Реакции гидрофильных аналогов коэнзима Q в дыхательной цепи митохондрий тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Московский Государственный Университет имени М. В. Ломоносова Химический факультет

□□3484694

На правах рукописи

Мотовилов Константин Александрович

Реакции гидрофильных аналогов коэнзима О в дыхательной цепи митохондрий

02. 00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

2 С КОЯ ?003

Москва 2009

003484694

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова и в отделе биоэнергетики Института физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ягужинский Лев Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Левашов Андрей Вадимович

доктор биологических наук, профессор Кобляков Валерий Александрович

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии Наук Институт теоретической и экспериментальной биофизики, г. Пущино

Защита состоится 8 декабря 2009 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Химическом факультете МГУ по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1, НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ. Автореферат разослан ноября 2009 года

Учёный секретарь совета, кандидат химических наук

Смирнова И. Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

В настоящее время показано, что начальный участок электрон-транспортной цепи — ИАВН дегидрогеназа (комплекс I) в митохондриях включает характерный сайт, связывающий ксенобиотики. Этот сайт с высокой эффективностью взаимодействует с бифильными молекулами, содержащими большой гидрофобный фрагмент. Такие молекулы могут относиться к самым различным классам органических соединений — ароматическим спиртам, амидам, эфирам кислот и др.; их попадание в митохондрии может осуществляться разными путями: например в форме лекарств, в качестве компонентов пищевой диеты; их появление может быть вызвано антропогенными загрязнениями окружающей среды, а также образованием аномальных продуктов в результате нарушения метаболизма клеток и организмов. Указанный сайт связывания ксенобиотиков взаимодействует также со структурными аналогами коэнзима С* (ротеноном и пиерицидином). Поэтому очевидно, что сайт связывания чужеродных молекул является одним из мест посадки коэнзима 0 в комплексе I. Именно поэтому посадка чужеродных соединений на сайт связывания коэнзима <3 блокирует функцию всей электрон-транспортной цепи и прерывает синтез АТФ. Поскольку митохондрии кроме функции энергообеспечения выполняют также функцию удаления избытка кислорода из клетки, подавление электрон-транспортной цепи должно вызывать окислительный стресс в результате накопления избытка кислорода и восстановленных пиридиновых нуклеотидов. Важно указать, что сайт связывания ксенобиотиков в дыхательной системе митохондрий обладает примерно такой же селективностью по отношению к ксенобиотикам, как и система множественной лекарственной устойчивости (он не взаимодействует с отрицательно заряженными молекулами). Кроме того, известно, что константа ингибирования КАБН де-гидрогеназы гидрофобными веществами различной химической природы хорошо коррелирует с константой связывания этих веществ с микросомальны-ми оксидазами — цитохромами Р450. Это говорит о том, что ключевые параметры систем защиты организма против ксенобиотиков подобраны в клетках таким образом, чтобы осуществлять эффективную защиту электрон-транспортной цепи от воздействия чужеродных веществ. Тем не менее, очевидно, что работа этих систем не выполняет полностью задачу защиты электрон-транспортной цепи при действии ксенобиотиков в клетка (органах), которые подвергаются массированному воздействию ксенобиотиков. Поэтому в митохондриях клеток, которые подвергаются массированному воздействию ксенобиотиков, в частности в митохондриях печени и лимфоцитов, присутствует дополнительная ЫАВН дегидрогеназа — так называемая ДТ-дифораза, в которой роль кофакторов вместо коэнзима 0 играют полярные хиноны, которые могут рассматриваться как аналоги коэнзима Хиноны этой группы с участием ДТ-диафоразы фактически формируют шунт в обход блока системы электронного транспорта в комплексе I, восстанавливают транспорт электронов в центральном и терминальной участках электрон-

транспортной цепи — Ьсгкомплексе (комплексе III) и цитохром с оксидазе (комплексе IV). При этом было приято считать, что при работе шунта хино-ны и ДТ-диафораза катализируют реакцию окисления NADH комплексом III. Кроме того, кофермент Q участвует не только в окислительно-восстановительных реакциях, но участвует также в энергозависимом транспорте ионов водорода через мембрану. Поэтому аналоги кофермента Q в принципе могут в восстановленной форме оказывать влияние не только на транспорт электронов, но и на работу системы протонного транспорта.

Однако детальное изучение окислительно-восстановительных реакций хинонов, а также реакций транспорта протона, протекающих при работе шунта, до настоящего времени не было проведено.

Целью работы явилось детальное изучение окислительно-восстановительных реакций, протекающих в начальном сегменте электрон-транспортной системы митохондрий в присутствии гидрофильных хинонов в условиях подавления функции комплекса I. Также целью работы было изучение влияния гидрофильных хинонов (гидрохинонов) на функционирование системы протонного транспорта в мембранах митохондрий.

Конкретные задачи исследования:

1. Изучить вопрос об участии комплекса II в работе электрон-транспортной системы митохондрий в присутствии полярных аналогов убихинона в условиях подавления функции комплекса I.

2. Исследовать особенности реакций взаимодействия электронейтральных полярных аналогов кофермента Q с комплексами II и III электрон-транспортной системы митохондрий (при подавлении функции комплекса I).

3. Провести изучение реакций взаимодействия положительно заряженных хинонов с электрон-транспортной системой митохондрий.

4. Исследовать характер взаимодействия положительно-заряженных хинонов (гидрохинонов) с системой транспорта ионов водорода в митохондриях.

Научная новизна работы. В работе проведено систематическое исследование окислительно-восстановительных реакций гидрофильных аналогов кофермента Q (экзогенных хинонов), которые протекают в электрон-транспортной системе митохондрий в условиях блокирования активности электрон-транспортной системы в комплексе I. Этот комплекс контролирует всю систему электронного транспорта, процесс синтеза АТФ и, в значительной степени, процесс образования активных форм кислорода в митохондриях. В работе найдены неописанные ранее реакции гидрофильных хинонов, протекающие в электрон-транспортной системе, а также в системе трансмембранного транспорта ионов водорода.

В работе было обнаружено, что полярный аналог убигидрохинона — дурогидрохинон, который ранее рассматривался исключительно как субстрат комплекса III при определенных условиях эффективно окисляется комплек-

сом II (сукцинатдегидрогеназой). Показано, что в таких условиях дурогидро-хинон специфически взаимодействует с активным центром сукцинатдегид-рогеназы, показано, что он взаимодействует с активным центром этого фермента. Были определены также условия, при которых дурогидрохинон вступает в описанную ранее реакцию избирательного взаимодействия с комплексом III.

Установлено, что в условиях подавления функции комплекса I полярные аналоги кофермента Q индуцируют не один, как считалось ранее, а два параллельно функционирующих шунта, которые переносят электроны на комплекс III в обход комплекса I. Один из них, известный из данных литературы, — шунт, связанный с протеканием редокс-реакций на ДТ-диафоразе, и второй — обнаруженный нами шунт, связанный с функционированием сук-цинатдегидрогеназы. В работе показана возможность существования трех состояний электрон-транспортной системы митохондрий, возникающей в условиях блока комплекса I в присутствии полярных аналогов кофермента Q (как хинонов, так и гидрохинонов).

Впервые обнаружена способность соединений ряда положительно заряженных хинонов эффективно восстанавливаться ДТ-диафоразой митохондрий печени и затем окисляться комплексом III.

Исследован механизм взаимодействия положительно заряженных гидрохинонов с системой протонного транспорта митохондрий. Показана способность этих соединений модифицировать терминальную стадию работы дыхательных протонных помп.

Практическая значимость работы. В настоящей работе обнаружены новые окислительно-восстановительные процессы, которые протекают в присутствии гидрофильных хинонов в условиях блока комплекса I ксенобиотиками. Результаты, полученные в настоящей работе, расширяют круг наших знаний о возможных путях восстановления функции митохондрий с помощью гидрофильных аналогов кофермента Q. Фактически эти соединения могут быть использованными для защиты энергообеспечения клетки от воздействия гидрофобных или бифильных ксенобиотиков различного строения, попадающих в организм в качестве загрязнений из окружающей среды и в качестве лекарственных препаратов. Полученные в работе данные имеют большую значимость в условиях массированного загрязнения окружающей среды продуктами антропогенной деятельности, а также в условиях стремительного роста количества новых лекарственных препаратов, используемых человечеством.

Апробация работы. Основные положения данной работы и ее основные результаты были представлены на международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, Россия, 5-7 июня 2007), международной конференции "15th European Bioenergetics Conference 2008" (Дублин, Ирландия, 19-24 июля 2008), международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, Россия, 2-4 июня 2009), международной конференции "The 34th FEBS Congress" (Прага, Чехия, 4-9 июля 2009). Кроме того, некоторые из результатов этой работы были представлены

в Институте Физико-Химической Биологии имени Белозерского МГУ имени М. В. Ломоносова на семинарах отдела биоэнергетики.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: «Список сокращений», «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список цитируемой литературы». Объем диссертации составляет 125 страниц машинописного текста и включает 57 рисунков, 7 таблиц и 155 библиографических ссылок.

Список сокращений.

2,3Q — 2,3-диметил-1,4-бензохинон; ДТД — ДТ-диафораза;

Комплекс I — NADH дегидрогеназа (NADH убихинон оксидоредуктаза); Комплекс II — сукцинатдегидрогеназа (сукцинат убихинон оксидоредуктаза);

Комплекс III — Ьсркомплекс (убихинол цитохром с оксидоредуктаза); Комплекс IV — цитохром с оксидаза; ПХФ — пентахлорофенол; СДГ — сукцинатдегидрогеназа;

ТТФА — теноилтрифторацетон (4,4,4-трифторо-1-(2-тиенил)-1,3-бутандион);

ТХФ —2,4,6-трихлорофенол;

ТХФ-С15 — 2,4,6-трихлоро-З-пентадецилфенол;

Шунт — шунт переноса электронов в обход блокированной NADH дегидро-

геназы, создаваемый гидрофильными хинонами и ДТ-диафоразой;

DQ/DQH2 •— дурохинон/дурогидрохинон;

FCCP — п-трифторометоксикарбонилцианидфенилгидразон;

NEM - N-этилмалеимид;

Q/QH2 — гидрофильный хинон/гидрофильный гидрохинон;

Q10/Q10H2 — убихинон/убигидрохинон;

TTFB — 4,5,6,7-тетрахлоро-2-трифторметилбензимидазол.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

На рис. 1 представлены структурные формулы хинонов, реакции которых в электрон-транспортной цепи митохондрий, исследовались в данной работе. Эти хиноны можно разделить на две группы, главное отличие между которыми заключается в наличии у хинонов V-VII положительно заряженной трифенилфосфониевой группировки в структуре, которая позволяет этим веществам накапливаться в энергизованных (имеющих потенциал на внутренней мембране) митохондриях.

