Синтез фрагментов бактериальных полисахаридов, содержащих аминокислоты, соединенные амидной связью с уроновыми кислотами, и неогликоконъюгатов на их основе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. Н. Д. ЗЕЛИНСКОГО

На правах рукописи

УДК 547.458.27 435.057:547.466:542.951,1:542.952.6

КОНОНОВ Леонид Олегович

СИНТЕЗ ФРАГМЕНТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ АМИНОКИСЛОТЫ, СОЕДИНЕННЫЕ АМИДНОЙ

СВЯЗЬЮ С УРОНОВЫМИ КИСЛОТАМИ, И НЕОГЛИКОКОНЪЮГАТОВ НА ИХ ОСНОВЕ

02.00.03 — Органическая химия 4

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических »наук

Москва 1991

Работа выполнена в лаборатории химии углеводов Института органической химии им. Н. Д. Зелинского АН СССР

Научные руководители: академик Н. К- КОЧЕТКОВ кандидат химических наук, ст. н. сотр. А. Я- ЧЕРНЯК

Ведущая организация: Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи

в часов на заседании специализированного совета

К 002.62.02 по присуждению степени кандидата химических наук в Институте органической химии им. Н. Д. Зелинского АН СССР, 117913, Москва, Ленинский проспект, 47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ АН СССР

Официальные оппоненты: доктор химических наук А. И. УСОВ кандидат химических наук Н. В. БОВИН

Защита диссертации состоится

1991 г.

г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор химических наук

Н. я. ГРИГОРЬЕВА

Актуальность проблемы. Биологически важными компонента^ клетки многих петогенных н условно патогенных бактерий, определявших их иммунологические свойства, являются капсуля^ные и 0-антигены. В большинстве капсудярных и во многих,0-специФических полисахаридах присутствуют отрицательно заряменные группировки, наличие которых во многом определяет биологические свойства бактериальных полисахаридов. Отрицательный заряд может, в частности, обеспечиваться присутствием неуглеводных заместителей. В бактериальные полисахариды ряда инфекционных микроорганизмов в качестве неуглеводных компонентов входят остатки аминокислот, соединенные апидной связью с карбоксильной группой остатка уро-новой кислоты, причем иногда в нестехиометрическом соотношении. Подходы к химическому синтезу амидов уроновмх кислот с.аминокислотами практически не разработаны. В то же время разработка достаточно общего метода синтеза соединений этого типа является актуальной задачей, поскольку синтетические фрагменты бактериальных полисахаридов, содержащих такие компоненты, могут представлять значительный интерес для иммунохимических исследований.

Наиболее интересен синтез фрагментов бактериальных полисахаридов, еключаюших амиды »ммнокисдот с уронор-ыми кислотами, в виде гликозидов с функционализованным агликоном, допускающим нх последующее превращение в искусственные антигены Снеогяикоконы«-гаты). Неогликпконъюгаты сопопиперного типа, как было показано в нашей лаборатории, а также другими' авторами, могут оказаться полезными при изучении иммунохимии нр'-родных антигенов н при диаг ностике бактериальных инфекций.

Це!ь_£г^_п_ги. 1. Рлзряйгта эффективного подхода к синтезу амидов аминокислот с уроновыми кислотами в виде гликозидов с Фунг цнонализованным зг ликонои.

2. Синтез-фрагментов бактериальных полисахаридов, содержащих

- г -

аминокислоты, соединенные анидной связью с уроновыми кислотами.

3. Превращение всех синтезированных фрагментов в неоглико-коньюгаты сополиперного типа.

Научная новизна н практическая значимость. Исследовано использование яактониой функции для временной" защиты гидроксильных fpynn в уроновых кислотах, позволяющее получать частично защищенные производные уроновых кисяот.

Разработан эффективный синтез амидов аминокислот с уроновыми кислотами в форме гликозидое с функционализованным агликоном путем конденсации уроновых кислот с аминокислотами в присутствии 2-зтокси-1-этоксикарбония-1,2-дигидрохинолина (EEDQ).

- ^Предложен новый 2-азидозтильный агликон, содержащий предшественник аминогруппы. Продемонстрирована возможность использования Гликозидов с этим агликоном для получения неог ликоконыогатов со-• полимерного типа.

С использованием этих разработок осуществлен синтез моно- и дисахаридных фрагментов капсулярного полисахарида из Escherichia coli 06:К54:Н10, как не содержащих аминокислотных остатков, так и содержащих остатки L-серина и L-треонина, соединенные амидной связью с карбоксильной группой D-глюкуроновой кислоты, а такте синтез фрагментов О-специфического полисахарида Proteus mirafai1 is 027, содержащих остаток L-лизина, соединенный анидной связью с карбоксильной группой D-глюкуроновой кислоты.

Все полученные' фрагменты бактериальных полисахаридов в результате сополимеризации с акриламидом превращены в неоглико-коньигаты сополиперного типа, представляющие потенциальный интерес для иммунохимических исследований.

- w Структура и- объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Тликоаминокислоты. Типы связи аминокислота - сахар"), обсуждения полученных результатов, экспери-

ментальной части, выводов и списка цитированной литературы

/)л J

ссылок). Общий обьеи диссертации«4*.! страниц. В работе содерг жите я

dt таблиц и рисунков. Йпробация полеченных результатов. Материалы диссертации были доложены на VIII Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Тбилиси, 1987 г.), на конкурсе молодых ученых ИОХ им. Н.Д, Зелинского ЙН СССР (1990 г.) и представлены в виде тезисов на VI Европейскую конференцию по углеводам (Эдинбург, 1991).

