Роль фактора элонгации EF-G в процессах транслокации и рибосомного рециклинга тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ГАВРИЛЮК Василий Васильевич

РОЛЬ ФАКТОРА ЭЛОНГАЦИИ ЕЕ-С В ПРОЦЕССАХ ТРАНСЛОКАЦИИ И

РИБОСОМНОГО РЕЦИКЛИНГА

02.00.10-биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, в лаборатории структурно-функциональной геномики Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН и лаборатории молекулярной биологии Биомедицинского Центра Уппсальского Университета (Швеция).

Научный руководитель: академик, доктор биологических наук, профессор

Лев Львович Киселев Профессор, заведующий лаборатории

Научный консультант молекулярной биологии Биомедицинского Центра

Уппсальского Университета (Швеция) Монс Эренберг

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Галнна Георгиевна Карпова доктор химических наук, профессор Иван Николаевич Шатский

Ведущая организация: Институт белка Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится 28 ноября 2006 г. в 17 часов на заседании диссертационного совета Д. 501.001.41 по химическим наукам МГУ при Московском Государственном Университете им. М.ВЛомоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", ауд.501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан " " октября 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук И. Г. Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Рибосома - молекулярная машина, синтезирующая белки согласно информации об их первичной структуре, заложенной в нуклеотидной последовательности мРНК. В процессе синтеза белков кроме рибосомы принимают участие дополнительные компоненты различной природы: белки, РНК, нуклеотиды, аминокислоты, различные ионы. Часть белковых трансляционных факторов обладает ГТФазпой активностью. Гидролиз ГТФ этими белками происходит на определенных стадиях белкового синтеза, и напрямую сопряжен со связыванием факторов с рибосомой, находящейся в соответствующем функциональном состоянии. В клетке Е. coli к ним относятся IF2, инициаторный фактор, приносящий на рибосому инициаторную fMet-TPHKfMet, элонгационные факторы EF-G и EF-Tu, ответственные за транслокацию и связывание новой тРНК в А-участке рибосомы, соответственно, а также терминационный фактор RF3, функция которого заключается в освобождении другого терминационного фактора, RF1 или RF2 с посттерминационного рибосомного комплекса Таким образом, ГТФазы принимают участие во всех этапах белкового синтеза. В связи с этим трудно переоценить значение понимания общих закономерностей, присущих ГТФазам, для понимания механизма трансляции в целом.

Исследование механизма действия конкретных ГТФаз позволяет найти общие черты, присущие этим белкам, что в свою очередь служит основой для исследования механизма действия менее изученных представителей этого семейства. В этом смысле исследование хорошо разработанной in vitro системы трансляции Е. coli полезно для последующего использования полученного знания при изучении значительно более сложного эукариотического трансляционного аппарата.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в выяснении детального механизма функционирования фактора элонгации EF-G в процессах транслокации и рибосомного рециклинга (ribosomal recycling). Конкретные задачи состояли в следующим: 1) разработать методическую базу для анализа транслокационного статуса рибосомных комплексов, а также для наблюдения за временной динамикой диссоциации рибосомных субъедениц в процессе рибосомного рециклинга 2) выделить и очистить необходимые компоненты трансляционной системы Е. coli (рибосомы, тРНК, мРНК, трансляционные факторы, аминоацил-тРНК-сиптеты), приготовить набор рибосомных комплексов, находящихся на различных стадиях белкового синтеза (претранслокационных, посттранслокационных, а также пре- и посттерминационных) 3) исследовать механизм

транслокации и рибосомного рециклинга.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработаны новые методы исследования процессов транслокации и рибосомной рецеклизации. Метод разрезания мРИК в А-участке под действием бактериального токсина RelE позволяет следить за относительным перемещением мРНК и рибосомы (или ее 30S субъединицы). Второй разработанный метод позволяет отслеживать кинетику обмена рибосомных субъединиц, что, в свою очередь, позволяет следить за диссоциацией рибосомы. Разработанные методы вкупе с применением ранее известных экспериментальных подходов позволили обнаружить новые этапы в процессах транслокации и рибосомного рециклинга.

Согласно полученным результатам, вне комплекса с рибосомой EF-G пребывает либо в комплексе с ГДФ, либо в безнуклеотидной форме. Претранслокационный рибосомный комплекс функционирует как GEF (ГТФ/ГДФ обменивающий фактор). Обмен ГДФ на ГТФ приводит рибосомный комплекс в ранее неизвестное состояние, промежуточное между пре- и посттранслокационным. Для аккомодации рибосомы в посттранслокационном состоянии необходим гидролиз ГТФ. При исследовании рибосомного рециклинга обнаружено, что расстояние между участком Шайн-Дальгарно и кодоном в Р-участке рибосомы играет определяющую роль в стабильности находящейся в Р-участке деацилированной тРНК. Показано, что диссоциация рибосомы на субъединицы происходит под действием факторов EF-G и RRF, после чего реассоциация предотвращается присоединением к 30S субъединице фактора IF3. Предложены модели механизмов транслокации и рибосомного рециклинга.

Раскрытие механизмов трансляции у бактерий имеет большое практическое значение, создавая базу для решения многих практических медицинских и биотехнологических задач, таких как создание новых антимикробных агентов, эффективных систем для бесклеточной трансляции.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на годичных конференциях: ICM (Hagbo, Sweden, 2003, 2004, 2005).

По материалам диссертации опубликованы 3 статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 106 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (119 наименований). Диссертация содержит 25 рисунков и 2 таблицы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Приготовление рибосомных комплексов

Трансляционные комплексы получали из очищенного препарата 70S рибосом Е. coli, к которым добавляли трансляционные факторы, мРНК, инициаторные и элонгационные тРНК, аминоацил-тРНК-синтетазы, а также смесь аминокислот, АТР и ГТФ. Комплексы очищали посредством гельфильтрации.

Инициаторный комплекс (1С) получен добавлением к 70S рибосомам инициаторных факторов IF1, IF2 и IF3, £Met-TPHKfMet и Р-мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей дипептид MI со стоп-сигналом UAA. Добавление к инициаторному комплексу элонгационных факторов EF-Tu и EF-Ts, суммарной тРНК Е. coli и изолейцл-тРНК синтетазы приводило к образованию претранслокационного рибосомного комплекса (ргеТ). При использовании мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей различные пептиды, такие как MFTI, MFTMI и MTMFTI в присутствии факторов, необходимых для образования ргеТ, а также EF-G и соответствующих аминоацил-тРНК-синтетаз получали терминационные комплексы (ТС).

Препараты ГТФ, ГДФ и GDPNP дополнительно очищали ионообменной хроматографией на сорбенте monoQ до степени чистоты > 99,9%.

Токсин-зависимое разрезание мРНК в рибосомном А-участке

Рибосомные комплексы инкубировали в присутствии бактериального токсина RelE при 37°С, вызывающего гидролиз мРНК в А-участке рибосомы, затем останавливали реакцию, экстрагировали РНК, осаждали этанолом с ацетатом натрия и наносили на 10% полиакриламидный гель. Степень разрезания мРНК определяли анализом полученных радиоавтографов программой ImageQant 5.0. Метод дополняет метод тоу-принтинга, в котором к рибосомному комплексу добавляют 33Р либо 32Р меченый олигонуклеотид, гибридизующийся с участком мРНК, находящимся в 3' сторону от образованного рибосомного комплекса, затем проводят синтез кДНК на мРНК обратной транскриптазой. Далее образец наносят на гель и по длине синтезированной кДНК определяют положение рибосомы на мРНК. Метод тоу-принтинга позволяет получить информацию о положении 3' границы покрытия мРНК рибосомой, однако не дает возможность отслеживать перемещение

мРНК непосредственно в А-участке, что позволяет метод разрезания с помощью ЯеШ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Аффинность ЕЕ-в к ГТФ/ГДФ и влияние рибосомы

Измерена константа связывания ЕР-О с ГДФ, которая составляет около 9 |д.М, рис. 14А в диссертации, что близко к данным литературы - 4 рМ. Однако, измерения константы связывания ГТФ дали результат, значительно отличающийся от литературных данных, что вероятно объясняется использованием в предшествующих работах неочищенных нуклеотидов. Сродство ЕР-в к ГТФ определяли путем измерения ингибирования связывания [3Н]ГДФ при помощи возрастающих концентраций ГТФ (рис. 14В в диссертации). Показано, что аффинность ЕР-в к ГТФ в -60 раз меньше, чем к ГДФ. Учитывая, что даже очищенные препараты ГДФ содержат около 0,1% ГТФ, можно утверждать, что в клетке ЕР-Б практически не связывает ГТФ и находится в свободной от нуклеотидов или ГДФ-связанной форме.

Следующим шагом было исследование связывания нуклеотидов с ЕР-в находящимся в комплексе с рибосомой. Т.к. ГТФ активно гидролизуется комплексом ЕР-О с рибосомой, для измерения констант связывания использовали негидролизуемый аналог нуклеотида, СОРОТ. Как показано ранее, в комплексе с поеттерминационной рибосомой, несущей дсацилированную тРНК в Р-участке, ЕР-в прочно связывает вОРОТ, т.е. поведение свободного и связанного с рибосомой ЕР-О радикально отличается. С использованием опытов по ингибированию связывания [Н3]ООРМР при помощи ГДФ были сравнены Ко(ГДФ) и Ко(СОРЫР) для ЕР-й в комплексе с поеттерминационным рибосомным комплексом. Как видно на рис. 1 А, аффинность ЕР-О-ОБРИР к рибосоме в поеттерминационном состоянии как минимум в 160 раз больше, чем к ГДФ, причем обмен нуклеотида даже в присутствии избытка ГДФ проходит крайне медленно (рис. 1В), что говорит о том, что ЕР-ОСОРЫР очень прочно связан с рибосомой.

