Синтез, структура и биологическая активность аминокислот и пептидов, содержащих адамантановый фрагмент

Степанов, Евгений Александрович

Синтез, структура и биологическая активность аминокислот и пептидов, содержащих адамантановый фрагмент тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

Степанов, Евгений Александрович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Самара МЕСТО ЗАЩИТЫ

2010 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.03 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Синтез, структура и биологическая активность аминокислот и пептидов, содержащих адамантановый фрагмент»

Автореферат диссертации на тему "Синтез, структура и биологическая активность аминокислот и пептидов, содержащих адамантановый фрагмент"

485578?

СТЕПАНОВ ЕВГЕНИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

СИНТЕЗ, СТРУКТУРА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АМИНОКИСЛОТ И ПЕПТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ АДАМАНТАНОВЫЙ ФРАГМЕНТ

02.00.03 - Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ОЕ3 20']

4855789

На правах рукописи

¿¿$г

СТЕПАНОВ ЕВГЕНИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

СИНТЕЗ, СТРУКТУРА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АМИНОКИСЛОТ И ПЕПТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ АДАМАНТАНОВЫЙ ФРАГМЕНТ

02.00.03 - Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный университет» на кафедре органической, биоорганической и медицинской химии

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Пурыгин Пётр Петрович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Орлов Владимир Юрьевич

доктор химических наук, профессор Моисеев Игорь Константинович

Ведущая организация: Государственное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова»

Защита состоится « 2011 г.

часов на заседании

диссертационного совета Д 212.139.01 при Московском государственном текстильном университете имени А.Н. Косыгина по адресу: 119071, г. Москва, ГСП-1, Малая Калужская ул., д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный текстильный университет имени А.Н. Косыгина»

Автореферат разослан » 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук, профессор ' ' " ' / Кильдеева Н.Р.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Разработка новых лекарственных средств для борьбы с различивши заболеваниями является приоритетным направлением деятельности химиков в современной медицине. Особую роль играют вирусные заболевания человека, такие как грипп, гепатит, СПИД и другие, уносящие миллионы жизней по всему миру. С другой стороны, постоянно появляются новые штаммы вирусов, устойчивые к существующим лекарственным препаратам, например вирусы птичьего, свиного гриппа и т.п.

Имеющиеся на сегодня наиболее активные противовирусные препараты, созданные на основе нуклеозидов и нуклеотидов, далеко не всегда эффективны, а в качестве профилактических средств крайне дороги. Поэтому при конструировании молекул новых лекарственных препаратов перспективными являются аминокислоты и пептиды, так как они экономически более доступны и могут подвергаться различным структурным модификациям. Использование аминокислот и пептидов также позволяет получать малотоксичные препараты.

Производные адамантана довольно давно и широко применяются в медицине и фармакологии. Эти соединения проявляют достаточно широкий спектр биологической активности: противогрибковая, противомикробная, нейропсихотропная активности и др. Но наиболее известными являются противовирусные свойства производных адамантана. Например, такие производные адамантана как ремантадин и амантадин являются эффективными препаратами в отношении различных штаммов вируса гриппа А. Однако данные препараты не действуют на штамм вируса свиного гриппа НШ1.

Компьютерные методы в настоящее время интенсивно применяются для поиска новых мишеней и базовых структур новых лекарств, а также для оптимизации их фармакодинамических и фармакокинетических характеристик. Польза компьютерных методов поиска новых лекарственных препаратов заключается в повышении безопасности и эффективности новых препаратов, путем заранее предсказанной токсичности и/или новых видов биологической активности.

В связи с этим актуальной задачей является синтез, компьютерный расчет и изучение биологической активности различных пептидов и аминокислот, модифицированных различными адамантильными остатками.

Цель работы. Синтез и исследование биологических свойств аминокислот и пептидов, модифицированных адамантильными фрагментами. Установление для молекул синтезированных соединений взаимосвязей между их физико-химическими свойствами (гидрофобность, наличие внутримолекулярных водородных связей) и биологической активностью с использованием компьютерных методов расчета.

Научная новизна. В результате проделанной работы были синтезированы модифицированные адамантильным остатком пептиды и аминокислоты, среди них 23 соединения получены впервые.

Проведено исследование активности полученных соединений против вируса свиного гриппа НШ1, а также проведено исследование

иммуномодулирующего действия полученных тетрапептидов in vitro на крови пациентов с различными иммунными заболеваниями.

При помощи ряда программ МОЕ 2009.10, ACD/Labs 12.0, Discovery Studio Visualizer 2.5, проведены компьютерные расчеты молекул синтезированных соединений, найдены их конформеры с глобальными энергетическими минимумами, для которых проанализированы конформации и водородные связи, проведена оценка гидрофобности молекул синтезированных веществ.

С помощью программного пакета PASS Professional 2007 предсказана биологическая активность синтезированных соединений.

На основании компьютерных расчетов, исследований иммуномодулирующих свойств, анализа активности соединений против вируса свиного гриппа H1N1 показано, что существует корреляция между предсказательной способностью программы PASS Professional 2007 и проявлением реальной биологической активности, а также между структурой молекулы, наличием внутримолекулярных водородных связей, наличием гидрофобных фрагментов и биологической активностью.

Практическая значимость. Два синтезированных тетрапептида обладают иммуномодулирующим действием, их влияние на отдельные звенья иммунной системы зависит от степени ее активации. Среди полученных веществ выделены соединения с высокой активностью против вируса свиного гриппа H1N1. Особенностью наиболее активных синтезированных противовирусных соединений, является простота их получения и экономическая доступность.

На защиту выносятся:

• синтез модифицированных адамантильными остатками аминокислот и пептидов;

• данные компьютерных расчетов синтезированных соединений (поиск конформеров с наименьшей энергией, гидрофобность, внутримолекулярные водородные связи, предсказание биологической активности);

• изучение биологической активности полученных соединений (иммуномодулирующее действие, активность против вируса свиного гриппа H1N1);

• установление взаимосвязей между компьютерными расчетами и результатами биологической активности.

Апробация работы. Основные результаты работы представлялись на XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008), XXXV Самарской областной студенческой научной конференции (Самара, 2009), VII Всероссийской интерактивной (с международным участием) конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2010), XLI научной конференции студентов (Самара, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ: 5 статьей в центральной печати, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 7 тезисов докладов международных, российских и областных конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 145 страницах, включая введение, литературный обзор, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы, 4 рисунка, 29 таблиц. Список цитируемой литературы включает 140 ссылок. Приложение содержит 9 страниц. Обзор литературы посвящен проблемам синтеза и исследованиям биологической активности пептидов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Синтез пептидов в растворе, на примере синтеза Н-Рго-ау-Су8(8-А(1НЛ1-Ас1

Для синтеза коротких пептидов с одинаковой эффективностью можно применять как классический синтез пептидов в растворе, так и твердофазный метод синтеза. Твердофазный метод синтеза был применен для ряда некоторых трипептидов, состоящих из остатков пролина и глицина, а также для синтеза тетрапептидов. Остальные соединения синтезированы с помощью классического синтеза пептидов в растворе.

Для классического синтеза в растворе были выбраны следующие методы образования пептидной связи:

• карбодиимидный метод;

• метод активированных эфиров.

Общая схема синтеза Н-Рго-01у-Су5(8-АсО-ЫН-Ас!

