Самоорганизация в реакциях иммунопреципитации

Фёдоров, Алексей Александрович

Самоорганизация в реакциях иммунопреципитации тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.01 ВАК РФ

Фёдоров, Алексей Александрович АВТОР

кандидата физико-математических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Санкт-Петербург МЕСТО ЗАЩИТЫ

2005 ГОД ЗАЩИТЫ

01.04.01 КОД ВАК РФ

Диссертация по физике на тему «Самоорганизация в реакциях иммунопреципитации»

Автореферат диссертации на тему "Самоорганизация в реакциях иммунопреципитации"

На правах рукописи

Фёдоров Алексей Александрович

САМООРГАНИЗАЦИЯ В РЕАКЦИЯХ ИММУНОПРЕЦИПИТАЦИИ

Специальности: 01.04.01 Приборы и методы экспериментальной физики 03.00.02 Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Санкт-Петербург - 2005

Работа выполнена в лаборатории оптики заряженных частиц и математического моделирования Института аналитического приборостроения Российской Академии наук

Научные руководители:

доктор технических наук, профессор Курочкин Владимир Ефимович

кандидат медицинских наук Мартынов Александр Игоревич

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Галль Лидия Николаевна

кандидат физико-математических наук, доцент Власова Ольга Леонардовна

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физики им. В.А. Фока Санкт-Петербургского Государственного Университета

Защита состоится "01" июля 2005 года в 11 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.034.01 при Институте аналитического приборостроения РАН по адресу:

190103, Санкт-Петербург, Рижский пр., д. 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института аналитического приборостроения РАН.

Автореферат разослан «V» оЦдД 2005 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В физике, химии и биологии известно множество примеров самопроизвольного образования различных макроскопических структур в открытых неравновесных системах. Согласно терминологии, введенной И. Р. Пригожиным, такие структуры называются диссипативными, а процессы образования этих структур - процессами самоорганизации.

В иммунологии хорошо известна реакция иммунопреципитации -образование в тонком слое геля узоров, в результате диффузии и взаимодействия иммуноактивных белков. Особый интерес представляет собой радиальная иммунопреципитация — диффузия одного белка из точечного источника в среде, содержащей другой белок. В результате такого процесса образуется правильное, четко очерченное кольцо, размер которого пропорционален количеству иммуноактивного белка в источнике. Эта закономерность лежит в основе единственного количественного иммунопреципитационного метода - метода радиальной иммунодиффузии. В настоящее время клиническая иммунология располагает целым арсеналом средств и методов качественного и количественного анализа иммуноактивных белков: агглютинация, иммунопреципитация в геле, нефелометрия, иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг, радиоиммуноанализ и т.д. Среди всех количественных методов, используемых для определения достаточно больших количеств белка, выгодно выделяется метод радиальной иммунодиффузии. Он достаточно прост, воспроизводим, легко доступен практически всем лабораториям клинической иммунологии и может использоваться при массовых обследованиях.

К иммунологическим методам, помимо их высокой информативности, предъявляется такое важное требование как стандартизованность. Использование при проведении массовых обследований готовых диагностикумов отчасти позволяет стандартизовать результаты, полученные в различных лабораториях. Однако, имеющиеся на сегодняшний день методы учета результатов реакции - измерение размеров колец преципитации при помощи специальных линеек и бинокулярной лупы не стандартизуется из-за того, что воспринимающим элементом является человеческий глаз. Появление прибора автоматизированного учета результатов радиальной иммунодиффузии позволит не только сократить трудозатраты, но и повысит точность измерения, что, в конечном итоге, позволит стандартизовать результаты, получаемые в различных лабораториях. Для решения задачи автоматизации в Институте аналитического приборостроения РАН ранее был разработан анализатор «ИМАТЕСТ» и программное обеспечение, для управления анализатором и обработки результатов с помощью компьютера. Однако результат предварительных испытаний этого комплекса оказался неудовлетворительным.

Определение возможностей совершенствования комплекса требовало хотя бы качественных физических представлений об исследуемом объекте. Кроме того, разработка количественной модели радиальной иммунопреципитации может оказать существенную помощь в решении задачи оптимизации существующих методик работы с готовыми стандартизованными диагностикумами. Между тем, в литературе полностью отсутствуют какие-либо количественные оценки по иммунодиффузии, а качественное представление, основанное на образовании иммунопреципитационного осадка в жидкости, не выдерживает никакой критики [Хаитов и др.1995, Воробьева, 2000].

Следует отметить, что образование иммунопреципитационных структур происходит в открытой системе, а потому представляется возможным использовать современные физические представления из области синергетики и физики открытых систем при исследовании этого процесса. Рассматриваемая система содержит целый ряд параметров - температура среды, концентрации взаимодействующих белков, соответствующие константы скорости ассоциации и диссоциации, а также коэффициенты диффузии отдельных белков и продуктов реакции. Между тем следует ожидать, что присущее открытым системам формирование структуры обусловливается лишь одним из параметров. Представляется интересным также вопрос об упорядоченности образовавшихся структур.

Таким образом, исследование образования иммунопреципитационных колец представляется интересным не только как основа для решения различных прикладных задач, но и как самостоятельное теоретическое исследование.

Цель работы.

Основная цель настоящей работы состояла в теоретическом исследовании образования иммунопреципитационных структур в гелевой среде. Практическая цель состояла в исследовании возможностей оптимизации метода радиальной иммунодиффузии и усовершенствования комплекса автоматизированного учета результатов радиальной иммунодиффузии.

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести анализ литературных данных по диффузии белков в гелевых средах.

2. Разработать количественную модель иммунопреципитации в рамках представления иммунной реакции как простой бимолекулярной реакции. Оценить оптимальное время учета результатов радиальной иммунодиффузии при количественном анализе иммуноглобулинов.

3. Построить качественную модель иммунопреципитации, дающую адекватное представление о причинах визуальной регистрации результата иммунной реакции в гелевой среде.

4. Определить специфику пространственной самоорганизации продуктов иммунной реакции при радиальной иммунодиффузии.

5. Проверить выбор схемы освещения иммунопреципитационных колец, а также выработать практические рекомендации по совершенствованию комплекса автоматизированного учета результатов радиальной иммунодиффузии.

Научная новизна.

1. Впервые иммунная реакция in vitro рассмотрена как объект физики открытых систем.

2. Впервые предложены качественная и количественная модели иммунопреципитации в гелевой среде.

3. Показано, что значение константы скорости ассоциации белков определяет степень упорядоченности структуры, образуемой продуктами иммунной реакции.

Практическая ценность.

1. Обосновано техническое решение выбора освещения иммунопреципитационных узоров для получения наиболее качественных фотографий.

2. Создан новый алгоритм обработки изображений для программного обеспечения анализатора «ИМАТЕСТ 01», расширяющий возможности анализатора.

3. Обоснована возможность сокращения времени количественного анализа иммуноглобулинов в методе радиальной иммунодиффузии.

4. Предложенная в диссертационной работе количественная модель может быть использована для определения возможностей оптимизации метода радиальной иммунодиффузии при работе с другими иммуноактивными белками, а также других методов иммунопреципитации в геле.

5. Разработанные модели могут служить теоретической основой при моделировании других иммунологических реакций или процессов с участием подобных молекул, например, при исследовании иммуносуспензионных методов диагностики и разработке соответствующей приборной базы.

Положения, выносимые на защиту.

• Количественная модель радиальной иммунопреципитации, позволяющая на макроуровне объяснить образование радиально-симметричной структуры продуктами иммунной реакции.

• Качественная модель иммунопреципитации, показывающая образование крупных молекулярных кластеров, которые обусловливают возможность визуальной регистрации результатов иммунной реакции в гелевой среде.

• Специфика пространственной самоорганизации продуктов иммунной реакции в геле при радиальной иммунодиффузии обусловливается свойствами взаимодействующих белков и среды.

• Возможность сокращения времени учета результатов радиальной иммунодиффузии при проведении количественного анализа иммуноглобулинов.

Апробация результатов работы.

Основные результаты работы докладывались на семинарах ИАнП РАН, 6-ой и 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2002, 2003), 10 Всероссийской конференции студентов-физиков и молодых ученых России (Москва, 2004), 3-ем съезде Биофизиков России (Воронеж, 2004).

Работа проводилась в рамках НИР "Новые принципы детекции и разработка на их основе приборов для автоматизации лабораторно-диапюстических методов исследования", выполняемой по межведомственной научно-технической программе «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего» (№ Гос. регистрации 01.200.2 09213).

Работа также поддержана грантом Санкт-Петербургского Конкурсного центра фундаментального Естествознания (грант М05-2.4К-215).

Публикации.

Основное содержание работы отражено в 5 научных публикациях, а также в сборниках трудов конференций.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 139 страницах, содержит 6 таблиц и 56 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы основные цели работы, кратко представлены содержание диссертации, сведения о ее апробации и основных публикациях, приведены положения, выносимые на защиту.

В первой главе обобщены литературные данные по белок-белковым взаимодействиям, являющиеся основой развиваемого в гл. 2 и 3 теоретического описания, рассматриваются реакции иммунопреципитации - объект исследования, а также современные представления физики открытых систем.

Иммунопреципитацией, или преципитацией, называют образование видимых невооруженным глазом осадков в жидкости или узоров в геле в результате взаимодействия двух иммуноактивных белков. Далее один из белков будет условно называться антителом (AT), а другой - антигеном (АГ). В тонком слое прозрачного геля взаимодействие АГ и AT приводит к образованию видимых глазом беловатых узоров (рис.1а-б). Если пробы помещаются в лунки, то, в результате встречной диффузии молекул, между лунками образуется светлая полоса (рис. 1а). Если один из реагентов, например, AT, изначально

находятся в геле, а молекулы АГ диффундируют из лунки, то в этом случае, вокруг лунки образуется светлое "кольцо". Зависимость размеров кольца от количества АГ в пробе лежит в основе метода радиальной иммунодиффузии, называемого также методом Манчини [Mancini, 1965]. В настоящее время этот метод наиболее часто используется для определения концентрации иммуноглобулинов A, G и М в сыворотке крови (IgA, IgG и IgM, табл. 1). Концентрация этих иммуноглобулинов является важным показателем состояния иммунной системы.

Рис. 1. Встречная (а) и радиальная (б) иммунопреципитация. Фотографии

выполнены на темном фоне в рассеянном диффузионном освещении.

Метод радиальной иммунодиффузии проводят в стандартных пластиковых чашках Петри, в тонком слое агарового геля. Гель содержит молекулы AT, которые взаимодействуют с диагностируемыми молекулами иммуноглобулинов. В геле проделываются ряды отверстий - лунок, в которые помещаются исследуемые жидкости. В лунках одного ряда титруется сыворотка известной концентрации для построения калибровочной кривой (логарифм концентрации)-(радиус преципитационного кольца). С помощью этого графика определяют концентрацию в тестируемых пробах.

