Разработка новых липидных зондов на основе производных дипиррометена для исследования мембран тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

Болдырев Иван Александрович

РАЗРАБОТКА НОВЫХ ЛИПИДНЫХ ЗОНДОВ НА ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНЫХ ДИПИРРОМЕТЕНА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕМБРАН

02 00 10 — биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

003163ЭВА

Москва - 2008

су

003163984

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Научный руководитель

доктор химических наук Молотковский Ю Г

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор,

Безуглов В В

кандидат химических наук, Маслов М А

Ведущая организация

Институт физической химии и электрохимии им А Н Фрумкина РАН

Защита состоится 30 января 2008 г в IV ч на заседании Специализированного совета Д 002 019 01 при Институте биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН по адресу 117991 ГСП-7, Москва В-437, ул Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Автореферат разослан "АЛ! декабря 2007

Ученый секретарь Специализированного совета доктор физико-математических наук

Олейников В А

Характеристика работы

Актуальность темы Открытие рафтов в составе мембран позволило по-новому взглянуть на известную проблему современной мембранологии -зависимость функционирования мембранных белков от липидного состава мембран Известно, что механические взаимодействия бислоя (липидного окружения) с молекулой белка могут быть опосредованы изменением напряжения изгиба мембраны, стремлением бислоя и белка уменьшить гидрофобное несоответствие (разницу между протяженностью гидрофобного участка белка и толщиной гидрофобной области бислоя), а также изменением профиля латерального давления

Для каждого из перечисленных механизмов известны примеры, однако их сложно формализовать Например, может быть установлено, что изменение конформации белка было вызвано изменением профиля латерального давления, но неизвестно каким был этот профиль до и после изменения конформации Инструментом для изучения свойств мембраны на разном расстоянии от поверхности бислоя может быть набор флуоресцентных липидных зондов, у которых флуорофор находится на разной глубине внутри мембраны Латеральное давление внутри бислоя определяется подвижностью метиленовых групп жирнокислотных цепей Мерой этой подвижности выступает анизотропия флуоресценции метки

Разработка набора флуоресцентных липидных зондов предназначенных для изучения свойств мембран на разном расстоянии от поверхности бислоя - актуальная задача мембранологии Их применение необходимо для выработки и уточнения теоретических моделей

Цель работы Задачей исследования была разработка набора флуоресцентных липидных зондов для изучения свойств биологических и модельных мембран на разном расстоянии от поверхности бислоя С этой целью необходимо было подобрать флуорофор, синтезировать набор зондов на его основе, исследовать спектральные характеристики новых зондов и их поведение в мембране Кроме того, важно было показать применимость нового набора зондов для решения поставленных задач

Объем работы Диссертационная работа изложена на 118 страницах

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержит 16 иллюстраций и 2 таблицы

Научная новизна и практическая ценность Разработан набор флуоресцентных липидных зондов для изучения свойств бислоя на разном расстоянии от его поверхности Флуорофор (BODIPY, 4,4-дифтор-4-бора-ЗаДагдиаза-Б-индацен) в новых зондах присоединен к 3-, 5-, 7-, или 9-ому атому углерода sn-2 ацильной цепи Изучение поведения новых зондов в мембранах и монослоях показало, что флуорофор у всех зондов полностью погружен в бислой и находится так глубоко, как позволяет ацильная цепь, а также что искажения вносимые зондами в мембрану незначителны и при концентрациях метки менее 1% пренебрежимо малы

Показано, что анизотропия флуоресценции новых зондов зависит от глубины погружения метки в бислой Характер изменения анизотропии флуоресценции по толщине мембраны во многом соответствует характеру изменения латерального давления в гидрофобной области бислоя, однако для получения строгой зависимости между подвижностью метки и латеральным давлением требуются дальнейшие исследования

Новые зонды позволят дифференцированно изучать свойства биологических и модельных мембран на разной глубине внутри бислоя Такие исследования позволят составить более точное представление о строении различных доменов мембран и свойствах мембранных фаз При изучении влияния свойств мембран на функционирование мембранных белков новый набор зондов позволит получить качественно новую информацию о состоянии системы Например, станет возможным следить за изменением профиля латерального давления одновременно с наблюдением за активностью белка

Апробация работы Основные материалы работы были представлены на 51 съезде Биофизического общества США (Baltimore, USA 2007), VIII чтениях памяти акад. Ю.А Овчинникова (Москва, 2006 г,), 50 съезде Биофизического общества США (Salt-Lake-City, USA 2006) и XVIII Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2006 г)

Публикации По теме диссертации опубликовано 3 статьи

Содержание работы

В соответствии с целью работы необходимо было выбрать флуоро-фор, разработать структуру зондов, синтезировать их, изучить спектральные свойства, поведение в модельных мембранах и показать применимость новых зондов для изучения свойств мембран на разном расстоянии от поверхности бислоя

Выбор флуорофора

В качестве основного характеристического параметра состояния флуорофора в мембране предлагается использовать анизотропию флуоресценции Основное влияние на анизотропию флуоресценции метки оказывает ее подвижность Подвижность в свою очередь зависит от свойств среды В данном случае - от подвижности метиленовых групп ацильных цепей вблизи молекулы флуорофора Свойства мембраны на разной глубине внутри бислоя определяются подвижностью ацильных цепей на этой глубине Для установления зависимости между свойствами мембраны и анизотропией флуоресценции метки, необходимо, чтобы последняя зависела только от подвижности флуорофора Другие возможные причины деполяризации эмиссии зонда (снижения анизотропии) - влияние растворителя, наличие акцепторов индуктивно-резонансного переноса энергии (ИРПЭ) или тушителей флуоресценции Вместе с обычным требованием, как можно меньше искажать упаковку липидов в бислое, необходимость ограничить влияние сторонних факторов на анизотропию флуоресценции привела к выбору в качестве флуорофора для новых зондов ВОБ1РУ-группы ВСШ1РУ обладает отличными спектральными характеристиками (узкие длинноволновые максимумы поглощения и испускания, высокая фотоустойчивость, высокие квантовый выход и коэффициент экстинкции, независимость параметров флуоресценции от полярности окружения) Собственно, ВСЮ1РУ - целое семейство флуорофоров, различающихся заместителями в положениях 1, 3, 5, 7 и 8 (2- и 6-заместители, как и отсутствие заместителей, снижают

Рис 1 Синтез флуоресцентных зондов и другие зонды, применявшиеся в работе

квантовый выход флуоресценции) и местом присоединения к молекуле-носителю (Treibs, Kreuzer, 1968, Karolme et al 1994, Johnson et al 1991)

Для меньшего искажения мембраны требуется метка как можно меньшего размера Это ограничивает выбор метильными производными BODIPY Среди всех возможных таких производных у 1,3,5,7-тетраметил-BODIPY группы, из-за высокой симметрии, разница между дипольными моментами поглощения и испускания наименьшая, что приводит к наименьшей зависимости спектральных свойств флуорофора от полярности окружения

BODIPY-группа обладает небольшой полярностью, и было показано, что у ряда BODIPY меченых липидов флуорофор способен всплывать к поверхности мембраны Четыре метальные группы должны снизить полярность флуорофора и способствовать его локализации в гидрофобной области бислоя (Johnson et al, 1991, Kaizer, London 1998)

Схема синтеза

Ключевые соединения для синтеза зондов, w-(Me4-BODIPY-8)жирные кислоты (XVI-XVII), были получены на основе модифицированного нами метода, описанного ранее (Burhart et al, 1999)- конденсация хлорангидридов монометиловых зфиров двухосновных кислот (I—IV) с 2,4-диметилпирролом (V) привела к нестойким дипиррометеновым производным (VI-IX), которые без очистки, действием эфирата трехфтористого бора и триэтиламина превращали в эфиры (X-XIII) искомых кислот

Фосфатидилхолины (ВЗ-РС — В9-РС) (Рис 1), ацилированные в sn-2-положении остатками всех четырех меченых кислот, были синтезированы стандартным способом - ацилированием лизофосфатидилхолина, полученного из яичного фосфатидилхолина, соответствующей кислотой в присутствии дициклогексилкарбодиимида Кроме этого, мы синтезировали также сфингомиелин (B7-SM) и галактозилцерамид (B7-GC) с остатком Ме4-ВОБ1РУ-8-гептановой кислоты (Рис 1), эти зонды также получены стандартным способом - путем N-ацилирования ВОР-эфиром кислоты (XVI) сфингозин- 1-фосфохолина (XIX) и l-O-ß-D-галактозилсфингозина (XX) соответственно

Спектральные свойства зондов

Рис 2 Нормализованные спектры возбуждения (Хет 510 нм) и испускания (\ех 480 нм) Me^-BODIPY-8-зондов А) В7-РС липосомах из DMPC (04 мг/мл) в PBS, молярное соотношение зонд-липид, 1 1000, при 37°С, Б) 1, эфир XII, 5% раствор (w/v, в капиллярах диаметром 0 5 мм) в хлороформе, при 20 °С (подробности в тексте), 2-4, В7-РС в липосомах из 1-палъмитоил-2-олеоилфосфатидилхолина (РОРС) в PBS, при 20 °С 01% молън зонда, концентрация липидов 0 8 мг/мл (2), 5 молън % зонда, концентрация липидов 0 02 мг/мл (3), 10% молън зонда, концентрация липидов 0 008 мг/мл (4)

Спектры поглощения и флуоресценции полученных зондов и соответствующих кислот практически идентичны и соответствуют характеристическим спектрам производных Ме4-В001РУ-8-флуорофора максимум поглощения при 498 нм (е = 8—10 104 М~1см~1 в этаноле) Спектр флуоресценции (максимум возбуждения 497-498 нм, максимум испускания 506-

508 нм) типичен для В001РУ-производных (КагоИпе et а1,1994) Спектры возбуждения и испускания для В9-РС в липосомах из дипальмитоилфос-фатидилхолина (БИРС) показаны на Рис 2 Спектры флуоресценции других описанных зондов снятые в растворителях различной полярности (не показаны) практически не отличаются друг от друга, что согласуется со сведениями о малой зависимости флуоресценции ВОБ1РУ от полярности окружения Квантовые выходы полученных Ме4-ВОБ1РУ-8-производных отдельно не определялись, но сравнительные измерения интенсивностей флуоресценции кислот ХР/-ХУН и известных ВОБ1РУ-зондов аналогичного строения фирмы Тпуйгс^еп, (квантовый выход ~0 9) показали, что отличия между ними незначительно Отличие Ме4-ВОБ1РУ-8-флуорофора от несимметричных аналогов, например, Ме2-ВОВ1РУ-3-флуорофора - отсутствие пика в спектре испускания в районе 630 нм Этот пик появляется при большой концентрации ВОБ1РУ производных (БаЬт et а1, 2002) и обусловлен эмиссией возбужденных димеров ВОШРУ (т н димеры типа И)(М1кЬа1уоу et а1, 2002) Это объясняется малой склонностью Ме4-В001РУ-8-флуорофора к димеризации

Чтобы исследовать возможность образования полученными Ме4-В001РУ-8-производными флуоресцирующих димеров, следовало снять спектр флуоресценции концентрированного раствора зонда. Спектры возбуждения и испускания 5% (~0 13М) раствора эфира XII в хлороформе показаны на Рис 2 (Б, 1) Максимум спектра возбуждения сдвигается в красную область (~4 нм) по сравнению со спектром разбавленного флуо-рофора в БМРС (Рис 2, А) При большой концентрации Ме4-ВОБ1РУ-8 в растворе спектр испускания значительно искажается Кроме сдвига максимума испускания с 506-508 на 518 нм, появляется дополнительный пик в области ~540 нм (Рис 2, Б, 1) Это является следствием перекрывания спектров возбуждения и испускания, так как расчетное значение поглощения превышает 500 о ед даже при длине оптического пути 0 05 см Свет, уже излученный одними молекулами флуорофора в области 500 нм, снова поглощается другими молекулами и вновь испускается но уже в области 540 нм

В спектре отсутствует пик в области 620-630 нм, характерный для

эмиссии ВСЮ1РУ-димеров Влияние высокой концентрации Ме4-В001РУ-8 на спектры флуоресценции В7-РС в липосомах из РОРС, содержащих 0 1, 5 и 10% мольн зонда исследовали на образцах с практически одинаковой оптической плотностью ~0 08 (Рис 2, Б, 2-4) Спектры образцов с молярным содержанием зонда 0.001 (2) и 0 05 (3) мало отличаются друг от друга и от спектра В7-РС 0 001% мольн в БМРС (Рис 2, А) В то же время при концентрации зонда 10% мольн наблюдается уширение спектра испускания (Рис 2, Б, 4) Пика в районе 620-630 нм нет и здесь, что еще раз демонстрирует отсутствие у Ме4-В(Ю1РУ-8 склонности к образованию флуоресцирующих димеров Относительно уширения спектра испускания нельзя сказать точно, вызвано ли оно эффектами внутренней фильтрации или образованием каких-либо неизвестных димеров ВОБ1РУ-группы

Положение флуорофоров в бислое Тушение флуоресценции йодидом натрия

Измеряя эффективность тушения флуоресценции можно оценить доступность флуорофора для молекул (ионов) тушителя (в данном случае йодида) Если флуорофор погружен в мембрану, константа тушения будет ниже константы тушения для флуорофора в растворе

Зависимость интенсивности флуоресценции метки от концентрации тушителя описывается формулой Штерна-Фольмера

- 1 + кд ■ т0 = 1 + Кду ■ [Я]

где Р0и Г- интенсивности флуоресценции в отсутствие и в присутствии тушителя, кд - бимолекулярная константа тушения, то - время жизни возбужденного состояния флуорофора в отсутствие тушителя, [<Э] - концентрация тушителя. Константа тушения Штерна-Фольмера определяется как кя то

Данные представляются в виде графических зависимостей Ро/Р от [<2] Линейный график Штерна-Фольмера обычно показывает наличие только одной популяции флуорофоров, где каждый флуорофор одинаково доступен для тушителя Если в системе существует две популяции флуо-

рофоров с разной доступностью, например, если часть флуорофоров находится в глубине бислоя, а часть всплывает к поверхности, график Штерна-Фольмера изгибается к абсциссе (Lakowicz, 1999)

Интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации флу-орофора только в очень разбавленных растворах На практике концентрация зонда берется достаточно малой, но основной вклад в оптическую плотность дает рассеяние света липосомами (Matsuzaki, 2000) Поэтому данные необходимо корректировать на эффект внутренней фильтрации.