I - Дурохинон II - Менадион

III - 2,3(2

IV-<5,

■СНАт-РРЧ.Вг

V - Мко(}|0: Я' = СН3, Я2= Я3= ОСН3

VI - ЭкО!: Я' = Н, К2= Я3 = СН3

VII - 8к(23: Я1 = Я2= Я3 = СН3

Рис. 1. Структуры хинонов, реакхщи которых в электрон-транспортной цепи митохондрий были исследованы в данной работе. Хиноны I-IV образуют группу гидрофильных хинонов (группа 1). Хиноны У-УП образуют группу так называемых митотропных хинонов (группа 2), способных благодаря наличию в структуре положительно заряженной три-фенилфосфониевой группировки накапливаться в матриксе митохондрий.

Часть I. Окислительно-восстановительные реакции хинонов (1-УН) в дыхательной цепи.

В условиях подавления функции первого комплекса гидрофильные аналоги ((2) убихинона ((2ю) — соединения 1-1У — индуцируют функционирование сукцинатдегидрогеназы митохондрий

Способность гидрофильных хинонов 1-1У восстанавливаться ДТ-диафоразой до соответствующих хинолов хорошо известна. В 60-х годах было показано, что в присутствии НАО+-зависимых субстратов эти хиноны реактивируют дыхательную и фосфорилирующую функцию митохондрий в условиях подавления комплекса I ротеноном. До настоящего времени считалось, что восстановленные ИАОН и ДТ-диафоразой гидрофильные хинолы окисляются непосредственно в Ьсркомплексе с участием природного убихинона Ою- При этом реализуется следующая последовательность реакций:

(5 + кабн + н+ лт-диафораза > дн2 + КАБ+,

<^.+<2,0-><№+<3 ,

/о

С)10Н2 + комплекс III...(процесс 1).

Эксперименты показали, однако, что дыхание митохондрий, активированное полярным хинолом — менадионом — в присутствии малата в среде частично (-30%) подавляется малонатом (рис. 2). ТТФА вызывает практически такой же эффект. Сходная качественно картина наблюдалась в случае электронейтральных хинонов (1-1У), в том числе с дурохиноном (I).

Рис. 2. Обнаружение шунта электронного транспорта в обход блока комплекса I, связанного с функционированием СДГ. На по-лярограмме можно видеть работу электрон-транспортной системы митохондрий в условиях блокирования функции комплекса I специфическим ингибитором — ротеноном. Функция терминального участка дыхательной цепи восстановлена путем внесения в систему гидрофильного хи-нона менадиона. На полярогралте видно, что специфический ингибитор комплекса II малонат частично (-30%) подавляет процесс поглощения кислорода. Малат (2 мМ)/глутамат (8 мМ) находятся в среде. Циклоспорин, ротенон и ПХФ были добавлены в среду инкубации перед менадионом.

Это позволило нам сделать предварительное заключение о том, что параллельно с процессом 1, который связан с функцией ДТД, полярные хиноны активируют процесс (2) в обход комплекса I, связанный с функцией СДГ:

НООССН2СН2СООН+ФАД—> НООССН=СНСООН+ФАДН2,

ФАДН2+(510—>ФАД + О10Н2,

С>10н2 + комплекс III... >Н20 (процесс 2).

В тоже время мы обратили внимание на то обстоятельство, что на первой стадии процесса (1) в системе образуется гидрохинон <ЗН2, который в силу формального структурного сходства с сукци-натом (рис. 3) в принципе мог бы играть роль субстрата СДГ в экспериментах, подобных тому, что представлен на рис. 2.

Дурохинол как новый субстрат сукцинатдегидрогеназы

В этом разделе проведена проверка гипотезы о том, что дурохинол может проявлять себя как субстрат сукцинатдегидрогеназы. При этом удалось показать, что использование дурохинола в качестве субстрата СДГ может восстанавливать функцию комплексов Ш-1У в условиях подавления функции комплекса I. Опыты проводились в присутствии ротенона, ингибитора ДТ-диафоразы дикумарола, а также разобщителя пентахлорофенола.

13

Рис.4. Подпрограммы, демонстрирующие окисление дурохинола (DQHz) электрон-транспортной цепью митохондрий:

а — линейность дыхания митохондрий в условиях окисления DQH2;

б, в — подавление процесса окисления DQH2 специфическими ингибиторами сукцинатдегидрогеназы ТТФА и малонатом;

г, д — подавление процесса окисления DQH2 специфическими ингибиторами bcj-комплекса миксотиазолом и антимицином.

Во всех представленных пробах перед дурохинолом в среду инкубации были добавлены: ингибитор комплекса I ротенон (1 мкМ), ингибитор ДТ-диафоразы дикумарол (10 мкМ), ингибитор открывания митохондриальной неспецифической поры циклоспорин (1 мкМ), разобщитель окислительного фосфорилырования пентахлорфенол (3 мкМ). Концентрация субстрата дыхания — дурохинола составляю 3 мМ.

На рис. 4 представлены данные ингибиторного анализа, на основании которых было сделано заключение о том, что DQH2 является полноценным субстратом сукцинатдегидрогеназы. Можно видеть, что скорость дыхания не изменяется во времени (рис. 4а) и, что главное, чувствительна к ингибиторам сукцинатдегидрогеназы ТТФА (рис. 46) и малонату (рис. 4в). Максимальное торможение малонатом, которое наблюдалось в этой серии экспериментов составляло 50-60%. Торможение ТТФА — около 50%.

Ингибиторы bci-комплекеа миксотиазол (рис. 4г) и антимицин (рис. 4д) подавляют окисление DQH2. Ингибитор комплекса III антимицин (рис.

4д) и ингибитор комплекса IV — цианид подавляют дыхание митохондрий, окисляющих DQH2, практически полностью.

Сопоставление степени торможения процесса окисления DQH2 в митохондриях ингибиторами комплексов II и III показывает, что -50% этого гидрохинона окисляется сукцинатдегидрогеназой и 50% — комплексом III.

В работе был выполнен докинг молекулы DQH? в активный центр сук-цинатдегидрогеназы (рис. 5). Была показана принципиальная возможность размещения молекулы искусственного субстрата вблизи места посадки близкого аналога субстрата (оксалоацетата) на расстоянии 6Ä от изоаллксазино-вого ядра. Установленная локализация DQH2 в активном центре согласуется с результатами ингибиторного анализа, согласно которым малонат — близкий структурный аналог естественного субстрата (а также оксалоацетата) подавляет реакцию окисления DQH2 на сукцинатдегидрогеназе.

Рис. 5. Докинг молекулы дурогидрохинона в сукцинатсвязывающий центр сукцинатдегид-рогеназы (код PDB: 1YQ3). Установлена возможность размещения дурогидрохинона (по пространственному критерию) на расстоянии, близком к изоаллоксазиновому ядру (~бА). На рисунках а и б проведено сопоставление положения дурогидрохинона в активном центре СДГ с положением близкого структурного аналога субстрата фермента сукцината — оксалоацетата, локализация которого в структуре комплекса II определена путем рентгеноструктурного анализа соответствующих кристаллов. Оптимальное положение дурохинола на ферменте рассчитано с помощью программы Lead Finder.

Что является субстратом (сукцинат или гидрохинон) сукцинатдегидро-геназы в условиях активации функционирования этого фермента гидрофильными аналогами убихинона

Как показывают приведенные выше данные, образующийся под действием ДТ-диафоразы дурогидрохинон DQH2 действительно может играть роль субстрата СДГ. В этом случае возникает вопрос о том, какой именно суб-

страт реально используется сукцинатдегидрогеназой в условиях наших экспериментов при протекании процесса (2) — сукцинат или 0(ЗН2

Для ответа на этой вопрос были проведены количественные эксперименты по измерению величины вклада сукцинатдегидрогеназы (процесс 2) в общий процесс поглощения кислорода митохондриями (процессы 1, 2). Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1. Идентификация СДГ-зависшюго шунта (в обход блока комплекса 1). Результаты измерений степени ингибирования дыхательной активности митохондрий специфическими ингибиторами сукцинатдегидрогеназы (СДГ) малонатом и ТТФА, определённые в условиях индукции ранее известного шунта, связанного с функционированием ДТ-диафоразы. Дыхание индуцировано гидрофильными хинонаии различного строения. Приведенные в таблице результаты даны в % от общей скорости дыхания; каждое значение получено на основании 3-7 экспериментов. Опыты проведены в присутствии 2мМ мала-

хинон (конц.) Ингибитор (конц.)

Хинон (формула) МАЛОНАТ (2,5 мМ) ТТФА(8 мкМ)

о

Дурохинон, 20 мкМ Н3С О 29±7 31±6

О II

Менадион, 8 мкМ с V О 26±8 28±8

о II

<Зо, 50 мкМ О 30±8 32±5

Несмотря на то, что свойства электрон-транспортной системы, функционирующей в присутствии гидрофильных хинонов, изучаются очень давно, мы не нашли работ, в которых бы проводилась регистрация активности сукцинатдегидрогеназы в условиях экспериментов с этими соединениями.

Между тем, этому феномену есть достаточно простое объяснение. Заключается оно в следующем.

Как уже отмечалось, ингибирование активности комплекса I (в присутствии ЫА0+-зависимых субстратов цикла Кребса) приводит к тому, что весь NAD+ переходит в восстановленную форму, цикл перестает работать в силу отсутствия субстрата. При внесении в систему гидрофильного хинона включается процесс окисления NADH. При этом происходит реактивация ферментов цикла Кребса, в том числе сукцинатдегидрогеназы (см. процесс 2). В наших условиях (в присутствии избытка глутамата 8 мМ) эффективно работает только часть цикла Кребса, в которой на одну молекулу сукцината синтезируется две молекулы NADH. Таким образом, теоретически ингибиторы СДГ не могут подавлять активность электрон-транспортной цепи более чем на 30%. В то время как при окислении DQH2 процент ингибирования может иметь сколь угодно большие значения.

Таким образом, из данных таблицы 1 можно видеть, что процент ингибирования суммарной активность электрон-транспортной цепи в условиях эксперимента, измеренный на большой серии экспериментов по стимуляции дыхания митохондрий хинонами различного строения, заметно не превышает 30%. Полученный результат позволяет сделать заключение о том, что субстратом сукцинатдегидрогеназы в условиях проведенных экспериментов является сукцинат, а не гидрохинон.