Н-СуБ(8-Ас1)-ОН Вос-Суз(8-Ас1)-ОН ->■ Вос-Суз(8-Ас1)-Ш-Ас1 Н-СуБ^-АсГНЫН-Ас! Вос-01у-Суз(8-Ас1}-Ж-Ас1 Н-01у-Суз(8-Ас1)-№-Ас1 Вос-Рго-О1у-Суз(8-А<1)-Ш-Аа -> Н-Рго-01у-Суз(8-Ас1)-М-1-Ас1

Для создания пептидной связи необходимо блокировать одну из реакционноспособных группировок аминокислоты. Для защиты М-конца аминокислот и пептидов использовалась легко удаляемая в сильнокислой среде треот-бутилоксикарбонильная группа (Вое). Карбобензокси-защитная группа (2-группа) не была использована из-за сложности ее введения, но в синтезах целевых соединений использовались готовые 2-аминокнслоты и пептиды.

Введение Вос-группы осуществлялось обработкой аминокислот ди-трет-бутилпирокарбонатом по следующей схеме:

о Н,с 1 сн,

Ш2-СЖ-С-ОН + Н3С-С-О-С-О-С-О-С-СН3 -»

н3с о о СН3

н3с о сн3

-- НзС-С-0-^-Ш-СШ-С-0Н+ С02 + Н3С-С-ОН

Нзс о СНз

где Я. = -СНг-З-Аё.

Реакция осуществляется в слабощелочной среде, без образования побочных продуктов и с высокими выходами целевых соединений.

Снятие Вос-защиты происходит в сильнокислой безводной среде в мягких условиях. Присутствие воды ведет к расщеплению пептидных связей. Поэтому была использована 100% муравьиная кислота.

Вос-группа удаляется кислотами по предполагаемому мономолекулярному механизму:

з + «¡*

н3с—с-о-с-к-^— Н3С—С-О-С-Л

сн3 ^ СН3

11 +

о-н

СН3 ■ СНз

НзС—с-о-с-я-~н3с—С+ + С02 + ин

сн3 он сн3

н3сч

,0=03,

где Я = остаток аминокислоты или пептида.

Н3С

Образование пептидной связи представляет собой нуклеофильную атаку карбонильного атома углерода одной аминокислоты азотом аминогруппы другой аминокислоты. Это достигается за счет активации карбоксильной группы заместителями, оттягивающими электронную плотность (индукционный эффект электроотрицательных заместителей или эффект сопряжения с тс-электронной системой).

Дициклогексилкарбодиимид (БСС) способен легко реагировать с карбоновыми кислотами с образованием реакционноспособных Оацилизомочевин.

Хорошим катализатором, повышающим выход при использовании ВСС является 4-диметиламинопиридн (ОМАР). Но так как данный катализатор повышает рацемизацию аминокислотных остатков, то его использовали за один час до окончания реакции. Реакция образования пептидной связи в этом случае протекает по следующему механизму:

()

я—с—он+ + с6н, —№=с=1*—сд,--

я—с—о" + с6н,гш-с=м-сбни

к—с

О Ы7 V—N.

,сн3

сн.

/ У-к

с6н1Гш-с=к-с6ни

/СН3 и— огс^-с6нп

сн3 ^ н^-к

.сн,

ЕШ-Ы' II /ГА

—-- к—с-ш-Я' + N ч>—~

№1

мч +о=с-ш-с6нп сн3

где К, Я' = остаток аминокислоты или пептида.

В случае проведения реакции модификации адамантильным остатком аминокислот по С-концу: Я = остаток Вос-защищенной аминокислоты; II' = 1-адамантил.

Метод активированных эфиров заключается в использовании сложных эфиров, содержащих электроноакцепторные группы. На примере синтеза трипептида Вос-Рго-01у-Суз(Б-А(1)-НН-Ас1 образование пептидной связи с применением замещенных фениловых эфиров можно представить следующим образом:

СН-Ш-С-СН9-Кг-

\У

СН,

о=с

кн-с-сн-ш-с-сн2-ш-с

Чем сильнее электроноакцепторные свойства замещенной фенильной группы, тем легче и быстрее проходит реакция образования пептидной связи. Поэтому предпочтительнее было использовать именно пентафторфениловые эфиры, а не пентахлорфениловые и и-нитрофениловые эфиры, которые также широко распространены в пептидном синтезе.

2. Твердофазный синтез пептидов, на примере синтеза А(1-СО-Рго-С1у-Рго-ОН

Идея твердофазного синтеза заключается в придании пептидной цепи способности не растворяться в растворителях, используемых для реакции. После присоединения очередного аминокислотного остатка не прореагировавшие реагенты удаляются промыванием полимера.

В твердофазном синтезе была выбрана Вос-стратегия с использованием метода активированных эфиров. В качестве твердой фазы использовалась хлорметилированная смола Меррифилда.

Общая схема синтеза Ас1-СО-Рго-01у-Рго-ОН

Вос-Рго-0~Сз+ Вос-Рго-ОСНгЧР) ~> Н-Рго-ОСН2-(Р) Вос-О1у-Рго-ОСН2-(Р) -> Н-01у-Рг0-0СН2-(Р) -> Вос-Рго-ау-Рго-ОСННР) Н-Рго-01у-Рго-ОСН2-(Р) ->• Н-Рго-ау-Рго-ОН Ас1-С0-Рго-О1у-Рго-Он

Получение цезиевой соли глицина проводили в водно-спиртовом растворе, постепенно повышая рН до 7 при помощи 2 М раствора моногидрата гидроокиси цезия:

Сб0Н'Н20 + Вос-Рго-ОН -> Вос-Рго-О'Сб* + 2Н20

Ковалентное присоединение первого аминокислотного остатка к твердой фазе осуществлялось по методу Гизина. Для повышения выхода продуктов реакции, данный метод усовершенствован за счет использования межфазного катализа, с применением в качестве катализатора иодида тетра-н-бутиламмония. Применение данного катализатора позволило повысить выход аминоацилированного полимера, провести синтез при температуре 50 °С и уменьшить расход Вос-Рго.

Удаление Вос-группы идет также по мономолекулярному механизму. Но в условиях твердофазного синтеза необходимо учитывать тот факт, что для удаления данной защитной группы с хорошим выходом, необходимо набухание гранул полимера. Поэтому в данном случае используют растворы кислот в органических растворителях, например 50% раствор трифторуксусной кислоты в дихлорметане.

Образование пептидной связи происходит таким же образом, как в классическом растворном синтезе пептидов. Только используется 3- или 4-х кратный избыток реагентов, для достижения практически количественного выхода на каждой стадии реакции присоединения последующего аминокислотного остатка.

Отщепление пептида от твердой фазы осуществляется путем переносного гидрирования. На данной стадии используется ацетат палладия (II) и восстановитель - формиат аммония или 100% муравьиная кислота:

Н-Рго-ау-Рго-ОСННР) + 2Н Н-Рго-ау-Рго-ОН + СН3-(Р)

Восстановительное расщепление связи С-О происходит за счет атомарного водорода, который выделяется в ходе разложения муравьиной кислоты или формиатов над палладиевым катализатором:

2НСООН 2Н' + Н20 + СОТ+ С02|

Модификацию адамантильными производными по Ы-концу осуществляли взаимодействием пептида с хлорангидридом 1-адамантанкарбоновой кислоты. Для связывания хлороводорода и ускорения реакции добавлялся диизопропилэтиламин (01РЕА). Реакция идет по механизму нуклеофильного замещения ВАс2:

Ad—С—CI + HN

е о

Ad—С-

С1

-N

IV-1

DIPEA

Ad-

е О

-с.....N

I IV^

С1 н

-[(iPr)2EtNH]~ С1+

Ad-

Ri= -Gly-Pro-OH

3. Анализ внутримолекулярных водородных связей в точках глобального энергетического минимума

Для поиска глобального энергетического минимума использовалась программа Molecular Operating Environment 2009.10 (МОЕ 2009.10) с силовым полем MMFF94x, которое разработано для расчета конформаций структур биоолигомеров и биополимеров. После предварительной оптимизации структур пептидов проводился конформационный поиск с целью нахождения конформера с наименьшей энергией из ста возможных конформеров для данной структуры. Выбор данной программы обусловлен возможностью поиска устойчивых конформеров сложных молекул, имеющих большое количество степеней конформационной свободы.

