Синтез и изучение свойств липодипептидов для самоорганизующихся систем доставки функциональных генов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Буданова, Ульяна Александровна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2008
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
03455361
На правах рукописи
БУДАНОВА УЛЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА
Синтез и изучение свойств липоднпептидов для самоорганизующихся систем доставки
функциональных генов
02.00.10 - Биоорганическая химия
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
О 5 ДЕК 2008
Москва 2008
003455361
Работа выполнена на кафедре химии и технологии биологически активных соединений им. H.A. Преображенского Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова
Научный руководитель
доктор химических наук, профессор Себякин Юрий Львович
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАМН Северин Сергей Евгеньевич
кандидат химических наук Константинова Ирина Дмитриевна
Ведущая организация:
Московская государственная академия ветерипарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина
Защита диссертации состоится 22 декабря 2008 г. в ч на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр. Вернадского, 86. С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru
Автореферат разослан __ ноября 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета
кандидат химических наук старший научный сотрудник
А.И. Лютик
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время катионные липосомы активно используются в качестве невирусных систем доставки генетического материала в клетки. При этом нуклеиновая кислота в комплексе с липидами защищается от неблагоприятных воздействий среды и обеспечивается её активный транспорт через плазматическую мембрану. Однако относительно низкая эффективность и высокая токсичность отдельных представителей синтетических медиаторов трансфекции стимулирует активный поиск новых амфяфилов.
В общем виде синтезированные к настоящему моменту катионные амфифилы можно разделить на четыре группы: производные диацилглицерина, холестерина, полиаминов и четвертичные аммониевые детергенты. В последние годы в качестве перспективной основы систем генного переноса в экспериментах in vitro рассматриваются алифатические производные аминокислот и пептидов. Они способны самостоятельно формировать в водной среде бислойные агрегаты, обладают низкой цитотоксичностыо, содержат активные группировки, позволяющие облегчить функционализацию и модификацию липосом. Кроме того, отличительными особенностями таких систем являются высокая аффинность по отношению к нуклеиновым кислотам, неиммуногенность и биодеградируемость,
Разработка методологии получения новых алифатических производных дипептидов, исследование их мембранообразующих свойств, изучение возможности создания на их основе средств доставки в клетки генов, выявление зависимости между структурой и трансфекционной активностью данного класса соединений представляется актуальным направлением биоорганической и медицинской химии.
Настоящая работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре химии и технологии биологически активных соединений им. H.A. Преображенского МИТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках бюджетной темы № 1Б-4-355 «Разработка химических и биотехнологических методов модификации биологически активных соединений с целью моделирования жизненно важных процессов в природе и создание новых лекарственных препаратов». Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 05-04-48544 и № 08-04-01150.
Цель работы. Цель работы состояла в разработке способа получения алифатических производных дипептидов, содержащих моно- и диэфиры ¿-глутаминовой кислоты и L-глутамина, исследовании влияния структуры гидрофобного и гидрофильного фрагментов синтезированных амфифилов на их физико-химические свойства, комплексообразование с ДНК и трансфекционную активность в экспериментах in vitro.
Научная новизна работы. Создана библиотека катионных липодипептидов. Полярная часть амфифилов представлена дипептидами OrnGlu, LysGlu, AigGlu, OrnGln, LysGln и ArgGln.
Гидрофобный фрагмент образован остатками I-глутаминовой кислоты или L-глутамина, этерифицироваиными различными насыщенными и ненасыщенными (С8, С14, CÍ6, С18:1) алифатическими спиртами. Выявлен комплекс уникальных мембранообразующих свойств синтезированных соединений. Продемонстрировано, что в зависимости от структуры и концентрации липодипептиды образуют в водной среде шарообразные, дисковые и стержневидные мицеллы, липосомы или многослойные везикулы, что позволяет выбирать в пределах одного типа соединений структуры с различной фазовой организацией, размером и морфологией. Для липосом обнаружена рН- и термочувствительность. Исследования трансфекционных свойств полученных соединений in vitro показали перспективность их использования в качестве самоорганизующихся невирусных систем доставки функциональных генов. Показана селективность действия медиаторов трансфекции на основе липодипептидов по отношению к опухолевым и неопухолевым линиям клеток.
Практическая значимость работы. Разработана методология синтеза ряда липодипептидов, различающихся структурой гидрофильных фрагментов, числом, длиной и степенью ненасыщенности углеводородных заместителей в гидрофобном блоке. Предложенный подход позволяет получать липодипептиды в количествах, достаточных для изучения их физико-химических свойств и проведения экспериментов in vitro. Для синтезированных амфифилов продемонстрирована высокая эффективность трансфекции, что открывает возможность использования их в биохимических исследованиях, направленных на получение специальных белков для целей молекулярной биологии, цитологии и медицины. Стерически стабилизированные агрегаты, сформированные полученными соединениями, предназначены для последующих исследований по разработке методов лечения генетических и онкологических заболеваний в условиях in vivo.
Положения, выносимые на защиту.
1. Разработка методологии получения новых алифатических производных дипептидов.
2. Исследование свойств агрегатов, формируемых полученными соединениями в водной среде с широким привлечением современных инструментальных методов.
3. Получение смешанных стерически стабилизированных липосом и липосом с заданной температурой фазового перехода.
4. Изучение комплексообразования катионных амфифилов с ДНК.
5. Выявление зависимости структура - трансфекционная активность в ряду синтезированных липодипептидов.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и 12 тезисов докладов на российских и международных конференциях и конгрессах.
Апробация работы. Результаты диссертации были частично доложены на X и XI Международных научно-технических конференциях «Наукоёмкие химические технологии» (Волгоград, 2004 и Самара, 2006); VIII Молодёжной научной школе - конференции по органической химии (Казань, 2005); Международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2006, 2007); XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007).
Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на (10 страницах, содержит^ -L рисунков и _3_ таблиц. Список литературы включает /А источников.
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Осуществлен синтез ряда липидоподобных алифатических производных дипептидов. Полярная часть соединений представлена дипептидами OrnGIu, LysGlu, ArgGlu, OrnGln, LysGln и ArgGln. Наличие нескольких положительных зарядов (аминогруппы и гуанидиновой группировки) в их структуре обеспечивает большую эффективность трансфекции по сравнению с монозаряженными. Гидрофобный фрагмент сформирован моно- и диэфирами ¿-глутаминовой кислоты или ¿-глутамина и различными по длине насыщенными и ненасыщенными (С8, С14, С16, С18:1) остатками алифатических спиртов, способными в водной среде формировать упорядоченные агрегаты.
Все компоненты синтезированных соединений являются природными веществами. Это обстоятельство способствует снижению цитотоксичности медиаторов трансфекции и обеспечивает биосовместимость с клеточными объектами.
Синтез липодипептидов на основе эфиров L-глутамииовой кислоты и ¿-глутамина
Стратегия синтеза липодипептидов включала в себя следующие этапы: получение этерифицированных остатками жирных спиртов производных I-глутаминовой кислоты и ¿-глутамина, защита аминогрупп ¿-орнитина, ¿-лизина и ¿-аргинина, активация карбоксильных групп и образование пептидной связи между гидрофобным и гидрофильным компонентами.
Синтез гидрофобных фрагментов амфифилов осуществляли по схеме 1.
Для проведения этерификации в зависимости от термолабильности исходной L-глутаминовой кислоты, её производных и соответствующих спиртов использовались различные подходы: сплавление при повышенной температуре или реакция в условиях азеотропной отгонки воды с толуолом. При действии на образовавшиеся тозилаты 10%-ным водным раствором NaHCOj получали соединения 1-8 в виде свободных оснований.
Схема 1
О
II
н21ч-снсон сн2
сн,сон
МеОН ° вОС!,
О
II
Н21Ч-СНСОН
сн2
СН2СОВи'
1.1ШН
2^аНСО,
сн2
СН2СОСН3
о ,
о
II
н21ч-снсон сн2
СН2С1ЧН2
о
о
II
куч-снсон
Н21Ч
о
II
-снсои
I
сн2
СН2С01*
СТи(Сп)2
1 К=С8Н,7 С1и(С8)2
2К=С14Н2, С1и(С14)2
311=С16Нзз аи(С16)2
4К=С18Н35 аи(С18:1)2
1-4
О
1.С16НВ0Н 2.1ЧаНС03
1.С14НвОН
2.КаНСО,
Н21Ч-СНСОС16Нзз СН2
СН2СОСН3
О 6
С1и(ОМе)С16
О
II
Н2>1"СНСОС,6Нзз СН2
СН2СШ2
О
7
С1пС16
1.0,^33011
2.МаНСО,
Н2]Ч-СНСОС16Нз3 СН2
СН2СОВи'
8
аисови^иб
Вое-защищенные производные аминокислот 12-14 получали действием на аминокислоты 9-11 ди-третл-бутилпирокарбоната (схема 2). Для синтеза производного ¿-аргинина 14 требовался контроль реакционной массы по данным ТСХ и поддержание высокого значения рН 12-13 среды в течение длительного времени (8 ч).