Реакции взаимодействия дурогидрохинона с комплексом II и комплексом III. Эффект переключения направления реакций дурогидрохинона при добавление низких концентраций окисленной формы этого соединения

Мы обнаружили эффект резкого изменения сродства дурогидрохинона к комплексу III в условиях, когда вместе с DQH2 добавлялось 2% окисленной формы этого соединения. Оказалось, что в таких условиях наблюдается повышение скорости окисления DQH2 (кривые а, б на рис. 6) и полное исчезновение чувствительности дыхания к ингибиторам комплекса II (кривая б на рис. 6). Далее было показано, что если вместо добавления окисленной формы хинона (DQ) индуцировать окисление пула кофермента Q путем предварительного добавления ингибиторов обеих дегидрогеназ (комплексов I и II), а также ингибитора ДТ-диафоразы, то наблюдается такой же эффект. Скорость окисления DQH2 возрастает (кривые в, г рис. 6) и полностью исчезает чувствительность к ингибиторам второго комплекса.

DQH,

DQH,

I

I

Рис. б. Низкие концентрации дурохинона переключают процесс взаимодействия DQH; с комплексом II на реакцию восстановления комплекса III. Можно видеть, что присутствие дурохинона приводит к исчезновению чувствительности дыхания к ингибиторам сук-цинатдегидрогеназы:

а — активность электрон-транспортной цепи, окисляющей высокоочищенный дурогид-рохинон, подавляется ингибитором сукгцшатдегидрогеназы малонатом;

б — при внесении вместе с дурогидрохиноном небольшого количества дурохинона (1:50 = = дурохинон:дурогидрохинон) чувствительность к малонату полностью исчезает;

в — активность электрон-транспортной цепи, окисляющей высоочищенный дурогидро-хинон, подавляется ингибитором сукцинатдегидрогеназы ТТФА;

г — в условиях окисления пула кофермента Q — при внесении ингибиторов двух дегидро-геназ ТТФА и ротенона, которое сделано перед добавлением субстрата электрон-транспортной цепи дурогидрохиноном, скорость поглощения кислорода не изменяется по сравнению со скоростью поглощения кислорода без ТТФА (в);

Во всех пробах перед добавлением дурогидрохинона и ТТФА (проба г) были добавлены ро-тенон, дикумарол, циклоспорин, ПХФ. В пробах аиб концентрации белка одинаковы. В пробах виг концентрации белка также одинаковы.

Таким образом, присутствие окисленной формы хинона в момент добавления избытка DQH2 приводит к резкому возрастанию сродства гидрохинона к комплексу III, а также и параллельно к повышению скорости окисления этого субстрата. В таблице 2 приведены дополнительные подтверждения результатов, представленных на рис. 6 в, г, где демонстрируется парадоксальный эффект ускорения работы системы электронного транспорта под действием ингибитора комплекса И. Можно предполагать, что в таких условиях эффективность комплекса III как системы окисляющей гидрохиноны, должна быть резко снижена в результате снижения концентрации окислен-

ной формы кофермента Q в N-центре Ьсркомплекса, которая, как известно, играет роль акцептора электронов в N-центре этого фермента. Обнаруженный эффект изменения сродства восстановленной формы хинонов к комплексам II и III в составе электрон-транспортной системы митохондрий вероятно следует рассматривать как указание на способность к саморегуляции системы электронного транспорта, индуцированной в митохондриях полярными хинонами — аналогами кофермента Q.

Таблица 2. Влияние порядка добавления DQH2 и ТТФА в суспензию митохондрий на скорость окисления дурогидрохинона.

«Аномальный» эффект ускорения процесса окисления DQH2 электрон-транспортной системой митохондрий под влиянием ингибитора сукцинатдегидрогеназы — ТТФА.

Возникновение эффекта определяется порядком добавления ингибиторов и субстрата и наблюдается в условиях полного окисления пула кофермента Q в момент добавления субстрата митохондриях путем предварительного внесения ингибиторов дегидрогеназ до добавления субстрата — DQH2 (Vttfa — скорость дыхания митохондрий при добавлении DQH2 после полного окисления пула Qw; Vdq2 — скорость дыхания митохондрий в условиях, когда в момент добавления DQH2 в системе присутствует восстановленная форма

QwHJ.

Номер эксперимента 1 2 3 4 5 Среднее значение и стандартная ошибка

Vttfa/VDOH2>% 95 100 153 148 122 124±12

Взаимодействие митотропных хинонов 8к<3 и Мко<3, содержащих в своей структуре положительно заряженную трифенилфосфониевую группировку, с ДТ-диафоразой

В специальном разделе работы был сделана попытка исследовать реакцию взаимодействия положительно заряженных хинонов ряда МкоС> с ДТ-диафоразой митохондрий (рис. 7).

Хорошо видно, что добавление в среду инкубации митохондрий ингибитора ДТ-диафоразы дикумарола (после того как в систему был добавлен ингибитор ИАОН дегидрогеназы ротенон) приводит к 50% снижению оставшейся активности электрон-транспортной системы (рис. 7а). Это является убедительным доказательством протекания реакции восстановления Мко(210 на ДТ-диафоразе митохондрий. Из контрольной кривой на рис. 76 видно, что добавление ингибитора сукцинатдегидрогеназы малоната достоверно снижает фоновую скорость остаточного дыхания, которая регистрируется после добавления ротенона. В связи с этим нам не удалось сделать однозначного вывода об активации сукцинатдегидрогеназной активности в условиях работы ДТ-диафоразы в присутствии МкоОю.

В этих экспериментах впервые был показан эффект включения положительно заряженных хинонов в систему электронного транспорта в мито-

хондриях. Это является наглядным свидетельством способности соединений ряда МкоСЬо к быстрым окислительно-восстановительным превращениям в условиях взаимодействия с ферментами электрон-транспортной цепи митохондрий.

Часть И.

Введение. Моделирование реакций гидрохинонов ряда вкО и Мко(2 как переносчиков ионов водорода через митохондриальные мембраны

Окислительно-восстановительные реакции хинонов, в том числе и ко-фермента сопряжены с реакциями присоединения-отщепления иона водорода:

Этот процесс протекает не только в растворах, но также и в системе окислительного фосфорилирования митохондрий при работе «дыхательных» протонных помп.

Из общих соображений можно было ожидать, что продукты восстановления некоторых хинонов в принципе могут обладать протонофорной активностью

Рис. 7. Взаимодействия Мио(2юС ДТ-диафоразой митохондрий печени в условиях блокирования функции комплекса 1.1 — добавка ротенона, 2 — добавка ингибитора ДТ-диафоразы дикумарола.З — добавка мал оната. Цифры на полярогрммах соответствуют скоростям дыхания митохондрий в мкМ 02/мг белка/мин.

5 мин

С>10Н2*

и модулировать механизм транспорта ионов водорода в митохондриях. В настоящей главе речь идёт о переносчиках ионов водорода нового типа. Особенностью этих веществ является их способность совершать внутримолекулярную перестройку, входе которой изменяется протонофорная активность этих соединений. Для изменения особенностей соединений У-УП как разобщителей оказалось необходимым принять во внимание то обстоятельство, что система транспорта ионов водорода в митохондриях может функционировать в двух качественно различных режимах в зависимости от внешних условий.

межфазная водная меморана граница | фаза

матрикс Н*-

Н* Г"-

тн<-

Н'-помпа

соои

|COO"...irj

Н*

• н*

(1) (2)

■СОО"

■соои

■»г

ьн

тн

(3)

Схема I. Взаимодействие классических разобщителей (ПХФ, ТТРВ, ТХФ, FCCP и др.) с ионами водорода в водном примембранном слое.

1 - реакция формирования неравновесных состояний кислот Бренстеда в области межфазной границы внутренняя митохондриальная мембрана — вода в процессе работы Н*-помп;

2 — процесс переноса Н+ -ионов через межфазную границу с поверхности мембраны в водную фазу. Катализ реакции диссоциации кислот Бренстеда в зоне межфазной границы мембрана — вода, осуществляемый под действием основания Льюиса НЕРЕБ;

3 - трансмембранный перенос протонов «из воды в воду» при участии кчассического разобщителя ПХФ. Т~— анион разобщителя.

В первом случае, согласно модели Митчелла, протонные помпы переносят ионы водорода через внутреннюю мито-хондриальную мембрану «из воды в воду». В этом случае анион разобщителя Т~ взаимодействует с протонами в водной фазе и переносит их из межмембранного пространства в матрикс согласно схеме 1.

Во втором случае режим работы протонных помп включает дополнительную терминальную стадию связывания ионов водорода с основаниями на внешней поверхности внутренней митохонд-риальной мембраны (схема 2). В этом случае значительная доля энергии окислительных реакций переносится на АТФ синтетазу мембраносвязанны-

ми ионами водорода. Оказалось, что в условиях работы Н+-помп слабые основания Льюиса (цитрат, НЕРЕБ), которые часто используются в качестве буфера, могут играть роль катализаторов, повышающих скорость отрыва (диссоциации) ионов водорода от поверхности мембраны в водную фазу и уменьшать тем самым объём фракции протонов, неравновесно связанных с поверхностью мембраны. Это наблюдение позволило нам использовать вышеуказанные катализаторы в качестве инструмента, с помощью которого можно изменять объём фракции мембраносвязанных протонов. Следует указать, что переход работы фосфорилирующей системы во второй режим индуцируется системой объёмной регуляции митохондрий в условиях низкоамплитудного набухания этих органелл, которое возникает, например, при помещении митохондрий в мягкие гипотонические условия (120 мосМ).

Согласно работам Муруговой в условиях низкоамплитудного набухания митохондрий происходят резкие структурные изменения в характере упаковки внутренней митохондриальной мембраны. В этих условиях образуются регулярная биламеллярная структура, которая была идентифицирована по появлению дифракционного пика на кривой рассеяния нейтронов (рис. 7а). Этот результат был подтверждён нами с помощью метода атомно-силовой микроскопии: на митопластах было показано образование структур, сформированных из внутренней мембраны, геометрические параметры которых совпадали с теми, что были обнаружены с помощью малоуглового рассеяния нейтронов (рис. 8в).

