Синтез, физико-химические и иммунобиологически свойства конъюгатов и коомплексов гантенов, белковых и микобактериальных антигенов с синтетическими полиэлектролитамми тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГО ОН

п а лг1 - , ,,

и и 1' ■ На правах рукописи

Сурикова (Филатова) Екатерина Дмитриевка

СИНТЕЗ, ФИЗИКО-ХИМНЧЕСКИЕ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОНЪЮГЛТОВ И КОМПЛЕКСОВ ГАПТЕНОВ, БЕЛКОВЫХ И МИКОБАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ С СИ 1ГГЕТЧЕСКПМИ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ

02.00Л0-биоорга1Н1ческап химс:», химия природных н физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москпа 1997

Работа выполнена и ГНЦ- Институте иммунологии Минздрава РФ ЦНИИ туберкулеза РАМН.

Научные руководители: доктор химических наук М.И. Мустафасв, доктор биологических наук РЛО.Ромапова.

Официальные оппоненты: доктор химических паук, профессор С.Е.Еснпов, доктор медицинских наук, ст. научи, сотр. Г.А.Игнатьева

Ведущая организация: Институт биорганнческой химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (Москва).

Зашита диссертации состоится «

в V^ часов на заседанпнн Диссертационного совета Д 084.68.01 в Государственном научном центре по антибиотикам (ГНЦА), по адресу: 113105, Москва, ул. Нагатинская, д.За.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦА. Автореферат разослан «

11 » ЯюбсуГЭ-Р. 19$Рг.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат медицинских наук

сел-1

СМ. Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

• Актуальность тета.Б 50-е годы билн с;:нтсз;грор.:уш лоли-ептцднка антигены, обладокщгтэ Iсягучост:„гулI гру-ел иии сЕо:1ства-:и. Было устоповлеио, что присоединение слабоил?уногенн1Ес он-? •игенор г. синтетическим поятаепт.'^дач-иоситоляы способно вшм-:ать суз^агвеиное усюк«и"» кмгунолог'.гческгл пяигиий. на лтигенн. Однако, ос тяпалось лотаг.;, играет ли ро.ть.з. птсч ■еноиено химическая природа досятеля, в кач*стм которого ис-[ользосали полклгптлди, белк;:, нуклеиновые кислот:.', полисах«-:эда, лкпополнеахареды л т.п.При' этом возможно, что х;шичес-:ая прасола носителя и на важна, а играет роль только его 'акроь:олояудяр«остк ...

К статсз:фуе>-:т.м ангзгенам, содеряэдш л своем составе [рироднкЯ сл»бшЧ члттггеп (АП.пред-ьяилЕэтся слсдуэтпвв трвбо-т'.ип: значительно* поагаснив ничукогекиости по срахнонта с (входным природам АГ пра-сохрашщна.спощ^ачиаояа к даинвыу 1Г; низшая токсичность сгатезкрова;пюго антигена и относительная стабильность при.физиологических условиях.

Гтим требованиям к синтвЭируемш антигенам отвечают кс-сусственныо антигени,. содержащие з качестве носителя поли-»лектролито: полиакриловую кислоту (ПАК), сополюгар ахрнло-зой кислота.а М-Бинидгпфролндска (Л'А5). поли-Л-винцлпиркцюг [П4ЕП), полц-2-мзтнл-5-пк!ГДлпирндин (ГТ.МБП), сополимер 4-ви-шдпириднна и. |\,-ацоти-4~р.тилпгф1{дцн!5;>..броинда (СП), и др. Зга полиэлектролатц.-образуют комплексы с белками крови: с зюорот.очныи альбумином и гаглгаглобулином;. устойчипнз .'»' ккс-юг* среде. .Одцр.кв, при переходе» я. йщкологичеекта.значануям' ?!1 7,0 г'7,2. »'.стабильность' зтях'.гсомпложсов енкчабтея. По*то-.*у, било необходимо ся1тззирова5ь.болез!Ъроч1ш9..ковплпптыио'" зоедшшнш. (кснългатн) таких белков с схнтоткчаеккш полгмзр-

ХгГА 19Д1уН0СТК1уЛЯТ0рЗЛИ, СПОСОбнМЭ ЗНЯЧИТгЛЬНО ПОВЫСИТЬ

4унвгеникз свойства »тих белков,........

.. Цзльо работы был сдатоз .копъюгатоз .гаптеноп, белкошк. и. .¡икобактериалышх антигенов с синтетическими полнглехтрохита-«•а и изучения их физнко -я:>с икастсх и жгг/нвбиологичясках ЗЕЗЙСТВ. . "

- 3 -

Научная. новизна.. Впервые сиытгзирозаны химические. сведи: нения: пихрат Л4БП и пшсрат.ПМШ, ни .сслоркацип. а своем сое ставе прзызаедных белкрв, полисахаридов, полипуклестядов или продуктов их дзегрукции, способные вызывать шшунный отват с отношении 2,4,6-тринитрофгнила у мышей.

Впервые синтезированы конъюгаты бычьего сшюроточного альбумина (БСЛ) с ПАК л сополимером 4-винштирвдина и fZ-аце-тил-4-винштиридиний бромида, способные индуцировать г-л.ун-ныя ответ у мышей, слабо отвечающих на ЕСА.

Влерзыс при изучении комплексообразования в системе П/иЧ:С«^+;БСА обнаружено явление обращения коллоидной мицеллы в водной фазе.

Впервые обнаружено протективное действие конъагатов ми-кобактериадьных антигенов с ПАК у ышей, заражеггных вирулентной культурой иикобактерий H37Ri/ и у тим^ктомкрованных ыы-пей, инфицированных микобактериями БЦд.

Практическая значимость. Разработаны методы усиления ш-муногенности слабых ю-олуногенов - БСА и антигенов шшобактер!; при конъюгировании их с синтетическими полимерными юдгунв стимуляторами,которые могут быть использованы для усиления имму-ногзнности и других слабых антигенов. Конъшгаты полиэлектркш: тов с разными антигенами клеточных стенок шшобактерий БЦК по разному влияют на туберкулезный процесс: ко.ныогаты с АГ с молекулярной массой от 40 ООО до 67 ООО оказывают защитное действие, а конъюгаты с АГ с молекулярной массой до 30 ООО усугубляет течение болезни. Г^от £акт можно использовать при раз работке искусственной противотуберкулезной вакцины.

Положения, выноскикз ка-задиту:

1. Способ синтеза пикрата ПМБП из 1Г.ЕГ и пикриновой кислоты и из ПМВП и 2,4,6-тринитробензолсулъ£окислоты, его физико-химические и антигенные свойства.

