Синтез композиционных сорбентов на основе фторированных полибутадиенов для выделения нуклеиновых кислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

; гс ОД

КАПУСТИН ДМИТРИЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

СИНТЕЗ КОМПОЗИЦИОННЫХ СОРБЕНТОВ НА ОСНОВЕ ФТОРИРОВАННЫХ ПОЛИБУТАДИЕНОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Специальность 02.00.06. - Химия высокомолекулярных соединений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА 2000

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Зубов Виталий Павлович

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, ст.н.с. Тверской Владимир Аркадьевич кандидат химических наук, ст.н.с. Мурзабекова Тамара Гаджиевна

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева.

Защита состоится мая 2000 г. в часов на заседании Диссертационного Совета

Д 063.41.05 в Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова по адресу: 119831, Москва, Г-435, ул. М. Пироговская, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

Отзывы на автореферат направлять по адресу:

117571, г. Москва, пр. Вернадского 86, МИТХТ им. М.В. Ломоносова, Автореферат разослан "

апреля 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 063.41.05, д.х.н., профессор ^ ^ Грицкова

А Я.. С

£ аьо я;л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. При создании композиционных полимерсодержащих сорбентов для выделения и очистки биополимеров наиболее перспективны пористые кремнеземы с иммобилизованными полимерными фазами. В частности, применение фторсодержащих полимеров в качестве модификаторов кремнеземных носителей позволило создать ряд сорбентов, характеризующихся высокой хемостойкостью, гидролитической стабильностью и уникальными сорбционными свойствами. Однако трудности, возникающие при проведении полимеризации фторсодержащих мономеров, а также при масштабировании процессов получения фторполимерсодержащих композиционных сорбентов стимулируют поиск и реализацию новых подходов при создании подобных материалов. Одним из таких подходов является фторирование предварительно иммобилизованных на поверхности носителя тонких полимерных пленок с применением дифторида ксенона, что позволяет получать сорбенты с повышенным содержанием фтора. Такие сорбенты при значительном снижении неспецифической сорбции характеризуются высокой селективностью в процессах выделения высокочистых препаратов нуклеиновых кислот из различных источников.

Цель работы: создание композиционных полифторбутадиенсодержащих сорбентов для выделения и очистки нуклеиновых кислот. Определение оптимальных параметров при получении таких сорбентов, а также исследование их структурных характеристик и адсорбционных свойств в процессах выделения ДНК из различных источников.

Научная новизна:

1. Предложен новый способ получения композиционных фторполимерсодержащих сорбентов, заключающийся в проведении фторирования полимерной фазы, предварительно иммобилизованной на поверхности дисперсных объемно-пористых носителей. Определены оптимальные условия для иммобилизации и фторирования полимерной фазы.

2. Впервые при получении композиционных полифторполимерсодержащих сорбентов на основе объемно-пористых кремнеземов использован дифторид ксенона в качестве фторирующего агента.

3. Показано, что при использовании дифторида ксенона в качестве фторирующего

агента возможно получать а мягких условиях композиционные полифторбутадиенсодержащие сорбенты, сохраняющие пористость и механическую прочность, присущие исходному носителю, и вместе с тем отличающиеся повышенным содержанием фтора, что исключает неспецифическую сорбцию при выделении нуклеиновых кислот.

4. Показано, что синтезированные предлагаемым способом сорбенты отличаются повышенной гидролитической стабильностью в щелочных средах.

5. Показано, что полученные сорбенты оказываются более эффективными в сравнении с коммерческими аналогами при выделении чистых ДНК с высоким выходом за счет снижения неспецифической сорбции.

Практическая значимость: предложены новые композиционные полифторбутадиенсодержащие сорбенты на основе объемно-пористых кремнеземов, которые характеризуются контролируемой пористостью, гидролитической стабильностью, высокой селективностью и позволяют получать чистые препараты ДНК из различных источников с высоким выходом. Автор защищает:

1. Способ получения композиционных полифторбутадиенсодержащих сорбентов на основе дисперсных объемно-пористых носителей, отличающихся высокой селективностью при выделении и очистке нуклеиновых кислот.

2. Оптимальные условия получения сорбентов, обеспечивающие иммобилизацию равномерной тонкой пленки полимера на поверхности объемно-пористых частиц носителя, а также повышенное содержание фтора в иммобилизованных полимерных пленках.

3. Дифторид ксенона в качестве фторирующего агента для получения композиционных полифторбутадиенсодержащих сорбентов с повышенным содержание фтора, обусловливающим низкий уровень неспецифической сорбции при выделении нуклеиновых кислот.

4. Оптимальные значения молекулярной массы и состав исходных олигобутадиенов, используемых при иммобилизации тонких полимерных пленок на поверхности объемно-пористых носителей для последующего фторирования.

5. Композиционные полифторбутадиенсодержащие сорбенты на основе кремнеземов для получения чистых препаратов ДНК из различных источников с высоким выходом.

Апробация работы: отдельные результаты работы докладывались на

международных конференциях: "18th International Symposium 011 Column Liquid Chromatography" (1993), "Third International Symposium on Bioorganic Chemistry" (1995), " 17th DECHEMA Arnual Meeting on Biotechnology" (1999), на "VII всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии" (1997), на научно-практической конференции "Биомедицинские технологии" (1996).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах

машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, литературный обзор, исходные вещества и методы исследования, результаты и их обсуждение, выводы; включает ■/О таблиц и рисунков. Библиография содержит 150

наименований.

ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА

Макропористые стекла: МПС-2000ГХ, МПС-1150ГХ, МПС-500ГХ, МПС-250ГХ (Горьковский опытный завод ВНИИ НП, Россия, фракция 0.25-0.5 мкм); CPG-10-500 (,Proligo, Германия, фракция 100 мкм); GPB-500-Trisopor™ (Shuller, Германия, фракция 100-200 мкм).

Олигобугадиены: средняя М,~10000, сод. 1,2-зв. - 30%, 1,4-зв. - 70% (Горьковский Опытный завод ВНИИ НП, Россия); средняя М„~5000, сод. 1,2-зв. - 20%, сод. 1,4-зв. - 80%; средняя М.-4500, сод. 1,2-зв. - 20%, сод. 1,4-зв. - 80% (Aldrich, Германия).

н-Пентан (t0™,, = 36.07, ТУ 6-09 3661-74), метиловый спирт (t0™,. = 64.5, ГОСТ 5962-67), кислота соляная (ГОСТ 3118-77) - все марки х.ч.; вода- стандартMilli Q.

Ферменты, бактериальные штаммы, компоненты лизирующей системы -предоставлены фирмой MIIM-Diagnnstica, GmbH, Германия.

Образцы плазмид предоставлены лабораторией генной инженерии Учебного центра ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.Препараты человеческой кррви предоставлены Научно-исследовательской лабораторией прикладной экологии Мцнздравмедпрома РФ, Москва.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Макропористые стекла модифицировали олигобутадиеном с помощью установки, представляющей собой вакуумируемый сосуд с навеской носителя (10-15 г), соединенный со снабженным поршнем цилиндром, содержащим предварительно подготовленный раствор олигобутадиена (0.125-1.25 г /г носителя) в н-пентане (45-50 мл). После вакуумирования линию насоса перекрывали, подавали раствор олигомера через трубку, устроенную таким образом, что раствор, проходя сквозь слой носителя, смачивал его, заполняя поры частиц. Затем сосуд помещали на 15 мин в ванну для обработки ультразвуком при атмосферном давлении. Растворитель отгоняли на роторном испарителе (3 ч, 30 об/мин) с использованием водяной бани (70°С). Проводя последующую сушку в вакуумном сушильном шкафу при комнатной температуре в течение 6 ч, получали полупродукт, который подвергали фторированию.

Фторирование полимерной фазы, адсорбированной на поверхности пор носителя, проводили на специальной установке в режиме «псевдоожижения», продувая током аргона пары Хер2, возгоняемого в специальной камере при 65° С в течение 1-4 ч через реакционную трубку, заполненную навеской сорбента. Материал в бескислородных условиях переносили в вакуумируемую камеру, выдерживали 1.5 - 4 ч при 25 - 80°С, затем сорбент отмывали метанолом (экстрактор Сокслста, 20 циклов, 4 ч) и сушили при 40°С в вакууме (6 ч).

Элементный анализ проводили в МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

Ртутную норометрию образцов сорбента проводили на приборе «Роге 81гег 9300» (Мюготегеисз, США). Численные значения среднего диаметра и удельного объема пор для построения порограмм определяли, используя разработанный в лаборатории "Полимеры для биологии" ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН алгоритм расчета для ЭВМ.

УФ-исследование проводили на УФ-спектрофотометре 011-70 (Весктап, США).

Очистку препаратов плазмидных п бактериальных ДНК осуществляли, внося клеточный лизат (100 - 400 мкл) в пластиковые картриджи (7x25 мм), содержащие 0.03 -30 мг полифторбутадиенсодержащего сорбента. Картриджи элюировали ТЭ-буфером самотеком либо центрифугируя в течение 1 мигг при 2000 об/мин. Фракции элюата

собирали в микропробирки. Наличие ДНК во фракциях подтверждали спектрофотометрически и по результатам электрофореза в 0.8% агарозном геле в ТБЭ-буфере.

Белковый электрофорез проводили по стандартной методике, используя разделяющий и концентрирующий полиакриламидные гели, в присутствии додецилсульфата натрия.

Выделение ДНК из лизированных препаратов ядрасодержащих клеток крови человека, обработанных протсиназой К, проводили, нанося 200 мкл образца на колонку (7x26 мм), содержащую сорбент МПС-2000ГХ-ПФБД. Использовали линейный градиент изопропанола (0 - 70%, 60 мин) в ТЭ-буфере.

Очистку ДНК из крови человека сорбцией примесей в объеме проводили, разбавляя в два раза ТЭ-буфером препарат, полученный после лизиса клеток и обработки протеиназой К, который вносили в пробирку, содержащую суспензию сорбента в ТЕ-буфере, инкубировали 10 мин, седиментировали 2 мин на настольной центрифуге при 3000 об/мин и отбирали супернатант. Далее процесс повторяли с новой порцией ТЭ-буфера.

Лизис бактериальных клеток проводили, по методике, разработанной фирмой MIRA-Diagnosüca, GmbH, Германия. Метод включал обработку клеточных осадков буферными растворами, содержащими лизоцим, протеиназу, РНКазу, а также смесью детергентов.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР-аналиэ) проводили по стандартной схеме с использованием 96-луночного амплификатора Perkin Elmer (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Обоснование выбора исходных реагентов.

Свойства композиционных полимерсодержащих сорбентов определяются особенностями иммобилизованной на поверхности носителя полимерной фазы, а также структурой и свойствами носителя. Принято считать (Snyder L.R., Kirkland J.J., 1979; Лисичкин Г.В. и др., 1986; Сабуров В.В., 1989), что «идеальный сорбент» одновременно должен характеризоваться нерастворимостью и (как правило) ненабухаемостью; проницаемостью для макромолекул; высокой жесткостью; контролируемой пористостью; достаточно большой удельной поверхностью; низкой неснецифической и

необратимой сорбцией; биологической стабильностью; способностью к направленной поверхностной модификации; регенерируемостью.

Отчасти этим требованиям удовлетворяют объемно-пористые кремнеземы, традиционно используемые в хроматографии биополимеров. Однако нестабильность при высоких и низких значениях рН, а также высокий уровень неспецифической сорбции сильно ограничивают применение таких материалов. В то же время возможность выбора типа пористого кремнезема с четко заданными значениями диаметра пор и площади поверхности позволяет с успехом применять кремнеземы в качестве носителей при создании стабильных композиционных сорбентов для выделения и очистки нуклеиновых кислот и белков. Особый интерес представляют кремнеземы, структура которых характеризуется наличием макропор (диаметром свыше 50 нм), проницаемых для макромолекул биополимеров. В настоящей работе в качестве носителей для получения сорбентов выбраны макропористые стекла (МПС) со средними значениями диаметров пор от 25 до 200 нм.

При создании композиционных фторполимерсодержащих сорбентов автором предложено использовать олигобутадиены, поскольку эти вещества доступны, способны к химической модификации и могут образовывать тонкие покрытия в результате физической сорбции на неорганических поверхностях. Тестировали выпускаемые в промышленности образцы с М„ 4500, 5000 и 10000, содержащие 1,4-цис-, 1,4-транс- и 1,2-звенья.

Способность проникновения макромолекул в поры носителя для создания однородной полимерной пленки при сорбции полимера из раствора определяется, в частности, размером макромолекулы в растворе. При этом размер возрастает с ростом молекулярной массы. Как известно, определив коэффициент поступательной диффузии из уравнения Цветкова и Кленина (Нефедов П.П., Лавренко П.Н., 1979) и гидродинамический радиус макромолекулы по формуле Стокса-Эйнштейна (Геллер Б.Э. и др., 1996), можно оценить среднее время сорбции ( при диффузии макромолекул олигобутадиена в частицу носителя радиусом И:

I - Л2/(]50р),

где Ор - исправленный с учетом линейности макромолекулы коэффициент поступательной диффузии (см2/с). Для олигобутадиена с М„ 4500 эта величина в зависимости от вязкости раствора может изменяться примерно от 20 с до 26 мин, в то время как для олигобутадиена с М„ 10000 расчетные времена сорбции возрастают

примерно на одну треть. Эти значения рассчитаны с учетом зависимости констант, входящих в уравнение Марка-Хаувишса-Флори, от конформации макромолекулы в растворе, термодинамического качества растворителя и температуры. Таким образом, вычисленные значения представляют собой предельные величины. Время контакта раствора олигобутадиена с частицами носителя в предлагаемой автором методике составляет 25 мин и практически включает весь диапазон значений для использованных образцов олигобутадиенов. В то же время размеры молекул олигобутадиенов и рассчитанные значения времени сорбции указывают на высокую проницаемость пор в макропористых стеклах для молекул олигобутадиенов, что обеспечивает возможность получения однородной пленки на внутренней поверхности пор носителя как при сорбции из раствора, так и в процессе удаления растворителя.

Равномерность распределения олигобутадиена различной молекулярной массы по поверхности частиц МПС с различными диаметрами пор оценивали по результатам ртутной порометрии. Полученные при этом значения средних диаметров пор (с/, им) и снижения удельного объема пор (V, см3/г) представлены в таблице 1.

Таблица X.

Изменение среднего диаметра пор нм) и удельного объема пор (V, см'/г) при иммобилизации олигобутадиенов на кремнеземах в зависимости от молекулярной массы

олигомеров и пористости исходного носителя.

Средняя молекулярная масса олигобутадиена

без покрытия 4500 5000 Г 10000

В V 11 V а V с1 V

25 0.550 21 0.280 0241 12 0.011

52 1.214 49 0.912 50 0.715 25 0.017

15 1.660 112 1.156 113 1.102 56 0.062

200 1.760 197 1.251 198 1.292 98 0.154

Из этих данных следует, что нанесение олигобутадиенов различной молекулярной массы в количествах, соответствующих по расчету получению бимолекулярного слоя, приводит в случае низкомолекулярных образцов к значительно меньшему изменению объема и диаметра пор, по сравнению с исходным носителем, чем при нанесении более высокомолекулярного образца. В последнем случае удельный объем и средний эффективный диаметр пор значительно снижаются из-за закупорки пор. Таким образом, эффективная толщина олигомерного покрытия уменьшается с понижением молекулярной массы образца. Заметное снижение объема пор (на 25%

вместо расчетных 15%) при использовании олигобутадиенов с молекулярной массой 5000 и 4500 объясняется, по-видимому, тем, что нефторированная полимерная фаза дополнительно не стабилизирована на поверхности носителя межмолекулярными связями и при проведении порометрии смещается ртутью во внутренний объем пор, образуя пробки в узких порах. Использовать олигобутадиен с молекулярной массой менее 4500 нецелесообразно, гак как вязкость образуемых ими в н-пентане растворов весьма незначительна, что приводит к неравномерному распределению олигомера по поверхности носителя при пропитке слоя носителя раствором олигомера.

То обстоятельство, что непредельные углеводороды можно фторировать, обрабатывая их дифторидом ксенона, имеет принципиальное значение, т. к. наличие атомов фтора в макромолекуле придает полимерам уникальные сорбционные свойства. Фторсодсржащие полимеры в силу высокой хемостойкости и способности образовывать однородные покрытия, хорошо экранируют поверхность неорганического носителя от воздействия агрессивных сред, а также характеризуются высокой селективностью и отсутствием неспецифической сорбции.

В настоящей работе предложен способ фторирования предварительно иммобилизованной полимерной фазы, заключающийся в обработке олигобутадиена, иммобилизованного на поверхности носителя, парами дифторида ксенона Хер]. Такой способ позволяет, с одной стороны, избежать сложностей в аппаратурном оформлении, которые обычно имеют место при проведении полимеризации фторсодержащих мономеров, а с другой стороны, варьируя условия фторирования, получать стабильные сорбенты с заданной селективностью. При фторировании полидиенов со временем образуется поверхностный фторированный слой, далее скорость процесса определяется диффузией реагентов в полимер. В настоящей работе иммобилизованная полимерная фаза представлена тонким (толщиной 20-30А) слоем, распределенным по развитой поверхности, причем фторирование проводится парами дифторида ксенона в условиях «псевдоожижения» порошкообразного носителя. При этом требуется значительно меньше времени, чем при фторировании в растворе, гак как при этом диффузия реагентов во внутренний объем пор происходит быстрее, чем в жидкости. Так, максимальная степень фторирования с использованием дифторида ксенона, определяемая по относительному привесу образца (25%), была достигнута при фторировании пленок 1,4-полибутадиена толщиной 20 мкм при 10-ти часовой

и

обработке. В разработанной автором методике оптимальная продолжительность фторирования не превышала 3 ч.

Таким образом, в настоящей работе для получения стабильных высокосслективных композиционных сорбентов для выделения и очистки биополимеров проводили иммобилизацию тонких пленок олигобутадиена с М„ 4500 с содержанием 1,4-цис- и 1,4-тиранс-звеньев - 80% и 1,2-звеньев - 20% с последующим фторированием дифторидом ксенона.

2. Синтез композиционных полифторбутадиенсодержащих сорбентов.

На первой стадии получения композиционного фторполимерсодержащего сорбента на поверхность макропористых стекол наносили топкий слой олигобутадиена по разработанной методике, которая, как показано ниже, обеспечивала равномерное покрытие как внешней, так и внутренней поверхности носителя олигомером.

В специальный сосуд помещали навеску макропористого стекла и вакуумировали при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего линию насоса перекрывали. Затем по трубке подавали раствор олигомера, который, проходя через слой носителя, равномерно смачивал его, впитываясь в поры частиц. Далее сосуд помещали на 15 мин в ванну для обработки ультразвуком при атмосферном давлении. Как известно, ультразвуковая обработка значительно повышает проницаемость системы для растворенных молекул олигомера (Мейсон Т. и др., 1993). Вместе с тем, при воздействии ультразвука полимеры могут подвергаться разрушению. Однако, для деструкции полимера необходим ряд условий: насыщение раствора полимера низкорастворимыми газами, использование растворителей с низким давлением пара, использование пониженных температур, понижение концентрации раствора и высокие (свыше 30 000) молекулярные массы полимера. В настоящей работе перечисленные условия не выполняются. Поэтому при обработке ультразвуком (при частоте 25 кГц) суспензии, содержащей частицы МПС (40 % об.) в н-пентане (1кип=36.07) и олигобутадиен (50 % масс.), деструкции последнего не происходило. После обработки суспензии ультразвуком, растворитель отгоняли на роторном испарителе (3 ч, 30 об/мин).