's

tí 0.6

s

А 0.4

8

X ffl 0.2

s

X Ш 0.0

Ё

Л*-Qm= 0.034 А"1 / \

матрикс

¡265 А

0.02

0.04 0.06 q.A"1

0.08

матрикс

в

Рис. 7. Определение толщины кристы внутренней митохондриальной мембраны в условиях низкоамплитудного набухания митохондрий в гипотонической среде (120 мосМ) методами малоуглового рассеяния нейтронов атомно-силовой микроскопии, а — Пик на кривой рассеяния нейтронов. Линией показана аппроксимация пика теоретической функцией. Из положения максимума пика (цт = 0.034±0.002 А'1) получено значение расстояния с/ между центрами мембран, формирующих кристу, согласно отношению: с! = 2ж/ цт. Расстояние с! между центрами мембран кристы составляет 190±Ю А. Толщина мембраны принята равной 75А (Ленинжер). Рисунок взят из работы Муруговой Т.Н.;

б — геометрическая модель кристы, полученная с помощью метода малоуглового рассеяния нейтронов. Полная толщина кристы, согласно методу, равна 265А; в — приведено наблюдаемое изображение «сухих крист», полученное нами методом атомно-силовой микроскопии. Согласно проведенному исследованию средняя толщина крист составляет приблизительно 300 А.

Свойства соединений ряда SkQ как разобщителей

Оказалось, что соединения ряда положительно заряженных хинонов (V-VII) действительно обладают протонофорными свойствами. Было показано, что в присутствии этих соединений также как и в присутствии классических разобщителей, происходит увеличение скорости дыхания митохондрий. Однако было очевидным при этом, что эти соединения не могут функционировать как обычные разобщители фенольного ряда по двум причинам.

Во-первых, в процессе функционирования классических разобщителей происходит циклический перенос ионов водорода, который включает перио-

дический процесс выброса молекул разобщителей из матрикса в межмембранное пространство. Для положительно заряженных молекул эта реакция полностью исключена, поскольку выход положительно заряженной молекулы во внешнее пространство из матрикса запрещен вследствие присутствия электрического поля на митохондриальной мембране. В настоящем разделе приведено объяснение наблюдаемому эффекту разобщения и дано обоснование физико-химических особенности функционирования соединений V-VII в качестве переносчиков протонов.

водная фаза

матрикс мембрана

межфазная граница

Н,Р04

Н:РО/

Схема 2. Взаимодействие аниона мембранотропного разобгцителя с неравновесно связанными с поверхностью внутренней мембраны митохондрий ионами Н+ в области межфазной границы.

(1) — реакция формирования неравновесных кислот Бренстеда на наружной границе внутренней митохондриальной мембраны в процессе работы УС-помп (в условиях трансмембранного потока ионов Н

(2) — катачиз реакции диссоциации кислот Бренстеда основанием Льюиса — НЕРЕБ.

(3) — реакция взаимодействия мембранотропного разобщителя ТХФ-С.ц с кислотой Бренстеда на межфазной границе.

(4) — реакция нейтрачизагцт неравновесной фракции кислот Бренстеда в условиях работы Н2Р04 /ОН антипортера.

Было показано, что в условиях эксперимента образуется электронейтральная форма этих соединений, которая возникает в результате образования внутримолекулярного циклического цвиттериона (рис. 8), в котором положительный заряд фосфония нейтрализован отрицательным зарядом аниона гидрохинона. Принципиальная возможность такой структуры была зарегистрирована нами в модельных экспериментах по эффекту резкого снижения константы диссоциации положительно заряженных гидрохинонов по сравнению с константой диссоциации дурогидрохинона в щелочной области рН в работе Еремеева и соавторов. При повышении ионной

силы растворов гидрохинонов наблюдалось увеличение константы диссоциации положительно заряженных гидрохинонов. Этим было показано, что снижение константы диссоциации гидрохинонов ряда БкС) действительно обусловлено ионными взаимодействиями.

Во-вторых, важной особенностью строения соединений ряда БкС) по сравнению с классическими разобщителями является очень высокое сродство к мембране этих соединений (параметр Р 2х104). Такое сродство препятствует эффективному переходу аниона разобщителя в водную фазу. Высокая гидрофобность этих соединений, по-видимому, связана с образованием циклической формы (Еремеев и соавт.).

он

он

СН^РСРЧз

+ 1Г

он

Р(1 I Р11 Р|1

Рис. 8. Реакг/ия обратимой внутримолекулярной циклизации митотропных хинолов ряда

Следует подчеркнуть, что с ДТ-диафоразой взаимодействует нециклический положительно заряженных хинон, который должен обладать гораздо более высокими гидрофильными свойствами. Поэтому следует считать, что хиноны У-УП с ДТ-диафоразой реагируют в разомкнутой гидрофильной форме при переносе электронов, а при переносе протонов они взаимодействуют с мембраной в циклической гидрофобной форме в качестве разобщителя. Для исследования особенностей взаимодействия с мембраной митохондрий протонофоров, обладающих повышенным сродством к мембране, нами было синтезировано модельное соединение.

Синтез и исследование свойств аналога митотропных хинолов 2,4,6-трихлоро-3-иентадецилфенола (ТХФ-С]5)

Синтез ТХФ-С15 был осуществлен путем хлорирования 3-пентадецилфенола в условиях интенсивного освещения УФ в течение 20 ч (рис. 9). Вещество очищено путем кристаллизации из этанола. Структура установлена методами ПМР и 13С-ЯМР.

он

он

С1

Рис. 9. Схема синтеза мембранотропного разобщителя 2,4,6-трихлоро-З-пентадецилфенола.

Это вещество является, подобно митотропным гидрохинонам, бифиль-ным — с относительно полярным фенольным ядром и большим пентаде-цильным фрагментом, который позволяет молекуле встраиваться в мембрану. Однако благодаря более простой структуре, это вещество не должно принимать участие в редокс-превращениях в электрон-транспортной цепи, а также циклизоваться подобно митотропным хинолам.

i-H0'r;s змм >-nm;s2UMM

3 4 5

ПХФ(Н)'М)

| S s &

350 300 250 § 200 « 150-

s 100

0

1 50 с

О

-IffiPKS ЗмМ -IIKPISIOmM

30 40 50 60

■геФ-сдиг-м)

б

Рис. 10. Катализатор переноса протона через межфазную границу поверхность мембраны-вода (HEPES) увеличивает эффект стимуляции дыхания митохондрий, индуцированный классическим разобщителем ПХФ (а), и подавляет эффект стимуляции дыхания, индуцированный мембранотропным разобщителем ТХФ-Сц (б).

Результаты проведенных нами экспериментов показали, что ТХФ-С15 действительно обладает свойствами разобщителя митохондрий (рис. 10). Можно видеть, что в отличие от пентахлорофенола более значительный эффект ускорения дыхания в случае ТХФ-С15 наблюдается при низкой концентрации НЕРЕБ. Кроме того, удалось показать (рис. И), что в среде, содержащей фосфат (2 мМ), наблюдаемый эффект разобщения под влиянием ТХФ-С15 значительно снижен. Этому было предложено следующее объяснение, которое впоследствии подтвердилось.

Внесение в среду фосфата приводит, как известно, к активации функционирования фосфат/гидроксил антипортера (схема 2), который переносит в матрикс дигидрофосфат-анион и выбрасывает в межмембранное пространство гидроксил-анион, нейтрализующий в первую очередь мембраносвязанные протоны. Как уже говорилось, именно с этими протонами в рамках обсуждавшейся модели ТХФ-С15 и должен взаимодействовать в первую очередь. Контрольный эксперимент, в котором в среде присутствовали и фосфат, и Ы-этилмалеимид, являющийся ингибитором указанного антипортера, показал, что разобщающее действие ТХФ-С15 восстанавливается (рис. 11в).

Рис. 11. Доказательство избирательного взаимодействия мембранотропного разобщителя (ТХФ-Сц) с фракцией неравновесно связанных с мембраной ионов водорода. Процесс фосфат-гидроксил обмена на внутренней мембране митохондрий снижает объём фракции мем-браносвязанных ионов водорода, образующейся на внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны при работе протонных помп. В результате почти полностью подавляется эффект стимуляции дыхания мембранотропным разобщителем, избирательно взаимодействующим с мембраносвязанными ионами водорода в области межфазной границы. Контроль — кривая а. Опыт (добавлен фосфат) — кривая б. Ингибитор фосфатного переносчика ИЕМ обращает эффект фосфата — кривая в.

Во всех экспериментах перед добавление,м субстрата — сукцината (добавка отмечена стрелкой с литерой Б) добавлены циклоспорин и ротенон. Стрелками без подписей обозначены добавки ТХФ-Сц (по 10 мкМ), к концу каждого опыта общая концентрация разобщителя достигает 60 мкМ. Цифрами обозначены относительные скорости поглощения кислорода в начале и в конце опыта.

Эксперименты с фосфатом были повторены с соединением ряда БкО — БкС)3. Оказалось, то в этом случае наблюдается картина стимуляции дыхания митохондрий качественно сходная с той, которую мы наблюдали на модельном соединении ТХФ-С15 (рис. 12). В этом случае добавление фосфата в среду инкубации митохондрий приводило к уменьшению наблюдаемого эффекта стимуляции, как и в случае модельного соединения. В этом случае также как и случае модельного соединения в условиях активации фосфат/гидроксил антипортера происходит нейтрализация неравновесного мембраносвязанного пула ионов водорода в процессе протекания фосфат/гидроксил обмена.

Б

Рис. 12. Доказательство избирательного взаимодействия хинона 8к()3 (гидрохинона, образующегося в условиях эксперимента в митохондриях) с фракцией неравновесно связанных с мембраной ионов водорода. Показана качественная аналогия действия этого соединения на дыхание митохондрий с действием .мембранотропного разобщителя ТХФ-С15 (см. рис. 11). Кривая а — контрольный опыт — стимуляция дыхания 8к(23. Кривая б — эксперимент, проведенный в присутствии 2 мМКН2РО4 в среде инкубации. Детачи условий эксперимента — см. подпись к рисунку 11. 5к()3 был добавлен в концентрации 1 мкМ.

выводы

1. В результате проведенных исследований была получена более полная и более точная картина функционирования искусственной системы электронного транспорта, которая возникает в митохондриях (печени) в присутствии неприродных гидрофильных хинонов (и гидрохинонов) при подавлении функции ключевого звена электрон-транспортной цепи — комплекса I.

2. Показано, что электронейтральные гидрофильные хиноны индуцируют (в обход блока комплекса I) не один, как считалось ранее, а два шунта электронного транспорта. Первый — известный ранее шунт связан с функционированием ДТ-диафоразы; возникновение второго шунта обусловлено активацией функции сукцинатдегидрогеназы в условиях опыта.