Содержание работы Разработка подхода к синтезу ашдов уроновых кислот с аминокислотами была осуществлена в ходе синтеза неоглмкоконъюгатов на основе фрагментов капсулярного полисахарида уропатогенного штамма Escherichia coli 0б:К54:Н10, а также фрагментов О-специфичес-кого полисахарида Proteus mirab11 is 027. Выбор этих объектов связан с тем, что бактерии E.eoli и представители рода Proteus представляют большой интерес с медицинской точки зрения.

Углеводная цепь капсулярного полисахаридного антигена (антигена К54) уропатогенного штамма Escherichia coli'06:K54:H10 состоит из диса*ари»,,<ых повторяющихся звеньев: ■

-rt-=-

*3)-p-D-GIcprt-(l+3)-a-L-Rhap-(l^)-p-D-Glcprt-(l+3)-4-L-Rha-(l*

-В - --Б -=-

Преобладающая часть повторяющихся звеньев (85Х) в качестве боковых заместителей содержит остатки Гидроксиаимнокислот (L-серина и L-треонина -в соотношении 1:9), соединенные амидной связью с карбоксильной группой остатка D-глюкуроновой кислоты. Задачей настоящего исследования был синтез неогликоконьюгатов, включающих все возможные фрагменты этого капсулярного.полисахарида на основе двух перекрыеакшхм повторяющихся звеньев й и Б, а также моносахаридных фрагментов, содержащих О-глкгсуроновую кислоту и аминокислоты (фрагмент В).

О-Специфический полисахарид Prnteus mirabilis 027 построен более сложно. Поэтому s рамках данной работы, открывающей иссяе-

Д

L-rtla . .. - L-Lys

\6 lé *3)-а-[)~6ь1рЙ-а+3)-р-0-61срШс-(1*ЗН-0-61срй-(1+

16 14

Н2М(СНг)г0-Р=0 p-D-GJcpNrtc

Jh

дования в области синтеза неогликоконьюгатоа, включающих амиды уроловых кислот с аминокислотами, мы ограничились задачей синтеза Фрагментов полисахарида, содержащих остаток L-лизина, который, как было показано, имеет существенное значение для иммуно-химических реакций некоторых полисахаридов рода Proteus,- диса-харидиого фрагмента Г и моносахаридного фрагмента Д.

В дисахарчдных фрагментах й, Б и В аминокислоты образуют амиды с биоуроновыми кислотами, содержащими, кроме уроновой кислоты (81сй), остатки дезоксисахара (R.ha) или аминосахара ÍGlcNrtc). Следует подчеркнуть, что аминокислоты, нходящие в состав синтезируемых фрагментов й-Д, имеют е своих боковых целях фунциональ-ные группы. Они относятся к классам гидроксиаминокислот (Ser, Thr) и диэминокислот (Lys). Поэтому разрабатываемые на этих примерах подходы < синтезу подобных соединений должны, по-видимому, иметь достаточно общий характер. 1. Синтез ацетатов лактоиов Р-гексопиранозидуроновмх кислот и ceiier гненос- распитие яакюнного цикла, в них при икоголизе, В структурах выбранны* дисахариднмх фрагментов Б и Г бактериальных' полисахаридов присутствует остаток О-гяюкяроновой кислп-tw, содержавдй глнкозильный заместитель в положении 3. Для син-

теза таких дисахаридов необходимо синтезировать частично защищенные производные глюкуроновой кислоты со свободной 3-ОН группой. Нами был исследован новый подход к короткому (2 стадии) синтезу подобных моногидроксильных производных различных уроно-вых кислот, потенциально пригодных в качестве гяикозмлируегш компонентов, в синтезе олигосахаридов. Идея этого подхода заключается в образовании 6,3-лактона с одновременным аце'тияированием остальных гидроксильных групп уроновой кислоты. Селективное раскрытие яа'ктонного цикла при алкоголизе должно приводить к высвобождению одной гмдроксияьной группы. Синтез 6,3-яактона аллия-р-0-гл«копир»нозидуроновой кислоты \1) и его раскрытие при метзно-яизе были предложены в нашей лаборатории до начала данной работы.

В данной работе рассматриваемый подход к получению частично защищенных производных уроновых кислот был распространен на другие уроновые кислоты и другие спирты. В качестве объектов исследования были выбраны три наиболее распространенные О-гексуроно-вые кислоты с глмко-, галакто- и манно-конфигурациями. Нами отработан способ I ревращения алкилгликозидов этих моносахаридов в ацетилироваиные 0-гексопиранозидуроно-ь,3-лактоны, заключающийся в нагревании уроновой кислоты в уксусном ангидриде с последующим дозцетилированием в присутствии пиридина (в случае О-маннуроно-вой кислоты образуется смесь ь,3-и ь,2- лактонов). Были найдены условия селективного алкогояиза лактонного цикла в этих соединениях (в присутствии йсОМа или без него) различными спиртами (метиловый, беизиловый и аллиловын спирты). При этом освобождается одна гидрофильная группа и образуется соответствующий сложный эфир. Выбор именно эти*' спиртов дзет определенную гвпболу в планировании многостадийны* гннтрзпв с участием обрачуюшихся моно-гидроггильны.х производных, т.к. усажанные сложим? зфирм можно

расщеплять в различных условиях.