После минимизации энергии молекул был проведен их анализ на наличие внутримолекулярных водородных связей в полученных соединениях в программе Discovery Studio Visualizer 2.5.

H-Cys(S-Ad)-NH-Ad

Водородные связи отсутствуют, поскольку геометрия молекулы в условиях энергетического минимума не позволяет им образоваться.

Н-^у-ау-РЬе-ГШ-Ас!

Водородные связи между:

1) атомом кислорода карбонильной группы 01у1 и атомом водорода амидной группы РЬеЗ;

2) атомом кислородом карбонильной группы в1у2 и атомом водорода амидной группы Ас1.

4. Расчет гидрофобности синтезированных соединений

С помощью программы АСЭЬаЬэ 12.0 были рассчитаны значения логарифмов коэффициентов распределения 1§Р для синтезированных соединений. Коэффициент распределения Р — безразмерная величина, характеризующая распределение вещества в системе н-октанол-вода, в которой к-октанол имитирует липидный слой. Если 1§Р равен нулю, то вещество одинаково хорошо растворяется как в органическом слое, так и в водном. Если больше нуля, то исследуемое вещество растворимо в органическом слое, а если меньше, то в водном.

Таблица 1

Гидрофобность модифицированных адамантильным остатком соединений в сравнении с не модифицированными аналогами

№ Пептид lgPi

1 H-Cys(S-AdbAd 5,39±0,56 6,13

H-Cys-OH -0,74 ±0,72

2 H-Pro-Gly-Cys(S-Ad>Ad 4,69 ±0,73 6,27

H-Pro-Gly-Cys-OH -1,58±0,60

3 H-Phe-Gly-Cys(S-Ad)-Ad 6,50 ±0,74 6,27

H-Phe-Gly-Cys-OH 0,23 ±0,63

4 Ad-CO-Phe-Gly-Cys(S-Ad)-Ad 9,26 ±0,76 9,03

H-Phe-Gly-Cys-OH 0,23 ±0,63

5 Ad-CH2-CO-Phe-Gly-Cys(S-Ad)-Ad 9,79 ±0,76 9,56

H-Phe-Gly-Cys-OH 0,23 ±0,63

Таким образом, гидрофобный вклад одной и той же адамантильной группы в одном и том же положении зависит от природы аминокислотных остатков входящих в состав соединения, но не зависит от наличия других адамантильных остатков.

5. Компьютерная оценка биологической активности

Расчет вероятностей проявления (Ра) и непроявления (Pi) различных видов биологической активности проведен в программе PASS Professional 2007.

Рассчитаны вероятности лекарственного подобия, вероятности проявления различных видов фармакологических эффектов, молекулярных механизмов, побочных и токсических эффектов, метаболизма. Из множества полученных значений выбирались восемь фармакологических эффектов следующих типов:

• первые 7 приведенных значений соответствуют вероятности проявления противовирусной активности (особенно против вируса гриппа), а также вероятности проявления иммуномодулирующей и иммунностимулирующей активностей;

• последнее значение - это максимальная вероятность проявления токсического эффекта.

Биологическая активность H-Cys(S-Ad)-NH-Ad

Таблица 2

H-Cys(S~Ad)-NH-Ad

P, Pi Активность

0,686 0,128 иммуномодулирующая (ВИЧ)

H-Cys(S-Ad)-NH-Ad

Ра Pi Активность

0,559 0,118 антивирусная (Arbovirus)

0,495 0,075 антивирусная (Picornavirus)

0,278 0,128 антивирусная (Poxvirus)

0,358 0,076 антивирусная (Adenovirus)

0,366 0,109 иммуностимулирующая

0,367 0,082 антивирусная (Influenza)

0,294 0,269 ДНК-повреждающая

На примере данного соединения видно, что имеется достаточно большая вероятность проявления им антивирусных свойств и, в частности, интересующей нас активности против вируса гриппа. Вероятность проявления токсического эффекта (повреждение ДНК) практически равна вероятности непроявления данного эффекта.

6. Результаты исследования биологической активности полученных соединений

Исследование биологической активности полученных соединений проводили с помощью классического иммуноферментного анализа, используя штамм вируса свиного гриппа (А/ПУ-Мобсош/О 1/2009 (НШ1)з\у1). Результаты противовирусной активности некоторых соединений приведены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты испытаний некоторых синтезированных соединений против вируса _гриппа А, штамм (А/ПУ-Мозсоуу/01/2009 (НШ1^1)_

№ Вещество Концен трация, мкг/мл on ОПср ОПк.к ОПв.к Процент ингибирова ния, %

H-Cys(S-Ad)-NH-Ad 0,320

1 10 0,330 0,323 0,342 0,810 104,131

0,319

H-Pro-Gly-NH-Ad 0,610

2 10 0,688 0,636 0,389 0,494 -135,238

0,610

3 H-Gly-Pro-Gly-NH-Ad 5 0,775 0,656 0,707 0,713 0,475 0,904 44,565

4 3AdCO*Lys-Ile-Ile-Lys 10 0,436 0,474 0,527 0,479 0,389 0,494 14,286

5 H-Val-Yal-Pro-CO-NH-Ad 10 0,865 0,665 0,656 0,661 0,360 0,680 5,941

6 Ремантадин Ad-CH(CH3)- nh2 10 0,447 0,517 0,496 0,487 0,389 0,494 6,984

ОП - оптическая плотность; ОПср. - среднее значение оптической плотности; ОПв.к. - оптическая плотность вирусного контроля; ОПк.к. - оптическая плотность клеточного контроля.

Расчет производился по следующей формуле (результаты округлялись до тысячных):

Процент ингибирования (%) = 100 - (КОПср.-ОПк.кЛ / (ОПв.к.-ОПк.к.)1*ЮО)

Среди исследованных веществ, два вещества показали степень ингибирования достаточную для использования данных веществ в разработке на их основе лекарственных препаратов:

• H-Gly-Pro-Gly-NH-Ad - 45%;

• H-Cys(S-Ad)-NH-Ad - 100%.

Особенностью синтезированных наиболее активных противовирусных соединений, является простота их получения и экономическая доступность.

Некоторые из синтезированных соединений, например H-Pro-Gly-NH-Ad ускоряют рост вируса. В присутствии данных соединений вирус быстрее размножается, чем по сравнению с чистой питательной средой. Возможно несколько причин возникновения данного факта:

• вещества меняют рН вирусных эндосом и это способствует ускорению стадии высвобождения нуклеокапсида вируса;

• ускоряется мембранное связывание частиц вируса и клеток-мишеней, за счет чего вирус быстрее проникает внутрь клетки;

• вновь образовавшиеся вирусные частицы легче покидают клетки-мишени. Для синтезированных тетрапептидов программа PASS Professional 2007

показала самую высокую комплексную иммуномодулирующую активность, порядка 73-91% для H-Lys-Ile-Ile-Lys-OH и 60-84% для модифицированного

адамантильным остатком соединения 3Ad-CO*Lys-Ile-IIe-Lys-OH. Для данных соединений было проведено пилотное исследование иммуномодулирующего действия in vitro на крови пациентов с различными иммунными заболеваниями.