3. Обнаружено, что высокоочищенный дурогидрохинон (DQH2) специфически окисляется в активном центре сукцинатдегидрогеназы (комплексе II). Установлено, что низкие концентрации дурохинона подавляют реакцию взаимодействия DQH2 с комплексом II и активируют при этом известный ранее процесс восстановления DQH2 кофермента Qio в комплексе III. Сделано предположение о том, что феномен переключения реакций взаимодействия DQH2 с комплекса II на комплекс III является фрагментом (моделью) природного триггерного механизма, регулирующего протекание двух конкурирующих реакциях восстановления комплекса III комплексами I и II.

4. Впервые показано, что хиноны ряда SkQ, содержащие в структуре положительно заряженную группировку, способны эффективно восстанавливаются ДТ-диафоразой и индуцировать шунт электронного транспорта в обход блока в комплексе I. Тем самым было показано, что соединения ряда SkQ могут снимать окислительный стресс, вызванный блокированием комплекса I, путём реактивации реакции окисления NADH кислородом.

5. Установлен механизм взаимодействия гидрохинонов ряда SkQ с системой транспорта ионов водорода в митохондриях. Для решения этой задачи был проведен синтез более простой молекулы 2,4,6-трихлоро-З-пентадецилфенола (ТХФ-С15), которая не принимает участия в окислительно-восстановительных превращениях в митохондриях. Путём сравнительного изучения гидрохинона SkQ3 и ТХФ-С15 было показано, что оба соединения специфически модифицируют терминальную стадию работы протонных помп митохондрий, взаимодействуя с ионами водорода на стадии их переноса через межфазную границу мембрана-вода.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. В. И. Каргищ К.А. Мотовилов, М.Ю. Высоких, J1.C. Ягужинский. Взаимодействие положительно заряженного аналога убихинона (MitoQm) с ДТ-диафоразой митохондрий печени // Биологические мембраны. 2008. Т. 25. С. 34-40.

2. К.А. Мотовилов, В.И. Юрков, Е.М. Волков, Л.С. Ягужинский. Изучение свойств и поиск методов исследования неравновесных состояний ионов водорода на межфазных границах мембран митохондрий, возникающих в условиях работы протонных помп // Биологические мембраны. 2009. Т. 26. С. 408-418._

3. С.А. Еремеев, В.И. Каргин, К.А. Мотовилов, В.Н. Ташлицкий, В.Ю. Марков, Г.А. Коршунова, Н.В. Сумбатян, М.Ю. Высоких, Л.С. Ягужинский. Молекулярные механизмы превращения митотропных хинонов ряда SkQ и поиск путей создания избирательно действующих «ловушек» свободных радикалов // Биохимия. 2009. Т. 74. С. 1368-1379.

4. E.V. Dubrovin, T.N. Murugova, К.А. Motovilov, L.S. Yaguzhinskii, I.V. Yaminskii. Application of Atomic-Force Microscopy Technology to a Structural Analysis of the Mitochondrial Inner Membrane // Nanotechnologies in Russia. 2009. V. 4. P. 876-880.

5. К.А. Мотовилов, Г.M. Колесова, Л.С. Ягужинский. "Индуцированный па-рабензо- и нафтохинонами перенос электронов между ДТ-диафоразой и комплексами II и III дыхательной цепи митохондрий." Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 57 июня 2007 г., Пущино, стр. 222-224.

6. К. Motovilov, L. Yaguzhinsky. Inhibitors of succinate dehydrogenase (SDH) and complex III promote respiration of liver mitochondria under conditions of functioning DT-diaphorase (DTD). Biochimica Biophysica Acta. Bioenergetics. 2008. V. 1777. P. S98-S99.

7. К.А: Мотовилов, Г.M. Колесова, Л.С. Ягужинский. «О специфических функциональных взаимодействиях дыхательных комплексов I-III в условиях перехода системы окислительного фосфорилирования в режим локального сопряжения». Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 2-4 июня 2009 г., Пущино, стр. 614-618.

8. К. Motovilov, G. Kolesova, N. Sumbatyan, L. Yaguzhinsky. The study of succinate dehydrogenase and bel complex interaction in intact liver mitochondria oxidizing artificial substrate duroquinol. FEBS Journal. 2009. V. 276 (Supplement 1). P. 213._

9. S. Eremeyev, \V. Karginj K. Motovilov, V. Tashlitsky, V. Markov, M. Vyssokikh, G. Korshunova, N. Sumbatyan, L. Yaguzhinsky. Investigation of chemical properties of group of mitotropic antioxidants of benzoquinone series. (2009) 34th FEBS Congress. July 4-9. Prague. Czech Republic. Late Abstract Book. P. 44.

Заказ № 13-а/11/09 Подписано в печать 02.11.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.rii; е-таН:ш/о@с/г.ги

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

2. ВВЕДЕНИЕ.

3. ОБЗОР ЛИТЕРТУРЫ.

3.1 ОБЩЕЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О СТРУКТУРЕ И ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВАХ ХИНОНОВ.

3.1.1. Хиноны как а,(3-ненасыщенные кетоны.

3.1.2. Хиноны как диенофилы.

3.1.3. Окислительно-восстановительные потенциалы некоторых хинонов и их производных и их зависимость от рН.

3.2. ХИНОНЫ И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ В ПРИРОДЕ.

3.2.1. Разнообразие хиноидных структур живых организмах.

3.2.2. Синтез хиноидных структур в живых организмах.

3.3 СТРУКТУРА КОМПЛЕКСОВ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ МИТОХОНДРИЙ И НЕКТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИХ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ.

3.3.1. Первый дыхательный комплекс.

3.3.2. Второй дыхательный комплекс.

3.3.3. Третий дыхательный комплекс.

3.4. РАЗВИТИЕ ТЕОРИИ О СОПРЯЖЕНИИ ПРОЦЕССОВ ДЫХАНИЯ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ.

3.4.1 Основные этапы развития теории сопряжения процессов дыхания и фосфорилирования в митохондриях.

3.4.2 Высокий кинетический барьер в реакции отрыва протона от поверхности мембраны.

3.5 ДТ-диафораза (ДТД).

3.6. Неспецифическое подавление функции комплекса I дыхательной цепи митохондрий гидрофобными органическими соединениями.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1 Выделение митохондрий печени.

4.2 Измерение скорости дыхания митохондрий.

4.3 Использовавшиеся реактивы.

4.4 Синтез ТХФ-С]5.

4.5. Атомно-силовая микроскопия.

4.6. Приготовление образцов митопластов для атомно-силовой микроскопии.

4.7. Среды инкубации митохондрий.

4.8. Ингибиторный анализ на полиферментной системе.

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Окислительно-восстановительные реакции гидрофильных электронейтральных хинонов в дыхательной цепи митохондрий.

5.1.1 Введение.

5.1.2 Блок комплекса I. Гидрофильные хиноны I-IV одновременно с активацией шунта с участием ДТ-диафоразы активируют второй шунт, функционирующий с участием сукцинатдегидрогеназы митохондрий.

5.2. РЕАКЦИИ ДУРОГИДРОХИНОНА В ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ МИТОХОНДРИЙ.

5.2.1. Высокоочищенный дурогидрохинон является субстратом сукцинатдегидрогеназы, но не комплекса III.

5.2.2. Обоснование возможности взаимодействия DQH2 с активным центром сукцинатдегидрогеназы (докинг дурогидрохинона в сукцинатдегидрогеназу)

5.2.3. Дурохинон катализирует реакцию "автономного" окисления дурогидрохинона комплексом II (без участия комплекса II).

5.2.4. Влияние порядка добавок ингибитора (ТТФА) и субстрата DQH2 на скорость дыхания митохондрий. При окислении DQH2 ингибитор комплекса II стимулирует дыхание митохондрий.

5.2.5. Обсуждение результатов раздела работы, посвященных изучению реакций DQH2.

5.3. ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ И КИСЛОТНО-ОСНОВНЫЕ РЕАКЦИИ ХИНОНОВ И ГИДРОХИНОНОВ, СОДЕРЖАЩИХ ПОЛОЖИТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННУЮ ТРИФЕНИЛФОСФОНИЕВУЮ ГРУППУ В СТРУКТУРЕ, в ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНОЙ СИСТЕМЕ МИТОХОНДРИЙ (ОБЩЕЕ ВВЕДЕНИЕ).

5.3.1. ДТ-диафораза восстанавливает MitoQ10.

5.3.2. Окисление MitoQioHk митохондриями. Участие цитохрома bei (комплекса 1П) и цитохром с оксидазы (комплекса IV).

5.3.3. Цианид-резистентное дыхание в митохондриях в присутствии MitoQ1()

5.3.4. Открывание митохондриальной поры в присутствии MitoQio.

5.3.5. Хиноны ряда SkQ-MitoQ, содеражищие в структуре положительно заряженную трифенилфосфониевую группу, как новые разобщители митохондрий.

5.3.6. Хиноны (гидрохиноны) ряда SkQ и MitoQ как модуляторы терминальной стадии процесса трансмембранного переноса Нойонов при работе Н+-помп митохондрий.

5.3.7. Эффект разобщения, индуцированный хинонами V-VII.

7. ВЫВОДЫ

1. В результате проведенных исследований была получена более полная и более точная картина функционирования искусственной системы электронного транспорта, которая возникает в митохондриях (печени) в присутствии неприродных гидрофильных хинонов (и гидрохинонов) при подавлении функции ключевого звена электрон-транспортной цепи — комплекса I.

2. Показано, что электронейтральные гидрофильные хиноны индуцируют (в обход блока комплекса I) не один, как считалось ранее, а два шунта электронного транспорта. Первый — известный ранее шунт связан с функционированием ДТ-диафоразы; возникновение второго шунта обусловлено активацией функции сукцинатдегидрогеназы в условиях опыта.

3. Обнаружено, что высокоочищенный дурогидрохинон (DQH2) специфически окисляется в активном центре сукцинатдегидрогеназы (комплексе II). Установлено, что низкие концентрации дурохинона подавляют реакцию взаимодействия DQH2 с комплексом II и активируют при этом известный ранее процесс восстановления кофермента Q)0 в комплексе III DQH2. Сделано предположение о том, что феномен переключения реакций взаимодействия DQH2 с комплекса II на комплекс III является фрагментом (моделью) природного триггерного механизма, регулирующего протекание двух конкурирующих реакций восстановления комплекса III комплексами I и II.

4. Впервые показано, что хиноны ряда SkQ, содержащие в структуре положительно заряженную группировку, способны эффективно восстанавливаться ДТ-диафоразой и индуцировать шунт электронного транспорта в обход блока в комплексе I. Тем самым было показано, что соединения ряда SkQ могут снимать окислительный стресс, вызванный с блокированием комплекса I, путём реактивации реакции окисления NADH кислородом.