В ходе реакции алкоголиза наряду с раскрытием лактонного цикла протекают побочные процессы миграции О-ацетильных групп и 0-дезацетнлирования. Однако, заметное влияние на выход целевых продуктов, зти процессы оказывали только в" случае 6,3-лактона метил а-й-галактопиранозидуроновой кислоты (2). Соотношение между различными продуктами реакции в этом случае зависело от природы используемого спирта. В случае же аякоголиза 6,3-лактона с С-глюко-конфигурацие,, (1) основным продуктом являлось производное со свободной ОН-группой при С-3. Йлкоголиз смеси 6,3- и 6,2-лак-тонов (3) и (4) с Р-манно-конфигурацией приводил к моногидрок-сильным соединениям со свободными ОН-группами при С-3 и С-2.

СО,Н со co,R C02ft

a:rtc20,70°;b:йс гО/Ру,20°;с:MeOH,20°;d:ROH,йсОНа,20°(R=Me,Bn,Й11)

2. Синтез Фрагментов капсулярного полисахарида R54 Escherichia coli, содержащих гилроксиаминокислоты.

Синтез Фрагментов этого полисахарида сводится к осуществлению следующих задач. ■

1. Синтез незамещенных дисахаридных Фрагментов й и Б.

2. Разработка эффективного подхода к синтезу амидов уроновых

кислот и аминокислот на примере синтеза амидов глюсуроновой кислоты и гидроксиаминокислот (т.е. синтез фрагмента В).

3.Синтез дисахаридных фрагмгнтов А и Б, содержащих аминокислоты.

При синтезе Фрагментов й и Б в качестве предшественника. 2-аминоэти'льного агликона мы использовали М-бензилоксикарбонилами-ноэтмльный и 2-азидоэтильный агликоны соответственно, позволяющие генерировать свободную аминогруппу в достаточно мягких условиях каталитического гидрогенолиза. В этих условиях не должны происходить деградация остатков гяюкуроновон кислоты и расщепление амидной связи между остатками аминокислот и глякуроновой кислоты.

2.1. Синтез дисахаридных фрагментов А и Б. не содержащих аминокислот.

Дисахариднмй Фрагмент А был. синтезирован путем глнкознлирова-ния рамнозида (6) глнкозилбромидом (5) с последующем удалением защитных групп. Конденсация рамнозида (б) с гликозилбромидгм (5) в дихлорметане в присутствии трифлата серебра и тетраметилиоче-вины (ТММ) в качестве акцептора кислоты (-б5-*20°) вместо ожидаемого дисахарида (7) привела главным образом к ортоэфиру (9) (изомеру дисахарида (7)) с выходом 45'/. н небольшому количеству (13/0 «-связанного дисахарида (9) со свободной 2-ОН группой в остатке глюкуроновой кислоты. При 'повторении конденсации в отсутствие ТММ-(возможной причини образования ортозфириого продукт та) или при ее недостатке удалось выделить дисахарид (7) с невысоким выходом (21%) и значительные количества (53%) 3-0-ацетил-рамнозмда (10). В другом варианте гликозмлирования рамнозида (6) глнкозилбромидом (5) при катализе солями ртути (Нб(С'М)2+Н§Вг2) из нескольких использовавшихся растворителей наилучшим оказался ацетонитрив. Предварительное высушивание компонентов для глию-

зилироеания лиофнлизацией из бензола и абсолютирование растворителя с помощью высоковакуумной установки (2х10~3Торр) позволило

увеличить выход дисахарида (Z) до 75%.

со2мв согме

__ОЛс но обг о-\—о овг АсО е>е

(41

<5>

—о Ato оьа

(Me (<(о>

ОАс чО ОЙ1 ■ (2)

»-..rtgOTfl, ТИМ, СНгС1г, -65*20°; b: Hg(CH)2, HgBr£, MeCN, 20°

Таким образом, была создана гликозидная связь между остатком глкжуроновой кислоты и рамнозы. Следующий этап состоял во введе-нйи агликона с 2-защищеиной аминогруппой. В соответствии с. раз-

(21

co,R

н<

он

о он

R= Ойс с>(12) R= Вг ^*<13) R= 0(СН2)2№)2

еГ<И> R= 2, R1= Me 3(15) R= H, R1= Me g^(lÉ) R= C0CH=CH2, Ra= Me ^417) R= C0CH=CH2, R1= H

a:rtc20-rtcÜH-H2S04,4°; b: HBrVCH2Cl2,4°; c: H0(CH2)2NHZ, Hg(CN)2, HgBr2,MS 3rt,MeCN-CH2C12,20°; d: Me0Na,Me0H,20°; e: H2,10X Pd/C, Me OH, 20°; V: CH2=CHC0C1, Douiex 1x8 (HC0~),Me0H-H20,20°; g: ЫаОН, Me0H-H20, 4®

работанным планом с, (теза был осуществлен селективный ацетолиз метилбиозида (£), позволивший получить а-ацетат (11) с выходом

- э -

01/!. Для введения аглнкона в молекулу требовалось получить гли-козилбромид (12). При обработке раствором бромистого водорода в хлористом метилене при 4°С ацетат (11) количественно переходил в гликозилбромид (12), конденсация которого с 2-(Ы-бензилоксикар-бонил)аминозта.ноиом е смеси ацетонитрил-дихлорметан в присутствии смеси цианида и бромида ртути приводила к гликозиду (13) с выходом ь9У..

Из нескольких вариантов удаления защитных групп в различной последовательности наиболее удачным оказался вариант, в котором сначала удалялись 0-защитные группы, а затем вводился акрилоиль-нмй остаток. При 0-дезацилировании полностью защищенного дисаха-рида (13) раствором метилата натрия в метаноле был получен дез-ацилированный дисахарид (14) с выходом 62%. Для введения в агли-кон акрилпильного остатка требовалось деблокировать аминогруппу в агликоне. Гндрогенолиз дисахарида (14) над 10Й Рй на угле в метаноле в присутствии 1.1 зкв. йсОН привел к амннозтиягликозиду (15) (вы*од 60%), который Ы-ацилировали акрилоилхлоридом в водном метаноле в присутствии анионита в НСО~-форме. При этом выделили 2-агриламидоэтилгликозид (1ь) с выходом считая на за^ дащеннмм днсахарид (14). Омыление метилбиоуроиата (1ь) НаОН в водном метаноле привело к незамещенному фрагменту Н (в виде гли-козида (17)) с выходом 75%.