Анализируется существующее представление о механизме образования иммунопреципитационных узоров в геле. Обосновывается его неадекватность, особенно в случае радиальной иммунопреципитации.

Во второй части главы рассмотрены существующие подходы к определению физической сущности процесса самоорганизации — теория диссипативных структур (Николис, Пригожий, 1979; Пригожий, 2002) и теория эволюционного катализа (Руденко, 1995). Проводится сопоставление этих подходов.

Далее представлен аналитический обзор моделей различных биологических и физико-химических систем, пространственная самоорганизация которых

Таблица 1. Диапазон изменения концентраций основных

Иммуноглобулин Концентрация, мг/мл

0.7-5.0

7.0 - 20.0

0.5 - 2.0

проявляется в образовании регулярных кольцевых структур. К ним относятся модели структурообразования в бактериальных колониях (Асланиди и др., 2001), колониях несовершенных грибов (Буляница и др., 2000; Панина, 2000), а также модели хорошо известных в физической химии эффектов Лизеганга (Droz, et в1, 1999). Показано, что ни одна из рассмотренных моделей не может дать адекватного представления о механизме образования единственного кольца при радиальной иммунодиффузии.

Вторая глава посвящена разработке количественной модели радиальной иммунопреципитации в агаровом геле. В рамках этой модели иммунная реакция рассматривалась как обычная бимолекулярная реакция, продуктом которой является комплекс АГ-АТ.

Для плоской радиально-симметричной диффузии молекул АГ из точечного источника в среде, содержащей молекулы AT, система уравнений вида реакция-диффузия может быть записана в следующем виде:

Здесь Сдь(r,t), C^g(r,t) и Саё-аь(г>0 - концентрации молекул AT, AT и комплексов АГ-АТ в момент времени t в пространственной точке г (радиальная координата г отсчитывается от центра полости). Dg - коэффициент диффузии белков в геле, £ass и Äd,ss— константы скорости ассоциации и диссоциации белков, Дг - радиальная составляющая оператора Лапласа в цилиндрической системе координат.

Проверка адекватности модели проводилась для каждого иммуноглобулина (АГ) - A, G и М в отдельности. Начальное распределение молекул АГ и AT, заданное для решения системы (1), представлено на рис.2а. Граничные условия выбирались как условия второго рода. Параметры модели реакция-диффузия приведены в табл.2. Значение коэффициентов диффузии в 1.5% агаровом геле, используемом для постановки радиальной иммунодиффузии, оценивалось с помощью следующего соотношения [Pluen, et. al, 1999, Johnson et al., 1996]:

где - отношение коэффициентов диффузии в геле и воде при

бесконечно малой концентрации белка, ф- объёмная доля образующих гель волокон, a, Ь и f - дополнительные параметры модели, определяемые концентрацией геля. В результате расчетов было показано, что скорость диффузии иммуноглобулинов в геле такой концентрации заметно снижается, тогда как литературные данные свидетельствуют лишь о незначительности изменения этого параметра. Между тем, уменьшение коэффициента диффузии молекул IgA и IgG составляет 25%, а для молекулы IgM достигает 50%.

Результаты численных экспериментов представлены на рис.2(б-г). На этом рисунке показана динамика образования комплексов АГ-АТ для IgA.

(1)

Da/D0=e-0Mf е

■1 09

(2)

Таблица 2. Параметры модели реакция-диффузия

_ каи, М"'с"' кщицС'1 £>0,мм*ч'т

1&А. " 10* 10"* 0.107

ДО НУ5 10'" 0.107

18М 1 10" [ 10'' 0.048

0 4 8

Рис 2. Динамика образования иммунопреципитационного кольца 1&А. (фотографии слева) и радиального распределения комплексов АГ-АТ (справа), рассчитанная по (1). Концентрация IgA в пробе - 4 мг/мл.

Для сопоставления результатов моделирования с экспериментальными данными на рис.2 приводятся фотографии, иллюстрирующие образование иммунопреципитационного кольца, вокруг пробы с такой же концентрацией IgA. Фотографии показывают, что образование "кольца" не носит характера распространяющейся волны возбуждения. Кольцо проявляется вокруг лунки спустя некоторое время после начала диффузии пробы, становясь постепенно

более отчётливым. Размер "кольца" при этом практически не меняется. Динамика образования комплексов АГ-АТ хорошо согласуется с этими данными. Как следует из рис.2, спустя некоторое время после начала диффузии пробы появляется область избытка комплексов АГ-АТ, находящаяся на некотором удалении от центра лунки. Избыток комплексов в этой зоне появляется спустя достаточно длительное время, а дальнейшие изменения заключаются лишь в увеличении концентрации комплексов в этой области. Таким образом, в рамках данной модели, преципитационное кольцо представляется как область максимальной концентрации продуктов иммунной реакции.

Рассмотрим механизм образования этой структуры.

По прошествии определенного промежутка времени истощается источник АГ и приостанавливается распространение фронта реакции (рис.2б), тем не менее, процесс образования продуктов реакции продолжается за счёт остатка свободных АГ. Эти молекулы медленно диффундируют по направлению к границе приостановившегося реакционного фронта со стороны источника, С противоположной стороны, навстречу молекулам АГ, диффундируют молекулы AT, причём скорости встречного движения обоих молекулярных потоков оказываются сопоставимыми. В результате, образование продуктов реакции локализуется в достаточно узкой окрестности точки остановки реакционного фронта, что, в свою очередь, приводит к постепенному накоплению в этой окрестности избытка комплексов АГ-АТ (рис. 2в и 2г).

В результате численных экспериментов было установлено, что характерный вид распределения комплексов сохраняется и для других начальных концентраций IgA (концентраций АГ в пробе). Сопоставление теоретической калибровочной кривой и экспериментальных данных калибровочных рядов двух чашек Петри (рис.3) подтверждает адекватность количественного описания процесса иммунодиффузии системой (1).

ЫС

(С, мг/мл)

1"-0.25

Г, ММ

Рис. 3. Теоретическая калибровочная кривая IgA и экспериментальные данные калибровочных рядов двух чашек Петри.

Характер распределения комплексов АГ-АТ при анализе ^М и IgG, в целом, сохраняется, а изменения касаются лишь временных и пространственных характеристик процесса образования кольца. Так, концентрация IgG в сыворотке крови в несколько раз превосходит концентрацию IgA (табл. 1), а потому, средний размер преципитационных колец IgG заметно больше, чем ^Л и, соответственно, увеличивается время формирования преципитата. Концентрация ^М, в среднем, в два раза меньше концентрации ЛА(табл. 1), однако и коэффициент диффузии ^М также почти в два раза меньше чем IgA (табл. 3), что замедляет формирование кольца.

Таким образом, результаты численных экспериментов показали, что процесс образования преципитата состоит из двух основных этапов:

- распространение реакционного фронта;

- образование области избытка продуктов реакции в окрестности точки остановки реакционного фронта.

Минимальное время учета результатов иммунодиффузии, очевидно, определяется продолжительностью первого этапа. Общее время учета результатов радиальной иммунодиффузии в чашке Петри, где одновременно диффундируют более двух десятков проб, определяется максимально возможной концентрацией диагностируемых молекул. Исходя из этого, для каждого иммуноглобулина было оценено минимально возможное время учета результатов (табл.3).

Таблица 3. Продолжительность распространения реакционного фронта

Вид анализа (максимальная концентрация, мг/мл)

Максимальная продолжительность распространения реакционного фронта, ч

Рекомендуемое время учета результатов радиальной иммунодиффузии, ч

Г&Л (5.0)

^(20.0)

^М (2.0)

19.5

48-72

Следует отметить, что рекомендуемое время выдержки чашек составляет 24 часа для IgЛ и IgG, и 2-3 суток для ^М. Между тем, оказалось, что учет результатов диффузии IgЛ с незначительной погрешностью может проводится уже через 10-11 часов, а для ^М продолжительность первой стадии не превышает 20 часов, т.е. время учета результатов может быть уменьшено в два раза. Продолжительность формирования колец IgG может превышать 30 часов, что обусловливается возможностью высокой концентрации этого иммуноглобулина в пробе. Тем не менее, изменения размеров колец после 24 часовой выдержки чашек не существенны и, следовательно, погрешность определения концентрации этого белка также не значительна.

В третьей главе рассматривается качественная модель иммунопреципитации, определяются особенности образования кольцеобразной

структуры при радиальной иммунодиффузии как процесса пространственной самоорганизации.

В первой части главы рассматривается качественная модель иммунопреципитации, выявляющая причины визуальной регистрации пространственного распределения продуктов иммунной реакции. В рамках количественной модели объяснение этого факта не представлялось возможным, поскольку ни сами молекулы, ни их комплексы оптически не активны. Единственная возможность изменить оптические свойства среды появится в случае образования не отдельных комплексов АГ-АТ, а больших молекулярных кластеров, соизмеримых с длиной волны видимого света.

Экспериментально доказано, что визуальная регистрация результатов иммунодиффузии возможна лишь в том случае, если оба вида взаимодействующих молекул поливалентны. Продукт взаимодействия именно поливалентных молекул, имеющих несколько активных участков (эпитопов), может иметь вид достаточно длинных молекулярных цепочек или крупных молекулярных агрегатов [Heidelberger & Kendall, 1935]. Однако, причины образования таких агрегатов в отсутствие диффузии продуктов иммунной реакции — комплексов АГ-АТ и мелких кластеров, а также в условиях низкой концентрации обоих реагентов до конца не ясны.

Для исследования причин формирования крупных агрегатов молекулами АГ и AT при иммунодиффузии, была предложена наглядная модель, построенная по аналогии с классическими моделями диффузионно-ограниченного роста фрактальных кластеров [Witten, 1981; Witten & Sander, 1983].

Рассматривалась область 1000X1000 ячеек, представляющая собой четверть лунки и окружающего пространства. На экране компьютера создавались распределения частиц (пикселей) двух типов, соответствующие реальным распределениям молекул АГ и AT в начале процесса (рис.4а). 1500 частиц, имитирующих АГ, были локализованы в левом верхнем углу экрана, частицы, имитирующие AT, распределялись по плоскости равномерно, с постоянным шагом 13 пикселей. Далее, следуя стандартному алгоритму, имитировалась диффузия частиц как случайное перемещение в одну из соседних ячеек, и образование агрегатов, обусловленное наличием двух эпитопов у каждой молекулы.