2. Способ синхеза ишуногенных конъюгатов ПАК-БСА и СП-БСА с помощью водорастворимого карбодгамвда.

3. Способ синтеза тройных конъюгатов ТНФ -БСА-ПАК путем тринитрофенилирования коныогата.БСА-ПАК и их иммуногенность.

4. Конъвгаты микобактериальных антигенов с ПАК индуцируют антителообразование, развитие ГЗТ (ггоерчувствительностп замедленного типа) и обеспечивают протективный эффект против вирулентных ылпобактерий R37P/ у муней и против ыикобактерий ЕИЖ у тшэктомированных иыпеЯ.

Апробация работа. Результата работа были доложены на !?се-сопзных совет:-..•ги.-пс Тт"?т»-т1Псскг? полт/»р: •/"у.-'-яигсяо«» -пазиа-чгнпя" (Дзерглс:с=;, 1,973 г.« Алма-ата, 1523 р., Здгыслрад, 1501 г,), .•»«'»•дчн«'" "'тлела Шгуяояогт чуб* ркулма РАМН.

Тл'бпухаг.ул. Пс- ^ссс^гацни г;-;-лино**. шс 1': ^¿-'.атных работ.

етгу^туга -"^точт 'л:!зт>.™ед*нил,

оозора лктеритугл*, л.-^ъп».. ;^чулмаг»>л (;, глаз),

глзпы "Материали и угт:дм", агллючелия, рмгляо* я спяска литературы. Работа »с- яд 14? Ж уаг.'>спнснсгс- текста, ЯУЖГ-.Я 13 7«Г>Л1'|.', 'л Г•-"•■}') 1Я5 СХгМ Л Ц-Л Ц>:ГН1.ойа?Т}'И/

ТО'-СТУКЛ •

ОСНОВНОЕ СОДЕШКЕ РАБОТЫ

Глава I крвдетазлявт собоЛ литературный о'зор сгоЯотв ги-сохеколекуляргкх дашуностчмуляторсв; яо.итгтт;^'«, ыолир'/пиро-вшшкх гаптеиами белпоз, а также сгатотических голиэлехтро^ч-тоз; методоп ¿ютеза конт-лгатоз и сзо^стз комплексов полиэлак-тралетой с белками; и синтгзирсззтпгх г.тчутгогпнов, содергсзщж полилле!{трол!ггн-д;м;лгсот;г?^ул,тгорт.

В глаге II обсуждаются результат:! ;то синтэзу и фтсико-хн-мичаскш свойствам пчкратов поти-4-а!"иишкрад;зт и полнй-и^-тил-5-вшилпир7Лк;а.

3 глава III сбеуздаугся результаты по синтезу конъагатов бичьего сизорото'п-ого адьбуггтка с сополгасрсм 4-вкнплшф:1ц!П1а и '.'-ацетил—брсмида и с полнакриловоЯ ккслотоП.

3 глав* 1У проведено сбг/угд^н'з результатов, получаггпхх при 1!ССЛ5Д02Ш,.:,.и кстлвчсообразогания полиакриловой кислота о <;*чьим скворотоплта адьбутзюм з арксутстятг исков наталлоз: Еа2\ Со2+, С/-3'" ч С.^'Ч

? глазе У сС-г.-хд.т-с': р;зул;,татк по :яучснкэ ¡^лулоггнио-с•/нтззирога.М/-:^ сслд.г«ап?..

В глазе 71 гпч>в*>д- чо р'т-ульп го.; жи? ч-г-?5: ч ло-

б-сайг гмч«ск;2г с.ят^я^ог-чнк-т: хг'п^гато?. *< то у ;:<»:■":.•»

антигенов мгагсба?.тер^! Б!!1"- с полг-акрилого!* кислотой ;; ссполи-мпрсм -гкрилззо.: кислот« л К'-япгллпирг'Ол.-'ДСиа.

3 гласа 711 иплояенн осноышв эксл еримен тал у'кв методы и матопики, испольрояаннке и разра^отаншз при вглтолиенни работ.и.

Работа посвацена экспериментальному подтверждению воз-мсшюсти :"енотипическо;. коррекции иммунного ответа при г.омо.'Л! синтетических полиэлектролитов. Оказалось, что присоединение гаптена 2,4,6-тринитро(?'енила (пикрила) к молекуле поли-4-вк-нилпиркдина или поли-2-метил-5-винилпирвдина превращает рти полиглектролиты в аитигени, способнее вшпзать у ¡тле'- значительное увеличение ентителообразукцих клеток (АОК) в селезенке к антител (АТ) в сыворотке крови.

I. Синтез пиктата поли-4-вшилп1говда;а и пикрата поли-.?-иетил-5-винилпитадина, их гк^кко-хтакчеекке и гел/уно биологические свойства.

Для такого синтеза воз;.:о:шы два пути: во-гервьа, можно три-нитро-Ьенилировать мономер и сспслимеризовать его с исходным мономером; во-вторых, мо:шо тринитрогенилировать уяе синтезированный полимер. В данном случае перш.: путь оказалсл не удобным, так как пирвдин образует с пикрилхлорвдом вьутрикогтлекс-ное соединение пикрилпирвдини* пикрат, которк.: трудно сополи-меризовать с вкниллирвдином из-за стсрических ограничении.

Второй путь: тринитросенилирование г.оли-4-е;-.' илпириг.ина (Г-4ВТ) или поли-2-метил->вшилпиркдина (ЛМЗП) оказался более удобньм и был осуществлен с помо.-ьп :;,4,г)-тркнитробензолсуль-гокислоты и пикриновой кислоты.

Синтезированные с помо ;ыо 2,4,5-тртитро'ен?олсуль|окислоты производные П43П и ПМВП Т11Ф-П4ВП у. ТКФ-ПМЗ": к синтезированные из пикриновой кислоты пикраты П'ЗП и П'ГБП ьЧ'лг. и.-учекы методами спектроскопии в УФ-области, пК-области, оптической области, ^Н-ЯИР - спектроскопии, вискозиметрии и хроматографии.

С помолыо методов ¡'К-спектроскопки (РисЛ) и спектроскопии 2И-ЯКР (Рис.2) показано, что в ТШЧШ1 и пипрате 1ТМЯ1 происходит протонирование атома азота в пиридиновом кольие полимера. При г,том по спектргм ^Н-ЯМР сигнал этого протона в ТНФ-ПМВП и пикрате ПМВП находится в области 8,5 к 8,55 н.д. в .де«тэрироаанк1 диметклеульфокевде и нитроиетаке соответственно, тогда как в исходных полимерах этот отсутствовал. Б ИК-спктрах у ТНФ-ПЧЗП и пикрата ПМЗП наблюдалась широкая полоса поглощения вблизи 2700 см-*, характерная для амвдного азота.

