Синтез производных антибиотиков тилозинового ряда как инструментов для изучения функционирования рибосомы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИМ ФАКУЛЬТЕТ

004600787 На правах рукописи

КАРПЕНКО ВИКТОРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

СИНТЕЗ ПРОИЗВОДНЫХ АНТИБИОТИКОВ ТИЛОЗИНОВОГО РЯДА КАК ИНСТРУМЕНТОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ

РИБОСОМЫ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

1 5 ДПР 20(0

№

Москва-2010

004600787

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научные руководители: доктор химических наук, профессор,

академик РАН

Богданов Алексей Алексеевич

кандидат химических наук Сумбатян Наталия Владимировна

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Олсуфьева Евгения Николаевна

доктор биологических наук Колб Вячеслав Адамович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт Биоорганнческой химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится 20 апреля 2010 года в 16 часов на -заседании Диссертационного Совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан ¿/марта 2010 года.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение механизма функционирования рибосомы, в частности, изучение механизма биосинтеза белка, остается одной из важнейших проблем молекулярной биологии и биохимии.

Рибосомкый туннель (РТ) является одним из наименее изученных функциональных центров рибосомы. Долгое время считалось, что он является лишь пассивным каналом для прохождения растущей полипептидной цепи. Однако позже было показано, что полипептидная цепь, образующаяся в процессе биосинтеза белка в рибосоме, может вступать в специфические взаимодействия с участками РТ, благодаря чему осуществляются механизмы общей регуляции трансляции и начальные этапы фолдинга растущего пептида. При этом взаимодействия внутри РТ могут приводить к остановке работы рибосомы. Молекулярные механизмы таких взаимодействий на данный момент не известны. Исходя из литературных данных можно предположить, что одним из важнейших элементов РТ, вовлеченных в узнавание последовательности растущей полипептидной цепи, является нуклеотидный остаток А2062 23S рРНК, расположенный рядом с пептидилтрансферазным центром (ПТЦ) рибосомы.

Ранее в нашей лаборатории для изучения взаимодействий синтезируемой полипептидной цепи со структурными элементами РТ был предложен новый подход, основанный на применении макролидных антибиотиков тилозиновой группы. Макролиды представляют собой класс природных, а также полусинтетических антибиотиков, построенных на основе 12-16-членного лактонного кольца, к которому присоединены один или более углеводных заместителей. Макролиды относятся к наиболее широко используемым клиническим и ветеринарным антибактериальным препаратам. Механизм действия антибиотиков-макролидов, в том числе тилозина и его аналогов, заключается в том, что они ингибируют биосинтез белка, связываясь в специфическом сайте РТ (т.н. "макролидном сайте», MBS) и закрывая при этом просвет для выхода растущей полипептидной цепи. Модифицируя тилозин по разным положениям остатками аминокислот и коротких пептидов, можно получить соответствующие производные антибиотика, которые представляют интерес как потенциальные зонды для исследования взаимодействий синтезируемой цепи с РТ: в этих соединениях антибиотик играет роль "якоря", расположенного строго в MBS, а аминокислотный или пептидный остаток моделирует полипептидную цепь.

Кроме того, известно, что для изучения функционирования рибосомы и процесса трансляции удобными являются флуоресцентные методы исследования. В частности, флуоресцентные метки могут использоваться: для изучения пептидилтрансферазной реакции, для определения конформации пептидов в РТ, для изучения связывания производных

макролидов методом вытеснения флуоресцентно меченого антибиотика той же группы из рибосомного комплекса.

Цель работы. Целью настоящей работы являлось получение аминокислотных, пептидных и флуоресцентных аналогов макролидных антибиотиков тилозинового ряда по положениям С20 и С4', которые могут служить инструментами для изучения функционирования рибосомы.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получена серия новых аминокислотных производных антибиотиков тилозинового ряда, содержащих по альдегидной группе С20 остатки гидрофобных, гидрофильных, ароматических и гетероциклических аминокислот (фенилаланина, тирозина, карнитина, 3-(урацил-1-ил)аланина). Отработаны удобные методы получения соединений этого ряда.

Разработан принципиально новый метод введения пептидных модификаций по положению С4' десмикозина. Впервые получены производные, содержащие остатки глицил-L-пролина и глицил-глицил-£-пролина, присоединенные к 4'-положению микаминозы через линкер, содержащий остаток бутандиовой кислоты.

Впервые синтезированы и охарактеризованы флуоресцентные производные антибиотиков тилозинового ряда, которые в дальнейшем могут быть использованы для исследования функциональных состояний бактериальной рибосомы.

Исследован характер взаимодействий остатка А2062 РТ с аминокислотами растущего пептида. Наши результаты демонстрируют, что существует непосредственное взаимодействие растущих пептидов с рибосомным туннелем. Предполагается, что ингибирование биосинтеза белка макролидами является результатом сложных взаимодействий между РТ, растущей пептидной цепью и антибиотиком.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации были опубликованы 2 печатные работы. Результаты работы были представлены на II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2006» (Москва, 2006), на III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), на XV Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2008), на 30-ом международном пептидном симпозиуме (Хельсинки, Финляндия, 2008) и на международной научной конференции по биоорганической химии, посвященной 75-летию со дня рождения Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 180 страницах и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы (180 ссылок). Диссертация содержит 28 рисунков, 22 таблицы и 35 схем.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Постановка задач работы

В основе дизайна потенциальных инструментов для исследования взаимодействий растущей полипептидной цепи белка с РТ лежит оригинальная идея использования макролидных антибиотиков, которые, как известно, прочно связываются в РТ бактериальных рибосом. Пространственное расположение тилозина в РТ (Рис. 1) было определено ранее методом РСА; было показано, что углеводные остатки по положению С5 лактонного кольца, лежат вдоль стенок туннеля по направлению к ПТЦ, а альдегидная группа в положении С20 образует ковалентную связь с N6 аденинового остатка 235 рибосомной РНК (А2062 в Е.соИ и А2103 в Н.таттогШ). Модифицируя тилозин по разным положениям остатками аминокислот и коротких пептидов, можно получить производные антибиотика, которые представляют интерес как потенциальные зонды для исследования взаимодействий синтезируемой цепи с РТ.

но

А2062

НоС. хн,

2' 3 N

птц

Выход из РТ «■ сн3 | " 2

3 17 сн, микаминоза 0 * снГтГ

мициноза 34

Тилозин микароза

Рис. 1. Схематическое расположение молекулы тилозина в РТ. Остатки микарозы и микаминозы направлены в сторону ПТЦ, микаминозы - в сторону выхода из туннеля. Альдегидная группа ориентирована в сторону остатка А2062 23S рРНК.

Первой задачей данной работы был синтез аналогов антибиотиков тилозинового ряда, содержащих в положении С20 различные аминокислотные заместители. Ранее в рамках совместной работы нашей лаборатории и группы П.Фучини Института молекулярной генетики им. М. Планка (Берлин, Германия) было проведено изучение комплекса аналога тилозина, модифицированного по положению С20 метиловым эфиром 2-аминооксиацетип-£-аланил-^-аланина (Ту1-А2) с бактериальными рибосомами Deinococcus radiodurans методом РСА.

Было показано, что это производное тилозина связывается в том же самом сайте РТ 50S рибосомной субъединицы, что и тилозин. Заместитель в положении С20 2-аминооксиацетил-£-аланил-/,-аланин расположен в непосредственной близости от важного для связывания с антибиотиком остатка А2062. Пептидный заместитель располагается в "адениновом кармане", который образуется в стенке РТ. Модификация тилозина по

альдегидной группе делает образование ковалентной связи антибиотика с остатком А2062 невозможным, и этот остаток принимает конформацию, сходную с таковой в свободной рибосоме, за счет поворота пуринового основания вокруг гликозидной связи примерно на 90°. Исходя из этих данных, было сделано заключение о принципиальной возможности специфического взаимодействия аминокислотных остатков растущей пептидной цепи с компонентами стенок рибосомного туннеля. Необходимо подчеркнуть также, что, как следует из литературы, изменение положения остатка А2062 приводит к структурным перестройкам в ПТЦ, непосредственно сказывающимся на функциональной активности рибосомы.

Известно, что полость "аденинового кармана" образована не только гидрофобными остатками гетероциклических оснований, но и заряженными фосфатными группами. В связи с этим можно было предположить, что наряду с гидрофобными взаимодействиями в «кармане» могут реализовываться электростатические взаимодействия между заряженными группами.

В связи с вышеизложенным, для модификации антибиотиков тилозинового ряда были выбраны остатки гидрофобных, гидрофильных, ароматических и гетероциклических аминокислот (фенилаланина, тирозина, карнитина, 3-(урацил-1-ил)аланина).

Кроме того, перед нами стояла вторая задача - модифицировать антибиотик остатками пептидов, направленными «вверх по туннелю». Как известно из литературы, тилозин связывается в MBS рибосомы таким образом, что лактонное кольцо закрывает просвет туннеля, остаток сахара мицинозы в положении 14 лактонного кольца направлен «вниз по туннелю», а остаток дисахарида микаминозил-микарозы в 5 положении лактонного кольца ориентирован «вверх по туннелю» в направлении ПТЦ (Рис. 1.). Мы решили заменить остаток микарозы пептидным заместителем и таким образом получить производные антибиотиков, содержащие в 4'-положении микаминозы пептидный фрагмент, направленный от MBS к ПТЦ. Подобные соединения также могут служить потенциальными зондами для изучения взаимодействий в функционально-важных районах РТ. В частности, регуляция транскрипции-трансляции белков триптофаназы и SecM основана на аресте трансляции, важнейшей причиной которого является связывание пролил-тРНК в ПТЦ. Однако структурные аспекты взаимодействия пролина с нуклеотидными остатками ПТЦ до сих пор остаются неясными. В связи с этим, мы модифицировали тилозин остатками пролин-содержащих пептидов. Были выбраны два пептида глицил-£-пролин и глицил-глицил-/,-пролин, присоединенные к 4'-ОН группе микаминозы через линкер. Длина пептидных фрагментов была подобрана, исходя из данных по компьютерному моделированию производных тилозина в РТ. С-концевой остаток пролина должен был имитировать пролил-тРНК в соответствующем сайте.

Известно, что для изучения функционирования рибосомы и процесса трансляции белка весьма информативными оказались флуоресцентные методы исследования. Однако до сих пор не описано ни одного флуоресцентного производного антибиотиков тилозинового

6

ряда, в то время как известен широкий круг других флуоресцентно меченных макролидов (например, эритромицина). В связи с этим третьей задачей настоящей работы было получение флуоресцентных производных антибиотиков тилозинового ряда.

Четвертой задачей было изучение функциональной активности полученных С20 аминокислотных и пептидных производных тилозина в биологических системах. Для этого нами были выбраны два основных подхода: 1) изучение связывания макролидных антибиотиков с рибосомой, позволяющее определить количественные параметры комплексообразования, методом вытеснения из рибосомы радиоактивно меченого антибиотика той же группы - [14С]-эритромицина; 2) оценка ингибиторной активности серии аминокислотных и пептидных производных антибиотиков тилозинового ряда по положению С20 в бесклеточной системе транскрипции-трансляции.