Образование комплекса АГ-АТ происходило в том случае, если две свободные молекулы разных типов оказывались в соседних ячейках. Данный процесс определялся вероятностью Рост кластера происходил за счет "прилипания" свободных частиц к частицам, входящим в состав кластера и имеющим свободный эпитоп. Вероятность данного процесса обозначалась , В случае взаимодействия частиц их координаты фиксировались, т.е. частицы становились неподвижными. Вероятность образования комплекса АГ-АТ оценивалась с помощью известного соотношения [Northrup, et al, 1983], определяющего связь между константой скорости диффузионно -контролируемой ассоциации молекул и вероятности образования комплекса находящимися на расстоянии Ъ друг от друга молекулами:

*,(1-Ь/с)

иЪ)-ка$!Ыс

Здесь = 4кЛЬ, где $ - коэффициент диффузии молекул, с —

минимальное расстояние между молекулами, при котором вероятность взаимодействия молекул пренебрежимо мала.

Считалось, что вероятность pi соответствует вероятности взаимодействия реальных молекул АГ и АТ, находящихся на расстоянии порядка своего линейного размера (¿>~10-12нм). В этом случае искомая величина (3]~0.7. Значение было выбрано 0.4. Программная реализация этой модели была выполнена с помощью языка

Рис. 4. Начальное распределение модельных молекул (а) в модели ограниченной диффузией агрегации кластеров и распределение кластеров, состоящих из 10 и более частиц (б), после завершения процесса.

На рис.3 б показано распределение самых крупных кластеров, после того как все молекулы АГ оказались связанными. Видно, что распределение этих кластеров также имеет довольно специфический, кольцеобразный характер. В результате моделирования было показано, что для любого количества точек АГ, лежащего в диапазоне 500-5000, характер пространственного распределения крупных кластеров сохраняется. «Калибровочная кривая» построенная для этого диапазона значений АГ, в целом, имеет тот же характер что и реальная калибровочная кривая. Непосредственное визуальное наблюдение процесса образования агрегатов на экране компьютера позволило понять причины и механизм образования крупных кластеров в окрестности точки остановки реакционного фронта. Оказалось, что вероятность "прилипания" свободной молекулы к первоначально образовавшимся кластерам заметно превосходит.

вероятность образования отдельного комплекса АГ-АТ. С одной стороны это обусловлено низкой концентрацией свободных молекул, с другой - высокой концентрацией образовавшихся кластеров.

Таким образом, избыток продукта реакции, обнаруженный в модели реакция-диффузия, представляет собой крупные молекулярные агрегаты, которые, локально изменяя светорассеяние, обусловливают появление заметного невооружённым глазом характерного кольцеобразного узора реакции. Подобная имитационная модель, в частности, позволила объяснить образование видимой полосы в результате встречной диффузии молекул АГ и AT.

Важным следствием этой модели явилось обоснование выбора рассеянного освещения для оптимального наблюдения иммунопреципитационных структур.

Во второй части главы рассматривается алгоритм имитации фотографии результатов радиальной иммунодиффузии, получаемой с помощью анализатора «ИМАТЕСТ». Имитация таких изображений может быть использована в дальнейшей работе по исследованию возможности экспресс-постановки метода радиальной иммунодиффузии, в условиях какого-либо внешнего воздействия

на процесс диффузии и взаимодействия белков. В основе предложенного алгоритма лежала система уравнений (1), дополненная слагаемым, описывающим

образование кластеров. Поскольку рост кластеров в точке г в момент времени t определяется:

- наличием первоначально образовавшихся комплексов АГ-АТ CAb-Ag(f,0>

- концентрацией свободных молекул АГ в этой точке Сд

- концентрацией свободных молекул AT в этой точке Сдь(лО>

искомое слагаемое может быть представлено в следующем упрощенном виде:

Рис.5. Образование иммунопреци-питационного кольца IgA. Концентрация IgA в пробе 4 мг/мл. Реальные (а) и модельные (б) фотографии лунки, выполненные через 7,12 и 24 часа после начала диффузии пробы.

Cciusier(r.t) ~ Саь-а8(г,Г) Сфл) СаьМ- (4)

Результаты имитации фотографии представлены на рис.5.

В заключение теоретического исследования, в третьей части главы, процесс образования иммунопреципитационной структуры рассматривается с позиций теории диссипативных структур И. Р. Пригожина и теории эволюционного катализа А.П. Руденко. Согласно И.Р. Пригожину образование любых пространственных структур в неравновесных системах следует рассматривать как процесс самоорганизации, тогда как теория эволюционного катализа утверждает, что самоорганизация имеет место лишь в том случае, если часть подведенной энергии была затрачена на полезную работу и, связанное с ней, увеличение степени неравновесия в системе. В процессе диффузии пробы образуются комплексы АГ-АТ и кластеры, формирование которых сопровождается выделением энергии [Janin, 1995]. Таким образом, изначально "вложенная" в систему энергия, частично диссипировалась, а частично задержалась в системе, в виде энергии связи АГ-АТ. При этом, очевидно, степень неравновесия в исходной системе возросла. Таким образом, обе теории сходятся в определении образования иммунопреципитационной структуры как процесса самоорганизации.

В гл. 1 было показано, что сравнение энтропии различных состояний системы, определяемых различными значениями входящих в систему параметров, позволяет определить какой из рассматриваемых параметров является управляющим. Предварительные численные эксперименты, проведенные в рамках количественной модели, показали, что единственным кандидатом является константа скорости ассоциации белков Влияние

этого параметра на пространственное распределение продуктов реакции показано на рис.6. Видно, что специфический характер распределения комплексов определяется именно параметром к^. При этом, чем больше значение тем выше и уже концентрационный пик и, следовательно, более яркие и чёткие границы будет иметь соответствующее преципитационное кольцо (рис.6). И наоборот, чем меньше к„,„ тем меньше высота и больше ширина концентрационного пика, т.е. соответствующее преципитационное кольцо будет иметь "размытые" границы. Таким образом, параметры пика, например отношение полуширины пика к его высоте, позволяют оценить порядок константы скорости ассоциации белков. Кроме того, из рис. 6, видно, что размер кольца, или, точнее, области занимаемой продуктами реакции, определяется также значением к^, что не было отмечено ранее. В пределе, при очень низком значении результат диффузии пробы будет представлять собой диск с сильно размытыми границами.

Значение энтропии системы S оценивалось по распределению комплексов АГ-АТ, после завершения процесса образования кольца [Климонтович, 1999]:

(4)

где f(r) - нормированное радиальное распределение комплексов АГ-АТ.

Результаты расчетов проиллюстрированы на рис.7. Видно, увеличение kass приводит к монотонному изменению степени упорядоченности системы, что позволяет определить параметр как управляющий параметр.

S=\]tf(r)hif(r)dr,

Рис.6. Распределения комплексов АГ-АТ через 24 часа, рассчитанные с помощью (1), соответствуют различным значениям параметра к^: 104(1), 105(2), и 107 ГУГ'с"1 (3).

Рис.7. Зависимость упорядоченности пространственного распределения комплексов от параметра kaSS.

Четвертая глава посвящена комплексу автоматизированного учета результатов радиальной иммунодиффузии - анализатору «ИМАТЕСТ» и программному обеспечению анализатора Immune. Эта программа осуществляет управление аппаратной частью анализатора, обработку получаемых анализатором фотографий чашек Петри и расчет численных характеристик анализа.

Внутри анализатора чашка Петри освещается кольцевой лампой дневного света, создающей рассеянное диффузионное освещение. Видеокамера, установленная внутри анализатора, передает изображение чашки Петри в компьютер в виде черно-белой фотографии BMP. Обработка фотографий

производится специальным алгоритмом программы Immune, который проводит идентификацию колец и определение их размеров.

Алгоритм обработки изображения определяет положение лунок и их центров, и, для каждой идентифицированной лунки, строит усредненное по углу радиальное распределение интенсивности пикселей. При наличии достаточно высокого пика делается вывод о соответствии этого пика реальному преципитационному кольцу (рис.8).

Идентификация преципитационных колец IgA и IgG представляло собой довольно простую задачу - отношение сигнал/шум достаточно высокое (соответствующие максимумы резко выделяются на фоне помех), и простая процедура отбора пика максимальной высоты оказывалась достаточно эффективной. Такой вариант алгоритма обработки был использован в макете анализатора.

Между тем, отношение сигнал/шум на фотографиях с результатами иммунодиффузии IgM, зачастую, достаточно небольшое. Как показала модель реакция-диффузия, это связано с меньшим количеством белка, образующего преципитат, т.е. это свойство реакции, а не недостаток аппаратной части прибора.

Полезный пик может также находиться в своеобразной "нише", вследствие чего его высота относительно нулевого значения интенсивности становится не информативной характеристикой (рис.9). Таким образом, указанная процедура идентификации колец оказывается не эффективной. Кроме того, на графиках радиального имеется ещё один пик, обусловленный краевым эффектом (наличие блика на краю лунки). Поэтому, в действительности, информативным является лишь второй максимум. Эта особенность графиков также мешала правильной идентификации преципитационных колец IgM.

Исходя из обнаруженных особенностей графиков, был предложен следующий алгоритм идентификации полезного сигнала:

- идентификация блика — первого максимума на графике интенсивности и определение его высоты

- определение минимального значения интенсивности в диапазоне поиска возможных значений радиусов колец rmj„ — rmax;

- задание величины порогового значения интенсивности (в долях Imax-Iinm);

- отсчет высоты всех пиков не от нулевого значения интенсивности, а от значения 1„иП;

- дополнительная проверка всех пиков, прошедших отбор по высоте, заключающаяся в определении значения интенсивности на некотором расстоянии (задаваемом величиной Arf)oT проверяемого пика (рис.9). В случае, если интенсивность в этой точке (Rx+Ar) превышает значение высоты самого пика (в точке Rx), последний отбраковывается.

Использование этого алгоритма значительно расширило возможности комплекса, и, в частности, позволило проводить автоматизированный учет результатов иммунодиффузии IgM.

О 5 ^ 10

Рис. 8. а) - Алгоритм обработки изображения строит усредненное по углу а радиальное распределение интенсивности отраженного света 1гедс(г). б) - Радиальная координата г отсчитывается от центра лунки. При наличии достаточно высокого пика алгоритм делает вывод о соответствии этого пика реальному преципитационному кольцу. Радиус кольца Ях определяется по координате соответствующего пика.

Рис. 9. Пример графика распределения интенсивности пикселей одной из проб при анализе ]£М, имеющей слабоконтрастное кольцо. Отсчет высоты пиков в новом алгоритме распознавания ведется от значения 7т(И, что увеличивает относительную высоту пиков, соответствующих преципитационным кольцам.

Основные результаты и выводы

В диссертации получены следующие основные результаты: 1) Проведена оценка коэффициентов диффузии иммуноглобулинов в агаровом геле. Показано, что уменьшение скорости диффузии иммуноглобулинов, вопреки литературным данным, оказывается весьма. существенным. Коэффициенты диффузии молекул и в такой среде на 25% меньше чем в воде, а для молекулы уменьшение коэффициента диффузии достигает 50%.

