Синтез, физико-химические и иммунобиологические свойства конъюгатов и комплексов гаптенов, белковых и микобактериальных антигенов с синтетческими полиэлектролитами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГ6 од

г» и <-*-■■■> На пряпях рукописи

Суранова (Филатова) Екатерина Дмитриевна

СИНТЕЗ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОНЪЮГЛТОВ И КОМПЛЕКСОВ ГАИТЕНОВ, ЦЕЛКОВЫХ И МИКОБАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ С СИНТЕТЧЕСКИМИ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ

02.00.10 -биооргапичсскал химии, хшиш природных и фишологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москиа 1597

Работ выполнена и Г11Ц- Институте иммунологии Минздрава РФ Ц11ИИ чубсркулеза РАМИ.

Научные руководители: доктор химических наук М.И. Мустафаев, доктор биологических наук Р.Ю.Романова.

Официальные оппоненты: доктор химических паук, профессор С.Е.Еснпов, доктор медицинских наук, ст. научи, сотр. Г.А.Пгнатьева Ведущая организация: Институт бнорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.Л. Овчинникова (Москва).

Защита диссертации состоите» «» $ ЛЛ ЛЧЧ^т.

в часои на заседашнш Диссертационного совета Д 084.68.01 и Государственном научном центре по антибиотикам (ГНЦА), но адресу: 113105, Москва, ул. Нагатинская, д.За.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦА. Автореферат разослан « 11 » ¿/¿¿¿уМ 19%Рг.

Ученый секретарь Диссертационного совете кандидат медицинских иаух;

С£уС1

СМ. Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

. Актуальность тегта. В 50-е года были синтезированы поли-пептидние антлгени, обладающкэ ма.г/нос1ди>'Л1фу:-с^;а?и сго:>.ства-уи. Еыло устаноЕл-зно, что присоединение слабоимиуногенних антигенов к синтетическим полипептидач-носитоля!! способно вызывать суассхпз.шое ус.тсшю итгунэлоппгегкнх пзагший. на такие антигены.Однако, оставалось не яснкы, игр-зет ли голъ-з. птои феноиене х:.'.г,г!йскля природа носителя, в качестве которого использовали полнпептэдк, белш:, нуклеиновые кислоты, полисахарид:;, липополисахарвдн л т.п.Пр'л этом возможно, что химическая привода носителя и не ваяна, а играет роль только его ыакроиолояулярцость. . .

К скнтс31шуемкм .-гдтигенглг, содержал;!« в своем составе пр'^родниЗ слабей пнтттген (АГ),пред-ьяплЕЗтся слсдуишге требования: значительно? повгаенаэ гммуногенноетц по срггнанта с каходни! пр'лродша АГ прн.-сохралонаи.спе1и:$ииноога к даамму аг; низкая .токсичность синтезиросз1П!ого антигена и относительная стабильность пря.физиологических условиях.

Ргкм требованиям и сгатаЗкруемш антигенам отвечают кс-кусствешшо антигенн, содержание в качестве ноетггсля полн-плектролиты: полиакриловую кислоту (ПАК), сополимер акркло-вой кислотм-к М-пинилпирроладона (Л'А5). гг6ли-4-ш!Ин.чп1фвдг.£ (П4ВП), пол«-5-мвт'/л-5-в;сгАШиридин'(ЛМБП), сополкмер 4-ви-ншгпкрндина и №-ацо?кл-4-в1:н;сткрчцанкй.брои:<да (СП) и до. Эта полнзлектролнты.-образуют комплексы с белками кроеес: с сгаоротошшн альбумином н гаунаглобулшлги;. устойчивый .в' кйс-лоГ срздв.-Однако, при перехода х. бтиологичесхкм-значениям" рН 7,0 г' 7,2.,! стабильность' ¿тхх'.комплэпсов снижается. Поэтому, было необходимо сантйзиропа.гь'.болйо."лрэч1!ыв..хаЕпляпт11Но'" соедшшшя. (конъагатн) такта белков с синтетическими полкчзр-шшн жмуностинудяторашх, способный значительно повысить ул-мунэгенкко свойства.птих белк опт...................

- Иельо работы бкл синтез.конъюгатоз.галтенов, белковых.«, мтобйктсриалышх антигенов с скнтвтичзсккмн полняаохтроюта-МН И НЗуЧСИИЭ их фИЗИКО-ХИМЫЧвСКНХ И Й/Ку!1Я б; '.О Л О Г !!Ч 5 С 1С свайств.

. . . Научная.новизна. Впорзыв синтезированы хим,.ческие. соедн.*' hshhh: пшграт Л4РЛ i: шлсрат.ПЧН], но .ссд^ркацна в спаем сое ст&ве пргизь&дных бодкрг, полисахаридов, пол;глуллеоткдов wли продуктов их дггт.укции, способные вызывать и.\с.:уиный ovstr и отнесении 2,4,6-трини-трофснила у кьгаей.

Впервые синтезированы конгэгаты бычьего сывороточного альбумина (БСА) с ПАК и сополимером 4-згл1шпирг,цина и Ь'-ацо-тил-4-виншшир5Щиний бромида, способные шщуцкровать ¡;;:\г/н-ииП ответ у г.гкл:еЯ, слабо отзечазкцих на ЕСА.

Впервые при изучении комплексообразования в системе ПАК:Си^+:ЕСА обнаружено явление обращения коллоидной шгдел-лы в водной фаз«.

Впервые обнаружено протентивное действие кон-ыэгатои ми-кобактериалышх антигенов с ПАК у мьллеЯ, sapasetcmx вирулентной культурой михобактернй H37Ki/ и у тим^ктоыкровалных мышей, инфицированных микобактершаш БЦа.

Практическая значимость. Разработаны методы усиления пм-муногенности слабых ихгиуногенов - БСА и антигенов шжоо'актери! при конъЕгировенни их с синтетическими полимерными итгунасти-ыуляторами,которые могут быть использованы для усиления имму-ногвшости и других слабых антигенов. Кон-ьвгаты полиэлектролитов с разными шшгггнаш; клеточных станок ыихобактерий БЦЯ по-разному влияют на туберкулезнш' процесс: конъюгаты с АГ с молекулярной массой от 40 С-00 до 67 ООО оказывают защитное действие , а конъюгаты с АГ с уолекулярной кассой до 30 ООО усугубляет течение болезни. Ргот факт можно использовать при разработке искусственной противотуберкулезной вакцины.