Оптимальные параметры загрузки по олигобутадиену определяли с помощью ртутной порометрии. При этом использовали количества олигобутадиена, соответствующие по расчету получению моно-, ди-, три-, пяти- и 10-молекулярных

слоев. Анализ порограмм показал, что если у исходного стекла марки СРВ-500-Тторог™ значения удельного объема пор и среднего диаметра пор составляли 1.214 см3/г и 52 нм соответственно, то при загрузке, требуемой для образования бимолекулярного слоя - эти значения снижались до 0,727 и 49-50 соответственно, при тримолекулярном слое - до 0,553 и 47, при 10-ти - поры практически отсутствовали (0,017 и полимодальное распределение пор по размерам от 20 до 40 нм). При интенсивном испарении растворителя раствор полимера и пограничный слой паровоздушной смеси над образующейся пленкой сильно охлаждаются. По этой причине, в частности, удаление растворителя осуществляли в два этапа. На первом этапе растворитель удаляли током воздуха для обеспечения более плавного роста концентрации олигомера в приповерхностном слое. После того, как сорбент становился сыпучим, удаление остаточного растворителя, а также сушку сорбента осуществляли в вакууме. Для предотвращения значительного снижения температуры при удалении паров растворителя использовали водяную баню (70° С).

Таким образом, разработанная методика обеспечивала равномерное распределение олигомера на поверхности частиц макропористого носителя.

Ранее было показано (Барсамян Г.Б., 1997; Прудникова О.А., 1999), что дифторид ксенона эффективно взаимодействует с полимерной поверхностью и модифицирует её. Так, при фторировании полиолефинов происходит последовательное замещение атомов водорода фтором. В качестве примера ниже приведены схемы реакций, протекающих при фторировании полиэтилена дифторидом ксенона:

ХеГ2 -> ХеР* +Г* ХеР*-»Хе + Г* -СНз-СНо- + |Р]-> -СН2-*СН- + НР -СН2-*СН- + [Р| -> -СН2-СНК-

-СН2-*СН- + (>2 -» -СНг-СН- -> продукты окисления

I

о-о*

Как видно из приведенной схемы, фторирование целесообразно проводить в бескислородных условиях. Действительно, при этом содержание фтора в образце увеличивается в 3 — 6 раз по сравнению с образцом, фторированным в присутствии кислорода. Можно ожидать, что замещение атомов водорода фтором в полидиенах, имеющих кратные связи, будет протекать легче, чем в полиолефинах, за счет наличия подвижных аллильных атомов водорода при двойной связи. Кроме того, возможно

непосредственное присоединение атомов фтора по кратной связи. В результате суммарная скорость фторирования полидиенов на 1,5-2 порядка выше, чем скорость фторирования полиолефинов. Как и в случае полиолефинов, проведение фторирования в бескислородных условиях (в атмосфере аргона) исключает появление полярных групп, наличие которых в сорбенте могло бы значительно увеличить уровень неспецифической сорбции. В отличие от полиолефинов, при фторировании полимеров с кратными связями, происходит эффективное структурирование полимерного слоя, как в результате рекомбинации макрорадикалов друг с другом за счет отрыва атома водорода с образованием межмолекулярной связи, так и в результате присоединения радикалов по кратным связям. Эти процессы приводят к получению сшитых полимерных покрытий с повышенным содержанием фтора. Варьируя температуру и время проведения процесса, можно изменять степень фторирования в широких пределах, что подтверждается, в частности, данными элементного анализа. Так, количество связанного фтора изменяется (в пересчете на массу полимерной фазы) с 25% масс, в случае фторирования в течение 1.5 ч до 53% масс, в случае 3-х часового фторирования. Схематически основные реакции, протекающие при фторировании полибутадиенов на примере 1,4-звена представлены ниже

УИ [К]

-СНГСН=СН-*СН- + НР -СНгСНР-*СН-СН2- —> -СН2-СНГ-СНР-СН2-

Скорость фторирования определяется главным образом диффузией реагентов в полимер. Продолжительность фторирования определялась степенью замещения атомов водорода на фтор, а также необходимостью предотвратить разрушение поверхности неорганического носителя. Серию экспериментальных образцов сорбентов, полученных при различных временах фторирования газообразным дифторидом ксенона, исследовали ртутно-порометрическим методом, а также проводили элементный анализ. Полученные данные приведены в таблице 2. Из этих данных видно, что оптимальная степень фторирования достигается при 3-часовой обработке при 20°С олигобутадиенового

К«* + Кщ* -> Кп-Кщ (рекомбинация)

покрытия газообразным дифторидом ксенона. На это указывает как малое отличие по содержанию фтора в образцах, полученных при 3-х и 4-х часовой обработке, так и возрастание диаметра пор в последнем образце до значения, превосходящего диаметр пор исходного носителя. Это связано с началом разрушения поверхности кремнезема, что может приводить к нарушению структуры сорбента.

Побочные продукты, прежде всего фтористоводородную кислоту и продукты ее воздействия на кремнезем (например гексафторкремниевую кислоту, распадающуюся в безводных условиях на газообразный тетрафторид кремния и фтористоводородную кислоту), а также сконденсировавшийся на поверхности пор дифторид ксенона удаляли, вакуумируя сорбент при повышенных температурах.

Таблица 2.

Влияние продолжительности фторирования на некоторые свойства иммобилизованного на носителе СРВ-500- Тпяэрог™ полифторбутадиена.

продолжительность фторирования, ч содержание углерода, % масс. содержание фтора, % масс. отношение Р/С (моль/моль) средний диаметр пор, нм

без фторирования 18.9 0 0 49.0

1,5 ' 18.40 6.49 0.222 49.5

2 17.09 12.43 0.533 50.5

3 15.74 23.65 0.949 51.0

4 12.65 22.39 1.117 53.0

Таблица 3.

Зависимость некоторых характеристик водных и метанольных суспензий сорбента ОРВ-

500-7'гао/и>/-га<-ПФБД (3-часовое фторирование при 20°С) от условий обработки.

продолжительность вахуумирования, ч Температура при вакуумировании, °С рН надосадочной жидкости (водн.сусп.) Поглощение при Л= 230 нм (мстанол.сусп.)

0.0 25 3.24 1.525

1.5 25 5.26 1.025

2.0 25 5.83 0.745

3.0 25 6.14 0.376

4.0 25 6.27 0.223

1.5 45 3.76 0.302

2.0 45 5.15 0.148

3.0 45 6.32 0.097

4.0 45 6.95 0.015

1.5 75 5.79 0.150

2.0 75 6.84 0.032

3.0 75 7.12 0.003

4.0 75 7.18 0.000-0.001

В таблице 3 приведены значения рН водных суспензий образцов сорбентов, исследованных после вакуумирования, проведенного с различной продолжительностью и при различных температурах. (Суспензии готовили в 50% водном метаноле, который затем замещали ТЭ-буфером (рН 7.2) и выдерживали 24 ч при 25 °С). В таблице 3 также представлены значения интенсивностей пиков поглощения надосадочных жидкостей при А,= 230 нм, полученных после инкубирования в течение 24 ч образцов сорбентов, помещенных в метанол непосредственно после процедуры фторирования. Эти данные указывают на значительные количества удерживаемых поверхностью сорбента сконденсировавшихся растворимых соединений, в частности, придающих суспензиям сорбента кислый характер. Оптимальным для удаления таких соединений из данного материала оказалось 4-х часовое вакуумирование при 75°С. Эти параметры, очевидно, могут изменяться в зависимости от пористости образца и его удельной площади поверхности. После дополнительной промывки метанолом (в экстракторе Сокслета в течение 4 ч; 20 циклов) поглощение в надосадочной жидкости в УФ- и видимой областях спектра отсутствовало,

Таким образом, установлено, что при фторировании газообразным дифторидом ксенона слоя олигобутадиена, (средняя Мп 4500, содержание 1,4-щс- и \,Ь-трапс-звеньев - 80%, 1,2 - звеньев - 20%), иммобилизованного на поверхности МПС (средний диаметр пор 50нм, удельная площадь поверхности 88 м2/г) оптимальными являются следующие условия: для проведения процесса требуется инертная атмосфера (аргон), продолжительность фторирования 3 ч при 20°С, продолжительность последующего вакуумирования (0.05 мм рт.сг.) 4 ч при температуре 75°С. При этом расход дифторида ксенона составил 0.91г на каждый грамм сорбента.

3. Структурные характеристики композиционных полифторбутадиенсодержащих

сорбентов.

Структура синтезированных композиционных сорбентов определяется как свойствами поверхности неорганического носителя, так и строением иммобилизованной на его поверхности фторированной полимерной фазы. Ранее было показано, что действие дифторида ксенона на относительно толстые (20 мкм) пленки полибутадиена, приводит к образованию полимерного слоя, характеризующегося высоким содержанием фтора. При этом содержание нерастворимой фракции достигало 98%, что видетельствует о наличии межмолекулярных связей. Можно полагать, что при фторировании тонких

олигобутадиеновых слоев, иммобилизованных на поверхности пористых кремнеземных носителей, также могут быть получены плотные сшитые полифторбутадиеновые пленки. Как показано выше, при этом в значительной мере сохраняется пористость исходного носителя. Для получения более детальной информации о морфологии полученного композиционного сорбента обратимся к данным ртутно-порометрического анализа. Как правило, при анализе порограмм приходится учитывать наличие мсжчастичного объема, который может давать вклад в удельный объем пор. Однако, поскольку эффективные средние значения диаметров пор в большинстве исследуемых образцов не превышали значения в 50 нм, вкладом межчастичного объема можно пренебречь, так как эффективные расстояния между частицами значительно выше и отображены на порограммах в виде пологого участка с низким значением тангенса угла наклона (рис. 1). Важно, что характер изменения порограмм позволяет судить о структуре иммобилизованного полимерного слоя. Как было показано выше, при анализе порограмм удается определить степень уменьшения эффективного диаметра и удельного объема пор носителя в результате нанесения олигомерного слоя и его последующего фторирования. Дополнительную информацию при анализе порограмм можно почерпнуть, изучая явление так называемого гистерезиса при ртутной порометрии. При этом на порограмме кривая вдавливания (интрузии) ртути в поры образца под действием приложенного давления не совпадает с кривой выхода (экструзии) ртути при понижении давления (рис. 1), образуя так называемую петлю гистерезиса. Это происходит вследствие того, что давление вдавливания ртути отличается от давления, при котором поры освобождаются от ртути из-за неравномерности пор по диаметру и объему. При анализе порограмм немодифицированных образцов МПС петля гистерезиса имеет вид, характерный для пористых кремнеземов, а именно: максимумы ветвей интрузии и экструзии совпадают в точке, соответствующей максимальному значению удельного объема пор (рис. 1, а). Однако, на порограмме образца МПС с нанесенным слоем жидкого олигобутадиена выявлено наличие существенной разности (АУ) между максимальными значениями удельного объема на порограмме для ветвей интрузии и экструзии ртути (рис. 1, б). Величина разности соответствует объему ртути, удерживаемой при экструзии в порах образца. Рассматриваемый эффект можно объяснить тем, что при порометрии образцов с нанесенным слоем олигобутадиена, последний смещается под давлением ртути во внутренний объем пор, имеющих диаметр менее 50 им, и препятствует высвобождению ртути при понижении давления.

Рис.1. Гистерезис при ртутной порометрии образцов: а -макропористое стекло ПРВ-500-ТпБорог™; б - то же, с нанесенным олигобутадиеном (0.25 г/1 г носителя); в - сорбент ОРВ-бОО-Тпворог™-ПФБД.

в

При ртутно-порометрическом исследовании фторированных образцов этот эффект выражен в меньшей степени (рис. 1, в), поскольку при фторировании полимерный слой структурируется, стабилизируется межмолекулярными связями и приобретает свойства плотной, связанной с поверхностью носителя пленки. Заметное снижение объема пор (примерно 25% вместо расчетных 15%, соответствующих объему, занимаемому полимерной фазой) можно объяснить тем, что ртуть удерживается шероховатостями поверхности в наиболее узких местах пор. При проведении непосредственно после экструзии повторной интрузии ртути величина ДУ на порограмме не изменяется, поскольку ртуть не удерживается более крупными порами. Ртутно-порометрическое исследование, таким образом, подтверждает, что при фторировании олигобутадиенового покрытия в результате отверждения олигобутадиена образуется плотная двумерная полимерная пленка, прочно связанная с поверхностью носителя.

Наличие межмолекулярных связей в полученных композиционных ПФБД-содержащих сорбентах было подтверждено при определении количеств растворимой фракции, при инкубировании навесок сорбентов в подходящем растворителе. Дня этого исследуемые образцы инкубировали в герметических сосудах в н-пентане при

перемешивании в течение 48 ч, а затем отбирали пробы надосадочной жидкости и измеряли остаточные массы перешедшего в раствор олигомера после испарения растворителя. При обработке н-пентаном навесок (по 0.1 г) нефторированных образцов в раствор переходило до 0.019 г олигомера с каждого образца, в то время как при исследовании фторированных образцов количество растворимой фракции не превышало 0.001 г, что с учетом значительного (в среднем, двукратного) повышения массовой доли полимерной фазы в композите после 3-х часового фторирования, указывает на стабилизацию полимерного покрытия. Эта особенность фторирования позволяет предварительно не проводить структурирование слоя олигобутадиена.

Дополнительную информацию о структуре иммобилизованных полифторбутадиенов можно получить, оценив степень экранирования неорганической поверхности носителя полимерной фазой. Для этого исследовали устойчивость синтезированных сорбентов в условиях щелочного гидролиза (инкубирование в течение 36 ч в 1М ЫаОН). Кинетика растворения материала носителя для различных образцов, исследованная на основании данных спектроскопии надосадочных жидкостей представлена на рис. 2.

а

/у

Рис. 2. Кинетические кривые гидролиза различных сорбентов в 1М ЫаОН: а - С1'В-Тпяорог ™-500\ б - тот же носитель с иммобилизованным слоем олигобутадиена 0.5 (20% масс.); в - то же, после фторирования ХеР2 (2 ч) с последующим вакуумированием (4 ч); г - то же, фторирование - 3 ч, вакуумирование -4 ч.

Гидролитическая стабильность модифицированных кремнеземов определяется устойчивостью к гидролизу связей 81-0 51. Кремнеземы частично растворимы во всей области рН, а в области значений рН 2-8 они относительно стабильны. Однако, для существенного изменения свойств сорбента достаточно незначительного гидролиза приповерхностных кремний-кислородных связей, что может приводить к отрыву молекул модификатора. Поэтому эффективное экранирование полимерным слоем неорганической поверхности носителя повышает "кинетическую" гидролитическую стабильность сорбента, в то время как "термодинамическая" стабильность при модифицировании не увеличивается. Данные, приведенные на рис. 2, свидетельствуют о том, что

нолифторбутадиенсодержащие сорбенты значительно более устойчивы в щелочных средах, чем ^модифицированные носители, особенно это проявляется при щелочной обработке в первые часы.

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что полученные композиционные ПФБД-содержащие сорбенты объединяют в одном материале механическую прочность и необходимую пористость исходного носителя с хемостойкостью иммобилизованного на поверхности этого носителя фторированного полимерного слоя. При этом полимерный слой имеет плотную сшитую структуру, хорошо экранирует поверхность носителя, что должно свести к минимуму неспецифическую сорбцию, присущую немодифицированным кремнеземам. Поэтому можно предполагать, что полученные сорбенты найдут эффективное применение в различных вариантах хроматографии, в том числе и в агрессивных средах, а также могут быть регенерированы и стерилизованы.

4. Применение композиционных ПФБД-содержащих сорбентов при выделении нуклеиновых кислот из различных источников.

Первые эксперименты по тестированию сорбентов проводили с плазмидными ДНК из грамотрицательной бактерии Е. coli (штамм JM 109). Раствор, полученный после щелочной экстракции клеточного лизата, и содержащий ДНК, РНК и сопутствующие белки в ТЭ-буфере (pH 7.5-8.0), наносили на сорбент, помещенный в пластиковый картридж. Картридж затем уравновешивали ТЭ-буфером и элюировали тем же буфером. Элюат анализировали спектрофотометрически при X 260 нм и 280 нм. Плазмидная ДНК элюировалась первой. Вслед за ней тем же буфером элюировалась РНК. Белки удавалось выделить при проведении последующего элюирования 50% метанолом. Тем самым сорбент легко регенерировали. Фракции анализировали в электрофорезе в 0.8% агарозном геле. Полученные результаты представлены на электрофореграмме (рис. 3). Отношение интенсивностей поглощения Л26(/Л28о s 2:1 дня фракции, содержащей ДНК, свидетельствовало о хорошем отделении белков.

Для выделения более крупной ДНК из крови человека было разработано несколько методик с использованием полученных сорбентов. После выделения и лизиса ядрасодержащих клеток с одновременной обработкой протеиназой К (Sambrook J., et al., 1989), получали препарат, ДНК из которого выделяли, сорбируя примеси на

хроматографической колонке с ПФБД-содсржагцим сорбентом. Образец, содержащий ДНК, растворяли в ТЭ-буфере и наносили на колонку с сорбентом, уравновешенным этим же буфером, Для очистки колонки от примесей, сорбировавшихся после элюирования ТЭ-буфером, и попытки их разделения, последующую элгацию проводили в режиме линейного градиента концентрации изопропанола (0-70%) в ТЭ-буфере. Спектрофотометрический и электрофоретический контроль состава фракций показал, что ДНК элюируется с колонки ТЭ-буфером непосредственно за «мертвым» объемом.

Рис. 3. Электрофореграмма фракций, собранных при картриджном варианте выделения плазмиды pBR 322 на сорбенте GPB-Trisopor™-500-r№Efl в 0.8% агарозном геле: 1 - раствор плазмиды в ТЭ-буфере (рН 7.5 - 8.2) перед нанесением на картридж; 2, 3 - первая и вторая фракции после элюирования ТЭ-буфером соответственно; 4 - фракция после элюирования 50% метанолом.

Удачным оказался также упрощенный метод выделения ДНК, заключающийся в сорбции примесей сорбентом в перемешиваемом объеме (в режиме "batch-процесса"). При этом раствор лизата, обработанный протеиназой К, разбавляли ТЭ-буфером, вносили в пробирку, содержащую суспензию сорбента в том же буфере. Операцию повторяли дважды. По данным электрофореза в 0.8% агарозном геле в первом супернатанте содержалось около 60%, а во втором - около 40% ДНК от ее суммарного количества в образце. При этом в обоих случаях РНК на электрофореграмме не обнаружена. Полученные растворы ДНК в ТЭ-буфере имели отношение Агво/Мт = 1.5-1.66.

Рис. 4. Электрофореграмма элюатов, полученных при выделении ДНК из E.coli с помощью картриджей, заполненных сорбентом СРВ-Тторогп'-500-ПФВД, после обработки рестриктазами:2, 4 - Eco RI; 3,5- Hinj 1 - маркер, 2, 4 - картриджный метод выделения ДНК; 3,5- batch-uermu.

ч

[ - .......• . ..

