Синтез конъюгатов α-фетопротеина человека с противоопухолевыми препаратами для направленной доставки в опухолевые клетки тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Список сокращений

Введение

1. Литературный обзор «Получение и оценка биологической активности комплексов лекарственных соединений с белками-векторами»

1.1. Введение

1.2. Рецепторопосредованный транспорт химиотерапевтических 9 препаратов в опухолевые клетки с помощью белковых векторных молекул

1.3. Преимущества и недостатки использования систем направленного 10 транспорта

1.3.1. Ковалентное связывание

1.3.2. Нековалентное связывание

1.4. Критические параметры использования систем направленного 13 транспорта

1.4.1. Внутриклеточный транспорт ковалентно связанного с вектором 15 химиотерапевтического препарата

1.4.2. Внутриклеточный транспорт нековалентно связанного с вектором 16 химиотерапевтического препарата

1.5. Белки-векторы, используемые для создания систем направленного 16 транспорта

1.5.1. а-Фетопротеин

1.5.2. Другие белки-векторы

1.6. Методы получения ковалентных конъюгатов макромолекул и 23 лекарственных препаратов в целях создания систем направленного транспорта

1.6.1. Конъюгаты содержащие тиоэфирную и дисульфидную связь

1.6.2. Конъюгаты содержащие амидную и сложноэфирную связь

1.6.3. Конъюгаты содержащие гидразоновую, озазоновую или 29 азометиновую связь в спейсерной группе

1.7. Противоопухолевые препараты, используемые при создании систем направленного транспорта

1.7.1. Антрациклиновые антибиотики

1.7.2. Ендииновые антибиотики

2. Обсуждение результатов

2.1. Выделение человеческого а-фетопротеина

2.2. Исследование статуса аминогрупп в а-фетопротеине

2.3. Восстановление дисульфидных связей в а-фетопротеине

2.4. Определение положения модифицированных остатков 56 аминокислот

2.5. Удаление 2-тиопиридильной защитной группы с остатков 61 3-меркаптопропионовой кислоты

2.6. Конъюгаты доксорубицина и а-фетопротеина

2.6.1. Получение конъюгата доксорубицина и а-фетопротеина с 63 использованием SPDP

2.6.2. Получение конъюгата доксорубицина и а-фетопротеина с 66 использованием гидразида 3-малеимидобензойной кислоты

2.6.3. Определение содержания нековалентно связанного 68 доксорубицина в конъюгатах

2.7. Исследование лиганд-рецепторного взаимодействия конъюгата 69 флуоресцеина с а-фетопротеином

2.8. Биологическая активность конъюгатов доксорубицина в опытах in 70 vitro

2.9. Выделение эсперамицина Aib

2.10. Получение конъюгата эсперамицина Aib с а-фетопротеином

2.11. Биологические испытания конъюгата эсперамицина А^ с а- 75 фетопротеина в опытах in vitro и in vivo

3. Экспериментальная часть

4. Выводы

Злокачественные опухоли представляют одну из основных причин смертности среди населения нашей планеты, особенно в старших возрастных группах. В последние годы, несмотря на значительный прогресс в области профилактики и лечения рака, наблюдается неуклонный рост заболеваемости этим серьезным недугом. Многие исследователи связывают рост заболеваемости злокачественными новообразованиями со стабильно возрастающим загрязнением окружающей среды. По данным ВОЗ ежегодно заболевает раком свыше 5 млн. человек и умирает от злокачественных новообразований - более 2 млн.

В последнее время все большее значение в лечении злокачественных новообразований приобретает так называемая химиотерапия, или воздействие на опухолевый процесс с помощью химических (фармакологических, лекарственных) веществ с целью его замедления, остановки или обращения. При этом используются вещества весьма разнообразного строения и химической природы. Эти соединения могут оказывать на трансформированную клетку различные повреждающие воздействия. Они модифицируют и повреждают клеточные мембраны, нарушают биосинтез белка, процессы клеточного метаболизма и деления, повреждают ДНК и в конечном счете вызывают гибель злокачественной клетки. Основное условие, которое предъявляется к потенциальным противоопухолевым препаратам (ПОП), -это более высокая токсичность этих препаратов для трансформированных клеток по сравнению с клетками нормальных тканей человека.

Применение современных фармакологических средств при некоторых видах рака позволяет добиться полного излечения пациента, однако в большинстве случаев достигается лишь более или менее продолжительная ремиссия и некоторое улучшение качества жизни пациента со злокачественным новообразованием. Это связано с трудностями диагностики злокачественных новообразований, а также с низкой избирательностью действия и, как следствие этого, с побочными эффектами подавляющего большинства ПОП.

Одним из основных недостатков применяемых в настоящее время ПОП является их низкая селективность в отношении опухолевых клеток. Большинство ПОП не обладает избирательным действием на опухолевые клетки. Важной их особенностью является то, что они влияют на клетки практически всех органов и тканей с высоким пролиферативным индексом. К недостаткам ПОП следует также 7 отнести многочисленные побочные эффекты, сопровождающие их терапевтическое действие. Существенно ограничивает возможности химиотерапии злокачественных новообразований первичная и приобретенная устойчивость опухолевых клеток к действию ПОП.

Одно из наиболее перспективных направлений в разработке новых ПОП основано на использовании макромолекулярных носителей для более селективной доставки ПОП в раковую опухоль. Это направление весьма интенсивно развивается в последнее время и подразумевает создание и изучение физико-химических и биологических свойств химерных конструкций, в состав которых с одной стороны входит известный или новый ПОП, а с другой - высокомолекулярное соединение, которое с той или иной степенью селективности обеспечивает доставку этого компонента в раковую опухоль или клетку. Среди подобных конструкций можно отметить жидкие или твердые золи или гели различного состава, липосомы, полисахариды, полимерные наночастицы, пептиды и белки. При этом доставка действующего компонента может осуществляться по одному из общих механизмов клеточного транспорта. Среди белковых векторов наиболее часто используют антитела, транспортные белки, гормоны и белково-пептидные факторы роста. Так как, наиболее высокоспецифичным взаимодействием является лиганд-рецепторное, характерное для некоторых транспортных белков и факторов роста, применение именно этих молекул в качестве векторов доставки ПОП в опухолевые клетки представляется предпочтительным.