Оптические спектры пикрата ГГ:ЗП, ТКФ-ПМВП к пикрата 2-метил-5-гтилпиридина в нитрометане и д кме т ил су л ьто к с иде (Рис.3) тождественны. При соотношении в синтезах в молях

Пикриновая кислота] 12,-1,6-трпкитробенэолс

кислота

. -i-

oí. г»-!.

\

'i! !,. !Г !¡ \-л . ;s

''¡vaJ

p..s> %

Lili I'll!

. i1:1 Ч 1111 I I I I I « t I

líCj »ал K» CV1

!'¡1С

Л. ИК-снсктр-д ПЯ?П (в), ст'. 11МРП (r.ï .: ГНФ-ГТ:

»r-jrvoM ее:?о,--О С.--.)

, ! ;( Я | I I ,

-------------. 1- rJ- J

J

ж

, II V '

__AJVvy

Р/с.2. 2Н-.ЯМР CR-r ТГ»' ПМРП (n)

; л та Ш16П '-■) т:::-:1:.:т. ,

С2Н3)2ъС.

зсс

feo

Я «и

Рис.С. Оптические спектпы и У'Ь-спситры ПМПП (а), пикрата П^П (о), ТН^ПМЕП (•) и пик опта 2-метил-5-этилпирнднна (М в((Л^)2Ь0.

-Г-

с

степень замел;ения синтезировшмого производного одинакова и по результатам спектро?отомстрии при 3R0 нм и анализа ^Н-ЯМр спектров составляла 18-19 /.

полученные результаты свидетельствует о тсздестве пикрата ИБ! и ТНТ'-ЛМЕГ, аналогичные данные получены ел я пикрата и ТШ'-НШШ, поэтому при дальне"аем изложении использовали только одно их название - пикраты.

Лккраты ПМЗЛ и П43П оказались сильными ионогенами, вызывающими значителыгута продукцко антител, специфичных к ranTeijy 2,4,6-тринитросч)нилу, определяемо по титрам .антител, по количеству антителообразукщих и розеткообразущих клеток у мъыей. Важно отметить, что иммуноге;п!ые пикраты П4ВГ и ГТ1иЗП не содержат в своем составе природных соединен;)" или прбдук»ов их Деструкции, и до настоя^е" работы неприродные соединения с такими свойствами не были описаны в литературе.

2.Синтез тонъюгатов бкчъего сывороточного альбумта с сополимером 4-в1иилпиридкна и ^-агетшМ-винилпиритни;: бгомида и с полиакриловой кислотоЛ, изучение их гнзико-х??мпческ:,х ÇBOfli Наличие антигенных свойств у пикратов ¡IMPIÎ и П40П, содержавших полиг-лектролиты - иммуностимуляторы позволило предположить, что присоединение к ним слабо тшуногенного для мыле Л бычьего сывороточного альбумина (БСА) способно усилить его ш-муногенность.

этого синтеза был применен карбодиимидны.'; метод образования пептидно/, связи между карбоксильными группами 1АЧ или СО' полимера и аминогруппами белка ГСЛ. Реакцию проводили в водно Г1 среде и использовали водорастворимы" карбодиимцц; лМдеклогексд М'-2-(-4-моргТ.олйп)-ртилкарбодишвд л-толуолсуль^оиат С0"И).Чтс бы избежать образования пептидно'* связи меаду карбоксильными группами БСА и его же аминогруппами реакция осуществляли в две стадии: сначала активировали карбоксильные группы сополимера 4-винилпиридкна .и ^-ацетил~4-виииллирвд1:нн': бромида (СП) при рН о,0 , дотитровьшали раствор 0,2 нЛ'аОН до 6,0 и только после этого добавляли БСА.

Седиментограммы реакционной смеси: СП, БСА и ivïi! после проведения реакции при рН 7,0 характеризуются унимодальным распрз деление:.: веществ с й с единственного пика 4,0. ¿с ЕС\ и ¿с СП по отдельности равны 2,5 Св и 4,5 Св , а в смеси £>с ;.СА и 5 СП соответственно равны Z.7-': Св и 4.L'"i Св. Таким образом, _

рззультати содгзлонтацгл свидетсльствуит о сигтсло ::о:гагата БСА-СП о поиоцкэ КД1 (Рис.4).

Рис.4. Седиментогсажы сополимсра 4-вкнилпнпидина и ?,'-ацпт!1Л-4-винилшго!ЩИнкй бромида (СП) и ССА в пквгаолекулярной смеси (СП+БСА\ их конъюгата СП-ЕСА.пш [С']]/[Га]= I н их„конъюгата СП-ЕСА, пни lU!j/j/.-CA) = 2; пол ученные при ультрапенгри^упфо-вании. Скорость вращения ротсра 56 ООО об/мин, длительность опыта 45 мин.

Для активации полиакриловой кислоты (ПАК) с помощью гу'И использовали рИ'3,0 , 4,0 , 5,0 и 7,0. Стадии конъюгашш осуществляли при рН 6,0. Садиментограммы реакционную c.\feces после проведения реакции при рН 7,0 , когда активацию проводили при рН 3,0 , 4,0 , 7,0 характеризуются наличием ПАК, ГСА и кснъюгата. При акт1шации ПАК КПД при рН .3,0 на содиыентограм-ыах присутствует только пик конъюгата (Рис.£Г). Посколыг-,«ри комплексообразовании ПАК с БСА при рН 3,0 комплексообразоваты • глает равноыершЗ характер (Мустас.аев М.И., Белова В.В., 1Ш1); а при рй 7,0 - кооперативный, наличие едюгствениого nr. л на сздиментограмыах при рН 7,0 является доказательством синтеза конъюгата IIAK-БСА. В отсутствие КДИ на седиментограше смеси ПАК и БСА при рН 7» 0 присутствуют два пга;а с = 1,08 Си и 5>с= 2,5 Сз, отвечающие ПАК и ЕСА. После активации при рН 5,С и конъюгкрованим с ЕСА при рН о,0 на седиыентограм/ч при рН 7,0 обнаруживается единственный met с = I,<10Сз (Рис.5)

Для определения состава реакционной смеси после конъюгации и состава конъюгата применяли методы скоростной седиментации, гель-хроиатогратии и электрофореза в голиакриламвдном геле.