Для образования пептидной связи между гидрофильным и гидрофобным фрагментами использовали метод активированных эфиров. Реакцию получения Л-оксисукцинимидных эфиров 15-17 проводили в стандартных условиях в присутствии конденсирующего агента -дициклогексилкарбодиимида фСС). Хроматографически чистые Л^-оксисукцинимидные эфиры ¿-орнитина, ¿-лизина и ¿-аргинина вводили в следующие реакции без дополнительной очистки.
имцсн.цгнсоон ^^^щсад^нсоон.^ ^мцсн^снс-с^/П
N112 \HBoc I
КНВос £
9-11 12-14 1Ы,
Схема 2.
О
ВосгО, НОЛви, О V С1и(Сп)2
II 1-3
О о о о
II II II II К',ЧН(С112)тСНС-1\НС11СОС11Н2м, 1*А> Я'(СН2)тСНС-МНСНСОС„Н2[^]
N11600 СН2 N43 сн2
сн^ос^, 2ск,сооеФ сн2сос„н21Н1
о О
18-26 27-35
№ ш И' п Выход № ш И' п Выход
1 - - 8 67 21 3 Вое 14 67
2 - - 14 95 22 4 Вое 14 58
3 - - 16 71 23 3 ВосШС(=КВос) 14 85
9 3 н - - 24 3 Вое 16 44
10 4 н - - 25 4 Вое 16 74
И 3 Ш2С(=М1) - - 26 3 ВоеШС^Вое) 16 30
12 3 Вое - 98 27 3 ТМН3 8 97
13 4 Вое - 99 28 4 8 89
14 3 ВосШС(=><Вос) - 44 29 3 +Н3КС(=КН)ТМН 8 63
15 3 Вое - 98 30 3 'ЫНз 14 79
16 4 Вое - 99 31 4 14 87
17 3 ВоеНЫС(=>ГОос) - 96 32 3 +Н3КС(=КН)КН 14 68
18 3 Вое 8 60 33 3 16 75
19 4 Вое 8 55 34 4 ^Нз 16 83
20 3 ВоеШС(=ЫВое) 8 34 35 3 ИзКС(=КН)Ш 16 77
Реакции между Лг-оксисукцинимидными эфирами соответствующих аминокислот 15-17 и эфирами 1-глутаминовой кислоты 1-4 проводили при соотношении реагентов 1 : 1.2 в тетрагидрофуране в присутствии 0.1 М водного раствора КНСОз. Продукты реакции в зависимости от структуры полученных соединений выделяли с помощью препаративной или колоночной хроматографии на силикагеле с индивидуальным подбором систем растворителей. Структура полученных соединений подтверждалась данными ИК- и 'Н-ЯМР-спектроскошш. В 'Н-ЯМР-спектрах присутствуют характерные сигналы протонов алифатических цепей при 0.8 и 1.2 м.д., протонов терети-бутильных групп при 1.4-1.5 м.д. и амидной связи при 5.6 м.д в виде уширенного синглета.
Вос-защитные группы удаляли действием безводной трифторуксусной кислоты. В масс-спектрах полученных солей 27-35 присутствуют пики молекулярных ионов. Данные элементного анализа удовлетворительно соответствуют расчетным величинам.
Катионные амфифилы с непредельными углеводородными цепями 36-38 и амфифилы, содержащие в гидрофобном блоке одну углеводородную цепь 39-46, получали аналогично по схеме 2.
О
м
О
II
1Г(С1(2)тШС- М1СНСОС18Н35
ХН3
ф
36-38
О
II
I
сн2
I
СН2СС18Н35 о
о
II
1Г(СН2)тСНС-^НСНСОС16Нзз
N113
©
I
сн2
СШСИ"
■'и
о
39-46
36 ш=3, 1Г=@М13,
37 т=4, И'^Шз,
38 т=3, Я^НзКгаН
©II N11
39 т=3, К-ЙНз. К'-МГ,
40 т=4, Я'=т3, Л"=НН2
41 т=3, Н31ЧС1ЧН, 11"=т2
©
42 т=3, И'= МИ3, й'-ОСНз
43 га=3, Н3>СМ1, 1Г=ОСНз
©II © ™
44 т=3, Я'^-Нз,
45 т=4, К'=1ЧИ3,
11"=ОН 1Г=ОН
46 т=3, R'=HзNCNH, Я"=ОН ©II N11
В результате проделанной работы сформирована библиотека из 20 катионных амфифилов на основе дипепшдов ОпЮЬ, ЬуБЙи, Аг§01и, ОтИп, ЬувбЬ и
Исследование свойств агрегатов, формируемых полученными соединениями в
водной среде
Полученные соединения обладают поверхностно-активными свойствами. В рамках данной работы для исследования возможности их использования в качестве основы для создания средств доставки в клетки функциональных генов необходимо было изучить фазовую организацию липодипептидов в водной среде при различных концентрациях, температурах и рН среды, оценить размер и стабильность формируемых ими агрегатов.
Для описания возможных форм частиц, образуемых амфифилами в водной среде, рассчитывался критический параметр упаковки (КПУ) по формуле I:
р=\7(Ьх8) (I), где V - объем углеводородных цепей амфифила, Ь - длина углеводородных цепей, в - площадь, занимаемая головной группой амфифила.
Величины для расчёта КПУ определяли из построений геометрических моделей молекул с помощью программы НурегСЪет 6.0.1.
Рассчитанные значения КПУ (0.6-0.7) для липодипептидов 30-38. структура гидрофобного блока которых представлена двумя углеводородными фрагментами длиной С14, С16, и С18-.1, свидетельствует о том, что наиболее вероятным видом их структурной организации в воде является ламеллярная фаза. Агрегаты, образуемые в воде соединениями 3946 с одной алифатической цепью, имеют мицеллярную форму (КПУ = 0.3-0.35), пограничная величина КПУ (~0.5) для амфифилов 27-29, с двумя короткоцепными (С8) фрагментами, означает, что вещества при различных условиях (концентрация, температура, рН среды) могут формировать агрегаты с мицеллярной или ламеллярной фазовой организацией (рис. 1).
Рис. 1. Схематичное изображение разнообразия размеров и форм частиц в зависимости от рассчитанного критического параметра
упаковки (КПУ) на примере производных ¿-орнитина.
0,49 0,63 0,36 0,35 | ■ КПУ I
Известно, что точка перегиба на графике зависимости оптичеекой плотности от концентрации амфифила в воде соответствует критической концентрации везикулообразования (ККВ). При меньшей концентрации амфифилы существуют в виде истинного раствора или неупорядоченной дисперсии, которые нельзя использовать для транспорта генетического материала.
С целью определения минимальной концентрации, при которой синтезированные соединения формируют агрегаты, установлена оптическая плотность ряда образцов в диапазонах концентраций 10"2 - 10'5 моль/л. Полученные значения ККВ приведены в таблице 1.
Показано, что кривая зависимости оптической плотности от логарифма концентрации для соединений 30-43 имеет типичный вид с одной точкой перегиба, что характерно для поверхностно-активных соединений.
Интересные результаты при определении ККВ были получены для амфифилов 27-29 с двумя короткоцепными углеводородными фрагментами. Кривая зависимости оптической плотности от логарифма концентрации для этих соединений имеет три точки перегиба (рис. 2).
Рис. 2. Зависимость оптической плотности от логарифма концентрации в воде для соединения 27 при температуре 18-20°С.
Очевидно, это связано с различными структурными переходами: от дисперсии к мицеллам (ККМ-1). от обычных шарообразных мицелл к дисковым мицеллам, которые являются предшественниками бислойных агрегатов (ККМ-2), затем к образованию ламеллярных везикул (ККВ) (рис. 2).
Рис. 3. Схематичное изображение многослойных везикул.
Интересное поведение липидных дисперсий в воде зафиксировано также для соединений на основе моноэфира I-глутаминовой кислоты 44, 45. Для этих амфифилов продемонстрировано формирование в воде первичных, вторичных и многослойных мицелл, которые принято называть «луковичные чешуйки» (onions, рис. 3), что связано с возможностью образования, как внутренней соли, так и возникновением межмолекулярных ионных взаимодействий. При этом переход от первичных мицелл к вторичным также характеризуется дополнительным перегибом на графике зависимости оптической плотности от концентрации (рис. 4).
Рис. 4. Зависимость оптической плотности от концентрации для соединения 44 при температуре 18-20°С.
Известно, что шарообразные частицы с диаметром менее 200 нм наиболее легко
проникают в клетку, поэтому размер частиц является важной характеристикой для средств
доставки. Доступным и удобньм методом изучения размеров частиц является
спектротурбидиметрия, основанная на теории рассеяния света шарообразными частицами.
10
Метод также позволяет получать информацию о степени гетерогенности липидных дисперсий, поскольку при наличии крупных частиц в системе наблюдается отклонение экспериментальных точек от прямой линии.