Мы предложили простую методику корректировки эффекта внутренней фильтрации для построения графиков Штерна-Фольмера при тушении в липосомах Рассеяние света липосомами можно описать как дополнительный вклад в изменение интенсивности флуоресценции fd Тогда уравнение Штерна-Фольмера можно записать

Fo/Fq = Fo/F + fd

где Fq - флуоресценция незатушенного образца, F - искомая (истинная) флуоресценция затушенного и Fq - наблюдаемая флуоресценция затушенного образца

Для определения fd идентичный образец разбавляют раствором не содержащим тушителя, но обладающим такой же ионной силой и коэффициентом преломления как и раствор тушителя (для тушения флуоресценции йодидом контрольный образец разбавляется NaCl, такой же концентрации как и раствор Nal для основного образца) Процесс разбавления контрольного раствора, очевидно, также должен следовать уравнению Штерна-Фольмера

F0/Fc = 1 + /d

где Fc - флуоресценция контрольного образца (fo - исходная флуоресценция, одна для обоих образцов, головного и контрольного) Комбинирование обоих уравнений дает искомое

Fo/F = Fo/Fq-Fo/Fe + l = l + Ksv [Q]

Йодид эффективно тушит флуоресценцию BODIPY-флуорофоров и спосо-

Рис 3 Графики Штерна-Фольмера для тушения йодидом зондов ВЗ-РС, В5-РС, В7-РС и В9-РС в липосомах из А) РОРС при 17 °С, Б) РОРС при 37 °С, В) DMPC при 17 °С, Г) DMPC при 37 "С, Д) DMPC-холестерин, 7 3 моль/моль при 37°С, Е) Графики Штерна-Фольмера для тушения при 37 °С смеси зонда ВЗ-РС и кислоты XIV в липосомах из РОРС (верхний график), и ВЗ-РС в липосомах из РОРС (нижний график)

бен проникать в фосфолипидный бислой (Johnson et al, 1991) Этот небольшой умеренно гидратированный анион не приводит к заметному изменению бислоя при концентрации <0 5М Распределение йодида по толщине мембраны было рассмотрено несколькими исследовательскими группами. Общая точка зрения после установления равновесия (между внутренним и внешним водными объемами) образуется градиент концентрации I- (видимо, нелинейный) по толщине бислоя (Langner, Hui, 1991)

На рисунке Рис 3, (В,Г) показаны графики Штерна-Фольмера для тушения флуоресценции BODIPY в липосомах из DMPC при 17 °С и 37 °С Тушение флуоресценции также проводили в липосомах состава DMPC/холестерин (7 3) при 37 °С (Рис 3, Д) Такой состав был выбран потому, что смеси DMPC с холестерином с содержанием стерина >25-30% мольн образуют жидкую упорядоченную фазу (Lagane et al 2002) Однородность свойств бислоя в этом случае должна упростить интерпретацию результатов Такой же анализ был выполнен для зондов в липосомах из РОРС при 17 °С и 37 °С (Рис 3, А,Б) Тушение флуоресценции при 37 °С проводили для сравнения и для антрилвинил-меченого фосфатидилхоли-на AV12-PC (Рис 3, Б, формула флуорофора - рис 1), полученного ранее, чей неполярный флуорофор, как надежно доказано, глубоко погружен в бислой (Bergelson et al, 1985) Значения констант тушения K$v для данных представленных на рисунке Рис 3 приведены в таблице 1 В качестве дополнительного контроля в котором Ме4-ВОБ1РУ-8-флуорофор присутствует в системе в двух популяциях с различной доступностью для тушителя, была приготовлена суспензия липосом из РОРС с эквимолярными количествами зонда ВЗ-РС и водорастворимой кислоты XIV (Рис 3, Б), тушение только ВЗ-РС в липосомах из РОРС приведено на этом же рисунке. Флуоресценция BODIPY в бислоях йодидом тушится, хотя и гораздо менее эффективно, чем в водном растворе Графики Штерна-Фольмера для липосом с одним зондом (Рис 3, А-Д) - прямые (коэффициент корреляции >0 98 Отсутствие изгиба по направлению к абсциссе говорит о наличии в системах лишь одной популяции зондов Малая константа тушения - 1-4 в мембранах против 110 в водном растворе (неопубликованные данные) говорит о том, что эта единственная популяция флуорофоров находится внутри

Таблица 1 Значения констант тушения Ме4-ВОБ1РУ-8-зондов йодидом

Состав липосом, температура °С

Зонд DMPC DMPC DMPC/Chol, 7.3 РОРС РОРС

17 °С 37 °С 37 °С 17 °С 37 °С

ВЗ-РС 131 3 73 2 31 2 33 4 12

В5-РС 103 2 02 1 72 1 39 3 30

В7-РС 0 91 310 174 1 53 317

В9-РС 0 85 2 74 171 147 2 94

AV12-PC - - - - 0 89

бислоя, на максимальной глубине, которую позволяет ацильная цепь

Во всех случаях ВЗ-РС, у которого флуорофор находится на максимально близком к полярным головкам расстоянии, обладает наибольшей константой тушения К$у (Таблица 1) В тоже время Me4-BODIPY-8-флуорофор ВЗ-РС в липосомах сравнительно мало доступен для йодида Так, тушение флуоресценции образца со смесью ВЗ-РС в липосомах и кислоты XIV во внешнем водном объеме, происходит со значительно большей эффективностью и начальной K$v ~Ю 3 В этом случае (Рис 3, Е верхняя кривая) график Штерна-Фольмера изгибается к абсциссе по сравнению с тушением ВЗ-РС в липосомах (нижняя кривая), что подтверждает наличие в системе двух популяций флуорофора

Зонды В5-, В7- и В9-РС тушатся йодидом менее эффективно по сравнению с ВЗ-РС Причем вместе с последовательным уменьшением локальной концентрации I- по мере отдаления от поверхности бислоя уменьшается и значение K$v в соответствии с расстоянием между флуорофором и полярной головкой Это имеет место для тушения флуоресценции в липосомах из DMPC при 17 °С и РОРС при 37 °С (Рис 3, В,Б) В бислое из DMPC при 17 °С т е при температуре ниже фазового перехода Тт = 24 °С, значения К ¡¡у - наименьшие Наибольшие значения К$у получены для липосом из РОРС при 37 °С, т е при температуре значительно выше температуры фазового перехода Тт = -5 °С При температурах не значительно превышающих температуру фазового перехода (DMPC при 37 °С и РОРС при 17 °С) зависимость констант тушения от длины метиленовой

цепи, отделяющей флуорофор от полярной головки, носит более сложный характер Это можно объяснить более сложным распределением йодида

В липосомах, содержащих холестерин, значения Ksv для В5-, В7- и В9-РС близки в пределах экспериментальной ошибки Значения находятся между значениями для чистого DMPC в гелевой фазе (17 °С) и в жидкой неупорядоченной фазе (37 °С) Возможно это отражает наличие жидкой упорядоченной фазы в холестерин-содержащей системе

По сравнению со всеми BODIPY-зондами, тушение йодидом флуоресценции антрилвинильного зонда AV12-PC менее эффективно, что объясняется глубокой локализацией флуорофора Линейная зависимость на графике Штерна-Фольмера для AV12-PC зонда, показывает наличие только одной популяции флуорофора Учитывая длинную углеводородную цепь (12 атомов) и неполярную природу самого флуорофора, так и должно быть Это соответствует данным о локализации AV зонда, полученным ранее с помощью 1Н-ЯМР

Глубина погружения флуорофора по методу параллакса

Для того чтобы подтвердить положение Me4-BODIPY-8 флуорофора и более точно определить глубину погружения флурофора в бислой, мы использовали метод параллакса В этом методе сравнивается эффективность тушения флуоресценции зонда от двух локализованных в мембране на разной глубине тушителей Для возможно меньшего искажения бислоя мы использовали специально синтезированные нами (рис 1) йод-меченые фосфо-липиды I7-PC и Ill-PC, с остатком 7-йодгептановой и 11-йодундекановой кислоты соответственно

Расстояние до флуорофора от цента бислоя (zcf) вычисляется по формуле (Chattopadhyay, London, 1987)

zcf = la + Hn(fr)/T • с - ьц/2 ■ l21

здесь Fi и - относительные интенсивности флуоресценции в присутствии I7-PC и Ill-PC соответственно, loi - расстояние от центра бислоя до атома йода в I7-PC, 1/21 ~ расстояние между атомами йода в I7-PC и Ill-PC, с -концентрация тушителя в молекулах на единицу площади

Таблица 2 Тушение йод-мечеными фосфатидилхолинами относительные интенсивности флуоресценции и расстояния от центра бислоя в А флуоро-фора Ме4-ВСЮ1РУ-8-зондов, определенные по методу параллакса в липо-сомах из РОРС

зонд Fx ¿2 zcf найд zcf вычисл

ВЗ-РС 0 77±0 00 0.93±0 00 14 1±3 7 11 3±2 1

В5-РС 0 83±0 01 0 92±0 01 11 6±4 0 9 6±2 3

В7-РС 0 84±0 03 0 91±0 01 10 6±3 9 7 9±2 б

В9-РС 0 92±0 03 0 93±0 02 7 9±2 6 6 6±2 8

F\ и F2 - относительные интенсивности флуоресценции (F/Fq) в присутствии малоуглубленного (I7-PC) и глубже погруженного (Ill-PC) тушителя, соответственно, zqf ~ расстояние флуорофора от центра бислоя

Для определения глубины погружения флуорофора необходимо знать на каком расстоянии от центра бислоя находятся атомы тушителя Принимается допущение положение атома тушителя соответствует положению атома углерода, к которому он присоединен В нашем случае, мы считали что атом йода в I7-PC находится там же где 8-ой, а атом йода в Ill-PC -там же где 12-ый атом углерода sn-2 ацильной цепи фосфолипида Средние расстояния до атомов углерода sn-2 ацильной цепи для бислоя из 200 молекул РОРС в жидкокристаллическом состоянии приведены в таблице 2 Расчеты положения указанных атомов были сделаны на основе модели бислоя, полученной с помощью методов молекулярной динамики Результаты определения расстояния от центра бислоя (zcf) для Me4-BODIPY-8-флуорофора четырех зондов приведены в таблице 2

Как ожидалось, флуорофор в В9-РС расположен наиболее близко к центру бислоя, а в ВЗ-РС - ближе всех к поверхности При этом различие между рассчитанным и полученным значением zcf от В9-РС к ВЗ-РС возрастает По всей видимости, метод параллакса дает наибольшую точность при нахождении флуорофора между двумя используемыми тушителями А с увеличением расстояния от тушителя до флуорофора точность определения падает

Расстояние от центра бислоя до флуорофора возрастает в порядке

В9-РС < В7-РС < В5-РС < ВЗ-РС Это соответствует данным полученным при тушении флуоресценции водорастворимым йодидом натрия