• PostTerm: l50= 161 цМ

* 70S: l50= 13 цМ

^M(GDPNP)= 1 J'M

1.0 1.5 GDP (mM)

2.0

2 4 6 Время (мин)

Рис. 1. (А) Определение равновесной константы связывания GDPNP EF-G, связанного с постерминационным рибосомным комплексом (postTerm) или с 70S рибосомой методом ингибирования связывания GDPNP титрованием ГДФ. (В) кинетика обмена GDPNP в комплексах GDPNP-EF-G-70S и GDPNP-EF-G- postTerm.

Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что связывание EF-G с рибосомой изменяет аффинность фактора к нуклеотидам и приводит к замене ГДФ на ГТФ, т.е. рибосома представляет собой ранее не известный GEF для EF-G. Полученные нами данные о сродстве EF-G к ГТФ/ГДФ позволяют объяснить, почему EF-G найден в растворе только в ГДФ-связанной форме (al-Karadaghi et. al., 1996), в то время как ГТФ-связанная конформация была получена несмотря на многочисленные попытки только на рибосоме (Frank et. al., 2000, Val. le et. al., 2003). To, что обмен нуклеотида на EF-G происходит при катализе рибосомой свидетельствует о том, что EF-G функционирует как типичная ГТФаза, совершая рабочий цикл с переходом из ГДФ в ГТФ-связанную форму и обратно, причем превращения катализируются рибосомой, выполняющей роль как GEF, так и GAP (второе показано Savelsbergh et. al., 2000, Mohr et. al., 2002).

Рибосомный комплекс, образующийся при добавлении EF-G к претранслокационному комплексу в присутствии GDPNP обладает рядом особенностей, отличающих его как от претранслокационного, так и от постгранслокационного комплексов. Этот комплекс, представляющий собой третье состояние рибосомы в процессе транслокации получил название промежуточного.

Анализ пре-, посттранслокационного и промежуточного состояний рибосомы

Для сравнения рибосомных комплексов использовали несколько экспериментальных подходов. Первый заключался в исследовании процесса обмена деацилированной изначально связанной с Р-участком претранслокационной рибосомы (схематическое изображение претранслокационного комплекса рис. 4А), со свободной немеченой тРНКгМе| (комплементарной находящемуся в Р-участке претранслокационной рибосомы кодону мРНК) и тРНКр1,е (не комплементарной). При инкубации с ЕР-0 и ГДФ обмена связанной с рибосомой тРНК на тРПК в растворе не наблюдали ни при добавлении тРНКгМе', ни при добавлении тРНКРЬе (рис. 2А). Это наблюдение свидетельствует о том, что [33Р] тРНКгМе'

оставалась в Р-участке рибосомы прочно связанной. При добавления ЕР-в и ГГФ, приводившего к образованию посттранслокационного комплекса, наблюдали быстрый кодон-независимый обмен тРНК. Эти результаты могут быть объяснены тем, что при участии ГТФ происходит быстрая транслокация [33Р]тРНКгМ|* в Е-участок рибосомы, где та кодон-независимо обменивается с незаряженной внешней тРНК.

...., Интересным был результат опыта с добавлением ЕР-О и ОГ)РЫР с образованием промежуточного комплекса. В этом случае [33Р]тРНК/Ис' могла быть сравнительно медленно замещена на «холодную» тРПК^0', однако не на тРНКР11е (рис. 2А). Таким образом, в комплексе с ЕР-в СБРИР [33Р]тРПКгМе1 продолжает сохранять сильное кодон-антикодоновое взаимодействие с мРНК, но приобретает возможность обмена с внешней тРНК, т.е. обладает свойствами, отличными от таковых тРНК связанной в классических и Е- и Р-участках. Качественно сходные результаты дал опыт, в котором вместо развертки по времени варьировали концентрацию добавленной тРНК-конкурента (рис. 2В). Транслокационые состояния сравнивали также по их способности реагировать с агентами, отщепляющими пептид, такими как пуромицин и терминационные факторы 1-ого класса КР1 и КР2. В первом типе опытов исследовали отщепление пуромицином либо 1*Р2 пептида [3Н]£Ме1-[14С]11е, связанного с находящейся Р-участке тРНК, рис. ЗА.

Добавление ЕР-О-ООРИР к претранслокационному комплексу переводит его в состояние, в котором пептид может быть высвобожден под действием пуромицина (рис. ЗА)

-А

- GTP + tfiNA'"»'

• GDP+ tRNA«"«

* GDPNP + lRNA*<«> »GTP + tRNA*»

o GDP + tRNA™* л GDPNP + tRNAfb*

В

1 2 3 4 5

Время (мип)

1.0

i.5 1.0 1.5 2.0 тРНК(цМ)

Рис. 2. (А) Кинетика обмена связанной [33P]rPHKfMet с тР1ПСгМе1 и тРНКРЬе в

претранслокационном, посттранслокационном и промежуточном рибосомных комплексах (В) концентрационная зависимость обмена [33Р]тРНКгМе1 с тРНК^ и тРНКГЬе в претранслокационном, посттранслокационном и промежуточном рибосомных комплексах.

• + GDPNP

• +GDP

• + GDPNP + GDP

В

л "Z

а

2 §

S и

те S

(9 О.

в

• + GDPNP ■ + GDP

а ♦ GDPNP + GDP

6 8 Время (мин)

10

0 20 40 60 80 100 120 140 160 Время (сек)

Рис. 3. Кинетика отщепления пептида в претранслокационном, посттранслокационном и промежуточном рибосомных комплексах под действием пуромицина (А) и RF2 (В).

или 11Р2 (рис. ЗВ). Промежуточное состояние рибосомы при добавлении ГДФ возвращается в исходное претранслокационное, поскольку при добавлении ГДФ утрачивается возможность взаимодействия с пуромицином. Опыты с использованием ИР2 приводят к

аналогичным результатам: ЕР-ССБРЫР переводит рибосому в состояние, в котором пептид может быть медленно отщеплен ИР2, последующее добавление ГДФ переводит систему в состояние устойчивости к НР2. Таким образом, в промежуточном состоянии происходит транслокация мРНК (этот факт с необходимостью следует из возможности взаимодействия с КР2, которому необходим стоп-кодон в А-сайте, возникнающий только в случае транслокации), при диссоциации же ЕР-йСОРОТ из промежуточного состояния мРНК возвращается в исходное претранслокационное положение, характеризующееся в нашем случае отсутствием в А-участке стоп-кодона и посему не способное взаимодействовать с фактором терминации 1*Р2, а также не обладающее пуромициновой реактивностью в связи с заполненностью А-сайта пептидил-тРНК. Подобное поведение не согласуется с «классической» моделью транслокации (1поие-Уокоза\уа еь а1., 1974, Сг\уогко\У5к| ег. а!., 1997), согласно которой смысл гидролиза ГТФ заключается в ускорении диссоциации ЕР-в с рибосомы после завершения транслокации, из чего следует, что диссоциация СБРИР должна приводить к завершению транслокации.

Основываясь на том, что количество тРНК, способной быть замещенной в Р-участке рибосомы при добавлении ЕР-С-СОР№ и тРНК-конкурента соответствует количеству образовавшегося комплекса рибосомы с ЕР-С-СВРЫР, была измерена аффинность ЕР-О-вОРОТ к рибосоме. Для определения количества связавшейся тРНК ргеТ комплексы инкубировали с ЕР-О, тРНК-конкурентом и увеличивающейся концентрацией СОРЫР, после чего определяли количество связанного с рибосомой тРНК методом фильтрации через нитроцеллюлозные мембраны. Кажущаяся константа диссоциации ЕР-ССОРЫРргеТ равна ~40 цМ, (рис. 10Е в диссертации). Следовательно, связывание ЕР-ССОР№ с ргеТ комплексом, ердержащим пептидил-тРНК в А-участке, —100 в раз слабее, чем связывание с ЕР-й-бОРОТ с роБ^ комплексом с пустым А-участком (рис. 7, IV в работе 2ау1а1оу е1. а]., 2003).

Сродство деацилированных тРНК к Е-участку рибосомы

В процесс транслокации пептидил-тРНК из А-участка перемещается в Р-участок, а деацилированная тРНК из Р-участка - в Е-участок и затем диссоцирует в цитоплазму. Поскольку мы сравнивали скорости обмена и диссоциации тРНК в Е-участке робП* комплекса и той же тРНК промежуточного состояния в комплексе с ЕР-О-СОРИР, возникла необходимость изучить связывание тРНК в Е-участке рибосомы.

9

Мы определяли константы диссоциации тРНКгМе1 и тРНКРЬес комплексами, несущими в Е-участке различные кодоны мРНК. Связывание [^ЗтРНКг"'* определяли методом фильтрования через нитроцелюзезные мембраны. Свободная тРНК проходит через мембрану, а находящаяся в комплексе с рибосомой связывается с мембраной. Для определения констант связывания

тРНКРЬе

использовали ингибирование связывания [33Р]тРНКгМй при помощи немеченой тРНКРЬе. (Таблица 1).

