Сканирующая силовая спектроскопия наноструктурированных полимерных и биологических систем тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.01 ВАК РФ

ФГУП Государственный научный центр Российской Федерации Институт теоретической и экспериментальной физики

На правах рукописи

Голутвнн Игорь Андреевич

Сканирующая силовая спектроскопия наноструктурированных полимерных и биологических систем

Специальность 01.04.01 - приборы и методы экспериментальной

физики

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в ФГУП ГНЦ РФ Институте теоретической и экспериментальной физики

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор физико-математических наук,

профессор Суворов А.Л.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор физико-математических наук,

профессор Неволин В.К.

кандидат физико-математических наук Савранский В.В.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Московский инженерно-физический

институт, кафедра №9

Защита состоится "«юкз 2004г. в [/ТгТР на заседании

Диссертационного Совета Д.201.002.01 Института теоретической и экспериментальной физики по адресу 117218 Москва, Б.Черемушкинская, 25

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института теоретической и экспериментальной физики

Автореферат разослан "2$ " а^слЛ. 2004г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы; Стремительное развитие биотехнологий обуславливает необходимость создания инструментов и методов для изучения характеристик биологических и полимерных систем в нанометровом диапазоне. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) является одним из основных инструментов для исследования поверхности различных систем с разрешением порядка нескольких нанометров. Топографическая информация, полученная при помощи АСМ, может быть дополнена информацией о локальных поверхностных свойствах объекта за счет применения метода сканирующей силовой спектроскопии (ССС). Этот метод является естественным продолжением метода АСМ и основан на возможности измерения отклика поверхности образца в ответ на приложенную силу давления со стороны зонда микроскопа. Учитывая, что величина этой силы составляет всего несколько наноньютонов (нН), метод ССС позволяет исследовать локальные микро- и наномеханические свойства поверхности, а возможность построения карты поверхностного распределения этих свойств одновременно с получением информации о топографии существенно расширяет набор характеристик описывающих исследуемый объект. Такая информация особенно интересна при анализе образцов с пониженной механической жесткостью поверхности, т.е. биологических и полимерных систем. Актуальность темы диссертационной работы обусловлена необходимостью разработки новых методов для исследования поверхностного распределения топографических механических и адгезивных характеристик полимерных и биологических систем в нанометровом диапазоне при- помощи комбинации АСМ и ССС. Выбор объектов исследования (наноструктурированных блок сополимеров, многослойных самоорганизующихся пленок на основе амфифильных полиэлектролитов, сформированных по технологии «слой-за-слоем» (СЗС) и вирусных частиц) объясняется растущим интересом к разработке новых

функциональных материалов, на

БИБЛИОТЕКА [

биомедицинских приложений, а также необходимостью развития новых диагностических подходов для обнаружения опасных для человека болезнетворных агентов.

Цели диссертационной работы:

- Исследование методами АСМ и ССС поверхностного распределения механических и топографических свойств наноструктурированных полимерных систем и изучение полимерных пленок сформированных по технологии СЗС.

- Получение новой информации о морфологических и структурных свойствах отдельных вирусных частиц на основе данных АСМ и ССС

- Исследование возможности применения АСМ и ССС для анализа образцов на предмет обнаружения опасных вирусов

- Разработка новых подходов к исследованию локальных механических характеристик поверхности методами АСМ и ССС

Для достижения поставленных целей был проведен ряд экспериментальных исследований, представленных в диссертационной работе, а также было разработано многофункциональное программное обеспечение, позволяющее значительно повысить эффективность анализа и упростить интерпретацию экспериментальных данных.

Научная новизна работы: В диссертации получены и выносятся на

защиту следующие основные результаты:

1. Разработана методика силового картирования, позволяющая определять относительные локальные механические характеристики поверхности, исходя из величины работы, затрачиваемой на деформацию поверхности образца.

2. Впервые проведено силовое картирование наноструктурированного блоксополимера стирол-бутадиен-стирола и определены его поверхностные наномеханические свойства.

3. Впервые исследовано поверхностное распределение механических и адгезивных свойств многослойных СЗС конструкций в нанометровом

диапазоне и изучена взаимосвязь механических свойств с топографическими особенностями поверхности для различных типов СЗС конструкций

4. Впервые проведено ЛСМ исследование вирусов полиомиелита, ротавируса и аденовируса на различных типах подложек и изучена микромеханика отдельных вирусных частиц при помощи метода ССС.

Практическая значимость работы:

1. Создано оригинальное многофункциональное программное обеспечение для анализа данных СЗМ, позволяющее в частности проанализировать данные ССС, повысить эффективность и упростить интерпретацию полученных результатов.

5. Разработаны подходы к исследованию распределения поверхностных свойств для различных типов СЗС конструкций, а также для контроля качества формируемых покрытий.

6. Разработаны методики наблюдения модельных вирусов в АСМ и исследована возможность применения АСМ на начальных этапах анализа водных проб на предмет обнаружения опасных вирусов. За счет применения метода ССС расширен набор характеристик описывающих отдельную вирусную частицу.

Структура и объем диссертации:

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы из 141 наименования. Она содержит 131 страницу, в том числе 46 рисунков и 5 таблиц.

