Синтез полимерных суспензий медико-биологического назначения тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ЛОБАНОВ АНДРЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

СИНТЕЗ ПОЛИМЕРНЫХ СУСПЕНЗИЙ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ

Специальность: 02.00.06.- высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

На правах рукописи

МОСКВА, 2003

Работа выполнена в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова на кафедре "Синтез полимеров".

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РФ доктор химических наук, профессор

ГРИЦКОВА Инесса Александровна

доктор химических наук, профессор

ПРОКОПОВ Николай Иванович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор

ЯРОСЛАВОВ Александр Анатольевич доктор химических наук, профессор

ПАПИСОВ Иван Михайлович

Ведущая организация: Федеральное Государственное Унитарное предприятие Государственный Научный Центр Российской Федерации Научно-исследовательский физико-химический институт им. Л .Я. Карпова-«НИФХИ им. Л.Я. Карпова».

Защита диссертации состоится " 27 " ноября 2003г. в _ 15_ часов на заседании Диссертационного Совета Д.212.120.04 В МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, проспект Вернадского, д.86, ауд. Т-410.

Отзывы на автореферат направлять по адресу:

119571, Москва, проспект Вернадского, д.86, МИТХТ им. М.В. Ломоносова

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии по адресу: 119831, Москва, ул. М.Пироговская, д.1, МИТХТ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан " 27 " октября 2003г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д.212.120.04 доктор химических наук, профессор

Грицкова И. А.

^ 7 2- ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Разработка современных, высокотехнологичных, простых в исполнении тест-систем для экспресс'-диагностики различных заболеваний и изучения рецепторного аппарата клеток является актуальным направлением в биотехнологии, медицине, иммунологии. Для создания тест-систем в последние годы широко используют в качестве носителей биологических лигандов полимерные микросферы.

Для успешного применения в этом качестве они должны иметь определенный диаметр, узкое распределение по размерам, сохранять устойчивость при синтезе, хранении, иммобилизации биолигандов в буферных растворах. В связи с этим весьма актуальным является синтез таких полимерных частиц для различных биохимических исследований.

Цель работы.

Синтез полимерных суспензий с определенным строением межфазного слоя частиц для использования их в качестве носителей биолигандов и создания систем различного биомедицинского назначения.

Научная новизна.

• Определены условия синтеза полимерных микросфер, отвечающих всем требованиям, предъявляемым к носителям биолигандов для создания тест-системы на фибронектин и на различные инфекционные и вирусные заболевания.

• Впервые методом рентгеноэлектронной спектроскопии проанализирован состав межфазного слоя полимерных микросфер различного строения. Показано, что в межфазном адсорбционном слое частиц содержатся функциональные группы сомономеров, входящих в состав сополимерной цепи, инициатора, ПАВ-полившгалпирролидона и додецилсульфата натрия.

• Установлено, что исключить агрегацию полимерных микросфер, полученных затравочной сополимеризацией стирола, стиролсульфоната натрия и акролеина, в буферных растворах возможно, если в их межфазном слое содержатся взятые в определенном массовом соотношении альбумин и поливинилпирролидон с молекулярной массой 40000 и их число не превышает 1012 на мл суспензии.

® Определены оптимальные условия совместной адсорбции желатины и альбумина на поверхность полистирольных микросфер, обеспечивающие получение высокоспецифичной и высокочувствительной тест-системы на фибронектин.

Практическая значимость.

Синтезированы полимерные микросферы с заданным комплексом свойств и на их основе созданы тест-системы для определения антигенов У.ег^егосоИйса серотипа 03, Ь. сашсо1а, Б. ри1огиш, вируса ИБК штамм Н120 путем аффи1ршгох»я№юмиги:^ЩШбулинов

I ?ОСБИБЛИОТЕКА I

1 С.Я««

кролика со спейсором-протеином А, предварительно иммобилизированным на поверхность полимерных частиц.

Создана тест-система для детекции клеточного фибронектина в реакции латексной агглютинации.

Тест-система на выявление вируса ИБК штамм Н120 прошла испытание с положительным результатом во Всероссийском Государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ).

Автор защищает

1. Выбор оптимальных условий получения полимерных микросфер с заданным комплексом свойств методами безэмульгаторной и затравочной полимеризации мономеров.

2. Оценку качества полимерных микросфер по устойчивости в физиологическом растворе, иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер (на примере желатины и системе контроля их активности в биологических реакциях).

3. Данные по составу межфазного адсорбционного слоя, определенные методом рентгеноэлектронной спектроскопии.

4. Устойчивость системы "полимерная микросфера-биолиганд" при разных условиях иммобилизации биолиганда (температура, физическая адсорбция, ковалентное связывание), а также специфичность и чувствительность реакции латексной агглютинации (РЛА) полученных тест-систем.

5. Использование полимерных микросфер для создания тест-систем на фибронектин и использование их в качестве носителей биолигандов при создании антительных диагностических тест-систем для определения антигенов (У.егйегосоНиса серотипа 03, Ь. сашсо!а, Б. ри1огиш, вируса ИБК штамм Н120).

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на: Научно-технической конференции "Молодые ученые и аспиранты МГТУ" (Мурманск 2001г., 2002г., 2003г.), Научно-практической конференции НПО "Биомедицинские технологии" (Москва 2001г.,2002г, 2003г), Всероссийской научной конференции по проблемам математики, информатики, физики, химии и методики преподавания естественнонаучных дисциплин (Москва, РУДН 2002г.,2003г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения. Материалы диссертации изложены страницах машинописного текста, включая**^ таблицы, -^рисунка. Список

литературы содержит/^работ.

Во Введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и сформулирована ее цель.

Глава I. Обзор литературы, в котором рассмотрены особенности синтеза и строения полимерных микросфер, полученных методом затравочной полимеризации и преимущества использования полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов по сравнению с природными.

Глава П. Экспериментальная часть.

Исходные вещества. Мономеры (стирол, метакриловая кислота(МАК), акролеин, стиролсульфонат натрия), инициаторы (динитрилазобисизомасляной кислоты (ДАК), персульфат калия-К^гОа-ЩСК)), очищали по стандартной методике, а-(карбоксиэтил)- со-(триметилсилокси)полидиметилсилоксан-(ПДС),- НООС-СНдСНг-З^СНз^О-^^СНзЬО]?-Si(CH3)3 был синтезирован в ИНЭОС РАН. Додецилсульфат натрия (ДСН) использовали марки "чда". Поливинилпирролидон, стабилизатор, применяли с молекулярными массами: 1300,2600,4900,40000, растворители (ацетон, гексан), применяли марки "ЧДА". Альбумин лиофилизированный (из человеческой сыворотки), 89041631 фирмы Reanal, молекулярная масса 67 кДа. Содержание активного вещества не менее 95%. Желатина костно-щелочная -Казанского желатинового завода ПО «Тасма», средняя молекулярная масса 95,10 кДа. Пуллурозная кроличья сыворотка, производства Государственного научно-контрольного института ветпрепаратов МСХ РФ, с титром в бактериальной агглютинации (РА)-1:400. Иммунная кишечно-иерсиниозная сыворотка кролика, оттитрованная в пассивной гемагглютинации (РПГ А)-1:6400. Положительная сыворотка против ИБК-ВНИИЗЖ (представлена ВГНКИ). Протеин А - рекомбенантный белок А, секретируемый штаммом B.Subtilis. Фосфатно-солевой буфер (ФСБ рН=7,2), был получен по описанной в литературе методике. Все остальные вещества, этиловый спирт, красители (Sudan Blue И, Oil Orange G, Color Index (C.I.) 11920, оранжевый; Sudan I, C.I. 12055, ГОСТ 7461-55, желтый; Sudan И, C.I. 12140, оранжевый; Sudan III, С. I. 26100, ВТУ TCHX 54-86-61, малиновый), использовали без дополнительной очистки. Вода - бидистиллят.

Методы исследования. Кинетику полимеризации изучали гравиметрическим методом. Размер и ^-потенциал частиц полимерных суспензий изучали методом фотон-корреляционной спектроскопии на приборе MALVERN, индивидуальность частиц в различных средах оценивали с помощью светового микроскопа. Концентрацию остаточного стирола определяли путем отгонки и измерения абсорбции нри 282 им на спектрофотометре Unicam SP 500. Рентгеноэлектронные спектры получали на электростатическом спектрометре МК II фирмы VG Scientific (Англия). Концентрацию альдегидных групп определяли методом

кондуктометрического титрования HCL Реакцию латексной агглютинации (РИА) проводили по стандартной методике, с использованием 96-луночной микроплаишеты.

Глава III. Результаты и их обсуждение.

В главе Ш.1 рассмотрено состояние проблемы по синтезу полимерных суспензий биомедицинского назначения. Сформулированы требования, предъявляемые к полимерным микросферам, используемым в качестве носителей биолигандов.

Рассмотрены основные, перспективные методы синтеза полимерных микросфер с функциональными группами различной природы-альдегидными, хлорметильными, эпокси-группами, амино-амидными, гликоиьными, гидроксильными и карбоксильными. Отмечены причины изменения свойств полимерных микросфер при синтезе и хранении, которые снижают чувствительность и специфичность изучаемых биохимических реакций. Показано, что каждый способ получения полимерных суспензий требует разработки специальных условий синтеза, обеспечивающих полимерным микросферам свойства, удовлетворяющие предъявляемым к ним требованиям.

III.2. Синтез затравочных нолнстирольных частиц методом полимеризации стирола в отсутствие эмульгатора.

Несмотря на то, что метод полимеризации стирола в отсутствие эмульгатора широко используется для синтеза частиц с узким распределением по размерам для применения их в иммуно-химических реакциях и для изучения фагоцитоза, мы не нашли готовых рецептов синтеза полимерных суспензий со средним диаметром частиц ~1,5 мкм, которые отвечали бы всем предъявляемым к ним требованиям: устойчивость в процессе синтеза, хранения, иммобилизации биолигандов в буферных растворах, сохранение индивидуальности частиц и узкого распределения их по размерам.

В связи с этим возникла необходимость проведения специальных исследований, которые позволили бы найти оптимальные условия их получения.

Диаметр частиц, в первую очередь, зависит от концентрации инициатора и мономера, поэтому исследования были начаты с изучения влияния массового соотношения мономерной и водной фаз, и концентрации инициатора на диаметр частиц полимерной суспензии и устойчивость реакционной системы в процессе синтеза и при хранении.

Массовое соотношение мономерной и водной фаз изменяли от 1:3 до 1:20, а концентрацию инициатора от ОД до 0,4 % масс в расчете на водную фазу. Рецепты проведения полимеризации приведены в табл.1.

Полимеризацию проводили при 70°С в течение 24 часов.

Как и следовало ожидать, скорость полимеризации возрастает, а диаметр частиц уменьшается по мере уменьшения объема мономерной фазы.

Таблица 1.

Рецепт проведения безэмульгаторных полимеризаций при различном соотношении фаз.