При гидратации плёнки липодипептидов на основе диэфиров ¿-глутаминовой кислоты с длиной цепей С]4, С16 и С18:1 образовывались мультиламеллярные везикулы со средним размером порядка микрона, которые при обработке ультразвуком разбивались на более мелкие частицы от 30 до 400 нм. Полученные таким образом дисперсии стабильны в течение недели.
Относительное распределение частиц по размерам определялось на анализаторе размера частиц серии LS™ 13320 (Beckman coulter, USA), принцип работы которого основан также на измерении светорассеяния.
Для соединения 36 средний диаметр липосом после обработки дисперсии ультразвуком составлял 142 нм (наиболее часто встречающийся размер 136 нм, а шрегаты с диаметром большем 200 нм и меньшем 100 нм суммарно составляют около 20%) (рис. 5).
Dííntmia Number
Диаметр, мкм
Рис. 5. Распределение частиц по размерам для соединения OrnGlu(C18:l)2 (36).
С целью детального изучения размера и формы агрегатов, были получены электронные микрофотографии водных дисперсий синтезированных амфифилов.
Показано, что соединений на основе дигексадецилового эфира ¿-Glu 33-35 в воде образуют сферические липосомы со средним диаметром 100 нм (рис. 6а, на примере соединения 33), которые при обработке ультразвуком (3x10 мин) превращаются в мелкие агрегаты с размером порядка 50 нм (рис. 66).
Рис. 6. Изображения водных дисперсий, полученные с помощью электронной микроскопии с негативным контрастированием уранилацетатом: а) для соединения 33, б) для соединения 33 после обработки ультразвуком, в) для соединения 27, г) для соединения 27 после обработки ультразвуком, д) для соединения 44, е) для соединения 44 при концентрации ~10'2 моль/л.
Соединения 27-29 на основе диоктилового эфира 1-01и при концентрации 9-] О"4 моль/л (между ККМ-2 и ККВ) образуют в водной среде стержневидные агрегаты (рис. 6в, на примере 27), которые после ультразвуковой обработки превращаются в меньшие по размеру дисковые мицеллы (рис. 6т). Амфифилы на основе моноэфиров /.-Ии при концентрации 1.3ТО"3 моль/л формируют в воде многослойные частицы (рис. 6д на примере соединения 44), которые при большей концентрации (~10"2 моль/л) склонны к агрегации и образованию ассоциатов (более 1 мкм) (рис. бе).
Таким образом, для соединений одного типа - липодипептидов на основе эфиров 1-глутаминовой кислоты и ¿-глутамина (рис. 1) комплекс независимых методов достоверно подтверждает, что в зависимости от структуры амфифила обнаружена различная фазовая организация в водной среде, что позволяет выбирать из сформированной библиотеки амфифилы с нужной фазовой организацией для решения различных задач.
Процесс фазового перехода для бислойных агрегатов исследовался нами с помощью метода, основанного на связывании молекулами соответствующего амфифила красителя эозина. Краситель образует в растворе две формы: мономерную и димерную. Зависимость отношения интенсивностей оптического поглощения димера/мономера от температуры в ходе взаимодействия с бислоем липосом обычно имеет перегиб в точке, соответствующей температуре фазового перехода (ТФП) (рис. 7). Это связано с переходом красителя из мономерной формы в димерную и проникновением его в гидрофобную область амфифила.
' Фотографии получены в.н.с., д.б.н. Попенко В.А. в лаборатории электронной микроскопии ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН.
Рис. 7. Зависимость отношения интенсивностей поглощения при 546 и 402 нм от температуры для смеси водных дисперсий соединений 27,33-35 с эозином.
Использованный метод определения ТФП является косвенным. Для подтверждения его применимости по отношению к липодипептидам использовался прямой метод ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (РТП1) (рис. 8, 9), позволяющий наблюдать конформационные изменения по колебательному спектру связей С-Н. Однако такой подход требует использования большого количества вещества (50 мг/мл).
Данные, полученные двумя методами, полностью совпадают. Это свидетельствует о перспективности метода с использованием красителя эозина, учитывая его простоту и значительно меньшие затраты амфифилов (2 мг/мл).
Рис. 9. Сдвиг полос валентных колебаний С-Н связей при повышении температуры для Аг§01и(С14)2 (32).
Определенные в ходе проведённых экспериментов параметры, характеризующие мембранообразующие свойства липодипептидов, приведены в таблице 1.
Таблица 1. Свойства синтезированных соединений.
Формула № КПУ ТФП, °с ККВ (ККМ-2, ККМ-1) моль/л*10"4
0гп01и(С8)2 27 0.49 25 9.2(1.1,0.67)
Ьуз01и(С8)2 28 0.49 25 9(1.0,0.6)
А^01и(С8)2 29 0.5 26 8.7(1.0,0.58)
0гп01и(С14)2 30 0.62 34 9.2
Ьуз01и(С14)2 31 0.64 33 8.5
Аге01и(С14)2 32 0.61 36 25
0гп01и(С16)2 33 0.63 40 9
Ьуз01и(С16)2 34 0.69 39 7.5
АгвС1и(С16)2 35 0.58 38 2.0
0гп01и(С18:1)2 36 0.72 25 9.3
Ьуз01и(С18:1)2 37 0.73 25 9.0
А^01и(С18:1)2 38 0.68 27 9.8
0гп01пС16 39 0.36 - 0.40
ЬуяЯпОб 40 0.31 - 0.65
Аг§апС16 41 0.30 - 0.32
0гп01и(0СНЗ)С1 42 0.41 - 1.0
Аг§С1и(ОСНЗ)С1 43 0.38 - 0.89
ОпЮ1и(ОН)С16 44 0.35 - 3 (0.85)
Ьуз01и(0Н)С1б 45 0.36 - 4.0(1.7)
Аг£С1и(ОН)С16 46 0.38 - 2.8(1.1)
Заряженные амфифилы с относительно небольшой полярной группой по сравнению с гидрофобной частью способны переходить из ламеллярной фазы в гексагонально-инвертированную фазу при изменении условий окружения, например, рН среды. При этом эффект дестабилизации бислоя после попадания транспортной системы в эндосому, внутри которой резко понижается рН, позволяет высвобождать содержимое в клетке.
Для изучения рН-чувствительности липосом были приготовлены дисперсии синтезированных липодипептидов в фосфатном буфере (рН 8.0), содержащим уранин Л (флуоресцеин натрия) - водорастворимый краситель. Невключённый во внутренний объём краситель удалялся с помощью гель-фильтрации. Затем осуществлялось изменение рН среды за счёт добавления 0.1 М соляной кислоты и фиксировалось увеличение интенсивности флуоресценции уранина А.
Показано, что при понижении рН до 5.0 для соединения 33 и до 6.0 для соединения 32 изменения незначительны, а затем происходит резкое возрастание интенсивности, связанное с дестабилизацией бислоя и истечением красителя из внутреннего объёма липосом (рис. 10).
Аг£01и(С14)2 (32) Ога01и(С16)2(33)
Рис. 10. Зависимость относительной интенсивности флуоресценции, включённого в лппосомы уранина А от рН среды.
Продемонстрированная рН-чувствительность синтезированных липодипептидов очень важна для медиаторов трансфекции, т.к. комплексы, которые они образуют с ДНК, должны быть стабильны в кровотоке (рН слабощелочная) и разрушаться только внутри клетки (рН слабокислая), высвобождая генетический материал.
Формирование смешанных липосом с заданными свойствами
Для защиты липосом от захвата клетками иммунной системы, обеспечения направленного транспорта лекарственных веществ в поражённые органы и ткани, а также контролируемого высвобождения содержимого непосредственно в нужной клетке липосомы подвергают модификации путём включения в их состав гидрофильных полимеров и векторов направленного действия.
Изучение свойств водных дисперсий синтезированных липодипептидов свидетельствует о способности их самопроизвольно образовывать агрегаты с различными мембранообразующими свойствами: размером, температурой фазового перехода и морфологией в зависимости от структуры соединения. Для трансфекции различного типа клеток необходимы частицы с разным набором свойств, которые будут диктоваться мишенью и условиями применения. Чтобы транспортная системы была стабильна в кровотоке необходимо создание на её поверхности стерического барьера. С целью формирования смешанных липосом с заданными свойствами, были приготовлены и исследованы агрегаты на основе смеси липодипептидов.
Нами изучены свойства смешанных липидных дисперсий на основе дигексадецил-ЛЦ!-орнитил)-1-глутамата бистрифторацетата (33) с добавлением холестерина, диокгил-Л^Х-орнитил)-£-глутамата бистрифторацетата (27) и диолеил-Лг-(1-орнитил)-1-глутамата бистрифторацетата (36) в различных соотношениях.
О 5 10 15 20 25 30
%
Рис. 11. Температура фазового перехода для смешанных липосом на основе OrnGlu(C16)2 (33)с добавлением соединения OrnGlu(C8)2 (27) и OrnGlu(C18:l)2 (36).