В связи с этим представляется актуальной разработка методов получения конструкций для направленного транспорта на основе известных белков-векторов и проведение испытаний их противоопухолевой активности в модельных опытах in vitro и in vivo.

1.1. Введение.

Одной из основных проблем современной химиотерапии является низкая селективность применяемых ПОП. Классические ПОП согласно их происхождению и механизмам действия принято делить на несколько типов, среди которых можно отметить, как наиболее важные, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики и алкилирующие агенты. Подавляющее большинство этих соединений представляют собой низкомолекулярные вещества, которые со сравнимой скоростью проникают как в нормальные, так и в раковые клетки. По этой причине их применение зачастую сопряжено с побочными эффектами, которые выражаются в угнетении кроветворной и иммунной системы, расстройствах пищеварения и т.д. Эти недостатки химиотерапевтических препаратов в последнее время в той или иной степени преодолеваются за счет избирательной доставки препарата в раковую опухоль. Использование различных полимеров, моноклональных антител, липосом и других конструкций для направленной доставки ПОП позволяет повысить селективность действия применяемого лекарства и в известной степени снизить побочные эффекты. Установлено, что транспортный онкофетальный белок человека - а-фетопротеин (АФП) с высокой эффективностью осуществляет доставку различных низкомолекулярных соединений не только в ткани эмбриона [1, 2], но и в злокачественные опухоли, поскольку практически все изученные раковые клетки человека в отличие от клеток нормальных тканей активно экспрессируют поверхностный рецептор АФП [3, 4].

1.2. Рецепторопосредованный транспорт противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки с помощью белковых векторных молекул.

Рецепторопосредованный эндоцитоз (РОЭ) представляет собой один из транспортных механизмов, позволяющих специфически доставлять терапевтические агенты в клетки-мишени. К настоящему времени рядом авторов были созданы системы направленного транспорта (СНТ) цитотоксических препаратов, базирующихся на процессе РОЭ. Имеются литературные данные об успешной адресной доставке в опухолевые клетки различных цитотоксических веществ: генов [5, 6], токсинов [7, 8] и противоопухолевых агентов [9, 10], вызывающих позитивные фармакологические эффекты in vivo.

Стратегия создания СНТ заключается в том, что лиганд, обладающий сродством к специфическому рецептору, используется в качестве векторной молекулы. Лиганд ковалентно или нековалентно связывается с ПОП и доставляется в клетку в результате РОЭ.

При создании СНТ обычно преследуют две основные цели. Во-первых, необходимо увеличить селективность доставки ПОП в клетки за счет более высокой экспрессии специфических для вектора рецепторов на поверхности опухолевых клеток-мишеней по сравнению с нормальными клетками. Во-вторых, обеспечить более высокую концентрацию ПОП в клетке за счет использования СНТ, чем при применении свободного ПОП.

Необходимо более подробно рассмотреть механизм действия СНТ в рамках концепции РОЭ. На первом этапе доставка ПОП в клетку-мишень инициируется формированием комплекса конъюгата (вектор-ПОП) с рецептором. На втором этапе комплекс через окаймленные везикулы попадает в клетку (стадия интернализации) и транспортируется в эндосомы, где, как полагают, происходит диссоциация комплекса вектор-ПОП от рецептора. Интернализованный лиганд рассортировывается из эндосом различными путями: транслоцируется в лизосомы, где подвергается протеолитической деградации, встраивается в плазматическую мембрану посредством рециклирования, распределяется по другим компартментам клетки [11, 12]. В случае, когда мишень цитотоксического действия препарата находится в цитозоле, ПОП должен освобождаться из эндосом непосредственно в цитозоль, где свободный терапевтический агент может проявить его фармакологический эффект [13, 14]. Степень фармакологического эффекта во многих случаях зависит от уровня накопления ПОП, доставляемого в клетку. Для этого необходимо, чтобы цикл эндоцитоза многократно повторялся. Поэтому важна скорость обращения рецептора, уровень его рециклирования в мембрану из внутриклеточных компартментов, а также количество вновь синтезированного рецептора.

Выводы.

1. Разработан новый технологичный метод выделения а-фетопротеина человека из сыворотки пуповинной крови, который позволяет выделять гомогенный белок в нативном состоянии.

2. Проведены исследования статуса амино- и сульфгидрильных групп в молекуле а-фетопротеина. В контролируемых условиях для восстановления с помощью дитиотреитолом доступна 1 дисульфидная связь, предположительно между остатками цистеина в положении 18 и 67 первичной последовательности.

3. Определены условия получения ацильных производных белка с помощью гидрохлорида иминотиолана и TV-оксисукцинимидного эфира 3-(2-пиридилдитио)пропионовой кислоты по одной и двум аминогруппам.

4. Проведена локализация аминокислотных остатков, которые модифицируются N-оксисукцинимидным эфиром 3-(2-пиридилдитио)-пропионовой кислоты.

5. Синтезированы ковалентные конъюгаты а-фетопротеина с доксорубицином и эсперамицином Ап,.

6. Показано, что ковалентный конъюгат АФП с ДР значительно (в 5 - 8 раз) превосходит свободный антибиотик по скорости накопления в клетках аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7, но уступает ДР по цитотоксической активности.

7. Показано, что ковалентный конъюгат а-фетопротеина с эсперамицином Aib в условиях in vitro не уступает свободному антибиотику по цитотоксической активности, но значительно превосходит его по противоопухолевому действию in vivo.

8. а-Фетопротеин человека представляет собой эффективный вектор для направленной доставки противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки.