(массовые части) _

Наименование компонента Наименование полимеризации

SL-1 SL-2 SL-3 SL-4 SL-5 SL-6 SL-7

Стирол 100 100 100 100 100 100 100

Вода 300 500 750 1000 2000 500 500

Персульфат калия, % масс. В расчете на водную фазу 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,1 0,4

На основании проведенных экспериментов был выбран рецепт синтеза полимерной суспензии, частицы которой были использованы в качестве затравочных при затравочной полимеризации мономеров (рецепт 8Ь-2).

Электронная микрофотография частиц суспензии, данные по распределению частиц по размерам и ^-потенциалу приведены на рис.1.

Intensity Size dietnbuuon(a)

wmi&m tllfflf

С ■

Б

Zeta PotentJaKmVl

-100 a 100

Zata PatBnialfmV)

В

Рис.1. Электронная микрофотография (А), распределение частиц по размерам (Б) и ^-потенциал (В) частиц полимерной суспензии полученной при массовом соотношении мономер/вода, равном 1:5 и концентрации персульфата калия, равной 0,2 % масс в расчете на мономер.

Видно, что средний диаметр частиц равен 1,06 мкм, распределение частиц по размерам узкое, ^-потенциал равен -22,8 мВ.

Для облегчения дальнейших исследований в этой области была создана простейшая математическая модель процесса безэмульгаторной полимеризации стирола, позволяющая предсказать основные свойства полимерной суспензии.

Ш.2.1. Проблемы удаления остаточного мономера из объема полимерных микросфер

В связи с негативным влиянием остаточного мономера на свойства полимерных микросфер и, как следствие, на специфичность и чувствительность реакции латексной агглютинации необходимо было выбрать способы его удаления из полимерной суспензии.

Процесс очистки полимерной суспензии от остаточного мономера проводили методами ультрафильтрации, используя в качестве растворителей ацетон и этиловый спирт, и радиоактивного облучения.

Наиболее эффективным способом очистки полимерных суспензий оказанось их облучение.

Ш.З. Затравочная полимеризация мономеров различной природы.

Полимерные микросферы получали затравочной сополимеризацией стирола (Ст), метакриловой кислоты (МАК), акролеина, стиролсульфоната натрия (ССН), затравочной сополимеризацией стиролсульфоната натрия со стиролом, содержащим растворенный в нем а-(карбоксиэтил)-сй-(триметилсилокси)полидиметилсилоксан (ПДС), а также затравочной

сополимеризацией стирола, акролеина, стиролсульфоната натрия, в присутствии поливинилпирролидона (ПВП) различной молекулярной массы, на полистирольных затравочных частицах, (рецепт 8Ь-2). Рецепты полимеризаций приведены в табл.2.

Выбор мономеров определялся в первую очередь необходимостью получения полимерных микросфер, в межфазном слое которых содержались бы функциональные группы: карбоксильные (метакриловая кислота), альдегидные (шсролеин), для ковалентного связывания с функциональными группами биолиганда. Концентрацию акролеина изменяли в интервале от 3 до 18 м.ч.

Выбор стиролсульфоната патрия в качестве сомономера при затравочной сополимеризации мономеров был сделан на основании предположений о том, что, входя в состав сополимерной цепи, звенья стиролсульфоната натрия, ориентируясь на границе раздела фаз, будут формировать в межфазном слое частиц электростатический и структурно-механический факторы стабилизации, увеличивая их устойчивость.

Использование смеси ПАВ (додецилсульфоната натрия, стиролсульфоната натрия и поливинилпирролидона) для формирования электростатического и структурно-механического факторов стабилизации в межфазных слоях полимерных микросфер связано с тем, что концентрация каждого из них не может быть увеличена выше определенного значения. При повышении содержания этих ПАВ выше определенной концентрации появляется вероятность образования новых частиц из клубков молекул поливинилпирролидона, олигомерных радикалов стиролсульфоната натрия (растворимого в воде) и из мицелл додецилсульфоната натрия. В этом случае распределение частиц по размерам будет широким, т.е. становится невьшйлнимым основное требование, предъявляемое к полимерным микросферам, носителям биолигандов - узкое распределение частиц по размерам.

Полимеризацию инициировали водорастворимым инициатором, - персульфатом калия и маслорастворимым инициатором, динитрилазобисизомасляной кислоты (рецепты приведены в табл. 2.).

Применение смеси масло- и водорастворимых инициаторов было обусловлено двумя причинами. Первая из них состояла в необходимости создания короткого периода формирования ПМЧ, а также создания в межфазном адсорбционном слое полимерных микросфер электростатического фактора стабилизации за счет ориентации концевых ионогенных групп полимерных цепей (фрагментов молекул инициатора) и структурно-механического фактора стабилизации за счет концентрирования полимерных цепей в межфазном слое и увеличения его прочности, для того, чтобы получить полимерную суспензию с узким распределением частиц по размерам. Для этого применяли в качестве инициатора персульфат калия, и проводили процесс при высокой температуре.

Вторая причина состояла в создании условий для проведения полимеризации до высокой конверсии мономера. Для этой цели использовали маслорастворимый инициатор, динитрилазобисизомасляной кислоты (ДАК), распадающийся на радикалы при более высокой температуре, чем персульфат калия.

Таблица 2.

Рецепты проведения затравочной сополимеризации на полистирольных затравочных

частицах, (массовые части в расчете на мономер).

№ Компоненты 88Ь-26 88Ь-27 8ЭЬ-28 88Ь-29 88Ь-30 88Ь-31 Бзь-зг 88Ь-33 88Ь-34

1 Полистирольная суспензия 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

2 Стирол 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0

3 Вода 2400,0 2400,0 2400,0 2400,0 2400,0 2400,0 2400,0 2400,0

4 Поливинилпирролидон, ПВП, м.м. 1300 - 1,0 - - - - - -

5 Поливинилпирролидон м.м. 2600 - - 1,0 - - - - -

6 Поливинилпирролидон м.м. 4900 - - - 1,0 - - - -

7 Поливинилпирролидон м.м. 40000 - - - - 1,0 1,0 - 1,0

8 Полидиметилсилоксан - - - - - - 3,0 -

9 Акролеин - 3,0 3,0 3,0 3,0 9,0 - 18,0

10 Метакриловая кислота 0,6 - - - - - - -

11 Динитрил азобисизомасляной кислоты (ДАК) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

12 Додецилсульфонат натрия (ДСН) 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4

13 Стиролсульфонат натрия 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

14 Персульфат калия 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31

Из приведенных в табл.3, данных видно, что при увеличении концентрации акролеина распределение частиц по размерам становится широким и снижается устойчивость полимерных суспензий в растворе электролитов. Оптимальная концентрация акролеина была равна 3 м.ч.

Было изучено влияние молекулярной массы поливинилпирролидона (ПВП) на свойства полимерной суспензии. Применяли ПВП с молекулярной массой 1300 (88Ь-27), 2600 (58Ь-28), 4900 (Б8Ь-29) и 40000 (ЗБЬ-ЗО). Полученные результаты приведены в табл.3. Видно, что диаметр частиц полимерной суспензии и их заряды близки по значениям, однако устойчивость в растворе буфера, ФБР, наблюдается только у частиц, стабилизированных поливинилпирролидоном (ПВП), молекулярной массы 40000, по-видимому, вследствие его большого вклада в структурно-механический фактор стабилизации.

Таблица 3.

Свойства полимерных суспензий.

Тип полимерной суспензии Средний диаметр частид, мкм. Устойчи вость к электрод итам, М Концент рация альдегид ных групп*, моль/г. ^-потенциал, тУ. Устойчивость полимерной суспензии

В ФБР** рН=7,2 В ФБР, при добавлении 0,09% р-ра альбумина

88Ь-26, (с метакриловой ¡кислотой) 1.4 0,15 - -36,4 +

88Ь-27, (ПВП с м.м. 1300) 0.7 0,10 - -22,1 -/+ +

881,-28, (ПВП с м.м. 2600) 0.8 0,15 - -19,9 -/+ +

88Ь-29, ПВП с м.м.4900) 1.4 0,20 - -17,1 +/- +

881,-30, (ПВП с м.м. 40000) (окрашенный) 1.0 0,25 0,81 -20,1 + +

Б8Ь-31 (ПВП с м.м. 40000 не окрашенный) 1.0 0,25 - -27,4 + +

881,-32 (9 м.ч. акролеина) 0.9 0,20 1,16 -31,0 +/- +

ЯБЬ-ЗЗ (с полидемитил-силоксаном) 0.9 0,25 - -44,4 - +

88Ь-34 (18 м.ч. акролеина) 0,9 0,05 - -35,0 - -

*- концентрацию альдегидных групп на поверхности частиц определяли методом

кондуктометрического титрования.

**ФБР- фосфатно-буферный раствор.

Оптимальная концентрация стиролсульфоната натрия составляла 3 % масс в расчете на мономер. Выше этой концентрации распределение частиц по размерам становилось широким, а ниже этой концентрации реакционная система была неустойчива.

Таким образом, устойчивой в процессе синтеза и в ФБР была полимерная суспензия, полученная при концентрации поливинилпирролидона с молекулярной массой 40000, равной 1 м.ч., стиролсульфоната натрия - 3 м.ч., ДСН - 2,4 м.ч., акролеина-3 м.ч. (рецепт синтеза ЗБЬ-30).

Содержание сухого вещества в затравочной суспензии составляло 6-10 %. При добавлении флуоресцентного красителя, величина ^-потенциала уменьшается с -27,4 до -20,1 мВ, по-видимому, из-за экранирования ионогенных групп полимерных цепей, ориентированных в водную фазу молекулами красителя.

Полимерную суспензию разводили фосфатно-солевым буфером (ФСБ) до содержания сухого вещества в ней, равной 0,1%, что соответствовало числу частиц порядка 1010-1011 частиц/литр суспензии.

Методом световой микроскопии было показано, что при замене водной фазы на буферный фосфатно-солевой раствор (рН=7,2), полимерные микросферы, за исключением

стабилизированных ПВП, были не индивидуальны, а образовывали флоккулированные агрегаты.

С целью повышения стабильности полимерной суспензии, на поверхность микросфер физически сорбировали полимерный ПАВ-альбумин разной концентрации. Частицы всех исследованных суспензий становились индивидуальными, и их можно было использовать в дальнейших исследованиях. Оптимальная концентрация альбумина составляла 0,09 %масс. Повышение стабильности полимерной суспензии при адсорбции на поверхности частиц альбумина, образующего слои большой толщины, можно объяснить формированием прочного межфазного слоя на поверхности полимерных микросфер (структурно-механических фактор стабилизации).

Таким образом, были получены полимерные суспензии, содержащие в межфазном слое карбоксильные и альдегидные группы, полидиметилсилоксан, полившшлпирролидон, сульфо-и сульфонатные группы молекул стиролсульфоната натрия, додецилсульфоната натрия и персульфата калия.

Они были использованы в качестве носителей биолигандов для конструирования тест-систем различного биомедицинского назначения.

Ш.3.1. Рентгеноэлектронное исследование межфазного слоя полимерных микросфер.

Получены обзорные спектры поверхности пленок из полимерных суспензий и проведен комплексный анализ элементного состава и характера химической связи полимеров. Рецепты синтеза исследованных полимерных суспензий приведены в табл.2, (образцы ББЬ-ЗО-ЗЗ).