2. Получение производных антибиотиков тилозинового ряда, содержащих остатки аминокислот и пептидов по положению С20

В работе был использован коммерческий препарат тилозина (I); десмикозин (II) и ОМТ (III) (Схема 1) были получены кислотным гидролизом тилозина. В качестве контрольного соединения для биологических экспериментов по описанной методике был получен тилозин, в котором альдегидная группа восстановлена до гидроксильной Tyl-H2 (IV).

В соответствии с задачей 1, мы модифицировали альдегидную группу антибиотиков тилозинового ряда (I-III) остатками аминокислот. Модифицированные антибиотики по положению С20 должны были содержать гидрофобные, гидрофильные, ароматические и гетероциклические аминокислотные остатки (фенилаланин, тирозин, карнитин, 3-(урацил-1-ил)аланин) (Рис. 2), которые могут участвовать в образовании специфических гидрофобных и электростатических контактов с нуклеотидными остатками района А2062 РТ.

Рис. 2. Аминокислоты и их производные, использовавшиеся для модификации антибиотиков тилозинового ряда по положению С20.

Из возможных способов модификации альдегидной группы мы выбрали три, а именно: 1) образование замещенных оксимов; 2) получение замещенных оснований Шиффа;

Н-/.-Туг-ОН

H-L-Car-OH

3) получение замещенных гидразонов по положению С20 макролидных антибиотиков тилозинового ряда (Схема 1).

2.1. Получение замещенных оксимов антибиотиков тилозинового ряда по положению С20. Синтез производных тилозина, десмикозина и ОМТ, содержащих остатки ¿-фенилаланина

Для синтеза производных методом образования замещенных оксимов остаток аминокислоты присоединяли к антибиотику через аминооксиацетильный линкер. В связи с этим для введения остатка фенилаланина по положению С20 предварительно был получен псевдопептид 2-аминооксиацетил-£-фенилаланин (H-Aoac-Phe-OEt). Синтез последнего был осуществлен в растворе методом активированных эфиров. В качестве активированных эфиров использовали 1-гидроксибензотриазоловые эфиры, которые получали in situ, применяя конденсирующий агент DCC. Для защиты аминогруппы N-концевой аминокислоты использовали Вос-группу, карбоксильной группы фенилаланина - этиловый эфир.

Конденсацию альдегидной группы антибиотиков (I, II или III) с аминогруппой псевдопептида проводили в водно-органической среде при рН 4,7 (0,2 М Na-ацетатный буфер / ДМСО, 2:3 или 1:1) (Схема 1, а). Добавление ДМСО было необходимо для повышения растворимости гидрофобного дипептида H-Aoac-Phe-OEt в водной реакционной смеси. Исходные концентрации тилозина, десмикозина и ОМТ составляли 0,01 М. Количество пептида в реакционной смеси составляло 4-6 экв. Смесь выдерживали при температуре 40 "С в течение 12 - 15 ч. Образовавшиеся производные антибиотиков (V-VII) выделяли экстракцией хлороформом, их очистку проводили с помощью препаративной ТСХ на силикагеле или колоночной хроматографии в системах, содержащих хлороформ и метанол в соотношении 4:1 (соединение V) или 9:1 (соединения VI и VII). Выходы после очистки составили 20 - 25%.

Индивидуальность полученных соединений доказывали методами ТСХ и ВЭЖХ, строение - методами масс-спектрометрии (TOF MALDI), аминокислотного анализа и ЯМР ('Н, |3С, COSY, НМВС, HSQC). Детальное отнесение сигналов в 'Н и 13С ЯМР-спектрах тилозина (I) было использовано для подтверждения структур модифицированных производных, в частности, для доказательства введения заместителей по положению С20. Протонные спектры макролидов, модифицированных по положению С20, отличаются от спектров исходных соединений отсутствием сигнала в области 9,6 - 9,7 м.д., характерного для альдегидного протона, и появлением сигнала -CH=N-npoTOHa в области 7,4 - 7,5 м.д. Кроме того, модификация именно С20 альдегидной группы подтверждалась исчезновением в спектре ,3С сигнала в области 202 - 204 м.д., соответствующего -СН=0 углероду и возникновением

НзС^гг,

ом 3 чоНзС1

СМЭ мэс

Н,СЧ Н3С

н,с

III: Я, = Н РЦ = Н

\но^ ?____он

0й—

'зЧ^ Н3С

Я ?НН3°. „С;

о Н3С^ „сн.

Н3С хп он,

МГЧ Н,с I

ОН ч0 3, ^

V: Я,= = /М^ "

VI: ^ = Н

VII: ^ = Н Я2=Н =

У1П,Х1: К =

он о"

он о

.Анн

Схема 1. Общая схема модификации альдегидной группы антибиотиков тилозинового ряда: (а) метод образования замещенных оксимов; (Ь) метод образования оснований Ши<Ь(Ьа; (с) метол образования замещенных гидразонов.

сигнала в области 150 - 160 м.д., характерного для вр2-углерода в основаниях Шиффа и оксимах; при этом сохранялся сигнал около 203 м.д., соответствующий углероду С9 кетонной группы. Корреляция протонов, а также атомов углерода с протонами изучалась в экспериментах двумерной ЯМР-спектроскопии COSY, НМВС и HSQC. В Таблице 1 приведены характеристики полученных соединений.

2.2. Получение оснований Шиффа тилозина с остатками ароматических и нуклеоаминокислот

Для получения производных тилозина и десмикозина с ароматическими аминокислотами (тирозином и фенилаланином), а также с нуклеоаминокислотой ЦД-3-(урацил-1-ил)аланином был использован способ образования оснований Шиффа (Схема 1, Ь). Метод заключается в непосредственном взаимодействии альдегидной группы макролидов с а-аминогруппой аминокислоты или пептида, приводящий к образованию имина.

Конденсацию тилозина с аминокислотами проводили в абсолютном метаноле с двукратным избытком аминокислоты в присутствии метилата натрия и молекулярных ситА? при комнатной температуре. Полученные основания Шиффа (VIII-X) оказались достаточно устойчивыми в растворах спиртов и в нейтральных водных растворах, что позволило их выделить как индивидуальные соединения методом препаративной ТСХ на силикагеле. Основание Шиффа тилозина, содержащее остаток тирозина, (X), было восстановлено до вторичного амина (XI). Было показано, что восстановление может быть проведено как после выделения соответствующего имина, так и in situ прямым добавлением цианборгидрида натрия в реакционную смесь.

Соединения характеризовали методом ТСХ, УФ- и MALDI MS-спектрометрии, а также ЯМР-спектроскопии. УФ-спектры оснований Шиффа значительно отличаются от спектров восстановленных соединений или полученных способом образования замещенных оксимов, в них появляются полосы в области 385 нм, которые обусловливают желтую окраску соединений.

2.3. Получение замещенного гидразона тилозина, содержащего остаток ¿-карнитина по положению С20

Для введения остатка ¿-карнитина в положение С20 тилозина был разработан способ, основанный на модификации карбоксильной группы кислоты с образованием гидразида и последующей конденсации гидразидной группировки с альдегидной группой антибиотика, в результате чего получается замещенный гидразон (Схема 1, с).

На первом этапе осуществляли получение гидразида ¿-карнитина по описанной методике: реакцию между ¿-карнитином и гидразин-гидратом проводили в метаноле при комнатной температуре. После упаривания реакционной смеси был получен продукт в виде

10

бесцветного кристаллического вещества, который не требовал дополнительной очистки и был введен в последующую реакцию с антибиотиком.

Конденсацию гидразидной группы ¿-карнитина с альдегидной группой тилозина проводили в 0,4 М Na-ацетатном буфере (рН 4,7) при перемешивании в течение 12 ч при комнатной температуре, очистку продукта осуществляли методом колоночной хроматографии в системе хлороформ - метанол, 4:1. Индивидуальность и строение соединения XII оценивалась методами ТСХ, ВЭЖХ и MALDI MS-спектрометрии, а также ЯМР-спектроскопии.

Характеристики всех полученных производных, содержащих остатки аминокислот и пептидов в положении С20, представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Характеристики С20 производных антибиотиков тилозинового ряда.

соединение шифр UV Ямах, nm MALDI MS m/z (найдено/вычислено) Дополнительные характеристики Выход*, %

Tyl-Phe V 282,0 1167,7/ 1167,4 ЯМР, а.к. анализ, ВЭЖХ 21

Des-Phe VI 283,5 1020,7/ 1020,1 ЯМР, а.к. анализ, ВЭЖХ 20

OMT-Phe VII 284,0 846,5 / 846,0 ЯМР, а.к. анализ, ВЭЖХ 23

Tyl=Tyr VIII 285, 345 1079,7/ 1079,3 ЯМР 25

Tyl=Phe IX 285,385 1063,7/ 1063,1 - 16

Tyl=Ual X 275 1097,7/ 1097,1 ЯМР 21

Tyl-Car XII 282,0 1070,8/ 1074,1 ЯМР, ВЭЖХ 42

Tyl-Tyr XI 225,285 1081,9/ 1081,1 ЯМР 23

* - здесь и далее, выход (%) на последней стадии после очистки

3. Синтез пептидных производных десмикозина по 4' - положению микаминозы

Как указывалось выше, перед нами стояла задача получить пептидные производные антибиотиков тилозинового ряда, пептидный заместитель которых должен быть направлен условно «вверх» по РТ в сторону ПТЦ. С этой точки зрения было удобно заменить остаток микарозы на пептидный фрагмент.

И

Для сохранения направления пептидной цепи, которое она принимает в процессе биосинтеза белка на рибосоме, необходимо было присоединять пептиды к 4'-гидроксилу микаминозы N-концом, поэтому использовали линкер - остаток янтарной кислоты, содержащий две карбоксильные группы. Для получения 4'-пептидных производных были выбраны два пептида: глицил-/,-пролин и глицил-глицил-/,-пролин. Длина пептидных фрагментов варьировалась и была подобрана, исходя из данных рентгеноструктурного анализа комплексов 50S субъединиц рибосом с тилозином, с одной стороны, и с аналогами 3'-концевых участков аминоацил- и пептидил-тРНК, с другой.

Синтез выбранных пептидов был осуществлен в растворе путем последовательного присоединения аминокислотных остатков, начиная с С-конца, методом 1-гидроксибензотриазоловых эфиров, которые получали in situ. Для защиты N-концевых аминокислот использовали Вос-группу, карбоксильная группа пролина была защищена метиловым эфиром. Вос-защищенные пептиды очищали перекристаллизацией из смеси гексан - этилацетат. Удаление защитной Вос-группы проводили трифторуксусной кислотой при перемешивании при комнатной температуре в течение 30 мин. Выделение пептидов из реакционной смеси проводили экстракцией этилацетатом, очистку осуществляли перекристаллизацией из смеси этилацетата и диэтилового эфира. Пептид H-Gly-Pro-OMe не требовал дополнительной очистки, в то время как H-Gly-Gly-Pro-OMe очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле в системе хлороформ - метанол, 11:1.