2) Построена количественная модель иммунопреципитации, представляющая собой систему из трех дифференциальных уравнений вида реакция-диффузия. В рамках макроскопического описания этой модели показано, что иммунопреципитационная структура обусловливается неоднородным пространственным распределением продукта иммунной реакции. Показана адекватность количественного описания модели как при сопоставлении динамики образования иммунопреципитационных колец, так и при сравнении калибровочных кривых для каждого иммуноглобулина.

В результате численных экспериментов установлено, что процесс формирования иммунопреципитационного кольца состоит из двух стадий: распространение реакционного фронта и формирование области избытка продукта реакции. На основании этих результатов обоснована возможность значительного сокращения времени количественного анализа иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии. Результаты иммунодиффузии могут учитываться через сутки, что в 2-3 раза меньше установленного времени выдержки чашек, а время учета результатов иммунодиффузии может быть сокращено с 24 до 8-11 часов.

3) Предложена качественная модель иммунопреципитации, учитывающая поливалентность взаимодействующих белков. Показано, что наблюдаемый физический сигнал (отраженный свет) обусловлен формированием крупных молекулярных кластеров, соизмеримых с длиной волны видимого света.

Предложен алгоритм имитации фотографий реальных результатов радиальной иммунодиффузии, получаемых с помощью анализатора «ИМАТЕСТ».

- их значительными размерами (которые обусловливают низкий коэффициент диффузии свободных белков и практически нулевой коэффициент диффузии продуктов их взаимодействия в гелевой среде),

- их поливалентностью (которая, в отсутствие диффузии продуктов реакции, обусловливает возможность формирования крупных молекулярных агрегатов),

- высоким значением константы скорости ассоциации этих белков.

При выполнении первых двух условий, именно этот параметр определяет формирование макроструктуры, образуемой продуктами иммунной реакции. Кроме того, константа скорости ассоциации белков определяет также упорядоченность образующейся макроструктуры.

5) При участии автора разработан более чувствительный алгоритм обработки изображений чашек Петри для программного обеспечения анализатора «ИМАТЕСТ».

На основании полученных результатов сделаны следующие выводы:

1) Использование агарового геля меньшей концентрации позволит сократить время учета результатов иммунодиффузии.

2) Визуальная регистрация пространственной макроструктуры, образуемой взаимодействующими иммуноактивными белками, обусловливается поливалентностью белков.

3) Константа скорости ассоциации иммуноактивных белков не только определяет характер пространственной самоорганизации продуктов иммунной реакции, но и является управляющим параметром.

4) Параметры концентрационного пика, например, отношение полуширины пика к его высоте, позволяют оценить порядок константы скорости ассоциации белков.

Список основных публикаций по теме диссертации

1. Фёдоров А. А. Математическое моделирование радиальной иммунодиффузии в геле // 6-я Пущинская школа-конференция молодых учёных. - Пущино, 2002, Тезисы докладов. - Т.2. - С. 198.

2. Отчет о НИОКР «Новые принципы детекции и разработка на их основе приборов для автоматизации лабораторно-диагностических методов исследования». Раздел 2.2: «Прибор для учета результатов реакции радиальной иммунной диффузии - анализатор ИМАТЕСТ 01». Руководитель темы: Князьков Н.Н., исполн. Курочкин В.Е., Князьков Н.Н., Бердников А.С., Демидов В.Н., Корнеева Н.П., Федоров А.А. и др. - СПб: ИАнП РАН, 2002. -Гос.рег. № 01.200.2 09213. - 165 с.

3. Фёдоров А.А. Кластерная модель иммунопреципитации в гелевой среде // 7-я Пущинская школа-конференция молодых учёных. - Пущино, 2003, Тезисы докладов. - Т.2. - С.256.

4. Фёдоров А.А. Моделирование роста кольцеобразного преципитата в методе радиальной иммунодиффузиии II. Решёточная DLA-модель // Научное приборостроение. - 2003. - Т. 13. - №4. - С.60-64.

5. Отчет о НИОКР «Новые принципы детекции и разработка на их основе приборов для автоматизации лабораторно-диагностических методов исследования». Раздел 2.2: «Прибор для учета результатов реакции радиальной иммунной диффузии - анализатор ИМАТЕСТ 01». Руководитель темы: Князьков Н.Н., исполн. Курочкин В.Е., Князьков Н.Н., Чубинский-Надеждин И.В., Бердников А.С., Федоров А.А. и др. - СПб: ИАнП РАН, 2003. - Гос.рег. №01.200.3 03772.-146 с.

6. Фёдоров А.А., Курочкин В.Е., Мартынов А.И., Андреев И.В. Моделирование роста кольцеобразного преципитата в методе радиальной иммунодиффузии // «Аллергия, астма и клиническая иммунология». - 2004. -Т.7.-№9.-С.212-215.

7. Фёдоров А.А. Самоорганизация иммунных комплексов антиген-антитело в процессе радиальной диффузии // 10-я Всероссийская конференция студентов-физиков и молодых ученых. - Москва, 2004, Тезисы докладов. - Т.2. -С.863.

8. Фёдоров А.А., Курочкин В.Е. Самоорганизация иммуноактивных белков и их комплексов // 3-й Съезд Биофизиков России. - Воронеж, 2004, Тезисы докладов. - Т. 1. - С. 116.

9. Фёдоров А.А., Курочкин В.Е., Мартынов А.И., Петров Р.В. Самоорганизация в реакциях иммунопреципитации // ДАН (принята в печать).

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

Подписано в печать 20.05. Формат 60x84/16. Печать офсетная. Уч. печ. л. У, 25" . Тираж ЮО . Заказ 304 .

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая, 29.

14 UM 2005

1632

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата физико-математических наук, Фёдоров, Алексей Александрович

Введение

Глава 1. Иммунопреципитация. Физическая сущность явления самоорганизации ¡

1.1 Взаимодействие белков. Явление иммунопреципитации

1.1.1 Антитела и антигены

1.1.2 Взаимодействие антиген-антитело как частный случай белок-белкового взаимодействия \

1.1.2.1 Описание белок-белковых взаимодействий

1.1.2.2 Условие образования белок-белковых комплексов

1.1.2.3 Динамика образования белок-белковых комплексов

1.1.3 Иммунопреципитация в жидкости

1.1.4 Иммунопреципитация в геле. Качественные и количественные методы иммунопреципитации

1.1.5 Автоматизация учета результатов радиальной иммунодиффузии. Анализатор «ИМАТЕСТ 01»

1.1.6 Существующее представление о механизме образования имунопреципитационных узоров

1.2 Самоорганизация. Физическая сущность явления самоорганизации

1.2.1 Мнимая неуниверсальность второго закона термодинамики

1.2.2 Самоорганизация как антиэнтропийный процесс, протекающий в открытой системе

1.2.3 Два подхода к пониманию физической сущности явления самоорганизации и оценке его меры

1.2.3.1 Физическая сущность явления самоорганизации, согласно теории диссипативных структур И.Р. Пригожина

1.2.3.2 Физическая сущность явления самоорганизации, согласно концепции эволюционного катализа А.П. Руденко

1.2.4 Примеры использования теории диссипативных структур и теории эволюционного катализа

1.2.4.1 Теория прогрессивной химической эволюции, основанная на теории эволюционного катализа 4 \

1.2.4.2 Б-теорема Ю.Л. Климонтовича

1.2.5 Сопоставление подходов И.Р. Пригожина и А.П. Руденко

1.3 Образование регулярных кольцевых структур в биологических и

• физико-химических системах

1.4 Постановка задачи

Глава 2. Количественная модель радиальной иммунопреципитации

2.1 Реакция иммунопреципитации как простая система реакция-диффузия

2.2 Начальные данные и граничные условия

2.3 Параметры модели

2.3.1 Коэффициенты диффузии

2.3.2 Константы скорости ассоциации и диссоциации иммуноглобулинов

2.4 Сопоставление результатов моделирования и экспериментальных данных для ^А

2.4.1 Пространственное распределение комплексов АГ-АТ в процессе диффузии АГ

2.4.2 Распределение комплексов для различных начальных концентраций АГ

2.4.3 Причины и механизм возникновения зоны избытка продукта иммунной реакции

2.4.4 Калибровочная кривая. Теоретические данные и эксперимент

2.4.5 Динамика распространения реакционного фронта

2.4.6 Продолжительность движения реакционного фронта

2.5 Сопоставление теоретических и экспериментальных данных для и

2.6 Основные результаты модели реакция-диффузия

Глава 3. Качественная модель иммунопреципитации.

Самоорганизация в процессе радиальной иммунодиффузии

3.1 Качественная модель иммунопреципитации

3.1.1 Продукт иммунной реакции - молекулярные кластеры

3.1.2 Фрактальные кластеры и модели их роста

3.1.3 Выбор модели роста кластеров для описания процесса иммунодиффузии

3.1.4 БЬА-модель процесса радиальной иммунодиффузии

3.1.5 Программная реализация задачи

3.1.6 Результаты моделирования

3.1.6.1 Пространственное распределение крупных кластеров

3.1.6.2 "Калибровочная кривая"

3.1.7 Механизм образования крупных кластеров в процессе радиальной иммунодиффузии

3.1.8 DLА-модель двойной иммунодиффузии

3.1.9 Обсуждение результатов

3.2 Возможности модели реакция-диффузия. Имитация реальной фотографии чашки Петри

3.2.1 Математическая основа алгоритма построения модельных фотографий

3.2.2 Программная реализация алгоритма

3.2.3 Обсуждение результатов

2.3.4 Иммунодиффузия при повышенной температуре

3.3 Процесс иммунопреципитации как пример процесса 104 самоорганизации

3.3.1 Иммунопреципитация — самоорганизация или организация?

3.3.2 Оценка степени упорядоченности пространственного распределения продуктов реакции \

3.4 Основные результаты главы

Глава 4. Анализатор иммуноактивных молекул «ИМАТЕСТ 01»

4.1 Назначение и области использования анализатора «ИМАТЕСТ 01»

4.2 Функциональная схема анализатора «ИМАТЕСТ 01»

4.3 Программное обеспечение анализатора «ИМАТЕСТ 01»

4.3.1 Алгоритм обработки изображения

4.3.2 Определение концентрации иммуноглобулинов

4.4 Идентификация преципитационных колец

4.4.1 Алгоритм обработки изображения макета анализатора 117 «ИМАТЕСТ» и его недостатки

4.4.2 Новый алгоритм распознавания Immune

4.4.3 Результаты 126 Заключение 127 Список основных публикаций по теме диссертации 130 Список литературы

Введение диссертация по физике, на тему "Самоорганизация в реакциях иммунопреципитации"

В физике, химии и биологии известно множество примеров самопроизвольного образования различных макроскопических структур в открытых неравновесных системах. Согласно терминологии, введенной И.Р. Пригожиным, такие структуры называются диссипативными, а процессы образования этих структур - процессами самоорганизации.