1. Herve F., Rajkowski K.M., Martin M.T., Dessen P., Gittanova N. Drug-binding properties of rat ai-foetoprotein. //Biochem. J. 1984. V. 221. P. 401-406.

2. Parmelee D.C., Evenson M.A., Deutsch H.F. The presence of fatty acids in human a-fetoprotein. // J. Biol. Chem. 1978. V. 253. P. 2114-2119.

3. Uriel J., Failly-Crepin C., Villacampa M.J., Pineiro A., Geuskens M. Incorporation of alpha-fetoprotein by the MCF-7 human breast cancer cell line. // Tumor Biology. 1984. V. 5. P. 41-46.

4. Torres J.M., Geuskens M., Uriel J. Receptor-mediated endocytosis and recycling of alpha-fetoprotein in human B-lymphoma and T-leukemia cells. // Int. J. Cancer. 1991. V. 47. P. 110-117.

5. Perales J.C., Ferkol Т., Beegen H., Ratnoff O. D., Hanson R.W. Gene transfer in vivo: Sustained expression and regulation of genes introduced into the liver by receptor-targeted uptake. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 4086.

6. Aboud-Pirak E., Hurwitz E., Bellot F., Schlessinger J., Sela M. Inhibition of human tumor growth in nude mice by a conjugate doxorubicin with monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 3778.

7. Wu G.Y. Wu C.H. Liver-directed gene delivery. // Adv. Drug Delivery Rev. 1993. V. 12. P. 159.

8. Bomsel M., Mostov K. Sorting of plasma membrane proteins in epithelial cells. // Curr. Opin. Cell Biol. 1991. V. 3. P. 647.

9. Perales J.C., Ferkol Т., Molas M., Hanson R.W. An evaluation ofreceptor-mediated gene transfer using synthetic DNA-ligand complexes. // Eur. J. Biochem. 1994. V. 226. P. 255.

10. Curiel D.T., Agarwal S., Wagner E., Gotten M. Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991. V. 88. P. 8850.

11. Shimizu A., Kawashima S. Kinetic study ofinternalization and degradation of 131I-labeled follicle-stimulating hormone in mouse Sertoli cells and its relevance to other systems. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 13632.

12. Kato Y., Sugiyama Y. Binding, internalization, degradation, and mitogenic effect of epidermal growth factor in cultured rat hepatocytes. // STP Pharm. Sci. 1993. V. 3. P. 75.

13. Strom T.W., Anderson P.L., Rubin-Kelley V.E., Williams D.P., Kiyokawa Т., Murphy J.R. Immunotoxins and cytokine toxin fusion proteins. // Ann. NY Acad. Sci. 1991. V. 88. P. 233.

14. Sanyal G., Marquis-Omer D., Gress J.O., Middaugh C.R. A transforming growth factor-a-Pseudomonas exotoxin hybrid protein undergoes pH-dependent conformational changes conducive to membrane interaction. //Biochemistry 1993. V. 32. P. 3488.

15. Mesri E.A., Kreitman R.J., Fu Y., Epstein S.E., Pastan I. Heparin-binding transforming growth factor a-pseudoinonas exotoxin A. // J. Biol. Chem. 1993. 268. P. 4853.

16. Seymour L.W., Ulbrich K., Wedge S R., Hume I.C., Strohalm J., Duncan R. N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide copolymers targetted to the hepatocyte galactose receptor: pharmacoldnetics in DBA2 mice. // Br. J. Cancer 1991. V. 63. P. 859.

17. Wu C.H., Wilson J.M., Wu G.Y. Targeting genes: Delivery and persistent expression of a foreign gene driven by mammalian regulatory elements in vivo. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 16985.

18. Wu G.Y., Wu C.H. Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo. // J Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 14621.

19. Shapiro J.T., Leng M., Felsenfeld G. Deoxyribonucleic acid-polylysine complexes. Structure and nucleotide specificity. // Biochemistry. 1969.V. 8. P. 3219.

20. Yoshikawa Т., Pardridge W.M. Biotin delivery to brain with a covalent conjugate of avidin and a monoclonal antibody to the transferrin receptor. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1992. V. 263. P. 897.

21. Allen Т.М. Long-circulating (sterically stabilized) liposomes for targeted drug delivery. // TiPS. 1994. V. 15. P. 215.

22. Torehilin V.P., Klibanov A.L., Huang L. O'Donnell S., Nossiff N.D., Khaw B.A. Targeted accumulation ofpolyethylene glycol-coated immunoliposomes in infarcted rabbit myocardium. // FASEB J. 1992. V. 6. P. 2716.

23. Pardridge W.M. Receptor-mediated transcytosis ofpeptides through the blood-brain barrier, in Peptide Drug Delivery to the Brain. Pardridge, W.M., Ed., Raven Press, New. York. 1991. P. 160.

24. Kawasala Т., Ashwell G. Chemical and physical properties of an hepatic membrane protein that specifically binds asialoglycoproteins. // J. Biol. Chem. 1976. V. 251. P. 1296.

25. Kawasaki Т., Ashwell G. Carbohydrate structure ofglycopeptides isolated from an hepatic membrane-binding protein specific for asialoglycoproteins. // J Biol. Chem. 1976. V. 251. P. 5292.

26. Meijer D.K.F., Molema G. Targeting of drugs to the liver. // Semin. Liver Dis. 1995. V. 15. P. 202.

27. Jackie S., Runquist E.A., Miranda-Brady S., Havel R.J. Trafficking of the epidermal growth factor receptor and transferrin in three hepatocytic endosomal fractions. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 1396.

28. Sugiyama Y., Sato H., Yanai S., Kim D C., Miyauchi S., Sawada Y„ Iga Т., Hanano M. Receptor-mediated hepatic clearance ofpeptide hormones. In Topics in Pharmaceutical

29. Sciences 1989, Breimer D.D., Crommelin D.J.A., Midha K.K., Eds., Amsterdam Medical Press. Noordwijk. 1989. P. 429.

30. Dunn W. A., Hubbard A.L. Receptor-mediated endocytosis of epidermal growth factor by liepatocytes in the perfused rat liver: Ligand and receptor dynamics. // J. Cell. Biol. 1984. V. 98. P. 2148.