Таким образом, был успешно завершен синтез дисахаридного фрагмента й, не содержащего аминокислотных заместителей.

Для синтеза дисахаридного фрагмента б необходимо было получить гликозид О-глюкуроновой кислоты, содержащий МН,-груплу в агяиюне. Соглагно литературным данным глнкозилироваине 2-(Ы-бензилоксикарбонилямино)зтанола производным О-глюкмроновой кислоты С5) происодцт 1- пчрнь низким вытодпм. Поэтому в дянном глучя(> испольюн 1нир ?-(Ы-б<*нзияоксмгарбония)аминоэтильного яг -пикона ПрВДСТаВЛЯЩ'СЬ тиичым. Мм прилип»,мяч нпвый способ

введения аминоэтильного агликона в виде его предшественника с азидной группой. Гликозилирование 2-азидоэтанола гликозилброми-дог1 (5) при кипячении в ацетонитриле в присутствии Hg(CN)2 привело с выходом 44У. к смеси аноперных гликозидов (18) и (19) в соотношении 64:16 (данные ГШХ). С целью повышения стереоселек-тивности реакции и выхода p-аномера конденсацию гликозилброммда (5) с 2-азидоэтанолом проводили в среде 2-азидоэтанола при повышенной температуре (Hg(CN)2, 105°, 10 мин); в результате получили р-гликозид (10) с выходом ь9Х (примесь а-аномера (19) составила ZV. - данные ГШХ).

согме СОгН ср

I г\ ^

<íl> С2_о0Н (gf>0Ac

соамв со 2.Мг

t^ ¿-Л

■ Ас оС/

оАс ОАс

а: Н0(СНг)гН3,Н2(СИ)г,105о; Ь: НаОН,МеОН-НгО,4°; с: нсг0,7С°;

d: Ас. ?0/Ру,20°; е: Ме0Н,20°

Для получения производного гликозида (22) со свободной З-ОН группой мы воспользовались разработанным нами (см. раздел 1 ав-тоферата) эффективным приемом, заключающимся в образовании 6,3-лактонного цикла с его последующим избирательным алкоголиком. Необходимую для синтеза 6,3-лактона (21) свободную уроновую кислоту (20) получали при омылении мегилуронага (18) ШОН в вод ном метаноле. Лактонизация уроновой кислоты (20) под действием уксусного ангидрида привела к 6,3-лактону (21) с выходом 66л, считая на тр'иацетил^ликозид (1§). В результате избирательного иетанолиза лактонного цикла в гликозиде (21) получили моногид-роксильное производное (22) (выход 76'/.).

Следующий этап состоял в создании гликозидной связи между остатками рамнозы и глюкуро'новой кислоты. Гликозилирование глюку- ' ронозида (22) ацетобромрамнозой (23) е дихлорметяне в присутствии трнфлата серебра при -40-»20°С привело к защищенному дисаха-риду (24) с выходом 40Я.

Для завершения синтеза свободного фрагмента Б оставалось ввести в аглнкон дисахарида. с О-ацетильнмми зямятинш группами

акриламидную функцию, после чего удалить защитные группы. При

COiMe со2Н

А<-0 оАс At-0 oAt о А с. . цо он он

(23) ьС^ R= Мз ' <20 R= U3

с>(25) R= ЫН2 (28) R= NHCOCH=Crl2

(2£) R= NHC0CH=CH

г

a: rtgOTfl,TMM,MS ЗЙ,СН2С1г,-40ч20о; b: 10% Pd/C,Me0H,20°; c: CH =CHC0C1, Dow&x 1x8 (HCCL)tMeOH-H,0,20o; d: MaOH, MeOH-H.O, 4o

гидрировании азидоэтилгликозида (24) над 10% Р4 на угле получили аминоэтилгликозид (25). йцияирование аминоэтилгликозида (25) ак-рилоилхлоридом в этилацетате в присутствии поли-(4-винилпириди-на) привело к (2-акрияа.мидоэтил)биозиду (26).с выходом 44%, считая на пентаацетмлгликозид (24). При омылении пентэацетилбиозида (26) МаОН в водном метанол? был получен свободный биозид (29) с выходом 83%.

Таким образом, был успешно завершен синтез Фрагментов й и Б, не содержащих аминокислотных заместителей. Введению аминокислот в зги Фрагменты был посвящен спедующнй этап работы. 2.2. Синтез амидов Р-глюкуроновой кислоты и гидрокснаминокнглот (Фрагмент В).

Дня успешного введения остатков яНинокислот в дисачаридные Фрагменты й и Б, полученные в результате многостадийных синте-

зов, был необходим аффективный метод создания анидной связи между карбоксильной группой уроновой кислоты и аминогруппой аминокислоты. Этот метод был разработан нами на примере синтеза ами-доь аминокислот с 2-а8идозтилгяико»идом D-rлюкуроноеом кислоты (20).'При этом были получены фрагменты типа В.

Для получения амидов уроновых кислот с аминокислотами мы выбрали вариант метода смешанных ангидридов, в котором конденсации амино- и карбоксильного компонентов проводят в присутствии 2-зтокси-1-атоксикарбония-1,2-дигидрохинолин_1 ^EEDQ), хорошо зарекомендовавшего себя в химии пептидов.