В иммунологии хорошо известна реакция иммунопреципитации — образование в тонком слое геля узоров, в результате диффузии и взаимодействия иммуноактивных белков. Особый интерес представляет собой радиальная иммунопреципитация - диффузия одного белка из точечного источника в среде, содержащей другой белок. В результате такого процесса образуется правильное, четко очерченное кольцо, размер которого пропорционален количеству иммуноактивного белка в источнике. Эта закономерность лежит в основе единственного количественного иммунопреципитационного метода — метода радиальной иммунодиффузии. В настоящее время клиническая иммунология располагает целым арсеналом средств и методов качественного и количественного анализа иммуноактивных белков: агглютинация, иммунопреципитация в геле, нефелометрия, иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг, радиоиммуноанализ и т.д. Среди всех количественных методов, используемых для определения достаточно больших количеств белка, выгодно выделяется метод радиальной иммунодиффузии. Он достаточно прост, воспроизводим, легко доступен практически всем лабораториям клинической иммунологии и может использоваться при массовых обследованиях.

К иммунологическим методам, помимо их высокой информативности, предъявляется такое важное требование как стандартизованность. Использование при проведении массовых обследований готовых диагностикумов отчасти позволяет стандартизовать результаты, полученные в различных лабораториях. Однако, имеющиеся на сегодняшний день методы учета результатов реакции — измерение размеров колец преципитации при помощи специальных линеек и бинокулярной лупы не стандартизуется из-за того, что воспринимающим элементом является человеческий глаз. Появление прибора автоматизированного учета результатов радиальной иммунодиффузии позволит не только сократить трудозатраты, но и повысит точность измерения, что, в конечном итоге, позволит стандартизовать результаты, получаемые в различных лабораториях. Для решения задачи автоматизации в Институте аналитического приборостроения РАН ранее был разработан анализатор «ИМАТЕСТ» и программное обеспечение, для управления анализатором и обработки результатов с помощью компьютера. Однако результат предварительных испытаний этого комплекса оказался неудовлетворительным.

Следует отметить, что образование иммунопреципитационных структур происходит в открытой системе, а потому представляется возможным использовать современные физические представления из области синергетики и физики открытых систем при исследовании этого процесса. Рассматриваемая система содержит целый ряд параметров — температура среды, концентрации взаимодействующих белков, соответствующие константы скорости ассоциации и диссоциации, а также коэффициенты диффузии отдельных белков и продуктов реакции. Между тем следует ожидать, что присущее открытым V системам формирование структуры обусловливается лишь одним из параметров. Представляется интересным также вопрос об упорядоченности образовавшихся структур.

Цель работы.

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести анализ литературных данных по диффузии белков в гелевых средах.

Научная новизна.

1. Впервые иммунная реакция in vitro рассмотрена как объект физики открытых систем.

2. Впервые предложены качественная и количественная модели иммунопреципитации в гелевой среде.

Практическая ценность.

Положения, выносимые на защиту.

Апробация результатов работы.

Работа проводилась в рамках НИР "Новые принципы детекции и разработка на их основе приборов для автоматизации лабораторно-диагностических методов исследования", выполняемой по межведомственной научно-технической программе «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего» (№ Гос. регистрации 01.200.2 09213).

Публикации.

Основное содержание работы отражено в 5 научных публикациях, а также в сборниках трудов конференций.

Объем и структура диссертации.

Заключение диссертации по теме "Приборы и методы экспериментальной физики"

Выход

Рис. 4.6. Первая задача алгоритма обработки - определение лунок и их центров.

4.3.1 Алгоритм обработки изображения

Алгоритм обработки фотографий выполняет следующие функции:

- осуществляет поиск лунок - наиболее темные области на фотографии (рис.4.6), и определяет центры лунок

- для каждой лунки строит график радиального распределения интенсивности отраженного света, усредненной по углу а (рис.4.7 и 4.8).

- осуществляет поиск пиков, соответствующих преципитационным кольцам, и определяет положение этих пиков - координату (рис. 4.7 и 4.8)

После обработки графиков интенсивности всех лунок программа выводит на экран размеченную фотографию (рис.4.9), для контроля оператором правильности результатов идентификации колец. На этой фотографии вокруг каждой лунки нарисован заштрихованный круг, радиус которого соответствует радиусу преципитациониого кольца, определенному алгоритмом обработки (рис.4.9).

0.09

1«Яв

0.045 а) б) г, пике.

О 5 ю

Рис. 4.7. а) - Алгоритм обработки изображения строит усредненное по углу а радиальное распределение интенсивности отраженного света 1пас(г). б) - Радиальная координата г отсчитывается от центра лунки. При наличии достаточно высокого пика алгоритм делает вывод о соответствии этого пика некоторому преципитационному кольцу. Радиус кольца определяется по координате соответствующего пика.

I Р1ш 1мНПЗ,(у СОВ0Е1

Я-21.Й

II 1 5л»«емр|

РЫВ /Гопйгш»

Рис. 4.8 а, б, в. Реальные распределения интенсивности отраженного света 1п$с(г) преци питационных колец IgA (рис.3.5) вокруг лунок № 1,6,13.

4.3.2 Определение концентрации иммуноглобулинов

На основе определенных алгоритмом радиусов преципитационных колец калибровочного ряда и введенной оператором информации об анализе (рис.4.4) производится построение калибровочной кривой и определение концентрации иммуноглобулинов в неизвестных пробах. Результаты расчетов отображаются на экране компьютера в виде таблицы (рис. 4.10)

4.4 Идентификация преципитационных колец

Определение концентрации АГ в неизвестных пробах, по радиусу преципитационного кольца, представляет собой достаточно простую вычислительную задачу, тогда как идентификация колец при обработке фотографий чашек Петри оказалась достаточно сложной задачей.

4.4.1 Алгоритм обработки изображения макета анализатора «ИМАТЕСТ» и его недостатки

Для макета анализатора «ИМАТЕСТ» был разработан алгоритм обработки изображения, основанный на свертке функции реального распределения интенсивности (рис. 4.8) и функции распределения интенсивности для идеального изображения (рис. 4.7).

Алгоритм свертки показал эффективность комплекса в целом, однако, два серьезных недостатка этого алгоритма не позволили использовать его в дальнейшей работе, а) Блик

В действительности края лунок не ровные и на каждой фотографии практически все лунки имеют на краю более или менее яркий блик (рис.4.5). В результате, на графике интенсивности отражённого света появляется довольно высокий пик, не имеющий никакого отношения к преципитационному кольцу (рис. 4.8). В ряде случаев, блик оказывается ярче приципитационного кольца вокруг лунки. Если на графике радиального распределения интенсивности пик, Онтипъ1га1е 1гппде

Выход Редактировать

Рис.4.9. После обработки изображения размеченная фотография выводится на экран монитора для проверки корректности результатов идентификации колец. Просмотр данник

ЕЗИНИ я]

М » в* к н Диотноз М |дС 1* 1дМ щ м г/я нп г/к

61 ГлйрыосеАП — - аетг — —

ЕС Пяигн'ям АС 474 0672 —

О П(мадж*щоАР — —' 391 ПФ4 — — м ИшяМП — — 1£1 ш - — .

С4Л*м«МГ — — 432 0612 — —

ОБ ГообдоинаП ^ - — 78 3 1.11 —

07 РпннСн14 1- А — тез 111 —

Пэт № А С. - " — - —

Ю| гГАЫОАНЕ) 19 Ш 176 0.249 176 014$ п<ц ЗТАШМПО М2 243 361 0 498 ЭЬЭ 0298

ПН еаз »86 702 0.965 7015 0 555

Рис. 4.10. Результаты расчетов - концентрации искомого иммуноглобулина в тестируемых пробах, могут быть сохранены в виде файла, а также распечатаны на принтере. соответствующий такому блику, оказывался выше пика, соответствующего преципитационному кольцу, алгоритм обработки принимал блик за результат диффузии пробы (рис.4.12).

Указанный недостаток был временно устранён введением параметра — минимальное значение радиуса поиска преципитационного кольца (рис.4.15). Однако, вследствие ошибок определения центра лунки и, в некоторых случаях, чрезвычайно высокой яркости блика, этот параметр приходилось задавать достаточно большим, т.е. приходилось удалять из рассмотрения значительную область вокруг лунки.

При обработке фотографий с результатами диффузии ^А (рис.4.5) и это не являлось серьёзной проблемой, поскольку радиус преципитационных колец этих иммуноглобулинов достаточно большой. При обработке фотографий чашек Петри с результатами диффузии этих иммуноглобулинов алгоритм идентификации колец показал достаточно неплохие результаты. Между тем, для 1§М, этот недостаток оказался весьма существенным для 1§М (рис. 4.11, 4.12 и 4.13), поскольку преципитационные кольца в несколько раз меньше, чем у ^А и Как показала модель реакция-диффузия, это связано с тем, что концентрация 1§М в исследуемых сыворотках крови в несколько раз меньше концентрации и ^А. б) Гиперчувствительность

Однако этот недостаток оказался не единственным. В результате более тщательных исследований результатов обработки чашек Петри этим алгоритмом обнаружился еще один его недостаток - большой процент ложных преципитационных колец. Иногда нет необходимости заполнять все лунки чашки Петри, а потому часть лунок может остаться пустой. Оказалось, что вокруг некоторых пустых лунок, алгоритм обработки обнаруживает "преципитационные кольца". Исследования графиков интенсивности показали, что эти "кольца" являются следствием небольших флуктуаций, возникающих на графике радиального распределения интенсивности. Эти флуктуации могут

Рис. 4.11. В связи с тем, что концентрация ^М, в среднем, в несколько раз меньше чем у ^А и ^С, преципитационные кольца этого ИГ выражены гораздо слабее. Этот факт, а также небольшой размер этих колец, сильно усложняют идентификацию колец этого ИГ.

Щ ® ©

1 ¡В Ф е ф е. ш к © е, В ©

Рис.4.12. Результат обработки фотографии 4.11 алгоритмом свертки. Параметр гт1„ = 10 пикселей. Видны ложноотрицательные кольца (пробы № 1, 4, 8, 12, 13, 20 ,21), связанные с наличием бликов на краях лунок. % <ш ® ш ж ш т

Рис.4.13. Результат обработки фотофафии 4.11 алгоритмом свертки с увеличенным значением гт,„ = 13 пикселей. Видны ложноположительные пробы в лунках №15, 19 быть вызваны как засоренностью поверхности геля или дна выдвижной каретки анализатора, так и незначительными дефектами заливки самого геля. Результат такого ложного распознавания приведен на рис.4.13. В результате обработки этой фотографии макетной программой, получается ряд ложно положительных проб (№ 15, 19), причем, этот недостаток встречается с равной долей вероятности при анализе всех грех видов иммуноглобулинов.