5. Установлен механизм взаимодействия гидрохинонов ряда SkQ с системой транспорта ионов водорода в митохондриях. Для решения этой задачи был проведен синтез более простой молекулы 2,4,6-трихлоро-З-пентадецилфенола (ТХФ-С15), которая не принимает участия в окислительно-восстановительных превращениях в митохондриях. Путём сравнительного изучения гидрохинона SkQ3 и ТХФ-С15 было показано, что оба соединения специфически модифицируют терминальную стадию работы протонных помп митохондрий, взаимодействуя с ионами водорода на стадии их переноса через межфазную границу мембрана-вода.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе исследованы реакции производных окисленных и восстановленных форм пара-бензохинона, а также менадиона. В круг исследований мы включили в первую очередь окислительно восстановительные реакции соединений, протекающие в электрон-транспортной системе митохондрий и, кроме того, прототрофные реакции гидрохинонов, которые могут оказывать большое влияние на работу системы транспорта протонов в митохондриях, которая органически включена в процесс синтеза АТФ.

На настоящем этапе мы не обсуждаем детали механизма обратного переключения системы комплексов II и III из режима сопряженного (рис. 41 А, 44А) в режим автономного (41Б. 44Б) функционирования. В тоже время в разделах 5.2.3 и 5.2.4 было показано, что переключение связано с изменением начальных условий опыта. Известно, что зависимость характера протекания процессов от начальных условий является практически однозначным критерием присутствия обратных связей в таких системах. К таким явлениям можно отнести обнаруженную нами корреляцию между режимом работы комплекса III и присутствием окислителя (Qi0 и DQ) в системе к начальным условиям эксперимента, т. е. к пусковому механизму процесса, который определяет переход всей системы в один из двух стационарных режимов функционирования изображённых на схемах (рис. 41, 44).

В процессе работы нами был обнаружен новый феномен — эффект переключения редокс-реакций искусственного субстрата дыхания митохондрий — дурогидрохинона (DQH2) с комплекса II на комплекс III, который «управляется» соотношением восстановленных и окисленных форм хинона (DQ или Q10) в митохондриях. Несмотря на то обстоятельство, что этот эффект был обнаружен нами в упрощенной модельной системе, в настоящем заключении нам хочется высказать мысль о том, что в другой форме этот эффект должен проявляться в тканях организма при переходе от нормальных условий к условиям глубокой гипоксии.

Наша уверенность в справедливости такого предположения базируется на том, что в условиях гипоксии комплекс III в силу своего устройства не может функционировать в «автономном» режиме. В таких термодинамически невыгодных условиях за счет энергии окислительных реакций, протекающих в комплексе II, происходит синтез окислителя — семихинона (Q*ö или Q*0H ), который фактически оказывается включенным в работу комплекса III.

Обнаружение режимов сопряженной работы комплексов II и Ш является центральным звеном настоящей работы, поскольку в сопряженном режиме комплекс II «подключен» к работе протонной помпы (комплексу III) в условиях, когда помпа не в состоянии функционировать.

1. Conover, Т.Е.,Ernster, L. (1962). DT diaphorase. II. Relation to respiratory chain of intact mitochondira. Biochim Biophys Acta 58, 189-200.

2. Conover, T.E.,Ernster, L. (1963). DT diaphorase. IV. Coupling of extramitochondrial reduced pyridine nucleotide oxidation to mitochondrial respiratory chain. Biochim Biophys Acta 67, 268-280.

3. Ernster, L.,Navazio, F. (1958). Soluble diaphorase in animal tissues. Acta Chem. Scand. 12, 595.

4. Yaguzhinsky, L.S., Smirnova, E.G., Ratnikova, L.A., Kolesova, G.M.,Krasinskaya, I.P. (1973). Hydrophobic Sites of the Mitochondrial Electron Transfer System. Journal of Bioenergetics and Biomemebranes 5, 163-174.

5. Колесова, P.M., Карнаухова, JI.В.,Яг-ужинекий, Л.С. (1991). Взаимодействие менадиона и дурохинона с Q-циклом в условиях работы ДТ-диафоразы. Биохимия 56, 1779-1786.

6. Ratnikova, L.A., Chistiakov, V.V.,Iaguzhinskii, L.S. (1978). Regulatory interaction between the respiratory chain of mitochondria and the oxidative system of the endoplasmic reticulum]. Biokhimiia 43, 1809-1815.

7. Ernster, L., Atallah, A.S.,Hochstein, P. (1986). DT diaphorase and the cytotoxicity and mutagenicity of quinone-derived oxygen radicals. Prog Clin Biol Res 209A, 353-363.

8. Ruzicka, F.J.,Crane, F.L. (1971). Quinone interaction with the respiratory chain-linked NADH dehydrogenase of beef heart mitochondria. II. Duroquinone reductase activity. Biochim Biophys Acta 226, 221-233.

9. Zhu, Q.S.,Beattie, D.S. (1988). Direct interaction between yeast NADH-ubiquinone oxidoreductase, succinate-ubiquinone oxidoreductase, and ubiquinol-cytochrome с oxidoreductase in the reduction of exogenous quinones. J Biol Chem 263, 193-199.

10. Колесова, Г.М., Вышинский, С.А.,Ягужинский, Л.С. (1989). Изучение механизма циан-резистентного дыхания митохондрий печени в присутствии менадиона. Биохимия 54, 103-111.

11. Колесова, Г.М., Карнаухова, Л.В., Сегаль, Н.К.,Ягужинский, Л.С. (1993). Влияние ингибиторов Q-цикла на циан-резистентное окисление малата в присутствии менадиона митохондриями печени. Биохимия 58, 1630-1640.

12. Нейланд, О.Я. (1990) Хиноны. в Хиноны, стр. 526-536. Высшая школа, Москва.

13. Реутов, О .А., Курц, А.Л.,Бутин, К.П. (2004) Хиноны. в Хиноны, стр. 460-474. БИНОМ. Лаборатория знаний, Москва.

14. Marchal, D., Boireau, W., Laval, J.M., Moiroux, J.,Bourdillon, C. (1997). An electrochemical approach of the redox behavior of water insoluble ubiquinones or plastoquinones incorporated in supported phospholipid layers. Biophys J 72, 2679-2687.

15. Rich, P.R. (1984). Electron and proton transfers through quinones and cytochrome be complexes. Biochim Biophys Acta 768, 53-79.

16. Thompson, R.H. (1997) Naturally Occurring Quinones IV. Recent Advances, Blackie A&P. New-York.

17. Li, Y.-G., Song, L., Liu, M., Zhi-Bi-Hu,Wang, Z.-T. (2009). Advancement in analysis of Salviae miltiorrhiazae Radix et Rhizoma (Danshen). Journal of Chromatography A 1216, 1941-1953.

18. Kaufman, S. (1995). Tyrosine hydroxylase. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 70, 103220.

19. Запрометов, М.Н.,Бухлаева, В.И. (1968). О двух путях биосинтеза галловой кислоты. Биохимия 33, 383-386.

20. Kefeli, V.I., Kalevitch, M.V.,Borsari, В. (2003). Phenolic cycle in plants and environment. Journal of Cell and Molecular Biology 2, 13-18.

21. Sun, F., Huo, X., Zhai, Y., Wang, A., Xu, J., Su, D., Bartlam, М.Дао, Z. (2005). Ciystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell 121, 10431057.

22. Walker, J.E. (1992). The NADII:ubiquinone oxidoreductase (complex I) of respiratory chains. Q Rev Biophys 25, 253-324.

23. Yagi, T.,Matsuno-Yagi, A. (2003). The proton-translocating NADH-quinone oxidoreductase in the respiratory chain: the secret unlocked. Biochemistry 42, 22662274.

24. Carroll. J., Fearnley, I.M., Shannon, R.J., Hirst, J.,Walker, J.E. (2003). Analysis of the subunit composition of complex I from bovine heart mitochondria. Mol Cell Proteomics 2, 117-126.

25. Sazanov, L.A.,Hinchliffe, P. (2006). Structure of the hydrophilic domain of respiratory complex I from Thermus thermophilus. Science 311, 1430-1436.

26. Papa, S.h другие. (2009). Pathogenetic mechanisms in hereditary dysfunctions of complex I of the respiratory chain in neurological diseases. Biochim Biophys Acta 1787, 502-517.

27. Balaban, R.S., Nemoto, S.,Finkel, T. (2005). Mitochondria, oxidants, and aging. Cell 120, 483-495.

28. Ohnishi, T. (1998). Iron-sulfur clusters/semiquinones in complex I. Biochim Biophys Acta 1364, 186-206.

29. Nakamaru-Ogiso, E., Yano, T., Yagi, T.,Ohnishi, T. (2005). Characterization of the iron-sulfur cluster N7 (Nlc) in the subunit NuoG of the proton-translocating NADH-quinone oxidoreductase from Escherichia coli. J Biol Chem 280, 301-307.

30. Sled, V.D., Rudnitzky, N.I., Hatefi, Y.,Ohnishi, T. (1994). Thermodynamic analysis of flavin in mitochondrial NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I). Biochemistry 33, 10069-10075.

31. Kotlyar, A.B., Sled, V.D., Burbaev, D.S., Moroz, I.A.,Vinogradov, A.D. (1990). Coupling site I and the rotenone-sensitive ubisemiquinone in tightly coupled submitochondrial particles. FEBS Lett 264, 17-20.

32. Kudin, A.P., Bimpong-Buta, N.Y., Vielhaber, S., Elger, C.E.,Kunz, W.S. (2004). Characterization of superoxide-producing sites in isolated brain mitochondria. J Biol Chem 279, 4127-4135.

33. Chen, Y.R., Chen, C.L., Zhang, L., Green-Church, K.B.,Zweier, J.L. (2005). Superoxide generation from mitochondrial NADH dehydrogenase induces self-inactivation with specific protein radical formation. J Biol Chem 280, 37339-37348.

34. Hagerhall, C. (1997). Succinate: quinonc oxidoreductases. Variations on a conserved theme. Biochim Biophys Acta 1320, 107-141.

35. Iverson, T.M., Luna-Chavez, C., Croal, L.R., Cecchini, G.,Rees, D.C. (2002). Crystallographic studies of the Escherichia coli quinol-fiimarate reductase with inhibitors bound to the quinol-binding site. J Biol Chem 277, 16124-16130.

36. Lancaster, C.R., Kroger, A., Auer, M.,Michel, H. (1999). Structure of fumarate reductase from Wolinella succinogenes at 2.2 A resolution. Nature 402, 377-385.