Таблица 1. Равновесные константы связывания различных деацилированных тРНК в Е-участке претранслокационных (ргеТ) и посттранслокационных (post) рибосомных комплексов.

Комплекс Пептид кодон в Е-участке тРНК

KD (пМ) Дополнительные факторы, температура

РгеТ

fMI

PostT fMI

fM

PostT PostT

fMFTI

fMI fMI

Thr(ACG)

Met (AUG)

Phe (UUU)

Thr (ACG)

Met (AUG) Met (AUG)

fMet 144 ±7 37*C

179 ± 14 EF-G + GTP; 37°C

770 ±80 EF-G + GDP; 3TC

40 ± 2 EF-G + GDPNP; 37°C

fMet 153 ±9 37°C

Phe 250 ± 30

fMet 295 ±26

Phe 84 ± II

fMet 162 ±5

Phe 134 ±20

fMet 155 ± 10 + RelE; 37°C

fMet 24.8 ± 1.2 0°C

Как тРНКРЬе, так и тРНК;1""" связываются с постгерминационым комплексом с приблизительно одинаковой аффинностью, мало зависящей от кодона в Е-участке. При этом аффинность тР1ГКгМе1 к ргеТ и роэгТ комплексам сходно независимо от разрезания мРНК ЯеШ в Е-участке. Связывание тРНК улучшается в 7 раз при понижении температуры с 37°С до 4°С. Низкая константа связывания в этом случае согласуется с данными по обмену тРНК. Добавление к ргеТ комплексу ЕБ-О-ГТФ не влияло на связывание с Е-участком тРНК^8*, что отражает то, что аффинность пре- и посттранслокационного Е-участка к тРНК практически одинакова. Добавление же ЕР-ОТДФ значительно понижало аффинность тРНК, что может быть вызвано стабилизацией образующегося комплекса в гибридном состоянии (Моагес! е1.

- Met

al., 1989), нто затрудняет связывамие деацшшрованной тРНК с Е-участком вследствие стерических затруднений, вызванных Р/Е гибридной тРНК.

Возможный механизм транслокации у прокариот

На основании полученных результатов и данных литературы предложена модель транслокации (рис. 4).

А о В • о С D

^¿("релаксированное -vJ Nj

^ состояние" '"f ъ GTP ^

"i ef-g ^ ' - —

E PtA ,. r>«GDP E p*- A' GDP i a . L7/L12

& cr^f Г > " lP'7^ fG

PpA A-^Г ^ ^ P A"

PreT «¿>- освобождение мРШС и Qjp QQp,p , ^

, ft ' G поворот 30S < транслокадия ^ ^ ' " поворот 30S

^"закрученное Ь-^DP * / случай U ^

r « состояние" ) и ► не1ндрулезусмого ^ / ^

^' . ^ аналога GTP -->

E P A А" p «5 A' ¿.«GDPNP e p A ■

Lt-r,f . t GDPNP u 45" >>ts\ 1,7 Г x?

^S«?, ' r........

^РПА ~ =э 4>"P A'" . * PtV"

«c: ACUAUGAUUUAA промежуточное Rp2 мРНК n поворот 30S Thr Met lie STOP состояние .................. иыомадаши мРНК postT

Рис. 4. Предложенная модель механизма транслокации, с предлагаемым механизмом действия GDPNP in vitro. Основой для предположенных структурных изменений в рибосоме в процессе транслокации (поворот 30S, закручивание, конформационные изменения в белке LI) служили исследования с помощью криоэлектронной микроскопии (Val. le al. . al. 2003, Rawat at. al. . 2003 и др.).

Вне рибосомы EF-G находится в комплексе с ГДФ или в свободной от нуклеотида форме. Связывание EF-G-ГДФ с ргеТ стимулирует обмен ГДФ на ГТФ, т.е. рибосомный комплекс выступает в роли GEF для EF-G (рис. 4А-С). Обмен нуклеотидов приводит к переходу ргеТ в «открытое» состояние (рис. 4А-В), последующий гидролиз ГТФ вызывает переход рибосомы в «закрытое» состояние (рис. 4D-E). В стимуляции гидролиза связанного с EF-G ГТФ ключевую роль играет рибосомный белок L7/L12, представляющий собой GAP для EF-G (Savelsbergh et. al., 2000). Последующий переход EF-G в ГДФ-связанную конформацию приводит за счет взаимодействия домена IV с 30S к переходу последней в

«расслабленное» состояние, что вызывает аккомодацию мРНК:тРНК комплекса в посттранслокационном состоянии. На этом этапе деацилированная тРНК теряет контакт с мРНК и аккомодируется в Е/Е положении, характеризующемся низкой аффинностью к тРНК и отсутствием кодон-зависимости связывания (рис. 2А-В, 4, Lili et. al., 1989). После диссоциации неорганического фосфата, которая, возможно, ускоряется вращением субъединиц рибосомы, EF-G в ГДФ-связанной форме быстро покидает рибосому.

Диссоциация деацилированной тРНК от посттерминационного комплекса в процессе

рибосомного рециклинга

Изучение механизма действия EF-G в процессе элонгации привело к пересмотру представлений о механизме действия EF-G, в связи с чем решено исследовать действие EF-G на этапе рибосомного рециклинга, суть которой заключается в том, что постерминационная рибосома подготавливается к новому циклу трансляции: диссоциирует на субъединицы, освобождается от деацилированной тРНК в Р-участке и от мРНК. После этого свободная 30S субъединица готова участвовать в образовании нового инициаторного комплекса, таким образом замыкая цикл трансляции.

Согласно одной из моделей, совместное действие EF-G и RRF. приводит к транслокации деацилированной тРНК в постгерминационном комплексе из Р в Е-участок, откуда тРНК диссоциирует с рибосомы (Fujiwara et. al., 2004). Согласно другой модели, EF-G и RRF диссоциируют рибосому на субъединицы, и тРНК удаляется с 30S под действием инициаторного фактора IF3 (Karimi et. al., 1999). Основное различие между этими моделями заключается в отсутствии либо присутствии транслокации на этапе рециклинга рибосом прокариот. Однако прежде чем переходить непосредственно к вопросу транслокации, необходимо исследовать закономерности, обуславливающие поведение субстрата рибосомного рециклинга - посттерминационного комплекса.

Мы приготовили три варианта терминационных комплексов, несущих в Р-участке тетра- , пента- или гексапептидил-тРНК11е, (рис. 5). Для анализа комплексов использовали метод токсин-зависимого разрезания мРНК в A-участке рибосомы (Zavialov et. al., 2004, Pedersen 2003 et. al.,). Во-первых, как известно из литературы и подтверждено нашими опытами, стабильность связывания тРНК в Р-участке зависит от наличия пептида. Пептидил-тРНК

МРТМ1 , *

Я

6 м

в

168 рРНК

еРу

л _____ -. ОТ

8? от

8

С

168 ргша

' 'аииио у

<4?° ЧУ

Рис. 5. Схематическое изображение использованных в работе претерминационных комплексы, ргеТ(МРТ1), ргеТ(МРТМ1) и ргеТ(МТМРТ1). В случае ргеТ(МТМБТ1) отсутствует контакт 165:Шайн-Дальгарно.

стабильно связана с рибосомным комплексом, отщепление же пептида приводит к резкому снижению сродства тРНК к Р-участку. Во-вторых, стабильность связывания деацилированной тРНК в Р-участке падает с увеличением расстояния от кодона в Р-участке до участка Шайн-Дальгарно, причем после синтеза гексапептида эта аффинность становится очень низкой. В-третьих, контакт между 168 рРНК и участком Шайн-Дальгарно мРНК сохраняется при синтезе коротких пептидов, что приводит эффективной реиницииации рибосомы на одной и той же мРНК, что может в свою очередь объяснять токсичность подобных коротких рамок считывания для клетки.

Высокая стабильность комплексов, несущих в Р-участке пептидил-тРШС, известна (гау!а1. оу е^ а1., 2001, 2002). В ходе наших опытов устойчивость комплексов подтверждена тем, что добавление Ке1Е через определенные промежутки времени к инкубирующимся при 37°С комплексам приводит к одинаковой интенсивности разреза в стоп-кодоне, т.е. количество рибосомных комплексов не изменялось в течение опыта. При отщеплении пептида пуромицином поведение комплексов меняется (рис. 6). В первой серии роэгТССМБЛ) и ро81ТС(МРТМ1), не несущие пептида, подвергали воздействию Ле1Е 15 сек в определенные моменты времени. В параллельном опыте К.е1Е присутствовал в реакционной смеси в течение всей инкубации. В первой серии в случае роь1ТС(МРТ1) с течением времени не наблюдали изменения доли разрезанной мРНК в кодоне НЛО, что говорит о том что рибосома оставалась в поеттерминационном состоянии. Напротив, в той же серии опытов в случае роз1ГС(МРТМ1) наблюдали падение интенсивности полосы, соответствующей Р-участку поеттерминационного

комплекса. Когда RelE присутствовал с начала инкубации отмечали уменьшение интенсивности полосы, соответствующей продукту разрезания мРНК в стоп-кодоне UA*G Р-участка как для postTC(MFTI), так и для postTC(MFTMI), однако в случае postTC(MFTMI) уменьшение интенсивности сигнала происходило быстрее.