Высокий процент ошибок, обусловленный этими факторами, не позволил использовать рассматриваемый алгоритм обработки фотографий в дальнейшей работе.

Таким образом, разработанный для макета анализатора алгоритм распознавания преципитационных колец продемонстрировал работоспособность комплекса в целом, однако указанные недостатки требовали разработки нового, более совершенного алгоритма распознавания. При участии автора алгоритм обработки фотографий был усовершенствован.

4.4.2 Новый алгоритм распознавания Immune

На сегодняшний день существует много различных способов обработки сложных сигналов с целью выделения полезного сигнала. Однако, программная реализация такой обработки и последующая настройка такой программы под определенную задачу достаточно трудоемки. Использование этих процедур обработки оправдано в том случае, если полезный сигнал оказывается достаточно слабым и теряется на фоне шумов.

Исследование графиков распределения интенсивности всех трех иммуноглобулинов показало, что пик, соответствующий преципитационному кольцу, как правило, достаточно высокий и хорошо заметен на фоне шумов (рис.4.8 и 4.14). В связи с этим было решено создать простой алгоритм, в основе которого лежал поиск второго высокого пика (т.к. первый соответствует блику) на графике распределения интенсивности (в диапазоне rmin-rmaх). Вводился параметр — пороговое значение интенсивности ожидаемого пика, превышение которого означало, что обнаруженный пик соответствует преципитационному кольцу. В случае, если таких пиков оказывалось несколько, алгоритм выбирал наиболее высокий. Высота пика, при этом, отсчитывается от нулевого значения интенсивности.

Обработка фотографий чашек Петри с результатами диффузии всех трех иммуноглобулинов продемонстрировала достаточно высокую эффективность такого алгоритма идентификации колец. Более того, оказалось, что процент ошибочной идентификации колец IgA и IgG этим алгоритмом меньше, чем при идентификации алгоритмом свертки. Однако для слабоконтрастных колец IgM (рис.4.11), которые образуются в результате диффузии этого иммуноглобулина, процент идентификации колец этим алгоритмом оказался чрезвычайно низким. Как показала модель реакция-диффузия, это обусловливается свойством данной реакции (в этом случае, количество белка, образующего преципитат значительно меньше, см. напр., рис. 2.11 и 2.12), а не техническим недостатком анализатора. Причины снижения эффективности работы алгоритма при работе с этим иммуноглобулином проиллюстрированы на рис.4.14а (для сопоставления с IgA см. рис. 4.8). Ptul InlBflSlty ел ней 5 10 IS 30 35 <0 <5 50 55 n"a!S |[ SavaBim | SavpttBMP|

FVlA гЧГрглжщц а) * Riol Intenstty ЕПИИП

FW R /CirtiMXn

Sav« a um j Sj« teSMPj

1 Ptot Inluniiity

Е1И0ЕЯ1

0 5 10 15 J0 25 XI 35 40 15 50 55

R-15IS roi r /conlruoui

Swe ях (Ml Sew es BWP в)

Рис.4.14. Зависимость усреднённой интенсивности 1ге/}с(г) от для пробы №13 (а), 1 (б), 5 (в), чашки с ^М, представленной на рис.4.11.

15 30 28 30 36

Ях+Дг ПИП ГПшх -«-»> пике.

Рис. 4.15. Фрагмент графика распределения интенсивности рис. 4.14(а). Отсчет высоты пиков в новом алгоритме распознавания ведется от значения /„„„, что увеличивает относительную высоту пиков, соответствующих преципитациониым кольцам.

Рис. 4.16. Результат обработки фотографии с ^М (рис.4.11) модернизированным алгоритмом распознавания. Видно, что все преципитационные кольца идентифицированы правильно.

Видно, что простая процедура поиска максимума на графике интенсивности оказывается не эффективной, поскольку преципитационный пик, хотя и имеет достаточную абсолютную высоту, но находится в своеобразной "нише", уменьшающей высоту пика относительно нулевой отметки. Поскольку небольшая флуктуация, расположенная за пределами "ниши", может иметь большую относительную высоту, то идентификация "полезного" пика рассматриваемым алгоритмом заведомо не возможна.

Образование этой "ниши" связано с тем, что в гель впитывается жидкость пробы. Иногда этот эффект очень заметен, как, например, для лунки №13. В результате, небольшая радиальная область геля вокруг лунки становится более прозрачной. На фотографии эта область темнее, а интенсивность отраженного света вблизи лунки оказывается заметно ниже (рис.4.14 а).

Поскольку глубина "ниши" может варьироваться в достаточно широких пределах, то задание величины пороговой интенсивности - критерия отбора "полезных" пиков, необходимо производить индивидуально для каждой чашки, что, естественно, не допустимо.

Между тем, было замечено, что отсчет высоты пиков не от нулевой отметки, а от значения 1тЫ (рис. 4.15) заметно увеличит относительную высоту "полезного" пика. Исходя из этого, был предложен следующий алгоритм идентификации преципитационного кольца:

- идентификация блика - первого максимума на графике интенсивности и определение его высоты 1тах\

- определение минимального значения интенсивности 1т1п в диапазоне поиска колец гтй1 - гтах;

- задание величины порогового значения интенсивности (в долях 1тах-1тт)',

- отсчет высоты всех пиков не от нулевого значения интенсивности, а от значения 1т;п;

- дополнительная проверка всех пиков, прошедших отбор по высоте, заключающаяся в определении значения интенсивности на некотором расстоянии (задаваемом величиной Дг) от проверяемого пика (рис.4.15). В случае, если интенсивность в этой точке (Ях+Аг) превышает значение высоты самого пика (в точке Д*), последний отбраковывается.

Таким образом, новый алгоритм распознавания содержал три основных параметра: высота возможного пика (в долях 1тах-1тт), расстояние проверки спада высоты А г, и максимально возможное значение интенсивности в этой точке (также в долях 1теи-1тм)• Подбором этих трех параметров удалось заметно повысить процент идентификации преципитационных колец ^М.

4.4.3 Результаты

Пример результатов обработки алгоритмом свертки и новым алгоритмом представлены на рис. 4.12, 4.13 и 4.16. Приведена фотография чашек Петри с результатами диффузии ^М, преципитационные кольца на которой достаточно слабоконтрастные. Видно, что идентификация колец новым алгоритмом гораздо более качественная - алгоритм свертки обнаружил два ложных кольца, тогда как новый алгоритм произвел идентификацию колец безошибочно.

В результате проверки программного обеспечения анализатора с представленным алгоритмом распознавания, Институт иммунологии принял решение о проведения медицинских испытаний анализатора «ИМАТЕСТ 01». В настоящий момент три опытных образца анализатора поставлены в организации, определенные Комитетом по новой медицинской технике МЗ РФ, для проведения этих испытаний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В диссертации получены следующие основные результаты:

1) Проведена оценка коэффициентов диффузии иммуноглобулинов в агаровом геле. Показано, что уменьшение скорости диффузии иммуноглобулинов, вопреки литературным данным, оказывается весьма существенным. Коэффициенты диффузии молекул ^А и 1§С в такой среде на 25% меньше чем в воде, а для молекулы уменьшение коэффициента диффузии достигает 50%.

В результате численных экспериментов установлено, что процесс формирования иммунопреципитационного кольца состоит из двух стадий: распространение реакционного фронта и формирование области избытка продукта реакции. На основании этих результатов обоснована возможность значительного сокращения времени количественного анализа иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии. Результаты иммунодиффузии ^М могут учитываться через сутки, что в 2-3 раза меньше установленного времени выдержки чашек, а время учета результатов иммунодиффузии IgA может быть сокращено с 24 до 8-11 часов.

4) Специфика рассматриваемого процесса самоорганизации заключается в образовании единственного "кольца", что, в свою очередь, связано со следующими свойствами взаимодействующих белков: их значительными размерами (которые обусловливают низкий коэффициент диффузии свободных белков и практически нулевой коэффициент диффузии продуктов их взаимодействия в гелевой среде),

- высоким значением константы скорости ассоциации этих белков.

На основании полученных результатов сделаны следующие выводы:

Список источников диссертации и автореферата по физике, кандидата физико-математических наук, Фёдоров, Алексей Александрович, Санкт-Петербург

1. A.A. Фёдоров Математическое моделирование радиальной иммунодиффузии в геле // 6-я Пущинская школа-конференция молодых учёных "Биология наука XXI века". - Пущино, 2002, Тезисы докладов. - Т.2. - С. 198.

2. A.A. Фёдоров Кластерная модель иммунопреципитации в гелевой среде // 7-я Пущинская школа-конференция молодых учёных "Биология наука XXI века". — Пущино, 2003, Тезисы докладов. - Т.2. - С.256.

3. A.A. Фёдоров Моделирование роста кольцеобразного преципитата в методе радиальной иммунодиффузиии II. Решёточная DLA-модель // Научное приборостроение. 2003. - Т. 13. - №4. - С.60-64.

4. A.A. Фёдоров, В.Е. Курочкин, А.И. Мартынов, И.В. Андреев Моделирование роста кольцеобразного преципитата в методе радиальной иммунодиффузии // «Аллергия, астма и клиническая иммунология». 2004. - Т.7. - № 9. - С.212-215.

5. A.A. Фёдоров Самоорганизация иммунных комплексов антиген-антитело в процессе радиальной диффузии // 10-я Всероссийская конференция студентов-физиков и молодых ученых. — Москва, 2004, Тезисы докладов. Т.2. — С.863.

6. A.A. Фёдоров, В.Е. Курочкин Самоорганизация иммуноактивных белков и их комплексов // 3-й Съезд Биофизиков России. Воронеж, 2004, Тезисы докладов. — Т.1.-С.116.

7. A.A. Фёдоров, В.Е. Курочкин, А.И. Мартынов, Р.В. Петров Самоорганизация в реакциях иммунопреципитации // ДАН (принята в печать).1. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

8. Роит А., Бростофф Дж., Мейл Д.Иммунология (Пер. с англ.) М.: Мир, 2000. - 592с.

9. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.:Медицина, 1999. - 608с.

10. Wilson I.A., Stanfield R.L. Antibody-antigen interactions // Curr. Opin. Struct. Biol. 1993. - vol.3. -№ 6. - p.l 13-118.

11. Davies D.R., Cohen G.H. Interactions of protein antigen with antibodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - vol.93. -№ 1. -p.7-12.