37. Yankovskaya, V., Horsefield, R., Tornroth, S., Luna-Chavez, C., Miyoshi, H., Leger, C., Byrne, B., Cecchini, G.,Iwata, S. (2003). Architecture of succinate dehydrogenase and reactive oxygen species generation. Science 299, 700-704.

38. Lemire, B.D.,Oyedotun, K.S. (2002). The Saccharomyces cerevisiae mitochondrial succinate:ubiquinone oxidoreductase. Biochim Biophys Acta 1553, 102-116.

39. Oyedotun, K.S.,Lemire, B.D. (1999). The Saccharomyces cerevisiae succinate dehydrogenase anchor subunit, Sdh4p: mutations at the C-terminal lys-132 perturb the hydrophobic domain. Biochim Biophys Acta 1411, 170-179.

40. Yankovskaya, V., Sablin, S.O., Ramsay, R.R., Singer, T.P., Ackrell, B.A., Cecchini, G.,Miyoshi, H. (1996). Inhibitor probes of the quinone binding sites of mammalian complex II and Escherichia coli fiimarate reductase. J Biol Chem 271, 21020-21024.

41. Ingledew, W.J., Salerno, J.C.,Ohnishi, T. (1976). Studies on electron paramagnetic resonance spectra manifested by a respiratory chain hydrogen carrier. Arch Biochem Biophys 177, 176-184.

42. Ohnishi, T.,Trumpower, B.L. (1980). Differential effects of antimycin on ubisemiquinone bound in different environments in isolated succinate . cytochrome c reductase complex. J Biol Chem 255, 3278-3284.

43. Ruzicka, F.J.,Beinert, H. (1975). A new membrane iron-sulfur flavoprotein of the mitochondrial electron transfer system. The entrance point of the fatty acyl dehydrogenation pathway? Biochem Biophys Res Commun 66, 622-631.

44. Salerno, J.C., Harmon, H.J., Haywood, B., Leigh, J.S.,Ohnishi, T. (1977). A transmembrane quinine pair in the succinate dehygrogense-cytochrome b region. FEBS Lett 82, 179-182.

45. Berry, E.A., Huang, L.S., Saechao, L.K., Pon, N.G., Valkova-Valchanova, M.,Daldal, F. (2004). X-Ray Structure of Rhodobacter Capsulatus Cytochrome be (1): Comparison with its Mitochondrial and Chloroplast Counterparts. Photosynth Res 81, 251-275.

46. Hunte, C., Koepke, J., Lange, C., Rossmanith, T.,Michel, H. (2000). Structure at 2.3 A resolution of the cytochrome bc(l) complex from the yeast Saccharomyces cerevisiae co-crystallized with an antibody Fv fragment. Structure 8, 669-684.

47. Iwata, S., Lee, J.W., Okada, K., Lee, J.K., Iwata, M., Rasmussen, B., Link, T.A., Ramaswamy, S.,Jap, B.K. (1998). Complete structure of the 11-subunit bovine mitochondrial cytochrome bcl complex. Science 281, 64-71.

48. Yu, C.A., Xia, D., Kim, H., Deisenhofer, J., Zhang, L„ Kachurin, A.M.,Yu, L. (1998). Structural basis of functions of the mitochondrial cytochrome bcl complex. Biochim Biophys Acta 1365, 151-158.

49. Zhang, Z., Huang, L., Shulmeister, V.M., Chi, Y.I., Kim, K.K., Hung, L.W., Crofts, A.R., Berry, E.A.,Kim, S.H. (1998). Electron transfer by domain movement in cytochrome bcl. Nature 392, 677-684.

50. Kramer, D.M., Roberts, A.G., Muller, F., Cape, J.,Bowman, M.K. (2004). Q-cycle bypass reactions at the Qo site of the cytochrome bcl (and related) complexes. Methods Enzymol 382, 21-45.

51. Covian, R.,Trumpower, B.L. (2008). Regulatory interactions in the dimeric cytochrome bc(l) complex: the advantages of being a twin. Biochim Biophys Acta 1777, 1079-1091.

52. Lipmann, F. (1946). b (Green, D.E.), CTp. p. 137. Interscience, New-York.

53. Slater, E.C. (1953). Mechanism of phosphorylation in the respiratory chain. Nature 172, 975-978.

54. Mitchell, P. (1961). Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature 191, 144-148.

55. Mitchell, P.,Moyle, J. (1958). Group-translocation: a consequence of enzyme-catalysed group-transfer. Nature 182, 372-373.

56. Neumann, J.,Jagendorf, A.T. (1964). Light-Induced Ph Changes Related Phosphorylation by Chloroplasts. Arch Biochem Biophys 107, 109-119.

57. Mitchell, P.,Moyle, J. (1965). Stoichiometry of proton translocation through the respiratory chain and adenosine triphosphatase systems of rat liver mitochondria. Nature 208, 147-151.

58. Mitchell, P.,Moyle, J. (1965). Evidence discriminating between the chemical and the chemiosmotic mechanisms of electron transport phosphorylation. Nature 208, 1205-1206.

59. Mitchell, P.,Moyle, J. (1967). Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation. Nature 213, 137-139.

60. Mitchell, P.,Moyle, J. (1967). Acid-base titration across the membrane system of rat-liver mitochondria. Catalysis by uncouplers. Biochem J 104, 588-600.

61. Mitchell, P.,Moyle, J. (1967). Respiration-driven proton translocation in rat liver mitochondria. Biochem J 105, 1147-1162.

62. Mitchell, P.,Moyle, J. (1969). Estimation of membrane potential and pH difference across the cristae membrane of rat liver mitochondria. Eur J Biochem 7, 471-484.

63. Levitskii, D.O.,Skulachev, V.P. (1972). Effects of penetrating synthetic ions on the respiration of mitochondria and submitochondrial particles. Mol Biol 6, 267-272.

64. Mitchell, P.,Moyle, J. (1968). Proton translocation coupled to ATP hydrolysis in rat liver mitochondria. Eur J Biochem 4, 530-539.

65. Kagawa, Y., Kandrach, A.,Racker, E. (1973). Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XXVI. Specificity of phospholipids required for energy transfer reactions. J Biol Chem 248, 676-684.

66. Nicholls, D.G. (1974). The influence of respiration and ATP hydrolysis on the proton-electrochemical gradient across the inner membrane of rat-liver mitochondria as determined by ion distribution. Eur J Biochem 50, 305-315.

67. Jagendorf, A.T.,Uribe, E. (1966). ATP formation caused by acid-base transition of spinach chloroplasts. Proc Natl Acad Sci U S A 55, 170-177.

68. Moyle, J.,Mitchell, P. (1975). Active/inactive state transitions of mitochondrial ATPase molecules influenced by Mg2+, anions and aurovertin. FEBS Lett 56, 55-61.

69. Chappell, J.B. (1968). Systems used for the transport of substrates into mitochondria. Br Med Bull 24, 150-157.

70. Chappell, J.B.,Crofts, A.R. (1966) Regulation of Metabolic Processes in Mitochondria, в Regulation of Metabolic Processes in Mitochondria (Tager, J.M., Papa, S., Quagliariello, E.,Slater, E.C.), стр. 293. Elsevier

71. Mitchell, P.,Moyle, J. (1969). Translocation of some anions cations and acids in rat liver mitochondria. Eur J Biochem 9, 149-155.

72. Liberman, E.A.,Skulachev, V.P. (1970). Conversion of biomembrane-produced energy into electric form. IV. General discussion. Biochim Biophys Acta 216, 30-42.

73. Drachev, L.A., Jasaitis, A.A., Mikelsaar, H., Nemecek, I.B., Semenov, A.Y., Semenova, E.G., Severina, II,Skulachev, V.P. (1976). Reconstitution of biological molecular generators of electric current. H+-ATPase. J Biol Chem 251, 7077-7082.

74. Massari, S.,Azzone, G.F. (1970). The mechanism of ion translocation in mitochondria. 2. Active transport and proton pump. Eur J Biochem 12, 310-318.

75. Racker, E.,Kandrach, A. (1971). Reconstitution of the third site of oxidative phosphorylation. J Biol Chem 246, 7069-7071.

76. Mitchell, P. (1966) Chemiosmotic Coupling in Oxidative and Photosynthetic Phosphorylation, Glynn Research Ltd. Bodmin.

77. Kell, D.B. (1979). On the functional proton current pathway of electron transport phosphorylation. An electrodic view. Biochim Biophys Acta 549, 55-99.

78. Rottenberg, H. (1975). The measurement of transmembrane electrochcmical proton gradients. J Bioenerg 7, 61-74.

79. Williams, R.J. (1961). Possible functions of chains of catalysts. J Theor Biol 1, 1-17.

80. Junge, W. (1982). Chapter 24 Electrogenic Reactions and Proton Pumping in Green Plant Photosynthesis Current Topics in Membranes and Transport 16, 431-465.

81. Montal, M., Nishimura, M.,Chance, B. (1970). Uncoupling and charge transfer in bacterial chromatophores. Biochim Biophys Acta 223, 183-188.

82. Auslander, W., Junge, W. (1974). The electric generator in the photosynthesis of green plants. II. Kinetic correlation between protolytic reactions and redox reactions. Biochim Biophys Acta 357, 285-298.

83. Drachev, L.A., Kaulen, A.D., Ostroumov, S.A.,Skulachcv, V.P. (1974). Electrogenesis by bacteriorhodopsin incorporated in a planar phospholipid membrane. FEBS Lett 39, 43-45.

84. Drachev, L.A., Kaulen, A.D.,Skulachev, V.P. (1984). Correlation of photochemical cycle, H+ release and uptake, and electric events in bacteriorhodopsin. FEBS Lett 178, 331-335.

85. Teissie, J., Prats, M., Soucaille, P.,Tocanne, J.F. (1985). Evidence for conduction of protons along the interface between water and a polar lipid monolayer. Proc Natl Acad SciUS A 82, 3217-3221.

86. Heberle, J.,Dencher, N.A. (1990). Bacteriorhodopsin in ice. Accelerated proton transfer from the purple membrane surface. FEBS Lett 277, 277-280.

87. Antonenko, Y.N., Kovbasnjuk, O.N.,Yaguzhinsky, L.S. (1993). Evidence in favor of the existence of a kinetic barrier for proton transfer from a surface of bilayer phospholipid membrane to bulk water. Biochim Biophys Acta.1150, 45-50.

88. Junge, W.,Polle, A. (1986). Theory of proton flow along appressed thylakoid membranes under both non-stationary and stationary conditions. Biochem. Biophys. Acta 848, 265273.