Было проведено сравнение результатов рентгеноспектрального анализа с условиями синтеза полимерных микросфер.

Согласно спектральным исследованиям в поверхностных слоях полимерных микросфер содержится сера. Интенсивность пиков серы для всех частиц примерно одинаковы, за исключением полимерных микросфер, полученных в присутствии ПДС (ЗБЬ-ЗЗ). Для них наблюдается наименьшая интенсивность пика серы (примерно в 3 раза). Так как энергия связи для серы составила 169 эВ, что соответствует группе-803Н, был сделан вывод о том, что основной вклад в формирование электростатического фактора стабилизации вносят именно эти группы, а сульфатные группы персульфата калия дополнительный, но гораздо меньший. Падение интенсивности пика серы для полимерных микросфер, полученных в присутствии кремнийорганических ПАВ, БЗЬ-ЗЗ, можно объяснить присутствием в межфазном адсорбционном слое частиц полидиметилсилоксана, который экранирует сульфонатные группы, располагаясь вдоль межфазной поверхности в виде спиралей или зигзагов с гидрофильными участками, обращенными в воду, снижая в этом случае роль электростатического фактора устойчивости.

Рентгеноспектральный анализ показал, что в межфазном адсорбционном слое частиц полученных в присутствии полидиметилсилоксана (БЗЬ-ЗЗ), содержится кремний.

Для создания структурно-механического фактора устойчивости в межфазном слое частиц при синтезе полимерных суспензий 88Ь-30, ЭЭЬ-31, 88Ь-32 добавляли поливинилпирролидон, в количестве 1 м.ч. в расчете на полимер. Рентгеноэлектронные спектры подтверждают наличие азота в поверхностном слое для всех частиц. При этом пик интенсивности во всех случаях составил примерно одинаковую величину, т.е. количество ПВП на поверхности частиц во всех исследованных образцах примерно одинаково, что согласуется с условиями их синтеза.

По условию синтеза полимерных суспензий ЗЭЬ-ЗО, 88Ь-31, 88Ь-32 (табл.2.) на поверхности частиц должны быть функциональные группы молекул акролеина. Массовые части акролеина составляли 3 и 9 м.ч. в расчете на полимер. Рентгеноспектральный анализ показал, что концентрация С=0 групп в межфазном адсорбционном слое частиц ЗЭЬ-ЗО и ЭЗЬ-31 содержащих и не содержащих краситель, соответственно, резко различаются. В окрашенном образце ББЬ-ЗО она почти в 10 раз выше чем в неокрашенном. Причиной этого является присутствие на поверхности частиц красителя, который содержит С=0 группу в своей структуре. При этом выделить альдегидные группы акролеина не представляется возможным. Из сравнения спектров для полимерных суспензий ЗБЬ-ЗО и вБЬ-31 следует, что основной вклад в содержание С=0 групп вносит краситель.

Содержание С=0 групп в образце 88Ь-32 составило наибольшую величину, практически в 1,5 раза больше, чем в образце БЗЬ-ЗО и в 14 раз чем в образце вБЬ-31. Согласно рецепт)' массовое соотношение акролеина в синтезе полимерных микросфер 88Ь-32 в 3 раза выше, чем в окрашенном ЭЭЬ-ЗО и в неокрашенном 88Ь-31. Таким образом спектральный анализ подтверждает увеличение содержания функциональных групп С=0 на поверхности.

В случае частиц полимерных суспензий, синтезированных в присутствии полидиметилсилоксана (ввЬ-ЗЗ), спектр также показал на присутствие С=0 групп, но так как акролеин в процессе синтеза этих частиц не добавляли, можно предположить, что информация об этих группах поступает от карбоксильных групп, содержащихся в полидиметилсилоксане.

Информационная глубина исследуемой поверхности полимерных микросфер составила 10 нм. Следовательно, полученную информацию о поверхности можно считать достоверной.

Таким образом, межфазный адсорбционный слой частиц содержит компоненты, каждый из которых придает определенные свойства этому слою. У всех полимерных суспензий в межфазном адсорбционном слое обнаружены функциональные группы полимерных цепей и ПАВ, обеспечивающие формирование электростатического и структурно-механического факторов стабилизации, а также функциональные группы, необходимые для ковалентного связывания биолигандов.

Ш.4. Создание тест-систем на фибронектин

При конструировании тест-систем для определения клеточного фибронектина необходимо было иметь носитель с контролируемыми свойствами его поверхностного слоя, при этом такой контроль был необходим на всех этапах получения тест-системы.

Для получения тест-систем были выбраны полистирольные частицы, полученные затравочной полимеризацией стирола на полистирольных затравочных частицах среднего диаметра 1,0 мкм.

Используемые частицы должны на своей поверхности содержать желатину заданной концентрации для аффинного взаимодействия с фибронектином, иметь диаметр в пределах 1-2 мкм., хорошо визуализироваться при микроскопии и оставаться индивидуальными в биологических жидкостях, число частиц в полимерной суспензии должно составлять Ю10-10ичастиц/л. Предварительные исследования монослоев желатины различного происхождения с помощью техники Ленгмюра (с использованием ванны кругового типа) путем регистрации двумерного давления в циклах сжатия-растяжения поверхностной пленки на подложке 0,4% моль/л. сульфата аммония, (выполненные совместно с проф. Измайловой), показали, что поверхностная активность модифицированных желатин уменьшается по сравнению с немодифицированной желатиной.

Исследования реологических свойств межфазных адсорбционных слоев, образованных на границе водный раствор желатины/м-ксилол показали, что модифицированные желатины образуют малопрочные межфазные слои. Наиболее прочные межфазные слои были получены в присутствии костно-щелочной желатины., содержащей 61,5% а-цепей и 38,5% фрагментов а-цепей.

Все дальнейшие исследования были выполнены с этой желатиной.

Желатину физически сорбировали на поверхность частиц и ковалентно связывали с альдегидными и карбоксильными группами полимерных цепей, расположенными в поверхностном слое полимерных микросфер.

Как было сказано ранее, концентрация фибронектина в сыворотке невысока (150-800 мкг/мл плазмы), следовательно концентрация желатины на поверхности полимерных микросфер должна быть небольшой. В связи с этим для сохранения устойчивости частиц в растворе буфера, в котором осуществляется взаимодействие молекул фибронектина и желатины, необходимо было создать смешанный адсорбционный слой из молекул желатины и альбумина, индеферентного по отношению к фибронектину.

Прежде всего, необходимо было выбрать оптимальные условия иммобилизации желатина на поверхность частиц.

Известно, что желатина адсорбируется на поверхности микросфер в конформации коллагеноподобной спирали при 5°С, и в виде клубка при 60°С.

Проведенные исследования (табл.4.) показали, что ^-потенциал частиц, при одинаковых концентрациях желатины, иммобилизированной на частицы полистирольной суспензии, увеличивается при повышении температуры иммобилизации от 5°С до 60°С. Это, видимо, обусловлено тем, что желатина, адсорбированная на поверхности частиц в виде коллагеноподобной спирали, экранирует большее число ионогенных групп, полимерных цепей чем желатина, адсорбированная в виде клубка.

Таблица 4.

Адсорбция костной желатины, при разных температурах, __на частицы полистирольной суспензии.

Концентрация Агрегативная

желатины, устойчивость частиц Полимерная

физически Диаметр £-потен- Концентра- Чувстви- суспензия

адсорбируемой на поверхности частиц % масс частиц, мкм. циал, мВ. в ФБР (рН-7,2) ция добавленного альбумина, % тельность РЛА не содержащая фибронектин (контроль)

при 60°С 0,004 (+) 0,025 1 : 320 Не агглютини-

0,035 0,15 0,6 1,15 1,27 -37,5 -22,4 + + (+) 0,012 1 : 160 1 : 80 1 :40 рует (+)

при 5°С 0,004 (+) 0,05 1 : 10 Не агглютини-

0,035 0,15 0,6 1,22 1,38 -20,3 -15,2 + (+) 0,025 (+) 0,39*10"3 1 : 10 рует (+)

- агрегативно неустойчивы + агрегативно устойчивы

Способ иммобилизации желатины на поверхность полимерных микросфер влияет и на чувствительность реакции латексной агглютинации. Так, чувствительность РЛА значительно выше при использовании частиц, на поверхности которых желатина адсорбирована в виде клубка (при 60°С), чем наблюдаемая при использовании частиц, на поверхности которых она адсорбирована в виде коллагеноподобной спирали (при 5°С).

Это может быть обусловлено как большим числом молекул желатины, адсорбированных на поверхности частиц в виде клубка, чем в виде спирали, а также способностью желатина в этой конформации более эффективно взаимодействовать с фибронектином.

Результаты измерений диаметра частиц и их распределения по размерам и \ -потенциалу для затравочной полимерной суспензии после физической адсорбции желатины на поверхность частиц приведены на рис.2-3.

Даота-патенциай.мВ

100

Рис.2, ^-потенциал частиц полимерной суспензии, полученных затравочной сополимеризацией стирола и стиролсульфоната натрия на полистирольных затравочных частицах после физической адсорбции желатины на их поверхность.

С№ > — 1 00%

6 10 60 10О ©ОО 1 ООО

Диаметр частиц, мм

Рис.3. Распределение частиц по размерам для полимерных суспензий, полученных затравочной сополимеризацией стирола к стиролсульфоната натрия на полистирольных затравочных частицах после физической адсорбции желатины на их поверхность.

Видно, что после адсорбции желатины на поверхность частиц наиболее вероятный диаметр частиц увеличивается с 1,0 мкм и до 1,14 мкм, электрокинетический потенциал уменьшается с -27,4 до - 22,4 мВ.

Разность между средними диаметрами полимерных частиц до и после адсорбции желатины составляет 0,14 мкм, т.е. толщина адсорбционного слоя желатины достаточно велика и составляет 0,07 мкм.

Для выбора оптимального соотношения между желатиной и альбумином на поверхность полимерных микросфер физически сорбировали желатину и человеческий альбумин разной концентрации . Концентрацию желатины изменяли в интервале от 0,017 % до 2,5 % масс в расчете на полимер. Как видно из данных табл.5-6., концентрация альбумина, необходимая для обеспечения устойчивости системы, изменяется в соответствии с концентрацией желатины. Чем выше концентрация желатины, тем меньше концентрация альбумина, необходимая для обеспечения устойчивости системы.

Необходимый титр РЛА достигается при использовании частиц, содержащих на поверхности желатину в интервале концентраций 0,017-0,07 % масс.

Таблица 5.

Влияние концентрации физически адсорбированной желатины и альбумина на устойчивость ____частиц и чувствительность РЛА.

Концентрация желатины, Агрегативная устойчивость частиц Чувствительность РЛА Полимерная суспензия не содержащая фибронектин (контроль)

физически адсорбируемой на поверхности частиц %масс. в ФБР (рН=7,2). Концентрация добавленного альбумина, %

1 .Полистирольная суспензия (Ст), частицы которой использованы для затравочной полимеризации, (8Ь-2).