Положения, зыносюаа на~защиту:

1. Способ синтеза пикрата ПМБЧ из ПМЕГ и пикриновой кислоты и из ПЫВП и 2,4,6 - т р книг ро б е н з о л с j: л ьфо :••: и с л о т ы, его физико-химические и антигенные свойства.

2. Способ синтеза тагыуно генных коньюгатов ПАК-БСА и СП-БСА с помощью водорастворимого карбодинмвда.

3. Способ синтеза троГашх коньюгатов ТНФ -БСА-ПАК путем тринитрофенилирования конъюгата БСА-ПАК и их иммуногенность.

4. Конъюгаты микобактериальных антигенов с ПАК индуцируют антителообразование, развитие ГЗТ (гиперчувствительности замедленного типа) и обеспечивают протективный эффект против вирулентных шиобактернй Н37Е/ у ыуюей и прегль кнхобокторий Е1И у ткмгктомированных ынлей.

~ л —

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Зсе-сопзннх совещаниях "Синтетические полторы м^птаинского назначения" (Дзер-пшс;:, 1979 г., Лл?:а-ата, 1933 г., Звенигород, 1991 г.), заседании отдела йлтюлогия ЦНИИ туберкулеза РАМН.

, Публикппии. Пз те.'/з диссертации спублгагззало К печатных работ.

Объем л структура.работч. диссертация ее-стоит нззвведения, осгора лътир^тури, ¡1элс»ен»;-ч результатоъ йсслб^овш.ия (5 глав), гласи "Материалы и методы", заключен;«, гиводов п списка литературы. Работа .-.злежена на с?маь:;-«.сппсноп текста, включал 13 таблщ, ?4 рисуька, 5 схем и 132 щтфэвакял* го-топи« <А ■

основное СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глада I представляет собой литературный обзор слойсга высокомолекулярных и-слувостшулятороэ: полипептвдов, мод«флкфо-ваншдс гаптеначи белков, а таюг.е синтетических полиолектроли-тов', методов синтеза конъагатов и свэГств комплексов полиэлок-трвлитов с белками; и синтезированных 5амуногс1юв, содеркацях полизлектролити-1с.я.^пгсст:з.1улятори.

В глапе II обсуддаются результат по синтезу и физихо-хн-ыичвесвойствам пикратов полиМ-яганллирвдина и поли£2-ма-ткл~5-винилпкрил!пщ.

В глав о III обсулдавтсл результаты по синтезу конъюгатоп бычьего сывороточного альбумина с сополимером 4-вшплпиридина и 1/-ацетил-4-вга1илпирздин;1Л бромида и с полиакриловой кислотоИ.

В гладе 1У проведено обоуздшшг результатов, полученных при исследовании кс;:плгксообразованкя полиакриловой кислоты с бычьим сгаоротсчнкч ал?:буша1С!1 в присутствие ионов металлов: Еа2+, Со2+, С/-3"1" и Ск2+.

3 главе У обсу.дагл'ся результаты по таученга ¡г-иушг;шю-с;:\ синтезированных соединений.

В гласа У1 проведено обсуждение результатов ггсг/ло^б'тс.'гп-бг-^гогпчеекпх споП"тз сглгггз.грОЕгаппсх ксыъ'огатов и комплексов алтнгчноз шшобактериЯ ЕЦХ с полиакриловоП кислотой и сополимером акриловой кислота и (/-¡зкнклпиррэдидона.

В главд УН оспоиииэ окспср!:-.!заталыш«.- методы и

методики, использованные и разработанные при выполнении работы.

Работа лосваиена экспериментальному подтвергдзнига возможности генотипическо'. коррекиии иммунного ответа при г.омо.л! синтетических полиэлектролитов. Оказалось, что присоединение гаптена 2,4,0-тринит'»Меняла (пикрила) к молекуле поли-4-вк-нилпиридина или поли-2-метил-'3-винилпкридина превращает .^ти лоли-лектролиты в антигены, способнее вкзнвать у ¡тле'' значительное увеличение антителоо5ра?уш;их клеток (АОК) в селезек-ке к антител (АТ) в сыворотке крови.

I.Синтез пикрата поли-4-втаилпишдша и пккрата голи-?-метил-5-вкнштиридина, 'лх ги^ико-х'.мичеекке и иммунобиологические свойства.

Для такого синтеза возг.кшш два пут;;: во-гервых, мокко три-нитро.^енилировать мономер и сополимеризовать его с исходник мономером; во-вторых, мо:шо тринитрогенилировать уже синтезированный полимер. В данном случае перш.: путь оказался не удобным, так как пиредин образует с глшрилхлоридом внутрикогилекс-ное соединение пикрилпирадини?. пикрат, которы.': трудно сополимеризовать с вкншширвдином из-за стсрических ограничении.

Бторо.': путь: тршитрофенилирование поли-4-з;.м1лг.ирвдина (Г^ВТ) или лоли-С-метил—З-вкнилпирвдкна (ПКЗП) оказглся более удобным и был осуществлен с г.омо.'ыэ ,4,г)-тринитробензолсуль-гокислоты и пикриновой кислоты.

Синтезированные с помо.;ью 2,4,5-трккитро'ензолсуль}окислоты производные П43П и ПМВП Т!№-П4ВП к ТКФ-1Г.;ЕГ г. с ш те тированные из пикриновой кислоты пикраты П^ЕП и ПЧБП бмлг. изучена методами спектроскопии в УФ-области, КК-области, оптической области, ^Н-ШР - спектроскопии, вискозиметрии и хроматографии.

С помолью методов ¡'К-спектроскопки (РисЛ) и спектроскопии 2Н-ЯКР (Рис.2) показано, что в ТШ>-ПМЗГ1 и пи.-грате |]МШ происходит протонирование атома азота в пиридиновом кольпе полимера. При г,том по спектра!,! ^Н-ЯМР сигнал этого протона в ТНФ-ПМШ и пикрате ПМБП находится в области 8,5 к 8,55 ы.д, в.дейтзрироуанки диметклеульфокевде и нитрометаке соответственно, тогда как в

СмгИАА „

исходных полимерах этот отсутствовал. Б Ил-спктрах у ТНФ-^.'ЗП

и пикрата ПМЕП наблюдалась широкая полоса поглощения вблизи

2700 характерная для амкдного азота.