Показано, что температура фазового перехода при добавлении 15% короткоцепного амфифила (27) снижается до 35 "С, а включение 15 % амфифила с непредельными цепями 36 уменьшает ТФП до 29°С (рис. 11).
Липосомы с одинаковой ТФП, равной 31 °С, содержащие 25% производного диолеилового эфира 36 в полтора раза меньше и на 11% устойчивее, чем содержащие 10 % липодипептида на основе диоктилового эфира 27.
Захват липосом ретикулоэндотелиальной системой (RES-захват) является одной из главных проблем, препятствующих доставке инкапсулированных в них веществ к определённым органам и тканям в условиях in vivo. Для создания стерически стабилизированных транспортных систем используется подход, заключающийся в увеличении гидрофильное™ наружной поверхности бислоя, что ведёт к понижению опсонизации. Кроме того, дополнительная оболочка липосом за счёт увеличения размера обеспечивает эффект пассивного нацеливания на опухоли и/или области воспалений, где размер пор капилляров больше, а следовательно выше способность транспортной системы проникать из кровотока в ткани.
В рамках данной работы нами осуществлён синтез производного полиэтиленгликоля (ПЭГ) 50 и холестерина (схема 3) и исследованы свойства липосом на основе OrnGlu(C16)2 (33) с его включением.
При смешивании липодипептидов с производным ПЭГ в воде самопроизвольно формировались липосомы со средним размером около 200 нм, разрушение липосом и истечение уранина А из внутреннего объёма частицы происходило при том же значении рН, что и без включения ПЭГ. Седиментационная устойчивость липодипептидной дисперсии, модифицированной производным ПЭГ, оказалась выше на 15 %, что позволяет хранить такие препараты в растворе более продолжительное время без осаждения частиц.
Схема 3.
РЕСгшОМе, РСС РМЛР
и,с—с.
I ,о
'ъс—с, _'о
1)МЛР НООСО^ЬСОО
Встраивание в линосомы холестеринового производного ПЭГ обеспечивает не только стерическую стабилизацию, но и повышение ТФП, причём фазовый переход происходит в узком интервале. При содержании 10% производного ПЭГ в липосомах, приготовленных из 0т01и(С1б)2 (34) фазовый переход происходит при 43 "С (рис. 12). Это достаточно ценное свойство, которое может быть использовано для конструирования транспортных систем с термоконтролируемым высвобождением содержимого.
Рис. 12. Температура фазового перехода для смешанных липосом на основе ОтОЬ(С16)2 (33) с добавлением производного ПЭГ 50.
Полученные результаты позволяют варьировать состав систем доставки генетического материала с заданными свойствами с целью повышения эффективности их использования для решения конкретных задач.
Изучение свойств комплексов катионпые липодипептпды/ДНК Изучены физико-химические свойства липоплексов, которые формируют полученные липодипептиды с ДНК. Для синтезированных соединений определены соотношения компонентов, при которых наблюдается максимальная степень связывания нуклеиновой кислоты в комплекс. Эксперименты проводились с помощью двух независимых методов: электрофореза на агарозе и флуоресцентной спектроскопии.
Смеси состава 1:2 - 2:1 моль/моль (+/-, №Р) инкубировались в течение 15 мин, достаточных для формирования используемых в экспериментах по трансфекции липоплексов. В качестве объекта сравнения использовалась свободная плазмида рЕвРР-Ю (ОоШесЬ, США, 4,7 кЬ).
В результате экспериментов по электрофорезу было показано, что для синтезированных амфифилов Ьуз01и(С1б)2 (34) и 0гп01и(С16)2 (33) соотношения, при которых наблюдается комплексообразование совпадают и составляют 1:1 (+/-). Полное связывание нуклеиновой кислоты в комплекс с липодипептидами ОгпС1и(ОН)С16 и ОпЮ1пС16 происходит при соотношении близком к 2:1 (+/-). Смешанные липосомы с холестерином состава Огп01и(С16)2/СЬо1 1:1 (моль/моль) формировали комплекс с плазмидой при соотношении 0.6:0.6:1 (+/-). Включение холестерина изменяет компактность бислоя, что приводит к стерическим затруднениям при взаимодействии молекул катионного липодипептида с цепочкой нуклеиновой кислоты и снижению содержания амфифила в липоплексе.
Рис. 13. Зависимость интенсивности флуоресценции комплекса
яиподипептид/ДНКЛЭДЗг от соотношения липодипептид/ДНК (+/-). За 100% принята флуоресценция комплекса ДНК/Е(Вг.
Полученные с помощью флуоресцентной спектроскопии результаты представлены в виде графиков зависимости интенсивности флуоресценции комплексов с различным соотношением липодипептид/ДНК (+/-) по сравнению с комплексом этидиум бромид/ДНК (рис. 13).
Показано, что в случае производных моноэфира 1-глутаминовой кислоты и ¿-глутамина интенсивность флуоресценции ассоциатов при увеличении содержания липодипептидов снижается всего на 5-6 % (Таблица 3), что, очевидно, связано с низкой способностью этих катионных амфифилов вытеснять краситель этидиум бромид из липоплекса.
Точки перегиба на графике зависимости интенсивности флуоресценции комплекса от соотношения липодипептид/ДНК (рис. 16), после которых наблюдаются слабые изменения флуоресценции, свидетельствуют об оптимальном комплексообразовании между амфифилом и плазмидой. В результате для липодипептида 0гп01и(0Н)С16 интенсивность резко уменьшается до соотношения 1.7:1, для липодипептида Ьуз01и(С16)г - до соотношения 1.1:1 и для 0ш01пС16 - до соотношения 2:1. Данные, полученные двумя независимыми методами практически совпадают.
Таблица 3. Характеристики комплекса липодипептидов с ДНК.
Соединение моль1Ч/мольР % вытеснения EtBr
OrnGlu(Cg)3 1.5 18
OrnGlu(Ci4)2 1,2 8
ArgGlu(C14)2 1,7 9
OrnGlu(C,6)2 1,2 20
LysGlu(Ci6)2 1,1 16
ArgGlu(C16)2 1,6 25
OmGlu(C[8:l)2 1,8 11
OrnGlnC,6 2 5
LysGlnCi6 2,1 6
OrnGlu(OH)Ci6 1,7 6
Размер и форма комплексов определялась методами атомяо-силовой и трансмиссионной электронной микроскопии с контрастированием уранилацетатом.
Для атомно-силовой микроскопии водные дисперсии комплексов ДНК и липопедаптидов готовили в соотношениях, определённых в ходе предыдущих экспериментов, 1:1.2дляОпЮ1иС16и 1.5:1 для ОтИиСв.
Рис. 14. Изображение с помощью атомно-силовой микроскопии комплексов а) Огп(С16)2/ДНК, б) Огп(С8)2/ДНК*.
Продемонстрировано, что комплексы ДНК с липодипептидами на основе дигекса- и дитетрадециловых эфиров 1-глутаминовой кислоты имеют вид агрегатов, которые в литературе принято называть «бусинки на нитке» (рис 14а, рис 15а). Производные диоктилового эфира формируют с ДНК компактные сферические липоплексы с диаметром около 100 нм (рис.146), а липодипептиды, содержащие моноэфиры, формируют липоплексы слоистой архитектуры (рис 156).
'Изображения получены проф., д.х.н. Соловьёвой А.Б., с.н.с., к.х.н. Тимофеевой В.А. в лаборатории "Модифицированных полимерных систем" ИХФ им. H.H. Семёнова РАН
Рис. 15. Изображения водных дисперсий, полз'ченные с помощью электронной микроскопии с негативным контрастированием уранилацетатом а), для смеси соединения 33 с ДНК, б) для смеси соединения 44 с ДНК (high molecular weight from К coli host strain, Sigma). (Фотографии получены в.н.с., д.б.н. Попенко В.А. в лаборатории электронной микроскопии ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН.)
Таким образом, показано, что природа аминокислот в структуре полярного блока амфифилов незначительно влияет на размер и морфологию комплексов, а наибольшее влияние на физико-химические свойства исследуемых объектов оказывает гидрофобный фрагмент.
Определение эффективности трансфекции полученных соединений
Продолжительность процесса проникновения в клетки средств доставки может сильно отличаться в зависимости от используемых линий клеток и структуры медиаторов трансфекции. Для оценки этого параметра в данной работе нами осуществлён синтез нового флуоресцентного маркера 52 на основе производного пирена (схема 4) и определена тропность модифицированных липосом к клеткам линии COS-7 (клетки африканской зеленой мартышки)*.
Схема 4.