0,017 0,035 0,07 0,15 0,31 0,62 1,25 + (+)0,025 (+)0,012 (+)0,005 (+)0,001 (+)0,001 (+)0,001 1: 125 1:256 1: 125 1:256 1:8 1:8 Не агглютинирует (+)

2,5 + - -

2.Сополимерная суспензия, полученная затравочной полимеризацией : Ст, ССН в присутствии ПДС,(88Ь-33).

0,017 - (+)0,58*10'2 1:8 Не агглютини-

0,035 0,07 0,15 0,31 0,62 + (+)0,58*10"2 (+)1,8*10"4 (+)0,11*10"4 (+)0,03*104 + 1:4 1:4 1:2 1:2 1:2 рует (+)

1,25 + + 1:2

2,5 + + 1:2

Сополимерные суспензии, полученные дисперсионной полимеризацией : З.Ст+МАК (88Ь-26).

0,017 + + + Не агглютини-

0,035 0,07 + + + + + + рует (+)

0,15 + + +

0,31 + + +

0,62 + + +

1,25 + + +

2,5 + + +

При ковалентном связывании функциональных групп желатины и полимера частиц, концентрацию желатины изменяли в том же интервале значений. Наличие ковалентно связанной желатины на поверхности частиц контролировали путем добавления в систему твин 80, ПАВ с более высокими поверхностно-активными свойствами, чем желатина. Как видно из данных табл.6., титр РЛА не изменялся, что означает, что взаимодействие фибронектин-желатина происходит только с ковалентно связанными функциональными группами полимера молекулами желатина.

Таблица б.

Влияние концентрации ковалентно связанной желатины и физически адсорбированного альбумина, на устойчивость частиц и чувствительность РИА с использованием полученных тест-

систем,

1 Концентрация желатины, при I ковапеитном 1 связывании с 1 частицами %масс. Агрегативная устойчивость частиц Чувствительность РЛА Полимерная суспензия, несодержащая фибронектин (контроль)

в ФБР (рН=7,2). Концентрация добавленного альбумина, % частицы, неотмы- тые твином 80 частицы, отмытые твином 80

1 1 .Сополимерная суспензия, полученная затравочной полимеризацией : Ст, ССН и МАК(88Ь-26)

0,017 0,035 0,07 0,15 0,31 0,62 1,25 1 - (+)0,09 (+)0,09 (+)0,09 (+)0,023 (+)0,023 (+)0,023 (+)0,023 + 1 1 1 1 1 1 1 512 256 256 256 128 128 128 + титр не изменился Не агглютинирует (+)

I 2.Сополимерная суспензия, полученная затравочной полимеризацией : Ст, ССН и АкролеинаСББЬ-ЗО)

0,017 0,035 0,07 0,15 0,31 0,62 1,25 1 2,5 - (+)0,023 (+>0,023 (+)0,023 (+)0,023 (+)0,023 (+)0,023 (+>0,005 (+)0,005 1:256 1:512 1:256 1:256 1:256 1:256 1: 128 1: 128 титр не изменился Не агглютинирует (+)

| 3.Сополимерная суспензия, полученная затравочной полимеризацией : I Ст, ССН и ГМА(88Ь-25)

! 0,017 0,035 0,07 0,15 1 0,31 0.62 1.25 2,5 - (+)0,023 (+)0,023 (+)0,023 (+)0,023 (+)0,023 (+)0,023 (+)0,023 (+)0,005 1: 128 1:256 1:256 1:256 1: 128 1: 128 1: 128 1: 128 титр не изменился Не агглютинирует (+)

4.Сополимерная суспензия, полученная затравочной полимеризацией : Ст, ССН в присутствии ПДС-№-33).

0,017 0,035 0,07 0,15 0,31 0,62 1,25 1 2,5 + + (+)0,58*10"2 (+>0,58*10"2 (+)1,8*10"4 (+)0,11*10-4 (+)0,03*10"4 + + + 1: 512 1: 512 1:256 1:256 1:256 1: 128 1: 128 1:128 титр не изменился Не агглютинирует (+)

- агрегативно неустойчивы

+ агрегативно устойчивы

Протекание РЛА в лунках планшеты, содержащих и не содержащих фибронектин, (контроль) наблюдали в течение 12 часов.

Из приведенных данных был сделан вывод о том, что агрегативная устойчивость частиц достигается при концентрации желатины, равной 1,25%, (пример 1, табл.6.) но при этом не протекает РЛА. Повторим, что при меньших концентрациях желатины устойчивость повышается при добавлении альбумина в концентрации >0,001%. Титр РЛА возрастает до 1:256 только при концентрации желатины, взятой в интервале 0,017-0,15%масс и концентрации альбумина, >0,001%, соответственно.

Следует отметить влияние природы полимера частиц и содержания в поверхностном слое частиц молекул кремнийорганического ПАВ, ПДС, на количество адсорбированной желатины, необходимой для получения устойчивой суспензии. Оказалось, например, что для частиц, стабилизированных ПДС, устойчивость полимерной суспензии достигается при концентрации физически сорбированной желатины, приблизительно в 2 раза меньшей, чем для частиц, полученных в его отсутствие. Однако титр РЛА в этом случае низок (1:8), по-видимому, вследствие недостаточной концентрации желатины на поверхности частиц.

В табл.6 приведены данные по влиянию концентрации желатины, ковалентно связанной с функциональными группами полимера различной природы, и концентрация альбумина, физически адсорбированного на поверхность частиц, на устойчивость тест-системы и чувствительность РЛА, Максимальная чувствительность РЛА (1:512) наблюдается при низких концентрациях желатины 0,017-0,035 % масс. При этом концентрация альбумина зависит от природы полимера частиц суспензии. Например, для сополимерной суспензии, полученной соиолимеризацией стирола, стиролсульфоната натрия и МАК, она составляет 0,09 % масс, в расчете на полимер, а при сополимеризадии стирола, стиролсульфоната натрия в присутствии ПДС - 0,58*10'2 % масс.

Установлено, что для обеспечения устойчивости частиц в буферном растворе в процессе получения тест-системы на фибронектин и необходимой чувствительности РЛА, межфазный адсорбционный слой частиц должен иметь толщину 0,07 мкм и состоять из молекул желатины и альбумина, взятых в определенных соотношениях.

П1.5. Получение антительных диагностических тест-систем.

При создании диагностических тест-систем для выявления антигенов различной природы были выбраны полимерные частицы, синтезированные по рецепту (Б8Ь-32), затравочной сополимеризацией стирола, акролеина (9м.ч.), стиролсульфоната натрия, на полистирольных затравочных частицах, стабилизированные поливинилпирролидоном и содержащие на своей поверхности реакционноспособные альдегидные группы.

В качестве биолиганда использовали специфический иммуноглобулин.

Было высказано предположение о том, что молекулу иммуноглобулина целесообразно фиксировать на поверхности полимерных микросфер Fc-фрагментом, а Fab-фрагмент, несущий активные центры, должен быть ориентирован "наружу". В этом случае взаимодействие активных центров иммуноглобулина и детерминантных участков антигена становится более вероятной. Кроме того, для исключения взаимодействия больших фрагментов молекулы иммуноглобулина с поверхностью полимерной микросферы представлялось целесообразным осуществлять иммобилизацию через спейсор, в качестве которого был выбран протеин А.

Концентрацию протеина А изменяли в интервале от 0,03 до 2,5 мг/мл. Минимальное количество протеина А, необходимое для обеспечения высокой чувствительности тест-системы, определяли по титру реакции латексной агглютинации (РИА). Оказалось, что, начиная с концентрации протеина А, равной 0,05 мг/мл, значение титра PJIA не изменяется.

Сенсибилизированные протеином А частицы агглютинировались в реакции латексной агглютинации сывороточным иммуноглобулином человека и кролика в титре 1:2560-1:16380 и 1:40-1:640 соответственно. Следует отметить, что титр реакции не изменялся при хранении суспензий в течение полугода (срок наблюдения).

Ограничения использования полученной таким образом тест-системы были следующие:

- антитела, взятые для иммобилизации через спейсор, должны содержать Fc-фрагмент.

- нативные сыворотки должны содержать определенную концентрацию специфических иммуноглобулинов в общем пуле у-глобулинов сыворотки.

На основе полимерных микросфер, сенсибилизированных протеином А, были получены антительные диагностикумы разной специфичности: иерсиниозный - к Yersinia enterocolitica серотипа 03, сальмонелезный к S. pulorum, и к вирусу инфекционный бронхит кур (ИБК) штамм HI20.

Данные по определению максимального количества иммуноглобулина (для разных сывороток), на поверхности конъюгата "полимерная микросфера-протеин А", при котором не происходит агглютинация частиц (субагглютинационная единица (СЕ)), приведены в табл.7.

Видно, что с ростом концентрации протеина А (от 0,03 до 0,05мг/мл.), титр для кишечно-иерсиниозной сыворотки увеличивался с 1:40 до 1:80, пулорозной сыворотки - с 1:20 до 1:40 для, для сыворотки вируса ИБК - с 1:32 до 1:64.

Полученную сыворотку с максимальной концентрацией иммуноглобулина смешивали с равным объемом 0,1%-ной полимерной суспензии, частицы которой содержали на поверхности ковалентно присоединенный протеин А.

Таблица 7.

Результаты реакции между протеином Л, содержащимся на поверхности микросфер, и антителами различной специфичности.

Концентрация протеина А, мг/мл.

частицы без протеина А

0,03 0,05 2,5

Агрега-тивная устойчивость частиц

в ФБР рН= 7,2

Титр РЛА

концентрация добавленного

альбумина, %

(+)0,0062

(+)0,0031 (+)0,78*10"5 (+)0,78*10~5

с нормальной человеческой сыворот-кой

+

1:1280 1:2560 1:2560

с иммунной кишечио иерсини-

озной сывороткой кролика

+

1:40 1:80 1:80

с иммунной пулорозной сывороткой кролика

+

1:20 1:40 1:40

с положительной сывороткой вируса ИБК*

Контроль без сыворотки

+

1:32 1:64 1:64

- агрегативно неустойчивы; + агрегативно устойчивы

* - ИБК- инфекционный бронхит кур.

В том случае, когда титр сыворотки в серологических реакциях ниже субагглютинационной единицы (СЕ) иммуносорбента "полимерная микросфера-протеин А", иммобилизованый на полимерных микросферах иммуноглобулин не взаимодействовал с антигеном. Только в том случае, когда количество специфического иммуноглобулина превышает количество неспецифического, возможно получение работающей с антигеном системы. Эта ситуация может контролироваться по соотношению титра сыворотки в серологической реакции и титра, определяемого в PJIA этой же сыворотки с иммуносорбентом.

Полученные антительные диагностикумы к Yersinia enterocolitica серотипа 03, S. pulorum, и к вирусу ИБК штамм HI20 оказались высоко чувствительны.

Выводы

1. Определены условия синтеза полимерных микросфер, отвечающих требованиям, предъявляемым к носителям биолигандов, и на их основе созданы тест-системы на фибронектин и на различные инфекционные и вирусные заболевания.