При проведении гелъ-хроыатограЧщ фракционированных образцов ПАК с и М|г=1'105 оначалосъ. что'на графике гсео-ции ПАК не выходит с колонки компактным симметричным пиком, характерным для белков (Рис,6). лрома того , коя№и!иент пхс-ткшшии ПАК ^ на п0рзд0к низе, чем коз'К-ипиент пкетш-кции БСАf^éo = О»^67, "^оптому, при нанесении реакционной сыеси после конъюгации ПАТ с ЕСА на гель-хроматограмме ПАК не обиаруяиваезся, и на ной присутствуют только пики конъпгата ПАК-ЕСА и ЕСА.

При проведении электрофореза в полиакрилачздном геле после конъюгации и исходной ПАК оказалосв, что ПАК не прокрашивается стандартными красителями для белков (кумасси и др.). Зсли гель не обработать красителем, а после Фиксации трихло-руксусно:\ кислото/. денситоыетрировать при 2С0 нм; ГДК', имея более низкий £ 2¿o'* чем ^СА, таске не обнаруживается на геле в присутствие ГСА.

Поэтому, состав конъюгата определяли лгэтодо'-г сетлментгион-ного анализа. Для зтого ТАЧ активировали КДИ при рН 5,0, конъ-югировали с равным объемом ЕСА так, чтобы [ГСА) / [ПАК] составляло 1,2,3,5, 10, и центрифугировали реакционные смеси при рН 7,0 при скорости вращения ротора Г35 ООО об/мин определяя константы седиментации пиков и ik площади.

-jV -

Fhc.ô. Гель->:соматограк*а ПАК ( М/. 50 ООО) Т>, С С/> (Щ и конъпгата плк-бсл (щ) на TiK геле 1117-60 .Япо-

ния). Скорость глошгл 30 мл/час; з бубегном гастгоро: ;,05 M К1ЙРОл - WaCH с 0,1 И ifafil, pli TtZ,

2

çt df

А / \ W

! \ ! ' U- --

1 ; ; ¿"'•7.7

, i « ' \ / • / Чч

/ i \ А V» .ài'-c^' , <JÏ/iïUtAn

r::c',,Vr ^влкмагго граммы IIAK, эквимолекулярной смеси IIAK+bCA и их конгюгата l'iAK-БСЛ d эквимолекуляг-ном соотношении, получении» при ультрагентрифть рованни. Скогость зташ£ния ротора 56 ООО о5/мин, длительность" опыта 7V мин.

Оказалось, что в нейтральной водной сроде растворы реакционных смесей седдаентируыт двумя пиками. Первый пик, соответствующий медленно седиментирукцему веществу, является свободной ПАК, а второй пик - конъюгатом. Увеличение концентрации белка (ЕСА) а смеси приводит к уменьшения площади первого пила и соответственно концентрации свободной поликислоты, а концентрация продукта взаимодействия возрастает. С увеличением концентрации ЕСА при {Ьсл)/{ГА'.{|около 3, пик ГЛК исчезает полностью, что позволяет заключить, что в конъюгате с одной макромолекулой ПАК связали 3 субъедикицы LCA.

Конъюгаты бычьего сьшоротчного альбумина с сополимером 4-вшшшйркдина и А/-а!'ети.ч-4-пикилп1грцднни!1 бромида и с полиакриловой кислотой оказались значительно Солее сильными им-муногенами, чем исходный БСА. Однако, для иммунологических исследований больаоН интерес представляли кошылгаты и комплексы 2,4,6-тр1:штро!,еш1лированного FCA с ЛАК, поскольку эти комплексы и конъюгаты содержат и FCA и гаптен - 2,4,3-тринит-рофенил.

2,4,6-Трш1итро^енил (ТИФ) могхко пвести в состав wnnev-сов НСА:ПАК или кош^огатов ГСА-ПАК только вводя его в су'г-оди-нииу ЕСА, т.к. только БСА содержит аминогруппы, способные к ковалентному присоединению 2,4,5-тринитро<;енила. Однако, кова-лентное соединение ПАК с БСА при помоги так*е осуществляется через аминогруппы ?.СА. По.-тому из триыггрофенилироьанного БСА, у которого часть аминогрупп не способна к присоединению ПАК, карбодиимедным методом не удалось получить тройной конъ-югат ТНФ-БСА-Ш.

Для его синтеза сначала синтезировали конъюгат £СА-ПА'<, затем этот конъюгат выделяли методом гель-чроматогра!'1Ш и три» н v;t рс'е ш их иро в ал и с поморья 2,4,й-тринитро<5ензолсу.и4а?ислотц. Таким образом были синтезированы конъюгаты: ТИФ^-БСА-ПАК, ТНФ16-БСА-ПАК и ТНФ19-ЕСА-ПАК.

Комллексообразовзние меггду TKf^-БСА, ТНф^-БСА, Tttf£--5CA ¡г НАл изучено методами вискозиметрии и седиментации. приведенная вязкость 1 г. л я --:о:шлексов ПА'С :: ТНФК-БСА, где х^5, 37,25 равномернсГсшпается при увеличении ТНф -БСА / ПАЧ от О до I, затем ее значения практически не изменяются. Результаты седимеитапионного анализа растворов комплексов ПАЧ с ТНФ^-БСА, ТНФ1?-БСА, Т11Ф26-БСА при различных соотношениях [ПЛК]/}ТНФ5.2(5] ЕСА показали, что при [Mi]/¡ТИФ^^-ГСа] = I наблюдалось унимодальное распределение сед'г-ентиру.'с^их ве :еств, свидетельст-

-II-

-"/•ígco on о.';рззЪ:.ллгш растворимых комплексов.

"гуплоксцобразогание полиакриловой кислоты и бычьего сывороточного алт^y.mn я присутствие ионов металлов.

!{ро?'0 -.сомллексоо ó разовая;!.'! /,;е;.:ду полиакриловой кислотой :i бычьим скьороточщк альбумином из литература известно, что •л ПАК и "OA образуй? ."о-^л-зксы с :xHr.wH двухвалентных металлов. По.—о'у 'м-о ра 17.110 предпояояг.гь, что зозивяно образование тройного полпмзр-ион мс-^лла-^е.-гогого комплекса в система

¿ля гау>?нил чеиМ'гясоабра^ованая з системе PAKsMe'^EQ,

о о i о о q q

гдэ Чо+<- - Вл , Go , 2" , Сц+" п Ст."4^, применяли методы шю-•(озг/етр:"", сдпмг^тпцки, -гурб!СИ2^етр:ах и гравиметрии.