Латеральная упаковка зондов в монослое1

Чтобы исследовать влияние Ме4-ВОБ1РУ-8-зондов на латеральную упаковку фосфолипидов, были зарегистрированы изотермы сжатия в монослое одного из зондов, В7-РС, как репрезентативного, а также РОРС (рис 4, А) и смеси РОРС/холестерин, 2 1 (рис 4, Б), с включением различных количеств В7-РС

Данные рис 4 показывают, что Ме4-ВОБ1РУ-8-флуорофор, присоединенный к ацильной цепи фосфатидилхолиновой молекулы, несколько увеличивает ее поперечное сечение, однако включение зонда монослой РОРС вплоть до 20% мольн практически не изменяют форму и расположение изотермы сжатия матричного липида

5о

-£40 £

¿30 щ

s

а 20

60 80 100 120 140 30 40 50 60 70 80 90 Площадь на молекулу (А2)

Рис 4 А ) Изотермы сжатия в монослое зонда В7-РС (график без маркеров), а также смесей РОРС с 0 1,1,10 или 20% мольн зонда В7-РС, температура 24 °С Б ) Изотермы сжатия в монослое смесей РОРС/Ско1, 2 1, содержащих 0 1, 1 или 10% мольн зонда В7-РС, изотерма для смеси РОРС/СЬ,о1, 2 1, совпадает с графиком без маркеров Температура 24 °С

Заметнее влияние зонда на монослой из смеси РОРС/СЬо1,2 1, в кото-

'Выполнено в лаборатории биохимии мембран Института им Хормеля, Миннесотский университет, Остин, Миннесота, США

ром конденсирующее действие холестерина проявляется достаточно сильно (Ь^апе et а1, 2002), и включенный в систему Ме4-ВСЮ1РУ-8-флуорофор препятствует этому действию Однако и здесь влияние флуорофора пренебрежимо мало при 0 1% мольн , становясь заметным только при 10% (рис 4, Б) Сходным образом ведут себя в монослоях Ме4-ВОВ1РУ-8-меченые сфингомиелин (В7-8М) и галактозилцереброзид (В7-СС) (данные не приведены).

Из этого следует, что Ме4-В001РУ-8-зонды достаточно близко имитируют поведение жидкофазных липидов и не нарушают заметным образом его упаковку вплоть до концентраций, значительно превышающих 1% мольн , что намного больше концентраций Ме4-ВОВ1РУ-8-зондов, применяемых при биофизических исследованиях

Анизотропия флуоресценции и подвижность ацильных цепей

Регистрация анизотропии г флуоресценции зондов в мембранах позволяет получать важную информацию о параметрах бислоя, в первую очередь о подвижности окружающих флуорофор молекул Модельными системами в наших экспериментах служили большие униламеллярные везикулы (БУВ) состава БМРС, смесь БМРС/СЬо1, 7 3, и РОРС, с добавлением 0 1 % мольн. зонда ВЗ-РС, В5-РС, В7-РС или В9-РС

Так как группа Ме4-ВОБ1РУ-8 имеет протяженность по высоте, соответствующую 4-5 СНг-группам ацильной цепи, можно предположить, что подвижность флуорофора определяется в основном подвижностью соседних метиленовых групп ацильных цепей СЗ-С8 для ВЗ-РС, С5-С10 для В5-РС, С7-С12 для В7-РС и С9-С14 для В9-РС На Рис 5 графически отображены величины анизотропии флуоресценции зондов ВЗ-РС, В5-РС, В7-РС и В9-РС в БУВ из БМРС, смеси БМРС/СЬо1, 7 3, и РОРС Вполне отчетливо увеличение подвижности ацильных остатков матрицы бислоя к его центру просматривается для бислоя из РОРС, хотя строго эта закономерность соблюдается только при 17-24 °С величина г последовательно уменьшается от ВЗ-РС к В9-РС Для бислоя же из БМРС падение анизотропии наблюдается лишь при переходе от самого «мелкосидящего» зонда ВЗ-РС к следующему, В5-РС) Далее к центру бислоя анизотропия зондов

- БМРС/Ою! 7

9 3 5 7 9 : Длина меченого ацила, С-атомы

Рис 5 Величины анизотропии флуоресценции зондов ВЗ-РС, В5-РС, В7-РС и В9-РС при температурах от 17 до 37°С (указаны у соответствующих графиков) в ВУВ из РОРС, ОМРС и смеси ВМРС-СНо1, 7 3

В7-РС и В9-РС снова увеличивается

Включение в бислой из БМРС холестерина влечет за собой существенное возрастание анизотропии зонда В5-РС, особенно при близких к Тт для БМРС температурах, что вполне закономерно Как известно, в модельных мембранах из БМРС холестерин располагается таким образом, что его тетрациклическая система находится между карбонильными группами ацильных остатков и их серединой, ограничивая подвижность этого участка в наибольшей степени (УШа1аш, 1996), что мы и наблюдаем Повышение температуры нивелирует этот эффект - см графики, снятые при 30-37 °С, что может быть следствием увеличения подвижности молекул холестерина вдоль ацильных цепей, локализация которого при повышенных температурах распространяется и на более глубокие области бислоя

Анизотропия длинноцепного зонда В9-РС в БУВ из БИРС и

DMPC/Chol заметно выше величины г для зонда В7-РС, чей флуорофор находится дальше от центра бислоя Этот феномен наблюдается как ниже, так и выше 24 °С, температуры фазового перехода для DMPC, и сильнее всего выражен в БУВ из DMPC при температурах ниже Тт Такое поведение зондов выглядит странным на основании данных по анизотропии флуоресценции набора 9-антроилоксижирных кислот (Хи, Ниапа, 1987) и набора флуоренил-меченых жирных кислот (Lala,2002) было показано, что ближе к центру бислоя из насыщенных липидов природного строения величина г уменьшается, т е подвижность цепей возрастает Наблюдаемый нами эффект нельзя объяснить и тем, что флуорофор зонда части молекул В9-РС смещается в близкую к водной фазе зону, как это происходит с более полярными флуорофорами, например N-дансильным, - флуорофор зонда В9-РС во всех случаях наименее доступен для тушения иодидом, т е полностью погружен в неполярную область бислоя

Естественным образом возникает предположение, что ббльшая величина г для зонда В9-РС по сравнению с В7-РС и другими зондами в наших опытах обусловлена взаимопроникновением ацильных групп двух оппозит-ных листков (монослоев), образующих бислой, встречаясь в центре бислоя, окончания ацильных групп должны тормозить подвижность этих окончаний и, как следствие, находящегося рядом флуорофора Такое взаимопроникновение зафиксировано рядом физических методов для многих видов бислоев и при некоторых воздействиях на них

Зонды ВЗ-РС - В9-РС синтезированы путем ацилирования меченой кислотой лизофосфатидилхолина, в свою очередь полученного из яичного фосфатидилхолина, те в положении sn-1 зондов находятся пальми-тоильный (С16 0) и стеароильный (С18 0) остатки в соотношении ~5 2 Поскольку миристоильные (С14 0) остатки матрицы бислоя существенно короче остатков в sn-1-положении зондов, любой из немеченых остатков зонда может проникать в противоположный листок бислоя, что должно привести к уменьшению его подвижности в области, близкой к концевым СНз-группам По-видимому, это торможение передается и рядом расположенному флуорофору, причем, естественно, в большей степени зонду В9-PG и в меньшей - В7-РС Что и наблюдается для обоих зондов в БУВ

из DMPC и DMPC/Chol при всех температурах (рис 5, А, Б) В БУВ из РОРС, где матрица составлена фосфолипидом с пальмитоильным (С16 0) и олеоильным (С18 1) ацильными остатками, можно видеть лишь незначительное увеличение анизотропии для зонда В9-РС, но не для В7-РС, при температурах 26-37 °С Возможно, в этих условиях проникновение sn-1-ацильных остатков зондов в противоположный листок бислоя тоже имеет место, но в малой степени и именно при повышенной температуре, когда флуктуационные вертикальные, перпендикулярно плоскости бислоя, перемещения его компонентов увеличиваются Подтверждением такой точки зрения может служить то, что в БУВ из смеси DMPC/Chol увеличение значения г для В9-РС относительно величин анизотропии других зондов происходит при увеличении температуры, то же явление в бислое из DMPC при температуре выше Тт выражено слабее Еще одним подтверждением можно считать значительное увеличение анизотропии зонда В9-РС в БУВ из DMPC при температурах ниже Тт - иммобилизующее действие на зонд двух листков бислоя, находящихся в гелевом состоянии, должно в этом случае проявляться в наибольшей степени Таким образом, с помощью набора Me4-B0DIPY-8-3OHfl0B можно изучать взаимопроникновение гидрофобных остатков с противоположных сторон бислоя, что будет одним из предметов наших дальнейших исследований

Заключение

Получен и предложен к применению новый набор флуоресцентных фосфатидилхолиновых зондов, несущих на ацильном остатке 4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4гбора-За,4а-диаза-Б-индацен-8-ильный (Me4-BODIPY-8) флуорофор на различном расстоянии от полярной головки, также синтезированы сфингомиелиновый и галактозилцереброзидный зонды Зонды отличаются высокой чувствительностью и фотоустойчивостью. В малых концентрациях (до 1% мольн) они мало нарушают упаковку мембраны

Ме4-ВСШ1РУ-8-флуорафор зондов погружен в бислой на максимальную глубину, допускаемую несущим ацилом Это свойство данного флуо-рофора дает возможность дифференцированно изучать с помощью полу-

ченного набора зондов структуру мембран по глубине

Возможности такого зондирования были продемонстрированы путем регистрации анизотропии флуоресценции в больших униламеллярных везикулах (БУВ) Данные анизотропии флуоресценции зондов показали различные профили подвижности микроокружения флуорофора в БУВ различного состава при разных температурах, что свидетельствует о чувствительности полученного набора зондов как инструмента исследования мембранных систем

Выводы

• Синтезирован представительный набор липидньтх зондов с малополярным высокочувствительным флуорофором Ме4-ВОВ1РУ-8, который в мембране располагается на разном расстоянии от ее поверхности

• Двумя независимыми методами установлено, что флуорофор каждого зонда полностью погружен в бислой и располагаются так глубоко, как позволяет ацильная цепь, несущая флуорофор

• Разработана новая процедура корректировки эффекта внутренней фильтрации при тушении эмиссии флуорофора, погруженного в бислой, проникающими тушителями, предложенная методика существенно повышает точность измерений

• В опытах на модельных системах различного состава показано, что синтезированный набор зондов чувствителен к изменению подвижности ацильных цепей по глубине мембраны

Работы, опубликованные по теме диссертации

1 А В Омельков, Ю Б. Павлова, И А Болдырев, Юл Г Молотковский Исследование неполярной области липидных мембран по глубине с помощью набора флуоресцентных зондов, Мв4-ВСЮ1РУ-8-меченных фосфатидилхолинов // Биоорган химия 2007, 33, 5, 544-549

2 I A. Boldyrev, X Zhai, М.М Momsen, Н L Brockman, R Е Brown, J G Molotkovsky New BODIPY lipid probes for fluorescence studies of membranes // J Lip Res 2007, 48, 1518-1532

3 И А Болдырев, Юл Г Молотковский Синтез и свойства новых 4,4-дифтор-За,4а-диаза-8-индацен (ВОБ1РУ)-меченых липидов // Биоорган химия 2006, 32, 1, 87-92

4 X Zhai, IA Boldyrev, Н.М. Pike, J G Molotkovsky, R E Brown BODIPY Resonance Energy Transfer for Monitoring Intermembrane Transfer of Glycohpid by Human Glycohpid Transfer Protein // 51th Ann Biophys Soc Meeting, Baltimore, Maryland, USA Feb 18-22, 2007

5 И А Болдырев, А В Омельков, Ю Г Молотковский Набор новых флуоресцентных липидных зондов для изучения мембранных систем // VIII чтения памяти акад Ю А Овчинникова, 25-27 окт 2006 г Сб тезисов С 105.

6 X Zhai, I A Boldyrev, М М Momsen, N К Mizuno, J G Molotkovsky, H L Brockman, R E Brown Monolayer charactenzation of sphmgolipid and phosphoglyceride derivatives containing tetramethyl BODIPY fluorophores linked by novel attachment to acyl chains // 50th Ann Biophys Soc Meeting, Salt Lake City, UT, USA Feb 18-22, 2006 (Biophys J , 2006, 90, 275-Pos)

7 И А Болдырев, К Жай, P Браун, Ю Г Молотковский Новые флуоресцентные липидные зонды на основе BODIPY флуорофора // XVIII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Москва, 7-10 февр 2006 г Сб тезисов С 17

Подписано в печать 25 12 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 1080 Тираж 70экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Введение

1 Обзор литературы. Флуоресцентные липидные зонды для исследования латеральной и трансбислойной структуры мембран

1.1 Исследование латеральной структуры мембраны.