2. Впервые методом рентгеноэлектронной спектроскопии проанализирован состав межфазного слоя полимерных микросфер различного строения. Показано, что в межфазном адсорбционном слое частиц содержатся функциональные группы сомономеров, входящих в состав сополимерной цепи, инициатора, ПАВ-поливинилпирролидона и додецилсульфата натрия.

3. Проведено сопоставление различных методов удаления остаточного мономера из полимерных микросфер. Показано, что наиболее эффективная очистка полимерных суспензий от остаточного мономера происходит при радиационном облучении.

4. Установлено, что исключить агрегацию полимерных микросфер, полученных затравочной сополимернзацией стирола, стиролсульфоната натрия и акролеина, в буферных растворах возможно, если в их межфазном слое содержаться взятые в определенном массовом соотношении альбумин и поливинилпирролидон с молекулярной массой 40000 и их число не превышает 1012 на мл суспензии.

5. Определены оптимальные условия совместной адсорбции желатины и альбумина на поверхность полистирольных микросфер, обеспечивающих получение высокоспецифичной и высокочувствительной тест-системы на фибронектин.

6. Проведена апробация синтезированных тест-систем в лабораторных условиях с положительным результатом.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1. Прокопов Н.И., Станишевский Я.М., Грицкова И.А., Лобанов А.Н., Кравцов Е.Г., Быков В.А., Далин М.В. Полимерные суспензии для проведения реакций фагоцитоза // Тезисы одиннадцатой научно-технической конференции МГТУ,- Мурманск-2000.-С.459-460.

2. Станишевский Я.М., Лобанов А.Н., Грицкова И.А., Измайлова В.Н., Быков В.А., Кравцов Е.Г., Прокопов Н.И., Харлов А.Е. Полимерные суспензии для диагностической тест-системы на фибронектин // БИОТЕХНОЛОГИЯ теоретический и научно-практический журнал,-Москва-2001.-Выл.З.-С.71-84.

3. Лобанов А.Н., Прокопов Н.И., Грицкова И.А., Селищева Е.Д., Станишевский Я.М. Снтез полимерных суспензий для иммунохимических исследований // Тезисы научно-технической конференции "Молодые ученые и аспиранты МГТУ".- Мурманск-2001.-С.323-324.

4. Станишевский Я.М., Грицкова И.А., Прокопов Н.И., Лобанов А.Н., Измайлова В.Н., Харлов А.Е., Быков В.А., Кравцов Е.Г. Принципы выбора полимерных микросфер для получения диагностической тест-системы на фибронектин // Тезисы научно-технической конференции "Молодые ученые и аспиранты МГТУ".- Мурманск-2001.-С.329.

5. Грицкова И.А., Лобанов А.Н., Станишевский Я.М., Быков В.А., Кравцов Е.Г., Прокопов Н.И., Измайлова В.Н. Влияние способа присоединения биолиганда на устойчивость иммунохимических тест-систем, основу которых составляют полимерные микросферы // Биомедицинские технологии. -Москва-2001.-Вып.16.-С.-107-113.

6. Лобанов А.Н., Станишевский Я.М. Подходы к созданию антительного диагностикума на саяьмонеллез // Тезисы XXXVIII Всероссийской научной конференции по проблемам

математики, информатики, физики, химии и методики преподавания естественнонаучных дисциплин (Химическая секция) - Москва: Изд-во РУДН, 2002.-С.72,

7. Станишевский Я.М., Лобанов А.Н., Григорьевская И.Й., Грицкова И,А., Прокопов Н.И. Создание антителыюй диагностической тест-системы на липтоспироз // Материалы Всероссийской научно-технической конференции. "Наука и образование - 2002" Тезисы докладов - Мурманск 2002.-С.-543-544.

8. Лобанов А.Н., Станишевский Я.М., Кравцов Э.Г., Григорьевская И.И., Прокопов Н.И. Способ получения антительного диагностикума на столбнячный анатоксин // Материалы Всероссийской научно-технической конференции. "Наука и образование - 2002" Тезисы докладов - Мурманск 2002.-С.-541-542.

9. Грицкова И.А., Прокопов Н.И., Лобанов А.Н., Станишевский Я.М., Ожеховски А., Синтез полимерных суспензий для иммунохимических исследований // Журнал Высокомолекулярные сединения,СерА,т.44,№11,с.1887-1893 Москва-2002, МАИК "Наука"

10.Грицкова И.А., Лобанов А.Н, Станишевский Я.М., Прокопов Н.И., Кравцов Э.Г., Волина Е.Г, Григорьевская И.И. Получение антительных диагностических тест-систем заданной специфичности // БИОТЕХНОЛОГИЯ теоретический и научно-практический журнал.-Москва-2003.-Вып.2.-С.81-85.

11.Станишевский Я.М., Лобанов А.Н., Григорьевская И.И. Использование полимерных микросфер в качестве иммуносорбентов для конструирования антительных противостолбнячных диашостикумов // Тезисы XXXIX Всероссийской научной конференции по проблемам математики, информатики, физики, химии и методики преподавания естественнонаучных дисциплин (Химическая секция) - Москва: Изд-во РУДН, 2003.-С.52.

12.Лобанов А.Н., Станишевский Я.М., Григорьевская И.И., Грицкова И.А., Прокопов Н.И. Разработка новых концепций синтеза полимерных микросфер для иммунохимических реакций // Материалы Всероссийской научно-технической конференции. "Наука и образование - 2003" Тезисы докладов - Мурманск 2003.-С.-38.

13.Станишевский Я.М., Лобанов А.Н., Григорьевская И,И., Сколинцев В.Б. Совершенствование свойств полимерных микросфер-носителей биолигандов и методики изучения фагоцитоза полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ) с их использованием // Материалы Всероссийской научно-технической конференции. "Наука и образование - 2003" Тезисы докладов - Мурманск 2003.-С.-134-135.

14.Станишевский Я.М., Лобанов А.Н., Грицкова И.А., Кравцов Е.Г., Григорьевская И.И. Создание антительных тест-систем заданной специфичности.// Биомедицинские технологии. Москва-2003.-С.-209-218.

¡7292

^ 1 7 25^

Принято к исполнению23/10/003 Заказ № 3 99

Исполнено 24/10/2003 Тираж: 100 экз.

ООО «НАКРА ПРИНТ» ИНН 7727185283 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 318-40-68 www.autoreferat.ru

Введение.

Глава I. Литературный обзор.

1.1. Полимерные микросферы как носители биолигандов для создания тест-систем.

1.2. Синтез полимерных суспензий методом затравочной полимеризации.

Глава И. Экспериментальная часть.

II. 1 Исходные вещества.

II.2 Методы исследования.

Глава III. Результаты и их обсуждение.

XII. 1. Состояние проблемы по синтезу полимерных суспензий биомедицинского назначения.

III.2. Синтез затравочных полистирольных частиц методом полимеризации стирола в отсутствие эмульгатора.

III.2.1. Проблемы удаления остаточного мономера из объёма полимерных микросфер.

111.3. Затравочная полимеризация мономеров различной природы.

III.3.1. Рентгеноэлектронное исследование межфазного слоя полимерных микросфер.

111.4. Создание тест-систем на фибронектин.

111.5. Получение антительных диагностических тест-систем

Полимерные микросферы нашли широкое применение в качестве носителей биолигандов при создании диагностических тест-систем, принцип работы которых основан на специфической иммунохимической реакции между антителом и антигеном. В этом случае полимерные микросферы должны содержать на поверхности специальные метки (флуоресцентные, хромофорные), быть окрашенными, иметь функциональные группы для ковалентного связывания с соответствующими группами биолиганда, либо на их поверхности должны содержаться специально добавленные лиганды для аффинного связывания с биолигандом и т.д. Кроме того, они должны обладать биологической, химической и коллоидной устойчивостью в физиологических растворах и биологических средах, иметь узкое распределение частиц по размерам и содержать специфический биолиганд на поверхности в определенной оптимальной концентрации для обеспечения высокой чувствительности реакции.

Сочетание таких свойств требует специального подхода к их синтезу, в процессе которого многие из выше указанных требований должны быть удовлетворены.

Выполнение высоких требований к полимерным микросферам, особенно возросших в последние годы в связи с решением сложных биологических проблем, требует нахождения пути к регулированию формирования состава межфазного слоя частиц, который определяет их устойчивость, возможный способ иммобилизации биолиганда.

Для решения этого вопроса необходимо систематическое исследование свойств частиц полимерных суспензий различной природы и изучение влияния состава их межфазного слоя на устойчивость частиц, иммобилизацию биолигандов и чувствительность биохимической реакции.

Цель работы состояла в синтезе полимерных суспензий с определенным строением межфазного слоя частиц для их использования в качестве носителей биолигандов и создания систем различного биомедицинского назначения.

128 Выводы

1. Определены условия синтеза полимерных микросфер, отвечающих требованиям, предъявляемым к носителям биолигандов, и на их основе созданы тест-системы на фибронектин и на различные инфекционные и вирусные заболевания.

2. Впервые методом рентгеноэлектронной спектроскопии проанализирован состав межфазного слоя полимерных микросфер различного строения. Показано, что в межфазном адсорбционном слое частиц содержатся функциональные группы сомономеров, входящих в состав сополимерной цепи, инициатора, ПАВ-поливинилпирролидона и додецилсульфата натрия.

3. Проведено сопоставление различных методов удаления остаточного мономера из полимерных микросфер. Показано, что наиболее эффективная очистка полимерных суспензий от остаточного мономера происходит при радиационном облучении.

4. Установлено, что исключить агрегацию полимерных микросфер, полученных затравочной сополимеризацией стирола, стиролсульфоната натрия и акролеина, в буферных растворах возможно, если в их межфазном слое содержаться взятые в определенном массовом соотношении альбумин и поливинилпирролидон с молекулярной массой

10

40000 и их число не превышает 10 на мл суспензии.

5. Определены оптимальные условия совместной адсорбции желатины и альбумина на поверхность полистирольных микросфер, обеспечивающих получение высокоспецифичной и высокочувствительной тест-системы на фибронектин.

6. Проведена апробация синтезированных тест-систем в лабораторных условиях с положительным результатом.

Заключение.

Синтез полимерных суспензий проводили эмульсионной полимеризацией в отсутствие эмульгатора, затравочной сополимеризацией мономеров различной природы в присутствии растворимых и нерастворимых в воде ПАВ. Добавление флуоресцентной метки или окрашивание полимерной суспензии проводили в процессе их синтеза, а также после полной конверсии мономера. Основной особенностью всех видов полимеризации было создание условий для формирования устойчивых в процессе синтеза частиц с диаметрами в интервале 09-1,5 мкм. и узким распределением по размерам. Получены таким образом полимерные микросферы с различным составом межфазного адсорбционного слоя; межфазным слоем, состоящим только из полимера и ионогенных фрагментов молекул инициатора (персульфата калия), содержащим функциональные группы полимера, способные непосредственно взаимодействовать с функциональными группами биолиганда (альдегидные группы), и после их активирования (карбоксильные), функциональные группы молекул ПАВ (карбоксильные), а также молекулы полимерных ПАВ-поливинилпирролидона и альбумина.