Система Гт\;:.!е'1'',{ПСА су^естг-уот как а гомогенной , так и з гетерогенной 7or_v.c. "pit -,с5аилонки растворов соле.! металлов к раствору ПАК :< к ~нз!'лслс1сулярног; evoca ПА! с БСА при рЧ 7,0 •,'азовое разделения происходит только тогда, когда Д^-число rtap-боягклыпгс групп ПА:;, лриходйцихся на I ион металла, достигает некоторых -'ритпчесглгс значении, при-том Х= >- зависимости от npi^AU !.*ет:лла.

1pit схегпзгяии растг-орзв ГЛК и растворов соло" металлов, ;гогда £ =Х»ф » всл ^ акяадаст з зсодой в вця,о полимер-металлического комплекса, охраненного з пзет растворов есла'-> металлов. "рисутстзнэ ГСА п смеси з чависнмссти о? ого концентрации частично или полностью npassrnpa^aeí '-азовсо разделенно.

Зависимость ыяеси осадка з системе ^AjÍíMd^íECA от соотношения [ь'Сл]/ ["Ач] пРИд%ХКр8» пРмаданнал на рис.? , показывает, что мтниплиюо количество йеяка, которое необходимо дли предотвращения овразогзмая осадка, лршерио одинаково для всех »зленных íbüos металлов, - rí,o—Следует отмстить,

что зависимость :мссы осадка от'соотношения [г.СЛ] /[^A'Cj при = Хкр. И0С5ГГ -¡стремальны» характер: гри возрастании[fca) / 'Ал]от 0 до 3,5 масса осадка сначала растет, достигает максимума и равномерно снижается вплоть до полного растворения.Про-!'зсс комплсксообразосяния при X ¡tp не зависит от природы на металла,

^ +3 гомогенно/, системе • 'АК:'.:е+2, для ¡'е+2 - Ва+'", Со+2, Cv»+2 и Сг когда [•;e+2J / |дк j увеличивается от С до 0,."5, наблюдается CHtCs6U!!§ приведение • вязкости: при-том максимальной кой-лактизулце" способностью обладает ион Си+'~, а минимально:"« -"ОН Со+2. /.обавленна в систему ГА!<: 'Лг*2 ЕСА при [FCA]/[rAK]v равном 1,-/3 привод;;? к некоторому увеличения вязкости и рас

- 13 -

I

Рис.7. Зависимость массы осадка fti |/г v системе

nAKiMe^rECA при Мэ+П/[АК1 = 5, рН=7,0 от [ЕСА]/[ПАК] ; где Ме+П- Ьа'('~, С ¿7 С^, Cia+~ и

; а [Л!(] - мономерное звено полиакриловом кислоты.

Рис.0. Кривая титрования ПАИ (fty=iOO СОО) ионами

творпмост» трогнюго комплекса.

Сод'.агзнтациотшЯ анализ системы ПАК:Ва+^:БСЛ для Га!С)/(к1+^= 100-5 и ÍECa]/ [ПАК]от I до 10 показал, что для / [Ва*2) = 5, унтасдальиоо распределение седимснтирующих веществ соответствует [бСА] / ПАК о. Поскольку э условиях седиментации иснлаче-;:о коитлчасоэбтазовант ПАК с ЕСА, соотношение соотпзтстяует характергатичзско;,:у составу комплекса ПАК:Ва+" :ЬПА.

/ля троГзюй систол! РАК:Си+"":ЕСА обнаружено изкененио строения кстлоид'ю;: -сюгицы гсиплзкса. Парадоксальная на первый глгалд заг.ссгдасть рН егаси ПАК:Сц+2:ЕСА ( Рис. í?,S) от соотношения [ЬСД] /1иАК]яэяяется лгаеГлой: когда (есл] /|*ТАК] меныпе 5, рН смеси .чсп;т!о 7,0 , а Когда [DCA] /[ПАК)больше 5, рН с:.:еси прзвипает 7,0 ; хотя все компоненты птоЯ системы нейтральные или слабокисла. В о Зраз сван ira даниол коллоидно!! частицы участвую? полианисн "A4, ионы и полизм?олг.'ЕСЛ. Зшсисление раствора при [еса] / {ЛАК] = 0-2 объясняется освобождением протонов при их замене па катион Си+~ в ПАК или суб-единине ЕСЛ. Увеличение основности коллоидно,": частицы при [ГСА]/[ПАК] = 3-10 мопет происходить только в том случае, когда при комплексооб-разовлняи в раствор обращены основные группы, которые есть только у ЕСА, и они находятся на поверхности коллоидно:! частит в ее riiea'sî oí ера. ¿айны " результат свидетельствует о том, что з состава тройного комплекса 1АК:''е"ь":ЕС'ч, ионы металла связаны с карбоксильными грулпаии ПА.

4. Иммунологический свойства снктстгоованных соединений.

Иммунологические сво'ства пикратов "¿iy и ТВП определяли по количеству антпт-злообразумцих клеток (itTO'-í), розеткооб-разуощих клеток (РОК) к нагруженным 2,4,6-тринктро'енилсм эритроцитам барана з селезенке ,\п,ке>': (СБАх.Т73Т)3}, и? <? тун из про-лэших внутривенно , и по титрам антител (AT) при помо:;;и реакции пассивно;! геггагглютинации (PITA).

Установлено, что пикрат ТЯЗП и пикрат Г4ВП облагают ярко выраженными антигенными свойствами. "аксиальные величины АТОК и FOK, a Taiae уаксималы-шз значения титров AT соответствовали дозе мкг/лпль. Максимальные значения показателей иммунного ответа и пикрату Т!ГГ и "4Т достигается на 10-14 сутки после иммунизации.

Су ;ественно отметить, что пикраты ~ И и "" 'ЕЛ не содержат в своем составе природных биополимеров или продуктов их дестпук-">'«. Го настояте.. работы в литературе не были описаны подобные :й!;ества, обладаю-ие антигенными свойствами.

Рис. 9. зависимость значений мутности!) ^qq при р.'! 7,0 ^ ■ (Кривая турбвдиметричоского титрования) систс;.гг; ~!AK:'Vt": ЕСЛ для [С1Л+2)/[ЛК] 0,2.3 (*); [Сй*2] / [лк] = 0,4 (-О*, [Cw+~J / [ЛК] ■= 0,48 (о) [С.л+2]/[ЛК] - 0,2 í<0 и зависимость

pH в момент смешивания юеагентов от Infjl /[¡ТАК] (г).