% разреза -

■ :■."., А 100 100 100 100 100 100 73 rj, . 100 83 г.я 100 „

(UAG)tÍB

М- . -I <тЫщиш V UA*G

UA*G

MFTI

«г ¡a; ss t¡a¡ wí ' r r; -í ii t.' a tj a ■ "i TTTr t™ Время 01248012480124801248 МИН

■/Л i,, "_____t ♦ _>v_

MFTI1 MFTM11 MFTI2 MFTMI 2

Рис. 6. Стабильность ро^Т(МРТ1) и роэ^МРТМ!) комплексов в присутствии ЯеШ в течение всего времени инкубации (первая серия, МБТП и МРТМ11), либо при добавлении токсина в определенные моменты (вторая серия).

Полученные результаты указывают на то, что кодон в Р-участке постгерминационного комплекса, в котором транслирующая рибосома удалена от инициаторного кодона на пять кодонов, более подвижен и быстрее покидает А-участок, в котором может быть разрезан Ке1Е, чем кодон в Р-участке рибосомы, протранслировавшей четыре аминокислоты. Возможным объяснением подобного феномена является уменьшение стабильности связанной в Р-участке рибосомы деацилированной тРНК, удерживающей мРНК от движения в рибосоме при помощи кодон-антикодонового взаимодействия. Второй вывод из сравнения первой и второй серии опытов заключается в том, что разрезание мРНК токсином как таковое повышает подвижность мРНК в посттерминационном комплексе, по-видимому, за счет понижения стабильности связанной тРНК в Р-участке.

Полученные данные указывают на то, что при удалении пептида тРНК диссоциацирует, что увеличивает подвижность мРНК, перемещающейся из исходного положения в Р-участке в новое, более энергетически выгодное. В отсутствие инициаторной тРНК (рис. 7) в ро5Л"С(МГТ1) и ро&ТС(МРТМ1) таковым является нахождение в Р-участке кодона АСв, кодирующего ТЬг. В присутствии инициаторной тРНК, как деацилированной, так и ацилированной, происходит реинициация.

% разреза . г • 100

(иЛБ)* Я

Я %ш ш 22. ii.iL

. ЫПЫ|

-4т АС'О -«-■ ипги

Время 0 0.5 1 1.5 г 3 4 4.5 в мин ШейРПК

Рис. 7. Временная зависимость перемещения рибосомы относитально мРНК после диссоциации деацилированной тРНК (дорожки 1-6), и реинициация при добавлении инициаторной тРНК (дорожки 7-9).

ргеТ комплекс, предварительно обработанный пуромицином, т.е. без пептида на связанной в Р-участке тРНК, подвергали действию токсина, добавляемого на 15 секунд в определенные моменты инкубации в течение 4 минут (рис. 7). Воздействие ЯеШ приводило к разрезанию мРНК в треониновом кодоне, что свидетельствует о перемещении мРНК относительно А-участка рибосомы. Затем к смеси добавляли ШегтРНК/^*, после чего появлялся разрез в новом положении А-участка рибосомы на мРНК, соответствующий образованию инициаторного комплекса. Аналогичный результат давало использование деацилированной инициаторной тРНК.

Разница в стабильности находящейся в Р-участке деацилированной тРНК для ро51ТС(МРТ1) и роз1ТС(МРТМ1) может быть связана с меньшим расстоянием от кодона в Р-участке до участка Шайн-Дальгарно в роз1.ТС(МРТ1). Для проверки этого предположения проведен опыт по исследованию способности комплексов, простраслировавшйх тетра-, пента-и гексапептиды реинициировать в присутствии анти-Шайн-Дальгарно дезоксиолигонуклеотида. Показано, что ройТС(МРТ1) и роз1:ТС(МРТМ1) способны реинициировать на той же мРЬЖ в присутствии анти-Шайн-Дальгарно, следовательно, в этих комплексах участок Шайн-Дальгарно не блокирован ДНК-РНК дуплексом. В случае ро81:ТС(МТМРМТ) реинициация полностью подавлялась при добавлении анти-Шайн-Дальгарно. За счет образования дуплекса анти-Шайн-Дальгарно:Шайн-Дальгарно рибосома не могла перейти в инициаторный комплекс после разрезания кодона в Р-участке токсином и диссоциации тРНКПе.

Роль КШ? и ЕР-С в диссоциации тРНК в процессе рибосомного рециклинга

После анализа поведения деацилированной тРНК на посггерминационнных комплексах изучено влияние факторов, участвующих в рибосомного рециклинга - ЯЯТ, 1РЗ и ЕБ-О.

% разреза

¿100 90 ее сл 100 -га м о«; 95

Время 0.25 2 4 6 0.25 2 4 6 0.25 2 4 6 0.25 2 4 6 МИН

ЕР-в+СТР ЕР-в+СТР ЕР-в+СТР ЕР-в+СТР +1РЗ +РШР +ЯРР+1РЗ

Рис. 8. Кинетика диссоциации поеттерминационных комплексов под действием ЕР-О, Ш1Р и №3 в присутствии ГТФ.

ро51ТС(МРТ1) комплексы инкубировали в присутствии различных факторов и долю рибосом, находящихся в ройТССМРИ), определяли по эффективности разрезания под действием токсина 11е1Е кодона иЛО в А-участке рибосомы (рис. 8). Кинетику процесса исследовали, отбирая аликвоты через 0,25, 2, 4 и 6 минут после добавления токсина. Добавление 1РЗ, ЕР-в и ГТФ не увеличило скорость реинициации, однако добавление ЕР-в, ШУ? и ГТФ с или без 1РЗ привело к быстрому удалению тРНК из Р-участка. Об этом свидетельствует быстрое уменьшение полосы, соответствующей комплексу, зафиксированному на мРНК посредством деацилированной тРНК в Р-участке, (рис. 8). Исследование кинетических параметров диссоциации деацилированной тРНК проводили с использованием роз1ТС(МРТ1), содержащих в Р-учаске [33Р]тРНКПе, которые инкубировали с Ы1Р, ГТФ, Ер-в и тРНК^®1 конкурирующей за связывание с рибосомным комплексом с [33Р]тРНКПе. ЯЯР и ЕР-<3 кооперативно стимулируют диссоциацию [33Р]тРНКПс (рис. 21В в диссертации).

Таким образом, ЕР-в ■ и Ш1Р ГТФ-зависимо ускоряют диссоциацию деацилированной тРНК из посттермииационного комплекса. Полученные данные противоречат ранним наблюдениям (Каппп е1. а1. . 1999) что связано, по-видимому, с использовавшимися в указанной работе недостаточными концентрациями факторов.

Взаимодействие RRF и EF-G на 70S и 50S рибосомах

Влияние RRF на аффинность EF-G в комплексе с [3H]GDPNP к postTC, 70S или 50S исследовали с использованием фильтрования через нитроцеллюлозные мембраны, д В

-Г-.

С С.

и

с_ Q

9 о Ú. LJ

•л •

1ЭЗ

D¿ rS

RRF(nM)

E

а

'О t $

üj

к>

oí.....

о

GDPNP(mM)

«»

с

с.

•л с. с

о •

о

и.

*ч

i , /

¥

сл oí эг о* »>4 о* n«

D

30S(mM)

с. y. да*, с. D

О » •

О

ti ВС

tu g -

а , t-i *

\

RRF(nM)

Рис. 9. Антагонизм и синергетизм связывания RRF и EF-G на 50S и 70S рибосомах. RRF повышает аффинность EF-G-[3H]GDPNP к 50S (А, С), сходно с 30S (В), но вытесняет EF-Gr[3H]GDPNP из комплекса с 70S (В).

Добавление RRF повышает сродство EF-G-[3II]GDPNP к 50S, причем эффект RRF может быть сравним с эффектом 30S, поскольку добавление 30S приводило к аналогичному результату (рис. 9 А и В). 50S может быть полностью связана в комплекс с EF-G-[3H]GDPNP при повышении концентрации [3H]GDPNP и EF-GGDPNPRRF-50S.

Если в случае 50S добавление RRF приводило к повышению аффинности к EF-G[3H]GDPNP, то в случае postTC и 70S эффект RRF был прямо противоположным (рис 9D). Подтверждены данные литературы о том, что EF-G-[3H]GDPNP и RRF конкурируют за связывание с 70S, и в случае высоких концентраций RRF происходит конкурентное вытеснение EF-G-GDPNP с рибосомы, при низких концентрациях RRF возможно его вытеснение при увеличении концентрации EF-G-GDPNP (Keil et. al., 2003, Fujiwara et. al., 2004).

Диссоциация 70S на субъединицы под действием RRF и EF-G

Диссоциацию 70S на субъединицы под воздействием трансляционных факторов, изучали ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы, измеряя профиль поглощения градиентов после центрифугирования. Это позволило обнаружить образование стабильно разделенных субъединиц, однако не позволяло обнаружить их образование в случае реассоциации. Для наблюдения реассоциирующих субъединиц использовали рибосомные комплексы, содержащие 33Р-меченную мРНК (рис. 10D). В реакционную смесь добавляли интересующие факторы и гуаниновые нуклеотиды, а также избыток 30S субъединиц, после чего смесь наносили на сахарозный градиент, центрифугировали, анализировали профиль поглощения при длине 260 нМ и измеряли количество радиоактивности отдельно в пиках 70S и 30S. При диссоциации рибосомы появлялась возможность обмена малой субъединицы с раствором, вследствие чего радиоактивность в пике реассоциирующих 70S падала.