0 0 о о
© II II @ II II
H3N(CH2)3CHC-NHCHCOCi6H33 H3N(CH2)3CHC-NHCHC0C,6H33 НО(СН2),, I I SOCI, I I
NH3 СН2 -► 6 NH3
2CF3COOe СН2СООН 2С1 СН2СС1
44 51 Q
о о
© II II
H3N(CH2)3CHC- NHCHCOC16H33
NH3 <рн2 2С? Ф СН2СО(СНг)4 О
52
Наблюдение процесса взаимодействия липодипептидов с клетками C0S-7 проводили с помощью флуоресцентной микроскопии на приборе Zeiss Axioskop 20, микросъемку делали с помощью видеосистемы AxioCamMR3. Для цифровой обработки изображений использовалось программное обеспечение KS 100 (Zeiss), Adobe Photoshop. К клеткам, рассеянным по лункам,
Данная часть работы выполнялась совместно с сотрудниками ЦИН РАН, г. Санкт-Петербург
объём среды - 200 мкл, добавлялась водная дисперсия липодипептидов. Концентрация производного пирена в среде составляла 5 мкмоль/л, температура при которой проводился эксперимент - 37°С, время облучения клеток ультрафиолетовым светом - 300 мс. В результате исследования тропности липосом к клеткам линии COS-7 было показано, что через 35 минут после инкубации наблюдается флуоресценция клеток по периметру, что может свидетельствовать о связывании липосом с плазматической мембраной, а через 60-80 мин происходит накопление флуоресцентной метки в цитоплазме в виде дискретных образований и по периметру ядра.
Полученные данные использовались далее в процессе изучения эффективности трансфекции.
Синтезированные соединения обладают низкой токсичностью по отношению к клеткам HELA, HEP и СНО. Концентрация, при которой начинает проявляться токсический эффект в несколько раз больше, чем у широко используемого коммерческого препарата Lipofectamíne 2000.
Определена эффективность трансфекции синтезированных соединений на опухолевых и неопухолевых линиях клеток с использованием в качестве генетического конструкта плазмиды pEGFP (Clontech, USA). В каждом случае для сравнения использовались коммерческие агенты нового поколения (HEP-, CHO-transfection reagent, Lipotaxi), обладающие наивысшей эффективностью трансфекции для выбранных в исследовании типов клеток (HEP - клетки карциномы горла человека, СНО - клетки яичников китайского хомяка и лейкоцитов крысы).
Вещества исследовались в концентрациях от 0.001 до 1 мг/мл. С повышением концентрации, как и следовало ожидать, увеличивалась и эффективность трансфекции, однако, даже при низких концентрациях процент трансфецированных клеток не понижался ниже 30%.
Transfection reagent
Рис. 16. Эффективность трансфекции опухолевых клеток (HEP). Погрешность измерений менее 0.5 %.
На опухолевых клетках (HEP) наибольшей эффективностью трансфекции в концентрации образцов 1 мг/мл обладали производные моноэфиров ¿-глутаминовой кислоты (79-83 %), специальный реагент для данного типа клеток в тех же условиях проявил меньшую
активность (77%). Короткоцепные диэфиры дипептидов обладали на этой линии клеток примерно в 1.3 раза большей эффективностью, чем их длинноцепные аналоги. Амфифилы с ненасыщенными цепями были менее эффективны, чем насыщенные липодипептиды. Добавление липида-помощника DOPE увеличивало эффективность трансфекции примерно на 20%. (рис. 16).
В экспериментах с неопухолевыми клетками, наблюдались иные закономерности. Производные дигексадецилового эфира ¿-глутаминовой кислоты и аналоги с непредельными алифатическими цепями проявили эффективность трансфекции, сопоставимую с контрольным образцом (65% и 71%, соответственно), а наибольшая активность среди синтезированных амфифилов (66%) была зарегистрирована для дигексадецил-Л'-(1-аргинил)-Х-глутамата бистрифторацетата (35) (рис. 17).
-¿яа:
^¡ЩЦ
щ|| РЩ1 ¿шт
рЩ У■
Ш 4«> * LI®
0гп(С16)2
Огп(С8)2
Огп(С16)2
Arg(C16)2 CHOTransfection reagent
Рис. 17. Эффективность трансфекции неопухолевых клеток (СНО). Погрешность измерений менее 0.5 %.
Наблюдаемое различие в поведении отличающихся по структуре медиаторов трансфекции, очевидно, определяется специфическим взаимодействием агентов с исследованными линиями клеток.
Соединения проявили достаточно высокий уровень трансфекции (61%) по отношению к лейкоцитам крысы - клеткам, которые относятся к плохо трансфицируемым линиям клеток и эффективность для них на большинстве коммерческих препаратов не превышает 35%.
Кроме того, следует отметить что, в отличие от коммерческих препаратов, липодипептиды из сформированной нами библиотеки катионных амфифилов обладают достаточно высокой эффективностью (выше 60%) на всех исследованных линиях клеток. Такая универсальность является неоспоримым достоинством новых агентов трансфекции.
Выводы:
1. Сформирована библиотека липидоподобных алифатических производных дипептидов ArgGlu, LysGlu, OrnGlu, LysGln и OmGln - медиаторов невирусной трансфскции. Гидрофобный фрагмент образован моно- и диэфирами L-глутаминовой кислоты или ¿-глутамина и различными насыщенными и ненасыщенными (С8, С14, С16, С 18:1) остатками алифатических спиртов.
2. Выявлен комплекс уникальных мембранообразующих свойств синтезированных соединений. Продемонстрировано, что в зависимости от сгруктуры и концентрации липодипептиды образуют в водной среде шарообразные, дисковые и стержневидные мицеллы, липосомы или многослойные везикулы.
3. Обнаружена pH- и термочувствительность липосом на основе синтезированных соединений.
4. Определены соотношения, при которых образуются комплексы липодипепгиды/ДНК, а также их размер и форма: «бусинки на нитке», компактные сферические липоплексы или липоплексы слоистой архитектуры.
5. Изучено влияние структуры гидрофобного и гидрофильного блоков липодипептидов на эффективность трансфекции. Новые системы доставки функциональных генов проявили высокий уровень генного переноса и селективность действия по отношению к опухолевым и неопухолевым клеткам.
Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:
1. Себякин Ю.Л., Буданова У.А. «pH-чувствительные катионные липопептиды для создания транспортных систем медицинского назначения» // Биоорган, химия. - 2006. - Т. 32. №5. -С. 453-458.
2. Себякин Ю.Л., Буданова У.А. «Изучение взаимосвязи структура-свойства в ряду катионных липопептидов»//Вестник МИТХТ. -2006.-Т. l.№ 1.-С. 44-49.
3. Себякин Ю.Л., Буданова У.А., Гурьева Л.Ю. «Структурно-функциональное разнообразие искусственных мембран на основе катионных липопептидов» // Биологич. мембраны. - 2007. -Т. 24. №3,-С. 273-279.
4. Yurii L. Sebyakin, Uliyana A. Budanova and Lyudmila Yu. Gur'eva «Self-organising aggregates of lipodipeptides in aqueous medium and their complexes with DNA» // Mendeleev Comm. - 2007. -V. 17.-P. 188-189.
5. Ларин A.C., Скрипникова M.A., Буданова У.А., Фесенко A.A., Себякин Ю.Л., Московцев A.A., Элкади A.C., Блохин Д.Ю., Жданов Р.И. «Форма и размер липоплекса - основные факторы, определяющие эффективность липофекции in vitro» // XYII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. - 2003. - г. Казань. - С. 261.
6. Буданова У.А., Степаненко Е.Г. «Перспективная технология получения новых медиаторов трансфекции липопептидной природы» // X Международная научно-техническая конференция «Наукоёмкие химические технологии -2004». - г. Волгоград. - С. 193-194.
7. Себякин Ю.Л., Буданова У.А. «Конструирование транспортных систем медицинского назначения на основе катионных липосом» // III Московский международный конгресс. Биотехнология: состояние и перспективы развития. - 2004. - г. Москва. - С. 62.
8. Буданова У.А., Себякин Ю.Л «Синтез и мембранообразующие свойства новых катионных амфифилов на основе пептидов» // Первая научно-техническая конференция молодых учёных МИТХТ им. М.В. Ломоносова «Наукоёмкие химические технологии». - 2005. - г. Москва. -С. 34.
9. Буданова У.А., Себякин Ю.Л. «Получение новых липидоподобных амфифилов на основе пептидов» // VIII Научная школа - конференция по органической химии. - 2005. - г. Казань. -С. 382.
10. Гурьева Л.Ю., Буданова У.А., Северьянова A.A., Цариковская М.В., Себякин Ю.Л. «Модифицированные амфифилы и неогликоконъюгаты широкого спектра действия на основе D-галактозы и D-лактозы» // Московская международная конференция «Биотехнология и медицина^. - 2006. - г. Москва. - С. 85-86.
П.Буданова У.А., Харитонова O.A., Мухина А.К., Себякин Ю.Л. Фазовая организация и морфология водных дисперсий липодипептидов и их комплексов с ДНК // XI Международная научно-техническая конференция «Наукоёмкие химические технологии -2006». - г. Самара. -С. 156-157.
12. Себякин ЮЛ., Буданова У.А., Мухина А.К., Харитонова O.A. «Направления создания новых катионных амфифилов для целей практической медицины» // Московская международная конференция «Биотехнология и медицина». - 2006. - г. Москва. - С. 56-57.