Одним из наиболее перспективных применений синтезированных ПФБД-

содержащих сорбентов оказалась возможность одностадийной (с момента получения клеточного лизата) сепарации геномной бактериальной ДНК с использованием картриджей, содержащих всего около 0.3 г сорбента. При этом возможно использование

как уравновешенных ТЭ-буфером колонок, так и колонок, содержащих сухой слой сорбента. Готовый лизат наносили на колонку и центрифугировали ее на настольной центрифуге в течение 1 мин при 2000 об/мин. Полученные препараты геномной бактериальной ДНК достаточно концентрированы и имеют степень очистки, позволяющую проводить последующую рестрикцию и, что особенно важно, ПЦР-анализ. Поскольку полимеразная цепная реакция (ПНР) весьма чувсгвителна к наличию ингибиторов фермента ДНК-полимеразы, амплифицируемость в ПЦР препаратов ДНК является надежным свидетельством высокой степени очистки наряду с возможностьюпроведения рестриктного анализа, который заключается в обработке ДНК ферментами-рестриктазами, расщепляющими молекулу нуклеиновой кислоты в определенном участке. В результате рестрикции на электрофореграмме единая полоса ДНК заменялась на ряд "ступенек" либо протяженный "хвост", состоящий из фрагментов исходной молекулы, что иллюстрирует рис. 4. Экстракцию ДНК проводили как из грамотрицательных, так и из грамположительных бактерий. Наряду с

Рис. 5. Электрофореграмма с результатами ПЦР, проведенной с элюатами, полученными при выделении ДНК из Е.соН с помощью картриджей, заполненных сорбентами GPB-Trisopor ™-500-ПФБД (1-3), МПС-1150ГХ-ПФБД (4-6), CPG-10-500-РгоПко-ПФБД (7-9); К+, К- -позитивный и негативный контроли, соответственно, М - маркер.

Рис. б. Электрофореграмма элюатов, полученных при выделении ДНК из бактерий с помощью картриджей, заполненных сорбентом GPB-Trisopor ™-500-ПФБД (1-5) и с помощью картриджей Ota Amp фирмы Qiagen (б - 10)\ М-маркер, 1,6 - E.coli; 2,7 - Proteus vulgaris; 3,8 -Salmonella lyphimurium; 4,9 - Bacillus subtilis; 5, 10 - Staphilococcus aureus.

тестированием картриджей с сорбентами проводили сорбцию примесей в перемешиваемом объеме, т. е. осуществляли «ба/сЛ-процесс». Тестировали ПФБД-содержащие сорбенты, синтезированные на основе различных кремнеземных носителей, полученных при различных режимах модифицирования (рис. 5). Поскольку ДНК является крупной молекулой, размер пор сорбента оказывает влияние на выход нуклеиновой кислоты. Более крупные поры способны

задерживать определенное количество ДНК, в то время как в мелких порах не сорбируется часть белковых макромолекул. Максимальный выход очищенной ДНК был достигнут при использовании сорбента со средним значением диаметра пор 50 нм.

Следует отметить, что эффективность выделения ДНК на картриджах с ПФБД-содержащими сорбентами оказалась выше, чем на коммерческих картриджах, предлагаемых, например, фирмой Qiagen (Германия). Так, с ПФБД-сорбента выделялась высокомолекулярная ДНК, представленная на электрофореграмме в виде четкой единичной полосы, в то время как с колонок Qia Amp, разработанных фирмой Qiagen, ДНК выделяется часто расщепленной (рис. 6). Удовлетворительная степень очистки ДНК подтверждена данными белкового электрофореза (рис. 7). (При этом из лизатов

Рис. 7. Электрофореграмма, полученная в результате белкового электрофореза элюатов, содержащих ДНК из E.coli, выделенные с помощью сорбента GPB-Trisopor 1М-500-ПФБД\ М - маркер, 1 - культура E.coli, 2 - йа/сА-метод, 3 -картридж.

объемом 200 мкл на картридже с сорбентом удерживалось не менее 90% белков, причем емкость сорбента по белку составила в среднем 25 мг на 1 гсорбМгга).

Таким образом, полученные композиционные ПФБД-содержащие сорбенты селективны в определенных условиях как к паре нуклеиновая кислота - белок, так и к паре ДНК - РНК. Применение синтезированных сорбентов в процедуре очистки ДНК обеспечивает экономию времени и реактивов, а также позволяет получать препараты ДНК в неденатурирующих условиях в концентрациях, достаточных для проведения ПЦР-анализа без дополнительных концентрирования и очистки. Возможность эффективного использования синтезированных сорбентов при нанесении обрабатываемой пробы без предварительного уравновешивания сорбента буфером (т. е. на сухой сорбент) облегчает стерилизацию и длительное хранение предварительно упакованного в картриджи материала.

ВЫВОДЫ

1. Предложен новый способ получения композиционных фторполимерсодержащих сорбентов, заключающийся в проведении фторирования предварительно иммобилизованной на поверхности дисперсных объемно-пористых носителей полимерной фазы.

2. Определены оптимальные условия для иммобилизации и фторирования полимерной фазы на поверхности дисперсных объемно-пористых носителей.

3. Впервые при получении композиционных полифторполимерсодержащих сорбентов на основе объемно-пористых кремнеземов использован дифторид ксенона в качестве фторирующего агента.

4. Показано, что при использовании дифторида ксенона в качестве фторирующего агента возможно в мягких условиях получать композиционные ПФБД-содержащие сорбенты, сохраняющие пористость и механическую прочность, присущие исходному носителю, и вместе с тем отличающиеся повышенным содержанием фтора, что исключает неспецифическую сорбцию при выделении нуклеиновых кислот.

5. Показано, что полученные композиционные сорбенты обладают повышенной гидролитической стабильностью в щелочных средах.

6. Показано, что полученные композиционные ПФБД-содержащие сорбенты характеризуются низким уровнем неспецифической сорбции и высокой селективностью при выделении нуклеиновых кислот. Предложены эффективные методы использования полученных сорбентов при выделении ДНК из различных источников.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

2. Д.В. Капустин, В.П. Зубов, Л.Л. Завада, В.А. Быков, Н.Е. Грузинова, A.B. Евстратов. O.A. Трифонова. Разработка и применение новых композиционных полимерсодержащих сорбентов для выделения и очистки ДНК. - «Биомедицинские технологии», вып. 8, 1998 . - С. 25.

2. V.V. Saburov, M.R. Muydinov, V.P. Zubov, D.V. Kapustin. Applications of novel composite silica sorbents modified with fluoropolymers in separation of biopolymers. -Third International Symposium on Bioorganic Chemistry, September 17-23, 1995, Dagomys, Russia, p. 107.

3. A.D. Kataev, M.R. Muydinov, D.V. Kapustin, V P. Zubov. Novel composite silica sorbents modified with fluoropolymers: preparation, structure and chromatographic properties. 18th International Symposium on Column Liquid Chromatography, May 8-13, 1993, Minniapolis. MN USA, p. 153.

4. Д.В. Капустин, B.B. Сабуров, В.П. Зубов, И.П. Чихачева, С.Д Ставрова, Г.Б. Барсамян, А.В. Пебалк. Новые полимерсодержащие кремнеземные сорбенты с повышенной гидролитической стабильностью. VII всероссийский симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии, Москва, 14-19 апр., 1996, с. 65.

5. Л.Л. Завада, Л.Ю. Филлипова, И.В. Бобылева, Т.В. Овчинникова, Д.В. Капустин, В В. Сабуров, В.П. Зубов, В.А. Быков. Новые композиционные полимерсодержащие сорбенты для получения чистой ДНК. Материалы международной конференции "Фармацевтическая биоэтика", М, 1997, с.25-26.

6. Д.В. Капустин, В.В. Сабуров, В.П. Зубов, Л.Л. Завада, И.П. Чихачева, Н.Н. Пономарев, Г.Б. Барсамян, О.М. Соловьева. Новые композиционные фторполимерсодержащие кремнеземные сорбенты для выделения и очистки биополимеров. Фундаментальные проблемы науки о полимерах (к 90-летию академика В. А. Каргина), М., 21-23 янв., 1997, с. СЗ-40.

7. Д.В. Капустин, В.В. Сабуров, Л.Л. Завада, АВ. Евстратов, Г.Б. Барсамян, В.П. Зубов. Композиционные фторполимерсодержащие сорбенты для выделения и очистки биополимеров. Биоорганическая химия, М., 1997, № 11, с.

8. Kapustin D.V., Zubov V.P., Plobner L., Leiser R.-M. Novel Composite Polymer-contaning Materials for Separation, Purificatioin, Concentration and Immobilization of Biopolymers. 17th DECHEMA Annual Meeting on Biotechnology. Wiesbaden, 27-29. April, 1999.

9. Kapustin D.V., Zavada L.L., Barsamjan G.B., Ponomariov N.N., Zubov V.P., Leiser R.-M., Plobner L. Ierashievskaya I.A. New hydrophobic polymer comprising fluorine moieties. European patent № 99Ю0416.9 Положительное решение от 12.01.1999.

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Глава 1. Носители для синтеза полимерсодержащих сорбентов (подходы к классификации). ^

Глава 2. Адсорбция полимеров на поверхности неорганических носителей. ^

Глава 3. Синтез композиционных сорбентов с привитой полимерной фазой.

Глава 4.Получение композиционных сорбентов с нетрадиционными полимерными фазами. ^

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исходные вещества, реагенты, материалы.

Аппаратура.

Методы исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Обоснование выбора исходных реагентов и методики синтеза композиционного сорбента.

Глава 2. Получение композиционных полифторбутадиенсодержащих сорбентов. ^

Глава 3. Структурные характеристики композиционных полифторбутадиенсодержащих сорбентов. ^

Глава 4.Применение композиционных ПФБДсодержащих сорбентов при выделении ^ нуклеиновых кислот из различных источников

ВЫВОДЫ

В последние годы в лабораторной практике широко применяются методы выделения и очистки, конкурирующие с традиционными хроматографическими колоночными схемами. К таким методам можно отнести капиллярный электрофорез, градиентную тонкослойную хроматографию и пр. Однако до сих пор невозможно представить полноценную лабораторию без использования методов жидкостной хроматографии как в аналитических, так и в препаративных целях. Более того, по оценке специалистов [1] хроматографическим методам принадлежит не менее 80% всех используемых в этих целях методик.

Несмотря на высказывавшиеся предложения строго классифицировать все типы применяющихся колонок и сорбентов с целью максимального сокращения их числа, последнее не представляется возможным, так как многообразие частных задач при разделении смесей различных веществ и реализуемых при этом условий практически невозможно свести к жестко ограниченному минимуму. Кроме того, анализ работ в области разработки теории хроматографии и математического моделирования процессов, происходящих при взаимодействии компонентов разделяемых смесей с поверхностью сорбента, свидетельствует об отсутствии комплексного подхода с учетом всех факторов, влияющих на эти процессы [2, 3], что также не позволяет провести жесткую унификацию и сокращение набора применяемых сорбентов.

Учитывая сказанное выше, а также в связи с дальнейшим развитием высокоэффективной жидкостной хроматографии и внедрением в практику крупномасштабных хроматографических процессов, целесообразен поиск новых счрбентов, выдерживающих высокое давление в колонках, не снижающих эффективности при смене условий разделения, обеспечивающих при этом высокие выходы разделяемых компонентов при сохранении ими нативных свойств, что особенно важно при работе с биологически активными соединениями.

Перспективными в этом отношении оказались полимерсодержащие кремнеземные сорбенты, применяемые в первую очередь для выделения биополимеров. Химическая модификация кремнеземов во многих случаях позволяет снижать неспецифическую сорбцию биополимеров на поверхности кремнеземной матрицы, а также вводить в состав сорбента необходимые функциональные группы. Создание тонкого (порядка нескольких нм) слоя полимерной фазы на поверхности неорганической матрицы делает возможным в одном композиционном материале объединить механическую прочность, жесткость, контролируемую пористость неорганической матрицы с инертностью, высокой емкостью, биосовместимостью, присущими традиционно используемым мягким органическим гелям.

Разработка композиционных полимерсодержащих сорбентов - комплексная проблема на стыке химии полимеров, физической и биоорганической химии. Методики получения таких материалов, способы иммобилизации полимерной фазы на неорганической поверхности пористой матрицы, механизм полимеризации и используемые мономеры в каждом конкретном случае весьма различны. При этом наряду с традиционными хроматографическими колонками широкое распространение получили компактные регенерируемые или одноразовые пластиковые и стеклянные картриджи, пригодные для проведения экспресс-анализа в диагностических целях. Удачными оказываются также упрощенные методы выделения биологически активных соединений, заключающиеся в сорбции примесей сорбентами в перемешиваемом объеме (в режиме «Ла/с/г-процесса») [4]. Перечисленные методики, как правило, реализуются с использованием модифицированных полимерсодержащих композиционных сорбентов.

Особые требования предъявляются к сорбентам, применяемым при выделении, очистке, концентрировании биополимеров, прежде всего нуклеиновых кислот и белков. Готовые препараты таких соединений не должны содержать примесей, в полной мере сохранять биологическую активность, а сама процедура выделения - занимать минимум времени. Использование фторсодержащих полимеров в качестве модификаторов кремнеземных носителей позволило получить ряд композиционных сорбентов, характеризующихся высокой хемостойкостью, гидролитической стабильностью и уникальными сорбционными свойствами. В то же время трудности, возникающие при полимеризации фторсодержащих мономеров, относительно высокие экономические, технологические затраты при масштабировании процессов получения фторполимерсодержащих композиционных сорбентов стимулируют поиск и реализацию новых подходов к созданию таких материалов. Одним из таких подходов является фторирование предварительно иммобилизованных на поверхности носителя тонких полимерных пленок с применением дифторида ксенона, что позволяет получать сорбенты с повышенным содержанием фтора. Такие сорбенты при значительном снижении неспецифической сорбции характеризуются высокой селективностью в процессах выделения высокочистых препаратов нуклеиновых кислот из различных источников.

Настоящая работа является частью структурно-функциональных исследований новых композиционных полимерсодержащих материалов, проводимых в лаборатории «Полимеры для биологии» Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Цель работы состоит в получении новых композиционных полифторбутадиенсодержащих сорбентов для выделения и очистки нуклеиновых кислот. В более узком смысле целью настоящей работы является разработка методики эффективного модифицирования внешней и внутренней поверхностей дисперсных объемно-пористых частиц кремнезема тонкой полибутадиеновой пленкой (толщиной 6 несколько десятков ангстрем) и последующая обработка этой пленки парами дифторида ксенона; определение оптимальных параметров при получении таких сорбентов, а также исследование их структурных характеристик и адсорбционных свойств в процессах выделения ДНК из различных источников при различных вариантах проведения хроматографического анализа.

Обзор публикаций с 70-х г. г. до последнего времени позволяет проследить, как изменялись требования, предъявляемые к сорбентам в связи с расширением сферы их применения и увеличением числа материалов, используемых при получении композиционных сорбентов, а также как совершенствовались подходы к их синтезу. Получение полимерсодержащих сорбентов и изучение их свойств способствовали как развитию теоретической базы при разработке теории хроматографического процесса, так и решению прикладных задач.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ГЛАВА 1.

НОСИТЕЛИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРСОДЕРЖАЩИХ СОРБЕНТОВ.

Для получения композиционных полимерсодержащих сорбентов чаще всего используют два основных типа носителей: пористые и поверхностно-пористые (тонкослойные или иные). К числу пористых носителей относят силикагель, диатомиты и пористые стекла. К поверхностно-пористым, состоящим из частиц с непроницаемой сердцевиной и тонкой пористой оболочкой, относятся зипакс - носитель с контролируемой поверхностной пористостью, корасил и поверхностно-травленные стекла [5]. В наибольшей степени для модификации полимерами подходит кремнезем, то есть диоксид кремния во всех его формах: кристаллических, аморфных или гидратированных. В гидратированных формах, имеющих состав п8Ю2*хН20, содержание воды определяется в основном присутствием групп 8ЮН, называемых силанольными. Для модификации используют аморфный кремнезем, т.к. кристаллический имеет неразвитую поверхность. Аморфный кремнезем состоит из тетраэдров 8ЮН4, ориентированных в пространстве случайным образом. Структурные характеристики кремнезема зависят от способа его получения. Наличие связанных и отдельно стоящих гидроксильных групп, их положение на поверхности аморфного кремнезема, степень дегидроксилирования поверхности, степень ее упорядоченности обусловливают различие свойств кремнеземов при их дальнейшей модификации.

На поверхности кремнезема в различных соотношениях может находиться до 5 типов групп: силанольная (связанная) вода - свободные отдельно стоящие ОН-группы; физически связанная вода - молекулы воды, связанные водородными связями с силанольными группами; дегидратированные оксиды - силоксановые группы; близнецовые (геминальные) ОЯ-группы, связанные с одним атомом кремния; реакционноспособные вицинальные ¿Ж-группы, преобладающие в тонкопористых кремнеземах - соседние, близко расположенные ОН-группы, связанные между собой водородными связями.

При повышении температуры прогрева кремнезема силанольные группы способны конденсироваться, образуя при этом силоксановые группы, а вода удаляется в виде пара. Прежде всего удаляется физически связанная вода, а затем происходит конденсация силанольных групп. Четко разграничить эти процессы не удается, т.к. они могут происходить одновременно.

Особая форма аморфного кремнезема - пористые стекла. Их получают при спекании диоксида кремния с другими оксидами с последующим вытравливанием растворимых в кислоте или щелочи продуктов.

Промышленностью выпускается несколько типов пористого стекла. Его готовят, расплавляя гомогенное боросиликатное стекло с последующим выдерживанием расплава при более низкой температуре для разделения на две несмешивающиеся фазы. При соответствующем образом подобранном составе эти фазы могут образовывать взаимопроникающие сетки. Затвердевание системы можно проводить на нужной стадии, чтобы остановить процесс огрубения структуры обеих фаз. Соединения бора и примеси других металлов, содержащиеся в стекле, можно растворить в сильной кислоте. Прлучаемое таким образом вещество представляет собой довольно чистый вьюокопористый кремнезем, называемый пористым стеклом. Размер пор в пористом стекле может быть получен в интервале от одного до нескольких сот нм. Каркас пористого стекла образован кремний-кислородными тетраэдрами исходного стекла, т.к. в процессе дальнейшей обработки связи Л'-О-Л/ не разрушаются. В исходном стекле имеются области, отличающиеся по химическому составу, т.к. атомы бора и кремния не образуют общей сетки. Наличие небольшого количества оксида натрия также обусловливает образование при температуре 700°С крупных неоднородностей. Совокупность этих неоднородных областей и структуры кремнезема определяет размер пор при обработке этих стекол кислотой. При действии щелочи силикагель, отложившийся на стенках пор при воздействии кислоты, растворяется, остается лишь кремнеземный каркас. Общий объем пор при этом увеличивается, а удельная поверхность заметно уменьшается. После обработки щелочью поры имеют диаметр от 20 до 200 нм. Изменяя продолжительность контакта с соляной кислотой, можно получить как объемно-пористые, так и поверхностно пористые стекла, причем средние размеры пор при этом не изменяются, изменяется лишь глубина травления.

Свойства сорбентов сильно отличаются в зависимости от размеров пор. Различают сорбенты с макропорами, эффективные диаметры которых превышают 50 нм; с мезопорами - размеры которых лежат в пределах от 2 до 50 нм; с микропорами - с диаметрами меньше 2 нм. При изучении диффузии макромолекул внутри пористого носителя прежде всего необходимо учитывать влияние строения пористой структуры на интенсивность диффузии. Пористость носителя, равная объему свободного пространства в единице объема пористой массы, определяет долю сечения гранулы носителя, доступную для диффузии. Извилистость пор характеризует увеличение среднего пути диффузии относительно длины в направлении, перпендикулярном внешней поверхности гранулы. Размер пор определяет механизм диффузии [6, 7]. Если диаметр поры превосходит длину среднего свободного пробега молекул, то перенос вещества будет осуществляться по закону молекулярной диффузии в свободном пространстве. Если размер пор значительно меньше длины среднего свободного пробега молекул, то такая диффузия называется кнудсеновской. Это справедливо для газов. На режим диффузии жидкостей размер пор не оказывает влияния, пока не станет соизмеримым с размером молекул жидкости [8].