Исследовали эффект EF-G, RRF, IF3 и ГТФ/ГДФ на образование не реассоциирующих субъединиц (рис. 1ОА-С). Для этого postTerm комплексы инкубировали в присутствии факторов 5 минут при 37°С, после чего образец наносили на сахарозный градиент. Добавление отдельно IF3, обладающего антиассоциативной активностью, позволяющей фактору предотвратить ассоциацию субъединиц в 70S (рис. 10А), не приводило к диссоциации. Добавление EF-G, RRF и IF3 ГТФ-зависимо приводило к диссоциации рибосомы (рис. 10В-С). Без IF3 этот набор не вызывал образования субъединиц, что объясняли отсутствием антиассоциативного агента, препятствующего образованию исходной рибосомы. В литературе имеется обширный материал про влиянию факторов на образование нереассоциирующих субъединиц, однако опытов по наблюдению реаасоциирующих субъединиц до нашей работы не проводилось, что приводило к возможной двоякой интерпретации роли IF3: либо этот фактор необходим исключительно

18

для стабилизации свободных субъединиц, диссоциированных ЕР-О или МШ (Капгш е1. а1. 1999), либо необходим для диссоциации рибосомы как таковой (Ннокалуа е!.а1.. 2002). Для

.....•• ¡И*>1ЯФ

■••Л'

2 .¡■с

1 •• ; ч [аа^ияг М|МГЭ • ¡г ?

* X

г

ЗЗР А

« >- Л«-

у: Гтг

Н

) ■ -

у зз^И'

ТГ V)

Йм

: Время (мин) ". ■ * •

Рис. 10. Диссоциация посттерминационных комплексов на субъединицы под действием ЕР-в и 1РЗ в присутствии гуаниловых нуклеотидов ультроцентрифугированием в сахарозном градиенте. Образование нереассоциирующих субъединиц требует присутствия ККБ, ЕР-в, ШЗи ГТФ (А-С). Схема опыта по обнаружению образования реассоциирующих субъединиц (Б), кинетика обмена 308 в присутствии ЕБ-О, ИКБ гуаниловых нуклеотидов (Е).

демонстрации диссоциации рибосомы в присутствии ЕР-в, КМ* и ГТФ провели опыты с обменом образующихся при диссоциации ЗОБ, позволяющих обнаружить не только образование стабильно диссоциированных, так и реассоциирующих субъединиц (рис. 10Б-Е). Показано, что обмен малых субъединиц происходит только в пристутствии ГТФ.

Возможный механизм рибосомного рециклиига у прокариот

На основании полученных результатов возможно сформулировать следующий механизм рибосомного рециклинга (рис. 11).

17Д.12 ■■

OIH GDP.t»j

A 1 , В , ^ С „___ £4ctp D

■■■■. ■■•'.i :■•.■.':■■':■.■..'■■ ■.'..-.'.-.'V1 .-.■■ '■•"■■ 1 разрыв ыежеубъедавичных контактов

r поворот 3 OS ■ r r . ■........,., .,•.■■■■:..,'■■

/е p ал' f** ■'/•£■.■■. p: -/,н..- p" a ■■■.■■.'. ■

н F —5W-G.O G --• н ——'

- РГ|А ^ Pfl* f ^-P-A' Л p A

диссоциация рибосомных . ■■

■■•■•<• субъединнц • ■■ ■. .. ■ •■. ■ ............■.■•

Рис. 11. Предложенный механизма рибосомного рециклинга.

Отправной точкой для предлагаемой модели служит полученный в процессе исследования механизма транслокации результат, свидетельствующий о том, что EF-G связывается с рибосомой в ГДФ-связанной форме и что постерминационная рибосома представляет собой GEF для EF-G. Исследования посттерминационого рибсомного комплекса с связанным с ним RRF (Agrawal. et. al., 2004, et. al., Gao 2005) с помощью криоэлектронной микроскопии показали, что в этом комплексе рибосома находится в закрученной конформации, с деацилированной тРНК в гибридном Р/Е состоянии, стабилизированной контактом с белком L1. Согласно нашим данным, рибосома в закрученной конфорамции представляет собой GEF для EF-G. Таким образом связывание EF-G-ГДФ с поеттерминационым рибсомальным комплексом со связанным с ним RRF приводит к обмену нуклеотида на EF-G и переходу фактора в ГТФ-связанную коиформацию. В полученном комплексе EF-G-ГТФ и RRF конкурируют за связывание с 70S (рис. 9) и либо EF-G, либо RRF покидает рибосому. Как показано в работе Gao et. al., 2005, при одновременном связывании EF-G-ГТФ и RRF с рибосомой головной домен RRF изменяет конформацию так, что облегчает диссоциацию рибосомы на субъединицы путём разрушения межсубъединичного контакта В2а.

Гидролиз ГТФ приводит к конформационному изменению EF-G, который переходит из ГТФ-связанной обратно в ГДФ-связанную форму, что вызывает полную диссоциацию

20

субъединиц (рис. 1 IE). Диссоциация субъединиц облегчает диссоциацию тРНК из Р-участка образующейся 30S, что важно при трансляции коротких пептидов, играющих важную роль в таких процессах. Диссоциация тРНК позволяет присоединение IF3 к 30S (Рис. 14G), после чего мРНК покидает малую субъединицу.

ВЫВОДЫ

1. Бактериальный трансляционный фактор EF-G находится в цитоплазме либо в свободной либо в ГДФ-связанной форме. При связывании с претранслокационным рибосомным комплексом резко измененяется сродство EF-G к ГДФ и ГТФ, что приводит к замене связанного ГДФ на ГТФ, т.е. рибосома выступает в роли GEF - фактора обмена ГДФ/ГТФ.

2. EF-G в ГТФ-связанной форме переводит рибосому в ранее не описанное промежуточное состояние, характеризующееся незавершенной транслокацией рибосомы относительно мРНК. Последующий переход рибосомы в посттранслокационное состояние требует гидролиза ГТФ.

3. Расстояние между участком Шайн-Дальгарно и ко доном в Р-участке посттермианционного рибосомного комплекса существенно влияет на стабильность связывания деацилированной тРНК с Р-участком рибосомы.

4. Трансляционные факторы RRF и EF-G в ходе процесса, требующего гидролиза ГТФ, диссоциируют посттерминационный рибосомный комплекс на свободные субъединицы, последующую реассоциацию которых предотвращает инициаторный фактор 1F3.

5. Трансляционные факторы RRF и EF-G обладают положительной кооперативностью при связывании с 5 0S рибосомной субъединицей и отрицательной - при связывании с 70S рибосомой, что объясняет механизм диссоциации посттерминационных рибосомных комплексов под действием этих факторов.

6. На основании полученных данных предложены модели транслокации и рибосомного рециклинга у бактерий.

БЛАГОДРАНОСТИ

Льву Львовичу Киселеву, Монсу Эренбергу, Андрею Завьялову, Людмиле Юрьевне Фроловой, Ивану Николаевичу Шацкому, Дёрмиду Хагису, Фабиану Дарфёй, Герхарду

Вагнеру и Ламину Буаказу за науку и помощь.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Zavialov A., Hauryliuk V., Ehrenberg М. (2005) Splitting of the posttermination ribosome into subunits by the concerted action of RRF and EF-G. Molecular Cell, 18, 675-686.

2. Zavialov A., Hauryliuk V., Ehrenberg M. (2005) Guanine-nucleotide exchange on ribosome-bound factor G initiates translocation of tRNAs. Journal, of Biology,4:9.

3. Гаврилюк В. В. (2006) ГТФфазы прокариотического аппарата трансляции. Молекулярная Биология, 40 (5), 1-15.

Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 19.10.2006 г.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ТРАНСЛЯЦИОННЫЕ ГТФАЗЫ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Общие свойства ГТФаз.

Структурные элементы рибосомы, участвующие в регуляции активности трансляционных ГТФаз.

ГТФазы трансляционного аппарата прокариот.

Инициация.

Элонгация и транслокация.

Терминация.

ГЛАВА II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Исследование механизма действия элонгационного фактора ЕБ-С в транслокации

Исследование транслокации методом токсин-зависимого разрезания мРНК в рибосомном А-участке.

Сравнительный анализ пре-, посттранслокационного и промежуточного состояний рибосомы.

Исследование обратимости образования в переходного состоянияпри связывании ЕГ-О'ООРЫР с претранслокационным комплексом.

Исследование аффинности деацилированных тРНК к Е-участку рибосомы . 35 Анализ чистоты используемых в лабораторной практикенуклеотидов: роль примесей результатах измерений.

Рибосома - вЕБ для ЕБ-О?.

Обсуждение результатов 1.

Исследование механизма действия трансляционных факторов ЕБ-О и в рибосомного рециклинга.

Исследование роли дисоциации тРНК с посттерминационногокомплекса в механизме реинициации.

Роль контактов между 16Б рРНК и последовательностью Шайн-Дальгарнопри реинициации трансляции.

Теримнацинные факторы не транслоцируют связанную в Р-участке посттерминационного комплекса мРНК.

Роль RRF и EF-G в диссоциации деацилированой тРНК с рибосомы.

RRF стимулирует связывание EF-G GDPNP с 50S и понижает с 70S.

Диссоциация 70S на субъединицы под действием RRF и EF-G.