31. Tsukada Y., Hibi N., Ohkawa K., Deutsch H.F. Cytocidal effect of daunomycin -unsaturated fatty acid complexes on rat tumor cell lines. // J. of Tumor Marker Oncology. 1994. V. 9. P. 99-104.

32. Deutsch H.F. The uptake of adriamycin arachidonic acid complexes by human tumor cells in the presence of a-fetoprotein. // J. of Tumor Marker Oncology. 1994. V. 9. P. 11-14.

33. Bergstrand C.G., Czar B. Demonstration of new protein from carcinoma of the colon. // J. Urol. 1954. V. 72. P. 212-215.

34. Bergstrand C.G., Czar B. Demonstration of new protein fraction in serum from the human fetus. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1956. V. 8. P. 1070-1077.

35. Abelev G.I., Perova S.D., Khratkova N.I., Postnikova Z.A., Irlin I.S. Production of embrional alpha-globulin by transplantable mouse hepatomas. //Transplantation. 1963. V. 1. P. 174-180.

36. Татаринов Ю.С. Присутствие эмбрионального альфа-глобулина в сыворотке больных с первичным раком печени. 1964. Т. 10. С. 90-91.

37. Alpert E. Human alpha-fetoprotein (AFP): Developmental biology and clinical significance. // Progress in liver Diseases. Popper H., Schafner F., Eds. Grune and Stratton. New York, 1976. V. 5. P. 337-349.

38. Deutsch H.F. Chemistry and biology of alpha-fetoprotein. //Adv. Cancer Res. 1991. V. 56. P. 252-267.

39. Smith C.J.P., Kelleher P.C. Alpha-fetoprotein molecular heterogeneity: physiologic correlations with normal growth, carcinogenesis and tumour growth. // Biochim. Biophys. Acta. 1980. V. 605. P. 1-32.

40. Yamashita K., Hitoi A., Tsuchida Y., Nishi S., Kobata A. Sugar chains of alpha-fetoprotein produced in human yolk sac tumour. // Cancer Research. 1983. V. 43. P. 46914695.

41. Yoshima H., Mizuochi Т., Ishii M., Kobata A. Structure of the asparagine-linked sugar chains of a-fetoproteine purified from human ascites fluid. // Cancer research. 1980. V. 40. P. 4276-4281.

42. Ruoslahti E., Terry W.D. Alpha-fetoprotein and serum albumin show sequence homology. //Nature. 1976. V. 260. P. 804-805.

43. Wu J.Т., Lloyd C.I. Human alpha-fetoprotein and albumin: differences in free sulfhydryl groups. //Clin. Physiol. Biochem. 1988. V. 6. P. 50-56.

44. Morinaga Т., Sakai M., Wegmann T.G., Tamaoki T. Primary structures of human a-fetoprotein and its mRNA. //Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1983. V. 80. P. 4604-4608.

45. Brown J.R. Structural origins of mammalian albumin. // Fed. Proc. 1976. V. 35. P. 21412144.

46. Mizejewski G.J. a-Fetoprotein as a biological response modifier: relevance to domain and subdomainstructure. //P.S.E.B.M. 1997. V. 215. P. 333-362.

47. Kioussis D., Eiferman F., van de Rijn P., Gorin M.B., Ingrain R.S., Tilghman S.M. The structures of the a-fetoprotein and albumin genes in the mouse. // J. Biol. Chem. 1981. V. 256. P. 1960-1967.

48. Copado M.A., Ruiz-Gutierrez V., Rodriguez-Burgos A. Fatty acids and squalene carried by alpha fetoprotein, and fetal and adult serum albumin from chicken. Comparison with these from mammals. // Journal of protein chemistry. 1999. V. 18(4). P. 413-424.

49. Savu L., Nunez E., Jayle M.F. Plasma diethylstilboestrol binding proteins of rat, mouse and man in the course of development: relations with the binding of estradiol. // Steroids. 1975. V. 25(6). P. 717-728.

50. Nagai M., Becker J.D., Deutsch H.F. The fatty acid levels of rat alpha-fetoprotein derived from fetuses, pregnancy and hepatoma sera. // Oncodev. Biol. Med. 1982. V. 3. P. 343-350.

51. Aoyagi Y., Ikenaka Т., Ichida F. Alpha-fetoprotein as a carrier protein in plasma and its bilirubin-binding ability. // Cancer Research. 1979. V. 39. P. 3571-3574.

52. Aussel C., Masseyeff R. Interaction of retinoids and bilirubin with the binding of arachidonic acid to human alpha-fetoprotein. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. V. 119. P. 1122-1127.

53. Aoyagi Y., Ikenaka Т., Ichida F. Copper II binding ability of human alpha-fetoprotein. //Cancer Research. 1978. V. 38. P. 3483-3486.

54. Lau S., Laussac J.-P., Sarcar B. Synthesis and Copper (II) binding properties of the N-terminal peptide of human a-fetoprotein. // Biochem. J. (GB). 1989. V. 257. P. 745-750.

55. Allen S.H.G., Bennett J.A., Mizejewski G.J., Andersen T.T., Ferraris S., Jacobson H. Purification of alpha-fetoprotein from human cord serum with demonstration of its antiestrogenic activity. //Biochimica et Biophisica Acta. 1993. V. 1202. P. 135-142.

56. Uriel J., DeNechaud В., Dupiers M. Estrogen binding properties of rat, mouse and man fetospecific serum protein. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. V. 46. P. 1175-1180.