Рис. 10. Гель-хроматограшы T?, ЕПТ, ЕЦ (белков цитоплазмы i-леток микобактерий) в 0, С • M KH9F0, - r/aOIÍ при pi! 7,2 на геле Tí К ftV-61 (ЯПОНИЯ). ¿ 4

-IG- ■

йммуногешюсть коггьюгатоз ГСА-ИАК и ГСА-сополтгор 4-ви-нилпирздина и ¿/-ацетил^-зшилпиридини* бромила определяли после внутрибрваияной инъекции мылам C5?BI,;-'CBAxC5?BI)Jj , С5731/6 и (СЗАхС57В1/5)?j в Дозе 00-100 мкг/мьиь по колтост-ву АТОК в селезенке и по титрам AT в РИГА. Усгановлено, что макс¡мальные значения иммунного ответа достигались на 10 сутки после )?м;.'унизашт и ого велггчша превышает ответ па ЕСА или на смесь ЕСА с полиг>лектролнтом в 10 раз.

Сравнивая числовые значения количеств АТОК, вырабатываемых а ответ на ко.тазгатн ТН^-ЕСА-ПАК, ТН^-ЕСА-ПАК, T}?vIg-ЕСА-ПАК и комплексы ТН.^-ЬСА:ПАК, ТН?1?-ВСА:ПАК, ТО;У-РСА;РАК установлено, что и «отвгата и комплексы являются силышми шцуногенздн в першином иыцушом стаете, но у комплексов с ростом степени трннитро^еннлнровштя х в составе ТК^Т> -ЕСА наблюдается более резкое увеличение количества АТОК, чем у конывгатоз, при дозе иммунизации 50-100 ет/;.шь по TIP^-ECA,

Таким образом, синтез тгрованннэ соедшения обладают выраженными иммуногенными свойствами. Они значительно увелпчпва-кт количество антнтелообразутаднх клеток и антител в чроаи г.кспэрнметальных пилотных. Показано, что пикрат Р"ВП и комплекс ЕСА с ПАл обладают свойствами тимуснезавиот.тых антигенов, комплекс ЕСА с ПАЧ или с сополимером акршюво.'4 кислоты и ^-вкнплпирролццока (УАЗ) потенцируй? индукции иммунологической памяти, ^о^'.огг/, с помодью синтетических газлп-чяеятро-лптоЕ-носителе:: возможно обойти Ir-генный контроле тедлупегог© стзета и осуществить его feHOTHmwecKyw коррекпкэ,

5. Синтез ко>.,плек'соп..и..кон^игатоз ентягенов штеебаяте--т:ил 'ЕЩ{ с стат^т-тостли.п^яд^лбятролптзйи.а пзугета.их.йа» :.?л:огенности.

аля синтеза кежкекеоз и кон-чогатов аиттчтов упкебак» термл ВЩ б»»лп г-цдэяггга белкоеая фракция методам Тода tE-T) мэ ультразвукового дезй&еграта микобзктери". и из оЗолочек ¡ШОбактерШ: При i экстракции Тритоном X-ICO - смесь

Пйнтидоглжаиов (Т-)» Т" йия разделен на -"ракцкп г.о молеку-дярно:: массе при пепощи гель-хроматогра^ии на се'эдексе <г-20°, были получены Тракцип Т~1 (.М'ЗО ООО), Т"2 С! гсо маркерам гель-хроматогра;ии от 57 ООО до 40 С00) и С! по маркерам гель-хроматогра:;ии от ¿0 ООО до 12 ООО).

'7о результатам гель-хро.\:атогра* ии на Т$л-Тоуоре.аг1 НК'-оО

препараты ТЭ гетерогенни, наиболее гомогенным является ЕТ. (Рис.10).

Для синтеза комплексов и кокыогатов антигенов '.•ккобактериГ; Бф) были определены условия их комплексообразования с ПАК в зависимости от рН методом турбидиметричоского титрования, Оказалось, что наиболее устойчивые комплексы ПАК образует с БПТ при рН 4,0-5,0 , с ТЙ - при рН 7,5 , а с 'Г33 - при рН 8,3-9,3,

Установлено, что при рН 7,0 образует прочныЛ комплекс с ПАК ( Гц- 4-Ю5) при [.ТЭ2}/[!!Л1:]= 3. Так С£ ПАК = 1,85, а ТЗ- = 4,2 по отдельности. При седиментации их смеин прп сооноиенип ['Г22] /|ПАК) =3 на сецьуентограмме отсутствует пик ПЛ5-Г, а ^ г гдшеагишэго тц.п.-состаил-'.тт 3,'40(Св]1.

Были синтезированы »»кек-?олс,!сулярг1аа комплексы: ЕГТ:РАК, Тз.-ПАК, таи ПАК, Т 32: ПАК, ТЗЗ:ПАК, с. тааае тройные интерс/е-таллическне комплексы: Е"Т:Су+": Н\5, Т52:Си"!"~ и ТЭ:Си"":^/Л5 (!/Л5 - сополшер акриловой кислота п Л;~ьинилпиррсшщона, со-дорьайция ЕЮ.С акриловой кислоты), В •¿'ро.'льк хомшнеох соотношение [ЕПТ] (Тз, ТЙ) /|КА5] равно 2, и на 2 карбоксильные группы //Ао приходился I кон Си+''.

Конъюгаты ГПТ-ПАК (ТЭ-ПАК, ТЭ1-ПАК, Т52-ПАК, ТЗ>ПАК) получали с помочью водорастворимого карбодшкида - //-циклогексил-К-2-(-4-1!ор:слил)-милкарбодишида метил-^гтолуолсуль'оната. Соотношение(НПТ](ТЭ, ТЭТ, ТЗ?, Т?3)/ПАК в этих конъюгатах бкло оквимолекулярным,

¿ля изучения иммуногенности комплексов и ко:П)Ягатов ГиТ, ТЗ, ТЭЗ, Т32, Т21 с ПАК к //А5 глтеЛ линии СЕА :мыунизировали этими комплексами и коныогатами в дозе 100 мкг/г.тшь. Через дло педели после иммунизации ■■квотных ".ора^аля вирулентной культурой ыихобактер:»'. Н37£,' в доте 0,025 мг/мсь и определяли титры противотуберкулезных антител по реакции пассивной гез.¡агглютинации, показатели туберкул:товых проб в поло,"мечтах лапок сшей и показатели селезеночного индекса.