13. Гурьева Л.Ю., Буданова У.А.; Себякин Ю.Л. Синтез новых углеводсодержащих липидов на основе D-лактозы // 18-й Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. - 2007. - г. Москва. - Т. 4. - С. 527.
14. Добрынина A.B., Буданова У.А., Себякин Ю.Л. Синтез и изучение свойств RGD-липопептида в составе катионных липосом.// 18-й Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. - 2007. - г. Москва. - Т. 4. - С. 530.
15. Себякин Ю.Л., А., Буданова У.А., Гурьева Л.Ю. Морфологическое разнообразие паноразмерных форм для биотехнологии и медицины // Московская международная конференция «Биотехнология и медицина». - 2007. - г. Москва. - Т. 1. - С. 92.
16. Себякин Ю.Л., Буданова У.А. Оптимизация протокола трансфекции клеток HEP, СНО и лейкоцитов крысы с помощью липодипептидов // XII Международная научно-техническая конференция «Наукоёмкие химические технологии -2008». - г. Волгоград. - С. 153.
24
Подписано в печать 18.11.2008 г.
Печать трафаретная
Заказ N° 1213 Тираж: 100 экз.
Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499)788-78-56 www.autorcferat.ru
СПИСОК ПРИНЯТЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
Компоненты катионных липосом.
Комплекс амфифил/ДНК.
Средства для модификации липосом.
Включение в липосомы векторов активного нацеливания на клетку-мишень.
Контролируемое высвобождение содержимого липосом.
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Синтез липодипептидов на основе эфиров /,-глутаминовой кислоты и /,-глутамина.
Исследование свойств агрегатов, формируемых полученными соединениями в водной среде.
Изучение свойств комплексов катионные липодипептиды/ДНК.
Определение эффективности трансфекции полученных соединений.
ВЫВОДЫ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
1.Warrens A.N., Heaton Т., Sid S., Lombardi G., Lecheler R.1. Transfected murine cells expressing HLA class II can be used to generate alloreactive human T cell clones // J. of immunological methods. - 1994. -V. 169. № 1. - P. 25-33.
2. Wurm F.M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells // Nature Biotechnol. 2004. - V. 22. - P. 1393-1398.
3. Grimm S. The art and design of genctic screens: mammalian culture cells // Nature Rev. Gen. -2004.-V. 5.-P. 179-189.
4. Raymond L.A., Moshaver A., Tingley W.G., Shalaby I., Huganir R.L. Glutamate receptor ion channel properties predict vulnerability to cytotoxicity in a transfected nonneuronal cell line // Mol. and Cell. Neurosci. 1996. - V. 7. - №. 2. - P. 102-115.
5. Glover D.J., Lipps H.J., Jans D.A. Towards safe, non-viral therapeutic gene expression in humans // Nature Rev. Gen. 2005. - V. 6. - P. 299-310.
6. Breakefield X., Pechan P., Johnston K., Jacoby D. Herpes virus vectors // Stemcell Biology and Gene Therapy / Eds P. Quesenberry et al. San Diego.- 1997.
7. Жданов Р.И., Хусаинов P.С., Иваницкий Г.Р., Борисенко А.С. Невирусные векторы в генной терапии. Новый подход в липофекции // Вопросы биологии, медицинской и фармацевтич. химии.- 2000.- № 1.- С. 10-17.
8. Mahato R.I., Rolland A., Tomlinson Е. Cationic Lipid-Based Gene Delivery Systems: Pharmaceutical Perspectives // Pharm. Res. 1997.- V. 14, №. 7.- P 853-859.
9. Tomlinson E, Rolland A. Controllable gene therapy: Pharmaceutics of non-viral gene delivery systems // J. Control. Rel.- 1996.- V 39: 357-372.
10. Anderson W. Human gene therapy. // Science.- 1992.- V. 256,- P. 808-812.
11. Xiujuan Z., Godbey W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering // Adv. drug del. rev. 2006. - V. 58. № 4. P. 515-534.
12. Strauss M., Baringer J. Consepts in Gene Therape. // Berlin.- 1997.
13. Ferber D. Gene therapy: safer and virus-free? И Science. 2001. - V. 294. - P. 1638- 1642.
14. Pietersz G.A., Tang C.-K., Apostolopoulos V. Structure and Design of Polycationic Carriers For Gene Delivery // Mini Rev. in Med. Chem. 2006. - V. 6. № 12. - P. 1285-1298.
15. Жданов Р.И., Куценко Н.Г., Федченко В.И. Невирусные методы переноса генов в генной терапии. //Вопр. мед. химии.- 1997.- Т. 1, С. 3-10.
16. Edelstein, М. L., Abedi, М. R., Wixon, J. and Edelstein, R. M. Gene therapy clinical trials worldwide 1989-2004 an overview // J. Gene Med. 2004. V. 6. P. 597-602.
17. Gascon A.R., Pedraz J. L. Cationic lipids as gene transfer agents: a patent review // Expert Opin. on Tlier. Patents. 2008. - V. 18. - № 5. - P. 515-524.
18. Wasungu L., Hoekstra D. Cationic lipids, lipoplexes and intracellular delivery of genes // J. of Control. Rel. 2006. V. 116. P. 255-264.
19. Lasic D.D., Templeton N.S. Liposomes in gene therapy // Adv. Drug Deliv. Rev. 1996. - V.20. P. 221-266.
20. Audouy S.A.L., de Leij L.F.M.H., Hoekstra D., Molema G. In Vivo Characteristics of Cationic Liposomes as Delivery Vectors for Gene Therapy // Pharm. Res. 2002. - V. 19. № 11. P. 15991605.
21. U'Ren L., Kedl R., Dow S. Vaccination with liposome-DNA complexes elicits enhanced antitumor immunity // Cancer Gene Ther. 2006. V. 13. - P. 1033-1044.
22. Opanasopit P., Nishikawa M., Hashida M. Factors affecting drug and gene delivery: effects of interaction with blood components // Crit. Rev. Ther, Drug Carr. Syst. 2002. - V. 19. - P.191-233.
23. Labat-Moleur F., Steffan A.-M., Brisson C. et al. An electron microscopy study into the mechanism of gene transfer with lipopoliamines // Gene Ther. 1996. - V. 3. - P. 1010-1017.
24. Hoekstra D., Rejman J., Wasungu L., Shi and F., Zuhorn I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of ail endosome // Biochem. Soc. Transact. 2007. - V. 35. - P. 68-71.
25. Li S., Huang L. Lipidic supramolecular assemblies for gene transfer // J. Liposome Res. 1996. - V. 6. - P. 589-608.
26. Briane D., Lesage D., Cao A., Coudert R., Lievre N., Salzmann J.L., Taillandier E. Cellular Pathway of Plasmids Vectorized by Cholesterol-based Cationic Liposomes // J. of Histochem. and Cytochem. 2002. - V. 50. - P. 983-992.
27. Gao X. and Huang L. Cytoplasmic expression of a reporter gene by co-delivery of T7-RNA-polymerase and T7-promotor sequence with cationic liposomes // Nucleic Acids Res. 1993. - V. 21. - P. 2867-2872.
28. Baraldo K., Leforestier N., Bureau M., et al. Sphingosine-based liposome as DNA vector for intramuscular gene delivery // Pharm. Res. 2002. - V. 19. - P. 1143-1148.
29. Boussif O., Gaucheron J., Santaella Hanno C., Kolbe V.J., Vierling P. Enhanced in vitro and in vivo cationic lipid-mediated gene delivery with a fluorinated glycerophosphoethanolamine helper lipid//J. Gene Med. 2001. -V. 3. - P. 109-114.
30. Kikuchi I.S., Carmona-Ribeiro A.M. Interactions between DNA and synthetic cationic liposomes // J. Phys. Chem. 2000. - V. 104. - P. 2829-2835.
31. Hasegawa S., Hirashima N, Nakanishi M. Comparative study of transfection efficiency of cationic cholesterols mediated by liposomes-based gene delivery. // Bioorg Med Chem Lett 2002. -V. 12. -№9. P. 1299-1302.
32. Константинова И.Д., Ушакова И.П., Серебренникова Г.А. Синтез положительно заряженных липидов с простой эфирной связью. // Биоорганич. химия. 1993. - Т. 19. - № 8. С. 844-848.
33. Kim A., Lee Е.Н., Choi S.H., Kim С.К. In vitro and in vivo transfection efficiency of a novel ultradeformable cationic liposome // Biomaterials. 2004. - V. 25. - P. 305-313.
34. Sen J., Chaudhuri A. Gene transfer efficacies of novel cationic amphiphiles with alanine, beta-alanine, and serine headgroups: a structure-activity investigation // Bioconjug. Chem. 2005. - V. 16. - P. 903-12.
35. Obika S.i, Yu W., Shimoyama A., Uneda Т., Miyashita K., Doi Т., Imanishi T. Symmetrical cationic triglycerides: an efficient synthesis and application to gene transfer // Bioorg. Med. Chem. -2001.-V. 9.-P. 245-254.