Замена водной фазы на физилогический раствор показала, что поведение полимерных суспензий различно и зависит от строения межфазного слоя частиц. Частицы, содержащие в межфазном слое поливинилпирролидон, были устойчивы, но на их поверхность не происходило физической адсорбции таких биолигандов как желатина, протеин А, столбнячный анатоксин и их использование в качестве носителей биолигандов оказалось возможным только в присутствии в межфазном слое частиц альдегидных или карбоксильных групп, к которым было возможно ковалентно присоединить функциональные группы биолиганда.

Частицы, несодержащие поливинилпирролидон в межфазном слое, образовывали в физиологическом растворе и других биосредах агрегаты, т.е. не обладали необходимой для дальнейшего использования устойчивостью.

Их применение в биоанализе оказалось возможным только после дополнительной адсорбции на поверхность частиц полимерного ПАВ-альбумина в определенной концентрации.

Частицы синтезированных полимерных суспензий были использованы для создания тест-систем различного биомедицинского назначения.

При создании тест-системы на фибронектин в межфазном слое полимерных микросфер должна была находится желатина в определенной концентрации, физически сорбированная или ковалентно связанная для аффинного взаимодействовия с фибронектином. Предварительный анализ желатины различного производства (костно-щелочной, костно-щелочной, модифицированной путем добавления формальдегидного дубителя ЛИКИ-1, или алкильного радикала С8) позволил выбрать для исследований костно-щелочную желатину. Ее физически сорбировали на поверхность частиц и ковалентно связывали с поверхностными карбоксильными группами полимера. Подробные исследования по влиянию состава межфазного слоя частиц, способа иммобилизации на их поверхность желатины и температуры (определяющей ее конформацию "клубок", "спираль") на чувствительность РЛА, показали, что для создания теста на фибронектин предпочтительно использовать полимерные микросферы, содержащие в межфазном слое альбумин и желатину в определенном массовом соотношении, и карбоксильные или альдегидные группы полимера для ее ковалентного связывания.

В этих исследованиях была обнаружена причина, не позволяющая создавать антительные тест-системы с использованием специфического у-глобулина. Эта причина состояла в том, что в общем пуле содержание специфического у-глобулина было мало по сравнению с неспецифическим. В этом случае на поверхность микросфер сорбировался в основном неспецифический у-глобулин и чувствительность РЛА была ничтожной.

Решить проблему создания антительной тест-системы удалось путем использования сывороток с высоким титром специфического у-глобулина.

В процессе решения этой задачи были решены и другие проблемы, такие как выделение у-глобулина из биосреды за счет аффинного взаимодействия его с протеином А, ковалентно связанным с поверхностными функциональными группами полимера микросфер; и создание антительной тест-системы на столбнячный анатоксин с использованием очищенного от других сывороточных белков у-глобулина, несодержащего Fc-фрагмент, ковалентно связанного с поверхностными карбоксильными группами полимера микросфер.

Полученные антительные диагностикумы оказались высоко чувствительны.

Полимерные микросферы, межфазный адсорбционный слой которых состоял из желатины, желатины с аффинно связанным фибронектином, протеином А, были использованы для детекции поверхностных клеточных рецепторов (клеточного фибронектина, фибронектинового клеточного рецептора, иммунных комплексов).

Полученные результаты отличались от известных в литературе. Было показано, что лиганды, иммобилизированные на микросферах, взаимодействуют с клеточными рецепторами лейкоцитов

Для создания антительных тест-систем путем затравочной сополимеризазии стирола, стирлсульфоната натрия и акролеина были синтезированы полимерные микросферы, стабилизированные поливинилпирролидоном, альбумином и полидиметилсилоксаном. Обоснована целесообразность иммобилизации иммуноглобулина на поверхность полимерных микросфер через спейсор протеин А.

С использованием этих частиц созданы высокочувствительные тест-системы разной специфичности : иерсиниозный - к Yersinia enterocolitica серотипа 03, сальмонелезный к S. pulorum, к вирусу ИБК штамм HI20.

1. Singer J.M, Plotz С. The latex fixation test. I.Application to the serologis diagnosis of rheumatoid arthritis. // Am. J.Med.-1956. v.21 - p.888 - 893.

2. Чайка H.А. Применение реакции агглютинации латекса для диагностики паразитарных болезней. // Мед.паразитол. 1982. - №2. — с.65 - 72.

3. Демина А.А., Ильина Т.В. Специфические латекс-препараты в этиологической диагностике гнойных бактериальных менингитов. // Ж-л микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. — 1985. №11. с.3-6.

4. Александрова И.А., Анцифирова Н.Г., Александров А.Д., Мороз А.Ф. Разработка метода латекс-агглютинации для диагностики синегнойной инфекции. // Ж-л микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. — 1986. -№4. -с. 10 -14.

5. Ruggeri F.M. Laboratory diagnosis of rotavirus infection in Diarrhoeal patienta by Immunoenzymatic and Latex agglutination assays. // Microbiol. -1992.- v.15. - №3. - p.249-257.

6. Temstet A. Evaluation of a monoclonal Antibody -Based Larex -agglutination Test for diagnosis of Cruptococ-cosis Comparison with two test using Polyclonal ant: - bodies. // J.Clin. Microbiol. - 1992. v.30. №10. - p.2544 -2550.

7. Hirschl A.M., Hirschl M.M., Berger J., Boffer M.L. Evaluation of a commercial latex test for serological diagnosis of helicobacter Pylor: infection in freated and untreafed patients. // Eur. J. Clin. Microbiol. - 1991. - v. 10. - №11. -p.971-974.

8. Leinonen M., Herva E. The latex agglutination test for the diagnosis of meningococcal and haemophilus influenzae meningitis. // Scand. J.Infect. Dis. -1977. v.9. - №3. -p.187-191

9. Severin W.P.J. Latex agglutination in the diagnosis of meningococcal meningitis.// J.Clin.Path. 1972. - v.25. - p. 1079 - 1982.

10. Bernard A., Vyskogil, Lauwerys R. Determination of a micraglobuline in human urine and serum by latex immunoassay. // J.Clin. Chem. -1982. - v.:27. -№6. -p.832 - 837.

11. Bernard A., Lauwerus R. Latex immunoassay of urinary albumin.// J.Clin. ' ~ Chem. Clin. Biochem. 1983. - v.21 -p.25-30.

12. Чайка H.А. Реакция агглютинации латекса. В кн.: серологическая диагностика паразитарных болезней. - М.: ВНИИМИБ 1982. - с. 14-25

13. Duagn. Latex agglutination test for cytomegalovirus antibody screening of transplant donors-impotant aspects. // Microbiol. Infect Dis. 1992. - v. 15 - №5. -p.407 - 409

14. Richardson I.R. Latex 34 Legionella pneumoplua species inentification using a commercial latex agglutination kit a potential gross-reaction problem with serogroup -12 //Med.Lab.Sci. 1992.-1992. - v.49. - №2. - p.144 - 146

15. Antifungal action of Carica -Papaya latex-isolation of fungal Cell Wall hydrolyzing enzymes.// Mycoses. 1991.-v.34. - №2. - 1.- p.469 - 477

16. Characteristics of inert beads provoking humoral immune responses in gallerin Mellonella Larval. // J.Insect Physiol. 1992. - v.38 - №7, - p.533-541

17. Misengard R.J. Development of rapid latex agglutination test for Periodontel Pathogens.// J.Periodontal. 1992. - v.63 - №7 - p.611-617

18. Parker S.P. Modified latex agglutination test for antibodies of Toxo plasma gondii in eluates from Guthrie cards.//J.Clin. Pathol. - 1992. - v.45 - №10 -p.907-909

19. Hazeleger W.C., Beumer R.R., Rombouts F.M. The use of latex agglutination test for determining Campylobacter species. //Microbiol. 1992.-apl. V.14 - №4-p.l81-184

20. Kanl R., Read J., Mattiasson B. Screening for plant lectins latex agglutination test.// Phytochemistry. -1991.-v.30 №12 - p.4005-4009

21. Гуркова E.M. Аффинная хромотография. // M., Мир. 1980. с. 174

22. Nathan C.F., Cohn Z.A.// J.Exp. Med., vol. 1981 №154.-p. 1539-1553

23. De Coster, Cambiaso, Masson. Immunological diagnosis of pregnancy in the mare agglutination of latex particles.// The riogenology.1980.-v.13 №6 -p.433-440

24. Singer J.M., The latex fixation test in rheumatoid disease/// AmJmed/-1961-v.31 p.766-775

25. Цанчев В., Повов н., Каларов С., Каракашов А. Лабораторная диагностика ревматических заболеваний. // София, 1964

26. Sam W.C. Latex agglutination assay for Delection of Cholera Toxin.// J.Clin.Microbiol.-1992-v.30 №9 - p.2518-2520

27. Sada E. Delection of Lipoarabinomannan as a diagnostic test for Tuberculosis.//.!.Clin.Microbiol.- 1992 v.30 - №9 - p.2415-2418

28. Перфдзе T.B., Халонен П. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций. — М.: Медицина, 1985,-с,250

29. Evaluation of two Colored Latex kits the well colex Colour Salmonella test and the Well colex colour Shigella species.// J. Clin.Microbiol.-1992,-v.30 -p.2184-86

30. Hartig W., Paulke B.R., Bruckher G. Fiuorescent latex microspheres for rethograde tracing of neurons in mouse basal forebrain combines with immunocytochemistry a methodical approach.//Acta Histochem.-1992-v.42.-p.261-265

31. Heizmann W.R. Detection of Salmonella in Human Faeces by Rambach Agar and a Color latex agglutination assay.// Med.Microbiol. Lett.-1993.-May.-v.1.,2 №3 -p.131-137

32. Bernard A., Lauwerys R. Turbidimetric latex immunoassay for serum ferritin.// J.Immunol. Meth.-1984.-v/71 ,-pЛ41 -147

33. Delarrea L.B. Automated determination of streptolysin — 0 antibodies by a turbidimetric latex immunoassay method. //J.Clin.Immunoassay.-1992-v. 15-№3 -p. 182-186

34. Saada E. Detection of lipoarobinomannau as a diagnostic test for tuberculosis // J.Clin. Microbiol.-1992.-v.30-№9 p.2415-2418

35. Borque L. Automated quantition nephelometric latex immunoassay for determining Ferritin in human serum // J.Clin.Lab. Anal.-1992-v.6 №4 p.239-244

36. Collet-Cassart, Masson, Cambiaso. Automated particle-counting immunoassay for a-feroprotein. //J.Clin.Chem.-1981-v.27- №1-3,64-67

37. Limet, Collet-Cassart, Magnusson, Sauvage. Particle-counting immunoassay (PACIA) of ferritin. // J.Clin. Biochem. 1982-v.20 - p.141-147

38. Collet-Cassart, Magnusson,Lesne, Masson. Automated particle-counting immunoassay for digoxine. // Clin.Chem. 1981-v.27 -№7 - p.l205-1209

39. Polesky H., Hanson S. Comparison of viral hepatitis marker test methods based on AABB-Cap survey data.// Amer. J.Clin.Path.-1981-v.76-№4-p.521-524

40. Kario K., Matsuo Т., Kabayashi H., Matsuo M. Rapid quantitative evaluation of plazma D-Dimer levels in Thrombotic states using an automated latex photometric immunoassay.//Thromb.Res.-1992- May.- v.166- №2-3 p.179-189

41. Norde W. Adsorption of proteins from solution at the solid-liquid // Advan/ Colloid and Interface Sci. 1986. - v.25. No 4. P. 267-340

42. Камышный A.JI. Адсорбция глобулярных белков на твердых носителях: некоторые физико-химические характеристики // Ж. физ. химии. -1981.-т. 55.-Вып. З.-С. 562-580.