89. Junge, W.,McLaughlin, S. (1987). The role of fixed and mobile buffers in the kinetics of proton movement. Biochim Biophys Acta 890, 1-5.

90. Nachliel, E.,Gutman, M. (1996). Quantitative evaluation of the dynamics of proton transfer from photoactivated bacteriorhodopsin to the bulk. FEBS Lett 393, 221-225.

91. Riesle, J., Oesterhelt, D., Dencher, N.A.,Heberle, J. (1996). D38 is an essential part of the proton translocation pathway in bacteriorhodopsin. Biochemistry 35, 6635-6643.

92. Dragunova, S.F., Krasinskaia, I.P.Jaguzhinskii, L.S. (1981). Control of proton transport across the double electrical layers of mitochondrial membranes]. Biokhimiia 46, 10871095.

93. Sharyshcv, A.A., Kostava, V.T., Evtodienko Iu, V.,Iaguzhinskii, L.S. (1979). Formation of a nigericin-like carrier in mitochondrial membranes treated with acids]. Biofizika 24, 339-340.

94. Sharyshev, A.A., Kostava, V.T., Ismailov, A.D., Evtodienko Iu, V.Jaguzhinskii, L.S. (1979). Ion currents in mitochondrial and liposome membranes induced by acid action]. Biofizika 24, 484-488.

95. Gutman, M.,Nachliel, E. (1990). The dynamic aspects of proton-transfer processes. Biochim Biophys Acta 1015, 391-414.

96. Petty, K.M.,Dutton, P.L. (1976). Properties of the flash-induced proton binding encountered in membranes of Rhodopseudomonas sphaeroides: a functional pK on the ubisemiquinone? Arch Biochem Biophys 172, 335-345.

97. Porschke, D. (2002). Reaction coupling, acceptor pK, and diffusion control in light induced proton release of bacteriorhodopsin. Journal of Physical Chemistry B 106, 10233-10241.

98. Cherepanov, D.A., Feniouk, B.A., Junge, W.,Mulkidjanian, A.Y. (2003). Low dielectric permittivity of water at the membrane interface: effect on the energy coupling mechanism in biological membranes. Biophys J 85, 1307-1316.

99. Jones, M.R.,Jackson, J.B. (1990). Proton efflux from right-side-out membrane vesicles of Rhodobacter sphaeroides after short flashes. Biochim Biophys Acta 1019, 51-58.

100. Schoepp, B., Brughna, M., Riedel, A., Nitschke, W.,Kramer, D.M. (1999). The Qo-site inhibitor DBMIB favours the proximal position of the chloroplast Rieske protein and induces a pK-shift of the redox-linked proton. FEBS Lett 450, 245-250.

101. Cadenas, E., Hochstein, P.,Ernster, L. (1992). Pro- and antioxidant functions of quinones and quinone reductases in mammalian cells. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 65, 97146.

102. Lind, C., Cadenas, E., Hochstein, P.,Ernster, L. (1990). DT-diaphorase: purification, properties, and function. Methods Enzymol 186, 287-301.

103. Pink, J.J., Planchon, S.M., Tagliarino, C., Varnes, M.E., Siegel, D.,Boothman, D.A. (2000). NAD(P)H:Quinone oxidoreductase activity is the principal determinant of beta-lapachone cytotoxicity. J Biol Chcm 275, 5416-5424.

104. Siegel, D., Gibson, N.W., Preusch, P.C.,Ross, D. (1990). Metabolism of mitomycin C by DT-diaphorase: role in mitomycin C-induced DNA damage and cytotoxicity in human colon carcinoma cells. Cancer Res 50, 7483-7489.

105. Asher, G., Dym, O., Tsvetkov, P., Adler, J.,Shaul, Y. (2006). The crystal structure of NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 in complex with its potent inhibitor dicoumarol. Biochemistry 45, 6372-6378.

106. Hosoda, S., Nakamura, W.,Hayashi, K. (1974). Properties and reaction mechanism of DT diaphorase from rat liver. J Biol Chem 249, 6416-6423.

107. Asher, G., Lotem, J., Cohen, B., Sachs, L.,Shaul, Y. (2001). Regulation of p53 stability and p53-dependent apoptosis by NADH quinone oxidoreductase 1. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 1188-1193.

108. Asher, G., Lotem, J., Tsvetkov, P., Reiss, V., Sachs, L.,Shaul, Y. (2003). P53 hot-spot mutants are resistant to ubiquitin-independent degradation by increased binding to NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 15065-15070.

109. Asher, G.,Shaul, Y. (2006). Ubiquitin-independent degradation: lessons from the p53 model. Isr Med Assoc J 8, 229-232.

110. Asher, G., Tsvetkov, P., Kahana, C.,Shaul, Y. (2005). A mechanism of ubiquitin-independent proteasomal degradation of the tumor suppressors p53 and p73. Genes Dev 19,316-321.

111. Hansch, C.,Anderson, S.M. (1967). The structure-activity relationship in barbiturates and its similarity to that in other narcotics. J Med Chem 10, 745-753.

112. Redfearn, e.R.,King, T.E. (1964). Mitochondrial Nadh2 Dehydrogenase and Nadh2 Oxidase from Heart Muscle: Possible Existence of a Ferredoxin-Like Component in the Respiratory Chain. Nature 202, 1313-1316.

113. Stockdale, M.,Selwyn, M.J. (1971). influence of ring substituents on the action of phenols on some dehydrogenases, phospholinases and the soluble ATPase from mitochondria. Eur J Biochem 21, 416-423.

114. Stoppani, A.O., De Brignone, C.M.,Brignone, J.A. (1968). Structural requirements for the action of steroids as inhibitors of electron transfer. Arch Biochem Biophys 127, 463475.

115. Wedding, R.T., Hansch, C.,Fukuto, T.R. (1967). Inhibition of malate dehydrogenase by phenols and the influence of ring substituents on their inhibitory effectiveness. Arch Biochem Biophys 121, 9-21.

116. Fujita, T., Iwasa, J.,Hansch, C. (1984). A New Substituent Constant, n, Derived from Partition Coefficients. Journal of American Chemical Society 86, 5175-5180.

117. Hansch, C., Quinlan, J.,Laurence, G. (1968). Linear free-energy relationship between partition coefficients and the aqueous solubility of organic liquids. Journal of Organic Chemistry 33, 347-350.

118. Ratnikova, L.A., Iaguzhinskii, L.S.,Skulachev, V.P. (1971). Inhibition of electron transport in the respiratory chain by phenols with low dissociation constant]. Biokhimiia 36, 376-379.

119. Yurkov, V.I., Fadeeva, M.S.,Yaguzhinsky, l.S. (2005). Proton transfer through the membrane-water interfaces in uncoupled mitochondria. Biochemistry (Mosc) 70, 195199.

120. Johnson, D.,Lardy, H. (1967). Isolation of liver or kidney mitochondria. Meth. Enzymol. 10, 94-96.

121. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L.,Randall, R.J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193, 265-275.

122. Zhu, Q.S., Berden, J. A., De Vries, S.,Slater, E.C. (1982). On the role of ubiquinone in the respiratory chain. Biochim Biophys Acta 680, 69-79.

123. Chen, M., Liu, B.L., Gu, L.Q.,Zhu, Q.S. (1986). The effect of ring substituents on the mechanism of interaction of exogenous quinones with the mitochondrial respiratory chain. Biochim Biophys Acta 851, 469-474.

124. Zhu, Q.S.,Beattie, D.S. (1988). The interaction of quinone analogues with wild-type and ubiquinone-deficient yeast mitochondria. Biochim Biophys Acta 934, 303-313.

125. Stroganov, O.V., Novikov, F.N., Stroylov, V.S., Kulkov, V.,Chilov, G.G. (2008). Lead finder: an approach to improve accuracy of protein-ligand docking, binding energy estimation, and virtual screening. J Chem Inf Model 48, 2371-2385.

126. Asin-Cayuela, J., Manas, A.R., James, A.M., Smith, R.A.,Murphy, M.P. (2004). Fine-tuning the hydrophobicity of a mitochondria-targeted antioxidant. FEBS Lett 571, 9-16.

127. Skulachev, V.P. (2007). A biochemical approach to the problem of aging: "megaproject" on membrane-penetrating ions. The first results and prospects. Biochemistry (Mosc) 72, 1385-1396.

128. Каргин, В.И., Мотовилов, K.A., Высоких, М.Ю.,Ягужинский, JI.C. (2008). Взаимодействие положительно заряженного аналога убихинона (MitoQio) с ДТ-диафоразой митохондрий печени. Биологические мембраны 25, 34-40.

129. Halestrap, А.Р. (1989). The regulation of the matrix volume of mammalian mitochondria in vivo and in vitro and its role in the control of mitochondrial metabolism. Biochim Biophys Acta 973, 355-382.

130. Chance, B.,Hollunger, G. (1961). The interaction of energy and electron transfer reactions in mitochondria. III. Substrate requirements for pyridine nucleotide reduction in mitochondria. J Biol Chem 236. 1555-1561.

131. McStay, G.P., Clarke, S.J.,Halestrap, A.P. (2002). Role of critical thiol groups on the matrix surface of the adenine nucleotide translocase in the mechanism of the mitochondrial permeability transition pore. Biochem J 367, 541-548.

132. Doughan, A.K.,Dikalov, S.l. (2007). Mitochondrial redox cycling of mitoquinone leads to superoxide production and cellular apoptosis. Antioxid Redox Signal 9, 1825-1836.

133. Yaguzhinsky, L.S., Yurkov, V.I.,Krasinskaya, I.P. (2006). On the localized coupling of respiration and phosphorylation in mitochondria. Biochim Biophys Acta 1757, 408-414.

134. Murugova, T.N., Gordeliy, V.I., Islamov, A.K., Kovalev, Y.S., Kuklin, A.I., Vinogradov, A.D.,Yaguzhinsky, L.S. (2006). Structure of membrane of submitochondrial particles studied by small angle neutron scattering. Materials structure 2, 68-70.

135. Муругова, Т.Н., Горделий, В.И., Куклин, А.И., Солодовникова, И.М.,Ягужинский, JI.C. (2007). Регистрация трехмерно упорядоченных структур в интактных митохондриях с помощью метода малоуглового рассеяния нейтронов Кристаллография 52, 545-548.

136. Dubrovin, E.V., Murugova, T.N., Motovilov, К.А., Yaguzhinskii, L.S.,Yaminskii, I.V. (2009). Application of Atomic Force Microscopy Technology to a Structural Analysis of the Mitochondrial Inner Membrane. Nanotechnologies in Russia 4, 876-880.