Рибосома - молекулярная машина, синтезирующая белки согласно информации об их первичной структуре, заложенной в нуклеотидной последовательности мРНК [1]. В процессе синтеза белка, который с химической точки зрения представляет собой полимеризацию аминокислот в полипептидную цепочку, принимают участие кроме рибосомы дополнительные молекулы. Во-первых, РНК, выполняющие следующие функции: а) кодирования аминокислотной последовательности будущего белка (мРНК), б) адаптера, приносящего в химически активированной форме аминокислоты и устанавливающего взаимнооднозначное соответствие трехбуквенному коду азотистых оснований код аминокислотной последовательности (тРНК), в) регуляторные функции (тмРНК, малые РНК). Во-вторых, важную роль в биосинтезе белка играют малые молекулы, такие как нуклеотиды АТР и GTP, аминокислоты, различные ионы. В-третьих, в процессе трансляции принимают участие белковые молекулы: аминоацил-тРНК-синтетазы, трансляционные факторы, а также многочисленные вспомогательные белки трансляционного аппарата, выполняющие различные регуляторные функции.

Часть трансляционных факторов обладает ГТФазной активностью (см. ревью [2, 3]). Гидролиз GTP этими белками происходит на определенных стадиях белкового синтеза, и напрямую сопряжен со связыванием факторов с рибосомой, находящейся в определённом функциональном состоянии. В клетке Е. coli к ним относятся: IF2, инициаторный фактор, приносящий на рибосому инициаторную fMet-TPHKtMet [4], элонгационные факторы EF-G и EF-Tu, ответственные за транслокацию и связывание новой тРНК в А-участке рибосомы соответственно [5-8], а также терминационный фактор RF3, функция которого заключается в освобождении другого терминационного фактора, RF1 или RF2 с посттерминационного рибосомного комплекса [5-9]. Таким образом, ГТФазы принимают участие во всех этапах белкового синтеза. В связи с этим невозможно переоценить значение понимания общих закономерностей, присущих ГТФазам, для понимания механизма трансляции в целом.

Исследование механизма действия конкретных ГТФаз позволяет найти общие черты, присущие этим белкам, что в свою очередь служит базой для исследования механизма действия менее изученных представителей семейства. В этом смысле весьма полезно исследование хорошо разработанной in vitro системы трансляции Е. coli с последующим использованием полученного знания при исследовании значительно более сложного эукариотического трансляционного аппарата (эта часть исследований не вошла в представляемую диссертацию).

В данной работе исследовали механизм действия элонгационного фактора Е. coli EF-G, участвующего в процессе транслокации, а также в процессе рибосомного рециклинга (ribosomal recycling) - процесса, состоящего в том, чтобы подготовить посттерминационную рибосому к новому раунду синтеза белка. Кроме исследования механизмов действия EF-G были исследованы сопредельные проблемы механизмов трансляции.

выводы

1. Бактериальный трансляционный фактор EF-G находится в цитоплазме либо в свободной либо в ГДФ-связанной форме. При связывании с претранслокационным рибосомным комплексом резко измененяется сродство EF-G к ГДФ и ГТФ, что приводит к замене связанного ГДФ на ГТФ, т.е. рибосома выступает в роли GEF -фактора обмена ГДФ/ГТФ.

2. EF-G в ГТФ-связанной форме переводит рибосому в ранее не описанное промежуточное состояние, характеризующееся незавершенной транслокацией рибосомы относительно мРНК. Последующий переход рибосомы в посттранслокационное состояние требует гидролиза ГТФ.

3. Расстояние между участком Шайн-Дальгарно и кодоном в Р-участке посттермианционного рибосомного комплекса существенно влияет на стабильность связывания деацилированной тРНК с Р-участком рибосомы.

4. Трансляционные факторы RRF и EF-G в ходе процесса, требующего гидролиза ГТФ, диссоциируют посттерминационный рибосомный комплекс на свободные субъединицы, последующую реассоциацию которых предотвращает инициаторный фактор IF3.

5. Трансляционные факторы RRF и EF-G обладают положительной кооперативностью при связывании с 50S рибосомной субъединицей и отрицательной - при связывании с 70S рибосомой, что объясняет механизм диссоциации посттерминационных рибосомных комплексов под действием этих факторов.

6. На основании полученных данных предложены модели транслокации и рибосомного рециклинга у бактерий.

1. Spirin A. S. 2002. Ribosome as a molecular machine. FEBS Lett. 514, 2-10.

2. Гаврилюк В. В. 2006. вТРфазы прокариотического аппарата трансляции. Молекулярная Биология. 40, 1-15.

3. Кубаренко А. В., Сергиев П. В., Роднима М. В. 2005. ГТФазы аппарата трансляции. Молекулярная Биология. 39, 746-761.

4. Maitra U. S. Е., Chaudhuri А. 1982. Initiation factors in protein biosynthesis. Annu Rev Biochem. 51, 861-900.

5. Agrawal R. K., Penczek P., Grassucci R. A., Frank J. 1998. Visualization of elongation factor G on the Escherichia coli 70S ribosome: the mechanism of translocation. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 6134-6138.

6. Noller H. F., Yusupov M. M., Yusupova G. Z., Baucom A., Cate J. H. 2002. Translocation of tRNA during protein synthesis. FEBS Lett. 514, 11-6.

7. Rodnina M. V., Pape Т., Fricke R., Wintermeyer W. 1995. Elongation factor Tu, a GTPase triggered by codon recognition on the ribosome: mechanism and GTP consumption. Biochem Cell Biol. 73, 1221-1227.

8. Stark H., Rodnina M. V., Rinke-Appel J., Brimacombe R., Wintermeyer W., van Heel M. 1997. Visualization of elongation factor Tu on the Escherichia coli ribosome. Nature. 389, 403-406.

9. Zavialov A. V., Buckingham R. H., Ehrenberg M. 2001. A posttermination ribosomal complex is the guanine nucleotide exchange factor for peptide release factor RF3. Cell. 107, 115-124.

10. Bourne H. R. 1993. GTPases. A turn-on and a surprise. Nature. 366, 628-629.

11. Bourne H. R. 1995. GTPases: a family of molecular switches and clocks. Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 349, 283-289.

12. Kaziro Y. 1978. The role of guanosine 5'-triphosphate in polypeptide chain elongation. Biochim Biophys Acta. 505, 95-127.

13. Wieden H. J., Gromadski K., Rodnin D., Rodnina M. V. 2002. Mechanism of elongation factor (EF)-Ts-catalyzed nucleotide exchange in EF-Tu. Contribution of contacts at the guanine base. J Biol Chem. 277, 6032-6036.

14. Wieden H. J., Wintermeyer W., Rodnina M. V. 2001. A common structural motif in elongation factor Ts and ribosomal protein L7/12 may be involved in the interaction with elongation factor Tu.JMolEvol. 52, 129-136.

15. Dell V. A., Miller D. L., Johnson A. E. 1990. Effects of nucleotide- and aurodox-induced changes in elongation factor Tu conformation upon its interactions with aminoacyl transfer RNA. A fluorescence study. Biochemistry. 29, 1757-63.

16. Rittinger K., Walker P. A., Eccleston J. F., Nurmahomed K., Owen D., Laue E., Gamblin S. J., Smerdon S. J. 1997. Crystal structure of a small G protein in complex with the GTPase-activating protein rhoGAP. Nature. 388, 693-697.

17. Rittinger K., Walker P. A., Eccleston J. F., Smerdon S. J., Gamblin S. J. 1997. Structure at 1.65 A of RhoA and its GTPase-activating protein in complex with a transition-state analogue. Nature. 389, 758-762.

18. Sprinzl M., Brock S., Huang Y., Milovnik P., Nanninga M., Nesper-Brock M., Rutthard H., Szkaradkiewicz K. 2000. Regulation of GTPases in the bacterial translation machinery. Biol Chem. 381, 367-375.

19. Berchtold H., Reshetnikova L., Reiser C. O., Schirmer N. K., Sprinzl M., Hilgenfeld R. 1993. Crystal structure of active elongation factor Tu reveals major domain rearrangements. Nature. 365, 126-132,

20. Savelsbergh A., Mohr D., Wilden B., Wintermeyer W., Rodnina M. V. 2000. Stimulation of the GTPase activity of translation elongation factor G by ribosomal protein L7/12. J Biol Chem. 275, 890-894.

21. Mohr D., Wintermeyer W., Rodnina M. V. 2002. GTPase activation of elongation factors Tu and G on the ribosome. Biochemistry. 41, 12520-12528.

22. Zavialov A. V., Ehrenberg M. 2003. Peptidyl-tRNA regulates the GTPase activity of translation factors. Cell. 114, 113-122.

23. Zavialov A. V., Mora L., Buckingham R. H., Ehrenberg M. 2002. Release of peptide promoted by the GGQ motif of class 1 release factors regulates the GTPase activity of RF3. Mol Cell. 10, 789-798.

24. Zavialov A. V., Hauryliuk V. V., Ehrenberg M. 2005. Guanine-nucleotide exchange on ribosome-bound elongation factor G initiates the translocation of tRNAs. J Biol. 4,9.

25. Cate J. H, Yusupov M. M., Yusupova G. Z„ Earnest T. N., Noller H. F. 1999. X-ray crystal structures of 70S ribosome functional complexes. Science. 285, 20952104.

26. Yusupov M. M., Yusupova G. Z., Baucom A., Lieberman K., Earnest T. N., Cate J. H., Noller H. F. 2001. Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science. 292, 883-96.

27. Sergiev P. V., Bogdanov A. A., Dontsova O. A. 2005. How can elongation factors EF-G and EF-Tu discriminate the functional state of the ribosome using the same binding sitQlFEBSLett.