Большой размер молекул биополимеров обуславливает существенное уменьшение коэффициентов диффузии по сравнению с неполимерными молекулами. Так, у белков эти значения в 10-30 раз меньше, чем у аминокислот. Поэтому расширение зон и ухудшение разрешения пиков при хроматографии макромолекул объясняются главным образом трудностью установления равновесия обмена между фазами. Это обстоятельство, в свою очередь, требует уменьшения скорости элюции при хроматографии. При достаточно малых размерах молекул скорость элюции удается увеличить (за счет повышения давления), и в этом случае возрастает опасность денатурации макромолекул в результате их сжатия. При хроматографии биополимеров существует также проблема доступности всего объема неподвижной фазы внутри гранул. За исключением метода гель-фильтрации, это обстоятельство не только снижает емкость сорбентов, но и существенно затрудняет установление равновесия в неподвижной фазе. При этом обычные микро- и мезопористые сорбенты не пригодны [9].

По структуре и по характеру диффузионных процессов, протекающих в порах сорбентов, последние делят на три основные группы. Во-первых, выделяют поверхностно-пористые сорбенты, характеризующиеся размером частиц 20-40 мкм, причем приповерхностный слой толщиной 2-3 мкм пронизан системой пор, а ядро частицы непористое. Во-вторых, объемно-пористые сорбенты, к которым относят большинство применяемых носителей, а также, в-третьих, макропористые микрочастицы, диаметром 310 мкм, применение которых позволяет повысить эффективность колонок.

Исходя из свойств носителя, конструкция композиционного полимерсодержащего материала для выделения биологических полимеров в общих чертах должна удовлетворять следующим требованиям:

• каркас неорганического носителя должен быть настолько плотно покрыт привитым полимером, чтобы взаимное расположение и конформация цепей привитых (или адсорбированных) макромолекул препятствовали непосредственному контакту поверхности кремнезема с молекулами биополимера.

• иммобилизуемый полимер должен обладать минимальной адсорбционной активностью по отношению к молекулам биополимеров, подлежащих выделению. При этом, как правило, он должен содержать якорные и функциональные группы, необходимые для проведения хроматографического разделения.

• иммобилизация полимера не должна приводить к сильным изменениям пористой структуры исходного кремнезема.

• полимерное покрытие должно быть химически чистым и биологически стабильным, достаточно прочно прикрепляться к неорганической поверхности.

Способы получения кремнеземных композиционных полимерсодержащих сорбентов, применяемые в настоящее время, можно условно разделить на три основные группы. К первой группе можно отнести способы получения сорбентов, основанные на физической адсорбции полимеров из растворов на поверхности кремнеземов с последующей дополнительной сшивкой или без таковой. Ко второй группе можно отнести способы получения сорбентов, заключающиеся в проведении хемосорбции полимеров, приводящей к образованию устойчивых химических связей полимерной фазы с поверхностью носителя. В первых двух случаях на поверхность носителя иммобилизуется предварительно полученный полимер (олигомер). Наконец, ряд способов получения композиционных полимерсодержащих сорбентов основывается на проведении радикальной или ионной полимеризации мономеров в присутствии кремнеземного носителя.

Необходимость применения полимерсодержащих сорбентов в хроматографии обусловлено тем, что полимерная фаза значительно изменяет свойства поверхности жесткой матрицы, идет ли речь о гидрофильных либо гидрофобных, а также ионогенных или неионогенных полимерах. Таким образом, обеспечивается возможность получать композиционные материалы с комплексом заданных свойств.

При хроматографическом процессе, как известно, имеет место разделение компонентов разделяемых смесей за счет диффузионной миграции, т.е. за счет различных скоростей перемещения молекул. При этом одновременно можно контролировать большое число параметров процесса. Таким образом, хроматографический процесс является многоканальным источником информации, чем определяется столь широкое его использование в аналитике и в препаративных целях. Среди хроматографических методов жидкостная хроматография развивается наиболее быстро [10], что касается как исследования и анализа простых и сложных смесей тяжелых органических и биологически активных соединений, так и полимерных композиций. В подавляющем большинстве случаев и по настоящее время используется высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), что требует применения высокооднородных сорбентов, обеспечивающих в условиях высокого давления удовлетворительных скоростей разделения. Ранее считалось, что в сравнении с газовой хроматографией число сорбентов для ВЭЖХ ограничено. Сегодня предлагаются новые сорбенты для решения специфических задач, таких как разделение белковых смесей, выделение и очистка нуклеиновых кислот, определение лекарственных препаратов и продуктов их метаболизма в сыворотке крови, разделение Ь- и Б-изомеров и пр.

Для ВЭЖХ как в качестве самостоятельных сорбентов, так и в качестве неорганических носителей для синтеза композиционных материалов используются преимущественно микрочастицы диаметром 3-10 мкм как нерегулярной, так и сферической формы с повышенной (до 90%) степенью однородности геометрии внутренней поверхности с возможностью ее регулирования. Эти частицы характеризуются средним диаметром пор в диапазоне от 6 до 10000 нм, удельной площадью поверхности 10-600 м2, удельным объемом пор от 0,3 до 1,8 см3/г, с повышенной прочностью, с возможностью регулировать емкость материалов [11, 12].

По химической природе сорбенты можно разделить также на три основные группы. В качестве примеров неорганических сорбентов можно привести силикагели, макропористые стекла, оксид алюминия, оксид титана. Примерами органических сорбентов являются многочисленные модификации гелевых и макропористых полимерных (сополимерных) материалов. Наконец, так называемые сменные (композиционные) сорбенты представлены материалами, представляющими собой неорганические частицы, инкапсулированные полимерным слоем, либо с привитыми полимерными цепям, либо с привитыми ионогенными группами и пр. Композиционные сорбенты представляют наибольший интерес с точки зрения возможности разнообразить композиции как для повышения селективности разделения компонентов смесей, так и для увеличения стойкости самих сорбентов и возможности их неоднократной регенерации без значительной потери полезных свойств. При получении композиционных материалов также следует учитывать технологичность их производства, возможность и относительную легкость масштабирования процессов их синтеза.

Прежде, чем обсуждать особенности процессов, происходящих при участии поверхности частиц сорбента, а также рассматривать проблемы, возникающие при их синтезе, необходимо определить требования, предъявляемые к сорбенту, как конечному продукту синтеза. Эти требования изменялись по мере расширения сферы их применения, совершенствования методик синтеза и расширения числа применяемых при этом материалов.

Разработка определенных типов сорбентов для решения различных аналитических и препаративных задач привела к возникновению более частных, чем приведенные выше, классификаций сорбентов (по используемому материалу, пористости, форме частиц, размеру частиц), в соответствие с чем формулировались и требования к синтезируемым

ГЛАВА 2.

АДСОРБЦИЯ ПОЛИМЕРОВ НА ПОВЕРХНОСТИ НЕОРГАНИЧЕСКИХ НОСИТЕЛЕЙ.

Обобщение требований, предъявляемых к свойствам композиционных сорбентов, возможно при наличии упорядоченных данных по фундаментальным вопросам взаимосвязи структуры и свойств таких материалов. То, как накапливались эти данные, в определенной мере отражает и хронологию исследований в данной области.

В конце 80-х г. г. Андре [13], изучая взаимодействие белков крови с полиэтиленоксидом (ПЭО), привитым к поверхности твердой матрицы, предложил качественное объяснение эффекта, наблюдаемого при адсорбции белка на нейтральном водорастворимом полимере. По его мнению, одним из механизмов подавления адсорбционных свойств исходной матрицы полимерной фазой может быть низкая поверхностная свободная энергия водорастворимых полимеров и гелей. Эти значения, определенные в более ранних работах японскими исследователями [14], составили для поливинилового спирта, например, 3,1 мДж/м2, а для полиэтилена 52,6 мДж/м2. Кроме того, они обнаружили, что сывороточный альбумин адсорбируется в значительно большей степени при увеличении межповерхностной свободной энергии полимера, взаимодействующего с белком. В работе [15] изучался уровень адсорбции (мкг/см2) для различных белков как функции поверхностной энергии субстрата из растворов с различными значениями свободной межповерхностной энергии. При этом при возрастании поверхностной энергии субстрата (т.е. с уменьшением межповерхностной свободной энергии) уровень адсорбции падал в случае системы с фосфатным буфером (более высокие значения межповерхностной энергии) в сравнении с водно-диметилсульфоксидными смесями (более низкие значения свободной межповерхностной энергии).

Если отсутствуют специфические взаимодействия (рецептор - лиганд), изменение свободной энергии Гельмгольца при адсорбции определяется уравнением:

ДРа<ц=УргУрГУ& где члены правой части уравнения представляют собой значения межповерхностного натяжения при взаимодействии белка и твердой фазы, белка и жидкости, а также твердой фазы и жидкости соответственно [16]. Следовательно, свободная энергия адсорбции белка на поверхности сорбента определяется не только поверхностной энергией белковой молекулы и твердой фазы, но и поверхностной энергией растворителя. Если поверхностное натяжение растворителя ниже, чем у белка, то с увеличением поверхностной энергии субстрата уменьшается изменение свободной энергии Гельмгольца, определяя тем самым повышение адсорбции белка на полимере. Поэтому носители для эксклюзионной и аффинной хроматографии должны быть максимально гидрофильными для максимального снижения нежелательной адсорбции. Если же поверхностное натяжение растворителя выше, чем для белка, то с увеличением этой величины для субстрата величина энергии Гельмгольца повышается, а адсорбция, следовательно, уменьшается. При равенстве значений поверхностных натяжений растворителя и белка изменение свободной энергии Гельмгольца равно нулю независимо от значения поверхностного натяжения субстрата.

В [17] на основании обсуждения гипотетической структуры поверхности с минимальной поверхностной энергией сделан вывод, что поверхности, сформированные адсорбированными водорастворимыми полимерами, являются идеальными. Конформация адсорбированных носителем полимерных цепей оказывает определяющее влияние на подавление адсорбционной активности субстрата. Т.к. цепи имеют «хвосты» и «петли», вероятность реализации некоторых конформационных изменений в молекуле сорбата мржет снижаться, что приводит к снижению свободной энергии межповерхностного взаимодействия [17]. При этом вследствие снижения подвижности закрепленных групп общая энтропия системы может уменьшаться. Снижение энтальпийного фактора при взаимодействии цепей в хорошем растворителе (вода) также вносит вклад в значение свободной энергии системы. Поэтому адсорбированные макромолекулы переориентируются в соответствии с микроокружением, облегчая контакт с белковой молекулой.

Рядом исследователей [18, 19] изучались как теоретические аспекты, так и экспериментально полученные данные по адсорбции макромолекул. В конечном счете они были сведены в [20] к балансу энтропийного и энергетических факторов. Для нейтральных полимеров имеют значение четыре фактора: энергия сегментальной адсорбции, являющаяся движущей силой адсорбции; энтропия конформации цепей (соответствует уменьшению энтропии макромолекул в адсорбированном состоянии по сравнению с макромолекулами в растворе) - так же, как и энтропия смешения сегментов и растворителя (которая определяет границу между сконцентрированной поверхностью и разбавленным раствором) - действуют в противоположном направлении. Четвертый фактор - взаимодействие между сегментами (определяется взаимодействиями полимер-полимер, растворитель-растворитель и полимер-растворитель) - обычно способствует накоплению сегментов в растворе. Равновесие при конечной концентрации приводит к существованию адсорбированных макромолекулярных слоев с «петлями» и «хвостами».

При адсорбции полиэлектролитов дополнительно появляется электростатический фактор. В случае заряженной поверхности сорбата энергия сегментальной адсорбции может быть больше или меньше, что определяется знаком и величиной заряда. Полиэлектролит адсорбируется при этом лишь в случае, если энергия адсорбции превышает энергию межсегментального взаимодействия и взаимодействия между сегментами и поверхностью. Электростатическое взаимодействие между сегментами снижает уровень адсорбции. Кроме того, адсорбция полиэлектролитов сильно зависит от ионной силы раствора. В растворах со слабой ионной силой сегменты стремятся максимально удалиться друг от друга, адсорбированный слой утончается, снижается количество «хвостов».

Дуглас [21], изучая адсорбцию полимеров на неровных поверхностях, обнаружил, что адсорбция усиливается на фрактальных поверхностях, поскольку при этом снижены «энтропийные затраты» и неровная поверхность способна адсорбировать полимер, в то время как соответствующая гладкая поверхность из того же материала не адсорбирует его. Неровности (другими словами, возрастание фрактальности), приводят к утолщению адсорбированного полимерного слоя. С другой стороны, макромолекулы с более гибкими цепями адсорбируются сильнее, чем жесткие полимеры.

Обширный экспериментальный материал позволил выявить некоторые закономерности, проявляющиеся при адсорбции полимеров. Так, Хоммель [22] установил зависимость конформации цепей полиэтиленоксида (ПЭО) при адсорбции на силикагеле от степени прививки, т.е. от площади поверхности, приходящейся на одну молекулу. В этой работе был применен один из методов формирования полимерной поверхности на неорганической твердой матрице, впоследствии с успехом использованный при синтезе сложных композиционных сорбентов, а именно - упаривание водного раствора полимера при отсутствии химической пришивки полимера к поверхности. В сформированные таким образом полимерные слои ПЭО исследовали, вводя спиновую метку в концевые группы полимера. При этом при низких поверхностных концентрациях ПЭО полимер присутствовал в виде двух типов молекул, различающихся по подвижности. Малоподвижные молекулы взаимодействовали с полярными силанольными группами, более динамичные молекулы были представлены цепями, экспонированными в раствор. При увеличении поверхностной концентрации в два раза обнаруживали только подвижные цепи, т.е. конформация цепей становилась более «рыхлой».

При изучении диффузионной подвижности полистирольных латексных частиц [23] в водных растворах ПЭО в зависимости от концентрации последнего было показано, что толщина гидродинамического слоя адсорбированного полимера, вычисленная на основании данных по уменьшению диффузионной подвижности частиц, возрастает при повышении поверхностной концентрации ПЭО. Эти данные согласуются с теорией Флира [18, 20], утверждающей, что основной вклад в толщину гидродинамического слоя вносят длинные петли и «хвосты», экспонированные в раствор.

Примерно в это время Фурусава и Ямамото [24], изучая адсорбцию полистирола с различными молекулярными массами и молекулярно-массовым распределением на пористом стекле с диаметром пор 1000 А, обнаружили, что способность адсорбированного полимерного слоя к обмену компонентами между твердой фазой и раствором сильно зависит не только от молекулярной массы адсорбированного полимера, но и от исходной концентрации раствора полимера, причем, макромолекулы, адсорбированные из растворов с высокой концентрацией, обмениваются интенсивней, чем молекулы из растворов с низкой концентрацией. Приняв, что способность молекул к обмену определяется числом сегментов, взаимодействующих с поверхностью, можно сделать вывод, что при адсорбции из концентрированных растворов макромолекулы взаимодействуют с поверхностью меньшим числом сегментов, чем в случае разбавленных растворов. Поэтому в последнем случае макромолекулы связываются с поверхностью большим числом сегментов и имеют более «распластанную» конформацию [25]. Ранее Косгров [26] рассчитал, что полимерная цепь экспонируется в раствор при условии, что энергия связывания мономерного звена с поверхностью превышает 2 кТ. В более концентрированных растворах макромолекула, особенно, если она не первая взаимодействует с поверхностью, имеет доступ к меньшей площади и адсорбируется меньшим числом сегментов и, соответственно, с большим числом «хвостов» и петель, и поэтому довольно легко десорбируется.

Учитывая вышесказанное, можно предсказать некоторые свойства прлимерсодержащих композиционных сорбентов. Так, стерически «распластанная» конформация макромолекул в достаточной степени способствует экранированию активных центров на поверхности носителя «петлями», подавляя таким образом неспецифическую сорбцию биополимеров поверхностью носителя. Поскольку части полимерных цепей экспонированы в раствор от поверхности носителя, функциональные группы полимерных макромолекул становятся доступными, кроме того, облегчается «адаптация» вариабельных макромолекул биополимеров к поверхности сорбента, что способствует сохранению их нативной структуры.

Обращает на себя внимание обстоятельство, что композиционные сорбенты, полученные физической адсорбцией нейтральных полимеров на кремнеземных матрицах с успехом использовались для выделения и очистки биополимеров начиная с 70-х г.г. Примерами таких необратимо адсорбированных благодаря большому числу слабо взаимодействующих с поверхностью матрицы сегментов стационарных фаз являются полиэтиленоксиды [27, 28] и поли-Ы-винилпирролидон [29]. В работе [27], например, сообщалось о получении сорбента посредством обработки водным 0,4 % раствором ПЭО массой около 100000 пористого стекла с диаметром пор 1250 А. Затем на таком материале были очищены некоторые вирусы, причем было обнаружено, что изготовленный исследователями материал предотвращает адсорбцию вирусов на макропористом стекле. При модификации аналогичной матрицы полиэтиленгликолем массой 20000 [28] был получен сорбент для препаративного выделения вируса миелобластоза из плазмы цыпленка методом эксклюзионной хроматографии. Однако белки с р1>7,5 необратимо сорбировались из-за взаимодействия с поверхностью матрицы. Иммобилизованная подобным способом на кремнеземной матрице полимерная фаза поливинилпирролидона [29] оказалась нестабильна при использовании хлороформ-метанольных смесей, традиционно применяемых при элюции в ВЭЖХ.

Для выработки подходов к повышению стабильности полимерных покрытий ирследователи обратились к изучению адсорбции заряженных полимеров на неорганических поверхностях. Электростатическое взаимодействие и множественные водородные связи являются, вероятно, причиной необратимой сорбции на поверхности пористых стекол поли-1,2,4-триазола [30]. Полученные таким образом сорбенты применяли для выделения ряда вирусов, которые сохраняли при этом антигенные и иммунные свойства.

Стабильные покрытия были получены также на основе катионогенных производных декстрана, активированных бромцианом для дальнейшей иммобилизации антигена [31]. Такой сорбент эффективно регенерировался без изменения емкости и специфичности. В работе [32] силикагели модифицировали декстранами различных молекулярных весов, различающихся содержанием ДЭАЭ-групп. Оказалось, что молекулярный вес не оказывает влияния на нейтрализацию поверхностных силанольных групп кремнеземов, однако число ДЭАЭ-групп сильно влияет на хроматографические свойства сорбентов, причем, имеется оптимальное их содержание. Так, при содержании указанных групп ниже 4% полной нейтрализации отрицательного заряда поверхности носителя не достигалось, а содержание более 10% создавало излишний положительный заряд на поверхности, что нарушало гель-проникающий механизм и придавало сорбенту анионообменные свойства.

Для увеличения стабильности иммобилизованного полимерного покрытия было предложено проводить химическую сшивку адсорбированных макромолекул бифункциональными и олигофункциональными реагентами. В работе [33] адсорбированный на поверхности силохрома с диаметром пор 1000-1300 А поливиниловый спирт сшивали эпоксидной смолой, затем вводили алкильные радикалы. Полученный материал использовали при выделении микробных липаз. Иммобилизованные на цеолите макромолекулы поливинилового спирта сшивали эпихлоргидрином, затем иммобилизовали на полученной поверхности краситель Cibacron Blue 3G-A, являющийся группоспецифичным лигандом для выделения киназ и дегидрокиназ [34]. Альперт и Ренье [35] адсорбировали на поверхность пористых силикагелей разветвленный полиэтиленимин с массой 600 Да из растворов в метаноле. Такие покрытия дополнительно сшивали для повышения стабильности полимерной фазы тетраглицидиловым эфиром пентаэритрита, а также диглицидилэтиленгликолем [36] и глутаровым альдегидом [37]. В работе [35] также приведены данные по зависимости величины необратимой сорбции полимера от диаметра пор силикагеля. В соответствие с этими данными, поверхность широкопористого силикагеля более доступна для сорбирующихся макромолекул полиэтиленимина, т. к. адсорбция, рассчитанная на единицу площади поверхности, оказывается выше для широкопористого силикагеля. В то же время величина необратимой сорбции выше для узкопористых силикагелей. Аминогруппы в подобных материалах можно кватернизовать, обрабатывая иммобилизованный полиэтиленимин метилиодидом. Полученные таким образом сорбенты позволяют разделять несколько тРНК, а при добавлении в элюент 15% ацетонитрила - разделять олигонуклеотиды с длиной цепи от тридцати до пятидесяти звеньев [38].