Оптические спектры пикрата ПИЗП, ТНФ-ПМВП и пикрата 2-меткл-5-гтилпирвдина б нитроыетане и диметилсулытоксвде (Рис.3) тождественны. При соотношении в синтезах в молях

пикриновая кислота) !2,4,б-трккитробензолсулъфо-|

1 * 1 "кислота • '

["ономеркое звено ПМВг] [монсмеряое звено ГИБЛ 1

С,,

• 'i

Gr^ià^n

■h

■ il ,i

ï 1 \kv

U^L^JHaUIÛ

................. ■ I ' I I I M ■ T I I

_Lt t

■л :

----— .......—.—

to 3CCO юао jko ira ta or1 i 'ne.т. КК-спсктр'! ПН?1! (a),

('. ) ., .Ter; о:.! ос; то л:., m с 1'!" ¿.С.:;.)

; А

-JL./

Ml

v-__>

1 У

yj'v'v_J

Р;-2.2. H-4MP сгл"тгг1 ПМРП (п)

тлта ГО18П '-,) :: Г :-'1'.:т.""(6) '

fCO

Я HU

Рис,;.. Оптические спектси и. УФ-спектры ПКШ (а), пикрдта таг; (о), Т1К>-ПМБП (•) it яияиата 2-метюг-5-этнлпир»щина (М b(CH¿)2S0.

-Г-

степень занесения синтезированного производного одинакова и

о

по результатам спектро?отометрии при сЯО им и анализа Н-ЯУР спектров составляла 18-19 />.

Полученные результаты свэдотельству:ст о тождестве пикрата ПМЗП и ТН'т-ПМВГ, аналогичные данные получены для пикрата ГИТ и ТЖ'-ПМВП, поэтому при дальнейшем изложении использовали только одно их название - пикраты.

Пикраты ПМЗЛ и П43П оказались сильными иммуногеняыи, вызывающими значительную продукцию антител, специфичных к гаптену 2,4,6-тринитросенилу, определяемую по титрам антител, по количеству антителообраэугсцих и розеткообрадующих клеток у мышей. Важно отметить, что иммуногенные пикраты П4БГ и П13П не содержат э своем составе природных соедкнени" или продуктов их деструкции, и до настовое" работы неприродные соединения с такими свойствами не были описаны в литературе.

2.Синтез конъюгатов бкчъего сывороточного альбумина с сополимером 4~в1лилпиридина и Ь'-ш'етил- '-винилпиоидиниг. бгогода и с полиакриловой кислотой, изучение их ,Ычико-хш;гсеск:,х спой;

Наличие антигенных свойств у пикратов ПМ№ и П4Щ, содер-гкацих г.олиг>лектролиты - иммуностимуляторы позволило предположить, что присоединение к ним слабо иммуногонного для миле Л бычьего сывороточного альбумина (БСЛ) способно усилить его им-г^уногенность.

этого синтеза был применен карбодиимидны.'; метод образования пептидно/ связи между карбоксильными группами 1АК или сополимера и аминогруппами белка ГСА. Реакцию проводили в водно? среде и использовали водорастворимы" карбодиимид: ^-циклогекои N -2-(-4-мор[ол1а)-г'тилкарбодишвд л-толуолсульГонат СО'Й). Ч-го-бы избежать образования пептидно'! связи неуду карбоксильными группами БСА и его же аминогруппами реакция осуществляли в две стадии: сначала активировали карбоксильные группы сополимера 4-винилпиридина и М-ацетил-4-винилпирвдини" бромида (СП) при рН Ь,0 , дотитровывали раствор 0,2 нЛ'аОН до 6,0 и только после этого добавляли БСА.

Седиментограшы реакционной смеси: СП, БСА и ЫД! после проведения реакции при рН 7,0 характеризуются унимодальным распределение:.: веществ с $0 единственного пика 4,0. ¿с ЕС^ и ¿с СП по отдельности равны 2,5 Св и 4,5 Св , а в смеси 5С 7.СА и 5С СГ: соответственно равны 2.7;: Св и 4,'¿~> Св. Таким образом, __

рэзультагц седиментации свидетельствуют о сиггязо аогплгата БСА-Ш о псшецьа КД1 (Рис.4).

Рис.4. Седиментогсаммц сополимера 4-т1Ш!лт<ои,цина и К-амстил-4-винилпиридиниП бсомида (СП) и ССА в ркз-.сюлекулярной смеси (СП+БСА\ их конъюгата СП-ГСАпши кЛ] / [ГCA] = I и их..конъгагата СЛ-ЕСА, при [Cl!j/|T>CAj = 2; полученные при ультрапентри,фугировании. Скорость вращения ротср'а 56 ООО об/мин, длительность опыта 4(5 мин.

Для активации полиакриловой кислоты (ПАК) с помочь» КД! использовали рН'3,0 , 4,0 , 5,0 и 7,0. Стадии Koiruiramni осуществляли при pli 6,0. Седиментограммы реакционных смесс после проведения реакции при рН 7,0 , когда активацию проводили при рН 3,0 , 4,0 , 7,0 характеризуются нал»гчиом ПАК, ГСА и конъюгата. При активации ПАК КДИ при рН 5,0 ка содкментограм-ыах присутствует только^ пик конъюгата (Pnc.ï). Поскольку ,прц комплексообразовании ПАК с БСА при рП 3,0 комплексообразованко ;г.1аот равномерны:! характер (.Чустасаев М.И., Колоса З.В,, 1Р31); а при рН 7,0 - коопзрстнБны;:, наяич;:а единственного па садшентограммах при рН 7,0 является доказательством синтеза конъюгата ПАК-БСА. В отсутствие КДИ на седкментограиме смеси 1!АК и БСА при рН 7,0 присутствуют два пгаса с £ •= 1,08 Св и ¡Ьс= 2,5 Св, отвечающие ПАК и БСА. После активации при рН 5,0 и конъюгироватш с БСА при рН о,0 на седиментограмт np:i рН 7,0 обнаруживается единственный пи:: с JyQ = 1,40&(Рис.5)

Для определения состава реакционной смеси после конкогац:»! и состава конъюгата применяли ме.тодк скоростной седиментации, гель-хроматогра^ии и электрофореза в полиакриламидном геле.