43. De Baillou N., Voegel J.C., Schmitt A. Adsorption of human albumin and librinogen onto heparin-like materials. Adsorption isoterms // Colloids and Surfaces. 1985. - v. 16. - P. 271-288.

44. Van Dulm P., Norde W. The adsorption of human plasma albumin on solid surfaces, with special attention to the kinetic aspects. // J. Colloid and Interface Sci. 1983. -v.91. -No. 1. -P. 248-255.

45. Ivarsson B.A., Hegg P.O., Lundstrom K.I., Jansson V. Adsorption of proteins on metal surfaces studied by ellipsometric and capacitance measurements. // Colloids and Surfaces. 1985. - v. 13. - P. 169-192.

46. Norde W., Fraaye J.G.E.M., Lyklema J. Protein adsorption at solid-liquid interfaces: a colloid-chemical approach. // ASC Symposium Series. 1987. No. 343.-P. 36-47.

47. Norde W., Mac Ritchie F., Nowicka G., Lyklema J. Protein adsorption at solid-liquid interfaces: reversibility and conformation aspects. // J. Colloid and interfaces Sci. 1986. - v. 112. -No.2. - P. 447-456.

48. Norde W., Lyklema J. The adsorption of human plasma albumin and bovine pancreas ribonoclease at negatively charged polystyrene surfaces. // J. Colloid and Interface Sci. 1978. - v.66. - No. 2. - P. 257-302.

49. Lyklema J., Norde W., Biopolymer adsorption with special reference to the serum albumin-polystyrene latex system. // Croat. Chem. Actia. 1973. - v.45. -No. l.-P. 67-84.

50. Fair B.D., Jamieson A.M. Studies of protein adsorption on polystyrene latex surfaces. // J. Colloid and Interface Sci. 1980. - v.11. - No. 2. - P. 525-534.

51. Kawaguchi H., Amagasa H., Hagiya T., Kimura N., Ohtsuka Y. Interaction between proteins and latex particles having different surface structures. // Colloids and Surfaces. 1985. - v. 13. - P. 295-311.

52. Bagchi P., Birnbaum S.M. Effect of pH on the adsorption of immunoglobulin G on anionic polyvinyl toluene model latex particles. // J. Colloid and Interface Sci. 1981. - v.83. - No. 2. - P. 460-478.

53. Kondo A., Kawanot Т., Higashitani K. Immunological agglutination kinetics of latex particles with covalently immobilized antigens. // J. Ferment Boieng. 1992. - v.73. - No. 6. - P. 435-439.

54. Kasuya Y., Fujimota K., Miyamoto M., Jujit Т., Otaka A. Preparation of peptide-carrying microspheres with bioactivity on platelets. // J. Biomater Sci-Polym. Ed. 1993. - v.4. - No. 4. - P. 369-380.

55. Yamada Т., Muzamatsu N., Kondo T. Phagocytosis of monosaccharide-Binding latex particles by buinea Pig Poly

56. Kondo A., Yamasaki R., Higashitani K. Affinity purification of antibodies using immunomicrospheres. //J.Ferment Bioeng.-1992-v.74-№4 -p.226-232

57. Nathar C.F., Cohn Z.A. // J.Exp.Med. vol.1981 - №154-p.l539-1553

58. Quash G., HagerH.//U.S.Pat. 3857931(1974).

59. Dorman L.C. // U.S.Pat. 4045384(1977).

60. Srere P.A., Uyeda K. «Methode in enzimology» v.XLIV., acad. Press. N.Y. - №2.-P.l 1-19., 1976.

61. Molday and Coll.//J. of cellular biology, vol.64.-1975.

62. Conda Met. And Coll.//J.Virology v.36 - p.572-576.-1978.

63. Harkins W.D. General theory of the reaction loci in emulsion polymerization. -Y.Chem.Phys., v.69, 1954, №6, p.1428-1444

64. Smith W., Ewart R. Kinetics of emulsion polymerization. Y.Chem.Phys., v.l6, 1948, №6, p.592-599

65. Медведев C.C., Хомиковский П.М., Шейнкер А.П., Заболоцкая Е.В., Бережной Г.Д. Закономерности эмульсионной полимеризации. Проблемы физической химии, 1958, вып.1, с.5-17

66. Ugelstad I., Mork Р.С. Kinetics and mechanism of emulsion polymerization.- Amer.Chem.Soc.Polym.Prepr., 1980, v.21, №2, p.291

67. Ширман П. Эмульсиию Перевод под редакцией Абрамзона А.А., Л., Химия, 1972, 448 с.

68. Prince Z.M. The theory of emulsion/ The negative surface tension on the oil/ water interfase. -I.Coll.Interf.Sci., 1967, v.23? №2, p.165-173

69. Ugelstad t. ,E1-Asser M.S., Vanderhoff I.W. Emulsion polymerization: initiation of polymerization in monomer droplets.- I.Polym. Sci. Polym.Zett.Ed., 1973, v.ll, №8, p.503-513

70. Ugelstad I., Hansen F.K. Kinetics and mechanism of emulsion polymerization Rubber Chem.and Technol., 1976, v.49, №3, p.536-609

71. Грицкова И.А., Седакова Л.И., Мурадян Д.С, Синекаев БМБ, Павлов А.В., Праведников А.Н. Топохимия и массоперенос при эмульсионной полимеризации. ДАН СССР, 1978, Т.243, №2, С.403-406

72. Hagiopol С., Dimonil V. Some aspects of suded emulsion polymerization of water soluble and non - soluble vinil monomers. - Acta Polym., 1981, №7, v.32, p.390-397

73. Chamber I.S., Smitham I.B., Napper D. H. Theoretical study of effects of surfactants on suded polymerization. T.Appl Polym. Sci.Polym. Symp., 1975, v. №49, p. 169-174

74. Hawkett B.S., Napper D.H., Gibbert R.G. Suded polymerization of styrene T.Chem. Soc.Faraday Trans, 1980, v.76, Part 1, №6, p. 1323-1343

75. Grancio M.R., Williams D.T. The morphology of the mononer polymer particles instyrene emulsion polymerization T.Polym.Sci., 1970, v.8, №9

76. Grancio M.R., Williams D.T. Molecular weight development in constant rate styrene emulsion polymerization T.Polym.Sci., 1970, №10, p.2733-2745

77. Tee D.T. Morphology of two-stage latex particles. Polystyrene and styrene-butadiene copolymer pair systems in Emulsion polymer and Emulsion polymerization ACS Symp. Ser., 1981, p.405-414

78. Okuba M., Katsuta Т., Matsumoto I. Rubture of anomalous composite particles prepared bysteden emulsion polymerization in aging period — T.Polym.Sci. Polym. Tett Ed.,1980, v.18, № 7

79. Okuba M., Ando M. Anomalous composite polymer emulsion partcles with voids produced by suded emulsion polymerization. -T.Polym.Sci. Polym Tett.Ed., 1981, v.18, №3,p.l43-147

80. Chainey M., Hearn Т. Preparation of overcoateed polymer lattices by a «short-growth» technique Brit. Polym Т., 1981, v. 13, №3, p. 132-186

81. Chainey M., Wilkinson M.C.Preparation of overcoated polymer lattices by a «short-growth» technique Lnd.Eng.Chem.Prod.Res.Dev., 1982, v.21, №2, p.171-176

82. Елисеева В.И., Титова H.B., Чалых A.E., Сломинский Г.Д. Структурно-морфологические превращения латексных частиц в процессе двухстадийной эмульсионной полимеризации. ДАН СССР, 1981, т.261, №2, с.402-405.

83. Грицкова И.А., Прокопов Н.И., Э. Гжива, И. Гжива-Никсиньска, E.H. Звонкова, В.А. Быков Способ получения монодисперсных полистирольных суспензий. Патент Республики Польша № 179375 от 31.08.2000г.

84. Басырева Л.Ю. Создание диагностических тест-систем на основе полимерных суспензий и факторы, определяющие их чувствительность и специфичность: Дисс.канд. хим. наук Москва, 1994г., 127 стр.

85. Прокопов Н.И. Синтез полимерных суспензий с узким распределением частиц по размерам методом гетерофазной полимеризации: Дисс.доктора хим. наук., Москва 1999г.,

86. J С Daniel Makromol. Chem., Suppl. 10/11 359 (1985)

87. ALL Palluel, M J Westly, С W A Bromley, S P Davies, A J Backhouse Makromol. Chem., Suppl. 35/36 509 (1990)

88. Y S Kim, M Ballauff Morfology of Composite Latex Particles of poly(styrene) and poly(methyl methacrylate). FRG, Karlsuhe: Polymer-Institut

89. VI Eliseeva Progress in Organic Coatings 13 195 (1985)

90. E В Brandford, J W Vanderhoff J. Polymer Sei. С 3 41 (1963)

91. T J Min, A Klein, M S El Aasser, J W Vanderhoff J. Polym. Sei., Polym. Chem. Ed. 21 2845(1983)

92. К Kato Kolloid Z. Z. Polym. 220(1) 24 (1967) Polymer 8 33 (1967).