В результате конденсации кислоты (20) с частично защищенными производными L-серина и L-треонина (29а и 296 соотв.) в присутствии EEDQ в ДММ при 20°С были получены амиды (50а.б) с выходами 93 и 99% соответственно. Следует итметить, что при использовании эквимолекулярных количеств амино- н карбоксильного компонентов (как это часто практикуется в пептидном синтезе) полная трансформация карбоксильного -компонента (20) не достигалась. Это может быть связано с участием аминокоипонента (29а.б) в побочном процессе образования уретана. Данное направление реакции начинает играть значительную роль при появлении стерических затруднений у карбонильной группы остатка карбоновой кислоты в смешанном ангидриде, промежуточно образующемся из карбоксильного компонента (20)- Поэтому при проведении конденсации мы использовали избыток аминокомпонента <1.5 зкв.).

Получение нами амидов (ЗОа.б) с высоким выходом (90-100%) выгодно отличается от описанных ранее немногочисленных примеров синтеза подобных соединений, выходы которых не превышали 50%.

"После успешного образования амидной связи между карбоксильной группой уроновой кислоты и аминогруппой аминокислоты необходимо было-ввести в «гпикон акриламидный остаток. Гидрирование азидов

(50а.б) над 10У. Р6 на угле привело с выходом, близким к количественному (95-10050 к соответствующим 2-аминоэтилгликозидам, которые ацилировали акрилоилхлоридом в водном метаноле в присутствии анионита в НСО~-форме. со*Н

¿7*4 +

да«-/ к

он

(20) (29а) й= СН2ОСМе3 (Ь^ег)

(296) СН(Ме)ОСМе5 <1_-ТЬг> (296.) 1?= (СНг)4МНС02СМе3 (Ыуз)

2.

н

соа/н он

^ /(ЗОа-в) К= как и для (29а-в). Н3 , СМе3

>(31а-в) 1?= то же, (1Н2 , Р.г= СМе, С >(32а-в) ¡?= то же, йА= МНС0СН=СНг , 1?2= СМе/ А МЗЗа-е) I?1* ЫНС0СН=СН2 , Кг= Н; (а) 1?= СНг0И (ЬЗег)

(б) СН(Ме)0Н (Ь-ТЫ)

(в) (СН2)4КН2 (Ыуз)

а: ЕЕ00,0МГ,20о; Ь: Н2,10У. Р<^/С,Ме0Н,20о; с: СН2=СНС0С1, Оомех 1x0 (НС0~),Ме ОН-Н20,20°; Л: ТГй,20°

Из амида (306) с выходом 92'/. получили акриламидное производное (326). Из производного серина (30а) с выходом 85У. получали 2-ак-риламидоэтилгликозид (32а-Р: из реакционной смеси с выходом 14% был выделен также минорный Е-изомер (по амидной связи ^гликона, 52а-П). Структуры этих изомеров обсуждаются в разделе 4 автореферата. Далее мы работали с основным 2-изомером (32а-1).

Последний этап синтеза фрагментов В заклинался в удалении защитных групп с аминокислотного остатка. Обработка трет-бутиловых зфиров (32а,б) трифтсруксусной кислотой привела к полностью де-

блокированным амидам (53а.б) с выходами 91 и 99Х соответственно.

Таким образом, применение ЕЕСО для полумения амидов аминокислот с уроновчми кислотами в виде гликозидов с функционалнзсван-нмм агликоном весьма эффективно. Использование трет-бутиловых зфироо для защиты аминокислотного остатка позволяет легко перейти от первичных аддуктоз к полностью деблокированным соединениям. Для синтеза других аминокислотных производных уроновых кислот, описанных в зтой работе, были использованы условия конденсации и деблокирования, отработанные в ходе синтеза Фрагмента В. 2.3. Синтез дисахаридных Фрагментов. замещенных гидроксиамино-кислотами.

Наличие акриламидной группировки в агликоне из-за возможности спонтанной полимеризации может осложнять проведение последующих трансформаций. Возможность использования двух различных подходов к получению целевых структур (т.е. акрилоилирование до или после введения аминокислотного остатка) может давать определенные преимущества в синтезе. Дня сравнения этих двух подходов в реакцию с производными гидроксиаминокислот (29а,б) фрагмент й вводился в виде 2-акриламидоэтилгликозида (17), а Фрагмент Б в виде. 2-азидозтилгликозида (27), который был получен с выходом 91% в результате омыления полностью защищенного метилового эфира (24).

Конденсация кислоты (27), содержащей азидну» группу в агликоне, с аминокислотными производными (29а.б) привела к соответствующим амидам (Зба.б) с выходами 85 и 92'/.. В результате конденсации (17) с (29а.6) в присутствии ЕЕОО получили амиды (ЗДа.б) с выходами 73 и 95'/.. При помощи препаративной ВЗШК на силикагеле (34а) был разделен на два компонента (в соотношении 2:1) (54з-1) и (34алП.), являющиеся 2- и Е-изомерами по амидной связи е агликоне (см. раздел 4 автореферата). Далее мы работали с основным г-изомером (34а-1).

Как и в синтезе моносахаридных фрагментов В, образование амидов ди сахар иди ых производных с аминокислотами прошло эффективно. Следующий этап заключался во введении акриламидкой группы в производные (36a.fr) и деблокировании всех полученных соединений. В результате гидрирования 2-азидоэтилглнкозидов (Зьа.б) над 10% Рс1 на угле были получены соответствующие амины (37а.б) (выходы 95 и

СОгЙ1

И

о ОН

, х(34а.б) ^ СМе3 Н(35а.б) Н

Н&Х С0„г/

СО.ыи н

(а? мг9*5>

^-{ N04-{

НО он он

ь ^-(Зба.о) Р^- Н3 , Р,г= СИе3

(а) Р>= Н (1.-5ег) с ЪМ37а.б) МНг , Кг= СНе?