Оказалось, что спустя 2 недели пост? иммунизации с помо-'ьч реакции пассивно:"! гемагглитгаацпи были выявлены невысокие титры антител в группах мышей, получивших конъюгатн 5ПТ-ПАК, ГПТ-/<Л5, Т'-ТАК. Через 3 недели после заражения на ¿юн? развития туберкулеза титры антител выявлены у всех групп мше!';, но наиболее высокие титры антител определен!: для конъзгатоз ЧАК и /Д5 с БПТ8 ТЭ1в ТЭ2 и ТЭЗ.

Через 2 недели после иммунизации выраженные реакции с подушечках лапок у мышэ? появились в ответ на введение коньпга-тов ЕПТ-ПАЯр Е'1Т-//А5 и ТЗ-ЛАК, тогда как введение ЬПТ, Т9, ПАК и //А5 не влияло на развитие реакции гиперчувствпт .льности

- 1Б„-

медленного типа (РГЗТ)й v'i4?. Через 3 недели после заражения туберкулиновые пробы выявлены у всех иммунизпро ванных ыьплей, однако, они наиболее выражены у мышей, иммунизированных конь-пгатами.

Значения селезеночного индекса юзрастали параллельно с РГ5Т1 на яоггькгаты, тогда как после введения только 5Í7? или РАК или b' А5 селезеисины;: индекс был невелик.

Такта образом, иммунизация коныогатами БПТ-ПАК, БПТ-АГА5 и ТЭ-ПАК вызывает выраженный гуморальный и клеточный иммунный ответ з организме экспериментальных животных, что и мобилизует защитный противоуикробныЯ иммунитет при последующем заражении вирулентной. культурой.

Протектигкое действие конъэгатов определяли по средней продолжительности жизни мьспей СЗА, иммунизированных кокъмга-тами: БПТ-ПАК, ТЭ-ПАК, T'I-ПАК, ТГ2-ПАК, ТТ.-ПАК, ТЭ-УА5 э дозе 100 мки/мыаь и зараженных вирулентной культурой Н37Я\/ в дозе 0,025 мг/мыаь. Контрольных мы^ей не иммунизировала, но заражали культурой H37R i/ в той лее дозе.

Установлено, что коиъвгат ВПТ-ПА1С и комплекс БПТ;Сц+2:?/А5 0блсяали::выражет!ым (КО-143 ?£) защитным действием я отноеэнйп В1фулентной культуры микобактериЯ H37Rv • Принтом сами БГГГ, ПАК и N'A5 протектиЕным действием не обладали.

Исследование протсктивного дейстзия конгюгатов ТЭ, Т?1, ТГ2, ТоЗ с ПАК и Нко показало, что они существенно различаются по влиянию на туберкулезный процесс. Статистически достоверно продлевают жизнь мыией ТЭ-ПАК, Т-Т2-ПАК и T?-WA5 на 126 %, 121 129 % соответственно. Конгэгат ТЭ1-ПАК не проявил протективно-го действия. Кошягат ТГв-ПА1<, как и'комплекс ТГЗ:ПАЯ, содержащий антиген с наименьшей молекулярной массой, спосо'бстзова-ли ускорению туберкулезного процесса - сокращали жизнь животных, зараженных микобактериями Н371Ж выживаемость составляла 93 Гтот конъюгат, как и комплекс TS3:!IAK, не стимулировал выраженного антителообразования, не вызывал развитие туберкулиновой пробы, замедлял развитие защитной гранулематозной реакции. В аналогичных услозиях асе ТЭ без РАК не защищали мкхсЯ.

По-видному, антигены мнкобактерий ТЭЗ и TS3 в клеточной оболочке, будучи связанны«! с природными высокомолекулярными соединениями, проявляют различные биологические свойства.

Протективное действие комплекса БПТгСи4"2: Ь'ХЪ у мышей с 'Г-леБкиитом определяли по сродней продолжительности жизни В-;л.т.ей лиши СВ.\, которых иммунизировали либо ЕПТ в дозе ТОО жг'мезь, япбо ЕПТ:Си+^:^"А5, содержащим по 100 мкг/мызь, и

- 12 -

ti которым медики по 2 мг/:.'1".::1, v,rao;' e гкцины ГЦ?. Контрольными 'были й-шаи, которым вводили по 2 мгЛолпь вакцины Eli'?.

Сказалось, что через 2 месяца после введения вакш!-

ни ЕЭД как контрольные (12 m 12) ногглтыпнроммиш; В-ыьли, ■¿ак и вакцинированные только ЕПТ (14 из 15) по:ч;1лп о? дкссо-мшированнэго процесса. 85 % ганзошьсс (22 из 27), -иммунизиро-EtHHiix тсо.'i-.it- ко'-'пл-оксок "•П.1 fM"*''-:.VA"> '•• глпигп лизм. Следуаг

, что ыч-дение Б'ГГ в «»^«ьэнгч ^¿.-еннда {ПдО ILM) в i'csi-ьмх tic o6c'cr:uUic...w защитного гмг£екта.

Так!1-; ;:'\1?е.:1,..ча■ 'К'.*;" ;

комплекс; есдсрсп::,:;-,!.белг,-:'и;'- i f.-,, и: Па.^^'гПЬ -г—

•noiai^^""-- и посстаноилсшшх i rvn^-f мозгом Т-десЬп'Ктиих иыао'-t от летально/, диссемшьсчи яп-дих ослаблении* микобакте^-ий нр.

' В i-i В ö д ::

1. Впервые синтезировал!! шгкратн ПМВП и П4ЕП, не содержала в своем составе природных соединении или продуктов их деструкции, способные индуцировать высокий и специфичны" иммушы'1 ответ к гаптену 2,4,о-тр*иитросенилу. Установлено то-здество ТПФ-I1MBII, синтезированого из ПМВП и 2,^б-тринитробензолсуль^окис-лоты, и пикрата ПМЗЛ, сштсзирозгннсго и> ПМВП и пикриновой кислоты.

2. Впервые синтезированы коныогаты бычьего сывороточного альбумина с сополимером 4-вхнплпиридипа и K-аиетил- 1-вииилпи-рцдиний бромида и с полиакриловой кислотой. Определено, что

в конъгогате 5СК-'.ТАЧ на одну макромоле!сулу ЛАК приходятся три субъединицц ЕСА. Сштезкроваш.* тройные комплексы ТНФУ-Г.'СА:ПА!{, где х=5,17,26 и конъпгаты Tfli> -'ECA-r,AK, где у=6; и">,1У.