1.2 Латеральная подвижность компонентов мембран.

1.3 Исследование параметров мембран по глубине.

1.4 Локализация флуорофоров в бислое.

1.4.1 Тушение флуоресценции.

1.4.2 Использование FRET

1.4.3 Использование ЯМР.

1.4.4 Резюме.

1.5 Перспективы применения флуоресцентных зондов в мембра-нологии.

2 Результаты и их обсуждение

2.1 Выбор флуорофора.

2.2 Структура зондов

2.3 Схема синтеза.

2.4 Спектральные свойства зондов.

2.5 Положение Ме4-ВОБ1РУ-8-флуорофора в бислое.

2.5.1 Определение положения флуорофоров в мембране тушением флуоресценции йодидом натрия.

2.5.2 Определение глубины погружения флуорофора методом параллакса.

2.6 Латеральная упаковка и спектральные свойства зондов в монослое

2.7 Анизотропия флуоресценции и упорядоченность ацильных цепей бислоя

Открытие рафтов в составе мембран позволило по-новому взглянуть на известную проблему современной мембранологии - зависимость функционирования мембранных белков от липидного состава мембран. Известно, что механические взаимодействия бислоя (липидного окружения) с молекулой белка могут быть опосредованы изменением напряжения изгиба мембраны, стремлением бислоя и белка уменьшить гидрофобное несоответствие (разницу между протяженностью гидрофобного участка белка и толщиной гидрофобной области бислоя), а также изменением профиля латерального давления.

Для каждого из перечисленных механизмов известны примеры, однако их сложно формализовать. Например, может быть установлено, что изменение конформации белка было вызвано изменением профиля латерального давления, но неизвестно каким был этот профиль до и после изменения конформации. Инструментом для изучения свойств мембраны на разном расстоянии от поверхности бислоя может быть набор флуоресцентных липидных зондов, у которых флуорофор находится на разной глубине внутри мембраны. Латеральное давление внутри бислоя определяется подвижностью метиленовых групп жирнокислотных цепей. Мерой этой подвижности выступает анизотропия флуоресценции метки.

Разработка набора флуоресцентных липидных зондов предназначенных для изучения свойств мембран на разном расстоянии от поверхности бислоя - актуальная задача мембранологии. Их применение позволит составить более точное представление о строении различных доменов мембран и свойствах мембранных фаз. При изучении влияния свойств мембран на функционирование мембранных белков новый набор зондов позволит получить качественно новую информацию о состоянии системы. Например, станет возможным следить за изменением профиля латерального давления одновременно с наблюдением за активностью белка.

Задачей настоящего исследования была разработка набора флуоресцентных липидных зондов для изучения свойств биологических и модельных мембран на разном расстоянии от поверхности бислоя. С этой целью необходимо было подобрать флуорофор, синтезировать набор зондов на его основе, исследовать спектральные характеристики новых зондов и их поведение в мембране. Кроме того, важно было показать применимость нового набора зондов для решения поставленных задач.

Выводы

• Синтезирован представительный набор липидных зондов с малополярным высокочувствительным флуорофором Ме4-ВОБ1РУ-8, который в мембране располагается на разном расстоянии от ее поверхности.

• Двумя независимыми методами установлено, что флуорофор каждого зонда полностью погружен в бислой и располагаются так глубоко, как позволяет ацильная цепь, несущая флуорофор.

• Разработана новая процедура корректировки эффекта внутренней фильтрации при тушении эмиссии флуорофора, погруженного в бислой, проникающими тушителями; предложенная методика существенно повышает точность измерений.

• В опытах на модельных системах различного состава показано, что синтезированный набор зондов чувствителен к изменению подвижности ацильных цепей по глубине мембраны.

4. Экспериментальная часть

4.1. Материалы и методы

Использовали ацетил хлорид (Fluka), пробковую (субериновую) и себациновую кислоты, монометиладипат, эфират трехфтористого бора, гексафторфосфат (бензотриазол- 1-илокси)трис- (диметиламино)фосфония (ВОР), 4-аминопиридин, 1-метилимидазол, 4-пирролидинопиридин (Aldrich), триэтиламин, дициклогексилкарбодиимид (Sigma), силикагель 60 и ТСХ пластинки DC-Alufolien Kieselgel-60 (Merck). Использовали 2,4-диметилпиррол производства Aldrich или получали его как описано ранее. 2,4-диметилпиррол перед применением перегоняли. Остальные реактивы производства Реахим (Россия). Метанол перегоняли над метила-том магния, хлороформ и хлористый метилен над пятиокисью фосфора. Остальные растворители использовали после обычной очистки. Для колоночной хроматографии применяли силикагель Kieselgel 60 (Merck, Германия), для ТСХ — пластинки с флуоресцентным индикатором Kieselgel 60 F254 и без индикатора Kieselgel 60 (Merck). Обнаружение при ТСХ: фосфорномолибденовой кислотой (А), молибденовым синим (Б) и УФ-облучением (В). Сфингозин-1-фосфохолин, l-0-ß галактозил-сфингозин и лизофосфатидилхолин (из яичного фосфатидилхолина) были получены, как описано ранее [198]; лизофосфатидилхолин содержал практически только остатки пальмитиновой и стеариновой кислот в соотношении ~5:2. Монометиловые эфиры себациновой (т.кип. 170 — 173°С/2 мм) и пробковой (т. кип. 188 — 192°С/20 мм) кислот получали по методу [199]. Из них хлорангидриды (III, IV) получали реакцией с тионил-хлоридом в сухом хлороформе в присутствии ДМФА. Хлорангидрид монометиладипата (II) получали обработкой моноэфира избытком тио-нилхлорида при комнатной температуре в течение 14 ч. Монометиловый эфир янтарной кислоты получали метанолизом янтарного ангидрида. Хлорангидриды (I—IV) использовали без очистки, после упаривания в токе аргона в течение 3 ч при 20°С/12 мм или соупаривания с толуолом на роторном испарителе.

Масс-спектры снимали на MALDI-времяпролетном спектрометре «UltraFlex» (Bruker Daltonics, Германия): Ш-лазер, 337 нм, матрица — 2,5-дигидроксибензойная кислота. УФ-спектры веществ регистрировали на спектрофотометре СФ-256 (Ломо-фотоника, Санкт-Петербург); спектры флуоресценции — на спектрофлуориметре Hitachi F-4000 (Япония). Спектры 1Н-ЯМР (<5, м.д. относительно Me4Si) регистрировали на спектрометре Bruker WM 500 (Германия).

4.2. Синтез

Метиловые эфиры а;-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-8-индацен-8-ил)алкановых кислот (VI-IX). К хлориду монометилового эфира кислоты (I-IV) (4.84 ммоль) в 20 мл сухого хлороформа при 0 °С добавляли по каплям за 10 мин 2,4-диметилпиррол (0.5 мл, 4.84 ммоль). Смеси давали нагреться до комнатной температуры, раствор образовавшегося дипиррометена использовали без дополнительной обработки.

К раствору дипиррометена (VI-IX), полученному на предыдущей стадии, прибавляли 2 мл триэтиламина, перемешивали 10 мин, добавляли 1.5 мл (~12 ммоль) свежеперегнанного эфирата трехфтористого бора и оставляли на 4 ч при комнатной температуре. Смесь упаривали и хроматографи-ровали на силикагеле в градиенте петролейный эфир-хлористый метилен 1:0 —j- 8:2. Эфиры Ме4-ВСЮ1РУ-8-алкановых кислот (X-XIII) выделяли с выходом 23-28% в виде темно-красных аморфных соединений; контроль ТСХ: Rf 0.12-0.14 (гексан - хлористый метилен, 4:6; В), УФ (в этаноле), 498 нм {е = 8"9 • 104). Получены:

Метил-5-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-8-индацен-8-ил) пентаноат (XI), MALDI-MS, m/z: 362.10 [М]+, 343.06 [М - F]+. 1Н-ЯМР (CDC13): 1.26 (2Н, м, СН2), 1.66 (2Н, м, СОСН2СН2), 2.35 (2Н, м, СОСН2), 2.42 (6Н, с, ССН3), 2.51 (6Н, с, ССН3), 2.97 (2Н, т, ССН2), 3.67 (ЗН, с, ОСН3), 6.05 (2Н, с, аром.).

Метил-7-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-s-индацен-8-ил)гептаноат (XII), MALDI-MS, m/z: 390.06 [М]+, 371.00 [М - F]+; 1Н-ЯМР (CDC13): 1.39 (2Н, м, СН2), 1.49 (2Н, м, ССН2СН2 СН2), 1.65 (4Н, м, СОСН2СН2, ССН2СН2), 2.32 (2Н, т, СОСН2), 2.41 (6Н, с, ССНз), 2.51 (6Н, с, ССНЗ), 2.94 (2Н, т, ССН2), 3.67 (ЗН, с, ОСН3), 6.05 (2Н, с, аром.).

Метил-9-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-з-индацен-8-ил)нонаноат (XIII) MALDI-MS, m/z: 418.12[М]+, 399.14 [М - F]+; 1Н-ЯМР (CDCI3): 1.25 (6Н, м, СОСН2СН2 (СН2)з), 1-48 (2Н, м, ССН2 СН2СН2), 1.62 (4Н, м, СОСН2СН2, ССН2СН2), 2.30 (2Н, м, СОСН2), 2.41 (6Н, с, ССН3), 2.51 (6Н, с, ССН3), 2.93 (2Н, т, ССН2), 3.67 (ЗН, м,

ОСН3), 6.05 (2Н, с, аром.) о;-(4,4-Дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-8-ивдацен-8-ил)алкановые кислоты (Х1У-ХУП) готовили непосредственно перед применением. Раствор 0.128 ммоль эфира (УШ-Х) в 5 мл изопропанола перемешивали с 2 мл водного 0.1 N КОН в атмосфере аргона при ^ 20 °С, отслеживая ТСХ в системе бензол-АсОЕ^АсОН, 80:19:1, превращение метилового эфира (УШ-Х) с Rf ~0.8 в кислоту (Х1-ХШ) с Rf ~0.5. После почти полного превращения (1-2 ч) смесь нейтрализовали 2 мл 0.1 N НС1 и выпаривали досуха. Остаток экстрагировали этилацетатом, экстракт высушивали ^2804 и упаривали. Полученные с выходом 86 - 95% в аморфном виде Ме4-ВОБ1РУ-8-алкановые кислоты, индивидуальные по данным ТСХ, использовали далее без дополнительной очистки.

1-Ацил-2-[а;-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-8-индацен-8-ил)-ацил]-8п-глицеро-3-фосфохолины (ВЗ-,В5-,В7-,В9-РС). Растворяли 10 мг (~20 мкмоль) яичного лизофосфатидилхолина (XVIII), 50 мкмоль кислоты (ХГУ-ХУН), 9 мг (95 мкмоль) 4-амииопиридина и 14 мг (95 мкмоль) 4-пирролидинопиридина в 3 мл сухого хлороформа при интенсивном перемешивании в атмосфере аргона. Добавляли 20 мг (95 мкмоль) БСС в виде 30%-пого раствора в ССЦ, перемешивали ~1 ч и оставили на ночь при 20 °С. Из смеси хроматографией на силикагеле в системе СНС1з-МеОН, от 5:1 до 1:1, выделяли оранжево-красные стеклообразные фосфатидилхолины, выход 20-25%, В,/ 0.35-0.4 в системе СНС1з-МеОН-вода, 65:25:4 (А, Б, В); хроматографическая подвижность одинакова с подвижностью яичного фосфатидилхолина. Получены: 1-Ацил-2-[5-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-зиндацен-8-ил)пентаноил]-зп-глицеро-3-фосфохолин (В5-РС), MALDI-MS, m/z: 826.44 [M + H]+, 806.36 [М - F]+ (показаны главные пики, где ацил = пальмитоил). 1Н-ЯМР (CDCI3/CD3OD, 2:1): 0.84 (ЗН, т, СН2СН3), 1.22 (24Н, уш. м, СН2), 1.52 (2Н, м, СН2), 1.64 (2Н, м, СН2), 1.79 (2Н, м, СН2), 2.22 (2Н, т, СН2), 2.31 (2Н, т, СН2), 2.41 (6Н, с, ССН3), 2.45 (6Н, с, ССН3), 2.97 (2Н, т, ССН2), 3.16 (9Н, с, NCH3), 3.61 (2Н, м, CH2N), 4.04 (2Н, уш. м, СН2ООС), 4.10 (1Н, м, СН2ОР), 4,27 (2Н, уш. м, CH2CH2N), 4.34 (1Н, м, СН2ОР), 5.21 (1Н, м, СНООС), 6.05 (2Н, с, аром).