Наряду с физически сорбированными полимерными фазами изучалась возможность ковалентной пришивки полимерных молекул к поверхности носителя. При хемосорбции полимера помимо снижения неспецифической сорбции носителем, достигается цель получения стабильного высокоемкого аффинного сорбента посредством введения макромолекулярного спейсора между поверхностью носителя и биоспецифическим лигандом, как было показано при модифицировании сефарозы полилизином и поливиниламином [39]. Оказалось возможным синтезировать композиционные сорбенты, используя, например, сополимеры винилсиланов с мрномерами, несущими функциональную группу, способную ковалентно связываться с поверхностными силанольными группами в результате конденсации с образованием «якорных» связей с поверхностью носителя. В работах Даванкова с сотр. [40] с этой целью применяли сополимер стирола с метилэтилдиэтоксисиланом. Для синтеза использовали кремнеземы с различными диаметрами пор. При этом обнаружили, что замедление диффузии полимера в узкие поры приводит к снижению поверхностной концентрации полимера. Топологию полимерного покрытия (объем пор и распределение пор по размерам) изучали методами ртутной порометрии и эксклюзионной хроматографии с применением полистирольных стандартов. В последнем случае оказалось, что хемосорбированное покрытие приводит к значительному уменьшению диаметра пор, в то время как при проведении ртутной порометрии снижение этой величины было незначительным. Поскольку при хроматографическом процессе полимерная фаза находится в «набухшем» состоянии и полимерные цепи сольватированы молекулами растворителя, проницаемость полистирольного стандарта ухудшается, при порометрическом же анализе полимерная фаза сорбента не набухает. Однако, поскольку полученные хроматограммы свидетельствуют о наличии адсорбционных взаимодействии между полистирольными молекулами в растворе и на поверхности кремнезема, неизбежны искажения результатов. Структуру полученных таким образом полимерных покрытий с большой степенью приближения можно считать «монослойной».

Большое число работ посвящено исследованию сорбентов с различной степенью гидрофобности. Такие сорбенты получали, например, модифицируя силикагель с хемосорбированным полиэтиленимином, который затем обрабатывали 2-(карбометокси)-этилтрихлорсиланом (КМЭТС), ацилировали ангидридом дикарбоновой кислоты [41]. С той же целью силикагель, модифицированный КМЭТС и тетраэтиленпентамином, ацилировали хлорангидридами жирных карбоновых кислот [42]. При хроматографии с применением этих сорбентов все белки (кроме лизоцима) выходили в свободном объеме при низкой ионной силе элюента. Для проведения катионообменной и гидрофобной хроматографии белков была осуществлена хемосорбция высокомолекулярного нейтрального полисукцинимида на аминопропильном силикагеле [43]. Такой сорбент может быть затем гидролизован с образованием полиаспарагиновой кислоты либо подвержен конденсации с Р-аланином в водном растворе с образованием ковалентно пришитого сополимера 2-карбоксиэтил аспартамида и аспартамовой кислоты. На таких сорбентах удовлетворительно разделяли смеси белков в градиенте хлорида натрия. Высокая ионообменная емкость и способность десорбировать полипептиды объясняли гидрофильностью и так называемой «пептидностью» полимерной фазы, т. е. наличием развитой полимерной поверхности с ионизованными группами, локализованными на концах цепей на удалении от поверхности носителя.

В середине 70-х г. г. внимание исследователей привлекли силикагели, модифицированные полиэтиленоксидом (ПЭО), в качестве сорбентов для гидрофобной хроматографии белков и нуклеиновых кислот. Например, реакционноспособными силанами, полученными посредством реакции гидросилилирования между аллиловыми эфирами олигоэтиленоксида и диметилхлорсиланом, обрабатывали силикагели [50] с целью получения сорбентов с различной гидрофобностью для разделения смесей стандартных белков в понижающемся градиенте сульфата аммония в растворе ацетата аммония. Выход всех белков превышал 90%. Исследования сорбентов, полученных на основе силикагелей, модифицированных 3-глицидоксипропилтриметоксисиланом и полиэтиленгликолем, позволили подобрать условия разделения белков посредством линейного градиента сульфата аммония при понижении концентрации последнего [51]. Было установлено, что природа соли в составе элюента, а также структура силана и молекулярный вес ПЭО оказывают различное влияние на эффективность разделения в зависимости от молекулярного веса сорбата [52]. Подобные «мягкие» стационарные фазы могут применяться для выделения высокочувствительных ферментов без потери активности последних.

Возможность «конструирования» композиционных сорбентов с заданными свойствами была реализована также при синтезе широкопористых кремнеземных материалов Ивановым, Зубовым и др. [44, 45] при ацилировании аминопропил-кремнеземов полимерами N-винилпирролидона и акрилоилхлорида, полученными сополимеризацией по свободно-радикальному механизму. Остаточные хлорангидридные группы обрабатывали моноэтаноламином с образованием 2-гидроксиэтиламидных групп. Эти материалы с успехом применяли для выделения различных вирусов, а также РНК из смеси, содержащей рибосомальные фрагменты 70S с количественным выходом. Полимерные фазы таких сорбентов диффузны и гидрофильны, поскольку образованы водорастворимыми полимерами. При этом 90% активных групп хлорангидрид-содержащего сополимера, который хемосорбируется аминопропил-кремнеземом, остаются свободными. Они содержатся в «петлях» и «хвостах» макромолекул [45].

Стабильные сорбенты также были получены в результате хемосорбции поли-п-нитрофенилакрилата на аминопропил-кремнеземе [46]. Поскольку при хемосорбции происходит выделение в раствор п-нитрофенола, оказалось возможным изучение конформационных изменений посредством УФ-спектроскопии. Первоначально макромолекула взаимодействует с поверхностными реакционными группами несколькими звеньями цепи. Затем происходит адаптация макромолекулы к поверхности. Если при этом в реакционную смесь ввести уксусный ангидрид, то при данных условиях ацилированию подвергается более 70% аминопропильных групп и первичные аминогруппы становятся нейтральными ацетиламидными группами, что способствует существенному снижению уровня неспецифической сорбции в сравнении с исходным носителем [47]. Далее п-нитрофенильные группы могут взаимодействовать с первичными аминами с образованием амидной связи. В качестве побочного продукта реакции при этом выделяется нитрофенол. В работах [48, 49] получены подобные гидрофобные сорбенты, модифицированные бутиламином и фениламином. Эти материалы оказались эффективны при ВЭЖХ белков, а бутилированный сорбент проявил максимальную емкость при выделении различных вирусов.

ГЛАВА 3.

СИНТЕЗ КОМПОЗИЦИОННЫХ СОРБЕНТОВ С ПРИВИТОЙ ПОЛИМЕРНОЙ ФАЗОЙ.

Возможности «конструирования» композиционных сорбентов были значительно расширены применением метода графт-полимеризации, благодаря которому на поверхности неорганической матрицы можно сформировать полимерную фазу, не прибегая к стадии адсорбции предварительно полученного полимера. При этом происходит не только рост полимерных цепей от поверхности носителя в ходе полимеризации, но и пришивка «живых» цепей к поверхности подложки. Полимерные молекулы диффундируют к поверхности твердой фазы, поэтому диффузионные и стерические затруднения могут снизить степень модификации и выход графт-полимеризации. Но поскольку размеры молекул малы, эти факторы при графт-полимеризации не имеют столь определяющего значения и существует возможность формировать фазы с высокой концентрацией полимера.

Необходимыми условиями для осуществления графт-полимеризации являются наличие и доступность активных участков модифицируемой поверхности. При этом можно формировать активные центры непосредственно на поверхности кремнезема с концентрацией силанольных групп 4,6-4,8 (9#-групп/нм2 [6, с.23]. С другой стороны, возможно предварительно химически модифицировать поверхностные гидроксильные группы с целью создания новых активных участков, образованных, например, силоксановыми мостиками. В качестве таких модификаторов широко используются органосиланы, обычно общей формулы ЯЯгХз, где X - гидролизуемая группа (галоген, алкокси- и пр.), а К - негидролизуемая органическая функциональная группа, которая и определяет химическую природу получаемого сорбента.

Следует заметить, что реакционноспособные центры могут быть получены также в результате активации поверхности носителя механохимическими реакциями, когда носитель (наполнитель) подвергается истиранию, расщеплению [53]. Однако эти методы, наряду с активацией поверхности минеральных носителей с помощью плазмы [54] используются преимущественно в создании высоконаполненных композиционных систем при наполнении полимеров на стадии синтеза. В то же время, образование реакционных центров и протекание графт-полимеризации может происходить при радиационном облучении либо под действием инициаторов свободных радикалов. Механизмы подобных процессов, позволяющих получать композиционные полимерсодержащие сорбенты, рассматриваются в ряде работ [55- 58].

Радиационно-инициированная полимеризация может проводиться различными способами [59]:

• прямым облучением системы носитель-мономер. Мономер при этом может находиться как в жидком состоянии (в чистом виде или в виде раствора), так и в газообразном или парообразном;

• прививкой на предварительно облученную в инертной атмосфере или в вакууме поверхность («пост-полимеризация»). При этом мономер обычно присутствует в газообразном или парообразном состоянии.

Радиационно-инициированная полимеризация в присутствии твердого носителя протекает в слоях мономеров, адсорбированных на ее поверхности. В случае силикагелей их поверхностные силанольные группы образуют радикалы БЮ* и при облучении.

Таким образом полимеризуются, например, стирол, метилметакрилат, акрилонитрил и аллилглицидиловый эфир на поверхности силикагеля [60].

При прямом облучении образуется значительное количество гомополимера из-за присутствия низкомолекулярных радикалов Н* и ОН*, химически не связанных с поверхностью. Поэтому необходимо предварительно обрабатывать силикагель нерастворимыми органосиланами для формирования более устойчивой полимерной фазы. Напротив, полимеризация мономеров в газовой фазе помимо низкого количества образующегося гомополимера характеризуется еще одним преимуществом: прививка к поверхности осуществляется даже при низком выходе активированных участков на кремнеземе после радиолиза. Количество привитого полимера увеличивается с увеличение дозы облучения и имеет предельное значение [61].

Еще большие преимущества дает низкотемпературная пост-полимеризация, поскольку при этом повышаются как выход полимера, так и эффективность прививки. В работе [62] сообщалось о полимеризации тетрафторэтилена на кремнеземной поверхности с эффективностью прививки свыше 30%. Однако при этом необходимо поддерживать условия полимеризации, предотвращающие закупорку пор матрицы.

Поскольку инициирование полимеризации винилсодержащих мономеров на поверхности силикагеля может проводиться посредством введения инициаторов свободно-радикальной полимеризации, различают несколько способов введения инициатора в систему:

• введение инициатора путем образования ковалентной пришивки к подложке -при этом увеличивается выход привитого полимера, но образуется также значительное количество гомополимера;

• физическая адсорбция инициатора на поверхности кремнезема из раствора;

• введение инициатора в мономер или в раствор мономера.

Вообще говоря, при получении однородных устойчивых полимерных покрытий, как правило, придерживаются нескольких правил. Во-первых, следует использовать мономеры с реакционноспособными группами. Например, при обработке макропористого стекла 2,3-эпоксипропилметакрилатом с последующей полимеризацией удалось получить однородное полимерное покрытие с сохранением пористости исходного носителя [63]. Во-вторых, поверхность предварительно активируют органосилильными соединениями, способными сополимеризоваться с винилсодержащими мономерами (метилметакрилат, акрилонитрил, акриловая и метакриловая кислоты, стирол, М-винилпирролидон, бинарные смеси триэтоксивинилсиланстирола или триэтоксивинилсилан-метилметакрилата с винилсодержащими мономерами и др.) для прививки полимеров на кремнеземные матрицы [64-69]. В-третьих, применяют бифункциональные сшивающие агенты (например, дивинилбензол в присутствии азо-бис-изобутиронитрила), вводя их в систему с суспендированными частицами носителя, причем, образующийся в жидкой фазе полимер адсорбируется на частицах твердой фазы и затем сшивается с образованием трехмерной сетки на поверхности частиц [70, 71].

Таким образом, подбор условий проведения полимеризации имеет большое значение, т.к. корреляция между условиями синтеза и свойствами конечного продукта менее очевидна, нежели при адсорбции полимеров. Вместе с тем обычно прививочная полимеризация проводится с меньшим числом стадий синтеза по сравнению с методиками, основанными на адсорбции полимеров.

Литературные данные свидетельствуют о том, что модификация поверхности кремнеземов олигомерами и полимерами позволила за последнее время создать поколение новых хроматографических материалов, сочетающих в себе высокую механическую и физико-химическую стабильность со способностью эффективного фракционирования сложных смесей биополимеров без существенной деградации их природных свойств.

Подобные материалы все чаще используются как для аналитических, так и для препаративных целей.

Мчедлишвили с сотр. [71] изучали свойства пористых стекол, модифицированных сополимерами N-винилпирролидона и диметакрилатов этилен- и триэтиленгликоля. Эти сорбенты применяли для гель-фильтрации вирусов гриппа и бешенства от примесных белков, причем выход разделяемых компонентов был близок к количественному, что подтверждает равномерность и плотность распределения полимера по поверхности стекла. Предполагая равномерность полимерного покрытия и принимая во внимание данные элементного анализа, была рассчитана средняя толщина полимерного слоя, равная 15-20 А. Пористая структура по данным ртутной порометрии значительно изменялась лишь в случае стекол со средним диаметром пор 200 А.

При у-облучении деаэрированной смеси цеолита с водным раствором 2-оксиэтилметакрилала (11%) и 14,№-метиленбисакриламида (0,15%) [34] с последующей иммобилизацией красителя Cibacron Blue F-3A был получен материал, способный сорбировать из раствора сывороточный альбумин.

Аффинные сорбенты, содержащие привитые сополимеры N-метилоилакриламида с N-замещенными акриламидами, содержащими активированные сложноэфирные группы (N-оксисукцинимидные), а также с аллиламином и N-аллилбромацетамидом на основе широкопористых силикагелей, химически модифицированных диольной фазой, описаны в работе [72]. При нагревании в присутствии каталитических количеств кислот метильные группы способны взаимодействовать с гидроксилами глицерилпропильной фазы с образованием простых эфирных связей; также могут иметь место реакции с отщеплением воды и образованием связи между атомами азота через промежуточную метиленовую группу, что обеспечивает сшивку адсорбированных молекул между собой и одновременное прикрепление их к носителю. В качестве аффинного лиганда к активированным носителям присоединяли гепарин, концентрация которого в иммобилизованном состоянии находилась в пределах 10-12 мг/г сорбента. На полученных таким образом сорбентах выделяли антитромбин-Ш, протеиназу из сыворотки крови, специфически связывающуюся с гепарином. Количество связанного антитромбина-III не зависит от концентрации лиганда внутри указанного интервала ее значений. Количество связанного белка оказалось в 4-5 раз выше, чем на гепарин-сефарозе С1-6В.

В распределительной хроматографии аминокислот использовали пористые носители, содержащие алифатические гидрокси-группы, модифицированные прививкой полиакриламида, которую осуществляли под действием окислительно-восстановительного инициирования [73].

Фирмой Toyo Soda Manufacturing разработаны композиционные сорбенты типа TSK-GEL SW, имеющие сферические частицы размером 10+2 мкм и диаметр пор 130, 240 и 450 А [74]. Эти сорбенты подвергались окислению периодатом и обработке гексаметилендиамином, что позволило иммобилизовать на их поверхности 7-пентанамидоцефалоспориновую кислоту [75]. Поэтому, вероятно, в состав покрытия TSK-GEL SW сорбентов входят гидроксил-содержащие полимеры. Элюция белков в 0,07 М фосфатном буфере (рН=6,8) в присутствии 0,1 М NaCI происходит на этих сорбентах по молекулярно-ситовому механизму, однако на основе этих сорбентов получены также анионообменные производные [76]. Этой же фирмой разработаны способы прививки виниловых мономеров на пористые материалы под действием |> и у-излучения [77]. Мономер адсорбировали на пористой матрице и облучали на источнике 60Со. Количество привитого полимера, как правило, увеличивалось с уменьшением дозы облучения. Оптимальная доза зависит от типа мономера и обычно составляет 1-10 Мрад при температуре образцов до 50°С. Эмпирически подобранная величина адсорбции мономера составила 6-7 мономолекулярных слоев.

В некоторых работах проведению полимеризации предшествует стадия адсорбции паров мономера на поверхности носителя. Так, по данным работы [78] при воздействии на кремнеземы ионизирующего излучения мощностью дозы до 40-100 рад/сек в присутствии паров акриловой кислоты и винилацетата с последующей активацией функциональных групп привитых полимеров удалось получить носители для иммобилизации ферментов, липидов, нуклеотидов, причем удавалось вводить до 4 ммоль функциональных групп на 1 г сорбента, что в 8 раз превышает аналогичный показатель для сорбентов, полученных путем обработки матриц кремнийорганическими реагентами.

Имеются данные [79] ртутно-порометрического анализа и тепловой десорбции азота для целого ряда модифицированных пористых стекол с диаметрами пор от 400 до 2000 А0, которые свидетельствуют об однородном распределении привитого полимера к внутренней поверхности частиц матрицы по крайней мере с диаметром пор не ниже 400

А.

Известно также [80], что в области низких концентраций мономера на поверхности кремнеземов образуется полимер, представляющий собой систему не взаимодействующих между собой макромолекул, связанных с твердой поверхностью. При переходе к большим концентрациям адсорбированного мономера в привитых макромолекулах уменьшается доля сегментов, связанных с поверхностью водородными связями. Так, при концентрации винилацетата 0,1 ммоль/г сорбента их количество составляет 70%, а при семикратной концентрации - 40%. Это явление, обусловленное конкуренцией привитых макромолекул за связывание с поверхностью носителя, косвенно указывает на их взаимное переплетение, как это имеет место при адсорбции полимера из раствора [81].

Методами прививочной полимеризации получают сорбенты со значительно большим количеством привитой органической фазы и со значительно большими молекулярными массами (до 10б и более) в сравнении с методами адсорбции полимеров [60]. Однако при этом регулировать величину молекулярной массы значительно сложнее,

33 кроме того, необходимо проводить дополнительные эксперименты по оптимизации количества адсорбированного мономера.

Прививка на поверхность пористого носителя винилсодержащих полимеров состава СВ2=СНСОЖ(СН2)2ЩСН3)2, СН2=СНСОЖ(СН2)2ЩС2Н5)2,

СИ2- СНС(ЖН(СН2)2N' (СНз)„ СН2=СНСОО\ СН2=СНС0ЖС(СН3)2СН2803\ позволяет получить ряд композиционных ионообменных сорбентов [82]. Плотность прививки полимера определяется плотностью гидроксильных групп на поверхности носителя, длина же привитой цепи определяется количеством мономера. Привитые цепи, как правило, не имеют разветвлений и образуют слои со щеточной структурой. При сорбции белков и нуклеиновых кислот оптимальная толщина такого слоя составляет 5-50 звеньев. Подобные материалы называются «щупальцевыми» и имеют повышенную селективность к белкам, поскольку молекулы сорбата вблизи поверхности такого сорбента легко «оплетаются» иммобилизованными молекулами полимерной фазы за счет оптимальных электростатических взаимодействий и тем самым обеспечивается взаимодействие сорбата с полимерной фазой на удалении от поверхности носителя при отсутствии неспецифической сорбции.