36. Herscovici J., Egron M., Quenot A., et al. Synthesis of new cationic lipids from an unsaturated glycoside scaffold // Org. Lett. 2001. - V. 3. - P. 1893-1896.
37. Tranchant I., Thompson В., Nicolazzi C. et al. Physicochemical optimization of plasmid delivery by cationic lipids // J. Gene Med. 2004. - V. 6. - P. 24-35.
38. Niculescu-Duvaz D., Heyes J., Springer C. Structure-activity relationship in cationic lipid mediated gene transfection // Curr. Med. Chem. 2003. - V. 10. - P. 1233-1261.
39. Martin B.,M.Sainlos M., Aissaoui A. The design of cationic lipids for gene delivery. Current pharmaceutical design. 2005.- V. 11.- P. 375-394.
40. Floch V., Loisel S., Guenin E., et al. Cation substitution in cationic phosphonolipids: a new concept to improve transfection activity and decrease cellular toxicity // J. Med. Chem. 2000. -V. 43.-P. 4617-4628.
41. Heyes J. A., Niculescu-Duvaz D., Cooper R. G., et al. Synthesis of novel cationic lipids: Effect of structural modification on the efficiency of gene transfer // J. Med. Chem. 2002. - V. 49. -P. 99-114.
42. Thomas M., Klibanov A. M. Non-viral gene therapy: polication-mediated DNA delivery // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. - V. 62. - P. 27-34.
43. Fortunati E., Bout A., Antonia Zanta M., Valerio D., Scarpa M. In vitro and in vivo gene transfer to pulmonary cells mediated by cationic liposomes // BBA. 1996. V. 1306. - P. 55-62.
44. Imaoka T., Date I., Ohmoto T., Yasuda T., Tsuda M. In vivo gene transfer into the adult mammalian central nervous system by continuous injection of plasmid DNA-cationic liposome complex // Brain Res. 1998. V. 780. - P. 119- 128.
45. Ewert K., Ahmad A., Evans H. M., Scmidt H.-W. and Safinya C. R. Efficient Synthesis and Cell-Transfection Properties of a New Multivalent Cationic Lipid for Non-viral Gene Delivery // J. Med. Chem. 2002. - V. 45. - P. 5023-5029.
46. Lleres D., Dauty E., Behr J., Mely Y., Duportail G. DNA condensation by an oxidizable cationic detergent. Interactions with lipid vesicles // Chem. Phys. Lipids. 2001. - V. 111. - P. 59-71.
47. Vigneron M. J.-P., Oudrhirt N., Fauquet M., et al. Guanidinum-cholesterol cationic lipids: Efficient vectors for the transfection of eukaryotic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93.-P. 9682-9686.
48. Frederic M., Schennan D., Byk G. Introduction of cyclic guanidines into cationic lipids for non-viral gene delivery // Tetrahedron Lett. 2000. V. 41. P. 675- 679.
49. Perez L. Pinazo A., Vinardell P., et al. Synthesis and biological properties of dicationic arginine-diglycerides //New J. Chem. 2002. - V. 26. - P. 1221-1227.
50. Noguchi A., Furuno T., Kawaura C., Nakanishi M. Membrane fusion plays an important role in gene transfection mediated by cationic liposomes // FEBS Lett. 1998. - 433. - P. 169-173.
51. Heyes J. A., Niculescu-Duvaz D., Cooper R. G., et al. Synthesis of novel cationic lipids: Effect of structural modification on the efficiency of gene transfer // J. Med. Chem. 2002. - V. 49. - P. 99-114.
52. Maitani Y., Igarashi S., Sato M., Hattori Y. Cationic liposome (DC-Chol/DOPE = 1:2) and a modified ethanol injection method to prepare liposomes, increased gene expression // Int. J. of Pharm. 2007. - V. 342 - № 1. - P. 33-39.
53. Read M.L., Singh S. Ahmed Z. A versatile reducible polycation-based system for efficient delivery of a broad range of nucleic acids // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33:
54. Wyman B., Nicol F., Zelphati O., Scaria P.V., Plank C., Szoka F.C. Jr. Design, synthesis, and characterization of a cationic peptide that binds to nucleic acids and perméabilités bilayers // Biochem. 1997. - V. 36. - 3008-3017.
55. Smith L.C., Duguid J., Wadhwa M.S., Logan M.J., Tung C.H., Edwards V., Sparrow J. T. Synthetic peptide based DNA complexes for non-viral gene delivery // Adv. Drug Deliv. Rev. -1998. V. 30.-P. 115-131.
56. Kim H.H., Lee W.S., Yang J.M., Shin S. Basic peptide system for efficient delivery of foreign genes//BBA. -2003. V. 1640.-P. 129- 136.
57. K. Rittner, A. Benavente, A. Bompard-Sorlet, F. Heitz, G. Divita, R. Brasseur, E. Jacobs, New basic membranedestabilizing peptides for plasmid-based gene delivery in vitro and in vivo II Molec. Ther. 2002. - V. 5. - P. 104- 114.
58. Tokunaga M., Hazemoto N., Yotsuyanagi T. Effect of oligopeptides on gene expression: comparison of DNA/peptide and DNA/peptide/Iiposome complexes // Int. J. Pharm. 2004. - V. 269.-P. 71-80.
59. Ewert, K. K., Ahmad, A., Evans, H. M., Safinya, C. R. Cationic lipid-DNA complexes for non-viral gene therapy: relating supramolecular structures to cellular pathways // Expert Opin. Biol. Ther. 2005. - V. 5.-P. 33-53.
60. Miguel M.G., Pais A., Dias R.S., Leal C., Rosa M., Lindman B. DNA-cationic amphiphile interactions // Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. 2003. - V. 228. - P. 43-55.
61. Chesnoy S., Huang L. Structure and function of lipid-DNA complexes for gene delivery // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2000. V. 29. P. 27-47.
62. Dunlap D., Maggi A., Soria R., Monaco L. Nanoscopic structure of DNA condensed for gene delivery//Nucleic Acids Res. 1997. -V. 12.- P. 3095-3101.
63. Thomson N. H., Collin I., Davies M.C. et al. Atomic Force Microscopy of Cationic Liposomes II Langmuir. 2000. V. 16. P. 4813-4818.
64. Elouahabi A., Ruysschaert J. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes // Molecular therapy.- 2005. V. 11.- №3.- P. 336-347.
65. Zuliorn I. S., Visser W. II., Bakowsky U. et al. Interference of serum with lipoplex-cell interaction: modulation of intracellular processing // Biochimica et Biophysica Acta. 2002. - V. 1560. - P. 25-36.
66. Choosakoonkriang S., Wiethoff C. M., Anchordoquy T. J., et al. Infrared Spectroscopic Characterization of the Interaction of Cationic Lipids with Plasmid DNA // J. Biol. Chem. 2001. -V. 276.-№. 11.-P. 8037-8043.
67. Pohle W., Selle C. Gauger D. R. FTIR spectroscopic characterization of a cationic lipid-DNA complex and its components // Phys. Chem. Chem. Phys. 2000. - V. 2. - P. 4642-4650.
68. Farago O., Ewert K., Ahmad A., Evans H.M., Grunbech-Jensen N., Safinya C.R. Transitions between Distinct Compaction Regimes in Complexes of Multivalent Cationic Lipids and DNA // Biophys. J. 2008. - V. 95. - P. 836-846.
69. Li S., Huang L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes // Gene Ther.- 1997,- V. 4.- P. 891-900.
70. Plane C., Mechtler K., Szoka F. C., et al. Activation of the complement system by synthetic DNA complexes: A potential barrier for intravenous gene delivery // Hum. Gene Ther.- 1996,- V. 7,- P. 1437-1446.
71. Andresen T.L.,. Jensen S.S, Jorgensen K. Advanced strategies in liposomal cancer therapy: Problems and prospects of active and tumor specific drug release // Progress in Lipid Res. 2005. -V. 44. - P. 68-97.
72. Kostarelos K. Rational design and engineering of delivery systems for therapeutics: biomedical exercises in colloid and surface science // Adv. in Colloid and Interface Sci. 2003. - V. 106. - P. 147-168.
73. Vlerken L.E., Vyas T.K., Amiji M.M. Poly(ethylene glycol)-modified nanocarriers for tumor-targeted and intracellular delivery // Pharm. Res. 2007. - V. 24. - № 8. P. 1405-1414.
74. Heyes J., Hall K., Tailor V., Lenz R., MacLachlan I. Synthesis and characterization of novel poly(ethylene glycol)-lipid conjugates suitable for use in drug delivery // J. of Controll. Release. -2006.-V. 112. P. 280-290.
75. Hashizaki K., Taguchi H., Sakai H., Abe M., Saito Y., Ogawa N. Carboxyfluorescein leakage from poly(ethylene glycol)-grafted liposomes induced by the interaction with serum II Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 2006. V. 54. - № 1. - P. 80-4.