28. Leffers H., Egebjerg J., Andersen A., Christensen T., Garrett R. A. 1988. Domain VI of Escherichia coli 23 S ribosomal RNA. Structure, assembly and function. J Mol Biol. 204, 507-22.

29. Moazed D., Robertson J. M., Noller H. F. 1988. Interaction of elongation factors EF-G and EF-Tu with a conserved loop in 23S RNA. Nature. 334, 362-4.

30. AEvarsson A., Brazhnikov E., Garber M., Zheltonosova J., Chirgadze Y., al-Karadaghi S., Svensson L. A., Liljas A. 1994. Three-dimensional structure of the ribosomal translocase: elongation factor G from Thermus thermophilus. EMBOJ. 13, 3669-3677.

31. Agrawal R. K., Linde J., Sengupta J., Nierhaus K. H., Frank J. 2001. Localization of LI 1 protein on the ribosome and elucidation of its involvement in EF-G-dependent translocation. J Mol Biol. 311, 777-787.

32. Diaconu M., Kothe U., Schlunzen F., Fischer N., Harms J. M., Tonevitsky A. G., Stark H., Rodnina M. V., Wahl M. C. 2005. Structural basis for the function of the ribosomal L7/12 stalk in factor binding and GTPase activation. Cell. 121, 991-1004.

33. Yusupov M. M., Yusupova G. Z., Baucom A., Lieberman K., Earnest T. N., Cate J. PI., Noller H. F. 2001. Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science. 292, 883-896.

34. Frank J. 2003. Toward an understanding of the structural basis of translation. Genome Biol. 4, 237.

35. Wahl M. C., Moller W. 2002. Structure and function of the acidic ribosomal stalk proteins. Curr Protein Pept Sci. 3, 93-106.

36. Agrawal R. K., Heagle A. B., Penczek P, Grassucci R. A., Frank J. 1999. EF-G-dependent GTP hydrolysis induces translocation accompanied by large conformational changes in the 70S ribosome. Nat Struct Biol. 6, 643-647.

37. Agrawal R. K., Spahn C. M., Penczek P., Grassucci R. A., Nierhaus K. H., Frank J. 2000. Visualization of tRNA movements on the Escherichia coli 70S ribosome during the elongation cycle. J Cell Biol. 150, 447-460.

38. Valle M., Zavialov A., Li W., Stagg S. M., Sengupta J., Nielsen R. C., Nissen P., Harvey S. C., Ehrenberg M., Frank J. 2003. Incorporation of aminoacyl-tRNA into the ribosome as seen by cryo-electron microscopy. Nat Struct Biol. 10, 899-906.

39. Valle M., Zavialov A., Sengupta J., Rawat U., Ehrenberg M., Frank J. 2003. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114, 123-134.

40. Frank J., Agrawal R. K. 2000. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406, 318-322.

41. Frank J., Agrawal R. K. 2001. Ratchet-like movements between the two ribosomal subunits: their implications in elongation factor recognition and tRNA translocation. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 66, 67-75.

42. Ogle J. M„ Brodersen D. E„ Clemons W. M„ Jr., Tarry M. J„ Carter A. P., Ramakrishnan V. 2001. Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit. Science. 292, 897-902.

43. Sundari R. M., Stringer E. A., Schulman L. H., Maitra U. 1976. Interaction of bacterial initiation factor 2 with initiator tRNA. J Biol Chem. 251, 3338-3345.

44. Brandt R, Gualerzi C. O. 1992. Ribosomal localization of the mRNA in the 30S initiation complex as revealed by UV crosslinking. FEBS Lett. 311, 199-202.

45. Calogero R. A., Pon C. L., Canonaco M. A., Gualerzi C. O. 1988. Selection of the mRNA translation initiation region by Escherichia coli ribosomes. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 6427-31.

46. Shine J., Dalgarno L. 1974. The 3'-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc Natl Acad Sci USA. 71, 1342-6.

47. Tchufistova L. S., Komarova A. V., Boni I. V. 2003. A key role for the mRNA leader structure in translational control of ribosomal protein SI synthesis in gamma-proteobacteria. Nucleic Acids Res. 31, 6996-7002.

48. Komarova A. V., Tchufistova L. S., Supina E. V., Boni I. V. 2002. Protein S1 counteracts the inhibitory effect of the extended Shine-Dalgarno sequence on translation. Rna. 8, 1137-47.

49. Boni I. V., Isaeva D. M., Musychenko M. L., TzarevaN. V. 1991. Ribosome-messenger recognition: mRNA target sites for ribosomal protein SI. Nucleic Acids Res. 19, 155-62.

50. Boni I. V., Isaeva D. M., Budovskii E. I. 1986. Ribosomal protein SI in the complex of E. coli ribosomal subunit 30S with phage MS2 RNA interacts with internal region of the replicase gene., Bioorg Khim. 12, 293-6.

51. Boni I. V., Zlatkin I. V., Budowsky E. I. 1982. Ribosomal protein SI associates with Escherichia coli ribosomal 30-S subunit by means of protein-protein interactions. Eur J Biochem. 121, 371-6.

52. McCutcheon J. P., Agrawal R. K., Philips S. M., Grassucci R. A., Gerchman S. E., demons W. M., Jr., Ramakrishnan V., Frank J. 1999. Location of translational initiation factor IF3 on the small ribosomal subunit. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4301-6.

53. Antoun A., Pavlov M. Y., Andersson K., Tenson T., Ehrenberg M. 2003. The roles of initiation factor 2 and guanosine triphosphate in initiation of protein synthesis. EMBOJ. 22, 5593-5601.

54. Hartz D., McPheeters D. S., Gold L. 1989. Selection of the initiator tRNA by Escherichia coli initiation factors. Genes Dev. 3, 1899-1912.

55. Antoun A., Pavlov M. Y., Lovmar M., Ehrenberg M. 2006. How initiation factors maximize the accuracy of tRNA selection in initiation of bacterial protein synthesis. Mol Cell. 23, 183-93.

56. Antoun A., Pavlov M. Y., Lovmar M., Ehrenberg M. 2006. How initiation factors tune the rate of initiation of protein synthesis in bacteria. Embo J. 25, 2539-50.

57. Allen G. S, Zavialov A, Gursky R., Ehrenberg M., Frank J. 2005. The cryo-EM structure of a translation initiation complex from Escherichia coli. Cell. 121, 70312.

58. Roll-Mecak A., Cao C., Dever T. E, Burley S. K. 2000. X-Ray structures of the universal translation initiation factor IF2/eIF5B: conformational changes on GDP and GTP binding. Cell. 103, 781-792.

59. Lee J. H„ Pestova T. V., Shin B. S., Cao C., Choi S. K., Dever T. E. 2002. Initiation factor eIF5B catalyzes second GTP-dependent step in eukaryotic translation initiation. Proc Natl Acad Sci USA. 99, 16689-16694.

60. Andersen G. R., Nissen P., Nyborg J. 2003. Elongation factors in protein biosynthesis. Trends Biochem Sci. 28, 434-441.

61. Nissen P., Kjeldgaard M., Thirup S., Polekhina G., Reshetnikova L., Clark B. F., Nyborg J. 1995. Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu, and a GTP analog. Science. 270, 1464-72.

62. Czworkowski J., Wang J., Steitz T. A., Moore P. B. 1994. The crystal structure of elongation factor G complexed with GDP, at 2.7 A resolution. Embo J. 13, 36613668.

63. Ito K., Fujiwara T., Toyoda T., Nakamura Y. 2002. Elongation factor G participates in ribosome disassembly by interacting with ribosome recycling factor at their tRNA-mimicry domains. Mol Cell. 9, 1263-1272.

64. Nakamura Y. 2001. Molecular mimicry between protein and tRNA. J Mol Evol. 53, 282-289.

65. Lancaster L., Kiel M. C., Kaji A., Noller H. F. 2002. Orientation of ribosome recycling factor in the ribosome from directed hydroxy! radical probing. Cell. Ill, 129-140.

66. Gromadski K. B., Wieden H. J., Rodnina M. V. 2002. Kinetic mechanism of elongation factor Ts-catalyzed nucleotide exchange in elongation factor Tu. Biochemistry. 41, 162-9.

67. Wieden H. J., Gromadski K., Rodnin D., Rodnina M. V. 2002. Mechanism of elongation factor (EF)-Ts-catalyzed nucleotide exchange in EF-Tu. Contribution of contacts at the guanine base. J Biol Chem. 277, 6032-6.

68. Wieden H. J., Wintermeyer W., Rodnina M. V. 2001. A common structural motif in elongation factor Ts and ribosomal protein L7/12 may be involved in the interaction with elongation factor Tu. JMol Evol. 52, 129-36.

69. Green R. 2000. Ribosomal translocation: EF-G turns the crank. Curr Biol. 10, 369373.

70. Moazed D., Noller H. F. 1989. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342, 142-148.

71. Noller H. F., Yusupov M. M., Yusupova G. Z., Baucom A., Cate J. H. 2002. Translocation oftRNA during protein synthesis. FEBS Lett. 514, 6-11.

72. Rodnina M. V., Savelsbergh A., Katunin V. I., Wintermeyer W. 1997. Hydrolysis of GTP by elongation factor G drives tRNA movement on the ribosome. Nature. 385, 37-41.