Схема синтеза 4'-пептидных производных десмикозина, модифицированных по положению 4' остатками пролин-содержащих пептидов представлена ниже (Схема 2). Существенной проблемой при разработке метода оказалась селективная модификация 4'-ОН группы микаминозы. Сложность этого процесса обусловлена тем, что тилозин содержит пять гидроксильных групп, и четыре из них достаточно реакционноспособны. В связи с этим на первой стадии осуществляли ацетилирование 2'-, 2"-, 4"- и 4"'- ОН-групп тилозина уксусным ангидридом в присутствии пиридина и каталитических количеств ДМАП при комнатной температуре. В результате реакции образуется смесь три-, тетра- и пента-ацетильных производных тилозина (по положениям 2', 4", 4"', 3 ~ 3" - в порядке убывания реакционной способности) с преимущественным содержанием необходимого нам тетраацетилтилозина (XIII). Очистку продукта осуществляли методом колоночной хроматографии в системе хлороформ - метанол, 9:1, или в системе бензол - ацетон - хлороформ - уксусная кислота, 100:50:60:2. Далее тетраацетилтилозин (XIII) подвергался гидролизу в присутствии 1 н. серной кислоты в смеси вода - ацетонитрил, в результате чего был получен десмикозин, защищенный по всем реакционноспособным гидроксильным группам, кроме 4'-ОН группы микаминозы (соединение XIV). 4'-ОН группа образуется в результате гидролиза гликозидной связи между остатками углеводов - микаминозы и микарозы. Эта свободная ОН-группа вводилась в

12

реакцию с янтарным ангидридом в присутствии триэтиламина с раскрытием цикла янтарного ангидрида и образованием реакционноспособной карбоксильной группы (соединение XV).

СН,

XV

0^сн' н,с

М,С. ЛН, \ п

0 с?^^-04'

„^О^^ХХ^ЖРН

° ТНР.Е^ } ">'

XIV

г

Схема 2. Схема синтеза 4'-пептидных производных десмикозина, содержащих в положении 4' остатки пролин-содержащих пептидов.

Дальнейшую конденсацию аминогруппы пептидов Н-С1у-Рго-ОМс и Н-С1у-С1у-Рго-ОМе с карбоксильной группой производного (XV) проводили в присутствии активирующих агентов ОСС/НОШ. Строение продуктов (XVI) и (XVII) доказывали методами масс-спектрометрии, ЯМР-спектроскопии и аминокислотного анализа.

На последнем этапе проводилось удаление защитных ацетильных групп по известным методикам метанолом при нагревании в течение 48 ч с получением целевых соединений (XVIII) и (XIX). В качестве примесных продуктов по данным масс-спектрометрии были обнаружены производные с одной ацетильной группой. По-видимому, это ацетильная группа в положении 4" остатка мицинозы. Её удаление, по литературным данным, требует более жестких условий (присутствия основания).

Продукты реакций на каждой стадии были очищены колоночной хроматографией на силикагеле. Соединения были охарактеризованы методами масс-спектрометрии, ВЭЖХ. Модификация по положению 4' микаминозы была доказана методом ЯМР-спектроскопии. Характеристики полученных производных представлены в Таблице 2.

Таблица 2. Характеристики промежуточных и конечных соединений, полученных в процессе синтеза 4'-пептидных производных десмикозина

Соединение Шифр МАЬЭ1-М5 хЫг найд./вычисл. ВЭЖХ, г* (мин) Дополнительные характеристики Выход, %

Ту1Ас XIII 1084,5/1084,1 22,2 - 51

ОезАс XIV 856,4/855,9 - ЯМР 54

Ое$Ас-СО-(СН2)2-СООН XV 956,4/956,0 - ЯМР 63

Ое5Ас-СО-(СН2)2-СО-ГШ-СР-ОМе XVI 1124,5/1124,2 6,7 Аминокислотный анализ 30

Пе5Ас-СО-<СН2)2-СОГШ-ССР-ОМе XVII 1181,7/1181,2 6,5 Аминокислотный анализ 32

Ое5-СО-(СН2)2-СО-МН-СР-ОМе XVIII 1042,5/1040,0 - - 65

Ое8-СО-(СН2)2-СО-ГШ-ССР-ОМе XIX 642,9/642,6 682,9/682,7 (фрагменты) - - 47

* г- время удерживания вещества на колонке (градиент ацетонитрила 20-80% в 0,1% ТФУ за 30 мин.)

Таким образом, в рамках данной работы разработан принципиально новый способ введения пептидных заместителей в положение 4' микаминозы антибиотиков тилозинового ряда. Этот подход планируется использовать в дальнейшей работе нашей лаборатории.

4. Синтез флуоресцентных производных антибиотиков тилозинового ряда

В рамках данной работы были впервые синтезированы флуоресцентные производные антибиотиков тилозинового ряда. Флуоресцентные остатки родамина В, флуоресцеина, Alexa 488 были введены по положению С20 методом получения замещенных гидразонов или тиосемикарбазонов, образующихся при взаимодействии альдегидной группы антибиотика и ЫН2-фра[мС1па гидразидов или тиосемикарбазида, содержащих соответствующие флуоресцентные заместители.

Гидразид родамина В был получен из родамина В, содержащего карбоксильную группу, путем обработки последнего гидразин-гидратом при комнатной температуре. В случае гидразида Alexa Fluor 488 и флуоресцеин-тиосемикарбазида мы использовали коммерческие препараты.

Для получения замещенных гидразонов макролидов мы применяли условия, аналогичные разработанным для получения гидразона тилозина, замещенного остатком /,-карнитина (ацетатный буфер рН 4,7, 20°С) (Схема 3). При синтезе родаминовых производных тилозина и десмикозина (соединения XX и XXI) отличие методики состояло в том, что ввиду низкой растворимости гидразида родамина В в воде в реакционную смесь добавляли ДМСО до полного растворения.

Производное тилозина, содержащее остаток Alexa Fluor 488, (соединение XXIII), было получено также в виде замещенного гидразона. Реакция проводилась в натрий-ацетатном буфере рН 4,7 без добавления ДМСО, так как реагенты и продукты обладали хорошей растворимостью в воде. Производное тилозина, содержащее остаток флуоресцеина, (соединение XXII), было получено способом, заключающимся во взаимодействии альдегидной группы тилозина и NHi-группы флуоресцеин-тиосемикарбазида, в условиях, аналогичных описанным выше для получения замещенных гидразонов тилозина. Однако в этом случае реакция проходила не так однозначно, как в случае с родамином В. Очистка продуктов реакций осуществлялась методом колоночной хроматографии в системах хлороформ - метанол с различными соотношениями.

Характеристики полученных флуоресцентных производных антибиотиков тилозинового ряда представлены в Таблице 3. Все соединения охарактеризованы методами масс-спектрометрии, УФ-спектроскопии, ВЭЖХ, измерены спектры их флуоресценции. Модификация по положению С20 была доказана методом ЯМР-спектроскопии на примере соединения XX.

Схема 3. Схема синтеза флуоресцентных производных антибиотиков тилозинового ряда (ХХ-ХХШ). Таблица 3. Характеристики флуоресцентных производных антибиотиков тилозинового ряда.

Флуоресцентное производное MALDI MS, m/z найдено./вычисл. Флуоресцентные характеристики Другие характеристики Выход, %

Лга, пш Лет, пт условия

XX 1354,9/ 1355,5 575 553 вода-ацетонитрил г=19,2, ЯМР 80

XXI 1213,0/1213,4 573 554 метанол г=16,0 30

XXII 1317,5/1319,4 516 492 0,1М Tris рН 9,0 г=14,5 70

XXIII 1301,9/ 1301,3 ГМ - mycarosel 512 488 вода г=12,0 50

*т- время удерживания на колонке (мин) ВЭЖХ, градиент СН3СЫ в 0,1% ТФУ 20-80%

Таким образом, в рамках данной работы были получены производные антибиотиков тилозинового ряда, содержащие в положении С20 флуоресцентные заместители. Эти соединения могут быть использованы в дальнейшей работе по изучению механизмов связывания макролидов в РТ.

5. Изучение функциональной активности производных антибиотиков тилозинового ряда, содержащих остатки аминокислот и пептидов по положению С20

5.1. Изучение сродства производных антибиотиков тилозинового ряда к рибосоме. Характеристика комплексообразования антибиотик-рибосома

Основной задачей этого раздела работы являлась характеристика способности полученных С20 аминокислотных и пептидных производных антибиотиков тилозинового ряда специфически связываться с "макролидным" сайтом рибосомного туннеля (MBS).

Стандартным способом изучения связывания макролидных антибиотиков с рибосомой, позволяющим определять количественные параметры комплексообразования, является метод вытеснения из рибосомы радиоактивно меченого антибиотика той же группы. Метод основан на конкуренции между антибиотиками за сайт связывания в рибосомном туннеле. В нашем случае в качестве меченого макролида использовался [,4С]-эритромицин. Эксперимент включал в себя получение комплекса [,4С]-эритромицина с бактериальными рибосомами D.radiodurans и последующее его титрование растворами исследуемых антибиотиков и их производных в широком диапазоне концентраций (0,05 - 10 мкМ). Образовавшиеся комплексы сорбировали на нитроцеллюлозных фильтрах, фильтры отмывали от несвязавшегося [|4С]-эритромицина и измеряли уровень остаточной радиоактивности фильтров, который был пропорционален количеству оставшегося в комплексе с рибосомой [14С]-эритромицина. Из этих данных получали кривые зависимости количества связанного с рибосомой эритромицина от концентрации конкурирующих с ним за связывание модифицированных антибиотиков.

В совместной работе с группой Д. Вилсона (Генетический центр Мюнхенского университета, Мюнхен, Германия) этим методом было исследовано связывание производных антибиотиков тилозинового ряда, содержащих остатки аминокислот и коротких пептидов по положению С20 с 70S субъединицами рибосом D. radiodurans (Рис. 3). Кроме соединений, полученных в данной работе, исследовались пептидные производные тилозина и десмикозина, содержащие 2-аминооксиаланилаланиновый заместитель в положении 20 (Tyl-A2 (XXIV) и Des-A2 (XXV) соответственно), полученные ранее в нашей лаборатории. На графиках (Рис. 3) показано изменение уровня радиоактивности комплексов эритромицин-рибосома в присутствии антибиотиков в широком диапазоне концентраций (0,1 - 10 мкМ). Из данных этих экспериментов были рассчитаны константы диссоциации для немодифицированных антибиотиков и их С20 производных (Таблица 4).

17

O Tylosin Т Des

в омт

4 Tyl-Phe ф Des-Phe О OMT-Phe

4 6 Antibiotic [pM]

Рис. 3. Конкурентное вытеснение антибиотиками-макролидами тилозинового ряда и их С20 производными радиоактивно меченого [|4С]-эритромицина из комплекса с рибосомами О.гаЛ'ск/ига/и.

Таблица 4. Кажущиеся константы диссоциации комплексов рибосом /) .гас1ю£1ига№ с антибиотиками-макролидами и их производными.