Таблица 4

Виды воздействия тетрапептидов на кровь пациентов в зависимости от вида иммунного заболевания__

Вид заболевания Н-Ьуз-Ие-Не-Ьув-ОН ЗАс1-СО*Ьуя-11е-11е-Ьу8-ОН

Аутоиммунные заболевания снижение ФАЛ повышение у-интерферона снижение ИЛ-1 снижение ФНО-а снижение ФАЛ снижение у-интерферона не влияет на ИЛ-1Р не влияет на ФНО-а

Иммунодефицит повышение ФАЛ снижение у-интерферона повышение ИЛ-1 р повышение ИЛ-6 повышение ФНО-а не влияет на ФАЛ не влияет на у-интерферон снижение ИЛ-1Р снижение ИЛ-6 снижение ФНО-а

Хронический лимфолейкоз не влияет на ФАЛ не влияет на у-интерферон повышение ИЛ-1р повышение ИЛ-6 снижение ФНО-а снижение ФАЛ снижение у-интерферона снижение ИЛ-1Р снижение ИЛ-6 не влияет на ФНО-а

Примечание:

• ФАЛ - фагоцитарная активность лимфоцитов;

• ИЛ-1 р - интерлейкин-1Р;

• ИЛ-6 - интерлейкин-6;

• ФНО-а - фактор некроза опухоли-а.

Показано, что оба тетрапептида обладают иммуномодулирующим действием. Влияние на отдельные звенья иммунной системы зависит от степени ее активации. В большинстве случаев действие веществ на иммунологические параметры противоположно.

7. Изучение корреляции между компьютерными методами оценки и биологической активностью синтезированных соединений

На активность против вируса свиного гриппа НШ1 влияет пространственное строение молекулы в совокупности с наличием водородных связей:

• молекула не должна быть слишком большой по размерам и желательно иметь цилиндрическую форму, как например Н-СуБ^-Аф-ЮТ-Ас!;

• в молекуле должны оставаться свободными функциональные группы, способные образовывать водородные связи с остатками аминокислот в белковой спирали М2 вируса гриппа;

• в молекуле должны присутствовать некоторые гидрофобные составляющие (адамантильный фрагмент, остаток фенилаланина, остаток пролина и т.п.)

для того, чтобы молекула могла закрепиться в вирусном канале М2 также

за счет гидрофобных взаимодействий. Хотя прямой корреляции между

гидрофобностью и биологической активностью не обнаружено.

С помощью программы PASS Professional 2007 можно с достаточно большой вероятностью предсказать наличие некоторых видов биологической активности: иммуномодулирующая и антивирусная активность.

ВЫВОДЫ

1. Методом классического пептидного синтеза в растворе и с помощью твердофазного метода осуществлен синтез 26 коротких пептидов и аминокислот. Среди синтезированных соединений, все модифицированные адамантильными остатками пептиды и аминокислоты получены впервые. Индивидуальность полученных соединений подтверждена данными ТСХ, а структура - данными элементного анализа, ЯМР :Н и масс-спектроскопии.

2. Проведено исследование биологической активности полученных соединений. Показано, что тетрапептиды H-Lys-Ile-Ile-Lys-OH и 3Ad-CO*Lys-Ile-Ile-Lys-OH обладают выраженным иммуномодулирующим действием. Изучена степень ингибирования вируса свиного гриппа А, штамм (A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl), в сравнении с известным противовирусным препаратом ремантадином, который не ингибирует репликацию вируса свиного гриппа H1N1. Среди исследованных веществ, два вещества показали максимальную степень ингибирования репликации вируса:

• H-Gly-Pro-Gly-NH-Ad - 45%;

• H-Cys(S-Ad)-NH-Ad - 100%.

Модифицированные адамантильным остатком 6-аминогексановая кислота и D-норлейцин показали высокую ингибирующую активность при слабой вирусной нагрузке (концентрация частиц вируса в 100 раз меньше стандартной):

• Ad-CH2-CO-D-norLeu-OH - 82%

• Ad-CH2-CO-NH-(CH2)5-COOH-100%

Некоторые соединения, например H-Pro-Gly-NH-Ad, напротив, ускоряют вирусную репликацию.

3. Для молекул синтезированных веществ с помощью программы МОЕ 2009.10 найдены конформеры с глобальными энергетическими минимумами. В программе Discovery Studio Visualizer 2.5 проведен анализ конформаций и водородных связей для молекул полученных соединений в точках глобального минимума. Установлено, что водородные связи при данных конформациях находятся внутри молекулы, а гидрофобные фрагменты (адамантильные и фенильные остатки) ориентированы наружу, что позволяет таким пептидам при плохой растворимости в воде легко проходить через липидные бислои биологических мембран. Оценка гидрофобности молекул синтезированных веществ при помощи программы ACD/Labs 12.0 показала, что гидрофобный вклад одной и той же адамантильной группы в одном и том же положении зависит от природы аминокислотных остатков входящих в состав соединения, но не зависит от наличия других адамантильных остатков.

4. Предсказана биологическая активность синтезированных соединений при помощи программного пакета PASS Professional 2007. Среди предсказанных видов биологической активности были выделены иммуномодулирующие, иммуностимулирующие, антивирусные свойства. Компьютерная оценка показала, что в большинстве случаев модификация пептидов адамантильным остатком повышает вероятность проявления антивирусной и иммуномодулирующей активности и понижает токсичность соединений.

5. На примере исследованных антивирусных активностей синтезированных соединений и пилотного исследования иммуномодулирующих свойств, показано, что существует определенная корреляция между предсказательной способностью программы PASS Professional 2007 и проявлением реальной биологической активности. Показана взаимосвязь между структурой молекул, наличием водородных связей, наличием гидрофобных фрагментов и их антивирусной и иммуномодулирующей активностью.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Пурыгин П.П., Срибная О.С., Степанов Е.А., Данилин A.A. Твердофазный метод синтеза потенциальных противовирусных препаратов пептидной природы И Вестник СамГУ - Естественнонаучная серия. 2010. №2 (76). -С.159-168.

2. Степанов Е.А., Пурыгин П.П., Чунаев А.О. Получение некоторых потенциально биологически активных трипептидов, с помощью твердофазного синтеза // Бутлеровские сообщения. 2010. Т.19, №1. -С.17-24.

3. Степанов Е.А., Пурыгин П.П., Чунаев А.О., Обухов C.B. Получение некоторых потенциально биологически активных трипептидов. Активность против вируса свиного гриппа // Бутлеровские сообщения. 2010. Т.21,№7.-С.14-23.

4. Степанов Е.А., Пурыгин П.П., Чунаев А.О., Обухов C.B. Получение некоторых потенциально биологически активных трипептидов на основе 8-адамантил-1-цистеина. Активность против вируса свиного гриппа // Бутлеровские сообщения. 2010. Т.21, №8. - С. 1-11.

5. Степанов Е.А., Пурыгин П.П., Чунаев А.О. Получение новых антивирусных препаратов пептидной природы // Бутлеровские сообщения. 2009. Т.15, № 2. - С.43-48.

6. Степанов Е.А., Чунаев А.О. Синтез адамантансодержащих гетероциклов / Тезисы докладов XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии: В 5 т.; т.5 - М.: Граница, 2007. - С.223.

7. Чунаев А.О., Степанов Е.А. Получение некоторых азотсодержащих гетероциклов адамантанового ряда / Материалы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых

«Ломоносов» / M.: Издательство МГУ; СП МЫСЛЬ, 2008. — 1 электрон, опт. диск (CD-ROM); 12 см. - С.535.

8. Степанов Е.А., Чунаев А.О., Пурыгин П.П. Региоселективный синтез адамантансодержащих пептидов без предварительной защиты С-концевой аминокислоты / Тезисы докладов XXIV Международной Чугаевской конференции по координационной химии, Санкт-Петербург 15-19 июня 2009 г. Санкт-Петербург: AHO «Русский запад», 2009. - С.532-533.

9. Гасова М.И., Пурыгин П.П., Степанов Е.А. Изучение антибактериальных свойств модифицированных пептидов / Тезисы докладов XXXV Самарской областной студенческой научной конференции. 14-24 апреля 2009 г., Самара. 2009. - С.160.