1-Ацил-2-[7-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-з-индацен-8-ил)гептаноил]-зп-глицеро-3-фосфохолин (В7-РС), MALDI-MS, m/z: 854.44 [М + Н]+, 834.4 [М - F]+ (показаны главные пики, где ацил = пальмитоил). 1Н-ЯМР (CDC13/CD30D, 2:1): 0.83 (ЗН, т, СН2СН3), 1.21 (26Н, уш. м, СН2), 1.37 (2Н, м, СН2), 1.49 (2Н, м, СН2), 1.54 (2Н, м, СН2), 1.61 (4Н, м, СН2), 2.26 (2Н, т, СН2), 2.31 (2Н, т, СН2), 2.39 (6Н, с, ССН3), 2.45 (6Н, с, ССН3), 2,94 (2Н, т, ССН2), 3.17 (9Н, с, NCH3), 3.59 (2Н, м, CH2N), 4.01 (2Н, уш. м, СН2ООС), 4.11 (1Н, м, СН2ОР), 4.26 (2Н-, уш. м, CH2CH2N), 4.35 (1Н, м, СН2 ОР), 5.19 (1Н, м, СНООС), 6.18 (2Н, с, аром).

1-Ацил-2-[9-(4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-8-индацен-8-ил)нонаноил]-зп-глицеро-3-фосфохолин (В9-РС), MALDI-MS, m/z: 882.48 [М + Н]+, 862.43 [М - F]+ (показаны-главные пики, где ацил = пальмитоил). 1Н-ЯМР (CDC13/CD30D, 2:1): 0.84 (ЗН, т, СН2СН3), 1.23 (28Н, уш. м, СН2), 1.32 (4Н, уш. м, СН2) 1.48 (2Н, уш. м, СН2), 1.58 (6Н, уш. м, СН2), 2.28 (4Н, уш. м, СН2), 2.41 (6Н, с, ССН3), 2.45, (6Н, с, ССН3), 2.95 (2Н, уш. м, ССН2), 3.19 (9Н, с, NCH3), 3.64 (2Н, м, CH2N), 4.03 (2Н, уш. м, СН2ООС), 4.14 (1Н, уш. м, СН2ОР), 5.22 (1Н,уш. м, СНООС), 6.06

2Н, с, аром).

N-[7 - (4,4-Дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-з-индацен-8-ил)гептаноил]сфингозин-1-фосфохолин (B7-SM). К раствору 3.5 мг (9 мкмоль) Ме4-В0Б1РУ-гептановой кислоты (XVI) и 5 мкл триэтиламина в 0.5 мл сухого хлористого метилена и 1 мл изопропанола прибавили ВОР (5 мг), перемешивали 1 час при 20°С, затем добавили 7 мг (9 мкмоль) сфингозин-1-фосфохолина (XIX), 0.5 мл хлористого метилена и 1 мл изопропанола. Перемешивали в течение ночи в атмосфере аргона, из смеси хроматографией на силикагеле в системе хлороформ-метанол, 1:0 —> 1:1, выделяли 5 мг (65%) сфингомиелина (B7-SM) в виде оранжевого стекла, Rj 0.40 в системе хлороформ-метанол 4N NH4OH, 65:35:8 (А, Б, В); хроматографическая подвижность одинакова с подвижностью сфингомиелина бычьего мозга. MALDI-MS, m/z: 823.87 [М + Н]+, 803.81 [М - F]+. 1Н-ЯМР (CDCI3/CD3OD, 2:1): 0.84 (ЗН, т, СН2СН3), 1.22 (22Н, уш. м, СН2), 1.37 (2Н, уш. м, СН2), 1.51 (2Н, уш. м, СН2), 1.62 (4Н, уш. м, СН2), 1.98 (2Н, уш. м, СН2), 2.17 (2Н, уш. м, СН2), 2.41 (6Н, с, ССН3), 2.45 (6Н, с, ССН3), 2.96 (2Н, уш. м, ССН2), 3.17 (9Н, с, NCH3), 3.59 (4Н, уш. м, СН и CH2CH2N), 4.27 (2Н, м, СНСН2ОР), 5.41 (1Н, уш. м, СН=), 5.68 (1Н, уш. м, СН=), 6.06 (2Н, с, аром.).

М-[7-(4,4-Дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-з-индацен-8-ил)гептаноил]-1-О-/3-галактозилсфингозин (B7-GC). К раствору 6.3 мг (16.7 мкмоль) Ме4-В001РУ-гептановой кислоты (XVI) и 10 мкл 1-метилимидазола в 2 мл сухого СН2С12 добавляли 8 мг ВОР (18 мкмоль), перемешивали 1.5 ч, прибавляли 8 мг (17.3 мкмоль) 1-0-/3-галактозилсфингозина (XX) и 1 мл изопропанола. Смесь перемешивали в течение ночи в атмосфере аргона, потом хроматографией на сили-кагеле в хлороформе с 5-20% метанола выделяли 7.6 мг (55%) липида (B7-GC). Аморфное оранжево-красное вещество), Rf 0.6 в системе хлороформ-МеОН АсОН, 78:20:3; вещество имеет одинаковую с природным галактозилцерамидом хроматографическую подвижность. УФ (в этаноле), 498 нм (е = 8.1 • 104). MALDI-MS m/z: 820.4 [М + Н]+, 800.42 [М - F]+. 1Н-ЯМР (CDCI3/CD3OD, 4:1): 0.81 (ЗН, т, СН2СН3), 1.18 (20Н, уш. м, СН2), 1.26 (2Н, уш. м, СН2), 1.32 (2Н, уш. м, СН2), 1.46 (2Н, уш. м, СН2), 1.57 (4Н, уш. м, СН2), 1.94 (2Н, уш. м, СН2СН=), 2.13 (2Н, т, СН2), 2.36 (6Н, с, ССН3), 2.43 (6Н, с, ССН3), 2.89 (2Н, т, ССН2), 3.45 (1Н, уш. м, СН, Gal), 3.49 (1Н, уш. м, СН, Gal), 3.51 (1Н, уш. м, СН2, Gal), 3.53 (1Н, уш. м, СН2, Gal Н-5), 3.72, 3.75 (2Н, два уш. м, С-ОСН2), 3.85 (1Н, с, СН, Gal), 3.93 (1Н, уш. м, СН), 4.03 (1Н, уш. м, CHN), 5.38 (1Н, м, СН=), 5.62 (1Н, м, СН=), 6.01 (2Н, с, аром.).

4.3. Приготовление липосом

Липосомы готовили так чтобы оптическая плотность образцов, обусловленная поглощением зондов, не превышала 0.05. Если не указано иное, концентрация зондов на основе BODIPY в образце 0.1% мольн., на основе AV - 0.5% мольн. Использовали один из способов:

А: Растворы липидов в хлороформе или в смеси хлороформ-метанол (1:1) и раствор зонда в этаноле смешивали в необходимой пропорции в пробирке или небольшой колбе. Растворитель удаляли на роторном испарителе или продувкой тока аргона. Остаток высушивали в вакууме (1-2 мм Hg, 2-3 часа). К полученной липидной пленке добавляли PBS и оставляли на ночь.

Затем каждый образец 8 раз замораживали в жидком азоте и оттаивали при перемешивании при 35°С. Полученные неоднородные по размерам мо-ноламеллярные липосомы использовали сразу после приготовления.

Б: Липидную пленку готовили как в А. К пленке добавляли PBS + 0.1% EDTA. Далее образец 5 раз замораживали в жидком азоте и оттаивали при перемешивании при 35°С. Полученную суспензию 20 раз продавливали через фильтр с размером пор 100 нм (Nucleopore, США) с помощью мини-экструдера (Avanti Polar Lipids, США). Полученные однородные мо-ноламеллярные липосомы со средним размером 100 нм хранили при +4оС и использовали в течение 5 суток.

4.4. Спектральные измерения

Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре СФ-256 (Ломо-фотоника, Санкт-Петербург). Стационарные флуоресцентные измерения проводили на флуориметре F-4000 (Hitachi Ltd, Япония) в термо-статируемых кюветах 10x10. Если не указано иное, Me4-BODIPY-8 зонды возбуждали при 497 нм. Эмиссию регистрировали при 505 нм. Ширина щелей на возбуждении и испускании - 5 нм. AV-зонд возбуждали при 373 нм. Эмиссию регистрировали при 434 нм. Ширина щелей на возбуждении и испускании 5 и 10 нм соответственно. В экспериментах с липосомами поляризаторы устанавливали перпендикулярно друг-другу (Еxpoi = 0° и Етро; = 90°) для того чтобы максимально отфильтровать шум от рассеяния света липосомами. Спектр флуоресценции концентрованного раствора зонда (5% в хлороформе) снимали в трех стеклянных капиллярах (внутренний диаметр 0.5 мм), помещенных в кварцевую кювету, заполненную толуолом.

4.5. Тушение флуоресценции

4.5.1. По Штерну-Фольмеру

Зонд встраивали в липосомы по методу Б (общая концентрация ли-пидов - 0.4 мг/мл), затем последовательно добавляли к суспензии липосом 1.5 М раствор Nal, содержащий 10 тМ ЫагЯгОз в PBS. После уравновешивания системы (~40-60 минут) регистрировали интенсивность флуоресценции.

4.5.2. По методу параллакса

В качестве матричного липида использовали РОРС. Зонд и о;-йод меченные фосфолипиды I7-PC и Ill-PC встраивали в липосомы по методу А (общая концентрация липидов - 0.15 мг/мл, концентрация йод-липида 5% мольн.)

Расстояние от центра бислоя до флуорофора (ZCF) определяли по формуле:

Zcf = Lei + HnÄ/тгС - L22l}/2L2i

Здесь Fi и F2 - относительные интенсивности флуоресценции в присутствии I7-PC и Ill-PC соответственно, Lei - расстояние от центра бислоя до атома йода в I7-PC, L21 ~ расстояние между атомами йода в I7-PC и Ill-PC, С - концентрация тушителя в молекулах на единицу площади. Пояснения на рис. 1.7. Эксперименты проводили при комнатной температуре (24°С). При этой температуре бислой находится в жидкокристаллической фазе, и площадь на молекулу принимаем равной 70Ä. Тогда С = 0.05/70. Для определения расстояний Lei и L12 использовали рассчитанную с помощью молекулярной динамики модель бислоя из РОРС в жидкокристаллическом состоянии [185] (в модели площадь на молекулу была равна 70А). Для упрощения принимаем, что атомы йода в I7-PC и Ill-PC находятся там же, где находится восьмой и двенадцатый атомы углерода sn-2 ацильной цепи фосфолипида. Тогда:

La = 8.8 ± 2.3 A, L12 = 4.3 ± 2.7 А

4.6. Измерение анизотропии флуоресценции

Измерение анизотропии флуоресценции проводили в диапазоне температур от 17 до 37 °С с шагом 0.2 0.3 °С. Температуру измеряли внутри кюветы. После стабилизации показаний температуры измеряли интенсивность флуоресценции при разной ориентации поляризаторов. Экспериментальные данные зависимости анизотропии флуоресценции от температуры были сглажены с помощью стандартной процедуры.

4.7. Измерения в монослоях

Параметры поведения в мослоях зондов, индивидуальных и в смесях с другими липидами, регистрировали в атмосфере аргона на компьютеризированной Ленгмюровской установке (весах); измеряли изотермы сжатия, т.е. поверхностное давление (тг) как функцию площади в поперечном сечении на одну молекулу (А), с одновременной регистрацией интенсивности флуоресценции как функции длины волны при фиксированной величине7г. Детально процедура измерения изотерм сжатия приведена в работе [200]. Флуоресцентные измерения проводили, как описано ранее [166]. Вкратце: монослой, содержащий ВСЮ1РУ-зонд, возбуждали под углом 90° неполя-ризованным лучом аргонового лазера (488 нм); испускаемый перпендикулярно к разделу фаз свет отводили с помощью волоконного световода в монохроматор эмиссии.

3. Заключение

Получен и предложен к применению новый набор флуоресцентных фосфатидилхолиновых зондов, несущих на ацильном остатке 4,4-дифтор-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-За,4а-диаза-з-индацен-8-ильный (Ме4-ВОБ1РУ-8) флуорофор на различном расстоянии от полярной головки; также синтезированы сфингомиелиновый и галактозилцереброзидный зонды. Зонды отличаются высокой чувствительностью и фотоустойчивостью. В малых концентрациях (до 1% мольн.) они мало нарушают упаковку мембраны.