57. Aussel C., Masseyeff R. Binding of estrogens to molecular variants of rat alpha-fetoprotein. //FEBS Lett. 1977. V. 81. P. 363,

58. Chaturvedi R., Agarkar V., Sharma G.L., Sarma P.U. Purification of alpha fetoprotein from human cord blood. // Prep. Biochem. Biotechnol. 1998. V. 28(4). P. 293-303.

59. Deutsch H.F., Taniguchi N., Evenson M.A. Isolation and properties of human a-fetoprotein from Hep G2 cell cultures. // Tumor Biology. 2000. V. 21. P. 267-277.

60. Tecce M.F., Теггапа B. High-yield and high-degree of purification of human alpha-fetoprotein produced by adaptation of the human hepatoma cell line HepG2 in serum-free medium. // Anal. Biochem. 1989. V. 169. P. 306-311.

61. Ruoslahti E., Seppala M. Studies on carcino-fetal proteins. III. Development of radioimmunoassay for alpha-fetoprotein. Demonstration of alpha-fetoprotein in serum of healthy human adults. // Int. J. Cancer. 1971. V. 8. P. 374-383.

62. Nishi S., Hirai H. Purification of human, dog and rabbit a-fetoprotein by immunoadsorbents of Sepharose coupled with anti-human a-fetoprotein. // Biochim. Biophys. Acta. 1972. V. 278. P. 293-298.

63. Nishi S. Isolation and characterisation of a human fetal alpha-globulin from the sera of fetuses and hepatoma patient. // Cancer Research. 1970. V. 30. P. 2507-2513.

64. Adinolfi A., Adinolfi M., Cohen S. Isolation and characterization of human foetal alpha-globulin (alpha IF) from foetal and hepatoma sera. // Biochim. Biophys. Acta. 1971. V. 251. P. 197-207.

65. Ruoslahti E. Immunochromatography on insolubilized antibodies of very low affinity: application to immunoadsorbence of bovine alpha-fetoprotein. //J. Immunol. 1978. V. 121. P. 1687-1690.

66. Taketa К., Izumi M., Ichikawa E. Distinct molecular species of human a-fetoprotein due to differential affinities to lectins. // Ann. New York Acad. Sci. 1983. V. 80. P. 61-68.

67. Alpert E., Dienstag J.L., Sepersky S., Littman В., Rocklin R. Immunosupressive characteristics of human AFP. Effect of tests of cell-mediated immunity and induction of human syppressor cells. // Immunol. Commun. 1978. V. 7. P. 163-185.

68. Uriel J., Bouillon D., Dupiers M. Affinity chromatography of human, rat and mouse alpha-fetoprotein on estradiol-sepharose adsorbents. //FEBS Lett. 1975. V. 53. P. 305-308.

69. Tatarinov Y.S., Terentiev A.A., Moldogazieva A.K., Tagirova A.K. Human alpha-fetoprotein and its purification by chromatography on immobilized estrogens. // Tumor Biology. 1991. V. 12. P. 125-130.

70. Tecce M.F., Terrana B. High-yield and high-degree of purification of human alpha-fetoprotein produced by adaptation of the human hepatoma cell line HepG2 in serum-free medium. // Anal. Biochem. 1989. V. 169. P. 306-311.

71. Mizejewski G.J., Jacobson H.I. Alpha-fetoprotein as a dual regulator of growth in estrogen-responsive tissues. // CRS Press. Boca Raton. Florida. 1985. V. 1. P. 71-82.

72. Uriel J., Villacampa M.J., Mora R., Naval J., Failly-Crepin Ch. Uptake of radiolabeled alpha-fetoprotein by mouse mammary carcinoma's and its usefulness in tumor scintigraphy. // Cancer Res. 1984. V. 44. P. 5314-5319.

73. Mora R., Tamaoki Т., Wegmann T.G., Longenecker B.M., Laderoute M.P. Monoclonal antibodies directed against a widespread oncofetal antigen: the alpha-fetoprotein receptor. // Tumor Biol. 1993. V. 14. P. 116-130.

74. Uriel J., Failly-Crepin C., Villacampa M.J., Pineiro A., Geuskens M. Incorporation of alpha-fetoprotein by the MCF-7 human breast cancer cell line. // Tumor Biology. 1984. V. 5. P. 41-46.

75. Villacampa M.J., Mora R., Naval J., Failly-Crepin C., Lampreave F., Uriel J. Alpha-fetoprotein receptors in a human breast cancer cell line. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. V. 122. P. 1322-1327.

76. Torres J.M., Geuskens M., Uriel J. Receptor-mediated endocytosis and recycling of alpha-fetoprotein in human B-lymphoma and T-leukemia cells. // Int. J. Cancer. 1991. V. 47. P. 110-117.

77. Suzuki Yuji, Zeng Q.Y., Alpert E. Isolation and partial characterization of a specific alpha-fetoprotein receptor on human monocytes. // J. Clin. Invest. 1992. V. 90. P. 1530-1536.

78. Torres J.M., Naval J., Laborda M. Expression of alpha-fetoprotein receptors by human T-lymphocytes during blastic transformation. // Mol. Immunol. 1989. V. 26. P. 851-857.

79. Cohen S. Isolataion of a mous submaxillary gland protein accelerating incisor eruption and eylid opening in the new-born animal. // J. Biol. Chem. 1962. V. 273. P. 1555-1562.

80. Gregory H. Isolation and structure of urogastrone and its relationship to epidermal growth factor. //Nature. 1975. V. 257. P. 325-327.

81. Savage Jr C.R., Hash G.H., Cohen S. Epidermal growth factor, location of disulfide bonds. //J. Biol. Chem. 1973. V. 248. P. 7669-7672.

82. Savage Jr C. R., Inagami Т., Cohen S. The primary structure of epidermal growth factor. //J. Biol. Chem. 1972. V. 247. P. 7612-7621.

83. Никольский H. H., Соркин А. Д., Сорокин А. Б. Эпидермальный фактор роста. 1987. Л.: Наука. 200 с.