73. Savelsbergh A., Katunin V. I., Mohr D., Peske F., Rodnina M. V., Wintermeyer W. 2003. An elongation factor G-induced ribosome rearrangement precedes tRNA-mRNA translocation. Mol Cell. 11, 1517-1523.

74. Savelsbergh A., Matassova N. B., Rodnina M. V., Wintermeyer W. 2000. Role of domains 4 and 5 in elongation factor G functions on the ribosome. J Mol Biol. 300, 951-961.

75. Semenkov Y. P., Rodnina M. V., Wintermeyer W. 2000. Energetic contribution of tRNA hybrid state formation to translocation catalysis on the ribosome. Nat Struct Biol. 7, 1027-31.

76. Valle M., Zavialov A., Sengupta J., Rawat U., Ehrenberg M„ Frank J. 2003. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114, 123-34.

77. Hirashima A., Kaji A. 1973. Role of elongation factor G and a protein factor on the release of ribosomes from messenger ribonucleic acid. J Biol Chem. 248, 75807587.

78. Hirokawa G., Kiel M. C, Muto A., Kawai G., Igarashi K., Kaji H., Kaji A. 2002. Binding of ribosome recycling factor to ribosomes, comparison with tRNA. J Biol Chem. 277, 35847-35852.

79. Karimi R., Pavlov M. Y., Buckingham R. H., Ehrenberg M. 1999. Novel roles for classical factors at the interface between translation termination and initiation. Mol Cell. 3, 601-609.

80. Selmer M., Al-Karadaghi S., Hirokawa G., Kaji A., Liljas A. 1999. Crystallization and preliminary X-ray analysis of Thermotoga maritima ribosome recycling factor. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 12), 2049-50.

81. Selmer M., Al-Karadaghi S., Hirokawa G., Kaji A., Liljas A. 1999. Crystal structure of Thermotoga maritima ribosome recycling factor: a tRNA mimic. Science. 286, 2349-52.

82. Scolnick E., Tompkins R., Caskey T., Nirenberg M. 1968. Release factors differing in specificity for terminator codons. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 768-74.

83. Milman G., Goldstein J., Scolnick E., Caskey T. 1969. Peptide chain termination. 3. Stimulation of in vitro termination. Proc Natl Acad Sci USA. 63, 183-90.

84. Caskey T., Scolnick E., Tompkins R., Goldstein J., Milman G. 1969. Peptide chain termination, codon, protein factor, and ribosomal requirements. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 34, 479-88.

85. Zhouravleva G., Frolova L., Le Goff X., Le Guellec R., lnge-Vechtomov S., Kisselev L., Philippe M. 1995. Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain release factors, eRFI and eRF3. EMBOJ. 14, 4065-4072.

86. Grentzmann G., Brechemier-Baey D., Heurgue V., Mora L., Buckingham R. H. 1994. Localization and characterization of the gene encoding release factor RF3 in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 5848-5852.

87. Mikuni O., lto K., Moffat J., Matsumura K„ McCaughan K., Nobukuni T„ Tate W., Nakamura Y. 1994. Identification of the prfC gene, which encodes peptide-chain-release factor 3 of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 5798-5802.

88. Kisselev L. L., Buckingham R. H. 2000. Translational termination comes of age. Trends Biochem Sci. 25, 561-566.

89. Freistroffer D. V., Pavlov M. Y., MacDougall J., Buckingham R. H., Ehrenberg M. 1997. Release factor RF3 in E.coli accelerates the dissociation of release factors RF1 and RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner. EMBOJ. 16, 41264133.

90. Nakamura Y., Ito K., Isaksson L. A. 1996. Emerging understanding of translation termination. Cell. 87, 147-50.

91. Klaholz B. P., Pape T., Zavialov A. V., Myasnikov A. G., Orlova E. V., Vestergaard B., Ehrenberg M., van Heel M. 2003, Structure of the Escherichia coli ribosomal termination complex with release factor 2. Nature. 421, 90-94.

92. Baca O. G., Rohrbach M. S., Bodley J. W. 1976. Equilibrium measurements of the interactions of guanine nucleotides with Escherichia coli elongation factor G and the ribosome. Biochemistry. 15, 4570-4574.

93. Pedersen K., Zavialov A. V., Pavlov M. Y„ Elf J, Gerdes K., Ehrenberg M. 2003. The bacterial toxin RelE displays codon-specific cleavage of mRNAs in the ribosomal A site. Cell. 112, 131-40.

94. Blaha G., Nierhaus K. H. 2001. Features and functions of the ribosomal E site. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 66, 135-46.

95. Dinos G., Kalpaxis D. L„ Wilson D. N., Nierhaus K. H. 2005. Deacylated tRNA is released from the E site upon A site occupation but before GTP is hydrolyzed by EF-Tu. Nucleic Acids Res. 33, 5291-6.

96. Nierhaus K. H., Beyer D., Dabrowski M., Schafer M. A., Spahn C. M., Wadzack J., Bittner J. U., BurkhardtN., Diedrich G., Junemann R., et al. 1995. The elongating ribosome: structural and functional aspects. Biochem Cell Biol. 73, 1011-21.

97. Nierhaus K. H., Junemann R., Spahn C. M. 1997. Are the current three-site models valid descriptions of the ribosomal elongation cycle? Proc Natl Acad Sci USA. 94, 10499-500.

98. Nierhaus K. H., Stuhrmann FI. B., Svergun D. 1998. The ribosomal elongation cycle and the movement of tRNAs across the ribosome. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 59, 177-204.

99. Lill R., Robertson J. M„ Wintermeyer W. 1989. Binding of the 3' terminus of tRNA to 23S rRNA in the ribosomal exit site actively promotes translocation. EMBO J. 8, 3933-3938.

100. Rawat U. B., Zavialov A. V., Sengupta J., Valle M., Grassucci R. A., Linde J., Vestergaard B., Ehrenberg M., Frank J. 2003. A cryo-electron microscopic study of ribosome-bound termination factor RF2. Nature. 421, 87-90.

101. Blanchard S. C., Kim H. D., Gonzalez R. L., Jr., Puglisi J. D„ Chu S. 2004. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proc Natl Acad Sci US A. 101, 12893-8.

102. Subramanian A. R., Dabbs E. R. 1980. Functional studies on ribosomes lacking protein LI from mutant Escherichia coli. Eur J Biochem. 112, 425-30.

103. Czworkowski J., Moore P. B. 1997. The conformational properties of elongation factor G and the mechanism of translocation. Biochemistry. 36, 10327-10334.

104. Inoue-Yokosawa N., Ishikawa C., Kaziro Y. 1974. The role of guanosine triphosphate in translocation reaction catalyzed by elongation factor G. J Biol Chem. 249, 4321-3.

105. Fujiwara T., Ito K., Yamami T., Nakamura Y. 2004. Ribosome recycling factor disassembles the post-termination ribosomal complex independent of the ribosomal translocase activity of elongation factor G. Mol Microbiol. 53, 517-28.

106. Dincbas V., Heurgue-Hamard V., Buckingham R. H., Karimi R., Ehrenberg M.1999. Shutdown in protein synthesis due to the expression of mini-genes in bacteria. J Mol Biol. 291, 745-59.

107. Zavialov A. V., Hauryliuk V. V., Ehrenberg M. 2005. Splitting of the posttermination ribosome into subunits by the concerted action of RRF and EF-G. Mol Cell. 18, 675-686.

108. Gao N., Zavialov A. V., Li W„ Sengupta J., Valle M., Gursky R. P., Ehrenberg M„ Frank J. 2005. Mechanism for the disassembly of the posttermination complex inferred from cryo-EM studies. Mol Cell. 18, 663-674.

109. Kiel M. C., Raj V. S., Kaji H., Kaji A. 2003. Release of ribosome-bound ribosome recycling factor by elongation factor G. J Biol Chem. 278, 48041-50.

110. Hirokawa G., Kiel M. C., Muto A., Selmer M., Raj V. S., Liljas A., Igarashi K., Kaji PL, Kaji A. 2002. Post-termination complex disassembly by ribosome recycling factor, a functional tRNA mimic. Embo J. 21, 2272-81.

111. Hirokawa G., Kiel M. C., Muto A., Kawai G., Igarashi K., Kaji H, Kaji A. 2002. Binding of ribosome recycling factor to ribosomes, comparison with tRNA. J Biol Chem. Ill, 35847-52.

112. Gao N., Zavialov A. V., Li W., Sengupta J., Valle M., Gursky R. P., Ehrenberg M., Frank J. 2005. Mechanism for the disassembly of the posttermination complex inferred from cryo-EM studies. Mol Cell. 18, 663-74.

113. Peske F., Rodnina M. V., Wintermeyer W. 2005. Sequence of steps in ribosome recycling as defined by kinetic analysis. Mol Cell. 18, 403-412.

114. Antoun A., Pavlov M. Y., Tenson T., Ehrenberg M. M. 2004. Ribosome formation from subunits studied by stopped-flow and Rayleigh light scattering. Biol Proced Online. 6, 35-54.

115. Cayama E., Yepez A., Rotondo F., Bandeira E., Ferreras A. C., Triana-Alonso F. J.2000. New chromatographic and biochemical strategies for quick preparative isolation of tRNA. Nucleic Acids Res. 28, E64.

116. Forster A. C., Weissbach H., Blacklow S. C. 2001. A simplified reconstitution of mRNA-directed peptide synthesis: activity of the epsilon enhancer and an unnatural amino acid. Anal Biochem. 297, 60-70.