Ме4-ВОБ1РУ-8-флуорофор зондов погружен в бислой на максимальную глубину, допускаемую несущим ацилом. Это свойство данного флуо-рофора дает возможность дифференцированно изучать с помощью полученного набора зондов структуру мембран по глубине.

Возможности такого зондирования были продемонстрированы путем регистрации анизотропии флуоресценции в больших униламеллярных везикулах (БУВ). Данные анизотропии флуоресценции зондов показали различные профили подвижности микроокружения флуорофора в БУВ различного состава при разных температурах, что свидетельствует о чувствительности полученного набора зондов как инструмента исследования мембранных систем.

1. Jensen М., Mouritsen O.G. Lipids do influence protein function: the hydrophobic matching hypothesis revisited. Biochim. Biophys. Acta., 1666:205-226, 2004.

2. Senisterra G., Epand R.M. Role of membrane defects in the regulation of the activity of protein kinase C. Arch. Biochem. Biophys., 300:378-383, 1993.

3. Stubbs C.D., Slater S.J. The effects of non-lamellar forming lipids on membrane protein-lipid interactions. Chem. Phys. Lipids, 81:185-95, 1996.

4. Cornell R.B., Arnold R.S. Modulation of the activities of enzymes of membrane lipid metabolism by non-bilayer-forming lipids. Chem. Phys. Lipids, 81:215-227, 1996.

5. Attard G.S., Templer R.H., Smith W.S., Hunt A.N., Jackowski S. Modulation of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase by membrane curvature elastic stress. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:9032-9036, 2000.

6. Li L., Storm P., Karlsson O.P., Berg S., Wieslander A. Irreversible binding and activity control of the 1,2-diacylglycerol 3-glucosyltransferase from acholeplasma laidlawii at an anionic lipid bilayer surface. Biochemistry, 42:9677-86, 2003.

7. Karlsson O.P., Rytomaa M., Dahlqvist A., Kinnunen P.K., Wieslander A. Correlation between bilayer lipid dynamics and activity of the diglucosyldiacylglycerol synthase from Acholeplasma laidlawii membranes. Biochemistry, 35:10094-102, 1996.

8. Schwarz D., Kisselev P., Pfeil W., Pisch S., Bornscheuer U., Schmid R.D. Evidence that nonbilayer phase propensity of the membrane is important for the side chain cleavage activity of cytochrome P450SCC. Biochemistry, 36:14262-70, 1997.

9. Botelho A.V., Gibson N.J., Thurmond R.L., Wang Y., Brown M.F. Conformational energetics of rhodopsin modulated by nonlamellar-forming lipids. Biochemistry, 41:6354-6368, 2002.

10. Brown M.S., Goldstein J.L. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell, 89:331-40, 1997.

11. Brown A.J., Sun L., Feramisco J.D., Brown M.S., Goldstein J.L. Cholesterol addition to ER membranes alters conformation of SCAP, the SREBP escort protein that regulates cholesterol metabolism. Mol. Cell, 10:237-45, 2002.

12. Streicher-Scott J., Lapidus R., Sokolove P.M. The reconstituted mitochondrial adenine nucleotide translocator: effects of lipid polymorphism. Arch Biochem Biophys, 315:548-54, 1994.

13. Van der Heide T., Poolman B. Osmoregulated ABC-transport system of Lactococcus lactis senses water stress via changes in the physical state of the membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:7102-6, 2000.

14. Van der Heide T., Stuart M.C., Poolman B. On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine. EMBO J., 20:7022-32, 2001.

15. Yang F.Y., Hwang F. Effect of non-bilayer lipids on the activity of membrane enzymes. Chem. Phys. Lipids, 81:197-202, 1996.

16. Chang H.M., Reitstetter R., Gruener R. Lipid-ion channel interactions: increasing phospholipid headgroup size but not ordering acyl chains alters reconstituted channel behavior. J. Membr. Biol., 145:13-9, 1995.

17. Perozo E., Kloda A., Cortes D.M., Martinac B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat. Struct. Biol., 9:696-703, 2002.

18. Keller S.L., Bezrukov S.M., Gruner S.M., Tate M.W., Vodyanoy I., Parsegian V.A. Probability of alamethicin conductance states varies with nonlamellar tendency of bilayer phospholipids. Biophys. J., 65:23-27, 1993.

19. Lundbaek J.A., Maer A.M., Andersen O.S. Lipid bilayer electrostatic energy curvature stress and assembly of gramicidin channels. Biochemistry, 36:5695-5701, 1997.

20. Rao N.M., Sundaram C.S. Sensitivity of phospholipase C (Bacillus cereus) activity to lipid packing in sonicated lipid mixtures. Biochemistry, 32:8547-52, 1993.

21. Pilot J.D., East J.M., Lee A.G. Effects of phospholipid headgroup and phase on the activity of diacylglycerol kinase of escherichia coli. Biochemistry, 40:14891-7, 2001.

22. Curran A.R., Templer R.H., Booth P.J. Modulation of folding and assembly of the membrane protein bacteriorhodopsin by intermolecular forces within the lipid bilayer. Biochemistry, 38:9328-36, 1999.

23. Bogdanov M., Dowhan W. Phospholipid-assisted protein folding: phosphatidylethanolamine is required at a late step of the conformational maturation of the poly topic membrane protein lactose permease. EMBO J., 17:5255-64, 1998.

24. Bogdanov M., Umeda M., Dowhan W. Phospholipid-assisted refolding of an integral membrane protein, minimum structural features for phosphatidylethanolamine to act as a molecular chaperone. J. Biol. Chem., 274:12339-45, 1999.

25. Maier O., Oberle V., Hoekstra D. Fluorescent lipid probes: some properties and applications (a review). Chem. Phys. Lipids, 116:3-18, 2002.

26. London., E. How principles of domain formation in model membranes may explain ambiguities concerning lipid raft formation in cells. Biochim. Biophys. Acta., 1746:203-20, 2005.

27. Munro S. Lipid rafts: elusive or illusive? Cell, 115:377-88, 2003.

28. Shaw A.S. Lipid rafts: now you see them, now you don't. Nature Immunol., 7:1139-1142, 2006.

29. Haverstick D.M., Glaser M. Visualization of Ca2+-induced phospholipid domains. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:4475-4479, 1987.

30. Haverstick D.M., Glaser M. Visualization of domain formation in the inner and outer leaflets of a phospholipid bilayer. J. Cell Biol., 106:1885-1892, 1988.

31. Veateh S.L., Keller S.L. Miscibility phase diagrams of giant vesicles containing sphingomyelin. Phys. Rev. Lett., 94:148101, 2005.

32. Serna J.B., Perez-Gil J., Simonsen A.C., Bagatolli L.A. Cholesterol rules: direct observation of the coexistence of two fluid phases in native pulmonary surfactant membranes at physiological temperatures. J. Biol. Chem., 279:40715-40722, 2004.

33. Veatch S.L., Keller S.L. Separation of liquid phases in giant vesicles of ternary mixtures of phospholipids and cholesterol. Biophys. J., 85:30743083, 2003.

34. Kahya N., Scherfeld D., Bacia K., Poolman B., Schwille P. Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy. J. Biol. Chem., 278:28109-28115, 2003.

35. Veatch S.L., Keller S.L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Phys. Rev. Lett., 89:268101, 2002.

36. Nag K., Pao J.S., Harbottle R.R., Possmayer F., Petersen N.O., Bagatolli L.A. Segregation of saturated chain lipids in pulmonary surfactant films and bilayers. Biophys. J., 82:2041-2051, 2002.

37. Feigenson G.W., Buboltz J.T.,. Ternary phase diagram of dipalmitoyl-PC/ dilauroyl-PC/cholesterol: nanoscopic domain formation driven by cholesterol. Biophys. J.: 80:2775-2788, 2001.

38. Dietrich C., Bagatolli L.A., Volovyk Z.N., Thompson N.L., Levi M., Jacobson K., Gratton E. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophys. J., 80:1417-1428, 2001.

39. Bagatolli L.A., Gratton E. A correlation between lipid domain shape and binary phospholipid mixture composition in free standing bilayers: a twophoton fluorescence microscopy study. Biophys. J., 79:434-447, 2000.

40. Bagatolli L.A., Gratton E. Two photon fluorescence microscopy of coexisting lipid domains in giant unilamellar vesicles of binary phospholipid mixtures. Biophys. J., 78:290-305, 2000.

41. Bagatolli L.A., Gratton E., Khan T.K., Chong P.L. Two-photon fluorescence microscopy studies of bipolar tetraether giant liposomes from thermoacidophilic archaebacteria sulfolobus acidocaldarius. Biophys. J., 79:416-425, 2000.

42. Bagatolli L.A., Gratton E. Two-photon fluorescence microscopy observation of shape changes at the phase transition in phospholipid giant unilamellar vesicles. Biophys. J., 77:2090-2101, 1999.

43. Korlach J., Schwille P., Webb W.W., Feigenson G.W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:8461-8466, 1999.

44. Parasassi T., Gratton E., Yu W.M., Wilson P., Levi M. Two-photon fluorescence microscopy of laurdan generalized polarization domains in model and natural membranes. Biophys. J., 72:2413-2429, 1997.

45. Veatch S.L., Keller S.L. Seeing spots: complex phase behavior in simple membranes. Biochim. Biophys. Acta., 1746:172-185, 2005.

46. Bagatolli L.A., Gratton E. Direct observation of lipid domains in free standing bilayers using two-photon excitation fluorescence microscopy. J. Fluorescence, 11:141-160, 2001.

47. Bagatolli L.A., Sanchez S.A., Hazlett T., Gratton E. Giant vesicles laurdan and two-photon fluorescence microscopy: evidence of lipid lateral separation in bilayers. Methods Enzymol, 360:481-500, 2003.

48. Bagatolli L.A. To see or not to see: lateral organization of biological membranes and fluorescence microscopy. Biochim. Biophys. Acta., 1758:1541-56, 2006.

49. Kahya N., Brown D.A., Schwille P. Raft partitioning and dynamic behavior of human placental alkaline phosphatase in giant unilamellar vesicles. Biochemistry, 44:7479-7489, 2005.

50. Kahya N., Scherfeld D., Schwille P. Differential lipid packing abilities and dynamics in giant unilamellar vesicles composed of short-chain saturated glycerol-phospholipids sphingomyelin and cholesterol. Chem. Phys. Lipids, 135:169-180, 2005.

51. Bacia K., Schuette C.G., Kahya N., Jahn R., Schwille R SNAREs prefer liquid-disordered over "raft"(liquid-ordered) domains when reconstituted into giant unilamellar vesicles. J. Biol. Chem., 279:37951-55, 2004.

52. Scherfeld D., Kahya N., Schwille P. Lipid dynamics and domain formation in model membranes composed of ternary mixtures of unsaturated and saturated phosphatidylcholines and cholesterol. Biophys. J., 85:37583768, 2003.

53. Baumgart T., Hess S.T., Webb W.W. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension. Nature, 425:821-824, 2003.

54. De Vequi-Suplicy C.C., Benatti C.R., Lamy M.T. Laurdan in fluid bilayers: Position and structural sensitivity. J. Fluorescence, 16:431-439, 2006.

55. Jones M.E., Lentz B.R. Phospholipid lateral organization in synthetic membranes as monitored by pyrene-labeled phospholipids: effects of temperature and prothrombin fragment 1 binding. Biochemistry, 25:567574, 1986.

56. Garda H.A., Bernasconi A.M., Brenner R.R. Possible compensation of structural and viscotropic properties in hepatic microsomes and erythrocyte membranes of rats with essential fatty acid deficiency. J. Lipid Res, 35:1367-1377, 1994.

57. Lentz B.R., Barenholz Y., Thompson T.E. Fluorescence depolarization studies of phase transitions and fluidity in phospholipid bilayers. 2twocomponent phosphatidylcholine liposomes. Biochemistry, 15:45294537, 1976.

58. Lentz B.R., Barenholz Y., Thompson T.E. Fluorescence depolarization studies of phase transitions and fluidity in phospholipid bilayers. 1. single component phosphatidylcholine liposomes. Biochemistry, 15:4521-4528, 1976.

59. Lentz B.R. Use of fluorescent probes to monitor molecular order and motions within liposome bilayers. Chem. Phys. Lipids, 64:99-116, 1993.

60. Parasassi T., Conti F., Glaser M., Gratton E. Detection of phospholipid phase separation, a multifrequency phase fluorimetry study of 16-diphenyl-135-hexatriene fluorescence. J. Biol Chem., 259:14011-14017, 1984.