При проведения гель-хроматографии фракционированных образцов ПАК с и fô»r=I'I05 оказалось, что на графике гепз-ции ПАК не выходот с колонки компактным ск/матричным пиком, характерны»! для белков (Рис.6). Хроме того , коя№иниент г>лс-типшии ПАК й на порядок ниже, чем кооК'Шшент пкеткн-кции RCAC^o = 0,367. 7оптому, при нанесении реакционной смеси после конъюгации ПАС с ЕСА на гель-хроматограмме ПАК не обнаруживаемся, и на ной присутствуют только пики конъпгпта ПАК-ЕСА и ЕСА.

При проведении глектро/ореза в полиакриламвдном геле после конъюгации и исходной ГАК оказалось, что ПАл не прокрашивается стандартными красителями для белков (кумасси и др.). Если гель не обработать красителем, a после Фиксации трихло-руксусноЛ кислото'/: денситометрировать при 2С0 нм; ГАК, шея более низкий £ [>¿0*° чем БСА, такяс не обнаруживается на геле в присутствие FCA.

Поэто.\у, состав кончогата определяли методов сетл-^ентгион-ного анализа. Для ¡этого ТАК активировали ИДИ при рН 5,0, конь-югировали с равным объемом ЕСА так, чтобы [ГС/О / [ПА!{] составляло 1,2,3,5, 10, и центрифугировали реакционные смеси при рН 7,0 при скорости вращения ротора 55 С00 об/мин определяя константы седиментации пиков и их площади.

/я

■у»"

D.

г?э

fi S

/

fP\

\ •

~"~7Г"у, H si •je 34' *9 *f t* ♦<

Fr-a,"\, Гол ь-у.гсу л-ч г г x;•:г.л "л* f í'y « 50 осп (t>, ЕС*

и -v..: -¡лЧ-БУ С1 ti) на Ш гсло iüA-ui .'Йг.о-

пня К. .Скорое': глзцка 50 нл/ч^с^а о'/С-.и^м растоорег

Логос 0,05 H líH¿FOa:

à. А

1 А . ж

i \ ; ч

/ V

л X

Л a4 /V / \ у \ У ч

А V» , cr.f?/,-tru«

; \

X

F::c, 5. C.eqK'îarrorcarïiu ИЛИ, эквимолекулярной с.че-сн ||АК+ЬСл к их ноггуегата ШК-GCA з эквгаолякуляг-ном соотношении, получении^ при ультрагентрифугн-¡•.оважм. Сиогог.гь вташршм ¡«тора 50 ООО оо'/м'ин, длительчост:»'omrro 70 мши

Оказалось, что з нейтральной водной срэде растворы реакционных смесей седиментируют двумя пиками. Первый пик, соответствующий медленно седиментирую^ему веществу, является свободной ПАК, а второй пик - конъюгатом. Увеличение кониеи-трации белка (EGA) в смеси приводит к уменьшению площади первого пика и соответственно концентрации свободной поликислоты, а концентрация продукта взаимодействия возрастает. С увеличением концентрации ЕСА при [GCA)/{nAK] около 3, пик ГАК исчезает полностью, что позволяет заключить, что в конъюгате с одно 'л макромолекулой ПАК связаны 3 субъединицы LGA.

Конъюгаты бычьего сыворотчного альбумина с сополимером 4-виш1лпирццина и К-агетил-4-винилпирздиниЯ бромида и с полиакриловой кислотой оказались значительно более сильными им-муногенами, чем исходный БСА. Однако, для иммунологических • исследований О.олыпоИ интерес представляли конъюгаты и комплексы 2,4,6-трк штроТенилированного ГСА с ЛАК, поскольку »ти комплексы и конъюгаты содержат и ЕСА и гаятен - 2,4,3-тринит-рофенил.

2,4,6-Тринитро1*енил (ТНФ) могхко ввести в состав комплексов БСА:ПАК или конъюгатов ГСА-ПАК только вводя его в суб^еди-нииу ЕСА, т.к. только БСА содержит алплогруппы, способные к ковалентному присоединению 2,4,5-тринитро';енила. Однако, кова-лентное соединенно ПАК с БСА при помоги ИЛИ такте осуществляется через аминогруппы ".СЛ. Погтому из тринитрофеиилированного БСА, у которого часть аминогрупп не способна к присоединению ПАК, карбодиимвдным методом не удалось получить тройной конъ-югат ТНФ-БСА-ПАК.

Для его синтеза сначала синтезировали конъюгат БСА-ПАК, затек этот конъюгат выделяли методом гель-чро:.:атогра!'ИИ и три» нитро;*еншшровали с помощью 2,4,6-тринитробензолсуль$о<-'ислоты. Таким образом были синтезированы конъюгаты: ТЯФ^-БСА-ПАК, ТНФ16-БСА-ПАК и ТНФ19-ЕСА-ПАК.

Комплексообразовзние ме;гду ТНФ^-БСА, ТНФ^-БСА, ТНФ2~-БСА ¡г ПАК изучено методами вискозиметрии и седиментации. приведенная вязкость 1 ,,„/с для -:о:гплексов ЛАК :: ТНФ^-БСА, где х-=5, 17,25 равномернсГсшкается при увеличении ТНФХ-БСА / ПАК от О до I, затем ее значения практически не изменяются. Результаты седиментаиионного анализа растворов комплексов ПАК с ТНФ^-БСА, ТНФ|7-БСА, ТИФ2б-БСА при различные соотношениях fllAliJ/{tH05_2q ЕСА показали, что при [ПАК]/[ТИФд^-ГСА] = I наблюдалось унимодальное распределение седи-ентирте^их зе :еств, свидетольст-

тущоо об образ&вашш растворяли комплексов.

2. Комплексообразованив полиакриловой кислоты и бычьего сывороточного алъбумит п присутстглю ионов металлов.

Креме комплексообразовалия между полиакриловой кислотой и Cinibiît сывороточным альбумгяом из литературы известно, что •л ПАК и ЕСЛ образуют штлакси с искали двухвалентных металлов, Псгтоиу б-гло разухио предполоаитъ, что возможно образованна тройного полимер-ион металяа-белксгого комплекса в система ПЛК:''о+2:ЕСЛ.

¿ля изучает котлекезобразованш а системе PAK::îo+2îECA, гдз Мв+2 - Ва+2, Со+2", Zt+2, Си+2 и Сг*3, применяли методы вио-Koaii'îCTpiK, спд;5мен7™щн1, турЗцдныетрии и гравшзтрии.