Ю.Степанов Е.А., Пурыгин П.П., Чунаев А.О. Активность адамантансодержащих пептидов против вируса свиного гриппа / Тезисы докладов VII Всероссийской интерактивной (с международным участием) конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии». 15 июня. Саратов, 2010. - С. 120-121.

П.Лачугина О.Д., Пурыгин П.П., Степанов Е.А. Синтез модифицированных адамантильным остатком пептидов, с потенциальной антивирусной активностью / Тезисы докладов XLI научной конференции студентов. 5-12 апреля 2010 года, Самара, Россия. - С.45.

12.0бухов C.B., Пурыгин П.П., Степанов Е.А. Синтез и структура адамантилсодержащих трипептидов с возможным антивирусным действием / Тезисы докладов XLI научной конференции студентов. 5-12 апреля 2010 года, Самара, Россия. - С.48.

Подписано в печать 14.12.10 Формат бумаги 60x84/16 Бумага множ. Усл.печ.л. 1,13 Заказ 410 Тираж 80 ГОУВПО «МГТУ им. А.Н. Косыгина», 119071, Москва, ул. Малая Калужская, 1

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Степанов, Евгений Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Пептиды - строение, получение, свойства.

1.2. Химический синтез пептидов.

1.2.1. Синтез пептидов в растворе.

1.2.1.1. Методы формирования пептидной связи.

1.2.1.2. Защитные группы для аминогруппы И-конца и методы депротекции.

1.2.2. Твердофазный синтез пептидов.

1.2.2.1. Методы формирования пептидной связи.26*

1.2.2.2. Защитные группы для аминогруппы Ы-конца и методы депротекции.

1.2.2.3. Присоединение первой аминокислоты к полимеру. Отщепление пептидов от твердой фазы.

1.3. Биологическая активность пептидов и аминокислот.

1.4. Вирусы гриппа человека — строение, механизм действия, лечение.

Глава 2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

2.1. Модификация аминокислот и пептидов адамантильным остатком.

2.2. Синтез Вос-аминокислот.

2.3. Снятие Ъ- и Вос-защиты с модифицированных аминокислот и пептидов.

2.4. Образование пептидной связи.

2.5. Оценка гидрофобности полученных веществ.

2.6. Анализ водородных связей в конформерах в точках глобального энергетического минимума.

2.7. Компьютерная оценка биологической активности.

2.8. Оценка биологической активности полученных соединений.

2.9. Изучение корреляции между компьютерными методами оценки и биологической активностью синтезированных соединений.

Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Приборы и материалы.

3.2.Синтез вспомогательных реагентов.

3.3. Твердофазный синтез.

3.4. Синтез в растворе.

3.5. Компьютерная оценка биологической активности с помощью программы PASS Professional 2007.

3.6. Создание и оптимизация молекулярных структур, нахождение конформеров с глобальным энергетическим минимумом.

3.7. Анализ конформаций и водородных связей для конформеров в точках глобального энергетического минимума.

3.8. Анализ ингибирующей способности полученных соединений против вируса свиного гриппа A/H1N1.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертация по химии, на тему "Синтез, структура и биологическая активность аминокислот и пептидов, содержащих адамантановый фрагмент"

Актуальность работы.

Изыскание и изучение новых фармацевтических средств является одной из важнейших проблем современной химии и медицины. Успех в производстве нового лекарственного препарата — это результат глобальной долгосрочной стратегии. При этом шансы на успешное завершение работ по созданию нового лекарства весьма незначительны, примерно 1 к 5000-10000, а процесс разработки и продвижения на рынок нового препарата занимает 12-15 лет. По данным фармацевтической компании Roche, чтобы получить один фармацевтический препарат, необходимо [2]:

• 1 000 000 000 долларов инвестиций;

• 7 000 874 часов работы;

• 6 587 экспериментов;

• 423 исследователя.

Разработка новых лекарственных средств для борьбы с различными заболеваниями является приоритетным направлением деятельности химиков в современной медицине. Особую роль играют вирусные заболевания человека, такие как грипп, гепатит, СПИД' и другие, уносящие миллионы жизней по всему миру. С другой стороны, постоянно появляются новые штаммы вирусов, устойчивые к существующим лекарственным препаратам, например вирусы птичьего, свиного гриппа и т.п.

Имеющиеся на сегодня наиболее активные противовирусные препараты, созданные на основе нуклеозидов и нуюгеотидов, далеко не всегда эффективны, а в качестве профилактических средств крайне дороги. Поэтому при конструировании молекул новых лекарственных препаратов перспективными являются аминокислоты и пептиды, так как они экономически более доступны и могут подвергаться различным структурным модификациям. Использование . аминокислот и пептидов также позволяет получать малотоксичные препараты.

Производные адамантана довольно давно и широко применяются в медицине и фармакологии. Эти соединения проявляют достаточно широкий спектр биологической активности: противогрибковая, противомикробная, нейропсихотропная активности и др. Но наиболее известными являются противовирусные- свойства производных адамантана. Например, такие производные адамантана как ремантадин и амантадин являются-эффективными препаратами в отношении различных штаммов- вируса гриппа А. Однако-данные препараты не действуют на штамм вируса свиного гриппа А/НШ1.

Научная- новизна. В результате проделанной работы были синтезированы модифицированные адамантильным остатком пептиды и аминокислоты, среди них 23 соединения получены впервые.

Проведено исследование активности полученных соединений против вируса свиного гриппа А/НШ1, а также проведено исследование иммуномодулирующего действия полученных тетрапептидов in vitro на крови пациентов с различными иммунными заболеваниями.

При помощи ряда программ МОЕ 2009.10, ACD/Labs 12.0, Discovery Studio Visualizer 2.5, проведены компьютерные расчеты молекул синтезированных соединений, найдены их конформеры с глобальными энергетическими минимумами, для которых проанализированы конформации и водородные связи,, проведена оценка гидрофобностй молекул синтезированных вещества

С помощью программного пакета PASS Professional 2007 предсказаны вероятности проявления различных видов биологической активности у синтезированных соединений.

На основании компьютерных расчетов, исследований иммуномодулирующих свойств, анализа активности соединений против вируса' свиного гриппа A/H1N1 показано, что существует корреляция- между предсказательной способностью, программы PASS Professional 2007 и проявлением реальной биологической? активности, а также между структурой молекулы, наличием, внутримолекулярных водородных связей, наличием гидрофобных.фрагментов и биологической активностью.

Практическая; значимость. Два синтезированных тетрапептида обладают иммуномодулирующим действием, их влияние на отдельные звенья иммунной системы зависит от степени ее активации. Среди полученных веществ выделены соединения с высокой, активностью против вируса-свиного гриппа A/H1N1. Особенностью наиболее активных синтезированных противовирусных соединений, является простота их получения и экономическая; доступность.

На защиту выносятся:

• синтез модифицированных адамантильными остатками аминокислот и пептидов;

• данные компьютерных расчетов синтезированных соединений (поиск конформеров с наименьшей энергией, внутримолекулярные -водородные связи, гидрофобность, предсказание биологической активности);

• изучение биологической активности полученных соединений (иммуномодулирующее действие, активность против вируса свиного гриппа'А/ШШ);

• установление взаимосвязей между компьютерными расчетами и результатами биологической активности.

Апробация работы. Основные результаты работы представлялись на XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008), XXXV Самарской областной студенческой научной* конференции^ (Самара, 2009), VII Всероссийской интерактивной (с международным участием) конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2010), ХЫ научной конференции студентов (Самара, 2010).