ГЛАВА 4.

ПОЛУЧЕНИЕ КОМПОЗИЦИОННЫХ СОРБЕНТОВ С НЕТРАДИЦИОННЫМИ

ПОЛИМЕРНЫМИ ФАЗАМИ.

Необходимость иметь в распоряжении лабораторий сорбенты, выдерживающие воздействие агрессивных сред, частую смену элюента и многократно регенерируемые без потери полезных свойств, обусловила разработку нового поколения полимерсодержащих композиционных материалов, в частности, фторсодержащих сорбентов. Эти материалы нашли широкое применение как при выделении низкомолекулярных соединений, так и при выделении и очистке биополимеров. Ранние работы в этой области были направлены на изучение функционализованных частиц полихлортрифторэтилена ПХТФЭ, который характеризуется хемостойкостью, гидрофобностью и высокой механической прочностью.

При обработке ПХТФЭ литий- и магний-органическими соединениями (н-бутиллитий, ариллитий, алкил-магний, арилмагний) получали материалы с пониженным содержанием хлора, содержащие алкильную группу [83]. Оптимальный выход реакции наблюдали при трехкратном избытке металлоорганического компонента, при комнатной температуре в среде ТГФ. Полученный таким способом н-бутил-ПХТФЭ применяли при разделении смесей ароматических соединений в водно-метанольных смесях [84], в то время как немодифицированный материал не дал положительных результатов. Работы по изучению свойств фенил-ПХТФЭ подтвердили обращенно-фазовый механизм удерживания, поскольку зависимость селективности к метиленовому звену от вида и содержания органического компонента в элюенте была линейной [85]. Модификацией ароматического ядра в цепи фенил-ПХТФЭ были получены сильные катионо- и анионообменники с емкостью около 0,2 ммоль/г [86]. Эти материалы характеризовались сочетанием обращенно-фазовых и ионообменных эффектов. Подобные материалы находили применение при разделении близких по строению лекарственных соединений пиридоксин, пиридоксамин и т.п.), а также при концентрировании следов органических соединений из водных растворов [87].

ПХТФЭ, модифицированный триалкил (С8-С10) метиламмонием либо четвертичным аммониевым соединением КРС-5 использовали в разделении т-РНК, нуклеотидов, нуклеозидов, ДНК-фрагментов [88-90]. Однако такие покрытия оказались недостаточно стабильными. ПТФЭ-частицы (или пленку) использовали также для иммобилизации различных ферментов (уреаза, лактат дегидрогеназа), однако емкость таких материалов оказалась невысока, вероятно, в связи с малым размером пор [91, 92]. В то же время колонки с подобными материалами оказались очень стабильными при различных значениях рН,

Создание композиционных сорбентов на основе неорганических пористых матриц с фторполимерсодержащими покрытиями открыло новые перспективы для применения композиционных материалов при очистке биологически активных соединений. Модифицировав силикагель (гептадекафтордецил)диметилсиланом (ГФД), Берендсен [93] сравнил полученный им материал с силикагелями, модифицированными пропил- и н-децил-углеводородными аналогами. Основным преимуществом ГФД-фазы оказалось хорошее удерживание на ней фторсодержащих соединений. Бензол и фторбензол удалось разделить на ГФД-фазе, в то время как на не содержащих фтор аналогах такое разделение не удавалось. При этом с увеличением числа атомов фтора удерживание усиливалось.

Было также показано [94], что ГФД-фаза слабее удерживает ароматические соединения, нежели С18 фазы. Однако эффект этот вызван не укорочением углеродной цепи лиганда. Было найдено, что при добавлении в подвижную фазу фторсодержащего компонента (трифторэтанола) селективность ГФД-фазы к фторсоединениям подавлялась, в то время как ряд не содержащих фтор соединений (ацетофенон, например) удерживались на ГФД сильнее, чем на С18 фазе. В удерживании полициклических ароматических углеводородов перфторэтоксиэтанольной фазой обнаружен вклад индукционных взаимодействий между С-Р диполями и электронами сорбатов [95]. Аналогичные результаты получены при изучении пентафторфенил-модифицированных силикагелей, в особенности сильно сорбировавших галоген-содержащие соединения [96]. Данная тематика рассматривается в ряде публикаций [97- 99].

Поскольку фторсодержащие сорбенты, как правило, сорбируют неполярные соединения слабее, чем сорбенты, содержащие углеводородные полимерные фазы, было предложено десорбировать белки с фторсодержащих сорбентов, уменьшая содержание органического компонента в элюенте, что, кроме прочего, позволило бы выделять белки в неденатурирующих условиях. Это предположение оправдало применение ГФД-модифицированных сорбентов [100].

Довольно обстоятельное исследование было проделано в работе [93], в которой изучались аспекты адсорбции фторсодержащих соединений, в том числе биополимеров, на фторированных полимерных матрицах. В работе сделан вывод, что природа взаимодействия предварительно полученного перфторалкилсодержащего белка с фторсодержащей углеродной поверхностью неизвестна. Предполагалось, что при этом имеет место особое, так называемое, «фтор-обусловленное» взаимодействие, отличное от обычно наблюдаемых при обращенно-фазовом разделении эффектов.

Весьма устойчивый так называемый бифильный сорбент был создан модификацией наружной поверхности частиц перфторбутилэтилендиметилсилильными группами для уменьшения адсорбции липофильных сорбатов (белков крови, например), в то время как внутренняя поверхность пор модифицировалась октадецильными группами для адсорбции низкомолекулярных соединений [101]. Такой материал позволил определять различные лекарственные препараты в крови человека. Этот сорбент по своему строению принципиально сходен с известными т. н. сорбентами Пинкертона [102], внешняя поверхность которых гидрофилизована и не удерживает компоненты смесей лекарственных препаратов и пептидов в биологических жидкостях, а внутренняя поверхность пор (до 98% всей поверхности) гидрофобизована трипептидом глицинфенилаланинфенилаланила. Протеины не проникают внутрь частиц сорбента в виду больших размеров, в то время как метаболиты лекарственных соединений хроматографируются во внутреннем объеме пор.

Альтернативный способ синтеза композиционных фторполимерсодержащих сорбентов был предложен в работах [103-105]. Способ заключается в радиационной постполимеризации тетрафторэтилена на пористых кремнеземах. Эти материалы очень устойчивы в широком диапазоне рН, в различных органических растворителях, при высоких температурах (до 200°С). Методика синтеза позволяет сохранить пористость исходной матрицы. Эти сорбенты использовали при селективной адсорбции биологических молекул, либо для адсорбции нежелательных примесей. Оба эти процесса оказалось возможным регулировать, изменяя полярность элюента при обращенно-фазовой хроматографии. Эти материалы можно применять также для эксклюзионной хроматографии. Эффективность применения такого сорбента можно продемонстрировать на примере отделения плазмидной ДНК от сопутствующих белков и РНК, причем, РНК и белки обратимо сорбируются. Плазмидная ДНК выходит в первой фракции при элюции 7Э-буфером (рН 7,5). При последующей элюции 50% метанолом РНК и белки также выходят в первой фракции. При отделении всех нуклеиновых кислот от белков требуется проведение градиентной элюции ацетонитрилом в смеси 0,01 М Тш-НС1. Нуклеиновая кислота выходит одним пиком при 10% концентрации ацетонитрила. В качестве примера можно привести очистку плазмиды рВК 322 от РНК и белков. Эту процедуру можно выполнять также в пластиковом картридже, содержащем всего около 300 мг сорбента. Начальный раствор в 0,01 М Тш-НСЛ буфере (рН 7,5-8,2) прокачивали с помощью шприца через картридж. Плазмидная ДНК выходила вместе с элюатом, РНК и белки сдрбировались на поверхности сорбента. Элюцию РНК проводили 5% и 10% ацетонитрилом. РНК фракция содержала РНК молекулы различной молекулярной массы, которые выходили последовательными пиками и давали две зоны в 1% агарозном геле.

В работах [106-108] для получения композиционных трифторстиролсодержащих сорбентов радикальной сополимеризацией в массе синтезировали сополимер трифторстирола и метилвинилдиэтоксисилана альтернативными методами. Так, силикагель ЗИшогЪ 300 модифицировали сополимером, вводя раствор сополимера в суспензию навески силикагеля в абсолютном толуоле с последующим кипячением, фильтрацией через ПТФЭ-мембрану и промывкой горячим абсолютным толуолом. Блокирование остаточных силанольных групп проводили кипячением сорбента в толуоле в присутствии гексаметилдисилана. Кроме того, силикагель, предварительно модифицированный тетрафторэтиленом, помещали в ампулу, присоединяли к вакуумной установке, охлаждали до 77 К и облучали ^-источником (дозой 3-5 Мрад). Затем образец постепенно нагревали до 333 К и в систему впускали парообразный трифторстирол. Ампулу термостатировали 18 часов при 333 К. Сорбент затем промывали толуолом для удаления димера трифторстирола.

Показано, что политрифторстиролсодержащие сорбенты, синтезированные двумя способами, имеют близкие адсорбционные и хроматографические свойства и занимают промежуточное положение по этим свойствам между кремнеземами, модифицированными политетрафторэтиленом и стиролом. Синтез сорбентов путем последовательной ^-инициированной пост-полимеризации тетрафторэтилена и трифторстирола на поверхности кремнеземов позволяет получать материалы, обладающие высокой гидролитической стабильностью. На их основе синтезировали катионо- и анионообменники с широким диапазоном концентраций ионообменных групп.

Таким образом, фторполимерсодержащие сорбенты, благодаря своим свойствам (высокая хемо- и термостойкость, низкая адсорбционная активность, высокая селективность к соединениям различных классов) перспективны для различных типов ВЭЖХ биополимеров.

В качестве альтернативы фторполимерсодержащим сорбентам можно привести пример композиционного сорбента на основе макропористого стекла, модифицированного полипараксилиленом [110]. Исходным мономером при этом служит п-ксилилен СН2-С6Н4-СН2-СН2-С6Н4-СН2, который в обычных условиях существует в виде циклического димера. Пиролизом при 600° С его переводят в мономерное состояние в газовой фазе, в присутствии неорганической матрицы с развитой поверхностью происходит интенсивная полимеризация с образованием тонкой (порядка 25-50 А толщиной по данным ртутной порометрии) сплошной пленки полимера на поверхности носителя, причем экранирование поверхности матрицы весьма существенно повышает устойчивость данного сорбента в условиях щелочного гидролиза и при этом сохраняется пористость исходной матрицы. Возможность ввода различных заместителей в мономер существенно расширяет применимость данной методики синтеза для получения сорбентов с заданными свойствами, однако относительная дороговизна исходных материалов и необходимость в установке для пиролиза несколько ограничивают темпы разработки таких материалов.

В работе [5] сообщалось также о синтезе композиционного сорбента с применением другого нетрадиционного материала. Комплекс полидиметилдиаллиламмоний хлорида (ПДМДААХ), с предварительно иммобилизованным инициатором полимеризации (пероксид водорода), наносили на поверхность пористой неорганической матрицы (МПС-2000 ГХ), удаляя растворитель, а з^тем вводили раствор акриламида в количестве, необходимом и достаточном для формирования набухающего пришитого к ПДМДААХ акриламидного геля. По результатам предварительных экспериментов сорбент оказался селективен к паре нуклеиновая кислота-белок, при этом белковые компоненты выходят с фронтом элюента, а нуклеиновые кислоты сорбируются неподвижной фазой.

Еще одним нетрадиционным мономером для синтеза композиционных сорбентов оказался анилин. Полианилин, как известно, впервые был описан еще в 1910-1912 г.г. (открыт в 1862 г.) как существующий в четырех окисленных состояниях, каждое из которых имеет октамерную структуру. В 1950-1960-х г.г. появились статьи по олигомерам полианилина и электрохимическому окислению. Термин «полианилин» сегодня относится к полимерам, состоящим из более чем 1000 звеньев, которые можно рассматривать как производные полимера с основной формулой, представленной на рис. 1 [111, 112], и содержащего чередующиеся восстановленные повторяющиеся единицы и окисленные повторяющиеся единицы. Иминные атомы азота в любом образце могут быть протонированы полностью или частично. Степень протонирования определяется окисленным состоянием полимера и рН водной кислоты. Полианилин может существовать в виде различных окисленных состояний, в форме основания или соли (протонированная форма). В форме основания различают три окисленных состояния полианилина: лейкомеральдиновое (ЛЭО), эмеральдиновое (ЭО) и пернигранилиновое (ПГО) основания. ЭО представляет собой полимер, в котором чередуются мономерные звенья в восстановленной-ЛЭО и в окисленной-ПГО формах.

Рис. 1. Основные формы полианилина и их взаимопревращения. АРБперсульфат аммония.

Единственной устойчивой протонированной формой полианилина является эмеральдиновая соль (С). В зависимости от метода получения можно выделить два вида полиэмеральдина [113]. Они отличаются друг от друга структурой протонированной формы. Обе формы получают с использованием различных окислителей и растворителей. Они имеют различные электрофизические и магнитные свойства. Частично протонированную соль полианилина можно получить полимеризацией в кислой среде с помощью окисляющих агентов, например, персульфата аммония в водном растворе соляной кислоты в виде осадка эмеральдиновой соли (эмеральдин гидрохлорид) темно-зеленого цвета, в состав которого входит 42% протонированных атомов азота. Этот полимер можно депротонировать водным раствором гидроксида аммония с образованием черно-синего эмеральдинового основания. Если депротонирование проводить в атмосфере инертного газа, основание будет несколько восстановлено. Если же проводить процесс на воздухе, то основание будет частично окислено. Кроме того, полианилин в допированной форме является электропроводящим полимером [114].

Уже это простое перечисление форм, в которых может существовать полианилин, указывает на сложности, сопряженные с синтезом полианилинсодержащих сорбентов и, вместе с тем, на возможности, открываемые применением таких сорбентов. Первые сообщения о принципиальной возможности использования полианилина как материала для хроматографических сорбентов относятся к 90-м г.г. [115, 116]. Наряду с этим появлялись работы по изучению уникальных свойств полианилиновых растворов и пленок. Так, в работе [117] обсуждается приготовление и свойства химически модифицированного пленочного элемента из поли-(п-хлор-анилина) для детекции pH. В некоторых работах, например в [118], указывается на возможность получения пленок полианилина с весьма упорядоченной однородной структурой. Эти свойства в будущем, несомненно, найдут применение при синтезе сорбентов.

Простота и преимущества синтеза полианилинсодерджащих сорбентов определяются прежде всего мягкими условиями полимеризации (комнатная температура, водная среда, отсутствие дорогого и сложного оборудования). Сложности заключаются в недостаточной изученности кинетики процесса, что определяет, в основном, эмпирический подход к подбору состава реакционной смеси; в превалировании побочных реакций при определенных условиях и формировании сильно разветвленных структур полимера на поверхности; в нерастворимости полианилина в подавляющем большинстве органических растворителей (в этом, вместе с тем, заключается определенное преимущество полианилина как компонента композиционного сорбента), в связи с чем сильно затруднено изучение характеристик полимера. Однако преимущества, даваемые таким сорбентом (/¿//-управляемая неподвижная фаза, визуализация разделения, комбинирование в одном сорбенте в зависимости от условий проведения элюции эффектов гель-фильтрации, обращенно-фазового разделения и ионнообменного механизмов) объясняют необходимость оптимизации методик синтеза и применения полианилин-содержащих сорбентов.

Приведенный в настоящей работе обзор литературных данных, конечно же, не исчерпывает всего многообразия синтетических композиционных материалов на основе макропористых полидисперсных неорганических носителей. Однако информация, представленная в нем, свидетельствует о том, что сегодня такие материалы находят широкое применение в проведении все более сложных анализов как с помощью ВЭЖХ, так и с применением альтернативных методов, вплоть до самых нетрудоемких, и вместе с тем весьма результативных. Потребность в таких материалах обусловливает значительное расширение набора модифицированных сорбентов. Прогресс в этой области привел, например, к появлению материалов, различным образом модифицированных по внешней и внутренней поверхностям, сорбентов, изменяющих топологию поверхности, а следовательно, и сорбционные характеристики при изменении рН среды либо температуры (так, в [119] описывается методика проведения противоточной хроматографии со сформированными /»//-зонами для предсказания гидродинамического механизма процессов разделения; появились весьма устойчивые к агрессивным средам и стабильные в широком интервале рабочих условий сорбенты; изучаются и используются возможности регулирования гидродинамических процессов в колонках с псевдоожиженным слоем под воздействием магнитного поля [120], предлагаются способы проведения хроматографического процесса с использованием так называемых колонок с контролируемым электрическим зарядом, в которых между слоем твердого электропроводящего сорбента и электродом, соединенным с корпусом колонки, накладывают электрический потенциал, что обеспечивает эффективное разделение компонентов при хроматографии [121]). Снизилась, по общим оценкам, себестоимость композиционных материалов и трудоемкость методик их синтеза.

Таким образом, создание современных композиционных материалов является актуальной междисциплинарной проблемой, которую невозможно успешно разрешить, не обращаясь к изучению химических, физико-химических, биохимических, технологических аспектов в их комплексе, обобщая и анализируя все данные, накопленные при использовании каждого конкретного подхода.

В связи с этим поиск новых доступных и перспективных материалов для получения композиционных сорбентов, разработка оптимальных и масштабируемых методик синтеза, а также методов тестирования полученных композиционных материалов представляются закономерными и необратимыми.

АВТОР ЗАЩИЩАЕТ:

1. Способ получения композиционных полифторбутадиенсодержащих сорбентов на основе дисперсных объемно-пористых носителей, отличающихся высокой селективностью при выделении и очистке нуклеиновых кислот.

2. Оптимальные условия получения сорбентов, обеспечивающие иммобилизацию равномерной тонкой пленки полимера на поверхности объемно-пористых частиц носителя, а также повышенное содержание фтора в иммобилизованных полимерных пленках.

3. Дифторид ксенона в качестве фторирующего агента для получения композиционных полифторбутадиенсодержащих сорбентов с повышенным содержание фтора, обусловливающим низкий уровень неспецифической сорбции при выделении нуклеиновых кислот.

4. Оптимальные значения молекулярной массы и состав исходных олигобутадиенов, используемых при иммобилизации тонких полимерных пленок на поверхности объемно-пористых носителей для последующего фторирования.

5. Композиционные полифторбутадиенсодержащие сорбенты на основе кремнеземов для получения чистых препаратов ДНК из различных источников с высоким выходом.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА, РЕАГЕНТЫ, МАТЕРИАЛЫ

Макропористые стекла: МПС-2000ГХ, МПС-1150ГХ, МПС-500ГХ, МПС-250ГХ (производства Горьковского опытного завода ВНИИНП, Россия, фракция 0.25-0.5 мкм; макропористые стекла предварительно замачивали в 18% соляной кислоте в течение 3 сут, отмывали водой до нейтральных значений pH, сушили до постоянного веса в вакуумном сушильном шкафу 17 ч при 70°); CPG-10-500 (производства фирмы Proligo, Германия, фракция 100 мкм); GPB-500-Trisopor™ (производства фирмы Shuller, Германия, фракция 100-200 мкм).

Олигобутадиен, молекулярная масса 5000, сод. 1,2 - звеньев - 20%, сод. 1,4 -звеньев - 80%, Aldrich, Германия. н-Пентан - марки х.ч., ГОСТ

Метиловый спирт, ГОСТ 5962-67.