61. Wolber P.K., Hudson B.S. Fluorescence lifetime and time-resolved polarization anisotropy studies of acyl chain order and dynamics in lipid bilayers. Biochemistry, 20:2800-2810, 1981.

62. Mateo C.R., Lillo M.P., Gonzalez-Rodriguez J., Acuna A.U. Lateral heterogeneity in human platelet plasma membrane and lipids from the time-resolved fluorescence of trans-parinaric acid. Eur. Biophys. J., 20:5359, 1991.

63. Velez M., Lillo M.P., Acuna A.U., Gonzalez-Rodriguez J. Cholesterol effect on the physical state of lipid multibilayers from the platelet plasma membrane by time-resolved fluorescence. Biochim. Biophys. Acta., 1235:343-350, 1995.

64. Bagatolli L.A., Maggio B., Aguilar F., Sotomayor C.P., Fidelio G.D. Laurdan properties in glycosphingolipid phospholipid mixtures: a comparative fluorescence and calorimetric study. Biochim. Biophys. Acta., 1325:80-90, 1997.

65. Bagatolli L.A., Parasassi T., Fidelio G.D., Gratton E. A model for the interaction of 6-lauroyl-2-(NN-dimethylamino)naphthalene with lipid environments: implications for spectral properties. Photochem. Photobiol, 70:557-564, 1999.

66. Parasassi T., Conti F., Gratton E. Time-resolved fluorescence emission spectra of Laurdan in phospholipid vesicles by multifrequency phase and modulation fluorometry. Cell Mol Biol, 32:103-108, 1986.

67. Parasassi T., Stasio G., Ravagnan R., Rusch R.M., Gratton E. Quantitation of lipid phases in phospholipid vesicles by the generalized polarization of laurdan fluorescence. Biophys. J., 60:179-189, 1991.

68. Parasassi T., Stefano M.D., Loiero M., Ravagnan G., Gratton E. Influence "of cholesterol on phospholipid bilayers phase domains as detected by laurdan fluorescence. Biophys. J., 66:120-132, 1994.

69. Krasnowska E.K., Gratton E., Parasassi T. Prodan as a membrane surface fluorescence probe: partitioning between water and phospholipid phases. Biophys. J., 74:1984-1993, 1998.

70. Krasnowska E.K., Bagatolli L.A., Gratton E., Parasassi T. Surface properties of cholesterol-containing membranes detected by prodan fluorescence. Biochim. Biophys. Acta., 1511:330-340, 2001.

71. Ipsen J.H., Mouritsen O.G., Zuckermann M.J. Theory of thermal anomalies in the specific heat of lipid bilayers containing cholesterol. Biophys. J., 56:661-7, 1989.

72. Harris F.M., Best K.B., Bell J.D. Use of laurdan fluorescence intensity and polarization to distinguish between changes in membrane fluidity and phospholipid order. Biochim. Biophys. Acta., 1565:123-8, 2002.

73. Zhang Y., Frangos J., Chachisvilis M. Laurdan fluorescence senses mechanical strain in the lipid bilayer membrane. Biochem. Biophys. Res. Com, 347:838-841, 2006.

74. Anderson R., Jacobson K. A role for lipid shells in targeting proteins to caveolae, rafts, and other lipid domains. Science, 296:1821-5, 2002.

75. Bellve K.D., Leonard D., Standley C., Lifshitz L.M., Tuft R.A., Hayakawa A., Corvera S., Fogarty K.E. Plasma membrane domains specialized for clathrin-mediated endocytosis in primary cells. J. Biol. Chem., 281:1613946, 2006.

76. Chen Y., Lagerholm B.C., Yang B., Jacobson K. Methods to measure the lateral diffusion of membrane lipids and proteins. Methods, 39:147-53, 2006.

77. Nenasheva T.A., Mashanov G.I. Visualizing single fluorophores in live cells. Biofizika, 51:454-65, 2006.

78. Mashanov G.I., Nenasheva T.A., Peckham M., Molloy J.E. Cell biochemistry studied by single-molecule imaging. Biochem. Soc. Trans., 34:983-8, 2006.

79. Pucadyil T.J., Chattopadhyay A. Effect of cholesterol on lateral diffusion of fluorescent lipid probes in native hippocampal membranes. Chem. Phys. Lipids, 143:11-21, 2006.

80. Przybylo M., Sykora J., Humpolickova J., Benda A., Zan A., Hof M. Lipid diffusion in giant unilamellar vesicles is more than 2 times faster than in supported phospholipid bilayers under identical conditions. Langmuir, 22:9096-9, 2006.

81. White S.H., Ladokhin A.S., Jayasinghe S., Hristova K. How membranes shape protein structure. J. Biol Chem., 276:32395-8, 2001.

82. Tristram-Nagle S., Nagle J.F. Lipid bilayers: thermodynamics, structure, fluctuations, and interactions. Chem. Phys. Lipids, 127:3-14, 2004.

83. Seddon J.M., Templer R.H. Polymorphysm of lipid-water systems in: R.Lipowski and E. Sackmann (Eds.) Handbook of biological physics. Elsevier science B.V., 1995.

84. Cantor R.S. Lateral pressure in cell membranes: a mechanism for modulation of protein function. J. Phys. Chem. B, 101:1723-1725, 1997.

85. Marsh D. Lateral pressure in membranes. Biochim. Biophys. Acta., 1286:183-223, 1996.

86. Epand R.M. Lipid polymorhysm and proteun-lipid interactions. Biochim. Biophys. Acta., 1376:353-368, 1998.

87. Gawrisch K, Holte L.L. NMR investigations of non-lamellar phase promoters in the lamellar phase state. Chem. Phys. Lipids, 81:105-116, 1996.

88. Templer R.H., Castle S.J., Curran A.R., Rumbles G., Klug D.R. Sensing isothermal changes in lateral pressure ■ in model membranes using di-pyrenyl phosphatidylcholine. Faraday Discuss, 111:41-53 discussion (6978), 1998.

89. Laan E.B., Dalbey R.E., Demel R.A., Killian J.A., Kruijff B. Effect of nonbilayer lipids on membrane binding and insertion of the catalityc domain of leader peptidase. Biochemistry, 40:9677-9684, 2001.

90. Cantor R.S. Lipid composition and lateral pressure profile in bilayers. Biophys. J., 76:2625-2639, 1999.

91. Cantor R.S. Size distribution of barrel-stave aggregates of membrane peptides: influence of the bilayer lateral pressure profile. Biophys. J., 82:2520-2525, 2002.

92. Harries D., Ben-Shaul A. Conformational chain statistics in a model lipid bilayer: comparison between mean field and Monte Carlo calculations. J. Chem. Phys., 106:1609-1619, 1997.

93. Venturoli M., Smith B. Simulating the self assembly of model membranes. Phys. Chem. Comm., 10, 1999.

94. Lindahl E., Endholm O. Spatial and energetic-entropic decomposition of surface tension in a lipid bilayer by molecular dynamics simulations. J. Chem. Phys., 113:3882-3893, 2000.

95. Gullingsrud J., Shulten K. Gating of MscL studied by steered molecular dynamics. Biophys. J., 85:2087-2099, 2003.

96. Cantor R.S. The lateral pressure profile in membranes: a physical mechanism of general anesthesia. Toxicol. Lett., 100:451-458, 1998.

97. Cantor R.S. The influence of membrane lateral preddures on simple geometric models of protein comformational equilibria. Chem. Phys. Lipids, 101:45-56, 1999.

98. Cantor R.S. Solute modulation of conformational equlibria in intrinsic membrane proteins: apparent. Biophys. J., 77:2643-2647, 1999.

99. Szleifer I.I., Ben-Shaul A., Gelbart W.M. Chain packing statistics and thermodynaics of amphiphile monolayers. J. Phys. Chem. B, 94:50815089, 1990.

100. Kruijff B. Lipids beyond the bilayer. Nature, 386:129-130, 1997.

101. Kruijff B. Lipid polymorphism and biomembrane function. Curr. Opin. Chem. Biol., 1:564-569, 1997.

102. Bezrukov S.M. Functional consequences of lipid packing stress. Curr. Opin. Colloid Iterface Sci, 5:237-243, 2000.

103. Cullis P.R., Hope M.J., Tilcock C.P. Lipid polymorphism and the roles of lipid in membranes. Chem. Phys. Lipids, 40:127-144, 1986.

104. Marsh D., Watts A., Smith I.C. Dynamic structure and phase behavior of dimyristoylphosphatidylethanolamine bilayers studied by deuterium nuclear magnetic resonance. Biochemistry, 22:3023-3026, 1983.

105. Perly B., Smith I.C., Jarrell H.C. Effects of replacement of double bond by a cyclopropane ring in phosphatidylethanolamines:a 2H NMR studyof phase transitions and molecular organisation. Biochemistry, 24:10551064, 1985.

106. Cantor R.S. The lateral pressure profile in membranes: a physical mechanism of general anesthesia. Biochemistry, 36:2339-2344, 1997.

107. Buck M. Trifluoroethanol and colleagues: cosolvent come of age. resent studies with peptides and proteins. Q. Rev. Biophys31:297-355, 1998.

108. Hamada D., Chiti F., Guijarro J.I., Kataoka M., Taddei. N., Dobson C.M. Evidence concerning rate-limiting steps in protein folding from effects of trifluoroethanol. Nat. Struct. Biol, 7:58-61, 2000.

109. Yiu C.P., Mateu M.G., Fersht A.R. Protein folding transition states: elicitation of hammond effects by 2,2,2-trifluoroethanol. Chembiochem., 1:49-55, 2000.

110. Cheng K.H., Ruymgaart L., Liu L.I., Somerharju P., Sugar LP. Intramolecular excimer kinetics of fluorescent dipyrenyl lipids: 1. DMPC/cholesterol membranes. Biophys. J., 67:902-913, 1994.

111. Cheng K.H., Ruymgaart L., Liu L.I., Somerharju P., Sugar I.P. Intramolecular excimer kinetics of fluorescent dipyrenyl lipids: 2. DOPE/DOPC membranes. Biophys. J., 67:914-921, 1994.

112. Cheng K.H., Somerharju P. Effects of unsaturation and curvature on the transverse distribution of intramolecular dynamics of dipyrenyl lipids. Biophys. J., 70:2287-2298, 1996.

113. Lakowicz J.R. Principles of fluorescence spectoscopy 2nd edition. Kluwer Academic/Plenum Publishers, 1999.

114. Blatt E., Sawyer W. Depth-dependent fluorescent quenching in micelles and membranes. Biochim. Biophys. Acta., 822:43-62, 1985.

115. Thulborn K.R., Sawyer W.H. Properties and the locations of a set of fluorescent probes sensitive to the fluidity gradient of the lipid bilayer. Biochim. Biophys. Acta., 511:125-140, 1978.

116. Moro F., Goni F.M., Urbaneja M.A. Fluorescence quenching at interfaces and the permeation of acrylamide and iodide across phospholipid bilayers. FEBS Lett., 330:129-32, 1993.

117. Bartlett D., Glaser M., Welti R. Membrane penetration depth and lipid phase preference of acyl-labeled dansyl phosphatidylcholines in phosphatidylcholine vesicles. Biochim. Biophys. Acta., 1328:48-54, 1997.

118. Chattopadhyay A., London E. Spectroscopic and ionization properties of n-(7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazol-4-yl)-labeled lipids in model membranes. Biochim. Biophys. Acta., 938:24-34, 1988.

119. Huster D., Muller P., Arnold K., Herrmann A. Dynamics of lipid chain attached fluorophore 7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazol-4-yl (NBD) in negatively charged membranes determined by NMR spectroscopy. Eur. Biophys. J., 32:47-54, 2003.

120. Johnson I.D., Kang H.C., Haugland R.P. Fluorescent membrane probes incorporating dipyrrometheneboron difluoride fluorophores. Anal. Biochem., 198:228-237, 1991.

121. Davenport L., Shen B., Joseph T.W., Straher M.P. A novel fluorescent coronenyl-phospholipid analogue for investigations of submicrosecond lipid fluctuations. Chem. Phys. Lipids, 109:145-56, 2001.

122. Chalpin D.B., Kleinfeld A.M. Interactions of fluorescence quenchers with the n-(9-anthroyloxy) fatty acid membrane probes. Biochim. Biophys. Acta., 731:465-474, 1983.

123. Cranney M., Cundall R.B., Jones G.R., Richards J.T., Thomas B.W. Fluorescence lifetime and quenching studies on some interesting diphenylhexatriene membrane probes. Biochim. Biophys. Acta., 735:418425, 1983.

124. Langner M., Hui S. Iodide penetration into lipid bilayer as a probe of membrane lipid organization. Chem. Phys. Lipids, 60:127-132, 1991.