(б) й= Ме (1_-ТЬг) ^ ^(ЗОа.б) МНСОСН=СНг , ' Рг= СМе,

^(ЗЗа.б) ИНСОСН=СНг , Рг= Н

а: ЕЕО0,ОНГ,2О°; Ь: Н2,10% Р()/С,Ме0Н,20°; с: СНг=СНС0С1, Помех 1x8 (НСО~),МеОН-НгО, 20°; <1: ТГй, 20°

76% соответственно), йцилирование (37а.б) акрилоилхлоридом в водном метаноле в присутствии анионита в НСО~-форме привело к 2-акриламидоэтилгликозидам (Зба.б) с выходами 90 и 51%, 'считая на азиды (Зба.б). Деблокирование полученных амидов (34а.б) и (30а.б) трифторуксусной кислотой привело с выходами 9ь-100% к свободным дисахаридным фрагментам й и Б (35а.б и 39а.б соответственно).

Таким образом, был осуществлен синтез дисахаридных фрагментов

й и 6, содержащих аминокислоты, в виде 2-акрияамидоэтиягяикози-дов. I

3. Синтез Фрагментов О-специФичеекого полисахарида Рг^ецз ййгаЬШв 027.

3.1, Синтез амида Р-гяккопиранозидуроновой кисяоты и 1-яизина (Фрагмент Д).

Одна из задан, дяя решения которой был предпринят синтез Фрагмента Д, состояла, в проверке возможности сополимеризации с акрияамидом мономера со свободной е-аминогруппой лизина.

0 результате конденсации уроиовой кислоты (20) с производным 1.-лизина (29в) в присутствии ЕЕОЯ с выходом 82% был получен амид (ЗОв). Гидрирование 2-азидоэтилгликозида (ЗОв) над 10а Р<) на угле привело к амину (З^в), Ы-акрилоилирование которого акрилоил-хлоридом в водном метаноле в присутствии анионита в НС0~- Форме дало 2-акриламидоэтилгликозид (22в). Деблокирование (32в) действием трифторуксусной кислоты количественно привело к свободному амиду 2-акриламидоэтил-р-0-глыкопиранозндуроновой кислоты с лизином (33§.) в виде соли с трифторуксусной кислотой. Тем самым «ыл завершен синтез фрагмента Д.

Сополимеризацич (ЗЗв.) с якриламидом протеи яла без осложнений (см. раздел 5 автореферата), структура сополимера (59) подтверждалась данными 11С-9МР спектра. Поэтому мы приступили к синтезу дисахаридного фрагмента Г.

3.2. Синтез дисахаридного Фрагмента Г.

Гликозилирование оксазолинами - самый короткий путь синтеза

1,2-трзнс-связанньи гликозаминидов, однако при попытках гликози-лированич моногидроксильного производного гишкуроновой кислоты (22) 2-метил-.(3,4,ь-три-0-эцетил-1,2-дидезогси-'-'Ч>-г лl^l|'OПИpaнo)-t2,l-(^ .1~2-оксазолином в присутс!вии Т^ОН нам не удалось выделить ожидаемый дисахэрид (45). Гликозилирование в присутствии 1.5

зкв. ТМЭЗТИ также не привела к образованию дисахарида (45); из реакционной спеси с выходом 35?! был выделен 3-0-триметилсилило-вый эфир гликозил-акцептора.

Поэтому мы применили более эффективный гликозил-донор - гли-козйлбромид (40) с Ы-фталоильной защитной группой. Гликозилиро-вание акцептора (22) в присутствии Н§(СМ)г в ацетонитриле привело к целевому дисахариду (41) с выходом 2УН. Для осуществления более эффективного гликозилирования относительно малореакцмоно-способной 3-ОН группы в (22) качестве промотора был использован трифлат серебра. Гликозилироваиие (2£) гликозилбромидом (40)

в присутствии й£СПТ1, 2,4,6-коллидина и молекулярных сит ЗА в' дихлорметане при -30->20°С привело к тому же дисахариду (41) с выходом 69%. ,

а: Н£(СН)г,МеСЫ,20°; Ь: 2,4.6-коляндин,МЗ ЗЙ,СНгС1г,-30"»

20°; с: К1а0Н,Ме0Н-Н20, 4°; Ы^'Н^.ЕЮН, Л; йс20,Ме0К, 0°

После создания гликозидной связи между двумя маносахаридными остатками было необходимо заменить М-фталоильную защитную группу на Н-ацетильнун' и удалить остальные защитные группы. Опыление. (41) МаОН в водном мтаноле привело к биоуроновой кислоте (42) в «иде На-соли, которую без сыделеиия обрабатывали гидразин-гидратом в условиях, использующихся для удаления М-фталомльной группы. Образовавшуюся при этап аминокислоту (43) (в солевой форме)

о

3

с I (43) (^й^^Н, (?*= Ма *(44) (гг^К^Н, Кг= Йс (45) Р=йг= Йс, И, й5= Ме

М-ацетилировали действием уксусного ангидрида в метаноле. После обессиливания на Биогеле Р-2 (пиридин-ацетатный буфер, рН 6.5), обращенно-фазовой хроматографии на колонке с Силасорбом 06 (0.4Й трифторуксусная кислота) и ионообменной хроматографии на ДЭ^З-Сфероне (ацетатная форма) с суммарным выходом 51?! (считая на защищенный дисахарид (41) с фталимидной группой) получили дисаха-ри^ (44) в виде свободной кислоты.