Система ПЛХ:Ме+2:БСА существует как в гомогешюГ: , так и в гетерогенной 'орле. "psi добавлении растворов солей металлов к раствору ПАК и к -«кшаолз'.гуллрноя смеси ПА! с ЕСА при рЧ 7,0 '¿азовсо раздолениз происходит только тогда, когда ^-чпело карбоксильных гругп ПАК, приходящихся на I ион металла, достигает некоторых критических значений, принтом Х- 2-5 зависимости от природы металла.

'ри смезгаашш раствороэ ГАК и растворов соло" металлов, ;гсгда £ гХкр » вся ^ выпадает а осадок в вадв по-шюр-кетал-лического ко:.:плзкса8 окрзионного в цвет растворов солоч металлов. "рисутствиэ ЕСА в смеси в зависимости о? его концентраций частично или полностьй предотвращает 1азокое разделение.

¿авнеимость массы псадка в системе ilAXîMe^.'ECA от соотношения [есл] / !•'Aii] при Х = Х ¡;р0 • приведенная на рис.? , показывает, что .уникальное количество Золка, которое необходшо для предотвращения образования осадка, пр!п.!0рн0 одинаково для всех изученных яоиоа мзяаяяса, «■ ft,5-6,5. Следуем ьтыв^ить»

что зависимость массы осадка от'соотношения [ECAj/[nA4j при X" Хкр. нос!гг -"йстремалышп характер: три возрастании [гсл] / [!Ал]от 0 до 5,5 масса осадка сначала растет, достигает манси* i.ry%:a и равномерно снижается вплоть до полного растворения.Про-

1»асс комплсксообразования при X <tn зависит от природы ио»

■ср.

на металла,

л +3 roMorsmtoi: системе • ÏAK:Me*2, для Ме+2 - Ва+2, Со+2, Си*2 и Сг когда [»в+~] / [дк ] увеличивается от С до 0,"5, наблюдается сшйсШШЗ лривэденно'- вязкости: принтом максимальной кои» пахтизукце* способностью облйдает ион Си+'с, а минимальной -нон со+<\ добавление в систему ПА:<:.'.!е+2 ЕСА при [есл]/ [гА'(] ч равном I, , '3 приводит к некоторому увеличения вязкости и рас

- 13 -

• Ci,

Я Cc

. Б.,"

Ск

J*

LШ1

Рис.7. Зависимость массы осадка (/г в системе

riAKSIe^rECA при Ме+Г7[АК]= 5, рН=7,0 от [ЕСА]/[ПАК] ; где Ба+~, Co+t Ct+S, (V+2 и

; а [Ali] - мономерное звено полиакриловом кислоты.

I /

VoO ,/

й

¥

J i

0 ! Г

I

Q2 {7^5: 0/< Qf

PüC б Кркяая титрования ГШ Ш; ~ iOO ООО) ионами

CVJ

TEopscíocTi! траг!ного комплекса.

СедплонтахшонниП анализ системы ПАК:Ва+^:БСА для [лк]/ 100-5 и [eCAJ/ [ПАК]от I до 10 показал, что для \\к]/[Ва+2]= 5, унз^/одольноо распределение содимснтирующлх веществ соответствует [бСа]/ пак = 3. Поскольку э условиях седиментации исключено коиплакеоэбразованио ПАК с ЕСА, соотношение [«СД) ^АК) * 3 соответствует характерглзтнчзскому составу комплекса ПАЧ:Еа+" :ЬОЛ.

/ля троГноЯ cncTGi.nl РАК: Си4*: ЕСА обнаружено изменение строения коллоидна:'. "зстгци коиплэкса. Парадоксальная на первый гагляд зависимость рН емзеи ПАК:Сц+^:ЕСА (Fот соотношения [сСа]/[ПАК] ,тз"яется л!п:з;'.:шй: когда [ЕСА] /|"!ак] меньае 5, рН смеси mch-tüo 7,0 , а Когда [ЕСА] /[пак]болмз 5, рН стесп провшает 7,0 ; хотя вез компоненты птоЯ системы нейтральные ила слабокгздиэ. 3 образовании данной коллодию Я частицы участвуй? полканиси ~АЧ, кони Сц+~ и полкам'ГолгЛСА. ¿адисленке раствора при[ЕСА] /|ПАК]= 0-2 объясняется освобождением протонов при их ссмсн? на катион Си*" в ПАК или суб--.единипэ FCA. Увеличение основности коллоидно,": частицы при [ГСА)/[плк] = 0-10 мо.-сет происходить только в том случае, когда при комплексооб-тлзосшпгл в раствор обращен» основные группы, которые есть только у ЕСА, п они находятся на поверхности коллоидной частицы в еэ гнеию?: сфере, ¿апкц" результат свидетельствует о том, что в состалз троГлюго комплекса lAK:'!e+,i:rC^, кони металла связаны с карбоксильными грулпр,^и Г ЗА.

4. Иииунологкчасхив свойства синтезированных соединени'!. ¡¡.•••мунодогические сио'ства пикратов "4Б17 и ~?'.!зп определяли по количеству антнтзлообразувщзк клеток (АТОЧ), розеткооб-pa3jhoq:K клзтотс (FGK) к нагруженным 2,4,6-тринитро'еннлс).1 эритроцитам барина в селезенке м-мэ^ (C8Ax-~73T)J¡, иыиунизиро-запных внутргзеино , и по титрам антител (AT) при помоги реакции пассивной re?,-агглютинации (PITA).

Установлено, что пшграт Т.ЩГ1 и пикрат Г4ВГ облагают ярко зираденными антигенными свойствами, "аксимальные величины АТОК и РОК, а такие лгансималыше значения титров AT соответствоза-iv, дозе "СО мкг/мыль. Максиуальнио значения показателей иу-.¡унного ответа к пикрату Т.!ПГ и "4:Г достигается на 10-14 сут-после иммунизации.

Су ;ественно отметить, что пикраты " Ti и r' J но солергкат з своем составе природных биополимеров или продуктов кх цестоук-!НИ. ,~о настоя::е.: работы в литературе не были описаны подобные ?0!;ества, облачаю "не антигенными сво'ствами.

Рис. 9. зависимость значений мутности 12) ¿qq при pH 7,0 (Кривая турбидиметрического титрования) системг, "'AK: "^"'"j ЕСА для [Си+2)/[АК] 0,3ô (*); / [ак] - 0,4 (¿); |Cu+~J/ÍAK)- 0,48 (о) ; 1Си+2}/|ЛК] = 0,2 (О и зависимость

pH в момент смешивания DearoHTon от iПГ:л 1 /[ПАК] (г).