Соединение Шифр Kd [нМ1*

Эритромицин 15

Тилозин I 0.65

Десмикозин II 0.3

ОМТ III 3

Ту1-Н2 IV не определено

Ту1-А2 XXIV 17.8

Des-A2 XXV 17.8

Tyl=Tyr VIII 109.1

Tyl-Tyr XI 14.2

Tyl=Ual X 3.6

Tyl-Car XII 0.6

Tyl-Phe V 3.6

Des-Phe VI 10.7

OMT-Phe VII 26.1

* - константы посчитаны по результатам трёх независимых экспериментов; средняя ошибка не превышала 10%

5.2. Изучение ингибигорных свойств производных антибиотиков тилозинового ряда, модифицированных остатками аминокислот и коротких пептидов по положению С20, в бесклеточной системе транскрнпции-трансляции зеленого флуоресцентного белка

В совместной работе с группой Д. Вилсона была изучена способность С20-модифицированных антибиотиков тилозинового ряда ингибировать биосинтез зеленого флуоресцентного белка (GFP) в бесклеточной системе транскрипции-трансляции. Уровень синтеза GFP определяли измерением интенсивности флуоресценции при 520 нм (длина волны возбуждающего света 488 нм) клеточного лизата, который содержал плазмиду с геном GFP и все необходимые компоненты для транскрипции и трансляции его мРНК. На графиках (Рис. 4) представлено изменение уровня флуоресценции, а, следовательно, и уровня образования GFP при увеличении концентрации С20-производных антибиотиков тилозинового ряда в клеточном лизате. Для сравнения эффективности антибиотиков и их производных были посчитаны значения концентраций, при которых наблюдается ингибирование трансляции GFP на 50% (1С50, Таблица 5).

GFP

О Tylosin

О Tylosin О ТуИТуг О Ту|-Туг ♦ Tyl-U V Tvl-Car О Ту1-Н2

О

О 0.5 1 1.5 2 25 Antibiotic [|jMJ

-—т-V-Ч //-**-

0 0.5 1 1.5 2 6 Antibiotic [рМ]

+ Tyl-Phe ф Des-Phe О OMT-Phe

О Tylosin Т Des

D ОМТ

Antibiotic [рМ]

Рис. 4. Ингибирование трансляции зеленого флуоресцентного белка GFP С20-модифицированными антибиотиками тилозинового ряда в бесклеточной системе транскрипции-трансляции.

Таблица 5.1С50 (мкМ) С20-производных антибиотиков тилозинового ряда, полученные в экспериментах по ингибированию биосинтеза зеленого флуоресцентного белка ОРР.

Соединение Шифр IC50 (мкМ)

Эритромицин 2.0

Тилозин I 0.3

Десмикозин II 0.7

ОМТ III не ингибирует >50 мкМ

Ту1-Н2 IV 4.0

Ту1-А2 XXIV 0.5

Des-A2 XXV 0.2

Ту1=Туг VIII 1.2

Tyl-Tyr XI 0.25

Tyl=Ual X 1.0

Tyl-Car XII 0.1

Tyl-Phe V 0.15

Des-Phe VI 0.3

OMT-Phe VII

* - 1С50 посчитаны по результатам трёх независимых экспериментов; средняя ошибка не превышала 10%

5.3. Антибактериальная активность С20 производных антибиотиков тилозинового ряда

В НИИ по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе РАМН была изучена антибиотическая активность некоторых из полученных нами производных тилозина, содержащих аминокислотные и пептидные заместители в положении С20, на стандартном наборе штаммов Staphylococcus и Enterococcus. Единственным аналогом, проявляющим антибактериальные свойства на одинаковом (или даже более высоком) уровне с немодифицированным тилозином, оказалось его производное, содержащее остаток карнитина.

6. Производные макролидов тилозинового ряда как потенциальные инструменты для изучения рибосомного туннеля

Как указывалось ранее, нашей главной задачей было исследование возможных контактов между аминокислотными остатками образующейся в процессе трансляции полипептидной цепи белка и нуклеотидными остатками 23 S рРНК, формирующими стенки РТ в той его области, которая примыкает к ПТЦ. Нами была получена серия производных антибиотиков тилозинового ряда, содержащих в положении С20 остатки аминокислот различной природы. Как уже отмечалось, выбор С20-производных макролидов определялся тем, что рентгеноструктурный анализ комплекса аланилаланинового производного тилозина по

этому положению выявил контакты пептидного остатка с функционально важным нуклеотидом А2062, расположенным в т.н. «адениновом кармане» РТ. Более того, связывание пептидного фрагмента в «адениновом кармане» вызывало сильное изменение конформации А2062.

Характерная особенность антибиотиков тилозинового ряда заключается в том, что, связываясь со специфическим «макролидным сайтом» рибосомы, они образуют ковалентную связь с аминогруппой аденинового основания в А2062, благодаря наличию у них ацетальдегидной группы в положении С20. Модификация макролидов по альдегидной группе исключала образование такой ковалентной связи.

В качестве «реперного» производного тилозина, лишеннного не только возможности ковалентно связываться с А2062, но и вступать с ним в какие бы ни было нековалентные взаимодействия, мы использовали антибиотик, альдегидная группа которого была восстановлена до гидроксильной (Tyl-H2 (IV)). Это соединение практически не подавляло трансляцию мРНК зеленого флуоресцентного белка (Таблица 5) и не конкурировало с радиоактивно меченым эритромицином за образование комплекса с 50S субчастицей рибосомы даже при концентрациях, превышающих концентрацию эритромицина в 100 раз (Таблица 4). Отсюда можно сделать вывод, что образование ковалентной связи является критичным для нормального функционирования антибиотика.

Как видно из данных, представленных в Таблицах 4 и 5 и на Рис. 3 и 4, включение в положение С20 тилозина аланилаланинового остатка (соединение XXIV) в значительной степени восстанавливало сродство к рибосоме и ингибирующую активность, хотя и не до уровня немодифицированного антибиотика. Важно также, что остаток Ala-Ala существенно повышал ингибирующую активность десмикозина, компенсируя таким образом не только отсутсвие ковалентоной связи, но и остатка микарозы. Согласно данным РСА, остаток Ala-Ala располагается в «адениновом кармане» параллельно плоскости гетероциклического основания А2062 (Рис. 5). Такая ориентация обусловлена гидрофобными взаимодействиями остатков аланина с аденином, а также пока еще достоверно не идентифицированными взаимодействиями другой природы (например, образованием водородных связей между карбонильным атомом кислорода пептидного остова и сахарофосфатными остатками). Логично было предположить, что замена остатка Ala-Ala на ароматические и гетероциклические аминокислоты существенно улучшит связывание антибиотика с РТ, поскольку в этом случае можно ожидать стэкинг-взаимодействия между аденином в А2062 боковыми группами аминокислотных остатков.

Однако, для серии соединений, в которых остатки аминокислот образовывали с тилозином основания Шиффа, таких эффектов мы не наблюдали: тилозин, содержащий остаток

урацилилаланина (Tyl=Ual (X)), обладал ингибирующей активностью в 2 раза ниже, чем Ту1-А2 (XXIV). Активность и сродство к рибосоме Tyl=Tyr (VIII) также оказались значительно хуже,

I

Tyl-A2

Рис. 5. Схематическое расположение тилозина (I) и Tyl-A2 (XXIV) в рибосомном туннеле по данным РСА.: (а) образование ковалентной связи между альдегидной группой тилозина (I) и аминогруппой А2062; (b) Ту1-А2 (XXIV) в РТ.

чем у Tyl-A2 (XXIV) (Рис. 3 и 4). Возможно, что наличие двойной связи в линкере уменьшает его гибкость и ограничивает конформационную подвижность боковой аминокислотной цепи. Действительно, после восстановления основания Шиффа в соединении VIII был получен Tyl-Tyr (XI), ингибирующая активность которого в экспериментах по транскрипции-трансляции была намного выше (сравнимая с активностью тилозина), чем у Tyl=Tyr (VIII) и Tyl-A2 (XXIV) (Рис. 3 и 4). Эти данные подтверждают предположение о наличии стэкинг-взаимодействий между остатком тирозина и А2062 (Рис. 6).

А2062

С2586

А2062f

Рис. 6. Модель, описывающая расположение Tyl-Tyr (VIII) в РТ, основанная на результатах РСА комплекса Tyl-A2 (XXIV) с рибосомой и изучении функциональной активности Tyl-Tyr (VIII).

Рис. 7. Модель, описывающая расположение Ту1-РЬе (V) в РТ. Видно возможное образование стэкинг-взаимодействия между остатком фенилаланина и нуклеотидами «аденинового кармана»

Серия производных, в которых тилозин, десмикозин и ОМТ модифицированы остатком фенилаланина с использованием удлиненного (оксимного) линкера, (соединения V-VII), обладала высоким сродством к рибосоме. Более того, Tyl-Phe (V) оказался очень сильным ингибитором трансляции GFP - в 3 раза сильнее, чем тилозин (I); в 5 раз сильнее, чем Tyl-A2 (XXIV) и в 40 раз сильнее, чем Tyl-H2 (IV). Соединения Des-Phe (VI) и OMT-Phe (VII) также оказались гораздо активнее немодифицированных антибиотиков; особенно сильный эффект наблюдался в случае фенилаланинового производного ОМТ, поскольку сам ОМТ практически не ингибирует трансляцию мРНК GFP (Рис. 4). Согласно данным компьютерного моделирования, часть модифицирующего остатка, несущего фенилаланин, взаимодействует с А2062, в то время как его ароматическое кольцо, скорее всего, находится в конформации, позволяющей стэкинг-взаимодействие с основанием С2586, расположенном на противоположной стенке «аденинового кармана» (Рис. 7). В настоящее время структура комплекса Tyl-Phe с 50S субчастицей рибосомы изучается метом РСА в лаборатории П.Фучини (Франкфуртский университет, Германия).

Большой интерес представляла оценка возможного участия во взаимодействии с боковыми радикалами аминокислотных остатков фосфатных групп фрагмента сахаро-фосфатного остова 23S рРНК, расположенного в «адениновом кармане». С этой целью был получен тилозин, содержащий остаток карнитина в положении С20 (XII); карнитин имеет постоянный положительный заряд. Как видно из графиков (Рис. 3 и 4), Tyl-Car (XII) обладает высокими ингибирующей активностью и сродством к рибосоме, сравнимыми по уровню с исходным немодифицированным тилозином. Следовательно, введение остатка карнитина (несмотря на его гидрофильность) компенсирует отсутствие ковалентной связи между альдегидной группой тилозина и аминогруппой А2062, благодаря взаимодействию с отрицательно заряженными фосфатами группами РТ (Рис. 8).

Рис. 8. Модель, показывающая расположение Tyl-Car (XII) в РТ. Видно, что заряженная аминогруппа карнитина сближена с фосфатными остатками нуклеотидов 23S рРНК в «адениновом кармане».

А2062

Легко заметить, что для многих соединений, полученных и исследованных в настоящей работе, не наблюдается корреляции между способностью конкурировать с эритромицином за связывание с рибосомой и их способностью ингибировать биосинтез белка. Этот факт, однако, не является неожиданным, поскольку эти процессы кардинально различаются. Известно, что связывание макролидов с их специфическим сайтом в РТ -процесс, по крайней мере, двухстадийный. На первой стадии (быстрой) антибиотики образуют нестабильные комплексы с участками, расположенными поблизости от входа в РТ. На второй стадии (медленной), происходит изменение конформации антибиотика, и он глубже погружается в туннель, занимая свое постоянное место. Если первая стадия процесса определяется в основном гидрофобными взаимодействиями, то вторая - гидрофильными группами антибиотика. Ясно, что заместители в модифицированных макролидах должны существенно влиять на кинетику связывания, что не может не отразиться на величинах кажущихся констант диссоциации комплексов. Когда же процесс связывания антибиотика завершится, его способность ингибировать трансляцию будет определяться не только стабильностью образовавшегося комплекса, но и особенностями его строения, поскольку от них также зависит возможность (или невозможность) продвижения вновь синтезируемой пептидной цепи по туннелю.