2. Исследование коотлексоооразования в системе где Мс+ - Ба+'"', Co+2,i>+", Cu+i"; покпзапо, что система может быть гомогенно,-, и гетерогенной.

Для "отерогенной ,?орли характерно то, что при «остолшо'': концентрации иоиои Ие+пколи,гес,*5с or-.-ya с увеличением ¡1>С;"] / |'!'\К) оч 2 о не зависит от приводы «cia.xT» :: при 1БСА] / [((Ali] больде б

происходит его полное растворение.

Д.'|я юмогенной форан ь слсти^о ¡¡„л: обнаружено,

что л комплексе на 1 макромолекул,; !!Л! ;\'i 2 зуб-ьида-

ницн ЕСА.

Б системе ПЛК:См+2:ЕСЛ при / |ак) 0,4 и 0,48,при

увеличении [ECaI / [РАК] от 2 zo 6 происходит выпадение осадка, при |ЕСА] / ['1А1{] больше 8 - его растворение с увеличением pH раствора. Таким образом показано, что происходит обращение коллоидно;! частицы троЛюго полимерметаллического комплекса, в котором ион меди связан с карбоксильной группой БСА,

4. Исследования иммунологических свойств пикратов ЧМБП, ткратоп П-53'I, синтезированных конъягатоз ЕСА-сополимер 4-вгаилпириднна и М-аиетил-4-вжилпирццпШ1;; бромида, ЕСА-ПЛК, TW--GCA, ТИФ^-ЕСА-ПАК, Т1И1д-ЕСА-ПАК показали, что все обладает высокой антигенной активностью по количеству АОК, F0K и титрам антител. Максиг'ум иммунного ответа наблюдался на 10-14 сутки после иммунизации, а его величина близка к величию иммунного ответа на сильны" кммуноген ТНФ^-ЕСЛ.

5. С;мтез:грованы ксь-югаты и комплексы уко бактериальных антигеноз с ПАК и f/A?, которые стимулировали гиперчувствительность замедленного типа г. антителообразование. Ка экспериментальной модели туберкулеза у мызе.: и i/одели БЦ^-диссеминапии

у тим^ктомированных милей обнаружено протективное действие кон-логатов киксбактериальных антигенов ЕПТ, Т?, Т^С с ПАК и }1к5.

Основное содержание диссертации изложено в следуюлих работах:

1. Петров Р.З., Евдаков В.П., Хаитов P.M., raa-TODa Е.Д., Алексеева II.й., Савинова И.В., Кожинова Е. 13., Воронцов Е.Д. "Антигенные свойства пикратов полиосновани.':"// Докл. АН СССР. -1577.-т.^б.-;."5.-с.12б0-126Ь.

2. Петров F.3. Хаитов P.M., Норимов A.L':., Кабанов В.А., Пуста:аев М. , '-"Платова "Нммуногенность ко1гыогата, полученного путем ковзлептноп сшивки бычьего сывороточного аль-бумша с сополимером 4-винилпиридина и 4-винил-//-ацетнлпири-дини.' бромида"// Докл.АН СССР.-;07Э.-т.24Э.~;г1.-с.24Э-252.

о. Константинова H.A. Алексеева Н.Ю., ,'Платова Е.Д., Лаврентьев В.В. "Сравнение антигенных своПств ряда синтетических антигенов методом термистограгии" // микробиол., ппидемиот. и иммунобиол. -i ./60. -74.-с. ЮГ-106.

4. Петров Р.В., Кабанов В.А., Хаитов P.M., .'¡уста^аев !.!!., Норимов А.11ч, 'илатова Е.Д. " 'оди"ипация иммунного ответа при помощи антигена, связанного с непригодными поли->лектролитамк" //Ж. микробиол., рпццемиол. и иымунобиол.-I JSI.-ÜE.-c. 3C-3S.

- 21-

5. Абраменко T.B,, Виноградов И.В., Кабанов В.А., Цустафа-ев М.И., Петров Р.В., Хаитов P.M., Филатова Е.Д. "Иммуноген-ность конъюгата бычьего сывороточного альбумина с полиакриловой кислотой".// £. микробиол., спидемиол. и иммунобиэл.-1983. -PII.-с.86-89.

6. Абраменко Т.В., Виноградов И.В., Филатова Е.Д. "Водорастворимые полигергамологи комплексов и коь-ьвгатос яолкакрачопой кислоты с бычьим сывороточным альбумином и их иымуногенность" // Тезисы докладов У1 Всесоюзного научного симпозиума "Синтетическою полимеры медицинского назначения".-Алма-ата.-IS83.-с.67-68.

'7. Романова P.S., Фадеева Н.И., Нортон А.С1., Филатова Е.Д. "Иммунологические свойства гл1гкопептидов, выделенных из клеточных оболочек ELEÜ с помощью тритона Х-100".// Сб. научных трудов "Иммунодиагностика и иммунотерапия туберкулеза". - Трупа с. - 1935. -с. 47-ЬО.

8. Мустафаев М.И., Абраменко Т.В., Филатова Е.Д.."Методы связывания белковых антигенов с одноименно заряженными поли-слектролитами и строение образующееся иммуногенных комплексных частиц".// Иммунология.-IS86.-tri.-с.53-60.

9. Романова Р.Ю., Авербах M.Ii., Мороз A.M., Норимов A.L"., Филатова Е.Д. "Искусственные иммунизирующие комплексы на модели туберкулезной инфекции".// Пробл. туб.-1968.-S5.-с.49-54.

10. Мустафаев М.И., Корило в А.И., Завгородний С.Г., Филатова Е.Д."Иммунны" ответ к 2,4,б-тршитробензолсульфокислоте 1гаптену1, включенную в растворимый полиялектролит-белковы" комплекс и его зависимость от зпитопной плотности гаптена". // Иммунология.-1989.-с.88-89.

11. Филатова Е:Д., Романова Р.Ю. "Комплексы и конъюгаты компонентов вакцины EtpK с полиакриловой кисло то4 - перспективны! вакцинирующие препараты против туберкулеза".// Тез. докл. IX Всесоюзного научного симпозиума "Синтетические полимеры медицинского назначения".-Звенигород.-1991.-е.53,

Iii. Мустафаев М.И., Романова Р.Ю., Коримо в А.Ш., Филатова Е.Д., Русак А.Ф. "0 роли химической природы полимера-носителя в иммуногенности и защитном действии поли.члектролитных комплексов антигенов клеточной оболочки микобактери" ЕЦК".// Кммуно-ло гия. -1992, -5^4. - с. 28-31. • />

МП «П«ГВ1. 3«ь юл юа