84. Brock J.H. Metalloproteins, Part2: Metall Proteins with Nonredox Roles. 1985. VCH: Weinheim. P. 183-263.

85. Testa U., Pelosi E., Peschle C. The transferrin receptor. // Crit. Rev. Oncogen. 1993. V. 4. P. 241-276.

86. Cazzola M., Bergamaschi G., Dezza L., Arosio P. Manipulations of cellular iron metabolism for modulating normal and malignant cell proliferation: achievements and prospects. //Blood. 1990. V. 75. P. 1903-1919.

87. Matsumura Y., Maeda H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. //Cancer Research. 1986. V. 46. P. 6387-6392.

88. Noguchi Y., Wu J., Duncan R, Strohalm J., Ulbrich K„ Akaike Т., Maeda H. Early phase tumor accumulation of macromolecules: a great difference in clearence rate between tumor and normal tissues. // Jpn. J. Cancer Res. 1998. V. 89. P. 307-314.

89. Boonstra J., de Laat S. W., Ponec M. Epidermal growth factor receptor expression related to differentiation capacity in normal and transformed keratinocytes. // Exp. Cell Res. 1985. V. 161. P. 421-433.

90. Kratz F„ Beyer U., Collery P, Lechenault F., Cazabat A., Schumaher P., Falken U., Unger C. Preparation, characterisation and in vitro efficacy of albumin conjugates of doxorubicin. //Biol. Pharm. Bull. 1998. V. 21. P. 56-61.

91. Kratz F., Beyer U., Roth Т., Shutte M.T., Unold A., Fiebig H.H., Unger C. Albumin conjugate of the anticancer drug chlorambucil: synthesis, characterisation and in vitro efficacy. //Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 1998. V. 331. P. 47-53.

92. M. J. Poznansky, R. L. Juliano. Biological approaches to the controlled delivery of drugs: a critical review. // Pharm. Rew. 1984. V. 36. P. 277-333.

93. J. D. Aplin, J. C. Jr. Wriston. Preparation, properties and applications of carbohydrate conjugates of proteins and lipids. // CRC Crit. Rew. Biochem. 1981. May. P. 259-305.

94. S.M. Beiser, V. P. Butler, B. F. Erlanger. Hapten protein conjugates: methodology and applications. Immunopathology. Grune and Stratton. 1968. P. 15-29.

95. B. F. Erlanger. Preparation of antigenic hapten-protein conjugates: a survey. // Methods Enzymol. 1980. V. 70. P. 85-104.

96. H. Ringsdorf. Structure and properties of pharmacologically active polymers. // J. Polym. Sci.: Polym.Symp. 1975. V. 51. P. 135-153.

97. Deshpande D., Toledo-Velasquez D., Thakkar D., WeiWen Liang, Rojanasakul Y. Enhanced cellular uptake of oligonucleotides by EGF receptor-mediated endocytosis in A549 cells. //Pharmaceutical Research. 1996. V. 13. P. 1.

98. Beyer U., Roth Т., Schumaher P., Maier G., Unold A., Frahm A.W., Fiebig H.H., Unger C., Kratz F. Synthesis and in vitro efficacy of transferrin conjugate of the anticancer drug clorambucil. //J.ofMed. Chem. 1998. V. 41. P. 2701-2708.

99. Schonlau F., Maibucher A., Kohnlein W., Garnett M.C. Mechanism of free and conjugated neocarzinostatin activity : studies on chromophore and uptake using a transferrin-neocarzinostatin conjugate. //Z. Naturforsch. 1997. V. 52. P. 245-254.

100. P. Ginobbi, Т.A. Geiser, D. Ombres, G. Citro. Folic acid polylisine carrier improves efficacy of c-myc antisense oligodeoxynucleotides on uman melanoma (Ml4) cells. // Anticancer Research. 1997. V. 17. P. 29-36.

101. Dosio F., Brusa P., Crosasso P., Arpicco S., Cattel L. Preparation, characterisation and properties in vitro and in vivo of a paclitaxel-albumin conjugate. // J. of Contr. Rel. 1997. V. 47. P. 293-304.

102. Takahashi N., Asakura Т., Ohkawa K. Pharmacokinetic analysis of protein-conjugated doxorubicin (DXR) and its degraded adducts in DXR-sensitive and -resistant rat hepatoma cells. // Anti-cancer drugs. 1996. V. 7. P. 687-696.

103. Singh M., Atwal H., Micetich R. Transferrin directed delivery of adriamicin to human cells. //Anticancer research. 1998. V. 18. P. 1423-1428.

104. Поваров Л.С. Полусинтетические производные противоопухолевых антибиотиков антрациклинов. // Успехи биологической химии. 1982. Т. 22. С. 225-244.

105. Di Marco A., Gaetani М., Orezzi P., Scarpinato B.M., Silvestrini R., Soldati M., Dasdia Т., Valentini L. "Daunomycin", a new antibiotic of the rhodomycin group. //Nature. 1964. V. 201. P. 706.

106. Dubost M., Ganter P., Maral R. Rubidomycin: a new antibiotic with cytostatic properties. // Cancer Chemother. Rep. 1964. V. 41. P. 35-45.

107. Бражникова М.Г., Збарский В.Б., Кудинова М.К., Муравьева Л.И., Пономаренко В.И., Потапова Н.П. Новый противоопухолевый антрациклин карминомицин. // Антибиотики. 1973. №. 8. С. 678-681.

108. Tan С., Tasaca Н., Yu К.-P., Murphy M L., Karnofsky D A. Daunomycin, an antitumor antibiotic, in the treatment of neoplastic disease. // Cancer. 1967. V. 20. P. 333-353.

109. Arcamone F., Franceschi G., Penco S., Selva A. Adriamycin (14-hydroxydaunomycin), a novel antitumor antibiotic. // Tetrahedron Lett. 1969. V. 13. P. 1007-1010.