üc.íO. Гель-хроматограммц TP, ЫТ, Щ (Оелкоя пито-гсазмы меток микобактерий) в 0. О • 'I KKoFO,, - ÑaOH pu pH 7,2 на геле Tí К W-ÔI (ЯПОК-щ). -

'Лммуногенность конъюгатов ГСА-ПАК и ЕСА-сопелкмер 4-ви-нилпиркдина и >/-aue.TWi—^-винилпиридши" бромкла определяли после внутрибршинноЯ инъекции мыкам C57BI,:-'C3AxC57BI)Jj , C573I/g и (CB/\xCo7B2/g)?j в дозе 50-100 мкг/мкяь по количеству А ТОК в селезенке и по титра;,i AT в Н7ГА. Установлено, что максимальные значзния иммунного ответа достигались на 10 сутки после 1ммунизйции и его величина превышает ответ на ЕСА или на смесь БСА с полэлектролитсм в 10 раз»

Сравнивая числовые значения количеств АТШ, вырабатываемых в ответ на конъдгатн ТН^-ЕСА-ПАК, TH^g-ECA-PAK,.. THv^g-ЕСА-ПАК и комплексы ТН.уЬСА:ПАК, ТН?17~ЕСЛ;ПАК. ТН^25-БСА:РАК установлено, что и конъюгатн и комплексы являются сгльнкми к,;муно генами в первичном тмунном ответе, но у комплексов с ростом степени трлнитро^енилкрования х в составе ТН>Т>Х-ЕСА наблюдается более резкое увеличение количества АТШ; чем у кснъэгагов, при дозо иммунизации 50-100 мкгЛмзь по ТН^-БСЛ»

Таким образом, синтезированные соединения обладают выра-тенними гсл!уногент.ми свойствами, Снп значительно увелячгтаа-ют количество антнтелообразукяих клеток и антител в крови тсспериметальных животных. Показано, что пикрат П,?БП и комплекс БСА с ПАК обладают свойствами тииуснезависпмых антигенов, комплекс ЕСА с ПАК или с сополимером акрилош" кислоты и //-винилпирролвдона (//A3) потенцируют тдукцгла иммунояогп-ческо:' памяти. го--»ому, с помодьа синтетических т>ля-«лектро-лктоа-носигеявй возможно обойти Ir-remm:': контроль mwytnroro ответа и осуществить его (Генотнпическую коррекции»

5. Синтез ко?итсксов .н.конъюгатов .рнт.ягенов мтабаяте-РИ.УБГК: с а.

муногенности,

¿.ля иштеэа по^лекеоэ а конъюгатов аптягекоэ мятобак-тери:« 0$ бия» гйделена белковая фракция методом Теда (Б-Т) из ультразвукового дезкгеграта микобактери" и из оболочек мшюбаитернй при тялоцй экстракции Тритоном Х-ЮО - смесъ пептвдоглкканов (Т")» Т" бнл разделен на "ракцкп по молеку-лярно:'; массе при помозд! гелъ-хроматогра'-ии на сегадексе (г-2Сп, бати получены Фракции Т"1 СМоО ООО), Т~2 П по маркерам гель-хроматогра; ии от 57 ООО до 40 ССО) и Т~с (". по маркерам гель-хроматогратии от ¿"0 ООО до 12 ООО).

•То результатам гель-хроматографии на Т$л-Тоуореаг1 НМ—оО

препараты ТЭ гетерогенны, наиболее гомогенны-/ является Е~Т.

(Рте. Ю). ^

- it -

Для синтеза комплексов и коп-ногат ов антигенов -.■икобактери:"; Slpí были определены условия их комплексообразования с ПАК в зависимости от рН методом турбидиметрического титрования. Оказалось, что наиболее устойчивые комплексы ПАК образует с БПТ при рН 4,0-5,0 , с TS2 - при рН 7,о , ас Т53 - при рН 8,3-9,3.

Установлено, что при рН 7,0 TS образует прочны;! комплекс с ПАК ( ¡iy. 4-Ю5) при [?:-£]/[ПАК] = 3. Так £0 ПАК = 1,85, а 5с = по отдельности. При седиментации их смеси при соонокзкии [ТЭ2] / ¡ПАК) =3 на сецимснтограмме отсутствует пик ПАК, a ¿ с единственного ппкгисоставляет 5,40(Сп}.

Еыли синтезировали рквкмолс-куляргпга комплексы: ЕПТ:ПАК, ТЭ.-ПАК, ТЭ1.-Г.АК, Т32:ПАК, Т33:ПАК, а таете тропике интерметаллические комплексы: Е7Г:Си+2: T3¿:Cn+s"H ТЗ:С^2:УА5 0/А5 - сополимер акриловой кислота к Л'-ьинилпирролвдона, со-дер.;;ащий 50.» акриловой кислоты), В тропик комплексах соотношение [ЕПТ] (ТЗ, ТЗС) /JííAoJравно 2, и на 2 карбоксильные группы //АЗ приходился I ион Си+".

Конъюгати ГПТ-ПАК (ТЭ-11ЛК, ТЭ1-ПАК, Т52-ПАК, ТЗЗ-РАК) получали с помощью водорастворимого карбодиимида - //-циклогексил-К-2-(-4-мор:олил)-.->тилкарбодишида метил-^гтолуолсуль'оната. Соотношение(НПТ](ТЭ, ТЭТ, ТЗЙ, Т93)/ПАК в этих конъюгатах бкло оквимолекулярным.

¿ля изучения иммуногенности комплексов и конъягатов ГПТ, ТЗ, ТЭЗ, ТЗЗ, T2I с ПАК и //До уисеЯ линии CEA иммунизировали от им и комплексами и конысгатамп в дозе 100 мкгА-ышь. Череп дле недели после иммунизации "ивотпых -орачали вирулентной культурой микобактериг. е дозе 0,025 мг/ыгаь и определя-

ли титры противотуберкулезных антител по реакции пассивной гемагглютинации, показатели туберкулиновых проб в подучечуах лапок мышей и показатели селезеночного индекса.

Оказалось, что спустя 2 недели после иммунизации с помощью реакции пассивно:! гемагглютинации били выявлены невысокио титры антител в группах мыяеГ., получивших коггмогатн ЗПТ-ПАК, ГПТ-//лз, Т"-1АК. Через 3 недели после заражения на фоне развития туберкулеза титры антител выявлены у всех групп мше*, но наиболее высокие титры антител определены для конъюгатов 1АК и f/кЧ с БПТ, ТЭ1„ ТЭ2 и ТЗЗ.