93. T Matsumoto, M Okubo, T Tmai Kobunshi Ronbunshu 36( 17) 459 (1979)

94. G Kanig, H Neff J. Colloid Polymer Sei. 253 29 (1975)

95. T Paxton J. Colloid Interface Sei. 31(1) 19 (1969)

96. L R Erickson, K L Hoy ACS Symposium Series 165 (1981)

97. R Arshady Suspension, Emulsion, and Dispersion Polymerization -A Methodological Survey Colloid and Polymer Science 270 717(1992)

98. J-E L Jonsson, H Hassander, L H Jansson, B Tornel Macromolecules 24 126(1991)

99. Yi-Chern Chen, V L Dimonie, S El Aasser J. Appl. Polym. Sei. 42 1049 (1991)

100. S A Chen, ST Lee, S J Lee Polymer International 30 461 (1992)

101. A Okubo Appl. Polym. Sei. 39 1453 (1987)

102. L Rios, M Hidalgo, J Y Cavaille, J Guillot, A Guyot, C Pichot Colloid Polym Sei. 269 812(1991)

103. A Cruz-Rivera, L Rios, C Monnet, B Schlund, J Guillot, C Pichot Polymer 60 1873 (1989)

104. V Dimonie, M S EL Aasser, A Klein, J W Vanderhoff AICHE Meeting Houston (1983)

105. WD Hergert, K Schmutzler, S Wartevig Macromol. Chem., Macromol. Symp. 31 123 (1990)

106. J Y Cavalle, C Jourdan, J Peres, J Guillot J. Macromol. Chem., Macromol. Symp. 23 123 (1990)

107. M J Devon, J I Gardon, G Roberts, A Rudin J. Appl. Polym. Sei. 39 2119 (1990)

108. D Y Lee, T Ishikava J. Polym Sei., Polym. Chem. Ed. 21 147 (1983)

109. I W Choi, K WLee J. Appl. Polym. Sei. 30 1903 (1985)

110. M Okuba, N Miyachi, Y Lu Colloid Polymer Sei. 272 270(1994)

111. T Matsumoto, M Okubo, S Shibao Ibid 33(10) 575 (1976)

112. M Okubo, Y Katsuto, T Matsumoto J. Polym. Sei., Polym. Lett Ed. 18 478 (1980)

113. M Okubo, M Ando, A Yamada,Y Katsuada, T Matsumoto J. Polym. Sei., Polym. Lett Ed. 19 143 (1981)

114. M Okubo, Y Katsuada, T Matsumoto J. Polym. Sei., Polym. Lett Ed. 20 45 (1982)

115. G E Molau J. Polym. Sei. Part A 3 1267 (1965)

116. GE Molau J. Polym. Sei. Part A 3 4235 (1965)

117. Y Ikada, F Horii, I Sakurada J. Polym. Sei., Polym Chem. Ed. 11 27 (1973)

118. F Horii, Y Ikada, I Sakurada J. Polym. Sei., Polym Chem. Ed. 11 27 (1973)

119. GE Molau Kolloid Z.Z. Polym.238 493 (1970)

120. R H Somani, M T Shaw Macromolecules 14 1549 (1981)

121. S Krause Colloidal and Morphological Behavior of Block and Graft Copolymer Plenum, New York (1971)

122. C H Bamford, G C Eastmond, D Whittle Polymer 12 141 (1977)

123. L H Sperling J. Polym. Sei., Macromolecul. Rev. 11 122 (1977)

124. L M Shevchuk, Ye N Milchenko, A V Zaitseva, A Ye Kulikova Vysokomol. Soedin., Ser. B 20 897 (1978)

125. LH Sperling, T W Chiu, C P Hartman, D A Thomas Intern. J. PolymericMater 1 333 (1972)

126. LH Sperling, T W Chiu, D A Thomas J. Appl. Polym. Sei. 17 2443 (1973)

127. JE Lorentz, D A Thomas, L H Sperling ACD Symp. Series 24 (1976)

128. V Huelk, D A Thomas, L H Sperling Macromolecules 5 340 (1972)

129. JA Grates, D A Thomas, Hickey, L H Sperling J. Appl. Polym. Sei. 19 1731 (1975)

130. J E Lorentz, D A Thomas, L H Sperling Ibid 19 2225 (1975)

131. J Sionakidis, LH Sperling, D A Thomas Ibid 24 1179 (1979)

132. J W Vanderhoff J. Polymer Sei. 72 161 (1985)

133. C Pichot Macromol. Chem., Macromol. Symp. 35/36 327 (1990)

134. M Lamia, B Schlund, E Lazarus, T Pith Macromol. Chem., Suppl. 10/11 463 (1985)

135. J Barton Macromol. Chem., Macromol. Symp. 35/36 41 (1990)

136. J Guillot Macromol. Chem., Macromol. Symp. 35/36 369 (1990)

137. S С Misra, С Pichot, M S El Aasser, J W Vanderhoff Polym. Lett. 17 567(1979)

138. К Chujo, Y Harada, К Tanaka J. Polym. Sci. C27 3321 (1969)

139. S Nishida, M S El Aasser, A Klein, J W Vanderhoff ACS Symp. Series 165 (1981)

140. A Guiot, J Guillot, С Pichot, L Rios ACS Symp. Series 165 415(1981)

141. DC Blackey, S Andries, R D Sebastian J. British Polymer 19 25 (1987)

142. L F Antonova, EI Abljakimov Vysokomol. Soed. A-14 881 (1972)

143. L F Antonova, E E Zaev, S R Rafikov Vysokomol. Soed. A-20 687 (1987)

144. J H Kim, M Chainey, M S El Aasser, J W Vanderhoff J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. Ed. 27 3187 (1989)

145. В.И.Елисеева, T.P Асламазова Успехи химии 2 398 (1991)

146. X. Бахарванд, А.А. Капустина, И. Гжива-Никсиньска, А.А Оганесян, И.А. Грицкова, П.В. Нусс, В.Н. Измайлова Коллоидный журнал 59(3) 299 (1997)

147. S A Chen, S Т Lee Macromolecules 25 1530 (1992)

148. Н.П. Блинов Химическая микробиология Высшая школа, Москва, 1984.

149. Н.И. Прокопов, И.А. Грицкова, В.Р. Черкасов, А.Е. Чалых Синтез монодисперсных функциональных полимерных микросфер для иммунодиагностических исследований МИТХТ, Москва (1995)

150. L В Bangs, Ph.D. Diagnostic Application of Latex Technology. Theory & Practice. Bangs Laboratories, Inc., Carmel IN (1997)

151. И.П. Тыщенко Ветеринария 7/8 26(1992)

152. LB Bangs Med. Diagn. Fpplic. of Latexes Course Orlando (1989)

153. V Hoopwood, D W Warnock, J D Milne . J. Clin. Microbiol. 6(4)392 (1987)

154. А. Дарбре Практическая химия белка Москва, Мир (1989)

155. Н.П. Блинов Химическая микробиология. Москва, Химия (1989)

156. У. Пол Иммунология Москва, Мир (1987)

157. Almog Y, Reich S, Levy M. Br Polym J 1987;14:131.

158. Шервурд П.М. Обработка данных в рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии. В сб. Анализ поверхности методами Оже- и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии. Под ред. Бриггса Д. и Сиха М.П. пер. с англ. Москва: Мир, 1987, с. 497.

159. Анализ поверхности методами Оже- и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии. Под ред. Бриггса Д. и Сиха М.П. пер. с англ. Москва: Мир, 1987, с. 406,407.

160. Yamada К., Olden К. Fibronektins- adhesive glycoproteins of cell surfase and blood//Nature.- 1978.- v.275.-p. 179-184.

161. Mosseson M., Amrani D. The strukture and biological aktiveties of plasma fibronektin // Blood.-1980.- v.56.-p.l45-158.

162. Златопольский А.Д., Мазуров В.И. Строение фибронектинов: сходство и различие. // Вопросы мед. химии.- 1985.- Т. 31.-№ 6.- с. 2-14.

163. Любимов А.В., Глейберман А.С. Поверхностные белки клеток и их изменения при нормальном развитии и опухолевом росте // в "Явления индукции и дифференцировки при опухолевом росте".- М. : Наука, 1981. с.171-258.

164. Титов В.Н., Сапфирова В.М. Фибронектин крови : биологическая и диагностическая значимость. Обзор//Тер. архив.- 1984.-Т.56. с. 147-149.

165. Mcdonagh J. Plasma fibronektin. Strukture and function //Hematology.- N.Y., 1985. v. 5.-p. 1-4.

166. Clark R., DellePella P., Manseau E. Blood vessel fibronektin increases in conjunction with endothelial cell proliferation and capillary ingrowith during wound healing // J. Invest. Dermat.- 1982.-v.79.-p.269-276.

167. Mosseson M., Amrani D. Interactions with glicosaminoglicans // in "Plasma Fibronektin. Structure and function". Hematology.- N.Y., 1985.-v.5.-p.77-98.

168. Hormann H. Iteraction with fibrinogen and fibrin // in "Plasma fibronektin. Strukture and funktion". Hematology.- N.Y., 1985.- v.5.-p. 99-120.

169. Keski- Oja J., Yamada K.M. Isolation of an actin-binding fragment of fibronektin // Biochem. J.- 1981.- v.- 193.-p. 615-620.

170. Pande H., Shvely J. NH2 -terminal seguences of DNA-, heparin- and gelatin binding tryptic fragments from human plasma fibronectin // Arch. Biochem. Biophys.-1982.- v.213.- p. 258-265.

171. Pierschbacher M., Ruoslahti E., Sundelin J. The cell attachment domein of fibronektin. Determination of the primary strukture // J. Biol. Chem.- 1982,- v. 257.-p. 9593-9597.

172. VanDeWater L. Phagocytosis // in "Plasma fibronektin. Strukture and function". Hematology.-N.Y., 1985.- v.5.-p. 175-196.

173. Pearlstein E. Substrate activation of cell adhesion factor as a prerequisite for cell attachment // Int. J. Cancer.- 1978.- v.22.- p. 32-35.

174. Rocco M., Carson M., Hantgan R. Dependense of the shape of the plasma fibronektin molecule on solvent composition : ionic strength and glycerol content // J. Biol. Chem.-1983.- v.258.- p. 14545-14549.

175. Измайлова B.H., Ребиндер П.А. Структурообразование в белковых системах. М.: Химия, 1974.

176. Bernstein F.C., Kaetzle T.F. ed al.// J. Mol. Biol. 1977. V. 112. P.535.

177. Sayle R. // Molecular Grafics Visualisation Tool, RasMol. 2.1.2.В. UK: University Edinburgh, 1991.

178. Измайлова B.H. Ямпольская Т.П., Сумм Б.Д. Поверхностные явления в белковых системах. М.: Химия, 1988 с. 240.

179. Алентьев А.Ю., Измайлова В.Н., Ямполльская Т.П. // Коллоид, журн. 1991. Т. 53. №4. с. 609.

180. Левачев С.М., Измайлова В.Н.// Коллоид, журн. 1994. Т.56. № 2. с. 193.

181. Бусол Т.Ф., Письменная Г.М., Жиглецова С.К., Тарасевич Б.Н., Измайлова В.Н. Адсорбция желатины на жидких границах раздела фаз. // Коллоидн. журн. 1979. Т. 41. № 6. С. 1055-1060.

182. Бусол Т.Ф. Исследование межфазных адсорбционных слоев желатины методом спектроскопии внутреннего отражения. // Дисс. . канд. хим. наук. М. 1980.

183. Ребиндер П.А. Поверхностные явления в дисперсных системах. Коллоидная химия. // Избр. тр. М.: Наука, 1978. Т.1.

184. Измайлова В.Н., Ямпольская Г.П., Туловская З.Д. // Коллоид, журн.1998. Т.60. № 5.с. 598.

185. А.М.Королюк, В.Б.Сбойчаков. Медицинская микробиология.-Учебное пособие. Санкт-Петербург 1999г.

186. S Torza, S Mason J. Colloid Interface Sci. 33 67 (1970)

187. Yi-Chern Chen, V L Dimonie, О L Shaffer, S El Aasser J. Polymer International 30 185 (1993)

188. D Sundberg, A P Casassa, J Pantazopoulos, M R Muscato J. Appl. Polym. Sci. 41 1429(1990)

189. Y С Chen Ph Thesis Lehigh University, Bethlehem, PA, USA (1991)

190. J-E L Jonsson, H Hassander, L H Jansson, В Tornel Macromolecules 24 126(1991)