125. Luisetti J., Mohwald H., Galla H.J. Monitoring the location profile of fluorophores in phosphatidylcholine bilayers by the use or paramagnetic quenching. Biochim. Biophys. Acta., 552:519-30, 1979.

126. Constantinides P.P., Wang Y.Y., Burke T.G., Tritton T.R. Transverse location of anthracyclines in lipid bilayers. paramagnetic quenching studies. Biophys Chem, 35:259-64, 1990.

127. Lala A.K., Koppaka V. Transverse location of new fluorene based depth dependent fluorescent probes in membranes-quenching studies with 9,10-dibromostearic acid. Photochem. Photobiol., 49:763-7, 1989.

128. London E., Feigenson G.W. Fluorescence quenching in model membranes. 1. characterization of quenching caused by a spin-labeled phospholipid. Biochemistry, 20:1932-8, 1981.

129. Chattopadhyay A., London E. Parallax method for direct measurement of membrane penetration depth utilizing fluorescence quenching by spinlabeled phospholipids. Biochemistry, 26:39-45, 1987.

130. Kaiser R.D., London E. Determination of the depth of bodipy probes in model membranes by parallax analysis of fluorescence quenching. Biochim. Biophys. Acta., 1375:13-22, 1998.

131. Kachel K., Asuncion-Punzalan E., London E. The location of fluorescence probes with charged groups in model membranes. Biochim. Biophys. Acta., 1374:63-76, 1998.

132. Cadenhead D.A., Kellner B.M.J., Miller-Landau F. A comparison of a spin-label and a fluorescent cell membrane probe using pure and mixed monomolecular films. Biochim. Biophys. Acta., 382:253-259, 1975.

133. Lee T.D., Birrell G.B., Keana J.F.W. A new series of minimum steric perturbation nitroxide lipid spin probes. J. Am. Chem. Soc., 100:16181619, 1978.

134. Vogel A., Scheidt H.A., Huster D. The distribution of lipid attached spin probes in bilayers: application to membrane protein topology. Biophys. X, 85:1691-1701, 2003.

135. Ladokhin A.S. Distribution analysis of depth-dependent fluorescence quenching in membranes: a practical guide. Methods Enzymol., 278:46273, 1997.

136. Barenholz Y., Cohen T., Korenstein R., Ottolenghi M. Organization and dynamics of pyrene and pyrene lipids in intact lipid bilayers. photo-induced charge transfer processes. Biophys. J., 59:110-124, 1991.

137. Koppel D.E., Fleming P.J., Strittmatter P. Intramembrane positions of membrane-bound chromophores determined by excitation energy transfer. Biochemistry, 18:5450-7, 1979.

138. Davenport L., Dale R.E., Bisby R.H., Cundall R.B. Transverse location of the fluorescent probe l,6-diphenyl-l,3,5-hexatriene in model lipid bilayer membrane systems by resonance excitation energy transfer. Biochemistry, 24:4097-108, 1985.

139. Podo F., Blasie J.K. Nuclear magnetic resonance studies of lecithin bimolecular leaflets with incorporated fluorescent probes. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 74:1032-6, 1977.

140. Molotkovsky J.G., Manevich Y.M., Babak V.I., Bergelson L.D. Perylenoyl- and anthrylvinyl-labeled lipids as membrane probes. Biochim. Biophys. Acta., 778:281-288, 1984.

141. Hoff B., Strandberg E., Ulrich A.S., Tieleman D.P., Posten C. 2H-NMR study and molecular dynamics simulation of the location, alignment, and mobility of pyrene in POPC bilayers. Biophys. J., 88:1818-27, 2005.

142. Jose J., Burgess K. Benzophenoxazine-based fluorescent dyes for labeling biomolecules. Tetrahedron, 62:11021-11037, 2006.

143. Treibs A., Haberle H. Concerning the synthesis and the electron spectrum of ms-substituted porphine. Liebigs Ann. Chem., 718:183-207, 1968.

144. Karolin J., Johansson L.B.-A., Strandberg L., Ny T. Fluorescence and absorption spectroscopic properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) derivatives in liquids lipid membranes and proteins. J. Am. Chem. Soc., 116:7801-7806, 1994.

145. Ulrich G., Ziessel R. Convenient and efficient synthesis of functionalized . oligopyridine ligands bearing accessory pyrromethene-BF2 fluorophores. J. Org. Chem., 69:2070-83, 2004.

146. Meltola N.J., Wahlroos R., Soini A.E. Hydrophilic labeling reagents of dipyrrylmethene-BF2 dyes for two-photon excited fluorometry: syntheses and photophysical characterization. J. Fluorescence, 14:635-47, 2004.155. www.invitrogen.com.

147. Rosenwald A.G., Pagano R.E. Intracellular transport of ceramide and its metabolites at the golgi complex: insights from short-chain analogs. Adv. Lipid Res., 26:101-118, 1993.

148. Bergstrom F., Hagglof P., Karolin J., Ny Т., Johansson L.B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:12477-81, 1999.

149. Lala A.K. Fluorescent and photoactivable probes in depth-dependent analysis of membranes. Chem. Phys. Lipids, 116:177-88, 2002.

150. Newton B.F. Site of action of polymixin on pseudomonas aeruginosa: antagonism by cations. J. Gen. Microbiol., 10:491-499, 1954.

151. Молотковский Ю.Г. Флуоресцентные липидные зонды: свойства и применение. Биоорган, химия, 25:855-867, 1999.

152. Birks J.B. Photophysical processes. In Photophysics of aromatic molecules. Willey-Interscience, 1970.

153. Birks J.B. Eximers. Rep. Prog. Phys, 38:903-974, 1975.

154. Birks J.B. The photophysics of aromatic eximers. In The Exiplex. Academic press, 1975.

155. Pagano R.E., Chen C.S.,. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Ann. N. Y. Acad. Sci., 845:152-160, 1998.

156. Dahim M.N., Mizuno X.M., Momsen W.E., Momsen M.M., Brockman H.L. Physical and photophysical characterization of a BODIPY phisphatidylcholine as a membrane probe. Biophys. J., 83:1511-1524, 2002.

157. Bergstrom F., Mikhalyov I., Hagglof P., Wortmann R., Ny T., Johansson L.B. Dimers of dipyrrometheneboron (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc., 124:196-204, 2002.

158. Mikhalyov I., Gretskaya N., Bergstrom F., Johansson L. Electronic ground and exited state properties of dipyrromethenboron difluoride (BODIPY) dimers with application to biosciences. Phys. Chem. Chem. Phys., 4:56635670, 2002.

159. Burghardt T.P., Lyke J.E., Ajtai K. Fluorescence emission and anisotropy from rhodamine dimmers. Biophys. Chem., 59:119-131, 1996.

160. Kubista M., Sjoback R., Eriksson S. Experimental correction for the innerfilter effect in fluorescence spectra. Analyst, 119:417-419, 1994.

161. Matsuzaki K., Murase O., Sugishita K., Yoneyama S., Akada K., Ueha M., Nakamura A., Kobayashi S. Optical characterisation of liposomes byv right angle light scattering and turbidity measurments. Biochim. Biophys.

162. Acta., 1467:219-226, 2000.

163. White G., Pencer J., Nickel B.G., Wood J.M., Hallett F.R. Optical changes in unilamellar visicles experiencing osmotic stress. Biophys. J., 71:27012715, 1996.

164. Holland J.F., Teets R.E., Kelly P.M., Timnick A. Correction of right-angel fluorescence measurements for the absorption of excitation radiation. Anal Chem., 49:706-710, 1977.

165. Yappert M.C., Ingle J.D. Correction of polycromatic luminescence signals for inner-filter effects. Appl. Spectrosc., 43:759-767, 1989.

166. Christman D.R., Crouch S.R., Timnick A. Precision and accuracy of absorption-corrected molecular fluorescence measurements by the cell shift method. Anal Chem., 53:2040-2044, 1981.

167. Riesz J., Gilmore J., Meredith P. Quantitative photoluminescence of broad band absorbing melanins: a procedure to correct for inner filter and reabsorption effects. Spectrochim Acta A, 61:2153-60, 2005.

168. Borissevitch I.E. More about the inner-filter effect: corrections of SternVolmer fluorescence quenching constants are necessary at very low optical absorbtion of the quencher. J. Luminescence, 81:219-224, 1999.

169. Subbarao N.K., MacDonald R.C. Experimental method to correct fluorescence intensities for the inner filter effect. Analyst, 118:913-916, 1993.

170. Marsh D. Membrane water-penetration profiles from spin labels. Eur. Biophys. J., 31:559-562, 2002.

171. Sankaram M.B., Thompson T.E. "Modulation of phospholipids acyl chain order by cholesterol. A solid-state 2H Nuclear magnetic resonance study. Biochemistry, 29:10676-10684, 1990.

172. Lagane B., Mazeres S., Grimellec C., Cezanne L., Lopez A. Lateral distribution of cholesterol in membranes probed by means of a pyrene-labelled cholesterol: effect of acyl chain unsaturation. Biophys. Chem, 95:7-22, 2002.

173. Bergelson L.D., Molotkovsky J.G., Manevich Y.M. Lipid-specific probes in studies of biological membranes. Chem. Phys. Lipids, 37:165-195, 1985.

174. Menger F.M., Keiper J.S., Caran K.L. Depth-profiling with giant vesicle membranes. J. Am. Chem. Soc., 116:7801-7806, 2002.

175. Eftink M.R., Ghiron C.A. Fluorescence quenching studies with proteins. Anal Biochem., 114:199-227, 1981.

176. Heller H., Schaefer M., Schulten K. Molecular dynamics simulation of a bilayer of 200 lipids in the gel and in the liquid-crystal phases. J. Phys. Chem. B, 97:8343-8360, 1993.

177. Smaby J.M., Momsen M.M., Brockman H.L., Brown R.E. Phosphatidylcholine acyl unsaturation modulates the decrease in interfacial elasticity induced by cholesterol. Biophys. J., 73:1492-1505, 1997.

178. Thulborn K.R., Tilley L.M., Sawyer W.H., Treloar F.E. The use of n-(9-anthroyloxy) fatty acids to determine fluidity and polarity gradients in phospholipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta., 558:166-78, 1979.

179. Singer S.J., Nicolson G.L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science, 175:720-31, 1972.

180. Shinitzky M., Dianoux A.C., Gitler C., Weber G. Microviscosity and order in the hydrocarbon region of micelles and membranes determined with fluorescent probes. I. Synthetic micelles. Biochemistry, 10:2106-13, 1971.

181. Cullis P.R., Fenske D.B., Hope M.J. Biochemistry of lipids, lipoproteins and membranes. New York: Elsevier Science B.V., 1996.

182. Villalain J. Location of cholesterol in model membranes by magic-angle-sample-spinning nmr. Eur. J. Biochem., 241:586-593, 1996.

183. Mcintosh T.J. Structure and the physical properties of the lipid membrane. Current topics membr., 48:23-47, 1999.

184. Tilley L., Thulborn K.R., Sawyer W.H. An assessment of the fluidity gradient of the lipid bilayer as determined by a set of n-(9-anthroyloxy) fatty acids (n 2, 6, 9, 12, 16). J. Biol. Chem., 254:2592-2594, 1979.

185. Xu H., Huang C. Scanning calorimetric study of fully hydrated asymmetric phosphatidylcholines with one acyl chain twice as long as the other. Biochemistry, 26:1036-1043, 1987.

186. Lala A.K., Dixit R.R., Koppaka V. Depth-dependent photolabelling ofmembrane hydrophobic core with 9-diazofluorene-2-butyric acid. Biochim. Biophys. Acta., 978:333-336, 1989.

187. Hutterer R., Schneider F.W., Hof M. Anisotropy and lifetime profiles for n-anthroyloxy fatty acids: a fluorescence method for the detection of bilayer interdigitation. Chem. Phys. Lipids, 86:51-64, 1997.

188. Молотковский Ю.Г., Дмитриев П.И., Никулина Л.Ф., Бергельсон Л.Д. Синтез новых флуоресцентномеченых фосфатидилхолинов. Биоорган. химия, 5:588-594, 1979.

189. Бергельсон Л.Д., Дятловицкая Э.В. Препаративная биохимия липи-дов. М.: Наука, 1981.

190. Durham L.J., McLeod D.J., Cason J. Methyl hydrogen hendecanedioate. Org. syntheses, 38:55-56, 1958.

191. Momsen W.E., Smaby J.M., Brockman H.L. The suitability of nichrome for measurement of gas-liquid interfacial tension by the wilhelmy method. J. Colloid Interface Sci., 135:547-552, 1990.