Заключение диссертации по теме "Органическая химия"

выводы

2. Проведено исследование биологической активности полученных соединений. Показано, что тетрапептиды H-Lys-Ile-lle-Lys-OH и 3Ad-CO*Lys-Ile-Ile-Lys-OH обладают выраженным иммуномодулирующим действием. Изучена степень ингибирования вируса свиного гриппа А, штамм (A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl), в сравнении с известным противовирусным препаратом ремантадином, который не ингибирует репликацию вируса свиного гриппа H1N1. Среди исследованных веществ, два вещества показали максимальную степень ингибирования репликации вируса:

• H-Gly-Pro-Gly-NH-Ad - 45%;

• H-Cys(S-Ad)-NH-Ad - 100%.

• Ad-CHo-CO-D-norLeu-OH - 82%

• Ad-CH2-CO-NH-(CH2)5-COOH - 100%

Некоторые соединения, например H-Pro-Gly-NH-Ad, напротив, ускоряют вирусную репликацию.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Степанов, Евгений Александрович, Самара

1. Jones J.H. Abbreviations and symbols in peptide science: a revised guide and commentary // J. Peptide Sci. 2006. - V.12. - P. 1-12.

2. URL: http://www.roche.ru/portal/roche.ru/eightsteps

3. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки / Пер. с англ. М.: Мир, 1976. - С.159-165.

4. Шредер Э., Любке К. Пептиды / М.: Мир, 1967. Т.1. - С.24-26.

5. Якубке Х.Д., Ешкайт X. Аминокислоты. Пептиды. Белки / Пер. с нем. -М.: Мир, 1985. С.87-89.

6. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия / М.: Просвещение, 1987. -С.153-156.

7. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия / М.: Высш. шк., 1998. -С.72-74.

8. Dekker С. A., Taylor S.P., Fruton J.S., Synthesis of peptides of methionine and their cleavage by proteolytic enzymes // J. Biol. Chem. 1949. - V.180. -P. 155-173.

9. Гринштейн Дж., Винниц М. Химия аминокислот и пептидов / Пер. с англ. М.: Мир, 1961. - С.391-395.

10. Youshko М.1., van Langen L.M., Sheldon R.A., Svedas V.K. Application of aminoacylase 1 to the enantioselective resolution of a-amino acid esters and amides // Tetrahedron: Asymmetry. 2004. - V.15. - P.1933-1936.

11. Jones J. The chemical synthesis of peptides / Oxford university press, 1994. -240 p.

12. Barrett G.C., Elmore D.T. Amino acid and peptides / Cambridge university press, 1998.-224 p.

13. Lloyd-Williams P., Albericio F., Giralt E. Chemical approach of the synthesis of peptides and proteins / CRC press, 1997. 278 p.

14. Jakubke H-D. Peptide: chemistry and biologie / Spektrum Akad. Verl., 1996. -450 p.

15. Shcherbakova T.A., Korennykh A.V., van Langen L.M., Sheldon R.A., Svedas V.K. Use of high acyl donor concentrations leads to penicillin acylase inactivation in the course of peptide synthesis // J. Mol. Cat. B: Enzym. 2004. -V.31. P.63-65.

16. Щелкунов C.H. Генетическая инженерия / Учеб.-справ.пособие. 2-е изд., испр. и доп. - Сибирское университетское издательство, 2004. -496 с.

17. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы / Ин-т биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.- М.:Наука, 2004. Т. 1. - 526 с.

18. Масколюнас Р.К., Лекис А.В., Коваленко М.И. Биосинтез белка в бесклеточных белоксинтезирующих системах из миокарда кролика при тотальной ишемии // Биополимеры и клетка. 1989. - Т.5, №1. - С.84-86.

19. Brungraber E.F. A simplified procedure for the preparation of "soluble" RNA from rat liver // Biochem. and Biophys. Res. Communs. 1962. - V.8, №1. -P.l-3.

20. Wettstein F.D., Staechelin Т., Noll H. Ribosomal agregate engaged in protein synthesis characterization of the ergosomes // Nature. 1963. - V.197, №4866.- P.430-437.

21. Гершкович А.А., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов / Киев: Наук, думка, 1992. 360 с.

22. Benoition L.N. Chemistry of peptide synthesis / CRC Press, 2005. 290p.

23. Grant G.A. Synthetic peptides: a user's guide / Oxford university press, 2002. -390 p.

24. Jakubke H-D., Sewald N. Peptides from A to Z: a concise encyclopedia / Wiley-VCH, 2008.-403 p.

25. Bodansky M., Bodansky A. The practice of peptide synthesis / SpringerVerlag, 1984.-284 p.

26. Benoiton N.L., Chen F.M. Not the alkoxycarbonylamino-acid 0-acylisourea // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1981. - V.21. - P.543-545.

27. Sheehan J.C., Hess G.P. A new method of forming peptide bonds // J. Am. Chem. Soc. 1955,- V.77. - P. 1067-1068.

28. Miyazawa T., Donkai T., Yamada T., Kuwata S. Effect of copper(II) chloride on suppression of racemization in peptide synthesis by the mixed-anhydride and related methods // Int. J. Pept. Prot. Res. 1992. - V.40. - P.49-53.

29. Wieland T., Schafer W., Bokelmann E. Peptide syntheses V. A convenient method for the preparation of acylthiophenols and their application in the syntheses of amides and peptides // Ann. Chem. 1951. - V.573. - P.99-103.

30. Schwyzer R., Feuer M., Iselin B. Activated esters. III. Reactions of activated esters of amino acid and peptide derivatives with amines and amino acid esters // Helv. Chim. Acta. 1955. - V.38. - P.83-97.

31. Bodanszky M. Synthesis of peptides by aminolysis of nitrophenyl esters // Nature. 1955. - V.75. - P.685-698.

32. Kupryszewski G., Formela M. Amino acid chlorophenyl esters III. N-Protected amino acid pentachlorophenyl esters // Rocz. Chem. 1961. - V.35. - P.931-939.

33. Sheppard W.A. Pentafluorophenyl group. Electronic effect as a substituent // J. Am. Chem. Soc. 1970. - V.92. - P.5419-5425.

34. Goodman M., Stueben K.C. Amino acid active esters III. Base-catalyzed racemization of peptide active esters // J. Org. Chem. 1962. - V.27. -P.3409-3415.

35. Sewald N., Jakubke H-D. Peptides: chemistry and biology / Wiley-VCH, 2009. -578 p.

36. Hirschmann R., Schwam H., Strachan R.G. and other. The controlled synthesis of peptides in aqueous medium. The preparation and use of novel a-amino acid N-carboxyanhydrides // J. Am. Chem. Soc. 1971. - V.93. -P.2746-2749.

37. McKay F.C., Albertson N.F. New amine-masking groups for peptide synthesis // J. Am. Chem. Soc. 1957. - V.79. - P.4686-4690.

38. Schwyzer R., Sieber P., Kappeler H. On the synthesis of N-Z-butyloxycarbonyl-amino acids // Helv. Chim. Acta. 1959. - V.42. -P.2622—2624.

39. Moroder L., Hallett A., Wunsch E., Keller O., Wersin G. Di-tert-butyldicarbonat an advantageous reagent for introduction of the tert-butyloxycarbonyl protecting group // Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. -1976. — V.357. - P. 1651-1661.

40. Kates S.A., Albericio F. Solid-phase synthesis: a practical guide / Marcel Dekker, 2000. 826 p.

41. Fields G.B. Solid-phase peptide synthesis / Academic press, 1997. 780 p.

42. Rivier J.E. Somatostatin. Total solid phase synthesis // J. Am. Chem. Soc. -1974. V.96. - P.2986-2992.

43. Sarin V.K., Kent S.B., Tam J.P., Merrifield R.B. Quantitative monitoring of solid-phase peptide synthesis by the ninhydrin reaction // Anal. Biochem. — 1981.-V.117.-P.147-157.

