLRDIV VFPHMIVPLF VGREKSIRAL 62

375. Rhime 1 MTN KTSPATESAT YPVLPLRDIV VFPHMIVPLF VGREKSIRAL 43

376. Mezlo 1 MKGWTMA KISKAPSDGV FAVLPLRDIV VFPHMIVPLF VGREKSIRAL 47

377. Agrtii 1 MT NITSAASGGT YPVLPLRDIV VFPHMIVPLF VGREKSIRAL 42

378. Azobr 1 MKEAQ SMFEIPRGAL YPVPPLRDIV VFPHMIVPLF VGREKSVRAL 45

379. Wemen 1 MTQ KEKHFEEYAA. LATLPLRDVV VYPHMVLPLF VGRPKSIAAL 43

380. Xanax 1 MAQSQPEVLD LPVLPLRDVV VFPHMVIPLF VGRDKSMRAL 40

381. Xanca 1 MAQSQPEILD LPVLPLRDVV VFPHMVIPLF VGRDKSMRAL 40

382. Derad 1 MIWE LPVVALRNIV ILPGVTMNVD VGRPKSKRAV 34

383. Xyfas 1 MPEWP HNGAIGFSVA VNSMHYTGVL MTQSSQKTLD LQVLPLRDVV VFPYMVIPLF VGREKSMRAL 66

384. Caucr 1 MSELRT LPVLPLRDIV VFPHMVVPLF VGRDKSVRAL 36

385. Th the 1 MKDFLRLE LPVLPLRNTV VLPHTTTGVD VGRLKSKRAV 3 8

386. Camje 1 MQ IEEIQNYPAN LPVLVEDELF LYPFMITPIF INDSSNMKAL 42

387. Helpy 1 MTEDFPKI LPLLVEEDTF LYPFMIAPIF LQNNASIKAV 38

388. Helpj 1 MTEDFPKI LPLLVEEDTF LYPFMIAPIF LQNNASIKAV 38

389. Bahal 1 MAESVRRN IPLLPLRGLL VFPTMVLHLD VGRKKSVEAL 38

390. Ocexh 1 MTTEFKQ IPLLPLRGLL VFPSMVLHLD VGRDKSIASI 37

391. Psaer 1 M SDQDVNPEHI SDAQPAGTGL VLPGQTLPTT LYVIPIHNRP FFPAQVLPVI VNEEPWAETL 61

392. Wi gbr 1 MNPEHSQQID IPVLPLRDVV VYPHMVVPLF VGREKSIRCL 40

393. Ricpr 1 MNKKS LPLMALRDMV VFPGVIAPIF VGRKKSLQALSRTT

394. Myxxa 1 MFFGRDD KKEAQKRGLT VPLLPLRDII VFPHMVVPLF VGREKSIAALKDAMA

395. Bacbr 1 MGERSGKRE LPLLPLRGLL VYPTMVLHLD VGREKSIRAL 39

396. Br the 1 MGERSGKRE IPLLPLRGLL VYPSMVLHLD VGREKSVRAL 39

397. Bacsu 1 MAEELKRS IPLLPLRGLL VYPTMVLHLD VGRDKSVQAL 38

398. Aquae 1 MNELFQ TPQVEAGIKE YPLMPLRDIV IFPTMVQPLF VGRRFSIRAI 4645 Zymob

399. Cloac 1 MNQENKV LPLIPLRGLI VFPYMVVHFD VGRDKSIEAL 37

400. Clope 1 MKEDKLI LPLIPLRGLT VFPNMVIYFD VGREKSIEAV 37

401. Thmar 1 MS KKSKDTEKSF KILEKYASQQ EKELEIPDSL PCIPLRNGMG VFPNTVVPFY VGRTGSLIAL 62

402. Me tma 1 MY SEQTYGNRES LVMPLFDIVV YPRSRAKFLA DKVTGEILLN 42

403. Met ас MY TEQAENNRES LIMPLFEVVV YPKGRAKFLA DKVTGEILLA 42

404. Metba 1 MRRLTMY PEQPDENRES IVMPLFEVVV YPKSRAKFLA DKVTGEILLN 47

405. Ricco 1 MM iiKKSLPLMAL RDMVVFPGVI APIFVGRPKS LQALSHTTIS 42

406. Caeel 96 RYPLFPGFIK KVDIVKDDNL KALIRRQLSL KQPYAGVFVK RDDENKEETI TSLSEVYPTG SFVQIIEVRD QGSVLELVLS AHRRIRALEP IDEITPKNET 195

407. Yeast 207 VMKAIKEMLD RQQPYIGAFM LKNSEEDTDV ITDKNDVYDV GVLAQITSAF PSKDEKTGTE TMTALLYPHR RIKIDELFPP NEEKEKSKEQ AKDTDTETTV 306

408. Chlpn 1 MDSTTN SDSPILDPNP EDVEKLLDES EEESEDQSTE P.LI.PSELFIL PI.NKRPFFPG MAAPILIESG PYYEVLKVLA KSSQKYIGLV LTKKENADIL 96