Как уже упоминалось, долгое время считалось, что РТ служит только пассивным каналом для выхода растущего пептида из рибосомы. В частности, из-за преимущественно гидрофильной природы строения стенок РТ и отсутствия достаточно больших гидрофобных участков, которые могли бы взаимодействовать с гидрофобными фрагментами растущей цепи. Наши результаты показывают, что некоторые аминокислоты и аминокислотные последовательности действительно вовлечены во взаимодействия с участками РТ. Эти взаимодействия могут иметь как гидрофобную, так и гидрофильную природу. В частности, мы предполагаем наличие стэкинг-взаимодействий между ароматическими аминокислотами и гетероциклом нуклеотида А2062, а также взаимодействия отрицательно заряженных фосфатов с заряженными остатками растущей цепи. Результаты нашего исследования дают возможность предположить, что в районе нуклеотида А2062 действительно есть все структурно-функциональные предпосылки для существования взаимодействия с растущей пептидной цепью, а, следовательно, мониторинга растущей цепи и осуществления механизмов регуляции её роста.

Выводы

1) Получена серия новых аминокислотных производных антибиотиков тилозинового ряда, содержащих по положению С20 остатки гидрофобных, гидрофильных, ароматических и гетероциклических аминокислот.

2) Предложен способ получения пептидных производных по положению С4' десмикозина.

3) Впервые осуществлен синтез флуоресцентных производных антибиотиков тилозинового ряда, содержащих в положении С20 остатки родамина В, флуоресцеина, Alexa Fluor 488.

4) При изучении связывания полученных производных антибиотиков тилозинового ряда с бактериальными рибосомами и их способности ингибировать биосинтез белка в бесклеточной системе выявлен потенциальный сенсорный элемент рибосомного туннеля (А2062), способный осуществлять мониторинг аминокислотной последовательности растущей пептидной цепи и участвовать в регуляции трансляции.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Karpenko V.V., Sumbatyan N.V., Korshunova G.A. Bogdanov A.A. Synthesis of desmycosin analogs containing peptides at 4'-position. In: Peptides-2008. Proceedings of 30th European Peptide Symposium, Helsinki. P.192-193.

2. Сумбатян H.B., Кузнецова И.В., Карпенко B.B.. Федорова Н.В., Чертков В.А., Коршунова Г.А., Богданов A.A. Аминокислотные и пептидные производные макролидных антибиотиков тилозинового ряда по альдегидной группе. Биоорганическая химия. 2010. Т. 36. No. 2. С. 265-276.

3. Сумбатян Н.В., Федорова Н.В., Шишкина A.B., Карпенко В.В.. Коршунова Г.А. Пептидные производные макролидных антибиотиков. II Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. Санкт-Петербург, 25-27 мая 2005 г. Тезисы докладов и стендовых сообщений. С. 117.

4. Карпенко В.В.. Сумбатян Н.В. Синтез и свойства производных тилозина, модифицированных по 20-положению. XIII Международная научная конференция для студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2006».

5. Богданов A.A., Сумбатян Н.В., Шишкина A.B., Карпенко В.В.. Коршунова Г.А. Пептидные производные антибиотиков-макролидов: новые инструменты для изучения механизма регуляции трансляции. Ill Российский симпозиум "Белки и пептиды», Пущино-2007. Тезисы докладов. С. 54.

6. Карпенко В.В.. Чешков Д.А., Сумбатян Н.В., Чертков В.А. Сравнительная характеристика конформационного состояния макролидных антибиотиков тилозина и десмикозина по данным ЯМР-спектроскопии. XV Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем», Яльчик, 2008 г. С. 93.

7. Karpenko V.. Sumbatyan N., Korshunova G., Bogdanov A. Synthesis of desmycosin analogs containing peptides at 4'-position. 30th European Peptide Symposium, Helsinki, Finland, 31 August - 5 September, 2008. J. Peptide Sei. 2008. Suppl. V. 14. Issue 8. P. 79.

8. Богданов A.A., Сумбатян H.B., Шишкина A.B., Карпенко B.B.. Коршунова Г.А. Роль рибосомного туннеля в регуляции трансляции: структурные аспекты. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. Москва-Пушино, 28 сентября - 2 октября 2009 г. Сборник тезисов. Т. 1. С. 10.

Заказ № б8-а/03/10 Подписано в печать 16.03.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровнчок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:Ьф@с/г.т

Список сокращений.

Глава 1. Антибиотики тилозинового ряда и их химическая модификация (Обзор литературы).

1.1. Макролиды.

1.1.1. Общие сведения о макролидах и кетолидах.

1.1.2. Сайт связывания макролидных антибиотиков.

1.1.3. Роль альдегидной группы С20 в связывании макролидов в рибосомном туннеле. Особенности нуклеотида А2062.

1.1.4. Механизм действия макролидов.

1.1.5. Резистентность бактерий к макролидам.

1.2. Физические свойства и химическая модификация антибиотиков тилозинового ряда.

1.2.1. Физико-химические свойства антибиотиков тилозинового ряда.

1.2.2. Химические свойства антибиотиков тилозинового ряда.

1.2.3. Реакции гидролиза, восстановления и окисления антибиотиков тилозинового ряда.

1.2.4. Химическая модификация альдегидной группы антибиотиков тилозинового ряда. Получение производных по положению С20.

1.2.5. Химическая модификация С9 кетогруппы антибиотиков тилозинового ряда.

1.2.6. Реакции присоединения по двойной связи С10-С11 лактонного кольца.

1.2.7. Химические модификации остатков Сахаров тилозина и его производных

1.2.8. Химические модификации ОМТ по положению С23.

Глава 2. Обсуждение результатов.

2.1. Получение производных антибиотиков тилозинового ряда, содержащих остатки аминокислот и пептидов по положению С20.

2.1.1. Получение замещенных оксимов по положению С20 антибиотиков тилозинового ряда. Синтез производных тилозина, десмикозина и ОМТ, содержащих остатки Ь-фенилаланина.

2.1.2. Получение оснований Шиффа тилозина с остатками ароматических и нуклеоаминокислот.

2.1.3. Получение замещенного гидразона тилозина, содержащего остаток ¿-карнитина по положению С20.

2.2. Синтез пептидных производных десмикозина по 4-положению микаминозы.

2.3. Синтез флуоресцентных производных антибиотиков тилозинового ряда.

2.4. Изучение антибиотиков тилозинового ряда методом ЯМР-спектроскопии.

2.5. Изучение функциональной активности производных антибиотиков тилозинового ряда, содержащих остатки аминокислот и пептидов по положению С20.

2.5.1. Изучение сродства производных антибиотиков тилозинового ряда к рибосоме. Характеристика комплексообразования антибиотик-рибосома.

2.5.2. Изучение ингибиторных свойств производных антибиотиков тилозинового ряда, модифицированных остатками аминокислот и коротких пептидов по положению С20, в бесклеточной системе транскрипции-трансляции зеленого флуоресцентного белка GFP.

2.5.3. Антибактериальная активность С20 производных антибиотиков тилозинового ряда.

2.6. Производные макролидов тилозинового ряда как потенциальные инструменты для изучения рибосомного туннеля.

Глава 3. Экспериментальная часть.

3.1. Исходные вещества и вспомогательные реагенты.

3.2. Методы.

3.3. Методики получения соединений.

3.3.1. Получение производных аминокислот и пептидов.

3.3.2. Получение С20-производных макролидов.

3.3.3. Получение пептидных производных десмикозина по 4'-положению.

3.3.4. Получение флуоресцентных производных тилозина и десмикозина.

3.3.5. Биохимические методы исследования.

Выводы.

Изучение механизма биосинтеза белка, в частности, изучение механизма функционирования рибосомы остается одной из важнейших проблем молекулярной биологии и биохимии.

Рибосомный туннель (РТ) является одним из наименее изученных функциональных центров рибосомы. Долгое время считалось, что он служит лишь пассивным каналом для прохождения растущей полипептидной цепи. Однако позже было показано, что полипептидная цепь, образующаяся в процессе биосинтеза белка на рибосоме, может вступать в специфические взаимодействия с участками РТ, благодаря чему осуществляются механизмы общей регуляции трансляции, а также начальные этапы фолдинга растущего пептида. При этом взаимодействия внутри РТ могут приводить к остановке работы рибосомы. Молекулярные механизмы таких взаимодействий на данный момент не известны. Из результатов недавних исследований РТ можно предположить, что одним из важнейших его элементов, вовлеченных в узнавание последовательности растущей полипептидной цепи, является нуклеотидный остаток А2062 23S рРНК, расположенный рядом с пептидилтрансферазным центром рибосомы.

Ранее в нашей лаборатории для изучения взаимодействий синтезируемой полипептидной цепи со структурными элементами РТ был предложен новый подход, основанный на применении макролидных антибиотиков тилозиновой группы. Макролиды представляют собой класс природных, а также полусинтетических антибиотиков, построенных на основе 12-16-членного лактонного кольца, к которому присоединены один или более углеводных заместителей. Макролиды относятся к наиболее широко используемым клиническим и ветеринарным антибактериальным препаратам. Механизм действия антибиотиков-макролидов, в том числе тилозина и его аналогов, заключается в том, что они ингибируют биосинтез белка, связываясь в специфическом сайте РТ (т.н. "макролидном сайте», MBS) и закрывая при этом просвет для выхода растущей полипептидной цепи. Модифицируя тилозин по разным положениям остатками аминокислот и коротких пептидов, можно получить соответствующие производные антибиотика, которые представляют интерес как потенциальные зонды для исследования взаимодействий синтезируемой цепи с РТ: в этих соединениях антибиотик выполняет роль "якоря", расположенного строго в MBS, а аминокислотный или пептидный остаток моделирует полипептидную цепь.

Кроме того, известно, что для изучения функционирования рибосомы и процесса трансляции удобными являются флуоресцентные методы исследования. В частности, флуоресцентные метки могут использоваться: для изучения пептидилтрансферазной реакции, для определения конформации пептидов в РТ, для изучения связывания немеченых производных макролидов методом конкурентного вытеснения.

Целью настоящей работы являлось получение аминокислотных, пептидных и флуоресцентных аналогов макролидных антибиотиков тилозинового ряда по положениям С20 и С4', которые могут служить инструментами для изучения функционирования рибосомы. Новые исследования путей передачи сигналов в рибосоме и регуляции процесса биосинтеза белка не только расширят фундаментальные знания о механизмах функционирования биологических систем, но и позволят в будущем на основе рационального «драг-дизайна» создавать селективные антибиотики, активные против резистентных штаммов бактерий.