Через 2 недели после иммунизации выраженные реакции в подушечках лапок у мыле? появились в ответ на введение конъггя-тов Ы17-ПАК, ЕПТ-М\5 и ТЗ-ЛАК, тогда как введение БПТ, T?, ПАК и М\5 не влияло на развитие реакции гиперчувствпч .льности за- 1В,.-

медленного типа (РГЗТки vïvï. Через 3 недели после заражения туберкулиновые пробы выявлены у всех иммунизировампдс швей, однако, они наиболее выражены у мыаей, иммунизированных конъ-ю тагами.

Значения селезеночного индекса возрастали параллельно с ■ РГЗТ на зронъкзгаты, тогда как после введения только 5ПТ или ПАК или Д'Аэ селезеночный индекс был невелик.

Таким образом, иммунизация коныогатами ЕПТ-ПАК, ЕГГГ-,\'А5 и ТЗ-ПАК вызывает выраженный гуморальный и клеточный иммунный ответ з организме экспериментальных животных, что и мобилизует защитный иротивомикробный иммунитет при последующем заражении вирулентной культурой.

Пгютективное действие конъагатов определяли по средней продолжительности жизни мызе Я СВА, иммуниз кро санных конъюга-тачи: БПТ-ПАК, Тг-ПАК, ТЧ-ПАК, ТГ2-ПАК, ТГ.-ПАК, T3-J/A5 в дозе 100 шш/мыаь и зараженных вирулентной культурой H3?Rv в дозе 0,025 ыг/мыяь. Контрольных мызеЯ не иммунизировала, но заражали культурой H3?Rv в той же дозе.

Установлено, что конъигат БПТ-ПАК и комплекс ЕПТ:См+2:?/А5 обладали:'.выраженным (140-143 Я) защитным действием в отношения вирулентной культуры ыиксбактерий H37Rv . Принтом сами ЕПТ, ПАК и NA5 протективным действием не обладали.

Исследование протективного действия конъюгатов ТЭ, T?I, Т£2, ТЗЗ с ПАК и ЙА5 показало, что они существенно разл!гчшотся по влиянию на туберкулезный процесс. Статистически достоверно продлевают жизнь къшей ТЭ-ПАК, Т-72-ПАК и Т.^КАо на 126 %, 121 129 % соответственно. Коньнгат ТЭ1-ПАК не проявил протективного действия. Конъагат Т?8-ПАК, как и 'комплекс Тг8:ПАК, содержащий антиген с накменысеЯ молекулярной массой, способствовали ускоренна туберкулезного процесса - сокращали жизнь животных, зараженных микобактериями H37RV(выживаемость составляла 93 ÍA. Ртот конъюгат, как и комплекс ТЗЗ:!1АК, не стимулировал выраженного антителообразования, не Еызывал развитие туберкулиновой пробы, замедлял развитие защитной гранулематозной реакции. В аналогичных условиях все ТЭ без ТТАК не защищали мыга^й.

По-видимому, антигены михобактерий ТГЙ и Т53 в клеточной оболочке, будучи связанны;.!!! с природными высокомолекулярными соединениями, проявляют различные биологические свойства.

Протективное действие комплекса БПТ:Сц*^: у мышей с Т-ле£ииитом определяли по српдней продолжительности жизни В-пщ:еЯ линии CEA, которых к»чунизировали либо ЕПТ в дозе ICO :-!тЛ!ыпь, либо ЕГГТ:Сп+2://А5, содержащим по 100 мкг/шяь, и

- И? -

и которым вводили по 2 ыг/.уш!Ъ уквс;* вакцины ГЦ?'. Контрольными 'были ü-лгши, которым вводили по 2 ыгЛишь вакцины Ell1:'.

Оказалось, что через 2 месяца после введения живо" вакцины НИ как контрольные (12 из 12) нокммушпированныа В-мыии, так и вакцинированные только EI7T (14 из 15) погибли от дпссе-минировашого процесса. 85 % нивотных (22 из 27), иммунизированию тройным комплексом ¡3nT;Ca+2sf/Aô гсгалксь кипы. Следует окотить, что введение; ЕПТ з ад:.ювакге Лрекнда (OAö ;:лл ÎLVÎ) в дтих условиях не обеспечивало Формярсвапая защитного гч^фекта.

Такш обролои, сиптсллгрогыпш". ïpoi-i:oU полшер.метгллический кс?.шлекс, содеркац;гЛ .бслкоптЛ антиген, cnocoucn защитить тпм---ктчиро ванных и восстановленных костным мозгом Т-де£иг'итных мкшо;! от летальной диссемшаыии пкзых с слабленных микобактерпй БЦИ.

ВЫВОД'.!

1. Впервые синтезированы пикраты П1ШИ и П4ВЛ, но содеркацие в своеи составе природных соединений или продуктов ж деструкции, способнее индуцировать высокий и специфичны" кммунны'1 ответ к гаптену 2,4, э-трчнитрос-енилу. Установлено тождество Т!!Ф-IUD1I, синтезированого из ПМЗЛ и 2,г$.,6-тркннтро5ензолсуль''о;'Ис-лоты, и пикрата ¡¡.'.1ВЛ, синтезированного из ПКБП и пикриновой кислоты.

2. Впервые синтезированы конъзгаты бычьего спзоротоодого альбумина с сополимеров 4-вхнклпирицина и К-аиетил—î-в'/нилпи-рндгашй бромида и с полиакриловой кислого:-'.. Определено, что

в конъгогате 5СЛ-ПАЧ на одну макромолекулу ПАК приходятся три субъединицы DCA, Синтез:фовшш тройные комплексы ТН\?Х-Г.'СА:РАК, где х=5,17,Р.й и конъигаты 'ГНФ -ЕСА-^АК, где y=6,15,J9.

2. 'Исследование комплексооб^азовшшя в системе ПАК:'!е+" :?СА, где Ме+ - Ва+''", С»"^, показало, что система может

быть гомогенно,! и гетерогенной.

Для гетерогенной "ормы характерно то, что при постоянной концентрации ионов Нэ+"количество осад::л с увеличением ¡ЬО"] / l'.'AK] от 2 до 5 не зависит от природы пена металла :: при [бса] / [пак] больче б происходит его полное растворение.

jjin гомогенной форин в системе 11АК:13а'"<::ЬСл обнаружено, что в комплексе на I ь-акрсиолокулу ГАК приводится 2 субъединицы ЕСА.