110. Di Marco A., Gaetani M., Scarpinato B.M. Adriamycin (NSC-123,127): a new antibiotic with antitumor activity. // Cancer Chemother. Repts. 1969. V. 53. P. 33-37.

111. Bonadonna G., Monfardini S., De Lena M., Fossati-Bellani F., Beretta G. Phase I and preliminary phase II evaluation of adriamycin (NSC 123127). // Cancer Research. 1970. V. 30. P. 2572-2582.

112. Бражникова М.Г. Противоопухолевый антибиотик карминомицин и его применение в клинике. М. 1980.

113. Di Marco A., Arcamone F. DNA complexing antibiotics: daunomycin, adriamycin and their derivatives. // Arzneimittel-Forschung. 1975. V. 25. P. 368-374.

114. Schwartz H.S. Mechanisms and selectivity of anthracycline aminoglycosides and other intercalating agents. //Biomedicine. 1976. V. 24. P. 317-323.

115. Varga J.M., Asato N., Lande S., Lemer A.B. Melanotropin-daunomycin conjugate shows receptor-mediated cytotoxicity in cultured murine melanoma cells. // Nature. 1977. V. 267. P. 56-58.

116. Myers C.E., McGuire W.P., Liss R.H., Ifrim I., Grotzinger K., Young R.C. Adriamycin: the role of lipid peroxidation in cardiac toxicity and tumor response. // Science. 1977. V. 197. P. 165-167.

117. Anghileri L.J. Ca2+-transport inhibition by the antitumor agents adriamycin and daunomycin. //Arzneimittel-Forsch. 1977. V. 27. P. 1177-1180.

118. Na C., Timasheff S.N. Physical-chemical study of daunomycin-tubulin interactions. // Arch. Biochem. Biophys. 1977. V. 182. P. 147-154.

119. Di Marco A. Adriamycin (NSC-123127): mode and mechanism of action. // Cancer Chemother. Repts. 1975. V. 6. P. 91-106.

120. Pigram W.J., Fuller W., Hamilton L.D. Stereochemistry of intercalation: interaction of daunomycin with DNA. //Nature New Biol. 1972. V. 235. P. 17-19.

121. Waring M.J. DNA modification and cancer. Ann. Rev. Biochem. 1981. V. 50. P. 159192.

122. Frederick C.A., Williams L.D., Ughetto G„ Vander Marel G.A., Van Boom J., Rich A., Wang A.H.J. Structural comparison of anticancer drug-DNA complexes: adriamycin and daunomycin. //Biochemistry. 1990. V. 29. P. 2538-2549.

123. Chaires J.B., Satyanarayana S., Suh D., Fokt I., Przewloka Т., Priebe W. Parsing the free energy of anthracycline antibiotic binding to DNA. // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 2047-2053.

124. Tewey K.M., Chen G.L., Nelson E.M., Liu L.F. Intercalative antitumor drugs interfere with the breakage-reunion reaction of mammalian DNA topoisomerase II. J. Biol. Chem. 1984. V. 259. P. 9182-9187.

125. Fogelsong P.D., Reckord C., Swink S. Doxorubicin inhibits human DNA topoisomerase I. // Cancer Chemother. Pharmacol. 1992. V. 30. P. 123-125.

126. Bachur N.R., Yu F., Johnson R., Hickey R., Wu Y., Malkas L. Helicase inhibition by anthracycline anticancer agents. // Mol. Pharmacol. 1992. V. 41. P. 993-998.

127. Nishiyama M., Horichi N., Mazouzi Z., Bungo M., Saijo N., Tapiero H. Can cytotoxic activity of anthracyclines be related to DNA damage? // Anti-Cancer Drug Design. 1990. V. 5. P. 135-139.

128. Bachur N.R., Gordon S.L., Gee M.V. A general machanism for microsomal activation of quinone anticancer agents to free radicals. // Cancer Research. 1978. V. 38. P. 1745-1750.

129. Potmesil M., Israels M., Silber R. Two mechanisms of adriamycin-DNA interaction in L1210. //Biochem. Pharmacol. 1984. V. 33. P. 3137-3142.

130. Tritton T.R., Yee G. The anticancer agent adriamycin can be actively cytotoxic without entering cells. // Science. 1982. V. 217. P. 248-250.

131. Lee M.D., Dunne T.S., Chang C.C., Ellestad G.A., Siegel M.M., Morton G.O., McGahren W.J., Borders D.B. Calichemicins, a novel family of antitumor antibiotics. 2. Chemistry and structure of calichemicin уЛ // J. Am. Chem. Soc. 1987. V. 109. P. 3466.

132. Golik J., Clardy G., Dubay G., Groenewold G., Kawaguchi H., Konishi M., Krishnan В., OhkumaH., Saitoh K., Doyle T.W. //J. Am. Chem. Soc. 1987. V. 109. P. 346.

133. Konishi M., Ohkuma H., Matsumoto K., Tsuno Т., Kamei H., Miyaki Т., Oki Т., Kawaguchi H., VanDuyne G.D., Clardy G. Dynemicin A, a novel antibiotic with the anthraquinone and l,5-diyn-3-ene subunit. //J. Antibiot. 1989. V. 42. P. 1449-1452.

134. Doyle T.W., Borders D.B. Endiyne antitumor antibiotics. // In: Enediyne antibiotics as antitumor agents. P. 1-16. Ed.: Borders D.B., Doyle T.W. 1995. P. 1-16. Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong.

135. Durr F.E., Roslyn E.W., Testa R.T., Kuck N.A. Biological activities of calicheamicin. // In: Enediyne antibiotics as antitumor agents. Ed.: Borders D.B., Doyle T.W. 1995. P. 127136. Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong.

136. NicolaouK.C., Dai W.M., Tsay S.C., Estevez V.A., Wrasidlo W. Designed enediynes: a new class of DNA-cleaving molecules with potent and selective anticancer activity. // Science. 1992. V. 256. P. 1172-1178.