12. Xavier К.A., Willson R.C. Association and dissociation kinetics of anti-hen egg lysozyme monoclonal antibodies HyHEL-5 and HyHEL-10 // Biophys. J. — 1998. -vol.74. №4. - p.2036-2045.

13. Zeden-Lutz G., Zuber E., Witz J., Van Regenmortel M.H.Thermodynamic analysis of antigen-antibody binding using biosensor measurements at different temperatures // Anal. Biochem. 1997. - vol.246. -№ 1. - p.123-132.

14. Иммунология (Под ред. У.Пола, т.З). М.: Мир, 1989. - 397с.

15. Janin У.Principles of protein-protein recognition from structure to thermodynamics // Biochimie. 1995. - vol.77. - № 7-8. - 497-505.

16. Veselovsky A. V., Ivanov Yu. D., Ivanov A.S., Archakov A.I., Lewi P., Janssen P. Protein-protein interactions: mechanisms and modification by drugs // J. Mol. Recognit. 2002. - vol. 15. - № 6. - p.405-422.

17. Jones S., Thornton J.M. Principles of protein-protein interactions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - vol.93. - № 1. - p.l3-20.

18. Xu D., Lin S.L., Nissinov R. Protein binding versus protein folding: the role of hydrophilic bridges in protein associations // J. Mol. Biol. 1997. - vol. 265. -p.68-84.

19. Tsai C.-J., Lin S.L., Wolfson H.J., Nissinov R. Studies of protein-protein interfaces: a statistical analysis of hydrophobic effect // Protein Sci. 1997. -vol.6. -№ 1. — p.53-64.

20. Xu D., Tsai C.-J., Nissinov R. Hydrogen bonds and salt bridges across proteinprotein interfaces//Protein Eng. 1997. - vol.10, -p.999-1012.

21. Hubbard S.J., Argos P. Cavities and packing at protein interfaces // Protein Sci. — 1994. vol. 3.-№ 12.-p.2194-2206.

22. Koren R., Hammes G.G. A kinetic study of protein-protein interactions // Biochemistry. 1976.-vol. 15.-№5.-p.l 165-1171.

23. Northrup S.H., Erickson H.P. Kinetics of protein-protein association explained by Brownian dinamics computer simulation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. -vol.89. - № 8. - p.3338-3342.

24. Szabo A., Stolz L., Granzow R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA) // Curr. Opin. Struct. Biol. 1995. - vol.5. -№5.-p. 699-705.

25. Kozack R.E., Subramaniam S. Brownian dynamics simulations of molecular recognition in an antibody-antigen system // Protein Sci. 1993. - vol. 2. - №6. -p.915-926.

26. Kozack R.E., d'Mello M.J., Subramaniam S. Computer modeling of electrostatic steering and orientational effects in antibody-antigen association // Biophys. J. -1995. vol.68. - №3. - p.807-814.

27. Zhou H.X. Brownian dynamics study of the influences of electrostatic interaction and diffusion on protein-protein association kinetics // Biophys. J. — 1993. -vol.64.-№6.-p. 1711-1726.

28. Schreiber GFersht A.R. Rapid, electrostatically assisted association of proteins // Nat. Struct. Biol. 1996. - vol.3 - №5. - p.427-431.

29. Воробьёва H.B. Руководство по иммунодиффузии и электрофорезу. — M.: МГУП, 2000.-42с.

30. Твердофазный иммуноферментный анализ (Сборник научных трудов). — Л.:Изд.Ин. им.Пастера, 1988.- 160с.

31. Janeway С.A., Travers P., Walport М., ShlomchikM. J. Immunobiology (5th ed.). New York:Garland Publishing. -2001. - 732 p.

32. Менделенко M.M., Котиков B.A., Мелещенко JI.H. Использование метода Mancini при массовом обследовании населения // Лаб. дело. — 1981. — №6. -с.353-354.

33. Heidelberger М., Kendall F.E. The precipitin reaction between type III pneumococcus polysaccharide and homologous antibody. III. A quantitative study and theory of the reaction mechanism // J. Exp. Med. 1935. - vol. 61. - № 4. -p.563-591.

34. Heidelberger M., Kendall F.E. A quantitative theory of the precipitin reaction: IV. The reaction of pneumococcus specific polysaccharides with homologous rabbit antisera // J. Exp. Med. 1937. - vol. 65. - № 5. - p.647-660.

35. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. — М.: ВНИРО Москва, 1995. 213с.

36. Никитин В.М. Справочник серологических реакций. — Кишинев/.Штиинца, 1977.-206с.

37. Ouchterlony О. Antigen-antibody reactions in gels // Acta Path. Microbiol. Scan. -1949.-vol.26.-№4. -p.507-515.

38. Ouchterlony O. Diffiision-in-gel methods for immunological analysis // Prog. Allergy. 1958. -vol. 5. - p.1-78.

39. Mancini G., Carbonara A. O., Heremans J. F. Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion // Immunochem. 1965. - vol.2. — №3. - p.235-254.

40. Mancini G., Nash D.R., Heremans J.F. Further studies on single radial immunodiffusion. Qualitative analysis of related and unrelated antigens // Immunochemistry. 1970. - vol.7. - №3. - pp. 261-264.

41. Laurell C.B. Electroimmuno assay // Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 1972. — vol.124.-p.21-37.

42. Laurell C.B. Quantitative estimation of proteins by electrophoresis in agarose gel containing antibodies // Anal. Biochem. 1966. - vol. 15. - № 1. - p.45-52.

43. Nash D.R., Scolari L., Heremans J.F. Further studies on single radial immunodiffusion. IV. Quantitation of heterologous antigens by means of cross-reacting antisera // Immunochem. 1970. - vol.7. - № 3. - p.265-274.

44. Rowe D.S. Radioactive single radial diffusion: a method for increasing the sensitivity of immunochemical quantification of proteins in agar gel // Bull. World Health Organ. 1969. - vol.40. - №4. - p.613-616.

45. Тихомиров А. А. Модификация метода Манчини для количественного определения иммуноглобулинов // Лаб. дело. 1977. — №1. — с.45-47.

46. Михайлова Н.Д., Гусейнов Ч.С., Лихачева З.И., Горелова A.M. Метод радиальной иммунодиффузии Манчини для определения продуктов деградации фибрин/фибриногена // Лаб. дело. 1978. - №8. - с.490-493.

47. Arbesman С.Е., Ito К., Wypych J.I., Wicher К. Measurement of serum IgE by a one-step single radial radiodiffusion method // J. Allergy Clin. Immunol. 1972. -vol.49.-№2.-p. 72-80.

48. Князева E.H., Курдюмов С.П. Законы эволюции и самоорганизация сложных систем. М.: Наука, 1994. - 236 с.

49. Капица С.П., Курдюмов С.П., Малинецкий Г.Г Синергетика и прогнозы будущего. М.: Наука, 1997. - 286 с.

50. Щербаков А.С. Самоорганизация материи в неживой природе. Философские аспекты синергетики. М.: Изд. МГУ, 1990. - 111 с.

51. Климонтович Ю.Л. Энтропия и информация открытых систем // УФН. — 1999. т. 169. - №4. с.443-452.

52. Weidlich W. Physics and Social Science the Approach to Synergetics // Physics Reports. - 1991. - vol. 204.- p. 1 -163.

53. Пригожим И.Р. От существующего к возникающему: время и сложность в физических науках Изд. 2-е. доп. Перевод с англ. Ю.А. Данилова М.:УРСС 2002. 288с.

54. Полак Л.С., Михайлов A.C. Самоорганизация в неравновесных физико-химических системах. М.:Наука. - 1983. - 283с.

55. Кернер Б.С., Осипов В.В. Самоорганизация в активных распределенных средах (Сценарии спонтанного образования и эволюции диссипативных структур) // УФН. 1990. - вып. 9. - с.2-75.

56. Шредингер Э. Что такое жизнь? (С точки зрения физики). M-JL: ИЛ, 1947. - 146 с.

57. Гвай И.И., Циолковский К.Э. О круговороте энергии. М.: Изд. АН СССР, 1957.- 80с.

58. Вернадский В.И. Биосфера. М.: Мысль, 1967. - 374с.

59. Бернал Дж.Наука в истории общества. М.: ИЛ, 1956. - 736с.

60. Гухман A.A. Об основаниях термодинамики (Изд.2-е). — М.:Энергоатомиздат, 1986.-324с.

61. Байер В. Биофизика. М.: ИЛ, 1962. - 432с.

62. Тринчер КС. Биология и информация. М.: Наука, 1964. - 100с.

63. Оппенгеймер К. Химические основы жизненных процессов (Пер. под ред. и С. Я. Капланского). М.-Л.: Биомедгиз. 1934. 309с.

64. Лазарев П.П. Современные проблемы биофизики. М.-Л.: Изд. АН СССР, 1945.- 149 с.

65. Пасынский А.Г. Биофизическая химия. М.: Высшая школа, 1963. - 432с.

66. Тарусов Б.И. Основы биофизики и биофизической химии (т.1). — М.: Высшая школа. -1960. — 233с.

67. Eyring Н., Воусе R.P., Spikes J.D. Thennodinamics of living systems. In: Comparative Biochemistry (vol. I). -N.-Y.:Acad. Press, 1960. p. 15-73.

68. Morowitz H.J. Energy Flow in Biology. N.-Y. Acad. Press, 1968. - 179 p.

69. Волькенштейн M.B. Молекулы и жизнь. Введение в молекулярную биофизику. М.: Наука. 1965. — 504с

70. Антонов В.Ф. Термодинамика биологических систем. В сб.: Биофизика. — М.:Высшая школа,1968. с.13-47.

71. Термодинамика биологических процессов (Под ред. А.И. Зотина). М.: Наука, 1976.-278 с.

72. Руденко А.П. Термодинамические закономерности химической эволюции и основы биоэнергетики. В кн.: Методологические и теоретические проблемы биофизики. М.: Наука, 1979. - с. 120-127.

73. Эйген M. Самоорганизация материи и эволюция биологических макромолекул. -М.: Мир, 1973. 216с.

74. Романовский Ю.М. Процессы самоорганизации в физике, химии и биологии. -М.: Знание, 1981.-48 с.

75. Курдюмов С.П., Малинецкий Г.Г. Синергетика теория самоорганизации. Идеи, методы, перспективы. — М.: Знание, сер. «Математика, кибернетика», 1983.-№2.-64с.

76. Гарел Д., Гарел О. Колебательные химические реакции. М.: Мир, 1986. -148с.

77. Кудрявцев И.К Химические нестабильности. -М.: Изд. МГУ, 1987. 255с.

78. Синергетика. (Труды семинара. Вып. 1). М.: Изд. МГУ, 1998. - 256с.