409. Chlmu 1 MNSTNN TDSQNLDPNA SEVEKLLDES AEAEEKTD-D HTPPSELFIL PLNKRPFFPG MAAPLLIEAG PHYEVLTLLA KSSQKHIGLV LTKKEDANTL 95

410. Ch i tr 1 MNSTNN TDSQNLDPNA SEVEKLLDES AEAEEKVD-D HTPPSELFIL PLNKRPFFPG MAAPLLIEAG PHYEVLTLLA KSSQKHIGLV LTKKEDANTL 95

411. Ara th2 46 TSLGHRAFFC SEPTNGEAAA EAETKAVESD SEVSDSKSSS AIVPTNPRPE DCLTVLALPV PHRPLFPGFY MPIYVKDPKV LAALQESRRR QAPYAGAFLL 145

412. ArathA 25 PVKNLLFKQL TLLTGWNRSS YELGRRSFSS DLDSDTKSST TTVSAKPHLD DCLTVIALPL PHKPLIPGFY MPIYVKDPKV LAALQESRRQ QAPYAGAFLL 124

413. Arath5 58 LLLFRAPTQL TGWNRSSRDL LGRRVSFSDR SDGVDLLSSS PILSTNPNLD DSLTVIALPL PHKPLIPGFY MPIHVKDPKV LAALQESTRQ QSPYVGAFLL 157

414. Maize2 37 RFCSNSSASD TEAAVAEAEA KAEDASAAEG EADSKASSAI VPTSTNIDDC LSVIALPLPH RPLFPGFYMP INVKDQKLLQ ALIENRKRSA PYAGAFLVKD 136

415. Schpo 162 LLALPIARRP LFPGFYKAIV TKNPSVSEAI KELIKKRQPY IGAFLLKDEN TDTDVITNID QVYPVGVFAQ ITSIFPAKSG SEPALTAVLY PHRRIRITEL 261003 68 Arathl 1 M AETVELPSRL AILPFRNKVL LPGAIIRIRC TSHSSVTLVE QELWQKEEKG LIGILPVRDD AEGSSIGTMI NPGAGSDSGE RSLKFLVGTT 91

416. Malzel 1 MS DSPVELPSRL AVLPFRNKVL LPGAIVRIRC TNPSSVKLVE QELWQKEEKG LIGVLPVRD- SEATAVGSLL SPGVGSDSGEG GSKVGGSAVE 92

417. Spiol 1 M AEAVELPSRL GILAFRNKVL LPGAIIRIRC TSPSSVKLVE QELWQREEKG LIGIVPVRDA SESASVAPVL YPGGGTDSGE RNVKSQPGLS 91

418. Dichl 1 MA DSPVELPGRL AILPFRNKVL LPGAIVRIRC TNPSSVKLVE QELWQKEEKG LIGVLPVRD- SEAAAVGSLL SPGVGSDSGE GGSKAGGSGE 91004 72 Urepl 1 MKKPILISRA IVVLPYETTT IEVGRPKSIQ AIDLAKQSSS KEIIIISQKD 50

419. Mycge 1 MPV TKKSQILVVR GQVIFPFVPF SLDVGRPRSR KIIKALKTLK TKRLVLVTQK 53

420. Mycpn 1 MPA VKKPQILVVR NQVIFPYNGF ELDVGRERSK KLIKALKNLK TKRLVLVTQK 53006 75 Human\2

421. Musmu2 1 MSSVSPIQI PSRLPLLLTH ESVXLPGSTM RTSVDTARNL QLVRSRLLKG TSLQSTILGV 59

422. ООХ 77 Trepa 24 AVENPSASAV SDGEERATFA PEVAPQTDTE SAQGAAQESE PEVQRAGEAE KGVPEKAKAV VPLDELLPQK VHLIPLTGRP IYPGIFTPLL IS DEDDVRS V 123

423. Borbu2 1 MQLKNLGQK SYMKSILNMI KNRKEDLPIV ILKENVLFPN ITLWVTFDNE YVINSIAQSM 59

424. Borbul 1 M DESKKARSGD KKKEKAVAGI LPHSNKPARV PLIAVPSHPV FPGMFIPIVL ISDSDMKAID YAMKGNGIIA 71

425. Mycsm 1 MAEAKT VPVLFLNDSI VLPGMVVPIE 26

426. MAAST GYVRLWAAAR MAAST GYVRLWAAAR

427. VRLWGAARCW VLRRPMLAAA MYRAG AVLLRGATRT

428. TKTLSTVART TRAIQYYRSI KDEDVKIVPD EKDTDNDVEP

429. CWVLRRPLLA VTGGRVPSAS CWVLRRPLLA VTGGRVPSAS

430. GGRVRTAAGA WLLRGQRTCD RLLAAASAHQ SFATFSQRNQ

431. AKTAAVSQRR FASTLTVRDV TRDDEIVNKD QEGEASKNSP.

432. NKPLDNKNDP KKTHNEDESH TNESLPSTDK KKKKDNDDFK