Синтезировав биоуроновую кислоту (44) в виде 2-азидозтилгли-козида, мы фактически получили фрагмент Г, не содержащий аминокислотного заместителя. Следующий этап состоял в образовании амидмсй связи между карбоксильной группой (44) и «-аминогруппой I-лизина. Конденсация кислоты (44) с частично защищенным производным 1_~ли?нна (29в) в присутствии ЕЕСС? в условиях, применявшихся нами в синтезе других амидов с аминокислотами, привела с выходом 62У. к амиду (46).

Далее в агликон полученного защищенного фрагмента Г (соединение (46)5 необходимо было ввести акриламидный остаток. Б резуль-

Н^СОг.К1

/ (сн^та.

гОИ СОИН , а /-0 Ьоо.л

(М + (29£) — (он >->

НОЧ-( И9Ч-(

/>/НДс ои

Ь 5^(47) К= ИЙг , СИе3 , Р.г= СО^СМе 3 с0,(49) Р= ННСОСН=СНг> Р-1= СМе ? , йг= С02СМг5 ¿<С(49) КНСОСН=СНг , р^,Р2= Н

а: ЕЕПа,ОМГ,20°; Ь: Нг,Ш/. Ра/С,Ме0Н,20°; с: СН2=СНС0С1, Ооюех' 1хй (НС0р,Ме0Н-Н20,20°; 4: ТГй.ЗО0

тате гидрирования азидоэтилглмкозида (46) над 10'л Рй на угле получили аммноэтилгликозид (4?) (выход 15У.), который был подвергнут М-зцилировлнии> действием акрилоилхлорида в присутствии энип-

нита в НС;0~- форме. Продукт акрилоилирования был разделен при помощи ВЗШК на три изомера (подробнее сп. раздел 4 автореферата); выход основного г-изомера (48-1) составил 60%.

Для получения дмсахарчдного фр'с нта Г, готового к сопояипе-ризации с акриламидом, оставалось удалить защитные группы с аминокислотного остатка. В результате деблокирования основного 2-изомера (49-1) действием трифторуксусной кислоты получили свободный фрагмент Г в виде 2-акриламидоэтилгликозида (49). 4. Спектральные характеристики (2)- и (Е)-изоиеров 2-акрияами-дозтилгликозидов.

Как уже было упомянуто при обсуждении синтеза фрагментов й,' В и Г, аминокислотные производные 2-акриламидоэтилгликозидов (32а), (34а) и (48) образуются в виде смесей изомеров. Эти изомеры был я разделены хроматографией на силикагеяе (иногда ВЭЙ1М) и охарактеризованы при помощи спектроскопии ЯИР; отличия между изомерами наблюдались только в области сигналов агликона. Спектральные характеристики (химические сдвиги 8ц и бр, КССВ меаду е'ицинальными протонами) основных (соответственно минорных) изомеров рассматриваемых соединений были близки между собой. Это дало основание предполагать и сходство конформаций всех основных' (соответственно минорных) изомеров между собой. На примере амида (32а) были определены конформации основного и минорного изомеров.

В эксперименте по 430 основного изомера (32а-1) предобяучение любого из протонов при двойной связи не привело к усилении! сигналов протонов СН^М-группы. Рассмотрение молекулярных моделей приводит к выводу о том, что такое отсутствие ЯЗО могло быть только в г-изопере, в котором все протоны двойной связи удалены от протоков СНгК-группы. Однако, на основании имеющихся данных невозможно сделать выбор между з-цие и 8-транс изомерами.

При предоблучении протона Н^ (но не Н^ или Нм) акриламидной

,СН=СН2

ну»?» Г 1 ,, н* н Н

(ЕЭ-в-цис (Е)-з-транс ^-в-цис/в-транс

(§) = остаток сахара

группировки в минорной компоненте (32а-Н) наблюдался ЯЭО на протонах СН2Н-группм. Это свидетельствовало о пространственной сближенности указанных протонов, что возможно только в Е-в-цис изомере.

2-Геометрия главных изомеров 2-акриламндозтилгликозидов согласуется с известным фактом большей стабильности (на 2-3 ккал/ моль) г-изомеров амидов. Именно эти изомеры (с "нормальными" спектральными характеристиками) и наблюдались ранее при синтезе 2-акриламидоэтилгликозидов.

5. Синтез неогликоконькгатов сополимерного типа на основе синтезированных Фрагментов.

Завершающий этап работы состоял в превращении синтезированных Фрагментов в неогликоконъюгаты сополимерного типа, необходимые для иммунохнмических исследований.

Все синтезированные нами фрагменты й-Г бактериальных полисахаридов были получены в виде 2-акриламидоэтилгликозидов. Эти фрагменты, как не содержащие аминокислотных остаткив ((17) и (26)). так и содержащие остатки аминокислот 1,-серина ((33а). (35а) и (32&))> 1--треонина ((336). (356) и (396)) н 1_-лизина ((ЗЗр) и (42)) были превращены в сополимеры (§0)~(52) в условиях радикальной сополн.меризации' с акриламидом при инициировании радикального процесса персульфатом аммония и К,М.М'.М'-тктраметил-

зтилендиамином по стандартной методике, использовавшейся и ранее в нашей лаборатории. Сополимеры были выделены из реакционных

соын2 сшн2

I I

юснгснгмноосн=снг + СНг=СИСОМНг -> -[(ОН2СН)^-СН2СН-(СИ2СН)у ]-

I

С0ИНСН2СНг01?