44. Hancock S., Prescott D.J., Vagelos P.R., Marshall G.R. Solvation of the polymer matrix. Source of truncated and deletion sequences in solid phase synthesis //J. Org. Chem. 1973. - V.38. - P.774-781.

45. Sarin V.K., Kent S.B., Merrifield R.B. Properties of swollen polymer networks. Solvation and swelling of peptide-containing resins in solid-phase peptide synthesis //J. Am. Chem. Soc. 1980. - V.102. - P.5463-5470.

46. Atherton E., Clive D.L., Sheppard R.C. Polyamide supports for polypeptide synthesis // J. Am. Chem. Soc. 1975. - V.97. - P.6584-6585.

47. Zalipsky S., Chang J.L., Albericio F., Barany G. Preparation and applications of polyethylene glycol-polystyrene graft resin supports for solid-phase peptide synthesis // Reactive Polymers. 1994. - V.22. - P.243-258.

48. Stewart J.M., Young J.D. Solid phase peptide synthesis // Pierce chemical company, 1984. 177 p.

49. Gilles M.A., Hudson A.Q., Borders C.L. Stability of water-soluble carbodiimides in aqueous solution // Anal. Biochem. 1990. - V.184. - P.244-248.

50. Meldal M., Klaus B. Pentafluorophenyl esters for temporary carboxyl group protection in solid phase synthesis of N-linked glycopeptides // Tetrahedron Lett. 1990. - V.48. - P.6987-6990.

51. Meldal M., Jense K.J. Pentafluorophenyl esters for temporary protection of the a-carboxy group in solid phase glycopeptide synthesis // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1990. - P.483-485.

52. Chan W.C., White P.D. Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach / Oxford university press, 2000. 346 p.

53. Houghten R.A., Beckman A., Ostresh J.M. Use of 10% sulfuric acid/dioxane for removal of N-a-tertiary-butyloxycarbonil group during solid phase peptide synthesis // Int. J. Peptide Protein Res. 1986. - V.27. - P.653-658.

54. Merrifield R.B. Solid-phase peptide synthesis // Endeavour. 1965. - V.24. -P.3-7.

55. Bergmann М., Zervas L. A general process for the synthesis of peptides // Ber. Deutsch. Chem. Ges. 1932. - B.65. - S.l 192-1201.

56. Rosenmund K.W., Heise F. Oxidative catalytic dehydrogenation of alcohols V. Catalytic reduction of esters and aldehydes // Ber. Deutsch. Chem. Ges. -1921. B.54. - S.2038-2041.

57. Kastin A.J. Handbook of biologically active peptides / Academie press is an imprint of Elsevier, 2006. 1595 p.65.0tvos L. Antibacterial peptides isolated from insects // J. Pept. Sci. 2000. -V.6, № 10. - P.497—511.

58. Таран С. А. Синтез и антибактериальная активность аналогов N-концевого фрагмента антимикробного пептида саркотоксина IA // Биоорганическая химия. 2002. - Т.28, №5. - С.396-401.

59. Тюкавкина Н.А. Биоорганическая химия / М.: Дрофа, 2005. С.492-494.

60. Гомазков О.А. Физиологически активные пептиды / М.: ИБХ РАМН, 1995. С.50-54.

61. Преображенский Н.А. Химия биологически активных природных соединений / М.: Химия, 1970. С. 109-126.

62. Ленинджер А. Биохимия / Пер. с англ. М.: Мир, 1974. - С.956.

63. Zimmerman G.R., Legault P., Selsted M.E. Solution structure of a defensin-like peptide from platypus venom // Biochemistry, 1995.- V.34-P.13663—13665.

64. Ашмарина И.П. Нейрохимия: учебник для биологических и медицинских вузов. — 2-е изд. / М.: . Институт биомедицинской химии РАМН, 1996. -470 с.

65. Гудашева Т.А., Сколдинов А.П. Стратегия создания дипептидных нейропсихотропных лекарственных препаратов // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2003. - Т.66, № 2. - С. 15-20.

66. DeWied D. Neurotrophic effects of ACTH/MSH neuropeptides // Acta Neurobiologicae Experimentalis. 1990. - V.50. - P.353 - 366.

67. Sewald N., Jakubke H-D. Peptides: Chemistry and Biology / Pierce Chemical Company, 2002. P.407-410.

68. Nicolaides E., DeWald H„ Westland R., Lapnik M., Posler J. Potential antiviral agents. Carbobenzoxy Di- and Triprptides. Active against Measles and Herpes viruses // J. Med. Chem. 1968. - V. 11. - P.74-79.

69. Balzarini J., Andersson E., Schols D., Proost P., Van Damme J., Svennerholm В., Horal P., Vahlne A. Obligatory involvement of CD26/dipeptidyl peptidase IV in the activation of the antiretroviral tripeptide glycylprolylglycinamide

70. GPG-NH2) 11 The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. -2004. №.34. - P. 1848-1859.

71. Andersson E., Horal P. No cross-resistance or selection of HIV—1 resistant mutants in vitro to the antiretroviral tripeptide Glycile-Prolyl-Glycine-amide // Antiviral research. 2004. - V.61. - P. 119-124.

72. Andersson E., Horal P. Glycine-amideis an active metabolite of the antiretroviral tripeptide Glycile-Prolyl-Glycine-amide // Antimicrobial agents and Chemotherapy. 2005. - V.49, №1. - P.40-44.80.URL: http://www.hexal.com

73. Samonina G., Ashmarin I., Lyapina L. Glyproline peptide family: review on bioactivity and possible origins // Pathophysiology. 2002. - V.8. - P.229-234.

74. Багликова K.E. Исследование противоязвенных эффектов дериватов коллагена пролин- и гидроксипролинсодержащих олигопептидов: автореф. дис. канд. биол. наук. Москва, 2007.

75. Мартынова К.В., Андреева JI.A., Климова П.А. и др. Структурно-функциональное исследование глицин- и пролинсодержащих пептидов (глипролинов) как потенциальных нейропротекторов // Биоорганическая химия. 2009. - Т.35, №2. - С. 165-171.

76. Жохов С.С., Костанян С.С., Гибанова Н.В. и др. Различные механизмы протекторного и дифференцирующего действия гомологических пептидов TGENHR и TQVEHR // Биохимия. 2004. - Т.69, вып.8. -С. 1059-1070.

77. Harris A., Cardone G., Winkler D.C., Heymann J.В., Brecher M., White J.M., Steven A.C. Influenza virus pleiomorphy characterized by cryoelectron tomography // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. - V.103 (50) . - P.19123-19127.

78. Nayak D.P., Balogun R.A., Yamada H., Zhou Z.H., Barman S. Influenza virus morphogenesis and budding // Virus Res. 2009. - V. 143, №2. - P. 147-161.

79. Skehel J.J., Wiley D.C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin // Annu. Rev. Biochem. 2000. - V.69. - P.531-569.

80. Schroeder C., Heider H., Moncke-Buchner E., Lin T.I. The influenza virus ion channel and maturation cofactor M2 is a cholesterol-binding protein // Eur. Biophys. J. -2005. V.34, №1. - P.52-66.

81. Newcomb L.L., Kuo R.L., Ye Q., Jiang Y., Tao Y.J., Krug R.M. Interaction of the influenza a virus nucleocapsid protein with the viral RNA polymerase potentiates unprimed viral RNA replication // J. Virol. 2009. - V.83, №1. -P.29-36.

82. Sullivan S.J., Jacobson R.M., Dowdle W.R., Poland G.A. 2009 H1N1 Influenza // Mayo. Clin. Proc. 2010. - V.85, №1. - P.64-76.

83. Smith G.J., Vijaykrishna D., Bahl J., and others. Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic // Nature. -2009. V.459, №7250. - P. 1122-1125.