79. Синергетика и методы науки. (Под ред. М.А. Басина). С.-Пб.: Наука, 1998. - 440с.

80. Гленсдорф П., Пригожий И.Р. Термодинамическая теория структуры устойчивости и флуктуаций. М.: Мир, 1973. - 280с.

81. Николис Г., Пригожий И.Р. Самоорганизация в неравновесных системах. — М.: Мир, 1979.-512с.

82. Белоусов Б.П. Периодически действующая реакция и ее механизм. В сб. рефератов по радиационной медицине за 1958 г. -М.: Медгиз, 1959. 145с.

83. Жаботинский A.M. Концентрационные автоколебания. М.: Наука, 1974. -178 с.

84. Жаботинский A.M. Колебания и волны в гомогенных химических системах. В сб.: Физическая химия. Современные проблемы. М.: Химия, 1987. — 6—47 с.

85. Руденко А.И Саморазвивающиеся каталитические системы // ДАН СССР. — 1964. т. 159. -№6. - с. 1374-1377.

86. Руденко А.П. Теория саморазвития открытых каталитических систем. — М.: Изд-во МГУ, 1969. 276с.

87. Руденко А.П. Физико-химические основания химической эволюции // ЖФХ. 1983. - т.57. - №7. - с.1597-1608; №11. - с.2641-2658.

88. Onsager L. Reciprocal Relations in Irreversible Processes. II. // Phys. Rev. — 1931. vol. 38. -№12. -p.2265-2279.

89. Turing A.M. The chemical basis of morphogenesis // Phil Trans. Roy. Soc. B. — 1952.-vol.237.-p.3 7-72.

90. Руденко А.П. Самоорганизация и прогрессивная эволюция в природных процессах в аспекте концепции эволюционного катализа. // Росс. Хим. журн. 1995. т. 39. - №2. - с.55-71.

91. Пригожим И.Р. Введение в термодинамику необратимых процессов. — М.: Издатинлит. — 1960. 128с.

92. Хакен Г. Синергетика. М.: Мир, 1980. - 404с.

93. Эбелинг В. Образование структур при необратимых процессах. М.: Мир. 1980.-279с.

94. Малинецкий Г.Г. Синергетика. Король умер. Да здравствует король! В кн.: Синергетика. (Труды семинара. Вып. 1.). М.: Изд. МГУ, 1998. - 52-80с.

95. Руденко А.П. Эволюционная химия и естественноисторический ПОДХОД к проблеме происхождения жизни. // Ж. ВХО им. Д.И. Менделеева. 1980. — т.23. — №4. — с.890-404.

96. Руденко А.П. Равновесная и неравновесная структурная организация природных объектов как основа их системной классификации. // В кн.: Система планета Земля. (Материалы научных семинаров). — M.: РОО «Гармония». 1999. - 7-12с.

97. Климонтович Ю.Л. Статистическая физика: Учебное пособие. — М.:Наука,1982.-608с.

98. Яглом A.M., Яглом И.М. Вероятность и информация. (Изд. 2-е). — М.: Физматгиз, 1960. — 315с.

99. Климонтович Ю.Л. Турбулентное движение и структура хаоса. — М.:Наука, 1990.-320с.

100. Климонтович Ю.Л. Уменьшение энтропии в процессе самоорганизации. S-теорема (на примере перехода через порог генерации) // Письма в ЖТФ.1983. т.9. - вып.23. - с.1412-1417.

101. Климонтович Ю.Л. Определение сравнительной степени упорядоченности состояний открытых систем по экспериментальным данным // Письма в ЖТФ. 1988. - т. 14. - вып. 7. - с.631-634.

102. Анищенко B.C., Сапарин П.И., Анищенко Т.Г. О критерии степени упорядоченности режимов автоколебаний. Иллюстрация S-теоремы Климонтовича // ЖТФ. 1994. - т.64. - № 11. - с. 1 -7.

103. Скоков В.Н. О степени относительной упорядоченности при неравновесном фазовом переходе в системе: тонкая пленка высокотемпературного сверхпроводника с током кипящий охладитель // Письма в ЖТФ. - 1997. — т.23 -№21. — с.64-68.

104. Савельев А.П., Митьковская Л.И., Куньева Л.Ф., Карнаухов В.Н., Савельева Л.Н. Последовательные волны периодического спорообразования колоний Streptomyces levons // Биофизика. 1999. - т.44. - №3. - с. 505-509.

105. Полежаев А.А., Птицын М.О. Механизм формирования пространственно-временной упорядоченности в бактериальных системах // Биофизика. 1990. -Т.35. — №2. -с.302-306.

106. Budrene Е., Berg Н. Dynamics of formation of symmetrical paterns by chemotactic bacteria // Nature. 1995. - v.376. - № 6535. - p.49-53.

107. Adler J. Chemotaxis in bacteria // Science. 1966. - v. 153. - № 737. - p.708-716.

108. Цыганов M.A., Асланиди Г.В., Шахбазян В.Ю., Бикташев В.Н., Иваницкий Г.Р. Нестационарная динамика бактериальных популяционных волн // ДАН.- 2001. т.380. - №6. - с. 1-6.

109. Буляница A.JI., Быстрова Е.Ю., Богомолова Е.В., Панина Л.К., Курочкин В.Е. Модель образования пространственно временных периодических структур в колониях мицелиальных грибов // Журнал общей биологии. — 2000. Т.61. - №4. - С.400-411.

110. Trinci A.P.J. Influence of the width of the peripheral growth zone on the radial growth rate of fungal colonies on solid media // J. Gen. Microbiol. 1971. - v.67.- №2. p.325-344.

111. Панина JJ. К Структурно-функциональная реорганизация микромицетов в процессах формообразования и роста на труднодоступных субстратах // Автореф. дисс. . докт. биол. наук. Санкт-Петербург, 2000. - 30с.

112. Droz М. Recent theoretical developments on the formation of Liesegang patterns // J. Stat. Phys. 2000. - vol. 101. - № 2. - p.509-519.

113. Шемякин Ф.М., Михалев П.Ф. Физико-химические периодические процессы. М.-Л.: Изд-во АН СССР. - 1968. - 181 с.

114. Шубников А.В., Парвов В.Ф. Зарождение и рост кристаллов. — М.: Наука, 1969.-73с.

115. Henisch Н.К., Garcia-Ruiz J.M. Crystal growth in gels and Liesegang ring formation // J. Cryst. Growth. 1986. - vol. 75. - p.195-211.

116. Goldstein В., DeLisi C., Abate J. Immunodiffusion in gels containing erythrocyte antigen. I. Theory for diffusion of antiserum from a circular well // J. Theor. Biol. 1975. - v.52. -№2. - p. 317-334.

117. B. Goldstein, C. DeLisi Immunodiffusion in gels containing erythrocyte antigen-II: Analysis of experiments involving the diffusion of antiserum from a circular well // Immunochem. 1976. - vol. 13. - № 1. - p.29-33.

118. DeLisi C., Goldstein B. The Kinetics of Hemolytic Plaque Formation // Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 1974. - v.71. - № 1. - p. 16-20.

119. Медвинский А.Б., Русаков A.B., Цыганов M.A., Кравченко В.В. Механизм формирования структур Лизеганга вокруг популяции Dictyostelium discoideum // Биофизика. 2000. - т. 45. - №3. - с.525-531.

120. Франк-Каменецкий Д. А. Диффузия и теплопередача в химической кинетике. М.: Наука, 1987. - 491с.

121. Pluen A., Netti P.A., Jain R.K., Berk D.A. Il Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations // Biophys. J. -1999. vol.77. - №4. -p.542-552.

122. Clague D.S., Phillips R.J. Hindered diffusion of spherical macromolecules through dilute fibrous media // Phys. Fluids. 1996. - vol.8, -p.1720-1731.

123. Johnson E.M.y. Berk D.A, Jain R. K., Deen W. M. Hindered diffusion in agarose gels: test of effective medium model // Biophys. J. 1996. - vol.70. - №2. -p.1017-1026.

124. Phillips R.J. IIA Hydrodynamic Model for Hindered Diffusion of Proteins and Micelles in Hydrogels // Biophys. J. 2000. - vol.79. - №12. - p.3350-3354.

125. Туп M.T., Gusek T.W. Prediction of diffusion coefficients of proteins // Biotech, and Bioeng. 1990. - vol.35. - p.327-338.

126. Gosting L.J. Measurement and interpretation of diffusion coefficients of proteins // Adv. Protein Chem. 1956. - vol.48. - №11. - p.429-554.

127. Griess G.A., Guiseley K.B., Serwer P. The relationship of agarose gel structure to the sieving of spheres during agarose gel electrophoresis // Biophys. J. 1993. -vol.65.-№l.-p.l38-148.

128. Самарский A.A. Теория разностных схем. М.:Наука, 1989. - 616с.

129. Смирнов Б.М. II Физика фрактальных кластеров. — М.Наука, 1991. — 136с.

130. Тоффоли Т., Марголус Н. Машины клеточных автоматов. М.: Мир, 1991. - 280с.

131. Федер Е. Фракталы (Пер. с англ.). М.:Мир, 1991. - 260с.

132. Witten Т.A., Sander L.M. Diffusion-limited aggregation, a kinetic critical Phenomenon // Phys. Rev. Lett. 1983. - vol.47. - №19. - p.5686-5697.

133. Meakin P. Formation of Fractal Clusters and Networks by Irreversible Diffusion-Limited Aggregation // Phys. Rev. Lett. 1983. - vol.51. - №13. -p.l 119-1122.

134. Kolb M., Botet R., Jullien R. Scaling of Kinetically Growing Clusters // Phys. Rev. Lett. 1983. - vol.51. - №13. - p. 1123-1126.

135. Jullien R., Kolb M. Hierarchical model for chemically limited cluster-cluster aggregation // J. Phys. A: Math. Gen. 1984. - vol.17. - №12. - L639-L643.

136. Meakin P. Diffusion-controlled aggregation on two-dimensional square lattices: Results from a new cluster-cluster aggregation model // Phys.Rev. B. 1984. -vol.29. - №6.- p.2930-2942.

137. Northrup S.H., Allison S.A., McCammon J.A. Brownian dynamics simulation of diffusion-influenced bimolecular reactions // J. Chem. Phys. — 1983. vol.80. -p.1517-1524.

138. Gabdoulline R.R., Wade R.C. Protein-protein association: investigation of factors influencing association rates by Brownian dynamics simulations // J.Mol.Biol. 2001. - v. 306. - №. - p.l 139-1155.

139. Johnstone R.W., Andrew S.M., Hogarth M.P., Pietersz G.A., McKenzie IF. The effect of temperature on the binding kinetics and equilibrium constants of monoclonal antibodies to cell surface antigens // Mol. Immunol. 1990. - vol.27. - №4. - p.327-333.