(50) К= р-0ЧНсРЙ-(1*3)-л-1--РЬар-(1+

(§1) (?= <1-1-РЬар-(1*3)-р-С-е1срЙ-(1-»

(52) 1?=

(53) (?= р-0-61срй-[6(Н)Ч--ТЬг]-(1-КЗ)-<1-1_-РЬар-(1+

(§4) К=

(§5) р= а-1-РЬар-(1+3)-р-0-61срЙ-Сб(Ы)-1-ТЫ 1-Ц-*

(56) Р= р-0-51срЙ-[б(Ы)-и-5ег]-(1+

Р= рЧН^срй-ГйМЫ-ТЬгЫ!*

(58) 1?= р-0--61срНйс--(1*3)-р~0-о1срЙ-[б(Ма)-1--1-уз1-(Г

(59) р-0-61срй-[б(Ма)-1-1уз ]-(!■*

смесей гель-хроматографией на Сефадексе 6-50; выходы составили 0О-5ОХ. И5 данных 15С-ЯМР спектроскопии следовало, что незамещенные остатки акрчламида и остатки, Н-замещенные углеводами, входят в состав сополимеров в соотношении « 10:1. Это соотношение следовало из интегрирования сигналов углеродных атомов агликона (0СН2СНгШ, 5-40 м.д.) и углеродных атомов петиленовых групп полиакриламидчон цепи (-СН-СН?-, Е» 35-37 м.д.) в 13С-ЯНР спеитрчх сополимеров. Отношение этих интегралов дает дол» остатков акриламида (в мцльч.Я), несущих углеводный заместитель, в полимере. Из этой величины легко рассчитать требуемое соотношение .

Планируется использовать синтезированные неогликоконъксаты в в имм^нохипическнх исследованиях и изумить возможность их применения в качестве диагностических препаратов. Часть соединений (на основе фрагментов Г и Д) передается на биологические испытания в Институт микробиологии (г.Лодзь, Польша). ' ВЫВОДЫ

1. Исследовано использование лактонной функции для временной защиты гидроксильных групп в уроновых кислотах, позволяющее получать частично защищенные производные уроновых кислот.

2. Разработан эффективный синтез амидов аминокислот с гликози-дами уроновых кислот путем конденсации в присутствии 2-этокси-1-зтоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина.

3. Предложен новый 2-азидоэтильный агликон, содержащий предшественник аминогруппы. Продемонстрирована возможность использо-

j

вания этого агли'кона для получения неогликоконъюгатов сополипер-ного типа.

4. Осуществлен синтез фрагментов капсулярного полисахарида Escherichia coli 0б:К54:Н10, как не содержащих аминокислотных остатков, так и содержащих остатки L-серина и L-треонина, соединенные амидной связью с карбоксильной группой D-гяюкуроноеой кислоты.

5. Осуществлен синтез фрагментов О-специфического полисахарида Proteu3 mirabilis 02?, содержащих остаток L-лизина, соединенный амидной связью с карбоксильной группой D-глюкуроновой кислоты.

ь. Все полученные фрагменты бактериальных полисахаридов превращены в неогликоконьюгаты сополимерного типа. Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Кононов Л.О, Синтез и избирательный алкоголиз ацетатов D-гек-сопиранозидуронояактонов // Тез. докл. на VIII Всех. конф. по химии и биохимии углеводов.- Тбилиси.-1997.-с.60-61

2, Черняк Й.Я., Кононов Л.О., Антонов К,В. Синте? и селективный

алкоголиз ацетатов лактонов D-гексопиранозидуроновых кислот // Изв.ЙН СССР, Сер.хим.-1983.-N7.-с.1660-1667

3. Черняк й.Я., Кононов /1.0., Кочетков Н.К. Синтез 2-акриламндо-зтилгликозидов 3-0-(р-0-глюкопиранозияуроновая кислота)-аЧ.-рам-нозы и 3-0-<«-1-рамнопиранозил)-р-0-глюкопирйнуроновои кислоты и сополимерных искусственных антигенов на их основе // Биоорган, химия.-1988.-т.15.-N10.-с.1394-1410 '

4. Chernyak fl.Ya., Kononov L.O., Kochetkov N.K. Synthesis of carbohydrate-amino acid conjugates related to capsular antigen K54 from Escherichia coli 06:K54:H10 and artificial antigens therefrom // Carbohydr. Res.-1991.-v.2/£.-f>.3& 3c?i?

5. Chernyak fl.Va., Sharma G.V.M., Kononov L.O., Radha Krishna P., Rama Rao ¿I.V., Kochetkov N.K. Synthesis of glycuronamides of amino acids, constituents of microbial polysaccharides, and their conversion into neoglycoconjugates of copolymer type // Glycoconjugate J.-1991.-v.S

6. Chernyak fl.Va., Sharma G.V.M., Kononov L.O., Radha Krishna P., Levinsky A.B., Rama Rao A.V. Preparation and use of 2-aiido-ethyl glycosides in the synthesis of neoglycoconjugates// abstracts of VI Europ. carbohydr. conf.-1991.-Edinburgh (Great Britain).-Abstract

A. IS

7. Chernyak rt.Va., Kononov L.O., Kochetkov N.K. Synthesis of neoglycoconjugates related to capsular polysaccharide from Escherichia coli 06:K54:H10// Abstracts of VI Europ. carbohydr. conf.-1991.-Edinburgh (Great Britain).-Abstract

Институт органической химии им. Н.Д.Зелинского йН ССОР Заказ Объем 1 п. л. Тира* .100

Типография ЖСиС, ул. Орджоникидзе, 6/9