84. URL: http://visualscience.ru/illustrations/modelling/gripp-HlNl/

85. Морозов И.С., Петров В.И., Сергеева С.А. Фармакология адамантанов / Волгоград: Волгоградская медицинская академия, 2001. 320 с.

86. Моисеев И.К., Багрий Е.В., Зефиров Н.С. Успехи химии адамантана / Сборник обзорных статей. М.: Химия, 2007. - 320 с.

87. Индуген М.К. Механизмы антивирусного действия производных адамантана / Под ред. М.К. Индугена. Рига: Зинатне, 1981. 163 с.

88. РЖ Химия 2001,- 10,- 19067К.

89. Литвинов В.П. Биологическая активность производных адамантана // ХГС. 2002. - №1. - С. 12-39.

90. РЖ Химия 2002,- 15,- 19061.

91. ЬСрасуцкий П. А., Семенова И.Г., Новикова М.И., Юрченко А .Г. а-аминокислоты ряда адамантана // ЖОрХ. 1985. - Т.21, вып.9. -С.1905-1910.

92. Красуцкий П.А., Семенова И.Г., Новикова М.И. // Хим. Фарм. Ж. -1985.-№7.-С.825-829.

93. Roscic М., Sabijic V., Mlinaric-Majerski К., Horvat S. In vitro enzymatic stabilities of methionine-enkephalin analogues containing an adamantane-type amino acid // Croat. Chem. Acta. 2008. - V.81, №4. -P.637-640.

94. Пурыгин П.П., Данилин А.А., Макарова H.B., Моисеев И.К. N-адамантаноил- и N-адамантилацегиламинокислоты // ЖОрХ. — 1998. -Т.34, вып. 10. — С. 1572-1573.

95. Adamantyl containing peptides: Unites States patent: 4,387,049. Jun.7, 1983.

96. Степанов Ф.Н., Исаев С.Д., Васильева З.П. а-Галогензамещенные кетоны и альдегиды ряда адамантана // ЖОрХ. 1970. — Т.6, вып.1. -С.51-55.

97. Bodansky M. Acylation of amino acids with acid chlorides of carboxylic acids // J. Protein Chem. 1985. - V.4, №2. - P.69-86.

98. Merrifield R.B. Solid phase synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. // J. Am. Chem. Soc. 1963. - V.85. - P.2149-2154.

99. Sheehan J.C., Hess G.P. A new method of forming,peptide bonds // J. Am. Chem. Soc. 1955. - V.77. - P. 1067-1068.

100. Benoiton N.L., Chen F.M. Reaction of N-t-butoxycarbonylamino acid anhydrides with tertiary amines and carbodiimides. New precursors for 2-t-butoxyoxazol-5(4H)-one and N-acylureas // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1981. - V.23. - P. 1225-1227.

101. Heinrich M.R., Klisa H.S., Mayr H. Enhancing the Catalytic Activity of 4-(Dialkylamino)pyridines by Conformational Fixation // Angew. Chem. -2003. VI15. - P.4975-4977.

102. Fu G.C. Asymmetric Catalysis with «Planar Chiral» Derivatives of 4-(Dimethylamino)pyridine // Acc. Chem. Res. 2004. V37. - P.542-547.

103. Shangjie X., Held I., Kempf B., Mayr H., Steglich W., Zipse H. The DMAP-Catalyzed acetylation of alcohols a mechanistic study // Chem. Eur. J. - 2005. - V. 11.-P.4751-4757.

104. Kisfaludy L., Ceprini M.Q., Rakoczy B., Kovacs J. Pentachlorophenyl and pentafluorophenyl esters of peptides and the problem of racemization II, in HC Beyerman, A van de Linde, W Massen van den Brink, eds. // Peptides, Proceedings of the 8th.

105. Bodanszky M. Active esters in peptide synthesis, in Gross E., Meienhofer J., eds. / The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Academic, New York. -1979. - P.105-196.

106. Гершкович А.А., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов / Киев: Наук, думка, 1992.-С.315.

107. Карякин Ю.В., Ангелов И.И. Чистые химические вещества / М.: Химия, 1974.-С.301.

108. Брауэр Г. Руководство по неорганическому синтезу / Пер. с нем./под редакцией Брауэра Г.-М.:Мир, 1985. Т.5. - С. 1805-1808, 1828-1831.

109. Кнунянц И.Л. Реагенты для органического синтеза / Пер. с англ./под ред. Кнунянца И.Л. М.: Мир, 1970. - Т.З. - С.53.

110. Audie J., Boyd С. The synergistic use of computation, chemistry and biology to discover novel peptide-based drugs: the time is right //Curr. Pharm. Des. -2010. V. 16. - P.567-582.

111. Baldisserotto A., Ferretti V., Destro F., Franceschini C., Marastoni M., Gavioli R., Tomatis R. a,(3-Unsaturated N-acylpyrrole peptidyl derivatives: new proteasome inhibitors // J. Med. Chem. 2010. - V.53. - P.6511-6515.

112. Dal Ben D., Antonini I., Buccioni M., Lambertucci C., Marucci G., Vittori S., Volpini R, Cristalli G. Molecular modeling^ studies on the human neuropeptide S receptor and its antagonists // Chem. Med. Chem. 2010. -V.5. - P.371-383.

113. Fjell C.D., Hancock R.E.W., Jenssen H. Computer-aided design of antimicrobial peptides // Curr. Pharm. Anal. 2010. - V.6. - P.66-75.

114. Поройков B.B., Филимонов Д.А., Степанчикова A.B. и др. Оптимизация синтеза и фармакологического исследования веществ на основекомпьютерного прогнозирования их спектров биологической активности // Хим.-фарм. журнал. 2002. - №9. - С.20-23.

115. Поройков В.В. Компьютерное предсказание биологической активности веществ: пределы возможного // Химия в России. 1999. - №2. - С.8-12.

116. Филимонов Д.А., Лагунин А.А., Поройков В.В. Виртуальная система предсказания спектра биологической активности химических соединений // Хим.-фарм. журнал. 2002. - №10. - С.21-26.

117. Глоризова Т.А., Филимонов Д.А., Лагутин А.А. и др. Тестирование компьютерной системы предсказания спектра биологической активности PASS на выборке новых химических соединений // Хим.-фарм. журнал. 1998. - № 1. - С.33-39.

118. Мартынова Н.Б., Филимонов Д.А., Поройков В.В. Компьютерное прогнозирование спектра биологической активности низкомолекулярных пептидов и пептидомиметиков // Биоорганическая химия. 2000. - Т.26, №5. - С.330-339.

119. Гомазков О.А. Пептиды в кардиологии: биохимия, физиология, патология, информация, анализ / М.: Материк-альфа, 2000. 144 с.

120. Luo W., Mani R., Hong M. Side-Chain Conformation of the M2 Transmembrane Peptide Proton Channel of Influenza A Virus from 19F Solid-State NMR // J. Phys. Chem. B. 2007. - V. 111. - P. 10825-10832.

121. Wang J-F., Wei D-Q., Chou K-C. Insights from investigating the interaction of adamantane-based drugs with the M2 proton channel from the P11N1 swine virus // Biochemical and Biophysical research communication. — 2009. V.388.-P.413-417.

122. Гинзбург О.Ф. Лабораторные работы по органической химии / Под ред. Гинзбурга О.Ф. М.: Высшая школа, 1974. - С.51-55.

123. Вайсбергер А., Проскауэр Э., Риддик Дж., Тупс Э. Органические растворители / Пер. с англ. Тихомировой Н.Н. М.: Издательство иностранной литературы, 1958. - 519 с.

124. Stewart J.M., Young J.D. Solid phase peptide synthesis // Pierce chemical company, 1984. P.76-111.

125. Kaiser E., Colescott R.L., Bossinger C.D., Cook P.I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides // Anal. Biochem. 1970. -№34. - P.595-598.