В системе 1Ж:Си+2:ВСЛ при [;u+2] / |ak] = 0,4 и О НО, при '

увеличении [ЕСЛ] / [ГАК] от 2 эд 6 происходит владение осадка, при [ЕСЛ] /[ :АК] больше 8 - его растворение с увеличение:: pH раствора. Таким образом показано, что происходит обращение коллоидной частпш троЛ;сго пол1п;ерметаллкчсского комплекса, в котором ион !.:од'.; связан с карбоксильной группоЛ БСА,

4. Исследования иммунологичнских свойств пиратов ПЧБП, ппкратов ГИВ'!, сттезировэкнкх контагатов ЕСА-сополимер 4-В',;!:ишгрид:г!а и Н-ацетил-4-мп1ЛЛ!тр:д;п!и:; бромида, ЕСА-ПАК, TJf^-БСА, ТИФ13-ЕСА-1ТЛК, ™19-БСА-ПЛК показали, что зсе обладает высокой антигенной активностью по количеству ДОК, F0K и титрам антктзл. '.¡ахс::му!,; иммунного ответа наблюдался на 10-14 сутки после иммунизации, а его величина близка к величине ic-^iyrawro ответа на сильны" -.имуноген ТНч^-ЕСД.

Синтезированы ксьп-.кгаты и комплексы :."ч-:обактзриалышх антигенов с ПАК и f/A?, которые стимулзгровал."! ггаерчувствителъ-ность замедленного т:ла г аптителообразовзлие. Ка ^кспери.:ен-тальной модели туберкулеза у мысе.: и модели БиД-диссемктпии у тнмзхтомироваикых мгпей обнаружено протективное действие ке.тьгагатоз ¡легобактзрнальных антигенов ГПТ, Т9, ТЗ? с ГАК и Ц\5.

Основное содор-ание диссертации изложено в следум'.к работах:

1. Петроз Р.З., Кздаков З.П., Хаитов P.M., илатова Е.Д., Алексеева II.Ю., Савинова Я.В., Кояикова Е.В., Воронцов Е.Д. "Лнтигонные свойства пикратов полиоснованиЛ"// Докл. АН СССР. -Ij77.-t.2w5.-;,"5.-c.IC60-I26o.

2. Петров F.3. Хаитов P.M., Иорлгов А.Г., Кабанов В.А., Пуста'аев М. , Филатова ".Д. "¡Ь-гмуногенность кон-уэгата, полученного путем ковэлентпоп сливки бычьего сывороточного альбумина с сополимером 4-эинилпирвдина и 4-вп;ил-//-ацетилпитн-дига.' бромида"// Докл..АН СССР.-;079.-т.249.-71. -С.С49-232.

Константинова H.A. Алексеева Н.Ю., ,'Платова E.J ., Лаврентьев З.В. "Сравнение антигенных своЯств ря"*а синтетических антигенов методом термистогра'.'ни" // микробнол., рпидемиот. и гамунобиол.-i."СО.4.-с. ЮГ-ICS.

4. Петров P.S., Кабанов ¡З.А., лаитов Р.'.!., Муста^аев !.!!., Портов А.11!. t Платова Е.Д. " 'оди "'/нация иммунного ответа при помощи антигена, связанного с непригодными полн^лектролитамк" // микробнол., г-пидемиол. и иммунобиол.-I !.-.'. "2.-с. >3.

- 21-

5. Абраызнко T.B,, Виноградов И.В., Кабанов В. А., Мустафа-ев М.И., Петров Р.В., Хаитов P.M., Филатова Е.Д. "Кммуноген-ность конъюгата бычьего сывороточного альбумина с полиакриловой кислотой". // 15. михробиол., онвдсмиол. и иммунобиол,-1933. -Ш.-с,86-89.

6. Абраменко Т.В., Виноградов И.В., Филатова Е.Д. "Водорастворимые полпмергомологи комллгксоз и конъюггтзь полиакриловой кислоты с бычьим сывороточным альбумином и их кымукогешость" // Тезисы докладов У1 Всесоюзного научного симпозиума "Синтетические полимеры медицинского назначения".-Алма-ата.-1983.-с.67-68.

'7. Романова P.C., Сацеева К.И., Норкмов А.С!., Филатова Е.Д. "1 "лаг/нс логические свойства глпкопептидов, выделенных из клеточных оболочек БЦК с помощью тритона Х-100".// Сб. научных трудов "Иммунодиагностика и иммунотерапия туберкулеза", -spytioc.-1935. -с. 47-ЬО.

8. Мустафаев М.'Л., Абраменко Т.В., Филатова Е.Д.."Методы связывания белковых антигенов с одноименно заряженными поли-мектролитами и строение образующихся имыуногенньк комплексных частиц".// Иммунология.-ISS5.-П.-с.53-60.

9. Романова P.C., Авербах М.М., Мороз A.M., Норимов A.IT., Филатова Е.Д. "Искусственные иимунизирукщие комплексы на модели туберкулезной инфекции".// Пробл. туб.-1958.-ü:5,-с. 49-54.

10. Мустафаев ".И., Коримо в А.Iii., Завгородний С.Г., Филатова Е.Д."Иммунны''1 ответ к 2,4,6-тршитробензолсульфокислоте 1гаптену1, включенную в растворимы"! полиглектролит-белковы'1 комплекс и его зависимость от япитолной плотности гаптена". // Иммунология.-1989.-ГА.-с.86-89.

11. чилатова Е;Д., Романова Р.Ю. "Комплексы и конъюгаты компонентов вакцины ЕЦН с полиахриловоГ: кислото" - перспективны! вакцинирующие препарвти г.рот:is туберкулеза''./'/ Тез. докл. IX Всесоюзного научного симпозиума "Синтетические полимеры медицинского назначения",-Звенигород.-I99I.-с.53«

К. Мустафаев М.И., Романова Р.Ю., Норимов А.Ш., Филатова Е.Д., Русак А.Ф. "О роли химической природы полимера-носителя в иммуногенности и защитном действии полиплектролитных комплексов антигенов клеточной оболочки микобактери" ЕЦЖ".// Иммунология.-1992„-!Р4.-с.28-31. ■ а

-ъСууЭЛ.ю? ¿Vt^

ЛШ «Пешг» 3«ь lût