Выводы

1) Получена серия новых аминокислотных производных антибиотиков тилозинового ряда, содержащих по положению С20 остатки гидрофобных, гидрофильных, ароматических и гетероциклических аминокислот.

2) Предложен способ получения пептидных производных по положению С4' десмикозина.

3) Впервые осуществлен синтез флуоресцентных производных антибиотиков тилозинового ряда, содержащих в положении С20 остатки родамина В, флуоресцеина, Alexa Fluor 488.

4) При изучении связывания полученных производных антибиотиков тилозинового ряда с бактериальными рибосомами и их способности ингибировать биосинтез белка в бесклеточной системе выявлен потенциальный сенсорный элемент рибосомного туннеля (А2062), способный осуществлять мониторинг аминокислотной последовательности растущей пептидной цепи и участвовать в регуляции трансляции.

1. Yonath A: Antibiotics targeting ribosomes: resistance, selectivity, synergism, and cellular regulation. Annu Rev Biochem 2005, 74:649-679.

2. Omura S: Macrolide Antibiotics: Chemistry, Biology, and Practice: 2nd edition. Academic Press; 2002.

3. Schlunzen F, Zarivach R, Harms J, Bashan A, Tocilj A, Albrecht R, Yonath A, Franceschi F: Structural basis for the interaction of antibiotics with the peptidyl transferase centre in eubacteria. Nature 2001, 413:814-821.

4. Hansen JL, Ippolito JA, Ban N, Nissen P, Moore PB, Steitz ТА: The structures of four macrolide antibiotics bound to the large ribosomal subunit. Mol Cell 2002,10:117-128.

5. Wilson DN, Harms JM, Nierhaus KH, Schlunzen F, Fucini P: Spccies-specific antibiotic-ribosome interactions: implications for drug development. Biol Chem 2005, 386:1239-1252.

6. Страчунский JIC, Козлов CH: Макролиды в современной клинической практике, www.antibiotics.ru/books/macrolid/

7. Poehlsgaard J, Douthwaite S: Macrolide antibiotic interaction and resistance on the bacterical ribosome. Curr Opin Investig Drugs 2003, 4:140-148.

8. Harms J, Bartels H, Schlunzen F, Yonath A: Antibiotics acting on the translational machinery. J Cell Science 2003,116:1391-1393.

9. Omura S, Nakagawa A, Machida M, Imai H: Evidence for configurational identity between leucomycin and tylosin. Tetrahedron Letters 1977:1045-1048.

10. Omura S, Naganawa A: Chemical and biological studies on 16-membered macrolide antibiotics. JAntibiot (Tokyo) 1975, 28:401-433.

11. Kanfer I, Skinner MF, Walker RB: Analysis of macrolide antibiotics.

12. JChromatogr A 1998, 812:255-286.

13. Kirst H, Sides G: New directions for macrolide antibiotics: structural modifications and in vitro activity. Antimicrob Agents Chemother 1989, 33:1413-1418.

14. Lawrence LE: ABT-773 (Abbott Laboratories). Curr Opin Investig Drugs 2001,2:766-772.

15. Dougherty TJ, Barrett JF: ABT-773: a new ketolide antibiotic. Expert Opin Investig Drugs 2001,10:343-351.

16. Zhong P, Shortridge V: The emerging new generation of antibiotic: ketolides. Curr Drug Targets Infect Disord 2001,1:125-131.

17. Douthwaite S, Champney WS: Structures of ketolides and macrolides determine their mode of interaction with the ribosomal target site. J

18. Antimicrob Chemother 2001, 48 Suppl Tl:l-8.

19. McGuire J, Bonience W, Higgens C, Hoehn M, Stark W, Westhead J, Wolfe R: Tylosin, a new antibiotic. I. Microbiological studies. Antibiot & Chemoth 1961,11:320-327.

20. Baltz RH, Seno ET, Stonesifer J, Wild GM: Biosynthesis of the macrolide antibiotic tylosin. A preferred pathway from tylactone to tylosin. J Antibiot (Tokyo) 1983,36:131-141.

21. Hamill RL, Haney ME, McGuire JM, Stamper MC: Antibiotics tylosin and desmycosin and derivatives thereof. 1965, Apr. 13, U.S. Pat. №3178341.

22. Baltz RH, Wild GM: Process for the production of mycaminosyltylonolide.1985, Aug.27, U.S. Pat. №4537957.

23. Ganguly AK, Liu Y, Mallams AK: 23-DemycinosyItylosin compositions andmethod of use. 1984, Mar. 13, U.S. Pat. №4436729.

24. Omura S, Nakagawa A: 20-Amino tylosin derivatives. 1984, G.B. Pat. №2115813 A.

25. Gorman M, Morin RB: O-mycaminosyl tylonolide and a process for thepreparation thereof. 1969, Aug. 5, U.S. Pat. №3459853.

26. Omura S, Sadakane N, Kitao C, Matsubara H, Nakagawa A: Production of mycarosyl protylonolide by a mycaminose idiotroph from the tylosin-producing strain Streptomyces fradiae KA-427. J Antibiot (Tokyo) 1980, 33:913-914.

27. Voss NR, Gerstein M, Steitz TA, Moore PB: The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. JMol Biol 2006, 360:893-906.

28. Moore PB, Steitz TA: The structural basis of large ribosomal subunitfunction. Amu Rev Biochem 2003, 72:813-850.

29. Mankin AS: Macrolide myths. Curr Opin Microbiol 2008, 11:414-421.

30. Hansen LH, Mauvais P, Douthwaitc S: The macrolide-ketolide antibiotic binding site is formed by structures in domains II and V of 23S ribosomal RNA. Mol Microbiol 1999, 31:623-631.

31. Poulsen SM, Kofoed C, Vester B: Inhibition of the ribosomal peptidyl transferase reaction by the mycarose moiety of the antibiotics carbomycin, spiramycin and tylosin. JMol Biol 2000, 304:471-481.

32. Liu M, Douthwaite S: Resistance to the macrolide antibiotic tylosin is conferred by single methylations at 23S rRNA nucleotides G748 and A2058 acting in synergy. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99:14658-14663.

33. Lai CJ, Weisblum B: Altered methylation of ribosomal RNA in an erythromycin-resistant strain of Staphylococcus aureus. Proc Natl Acad Sci USA 1971,68:856-860.

34. Skinner R, Cundliffe E, Schmidt FJ: Site of action of a ribosomal RNA methylase responsible for resistance to erythromycin and other antibiotics.

35. J Biol Chem 1983, 258:12702-12706.

36. Douthwaite S, Hansen LH, Mauvais P: Macrolide-ketolide inhibition of MLS-resistant ribosomes is improved by alternative drug interaction with domain II of 23S rRNA. Mol Microbiol 2000, 36:183-193.

37. Douthwaite S: Functional interactions within 23S rRNA involving the peptidyltransferase center. JBacteriol 1992,174:1333-1338.

38. Sigmund CD, Morgan EA: Erythromycin resistance due to a mutation in a ribosomal RNA operon of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sei USA 1982, 79:5602-5606.

39. Weisblum В: Erythromycin resistance by ribosome modification.

40. Antimicrob Agents Chemother 1995, 39:577-585.

41. Манькии А: Рибосомные антибиотики. Молекулярная биология 2001, 35:597-609.

42. Vester В, Douthwaite S: Macrolide resistance conferred by basesubstitutions in 23S rRNA. Antimicrob Agents Chemother 2001, 45:1-12.

43. Gregory ST, Dahlberg AE: Erythromycin resistance mutations in ribosomal proteins L22 and L4 perturb the higher order structure of 23 S ribosomal RNA. J Mol Biol 1999, 289:827-834.

44. Gabasvili IS, Gregory ST, Valle M, Grassucci R, Worbs M, Wahl MC, Dahlberg AE, Frank J: The polypeptide tunnel system in the ribosome and its gating in erythromycin resistance mutants of L4 and L22. Mol Cell 2001, 8:181-188.

45. Garza-Ramos G, Xiong L, Zhong P, Mankin A: Binding site of macrolide antibiotics on the ribosome: new resistance mutation identifies a specific interaction of ketolides with rRNA. JBacteriol 2001,183:6898-6907.

46. Petropoulos AD, Kouvela EC, Dinos GP, Kalpaxis DL: Stepwise binding of tylosin and erythromycin to Escherichia coli ribosomes, characterized by kinetic and footprinting analysis. J Biol Chem 2008, 283:4756-4765.

47. Moazed D, Noller HF: Chloramphenicol, erythromycin, carbomycin and vernamycin В protect overlapping sites in the peptidyl transferase region of 23S ribosomal RNA. Biochimie 1987, 69:879-884.

48. Rodriguez-Fonseca C, Amils R, Garrett RA: Fine structure of the peptidyl transferase centre on 23 S-like rRNAs deduced from chemical probing of antibiotic-ribosome complexes. JMol Biol 1995,247:224-235.

49. Sutcliffe JA: The Search for New Antibiotics Targeting the 50S Ribozyme.

50. Features 2004, 70:513-519.

51. Auerbach T, Bashan A, Yonath A: Ribosomal antibiotics: structural basis for resistance, synergism and selectivity. Trends Biotechnol 2004, 22:570-576.

52. Steitz TA: On the structural basis of peptide-bond formation and antibiotic resistance from atomic structures of the large ribosomal subunit.

53. FEBSLett 2005, 579:955-958.

54. Jenni S, Ban N.: The chemistry of protein synthesis and voyage through the ribosomal tunnel. Curr Opin Investig Drugs 2003,13:212-219.

55. Tu D, Blaha G, Moore PB, Steitz TA: Structures of MLSBK antibiotics bound to mutated large ribosomal subunits provide a structural explanation for resistance. Cell 2005,121:257-270.

56. McGhee JD, von Hippel PH: Formaldehyde as a probe of DNA structure. I. Reaction with exocyclic amino groups of DNA bases. Biochemistry 1975, 14:1281-1296.

57. Yan K, Hunt E, Berge J, May E, Copeland RA, Gontarek RR: Fluorescence polarization method to characterize macrolide-ribosome interactions.

58. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49:3367-3372.

59. Ban N, Nissen P, Hansen J, Moore PB, Steitz TA: The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science 2000, 289:905-920.

60. Yonath A, Leonard KR, Wittmann HG: A tunnel in the large ribosomal subunit revealed by three-dimensional image reconstruction. Science 1987, 236:813-816.

61. Nakatogawa H, Ito K: The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell 2002,108:629-636.

62. Gong F, Yanofsky C: Instruction of translating ribosome by nascent peptide. Science 2002, 297:1864-1867.

63. Tenson T, Ehrenberg M: Regulatory nascent peptides in the ribosomal tunnel. Cell 2002,108:591-594.

64. Seidelt B, Innis CA, Wilson DN, Gartmann M, Armache JP, Villa E, Trabuco L, Becker T, Mielke T, Schulten K: Structural insight into nascent polypeptide chain-mediated translational stalling. Science 2009, 326:1412-1415.

65. Vazquez-Laslop N, Thum C, Mankin AS: Molecular mechanism of drug-dependent ribosome stalling. Mol Cell 2008,30:190-202.