137. Zein N. Colson K.L., Leet J.E., Schroeder D.R., Solomon W., Doyle T.W., Casazza A.M. Kedarcidin chromophore: an enediyne that cleaves DNA in a sequence-specific manner. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 2822-2826.

138. Bergman R.G. Rearrangement of enediyns. // Acc. Chem. Res. 1973. V. 6. P. 25.

139. Zein N., Sinha A.M., McGahren W.J., Ellestad G.A. Calicheamicin gamma II: an antitumor antibiotic that cleaves double-stranded DNA site specifically. // Science. 1988. V. 240. P. 1198-1201.

140. Walker S., Landovitz R., Ding W.-D., Ellestad G.A., Kahne D. Cleavage behavior of calicheamicin gamma 1 and calicheamicin T. // Proc. Natl. Acad Sci. 1992. V. 89. P. 46084612.

141. Long B.H., Golik J., Forenza S., Ward В., Rehfus R., Dabrowiak J.C., Catino J.J., Musial S.T., Brookshire K.W., Doyle T.W. Esperamicins, a class of potent antitumor antibiotics: mechanism of action. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. V. 86. P. 2-6.

142. Sugiura Y., Uesawa Y., Takahashi Y., Kuwahara J., Golik J., Doyle T.W. Nucleotide-specific cleavage and minor-groove interaction of DNA with esperamicin antitumor antibiotics. //Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. V. 86. P. 7672-7676.

143. Konishi M., Oki T. Dynemicin. // In: Enediyne antibiotics as antitumor agents. Ed.: Borders D.B., Doyle T.W. 1995. Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong.

144. Zein N. Casazza A.M., Doyle T.W., Leet J.E., Schroeder D.R., Solomon W., Nadler S.G. Selective proteolytic activity of the antitumor agent kedarcidin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 8009-8012.

145. Hanada M., Ohkuma H., Yonemoto Т., Tomita K., Ohbayashi M., Kamei H., Miyaki Т., Konishi M., Kawaguchi H., Forenza S. Maduropeptin, a complex of new macromolecular antitumor antibiotics. //J. Antibiotics. 1991. V. 44. P. 403-414.

146. Goldberg I.H., Kappen L.S. Neocarzinostatin: chemical and biological basis of oxidative DNA damage. // In: Enediyne antibiotics as antitumor agents. Ed.: Borders D.B., Doyle T.W. 1995. P. 327-362. Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong.

147. Zein N„ Colson K.L., Leet J.E., Schroeder D.R., Solomon W., Doyle T.W., Casazza A.M. Kedarcidin chromophore: an enediyne that cleaves DNA in a sequence-specific manner. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 2822-2826.

148. Kohn J., Wilchek M. A new approach (cyano-transfer) for cyanogen bromide activation of Sepharose at neutral pH, which yields activated resins, free of interfering nitrogen derivatives. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. V. 107. P. 878-884.

149. Mancini G., Carbanara A.O., Heremans J.F. Immunochemical quantitation of antigenes by single radial immunodiffusion. // Immunochemistry. 1965. V. 2. P. 235-254.

150. Laemmli U.K. Cleavage of stryctural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. // Nature (London). 1970. V. 277. P. 680-685.

151. Hermanson G.T. Bioconjugate techniques. San Diego; New York; Boston; London; Sydney; Tokyo; Toronto: Academic Press, 1996.

152. Carlsson J., Drevin H., Axen R. Protein thiolation and reversible protein protein conjugation. N-Succinimidyl 3(2-pyridyldithio)propionate, a new heterobifunctional reagent. //Biochem. J. 1978. V. 173. P. 723-737.

153. Cattel L., Dosio F., Brusa P., Arpicco S. The role of conjugation processes and linking agents in the preparation of molecular/particulate conjugates. // S.T.P. Pharma Sciences. 1999. V. 9. P. 307-319.

154. Gorin M.B., Cooper D.L., Eiferman F., van de Rijn P., Tilghman S.M. The evolution of a-fetoprotein and albumin. I. A comparison of the primary amino acid sequence of mammalian a-fetoprotein and albumin. // J. Biol. Chem. V. 256. P. 1954-1959.

155. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups. // Arch. Biochem. Biophys. 1959. V. 82. P. 7077.

156. Mansoor M.A., Svardal A.M., Ueland P.M. Determination of the redox status of cysteine, cysteinylglycine, homocysteine, and glutathione in human plasma. // Anal. Biochem. 1992. V. 200. P. 218-229.

157. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Malia A.K., Garthner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. // Anal. Biochem. 1985. V. 150. P. 76-85.

158. Hayakawa E., Nakakura M., Kato Y., Okubo Y., Hosokawa T. Encapsulation of doxorubicin into liposomes by a freeze-thawing method using buffer solution. // Chem. Pharm. Bull. 1991. V. 39. P. 773-776.

159. Ling Y.-H., Priebe W., Perez-Soler R. Apoptosis indused by anthracycline antibiotics in P388 parent and multidrug-resistant cells. // Cancer Research. 1993. V. 53. P. 1845-1852.

160. Tarasiuk J., Frezard F., Garnier-Suillerot A., Gattegno L. Anthracycline incorporation in human lymphocytes. Kinetics of uptake and nuclear concentration. // Biochem. Biophys. Acta. 1989. V. 1013. P. 109-117.109

161. Lam K.S., Forenza S. Fermentation and isolation of esperamicins. In: Enediyne antibiotics as antitumor agents. Ed.: Borders D.B., Doyle T.W. 1995. P. 161-186. Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong.

162. Mosmann Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival. // J. Immunol. Meth. 1983. V. 65. P. 55-78.

163. Edman P., Begg G. A protein sequenator. // Eur. J. Biochem. 1967. V. 1. P. 80.

164. Jobbagy A., Kiraly K. Chemical characterization of fluorescein isothiocyanate-protein conjugates. //Biochim. Biophys. Acta. 1966. V. 124. P. 166.