Кислота соляная - марки х.ч., ГОСТ

Вода - стандарт Milli Q.

Ферменты: РНКаза (Calbiochem, Швейцария), рестриктазы Ecu RI, Hinf -предоставлены фирмой MIRA-Diagnostica, GmbH, Германия.

Бактериальные штаммы предоставлены фирмой MIRA-Diagnostica, GmbH, Германия.

Образцы плазмид предоставлены лабораторией генной инженерии Учебного центра ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Препараты человеческой крови предоставлены Научно-исследовательской лабораторией прикладной экологии Минздравмедпрома РФ, Москва.

Лизирующая система (буфер для лизиса клеточной стенки, оболочки и протеолиза, а также смесь детергентов) - предоставлены фирмой MIRA-Diagnostica, GmbH, Германия.

Набор для выделения бактериальных ДНК QiaAmp (Qiagen, Германия).

Реагенты для проведения электрофореза: агароза (Fluka, Швейцария), акриламид (Merk, Германия), А^ТУ'-метилен-бис-акриламид (Merk, Германия), Трис (Merk, Германия), Na г. ЭДТА (Sigma, Германия); додецилсульфат натрия (Sigma, Германия), персульфат аммония (Sigma, Германия), ТЕМЕД (Sigma, Германия), красители (оранжевый Ж, этидиума бромид, бромфеноловый синий, кумасси (Roti-blue) - все фирмы Merk, Германия; буфер Laemmly (Aldrich, Германия), глицерин (Aldrich, Германия), ß-меркаптоэтанол (Aldrich, Германия), кислота уксусная (Aldrich, Германия), сульфат аммония (Sigma, Германия), глицин (Aldrich, Германия); маркер (белковая смесь -лизоцим , 12 кДа, ß-лактоглобулин, 19 кДа, угольная ангидраза, 28 кДа, овальбумин, 45 кДа, бычий сывороточный альбумин, 68 кДа, фосфорилаза В, 107 кДа, миозин (Я-цепь), 208 кДа) - предоставлен фирмой MIRA-Diagnostica, GmbH, Германия.

Реагенты для проведения ПЦР: растворы нуклеотидов, буфер (Perkin Elmer, США); праймеры - предоставлены фирмой MIRA-Diagnostica, GmbH, Германия.

Буферный растворы: ТЭ, pH 1А (Трис, М^-ЭДТА), боратный буфер, pH 9.0, ТБЭ, pH 8.0 (Трис, борная кислота, М^-ЭДТА).

АППАРАТУРА

Ртутный порометр Pore Sizer 9300 (Micromeretics, США); ультразвуковая ванна;УФ-спектрофотометр DU-70 (Весктап, США); /7#-метр ОР-211/1 (Radelkis, Венгрия); ИК-спектрофотометр Specord IR 75 (Carl Zeiss, Jena, Германия); центрифуга Centrifude 5414 (Labomed Eppendorf, Германия); прибор для настольного электрофореза GNA-10 (Pharmacia, Швеция); фотосканер (Perkin Elmer, США); термостат Julabo

Labortechnik, GMBM, Германия), хроматограф жидкостный (Весктап, США); амплификатор (Perkin Elmer, США); весы электронные (Sartorius-120, Великобритания); насос перистальтический Varioperpex 2120 (.LKB, Швеция); хроматографические колонки для жидкостной хроматографии 5x10 см (Pharmacia, Швеция); пластиковые картриджи со сборниками Lila (Турция) - предоставлены фирмой MIRA-Diagnostica, GmbH, Германия.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Синтез полифторбутадиенсодержащих сорбентов проводили на установке, представляющей собой вакуумируемый сосуд (объемом 100 мл), содержащий навеску носителя (10-15 г), соединенный со снабженным поршнем цилиндром, содержащим предварительно подготовленный раствор олигобутадиена (0.125-1.25 г /г носителя, т.е. исходя из загрузки, эквивалентной моно- - десяти-молекулярным слоям олитгобутадиена на поверхности носителя в зависимости от площади поверхности носителя) в н-пентане (45-50 мл) (рис. В). Сосуд снабжен также трубкой с вентилем, соединенной с линией вакуумного насоса. После вакуумирования линю насоса перекрывали, затем подавали раствор олигомера через трубку, устроенную таким образом, что раствор, проходя сквозь слой носителя, смачивает его, интенсивно впитываясь в поры частиц. При этом образуется равномерно смоченный плотный слой носителя. Сосуд затем помещали на 15 мин в ванную для обработки ультразвуком при атмосферном давлении. После озвучивания суспензии растворитель отгоняли на роторном испарителе (3 ч, 30 об/мин) с использованием водяной бани (70°С). Образовавшийся полупродукт был окрашен в белый цвет и не смачивался водой. Проводя последующую сушку в вакуумном сушильном шкафу при комнатной температуре в течение 6 ч, получали полупродукт, который подвергали фторированию.

Фторирование полимерной фазы, адсорбированной на поверхности пор носителя, проводили на специальной установке в режиме «псевдоожижения», продувая аргон в течение 1-4 ч через реакционную трубку, заполненную навеской сорбента и парами возгоняемого при 65° С в специальной камере дифторида ксенона (рис. 5,6). Полученный сыпучий образец сорбента белого цвета не смачивается водой. Для удаления летучих побочных продуктов продукт в безкислородных условиях переносили в вакумируемую камеру, которую вакуумировали в течение 1.5 - 4 ч при температурах 25 -80°С.

Для оценки гидролитической стабильности сорбентов два образца МПС, немодифицированного и модифицированного фторполибутадиеном, одинаковой массы предварительно замачивали в 70% метаноле на ночь, затем добавляли равный объем буфера (рН 9,5), содержащего 0,025 М борат натрия и 0,1 М гидроксид натрия, осаждали сорбент, центрифугируя в течение 1 мин при 3000 об/мин, отбрасывали супернатант, вновь добавляли буферный раствор до получения 10% суспензии сорбента (по массе) и инкубировали образцы в этом буфере при комнатной температуре в течение 8 ч. Добавляли раствор 0,05 М молибдата натрия, подкисленный серной кислотой (1/200 объема раствора молибдата натрия) и перемешивали суспензию 10 мин; после осаждения сорбента пипеткой отбирали аликвоты надосадочной жидкости и измеряли интенсивность поглощения при Л=320 нм, снимая спектрограммы на спектрофотометре Векстап.

Элементный анализ проводили проводили в МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

Ртутную порометрию образцов сорбента проводили на приборе «Роге Зггег 9300» (Млсготегейсв, США). Образец сорбента помещали в чашку пенетрометра, представляющего собой цолый открытый с двух концов стержень со стеклянной чашкой на одном конце, вакуумировали и приводили в контакт с металлической ртутью. Ртуть заполняла внутренний стержень пенетрометра и объем чашечки, свободный от частиц сорбента, затем к открытому концу пенетрометра прикладывали давление. При этом ртуть вдавливалась в поры сорбента, а внутренний объем стержня пенетрометра частично освобождался. По разнице электрической емкости конденсатора, «пластинами» которого служат металлическая поверхность стержня пенетрометра и поверхность столбика ртути, рассчитывали объем вдавленной в поры ртути. Численные значения среднего диаметра и удельного объема пор для построения порограмм определяли, используя разработанный в лаборатории "Полимеры для биологии" ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН алгоритм расчета для ЭВМ. Зависимости объема вдавленной ртути при данном давлении от диаметра пор представляли в виде дифференциальных кривых вдавливания ртути или, что то же самое, в виде кривых распределения пор по эффективным диаметрам.

Степень удерживания иммобилизованной полимерной фазы поверхностью носителя в растворителе, являющимся хорошим для немодифицированного олигомера, определяли, инкубируя образцы сорбентов в герметических сосудах в н-пентане при перемешивании в течение 48 ч, а затем отбирали аликвоты надосадочных жидкостей и измеряли остаточные массы перешедшего в раствор олигомера. При этом сравнивали образцы модифицированных при различных режимах фторирования сорбентов с нефторированным образцом.

Микроскопию образцов сорбентов проводили, используя микроскоп Olympus Vanox-T со встроенной фотосистемой. Исследовали образцы суспензий сорбентов в 50% метаноле. Масштабную линейку наносили на отпечаток.

ИК-исследование образцов сорбентов проводили методом ИК-микроспектроскопии на ИК-спектрометре с преобразованием Фурье SPECTRUM 2000 с ИК-микроскопом I-серии фирмы 11 Per kin-Elmer" (США). Условия съемки - диапазон -4000* 500 см"1, разрешение - 4 см"1, число сканирований - 200. Пробоподготовка заключалась в раздавливании образца в алмазной кювете высокого давления фирмы "Highg Pressure Diamond Optics, 7JVC"(CIIIA).

УФ-исследование проводили на УФ-спектрофотометре DU-70 (Весктап, США) по стандартной схеме с использованием 1.5 кварцевых кювет.

Очистку плазмидной ДНК осуществляли, нанося раствор (400 мкл), содержащий ДНК, РНК и сопутствующие белки в ТЭ-буфере после щелочной экстракции клеточного лизата (очистка была более эффективной, если из препаратов дополнительно удаляли с помощью хлорида лития рибосомную РНК) на сорбент, содержащийся в пластиковом картридже (7x25 мм) вмещающем 0.3 г сорбента. Фракции элюата собирали в микропробирки (по 400 мкл в каждую). Наличие ДНК во фракциях подтверждали спектрофотометрически при 2=260 нм и по результатам электрофореза в 0.8% агарозном геле в ТБЭ-буфере. ДНК окрашивали бромидом этидиума и фиксировали при облучении длинноволновым УФ-светом.

Получение препарата ДНК ядросодержащих клеток крови. 15 мл крови центрифугировали для отделения форменных элементов, эритроциты лизировали, ядросодержащие клетки концентрировали центрифугированием. Проводили лизис клеток и их ядер с одновременной обработкой протеиназой К при 37°С в течение ночи.

Выделение ДНК из крови человека проводили, нанося 200 мкл исследуемого образца, на колонку 7x26 мм, содержащую сорбент МПС-2000ГХ-ПФБД. Использовали линейный градиент изопропанола (0 - 70%, 60 мин) в ТЭ-буфере.

Очистка ДНК сорбцией примесей в объеме проводили, разбавляя в два раза ТЭ-буфером препарат, полученный после лизиса клеток и обработки протеиназой К, вносили в пробирку, содержащую примерно такой же объем суспензии сорбента в ТЕ-буфере, встряхивали 5-10 мин, инкубировали раствор с сорбентом еще 10 мин (все операции проводили при комнатной температуре), седиментировали 2 мин на настольной центрифуге центрифугированием при 3000 об/мин и отбирали супернатант. Далее сорбент заливали новой порцией ТЭ-буфера (равной объему сорбента) и процесс повторяли.

Лизис бактериальных клеток проводили, по методике, разработанной фирмой MIRA-Diagnostica, GmbH, Германия. 1.5 мл клеточной суспензии в разведении 104 центрифугировали 2 мин при 13000 об/мин, осадок обрабатывали лизирующими буферами. Метод включал обработку клеточных осадков буфером, содержащим протеиназу, РНКазу, а также буфером, содержащим смесь детергентов. Процедура занимала не более 25 мин.

Выделение бактериальных ДНК, проводили, нанося полученный лизат (200 мкл) на картриджи с сорбентом (не более 0.3 г) и центрифугируя картриджи, вставленные в центрифужные колонки-сборники в течение 1 мин при 2000 об/мин.

Процедуру выделения ДНК из бактериальных культур на колонках типа Qia Amp (iQiagen) проводили по стандартной методике фирмы Qiagen.

Выход ДНК в собранных элюатах определяли спектрофотометрически, а также проводя агарозный (0.8-1%) электрофорез при 75 А в ТБЭ-буфере. Пробы наносили по 1015 мкл в лунку. Пробы окрашивали бромидом этидиума, визуализировали в УФ-свете и фотографировали с помощью фотосканера.

Белковый электрофорез проводили, используя 12.5% разделяющий гель (1.5 М Трис-НС1, рН 8.8, 40% акриламидную смесь, 10% додецилсульфат натрия, 10% персульфат аммония, 1% ТЕМЕД), а также концентрирующий гель (0.5 М ТрисЯС/, рН 6.8, 40% акриламидную смесь, 10% додецилсульфат натрия, 10% персульфат аммония и 0.5% ТЕМЕД). Пробы готовили с использованием Laemmly- буфера. Электрофорез проводили при 25-35 А для выхода проб из лунок, при 75 А - до входа в разделительный гель, при 120 А - до окончания процесса. Гель окрашивали в растворе Кумасси (Roti-blue)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

1. Предложен новый способ получения композиционных фторполимерсодержащих сорбентов, заключающийся в проведении фторирования предварительно иммобилизованной на поверхности дисперсных объемно-пористых носителей полимерной фазы.

2. Определены оптимальные условия для иммобилизации и фторирования полимерной фазы на поверхности дисперсных объемно-пористых носителей.

3. Впервые при получении композиционных полифторполимерсодержащих сорбентов на основе объемно-пористых кремнеземов использован дифторид ксенона в качестве фторирующего агента.

4. Показано, что при использовании дифторида ксенона в качестве фторирующего агента возможно в мягких условиях получать композиционные ПФБД-содержащие сорбенты, сохраняющие пористость и механическую прочность, присущие исходному носителю, и вместе с тем отличающиеся повышенным содержанием фтора, что исключает неспецифическую сорбцию при выделении нуклеиновых кислот.

5. Показано, что полученные композиционные сорбенты обладают повышенной гидролитической стабильностью в щелочных средах.

6. Показано, что полученные композиционные ПФБД-содержащие сорбенты характеризуются низким уровнем неспецифической сорбции и высокой селективностью при выделении нуклеиновых кислот. Предложены эффективные методы использования полученных сорбентов при выделении ДНК из различных источников.

1. Сакодынский К.И., Бражников ВВ., Волков С.А. и др. Аналитическая хроматография. М., Наука, 1994, с. 6.

2. А.Е. Ivanov, V.V. Saburov, V.P. Zubov. Polymer-Coated Adsorbents for the Separation of Biopolymers and Particles. Adv. in Polym. Science, 1992, v. 104, p.287-299.

3. Грег С., Синг К. Адсорбция, удельная поверхность, пористость. М., Мир, 1984, с. 186.

4. Капустин Д.В., Завада Л.Л., Зубов В.П., Быков В.А., Грузинова Н Е., Евстратов А.В., Трифонова О.А. Разработка и применение новых композиционных полимерсодержащих сорбентов для выделения и очистки ДНК. «Биомедицинские технологии», вып. 8, 1998 . С. 25.

5. Лисичкин Г.В. (ред.), Кудрявцев Г.В., Сердан А.А. и др. Модифицированные кремнеземы в сорбции, катализе и хроматографии. М. «Химия», 1986, с. 24-25.

6. Шервуд Т., Пичфорд Р., Уилки Ч. Массопередача. М.: Химия, 1982, с. 52-53.

7. Рудобашта С.П. Массоперенос в системах с твердой фазой. М.: Химия, 1980, с. 42-43.

8. Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985, с.44-47.10. Ссылка 9., с. 189.

9. Препаративная жидкостная хроматография. Под ред. Б. Бидлингмейера. М.: Мир, 1990, с.9-10.12. Ссылка 1., с.225-226.

10. L.R. Snyder, J.J. Kirkland. Introduction to Modern Liquid Chromatography. NY, Chichester, Brisbane, Toronto. John Wiley & Sons, inc., 1979, p. 170-171.

11. Lee J.H., Kopecek J., Andrade J.D. Protein-resistant surfaces prepared by PEO-contaning block copolymer surfactants. J. Biomed.Mat.Res., 1989, v.23,p.351-368.

12. Matsunaga T., Ikada Y. Interaction between polyvinyl alkohol), poly(ethylene oxide) and their hydrogels surfaces. J. Coll. Interface Sci., 1989, v.84, p. 8-13.

13. Absolom D.R., Zingg W., Newmann A.W. in: Brash J.L. (ed.) Proteins at Interfaces. ACS Symposium Series 343, American Chemical Society, Washington, 1987, p.401-421.

14. Nagaoka S., Mori Y., Takiuchi H., Yokota K., Tanzawa H., Nishiumi S., Shalaby Sh.W. (ed.) in: Polymers as Biomaterials. Plenum Press, New York, Interaction between blod components and hydrogeles with Polyoxyethylene., 1984, p. 361-374.

15. Scheutjens J.M., Fleer G.I., J. Phys. Chem., Statistical Theory of Adsorption of Interacting Chain Molecules. 1979, v.83, p. 1619-1635.

16. Kawaguchi M., Hagakawa M., Takahashi A. Adsorption of polystyrene onto silica at the theta temperature. Polym. J., 1980, v. 12, p. 265-270.

17. Fleer G.J., Lyklema J., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1987, v. 368, p. 741-746.

18. Douglas J.F. How does Sourface Roughness Affect Polymer-Surface Interaction. Macromolecules, 1989, v.22, p.3707-3716.

19. Hommel H., Legrand A.P., Tougne P., Balard H., Papirer E. Ratio on the conformation of Polyethylene oxide chains grafted on silica, influence of the grafting. Macromolecules, 1984, v. 17, p.1578-1581.

20. Cohen Stuart M.A., Waajen F.W. Cosgrove T., Vincent B., Crowely T.L. Hydrodynamic thickness of absorbed polymer layers. Macromolecules, 1984, v. 17, p.1825-1830.

21. Furusawa K., Yamamoto K. Competitive effects in polymer adsorption and exchangeability of adsorption layer. Bull. Chem. Soc. Jpn., 1983, v.56, p. 1958-1962.

22. Cosgrove T. Estimates of the bonded fractions of an adsorbed polymer at the solidliquid interface.Macromolecules, 1982, v.15, p. 1290-1293.

23. Hiatt C.W., Shelokov A., Rosental E.J., Galimore J.M. Treatment of controlled pore glass with poly(ethylene oxide) to prevent adsorption of viruses. J. Chromatogr., 1971, v. 56, p.362-364.

24. Darling Т., Albert J., Russel P., Albert D.M., Reid T.W. Rapid purification of an RNA tumor virus and proteins by high performance steric exclusion chromatography on porous glass columns. J. Chromatogr., 1977, v. 131, p. 383-390.

25. Letot L., Lesec J., Quivoron C. A new packing for aqueous size-exclusion chromatography. Polyvinylpyrrolidone-coated columns. J. Liq. Chromatogr., 1981, v. 4, p. 1311-1316.

26. Копьев В.П. Жигис JI.C., Решетов П.Д., Бабурина Т.М., Пантелеев Ю.В., Сурин В.Н. Фильтрационно-хроматографический метод очистки ротавирусов. Вопр. вирусологии, 1989, т. 6, с. 760.

27. Tardy М., Tayot J.L., Roumyantseflf М., Plan R. Epton R. (ed.) Chromatography of Synthetic and Biological Polymers, 1978, v. 2, Ellis Horwood, Chichester, p. 231-236.

28. Santarelli X., Muller D., Jozefonvicz J. Dextran-coated silica packings for highperformance size-exclusion chromatography of proteins. J. Chromatography., 1988, v. 443, p. 55-62.

29. Букберде В.У., Арен A.K., Грузинь И.В., Лестровая Н.Н., Лебедева Ж.Д., Волкова И.М., Рубан Е.Л. Способ получения сорбента для аффиннойхроматографии микробных липаз. Авт. свид. СССР № 935121, 1980, опубликовано в Б.И. № 22, 1982.

30. Rosevear A., Mattock P. Improvments in or relating to affinity chromatography. US Patent № 1602432, 1981, РЖХ 21Б1838П, 1982.