76. Judge A.D., McClintock K. Shaw J.R., MacLachlan I. Hypersensitivity and loss of disease site targeting caused by antibody responses to pegylated liposomes // Mol. Ther. 2006. - V. 13. - P. 328-337.
77. Maruyama K., Okuizumi S., Ishida O. Phosphatidyl polyglycerols prolong liposomes circulation in vivo. Int. J. of Pharmaceutics. 1994. V. - 111. - P. 103-107.
78. Gregoriadis, G., McCormack, B., Wang, Z., and Lifely, R. Polysialic acids: potential in drug delivery // FEBS Lett. 1993. - V. 315. - P. 271-276.
79. Rooijen. N., Bakekr J., Sander. A. Transient suppression of macrophage function by liposomes-encapsulated drugs // Trends Biotechnol. 1997. - V. 15. - P. 178-185.
80. Sapra P, Allen T.M. Ligand-target liposomal anticancer drugs // Prog. Lipid. Res. 2003. - V. 42. - P. 439-62.
81. Cavalli S., Tipton A.R., Overhand M., Kros A. The chemical modification of liposome surfaces via a copper-mediated 3 + 2. azide-alkyne cycloaddition monitored by a colorimetric assay // Chem. Commun. 2006. - P. 3193-3195.
82. Kok R.J., Schraa A. J., Bos E.J., et al. Preparation and Functional Evolution of RGD-Modified Proteins as Integrin Directed Therapeutics // Bioconjugate Chem. 2002.- V. 13.- P. 128-135.
83. Gabizon A., Shmeeda H., Horowitz A.T., Zalipsky S. Tumor cell targeting of liposome-entrapped drugs with phospholipid-anchored folic acid-PEG conjugates // Adv. Drug Del. Rev. -2004.-V. 56-P. 1177- 1192
84. Saul J. M., Annapragada A., Natarajan J. V., Bellamkonda Ravi V. Controlled targeting of liposomal doxorubicin via the folate receptor in vitro II J. of Control. Release. 2003. - V. 92. - P. 49-67.
85. Leamon C.P., Cooper S.R., Hardee G.E. Folate-liposome-mediated antisense oligodeoxynucleotide targeting to cancer cells: Evaluation in vitro and in vivo 11 Bioconjugate Chem. 2003. - V. 14. - P. 738-47.
86. Pan X.Q., Wang H.Q., Lee R.J. Antitumor Activity of Folate Receptor-Targeted Liposomal Doxorubicin in a KB Oral Carcinoma Murine Xenograft Model // Pharm. Res. 2003. - V. 20. - P. 417-22.
87. Reddy J.A., Abburi C., Hofland H. Howard S.J., Vlahov I., Wils P., Leamon C.P. Folate-targeted, cationic liposome-mediated gene transfer into disseminated peritoneal tumors // Gene Ther. 2002. - V. 9. - P. 1542-1550.
88. Gabizon A., Shmeeda H., Horowitz A.T., Zalipsky S. Liposomes as targeted drug delivery systems in the treatment of breast cancer // Adv. Drug Del. Rev. 2004. - V. 56. - P. 1177-92.
89. Faivre V., de Lourdes Costa M., Boullanger P., Baszkin A., Rosilio V. Specific interaction of lectins with liposomes and monolayers bearing neoglycolipids // Chem. and Phys. of Lipids. 2003. - V. 125. - 147-159
90. Hisayasu S., Miyauchi M., Akiyama K., Gotoh T., Satoh S. and Shimada T. In vivo targeted gene transfer into liver cells mediated by a novel galactosyl-D-lysine/D-serine copolymer // Gene Ther. 1999. - V. 6. - №. 4. - P. 689-693.
91. Walton C.M., Wu C.H., Wu G.Y. A DNA delivery system containing listeriolysin O results in enhanced hepatocyte-directed gene expression // World J. of Gastroenterology. 1999. - V. 5. № 6. V. 465-469.
92. Wang S., Deng Y., Xu H., Wu H., Qiu Y., Chen D. Synthesis of a novel galactosylated lipid and its application to the hepatocyte-selective targeting of liposomal doxorubicin // Eur. J. of Pharm, and Biopharmaceutics. 2006. - V. 62. - P. 32-38.
93. Zhu J., Yan F., Guo Z., Marchant R.E. Surface modification of liposomes by saccharides: Vesicle size and stability of lactosyl liposomes studied by photon correlation spectroscopy // J. of Colloid and Interface Sei. 2005. - V. 289. - P. 542-550.
94. Tang C.K., Lodding J., Minigo G. Pouniotis D.S., Plebanski M., Scholzen A., McKenzie I., Pietersz G.A., Apostolopoulos V. Mannan-mediated gene delivery for canccr immunotherapy // Immunology. 2007. - V. 120. - P. 325-335.
95. Bhattacharya S. Bajaj A. Recent advances in lipid molecular design // Curr. Opin. in Chem.l Biol. 2005. - V. 9. P. 647-655.
96. Drummond D.C., Zignani M. Leroux J. Current status of pH-sensitive liposomes in drug delivery // Prog. Lipid Res. 2000. - V. 39. - P. 409-60.
97. Sakaguchi N., Kojima C., Harada A., Koiwai K., Emi N., Kono K. Effect of Transferrin As a Ligand of pH-Sensitive Fusogenic Liposomc-Lipoplex Hybrid Complexes // Bioconjug. Chem. -2008. -V. 19. P. 1588-1595.
98. Guo X., MacKay J.A., Szoka F.C. Mechanism of pH-Triggered Collapse of Phosphatidylethanolamine Liposomes Stabilized by an Ortho Ester Polyethyleneglycol // Lipid Biophys. J. 2003. - V. 84. - P. 1784-95.
99. Spratt T., Bondurant B., O'Brien D.F. Rapid release of liposomal contents upon photo initiated destabilization with UV exposure // BBA. 2003. - V. 1611. - P. 35-43.
100. Drummond D.C,. Noble C. O , Hayes M. E., Park J.W., Kirpotin D.B. Pharmacokinetics and in vivo drug release rates in liposomal nanocarrier development // J.of Pharm. Sei. 2008. - V. 97. -№11. - P. 4696 - 4740.
101. Bisby RH, Mead C, Morgan CG. Active-uptake of drugs into photosensitive liposomes and rapid release on UV photolysis. // Photochem. Photobiol. 2000. - V. 72. - P. 57-61.
102. Meers P. Enzyme-activated targeting of liposomes // Adv. Drug. Del. Rev. 2001. - V. 53. -№ 3. P. 265-72.
103. Foged C., Nielsen H.M., Frokjae S. Phospholipase A2 Sensitive Liposomes for Delivery of Small Interfering RNA (siRNA) // J. of Liposome Res. 2007. - V. 17. - P. 191 - 196.
104. Millan J.8L., Fishman W.H. Biology of human alkaline phosphatases with special reference to cancer// Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 1995. - V. 32. - P. 1-39.
105. Себякин Ю.Л. Буданова У.А. «рН-Чувствительные катионные липопептиды для создания транспортных систем медицинского назначения» // Биоорган, химия. 2006. - Т. 32. №5. -С. 453-458.
106. Себякин Ю.Л., Федякова И.Л, Рунова Т.Л. Синтез алифатических производных L-серина//Биоорган. химия.-1994.-Т.20.-№10.-С. 1101-1106.
107. Позднев В.Ф., Подгорнова H. Н., Зенцова Е. К., Ауконе Г. И., Калей У. О. // Химия природных соединений.- 1979.- № 4,- С. 543-548.
108. Позднев В.Ф. N", N', Л;; -трп-/»/;е?/»-бутилоксипирокарбониларгинин новое производное аргинина для пептидного синтеза// Биоорган, химия.- 1986.- Т. 12.- № 8.- С. 1013-1022.
109. Anderson G.W., Zimmerman J.E. Callahan F.M. The use of esters of vV-hydroxysuccinimide in peptide synthesis // J. Amer. Chem. Soc. 1964. - V. 86. - P. 1839-1842.
110. Себякин Ю.Л., Буданова У.А., Гурьева Л.Ю. «Структурно-функциональное разнообразие искусственных мембран на основе катионных липопептидов» // Биологии, мембраны. 2007. - Т. 24. №3. - С. 273-279.
111. Yurii L. Sebyakin, Uliyana A. Budanova and Lyudmila Yu. Gur'eva «Self-organising aggregates of lipodipeptides in aqueous medium and their complexes with DNA» // Mendeleev Comm. 2007. -V. 17. - P. 188-189.
112. Tanhuanpaa K., Virtanen J., Somerharju P. Fluorescence imaging of pyrene-labeled lipids in living cells // BBA. 2000. - V. 1497. - № 3. - P. 308-320.
113. Boissonnas R. A., Guttmann St., Jaquenoud P.-A., Waller J.-P., Cherbuliez E., Stoll A. Une nouvelle synthèse de l'oxytocine // Helv. Chim. Acta. 1955. - V. 38. - P. 1491-1501.