66. Bayfield MA, Thompson J, Dahlberg AE: The A2453-C2499 wobble base pair in Escherichia coli 23S ribosomal RNA is responsible for pH sensitivity of the peptidyltransferase active site conformation. Nucleic Acids Res 2004, 32:5512-5518.

67. Muth GW, Ortoleva-Donnelly L, Strobel SA: A single adenosine with a neutral pKa in the ribosomal peptidyl transferase center. Science 2000, 289:947-950.

68. Gaynor M, Mankin AS: Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance. Curr Top Med Chem 2003, 3:949-961.

69. Contreras A, Vazquez D: Cooperative and antagonistic interactions of peptidyl-tRNA and antibiotics with bacterial ribosomes. Eur J Biochem 1977, 74:539-547.

70. Mao JC, Robishaw EE: Erythromycin, a peptidyltransferase effector.

71. Biochemistry 1972,11:4864-4872.

72. Menninger JR, Otto DP: Erythromycin, carbomycin, and spiramycin inhibit protein synthesis by stimulating the dissociation of peptidyl-tRNA from ribosomes. Antimicrob Agents Chemother 1982,21:811-818.

73. Champney WS, Burdine R: Macrolide antibiotics inhibit 50S ribosomal subunit assembly in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 1995, 39:2141-2144.

74. Tenson T, Lovmar M, Ehrenberg M: The mechanism of action of macrolides, lincosamides and streptogramin B reveals the nascent peptide exit path in the ribosome. J Mol Biol 2003, 330:1005-1014.

75. Usary J, Champney WS: Erythromycin inhibition of 50S ribosomal subunit formation in Escherichia coli cells. Mol Microbiol 2001, 40:951-962.

76. Champney WS, Tober CL: Inhibition of translation and 50S ribosomal subunit formation in Staphylococcus aureus cells by 11 different ketolide antibiotics. Curr Microbiol 1998, 37:418-425.

77. Normark BH, Normark S: Evolution and spread of antibiotic resistance.

78. J Intern Med 2002, 252:91-106.

79. Levy SB, Marshall B: Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses. Nat Med2004,10:SI22-129.

80. Lipsitch M: The rise and fall of antimicrobial resistance. Trends Microbiol 2001,9:438-444.

81. Matsuoka M, Inoue M, Endo Y, Nakajima Y: Characteristic expression of three genes, msr(A), mph(C) and erm(Y), that confer resistance to macrolide antibiotics on Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett 2003, 220:287-293.

82. Furneri PM, Rapazzo G, Musumarra M, Pietro P, Catania LS, Roccasalva LS: Two new point mutations at A2062 associated with resistance to 16-membered macrolide antibiotics in mutant strains of Mycoplasma hominis. Antibiot & Chemoth 2001, 45:2958-2960.

83. Nakajima Y: Mechanisms of bacterial resistance to macrolide antibiotics.

84. J Infect Chemother 1999, 5:61-74.

85. Kamimiya S, Weisblum B: Induction of ermSV by 16-membered-ring macrolide antibiotics. Antimicrob Agents Chemother 1997, 41:530-534.

86. Douthwaite S, Crain PF, Liu M, Poehlsgaard J: The tylosin-resistance methyltransferase RImA(II) (TIrB) modifies the N-l position of 23S rRNA nucleotide G748. J Mol Biol 2004, 337:1073-1077.

87. Pfíster P, Corti N, Hobbie S, Bruell C, Zarivach R, Yonath A, Bottger EC: 23S rRNA base pair 2057-2611 determines ketolide susceptibility and fitness cost of the macrolide resistance mutation 2058A—>G. Proc Natl Acad Sci USA 2005,102:5180-5185.

88. Katz L, Ashley GW: Translation and protein synthesis: macrolides. Chem Rev 2005, 105:499-528.

89. Martel A, Baele M, Devriese LA, Goossens H, Wisselink HJ, Decostere A, Haesebrouck F: Prevalence and mechanism of resistance against macrolides and lincosamides in Streptococcus suis isolates. Vet Microbiol 2001, 83:287297.

90. Culic O, Erakovic V, Parnham MJ: Anti-inflammatory effects of macrolide antibiotics. Ear J Pharmacol 2001, 429:209-229.

91. Braga PC: Relationship between differences in 16-, 14-, and 15-membered ring macrolides and Streptococcus pyogenes resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2002, 21:146-148.

92. Tensón T, DeBlasio A, Mankin A: A functional peptide encoded in the Escherichia coli 23S rRNA. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93:5641-5646.

93. Tensón T, Xiong L, Kloss P, Mankin AS: Erythromycin resistance peptides selected from random peptide libraries. J Biol Chem 1997, 272:17425-17430.

94. Tensón T, Mankin AS: Short peptides conferring resistance to macrolide antibiotics. Peptides 2001,22:1661-1668.

95. Vimberg V, Xiong L, Bailey M, Tenson T, Mankin A: Peptide-mediated macrolide resistance reveals possible specific interactions in the nascent peptide exit tunnel. Mol Microbiol 2004, 54:376-385.

96. Lomvar M, Nilsson K, Vimberg V, Tenson T, Nervakk M, Ehrenberg M: The molecular mechanism of peptide-mediated erythromycin resistance. J Biol Chem 2006, 281:6742-6750.

97. Merck index-, 1976, 9th edition.

98. Paesen J, Cypers W, Pauwels K, Roets E, Hoogmartens J: Study of the stability of tylosin A in aqueous solutions. J Pharm Biomed Analysis 1995, 13:1153-1159.

99. Morin R, Gorman M: O-Mycamynosil tylonolide and process for the preparation thereof. 1969, U.S. Pat. №3459853.

100. Kirst HA, Toth JE: C-20-Modified macrolide derivatives of the macrolide antibiotics tylosin, desmycosin, macrocin, and lactenocin. 1984, Apr. 17, U.S. Pat. №4443436.

101. Debono M: C-23-substituted mycaminosyltylonolide compounds, pharmaceutical compositions and methods of use. 1986, Aug.5, U.S. Pat. №4604380.

102. Phan LT, Jian T, Chen Z, Qiu YL, Wang Z, Beach T, Polemeropoulos A, Or YS: Synthesis and antibacterial activity of a novel class of 4'-substituted 16-membered ring macrolides derived from tylosin. J Med Chem 2004, 47:29652968.

103. Fu H, Marquez S, Gu X, Katz L, Myles DC: Synthesis and in vitro antibiotic activity of 16-membered 9-O-aryIalkyIoxime macrolides. Bioorg Med Chem Lett 2006,16:1259-1266.

104. Ruggeri C, Laborde MA, Dessinges A, Ming L, Olesker A, Lukacs G: Synthesis and antibacterial activity of 9-0-(2-methoxyethoxy)methyl.-oximes of tylosin and demycarosyltylosin. J Antibiot (Tokyo) 1989, 42:14431445.

105. Tanaka A, Watanabe A, Tsuchiya T, Umezawa S, Umezawa H: Syntheses of 4'-deoxy-demycarosyl tylosin and its analogues. J Antibiot (Tokyo) 1981, 34:1381-1384.

106. Mori S, Okamoto R, Inui T, Takeuchi T: Tylosin derivatives. 1980, May 27, U.S. Pat. №4205163.

107. Matsubara H, Miyano K, Nakagawa A, Omura S: Chemical transformation of tylosin, a 16-membered macrolide, and its structure-activity relationship.

108. Chem Pharm Bull (Tokyo) 1982, 30:97-110.

109. Коршунова ГА, Сумбатян HB, Федорова НВ, Шишкина АВ, Богданов АА: Пептидные производные макролидов, родственных тилозину.

110. Биоорг химия 2006, 33:235-244.

111. Sakakibara Н, Fujiwara Т, Okegava О, Honda Е: Deformiyltylosin derivatives. 1982, Aug.17, U.S. Pat. №4345069.

112. Debono M, Kirst HA: C-20-Digidro-deoxy-(cyclic amino)-derivatives of macrolide antibiotics. 1989, Apr.l 1, U.S. Pat. №4820695.

113. Narandja A, Suskovic B, Kelneric Z, Djokic S: Structure-activity relationship among polyhydro derivatives of tylosin. J Antibiot (Tokyo) 1994, 47:581-587.

114. Tsuzuki K, Matsubara H, Nakagawa A, Omura S: Syntheses and antimicrobial activities of 9-O-acyl derivatives of tylosin and demycarosyltylosin. J Antibiot (Tokyo) 1986, 39:1784-1787.

115. Kirst HA, Willard KE, Debono M, Toth JE, Truedell BA, Leeds JP, Ott JL, Felty-Duckworth AM, Counter FT, Ose EE, et al.: Structure-activity studies of 20-deoxo-20-amino derivatives of tylosin-related macrolides. J Antibiot (Tokyo) 1989, 42:1673-1683.

116. Fujiwara T, Watanabe H, Kogami Y, Shiritani Y, Sakakibara H: 19-DeformyI-4'-deoxydesmycosin (TMC-016): synthesis and biological properties of a unique 16-membered macrolide antibiotic. J Antibiot (Tokyo) 1989, 42:903-912.

117. Omura S, Tishler M: Relationship of structures and microbiological activities of the 16-membered macrolides. J Med Chem 1972,15:1011-1015.

118. Lundy KM, Yu CB: Amide derivatives 16-membered ring antibiotic macrolides. 1998, Feb.5, U.S. Pat. №5716939.

119. Mutak S, Marsic N, Kramaric MD, Pavlovic D: Semisynthetic macrolide antibacterials derived from tylosin. Synthesis and structure-activity relationships of novel desmycosin analogues. J Med Chem 2004, 47:411-431.

120. Narandja A, Lopotar N, Mandic Z: New hydroxy derivatives of tylosin and process for their preparation. 2000, E.P. №0985679 Al.

121. Mallams AK, Rossman RR: 12,13-oxoderivatives of macrolides. 1989, Feb. 28, U.S. Pat. №4808575.

122. Naranda A, Lopotar N, Kelneric Z: New dihydro and tetrahydro derivatives of desmycosin. Ш. The opening of oxirane ring of 12,13-epoxydesmycosin. J Antibiot (Tokyo) 1997, 50:860-865.

123. Реутов OA, Курц AJT, Бутин КП: Органическая химия, vol 3. M.: Бином. Лаборатория знаний.; 2004.

124. Hayashi М, Ohno М, Satoi S \ J Chem Soc Chem Соттип 1980:119.

125. Wild GM: 20-Dihydro-20-deoxy-23-de(mycinosyloxy)tyIosin. 1985, July 5, U.S. Pat. № 4528369.

126. Satoi S, Muto N, Hayashi M, Fujii T, Otani M: Mycinamicins, new macrolide antibiotics. I. Taxonomy, production, isolation, characterization and properties. J Antibiot (Tokyo) 1980, 33:364-376.

127. Mitsunobu O: The use of diethyl azodicarboxylate and triphenylphosphine in synthesis and transformation of natural products.1. Sinthesis 1981,1:1-28.