31. Alpert A., Regnier F.E Preparation of porous microparticulate anion-exchange cgromatography support for proteins. J. Chromatogr., 1979, v. 185, p. 375-392.

32. Lawson T.G., Regnier F.E., Weith H.L. Separation of synthetic oligonucleotides on column of microparticulate silica coated with crosslinked polyethylenimine. Anal. Biochem., 1983, v. 133, p.85-93.

33. Watanaba K., Chow W.-S., Royer G.P. Column chromatography on polyethylenimine-silica: rapid resolution of nucleotides and proteins with short columns and low pressure. Anal.Biochem., 1982, v. 127, p. 155-158.

34. Drager R.R., Regnier F.E. High-performance anion-exchange chromatography of oligonucleotides. Anal. Biochem., 1985, v. 145, p. 47-56.

35. Wilchek M. Stable and high-capacity Sepharose derivatives for affinity chromatography. FEBS Lett., 1973, v. 33, p. 70-74.

36. Kurganov A., Kuzmenko O., Davankov V.A., Eray В., Unger K.K., Trudinger U. Effect of polystyrene coating on pore structural and chromatographic properties of silica packings. J. Chromatogr., 1990, v. 506, p.391-400.

37. Gupta S., Pfannkoch E., Regnier F.E. High-performance cation-exchange chromatography of proteins. Anal. Biochem., 1983, v. 128, p. 196-201.

38. Fausnaugh J.L., Pfannokoch F., Gupta S., Regnier F.E. High-performance hydrophobic interaction chromatography of proteins. Anal. Biochem., 1984, v. 137, p. 464-472.

39. Alpert A. High-performance liquid chromatography of proteins on poly(aspartic acid)-silica. J. Chromatogr., 1983, v. 266, p. 23-37.

40. Иванов А.У., Жигис Л.С., Чеховских ЕЮ., Решетов П.Д., Зубов В.П. Хлорангидридсодержащие носители для иммобилизации биоспецифических лигандов. Биоорган, химия, 1985, т. 11, № 11, с. 1527-1532.

41. Иванов А.Е., Жигис JI.C., Турчинский М.Ф., Копьев В.П., Решетов П.Д., Зубов В.П., Кастрикина JI.H., Донская Н.И. Полимерно-модифицированные сорбенты для молекулярно-ситовой хроматографии. Мол. Ген. Микробиол. Вирусол., 1987, т. 11, с. 39-46.

42. Papirer Е., Nguyen Van Tao. Anionic grafting on silica. J. Polym. Sci., 1972, v. 108, p. 167-175.

43. Nomura A., Yamada J., TsunodaK.I. Anal. Sci., 1986, v. 3, p. 209-215.

44. Иванов A.E., Верховская Jl.В., Хилько С.Н., Зубов В.П. Твердокаркасные широкопористые сорбенты для гидрофобной хроматографии белковю Биоорган, хим., 1990, т. 16, с. 1028-1039.

45. Иванов А.Е., Вульфсон А.Н., Якимов С.А., Зубов В.П. Арутюнян A.M. 5-ый Всесоюзный симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии, 20-22 ноября 19906 Рига, СССР, с. 172.

46. Miller N.T., Feisbush В., Karger B.L., Wide-pore silica based coater-bonded phases for separation of proteins by high-performance hydrophobic-interaction and size-exclusion chromatography. J. Chromatogr., 1985, v. 316, p. 519-537.

47. Chang J.E., El Rassi Z., Horvath Cs. Silica-bound polyethyleneglycol as stationary phase for separation of proteins by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr., 1986, v. 319, p. 396-399.

48. El Rassi Z., Horvath Cs. Hydrophobic-interaction chromatography pf t-RNA and proteins. J. Liq. Cgromatogr., 1986, v. 9, p. 3245-3268.

49. Таубман А.Б. В кн.: Материалы V Всес. симпозиума по механоэмиссии и механике твердых тел (Таллин, 1975). Таллин, 1977. Т. 1. с. 79.

50. Berg D, Tiller H.J.G., Корка J., Lanyguth B. Z. Chem., 1978, Bd. 18, № 6, S. 219.

51. Брык M.T. Полимеризация на твердой поверхности неорганических веществ. Киев: Наукова думка, 1981, 288 с.

52. Брук М.А., Павлов С.А., Полимеризация на твердой поверхности, 1990, М.: Химия.

53. Иванчев С.С., Дмитренко A.B. Успехи химии, 1982, т. 51, № 7, с. 1178-1200.

54. Иванчев С.С. Радикальная полимеризация. Ленинград: Химия, 1985, с. 216-258.

55. Бабкин И.Ю., Цетлин Б.Л. Радиационная прививочная полимеризация как метод модифицирования полимерных и неорганических материалов. Ж. Всес. Хим. 06-ва им. Д.И. Менделеева, 1973, т. 18, с. 263-275.

56. Брук М.А. Радиационная полимеризация мономеров, адсорбированных на поверхности твердых тел. Успехи химии, 1987, т. 56, с. 148-174.

57. Оленин A.B., Кристюк А.Л., Голубев В.Б., Зубов В.П., Кабанов В.А. Изучение механизма инициированной пострадиационной прививочной полимеризации виниловых мономеров на твердых неорганических материалах. Высокомол. Соед., 1983, т. 25А, с. 423-426.

58. Брук М.А., Абкин А.Д., Демидович В.В., Ерошина Л.В., Урман Я.Г., Слоним М.Я., Леденева Н.В. Исследование радиационной полимеризации тетрафторэтилена, адсорбированного на некоторых высокопористых сорбентах. Высокомол. Соед., 1975, т. 17А, с. 3-12.

59. Bleha М., Votavova Е., Tlustakova М, Kalal J. Internal tructure of porous glass coated with a polymer layer of poly(2,3-epoxypropylmetacrylate). Angew. Makromol. Chem., 1982, v. 107, p. 25-32.

60. Иванчев С.С., Дмитренко A.B., Шадрина Н.Е., Волков A.M., Улинская H.H. Прививочная радикальная со- и полимеризация как способ целенаправленногосинтеза новых полимер-неорганических адсорбентов. Докл. Акад. Наук. СССР, 1987, т. 297, с. 402-407.

61. Barabas E.S., Grosser F. Insoluble crosslinked homopolymers and copolymers, polymerized on an inert substrate. US Patent No 3941718, 1976.

62. Gobel G., Starnic J. Zzur Adsorptionspolymerisation auf porosen Feststoffen. Angew. Makromol. Chem., 1978, v. 1, p. 167-188.

63. Ivancev S.S., Dmitrenko A.V. Radical ketten polymerization bei Anwesenheit oberflachenmodifizierter Füllstoffe als verfahfen zur herstellung von polymer mischungen. Elast und kautschuk, v. 32, № 2, s. 41-48.

64. Коршак B.B., Зубакова JI.В., Качурина Н.В., Балашова О.В. Химическая прививка виниловых гетероциклических мономеров к поверхности минеральных носителей. Высокомол. Соед., 1979, т. 21А, с. 1132-1138.

65. Hayakawa К., Kawase К., Yamakita Н. Graft polymerization of triethoxyvinylsilane-styrene and triethoxyvinylsilane-methylmethacrylate binary monomers onto various silicates. J. Appl. Polym. Sei., 1977, v. 21, p. 2921-2928.

66. Abuelafiya R., Pesek J. Synthesis of chemically bonded polystyrene-divinylbenzene on silica by free radical initiation with gamma-radiation cross-lincing. J. Liq. Chrom., 1989, v. 12, p. 1571-1578.

67. Schutijser J. Porous inorganic support material coated with an organic phase for use in chromatography and process for its preparation. US Patent № 4415631, 1983, Chem. Abs., 98:50017e.

68. Muller W. New phase supports for partition chromatography of biopolymers. Chem. Hoppe-Seyler, 1987, v. 368, p. 763.

69. Majors R.E. Recent advances in HPLC. Packing and columnc. J. Chromatogr. Sci., 1980, v. 18, p. 488-511.

70. Rogers M.E., Adlard M.W., Sannders G., Halt G. High-performance liquid affinity chromatography oft-RNA's and proteins. J. Chromatogr., 1985, p. 163-172.

71. Kato Y., Komiya K., Hashimoto T. Study of experimental conditions in highperformance ion-exchange chromatography of proteins. J. Chromatogr., 1982, v. 246, p. 13-22.

72. Kosaka Y., Yemura M., Hashimoto Т., Fukano K. High-energy radiation induced polymerization on a chromatographic solid supports. US Patent № 4045353, 1977, Chem Abs., 85:47865f.

73. Варламов В.П., Власов А.В., Банникова Т.Е., Цетлин Б.Л., Рогожин С.В. Способ получения водонерастворимых биологически активных соединений. Авт. свид. СССР № 689200, 1980, опубликовано в Б.И. № 38, 1980.

74. Kalal J., Tiustakova М. Reactive polymers. Preparation of poly(2,3-epoxypropylmethacrilate) on porous glass. ActaPolym., 1979, v. 30, p. 40-43.80. Ссылка 55., с. 127.

75. Липатов Ю.С., Сергеева Л.М. Адсорбция полимеров. Киев: Наукова Дуика, 1972, с. 90.

76. Mino G., Kaizerman S. A new method for the preparation of graft copolymers. Polymerization initiated by eerie ion redox systems. J. Polym. Sci., 1958, v. 31, p. 242-247.

77. J.A. Huth, N.D. Danielson. Derivatization of Kel-F particles with n-butillitium for liquid chromatography. Anal. Chem., 1982, v. 54, p. 930-934.

78. N.D. Danielson, S. Ahmed, J.H. Huth, M.A. Targove. J. Chromatogr., 1986, v.9, p. 727-735.

79. R.W. Siergej, N.D. Danielson. Phenyl-modyfied Kel-F as a column packing for liquid chromatography. Anal. Chem., 1983, v. 55, p. 17-22.

80. R.W. Siergej, N.D. Danielson. Preparation and characterization of Kel-F IonExchange HPLC Packings. J. Chromatogr.Sci., 1983, v.21,p.362-366.

81. M. Kruepelman, N.D. Danielson. Liquid chromatographic characterization of picolyl-Kel-F as a reversed phase, weak anion-exchange column packing. Anal. Chem., 1985, v. 57, p. 340-346.

82. R.L. Pearson, J.F. Weiss, A.D. Kelmers. Improvement separation of t-RNA on polychlorotrifluoroethylene-supported reversed phase chromatography columns. Biochim. Biophys. Acta, 1971, v.228, p.770-774.

83. B.Z. Egan, BBA, 1973, v. 319, p. 11.

84. R.P. Singhal. Anion-exchange cgromatography on reversed-phase columns: isolation of nucleosides, nucleotides and oligonucleotides from nucletc acids from cytoplasm. Biochim. Biophys. Acta, 1973, v. 319, p. 11-24.

85. J.H. Fishman. US Patent № 3843443, 1974.

86. N.D. Danielson, R.W. Siergej. Biotech. Bioeng., 1981, v. 23, p. 1913-1918.

87. G.E. Berendsen, K.A. Pikaart, L. de Galan, C. Olieman. (Heptafluorodecyl)dimethylsilyl bonded phase for reversed-phase liquid Chromatography. Anal. Chem., 1986, v.52, p. 1990-1993.

88. R.K. Kobes, T.W. Eveleigh, R. Arentzen. A novel fluorocarbon-based immobilization technology. Trends in biotechnology, 1989, v. 7, № 4, p. 101.

89. H.A.H. Billiet, P.J. Schoenmakers, L. de Galan. Separation of proton-donating sorbents by liquid chromatography with a strong proton acceptor. TRI-n-octylamineoxide in the liquid stationary phase. J. Chromatogr., Anal. Chem., 1981, v.218, p. 455463.

90. W.Ecking, B. Trung, R. Radeglia, U. Gross. Group Separation of Alky 1-Substituted Aromatic Hydrocarbons by High-Performance Liquid Chromatography using perfluorocarbon modified silica gel. Chromatographia, 1982, v. 16, p. 178-182.

91. E. Csato, N. Fulop, G. Szabo. J. Chromatogr., 1990, v. 551, p. 79.

92. G. Felix, C. Bertrand. HPLC on pentafluoro-ohenyl silica gel. J. High Resol. Chromatogr. Chromatogr. Commun., 1987, v.7, p. 411-412.

93. G. Felix, A. Tienpont, C. Bertrand. HPLC on pentafluoroamidopropyl silica gel Chromatographia, 1987, v. 23, p. 684-685.

94. G. Felix, C. Bertrand. HPLC on pentafluorobenzamidopropyl silica gel. J. High Resol. Chromatogr. Chromatogr. Commun., 1985, v.7, p. 362-363.

95. G. Xindu, P.W. Carr. Use of fluorinated bonded phases in reversed-phase highperformance liquid chromatography of proteins. J. Chromatogr., 1983, v. 269, p. 96102.102. Ссылка 1., с. 239.

96. D.W. William, P.M. Kabra. Extended life for blood serum analysis columns using dual zone chromatographic materials. Anal. Chem., 1990, v. 62, p. 807-810.

97. Сабуров B.B., Муйдинов M.P., Катаев А.Д., Туркин С.И., Зубов В.П. (1990). 5-ый Всесоюзный симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии. 20-22 ноября 1990 г., Рига, СССР, с. 207.

98. А.Д. Катаев. Синтез композиционных политрифторстиролсодержащих сорбентов и их использование в хроматографии биополимеров: дисс. канд. хим. наук. -М., 1993. 142 с.

99. A.D. Kataev, О.A. Reznikova, D.V. Kapustin, V.P. Zubov. Polytrifluorostyrene-coated silica as a packing for column liquid chromatography. J. Cgromatogr. A. 1994, v. 660, p. 131-136.

100. J.F. Wolf, С.Е. Forbes, S. Gould, L.W. Shacklette. Proton-Dependent Electrochemical Behavior of Oligomeric Polyaniline Compounds. J. Electrochem. Soc., v. 136, № 10, 1989, p. 2887.

101. B.M. Кобрянский, С. А. Арнаутов, M.B. Мотякин. Изучение механизма реакции конденсации анилина на примере получения водорастворимого полимера. Высокомолекулярные соединения, Серия А т- 37, 1995, с. 35-38.

102. G.Felix, et.al., HPLC on pentafluoroamidopropyl silica gel Chromatographia, 1987, v. 23, p. 684.

103. К. Kaneto, М. Kaneko, Y. Min, Alan G. MacDiarmid. "Artificial muscle": Electromechanical actuators using polyaniline films. Synthetic Metals, v. 71, 1995, p. 2211-2212.

104. D.W. William, et.al., Anal. Chem., 1990, v. 62., p. 807.

105. Wu Shuizhu. Diffusion-controlled Deposition of Polyaniline onto Poly(methylmethacrilate) Substrates. Polymer Interactional, 1998, v. 47, p. 335-339

106. A. Syed. Polyaniline: Reaction Sthechiometry and Use as an lonexchange Polymer and Acid/Base Indicator. Synthetic Metals, 1990, v. 36, p. 209-215.

107. C. Zhu, C.Wang, L. Yang, C. Bai, F. Wang. Dopant dimension influence on polyaniline film structure. Applied Physics A, 1999, v. 68, p. 435-438.

108. Saje Lidija M., Jovanoic Zoran R., Jovanoic Goran N., Vunjak-Novakovic Gordana, Pesic Radojca D., Vucovic Dragoljub V. Fluidodinamika hromatografs ke kolone sa magnetno stabilisanim fluidizovanim slojem.Hem. ind. 1993, v. 47, № 4-6, C. 6268.

109. Flow-through capacitor: Пат. 5192432 США, МКИ5 В 01 D 15/08 / Andelman MJ -№ 792902; заявл. 15.11.91; опубл. 09.03.93.122. Ссылка 6., с.9.

110. М. Hanson, К.К. Unger. Non-porous polybutadiene-coated silicas as stationary phases in reversed-phase chromatography. J. Chromatogr., 1990, v. 517, p.269-284.

111. M. Hanson, В. Eray, K. Unger, A.V. Neimark, J. Schmid, K. Albert, E. Bayer. A Model for Polybuyadiene Coatings on Porous Silica. Chromatographia, 1993, v. 35, № 7/8, p. 403-409.

112. Нефедов П.П., Лавренко П.Н. Транспортные методы в аналитической химии полимеров, Л.: Химия, 1979, с. 36-40.

113. Дж. Перри. Справочник инженера химика, т.1, Л.:Химия, 1969, с. 109-110.

114. Геллер Б.Э., Геллер A.A., Чиртулов В.Г. Практическое руководство по физикохимии волокнообразующих полимеров. М.: Химия, 1996, с. 34.

115. Фторполимеры. Под ред. Leo A. Wall. M: Мир, 1975, с. 409, сл.

116. Т. Volkmann, H. Widdecke. Makromol. Chem., Makromol. Symp. 1989, v. 25, p. 243-248.

117. R.J. Lagow., J.L. Margrave. Prog, in inogr. Chem. 1979, v. 26, № 2, p. 253.

118. Соединения фтора. Под ред. H. Исикава. M: Мир, 1990, с. 205, сл.

119. Прудникова O.A. Модификация насыщенных и ненасыщенных полимеров дифторидом ксенона в различных средах". Дисс. канд. хим. наук. -М., 1999.

120. Мейсон Т., Линдли Дж., Дэвидсон Р., Лоример Дж., Гудвин Т. Химия и ультразвук. М.: Мир, 1993, с. 24134. Ссылка 133., с. 119-160.

121. Schmid G., Rommel О., Z. Phys. Chem., 1939, v.185 A, p.97.

122. Mark H.F., Acoust. Soc. Am., 1945, v. 16, p. 183.

123. КестингР.Е. Синтетические полимерные мембраны. M.: Химия, 1991, с. 241.

124. A. Doolittle, Ind. Eng. Chem., 1944, v. 39, p. 239.

125. Санжаровский A.T., Епифанов Г.И. Высокомолекулярные соединения, 1961, № 3, с. 1641.

126. Каргин В.А. Современные проблемы науки о полимерах. Изд. МГУ, 1962.141. Ссылка 137., с.242.

127. Барсамян Г.Б. Применение дифторида ксенона для поверхностной модификации полимерных материалов. Дис. канд. хим. наук, М., 1994.

128. Сабуров В.В. Синтез композиционных перфторсодержащих сорбентов и их использование в хроматографии биополимеров. Дисс. канд. хим. наук. М., 1989, с. 60.144. Ссылка 3., с. 196-199.

129. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитилж Ф., Дьюри Г., Джэкоб JL, Уолден Р., Кумар А., Джефферсон Р., Хэмил Дж. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. М.: Мир, 1991, с. 238.

130. Гловер Д. (ред.) Клонирование ДНК. Методы. М.: Мир, 1988, с. 361.

131. Qiagen. Product Guide. 1988., p. 14.

132. David G.L., Dibner M.D., Battey J. F. Basic Methods in Molecular Biology. New York: Elsevier, 1986, p. 42-50.

133. Leadon S.A., Cerutty P.A. Anal. Biochem. 1982. V. 120. P. 282-288.

134. Bowtelld D.L. Anal. Biochem. 1987, v. 162, p. 463-465.

135. Civlla T.A., Sklar R.M., Hauser S.L. Anal Biochem 1988, v. 174, p, 485-488.

136. Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. Nucl. Acids Res. 1988, v. 16, p. 1215.

137. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, New York, 1989, p. 9, 12.

138. Саики P., Гиленстен У., Эрлих Г. Полимеразная цепная реакция. В "Анализ генома. Методы", под ред. К. Дейвиса. М.: Мир, 1990, с. 176.