128. Kirst HA, Toth JE: C-20- and C-23-modified macrolide derivatives. 1984, Aug.28, U.S. Pat. №4468511.

129. Debono M, Kirst H: C-20- and C-23 modified macrolide derivatives.1986, Dec. 16, U.S. Pat. №4629786.

130. Kirst HA, Toth JE, Debono M: C-20 and C-23 modified macrolidederivatives. 1984, Sep.5, G.B. Pat. №2135670 A.

131. Blatter F, Brenner M, Brink M, Fleischhauer K, Hu G, Niedermann HP, Rager T, Schweisei T, Veit S, Warrass R, et al.: Macrolide synthesis process and solid-state forms. 2009, Feb. 12, U.S. Pat. №2009/0042815 Al.

132. Matsubara H, Inokoshi J, Nakagawa A, Tanaka H, Omura S: Chemical modification of tylosin: synthesis of amino derivatives at C-20 position of tylosin and demycarosyltylosin. JAntibiot (Tokyo) 1983, 36:1713-1721.

133. Ganguly AK, Mallams AK, Liu Y-T: Tylosin 20-imino-20-deoxo-4"-acyl derivatives, pharmaceutical compositions and method of use. 1984, March 6, U.S. Pat. №4435388.

134. Hecker S, Jefson MR, McFarland JW: Derivatives 16-membered ring antibiotic macrolides. 1994, W.O. №9402594.

135. Hranjec M, Starcevic K, Zamola B, Mutak S, Derek M, Karminski-Zamola G: New amidino-benzimidazolyl derivatives of tylosin and desmycosin.

136. JAntibiot (Tokyo) 2002, 55:308-314.

137. Narandja A, Suscovic B, Djokic S, Lopotar N: Derivatives of tylosin and 10,11,12,13- tetrahydro tylosin and their use in pharmaceuticals. 1991, Jun.l 1, U.S. Pat. №5023240.

138. Naranda A, Lopotar N: New derivatives of tylosin. IV. Dihydro and tetrahydro desmycosin oximes. JAntibiot (Tokyo) 1999, 52:68-70.

139. Сумбатян HB, Коршунова ГА, Богданов AA: Пептидные производные иигабиторов синтеза белка антибиотиков тилозина и десмикозина.

140. Биохимия 2003, 68:1436-1438.

141. Kennedy JH: Macrolide derivatives. 1986, April 8, U.S. Pat. №4581346.

142. Bobillot S, Bakos T, Sarda P, Thang TT, Ming L, Olesker A, Lukacs G: Chemical modification of tylosin. J Antibiot (Tokyo) 1995, 48:667-670.

143. Ton That T, Laborde MdlA, Olesker A, Lukacs G: A new approach to the stereospecific synthesis of branched-chain sugars. J Chem Soc Chem Commun 1988:1581-1582.

144. Huber JE: Photo oxygenation of enamines a partial synthesis of progesterone. Tetrahedron Lett 1968, 29:3271-3272.i

145. Omura S, Matsubara H, Tsuzuki K, Nakagawa A: Chemical modification of tylosin. Thioether derivatives of tylosin and demycarosyltylosin. J Antibiot (Tokyo) 1984,37:1007-1015.

146. Fujiwara T, Watanabe A, Hirano T, Sakakibara H: 23-0-Acyl-23-demycinosyldesmycosin derivatives. 1983, Jan. 21, G.B. Pat. №2116170A.

147. Kirst HA, Debono M, Toth JE, Truedell BA, Willard KE, Ott JL, Counter FT, Felty-Duckworth AM, Pekarek RS: Synthesis and antimicrobial evaluation of acyl derivatives of 16-membered macrolide antibiotics related to tylosin. J

148. Antibiot (Tokyo) 1986, 39:1108-1122.

149. Шишкина AB: Пептидные производные 5-О-микаминозил-тилонолида как инструменты для изучения рибосомного туннеля: дизайн, синтез, биологические свойства. Диссертационная работа (МГУ) 2009.

150. Phan LT, Tianying J, Yao-Ling Q, Yat Sun O: 4'-0-substituted tylosin analogs. 2003, June 10, U.S. Pat. №6576615.

151. Phan LT, Tianying J, Yao-Ling Q, Yat Sun O: 4'-0-substituted tylosin analogs. 2003, May 15, U.S. Pat. №2003/0092639.

152. Narandja A, Kelneric Z, Kolacny-Babic L, Djokic S: 10,11,12,13-Tetrahydro derivatives of tylosin. II. Synthesis, antibacterial activity and tissue of 4'-deoxy-10,ll,12,13-tetrahydrodesmycosin. J Antibiol (Tokyo) 1995, 48:248-253.

153. Cabri W, Candiani I: Rescent developments and new perspectivites in the Heck reaction. Acc Chem Res 1995, 28:2-7.

154. Kirst HA, Leeds JP: Modifications of mycinose and 3-O-demethylmycinose in tylosin-type macrolides. 1990, Apr. 24, U.S. Pat. №4920103.

155. Gotoh Y, Saitoh II, Miyake T: Chemical transformation of tylosin derivatives into neutral macrolides having a 3'-methoxyl group. Carbohydr Res 1998, 309:45-55.

156. Kirst H, Toth JE: C-23-modified derivatives of OMT, pharmaceutical compositions and method of use. 1984, Jul. 10, U.S. Pat. №4459290.

157. Kirst H, Toth JE: C-23-Modified derivatives of DMT. 1984, Jun. 5, U.S. Pat. №4452784.

158. Tanaka A, Tsuchiya T, Umezawa S, Hamada M, Umezawa H: Syntheses of derivatives of 4'-deoxymycaminosyl tylonolide and mycaminosyl tylonolide modified AT C-23. JAntibiot (Tokyo) 1981, 34:1377-1380.

159. Fujiwara T, Watanabe H, Hirano T, Sakakibara H: 23-Demycinosyldesmycosin derivatives. 1985, May 7, U.S. Pat. №4515941.

160. Creemer LC, Beier RC, Kiehl DE: Facile synthesis of tilmicosin and tylosin related haptens for use as protein conjugates. J Antibiot (Tokyo) 2003, 56:481-487.

161. Takata A, Tsuchiya T, Okada Y, Umezawa S: Syntheses of 23-dialkylamino derivatives of mycaminosyl tylonolide and 4'-deoxymycaminosyl tylonolide effective against Gram-negative bacteria. J

162. Antibiot (Tokyo) 1982,35:113-116.

163. Sakamoto S, Tsuchiya T, Takata A, Umezawa S, Iiamada M, Umezawa H: N-Substituted derivatives of 23-amino-4',23-dideoxymycaminosyl tylonolide. Synthesis and antibacterial activity. J Antibiot (Tokyo) 1985, 38:477-484.

164. Kirst HA, Toth J.E.: Method of preparing 23-monoesters of OMT and DMT. 1984, U.S. Pat. № 4487923.'

165. Yanofsky C: RNA-based regulation of genes of tryptophan synthesis and degradation, in bacteria. RNA 2007,13:1141-1154.

166. Ramu H, Mankin A, Vazquez-Laslop N: Programmed drug-dependent ribosome stalling. Mol Microbiol 2009, 71:811-824.

167. Cruz-Vera LR, Rajagopal S, Squires C, Yanofsky C: Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression. Mol Cell 2005,19:333-343.

168. Mankin AS: Nascent peptide in the Tjirth canal' of the ribosome. Trends Biochem. Sci. 2006, 31:11-13.

169. Якубке Х-Д, Ешкайт X: Аминокислоты, пептиды, белки. М.: «Мир»; 1985.

170. Гершкович АА, Кибирев ВК: Химический синтез пептидов. Киев: Наукова думка; 1992.

171. Nomura T, Iwaki T, Narukawa Y, Uotani K, Hori T, Miwa H: A new type of ketolide bearing an N-aryl-alkyI acetamide moiety at the C-9 iminoether: synthesis and structure-activity relationships. Bioorg Med Chem 2006, 14:3697-3711.

172. Пшеничникова АБ, Карнаухова EH, Мицнер БИ, Щвец ВИ: Синтез и свойства N-ретинилиденовых производных полярных аминокислот.

173. Биоорг химия 1996,10:852-855.

174. Oka Y, Yonemoto Н, Yurugi S: Carnitine derivatives. Takeda Kenkyusho Nenpo 1963,22:13-18.

175. Schmeing TM, Seila AC, Hansen JL, Freeborn B, Soukup JK, Scaringe SA, Strobel SA, Moore PB, Steitz ТА: A pre-translocational intermediate in protein synthesis observed in crystals of enzymatically active 50S subunits.

176. Nat Struct Biol 2002, 9:225-230.

177. Xu S, Held I., Kempf В., Mayr H„ Steglich W., Zipse H.: The DMAP-catalized acetylation of alcohols a mechanistic study (DMAP = 4-(dimethylamino)pyridine). Chem. Eur. J. 2005,11:4751-4757.

178. Brandt-Rauf P, Vince R, LeMahieu R, Pestka S: Fluorescent assay for estimating the binding of erythromycin derivatives to ribosomes. Antimicrob Agents Chemother 1978,14:88-94.

179. Dujols V, Ford F, Czarnik A: A long-wavelength fluorescent chemodosimeter selective for Cu(II) ion in water. J Am Chem Soc 1997, 119:7386-7387.

180. Yang XF, Guo XQ, Zhao YB: Development of a novel rhodamine-type fluorescent probe to determine peroxynitrite. Talanta 2002, 57:883-890.

181. Yang XF, Guo XQ, Li H: Fluorimetric determination of hemoglobin using spiro form rhodamine В hydrazide in a micellar medium. Talanta 2003, 61:439-445.

182. Omura S, Nakagawa A, Neszmelyi A, Gero SD, Sepulchre AM, Piriou F, Lukacs G: Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectral analysis of 16-membered macrolide antibiotics. J Am Chem Soc 1975, 97:4001-4009.

183. Rossi C, Donati A, Picchi MP, Sansoni MR: Proton and carbon chemical shift assignment and dynamic investigation of the macrolide antibiotic tylosin. Magnetic Resonanse in Chemistry 1992, 30:954-957.

184. Karahalios P, Kalpaxis DL, Fu H, Katz L, Wilson DN, Dinos GP: On the mechanism of action of 9-O-arylalkyIoxime derivatives of 6-0-mycaminosyltylonolide, a new class of 16-membered macrolide antibiotics.

185. Mol Pharmacol 2006, 70:1271-1280.

186. Petropoulos AD, Kouvela EC, Starosta AL, Wilson DN, Dinos GP, Kalpaxis DL: Time-resolved binding of azithromycin to Escherichia coli ribosomes. J

187. Mol Biol 2009, 385:1179-1192.

188. Кейл Б: Лабораторная техника органической химии. Москва: Мир; 1966.

189. Marshall JA, Chobanian Н: Lipase-catalyzed resolution of 4-trimethylsi!yl-3-butyn-2-ol and conversion of the (R)-enantiomer to (R)-3-butyn-2-yl mesylate and (P)-l-tributylstannyI-l,2-butadiene. Org Syn 2005, 82:43-54.

190. Szaflarski W, Vesper O, Teraoka Y, Plitta B, Wilson DN, Nierhaus KH: New features of the ribosome and ribosomal inhibitors: non-enzymatic recycling, misreading and back-translocation. J Mol Biol 2008, 380:193-205. '

191. Stern S, Moazed D, Noller HF: Structural analysis of RNA using chemical and enzymatic probing monitored by primer extension. Methods Enzymol 1988,164:481-489.