Апробация работы:

Основные результаты диссертационной работы были доложены на семи международных конференциях: 5h ISTC Scientific Advisory Committee Seminar "NANOTECHNOLOGIES in the area of physics, chemistry and biotechnology (St. Petersburg, 2002), 5th International Congress "ECWATECH-2002 water ecology and technology (Moscow, 2002), 1-st

International Congress "BIOTECHNOLOGY - state of the art and prospects of development (Moscow, 2002), International Workshop on Micro Robots, Micro Machines and Micro Systems International Advanced Robotics Program (Moscow, 2003), 1st FEMS Congress of European Microbiologists (Ljubljana, Slovenia,2003), 12th International Conference on Scanning Tunneling Microscopy/Spectroscopy and Related Techniques (Eindhoven, The Netherlands, 2003), 7th INTERNATIONAL MOSCOW SCHOOL OF PHYSICS (Otradnoye, 2004).

Публикации:

Основные результаты диссертации отражены в 7 научных работах из них: две статьи опубликованных в реферируемых журналах, 2 опубликованных доклада на международных конференциях, 1 статья в виде внутренней публикации ИТЭФ и 2 статьи приняты к печати.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность выбранной темы диссертации, сформулирована цель исследований, дано краткое содержание глав диссертации.

В Главе I описаны основные принципы атомно-силовой микроскопии. При этом в первой части главы речь идет об устройстве атомно-силового микроскопа и основных режимах его работы, а во второй части произведен анализ сил, которые возникают при взаимодействии зонда с поверхностью образца. В третьей и четвертой частях первой главы приведен обзор литературных данных посвященный применению методов АСМ и ССС для исследования биологических и полимерных систем.

Глава II посвящена методам определения механических характеристик поверхности при помощи АСМ и ССС. Возможность измерения механических характеристик поверхности при помощи АСМ заключена в силовом характере взаимодействия зонда и образца. Анализируя силы, возникающие между зондом и образцом в каждом конкретном случае и контролируя изгиб балки кантилевера можно

определить изменение топографии поверхности, обусловленное силой давления зонда на образец. Для определения величины контактного давления, которое при этом возникает необходимо произвести калибровку прибора, которая производиться при помощи силовых кривых. Силовая кривая АСМ представляет собой зависимость изгиба балки кантилевера от расстояния между кантилевером и поверхностью образца, построенную для заданной точки поверхности, и для заданной величины максимальной силы давления (рис. 1). Исходя из этой зависимости, можно установить величину силы, которая необходима для деформации образца на заданную величину, и определить механические и адгезионные характеристики поверхности. Силовая кривая АСМ полученная на жестком образце приведена на рис. 1.

При большом расстоянии между зондом и образцом (точка 1) сила взаимодействия равна нулю. При приближении к поверхности кантилевер может отклониться вниз (к образцу) за счет сил притяжения (точка 2), до тех пор, пока зонд не придет в контакт, при этом мы будем наблюдать отрицательный | изгиб кантилевера. При

дальнейшем подводе зонда к поверхности, изгиб балки кантилевера становится

Полож«ии« mmmmm (им)

положительным (точка 4) и силовая п , „ лГ...

4 ' Рнс. I Силовые кривые АСМ при

кривая начинает расти. Часть подводе и отводе зонда от поверхности

кривой, описывающая приближение образца зонда к образцу может быть использована для определения различных поверхностных сил. В случае если образец мягкий и деформируется под воздействием зонда, силовая кривая вообще говоря будет отличаться от случая жесткого образца. На рис. 2 приведены силовые кривые для этих двух случаев.

При построении силовых кривых обычно получают зависимость

изгиба кантилевера ДZc от положения образца по отношению к зонду

ДZp. На абсолютно жестком образце перемещению сканера дZp

соответствует отклонение кантилевера .ДZc, при ЭТОМ ДZp=дZc. В случае

мягкого образца, ДZc<ДZp, что объясняется деформацией образца под воздействием зонда (рис. 3).

Рис. 2 Силовые кривые АСМ для жесткого и мягкого образцов, полученные при подводе зонда к поверхности образца.

При этом величина D=дZp - ДZc' будет определять величину проникновения зонда внутрь образца или деформацию образца.

Рис. 3. Упругая деформация образца зондом АСМ. Пунктирная линия соответствует ситуации, когда на поверхность образца не действует никакая сила, и-соответственно нет деформации поверхности.

Если деформация образца является упругой, то зависимость размера области контакта и величины деформации от контактного давления может, быть получена аналитически. Первой теорией, которая описывала-механический контакт двух твердых тел, была теория Герца. Согласно этой теории в случае, когда контактирующие тела имеют сферическую геометрию (а именно такой случай часто используется при интерпретации данных АСМ):

{ я + *')

, где а - радиус области контакта, К = -у-—— +

где Е, Е', а и а' модули Юнга и Пуассона материалов зонда и образца, a F - сила давления, связанная с изгибом кантилевера по закону Гука. Для величины h - сближения зонда и образца за счет контактных деформаций:

Применение теории контактных деформаций для анализа данных АСМ сопряжено с рядом трудностей. Во-первых, для непосредственного определения модуля Юнга необходимо знать геометрию зонда. При применении теории Герца или других более сложных (ДКР, ДМТ, МД; эти модели также рассмотрены в главе II настоящей работы), обычно аппроксимируют зонд сферой радиуса R, ив этом случае модуль Юнга будет зависеть от радиуса кривизны зонда, определение которого является трудной задачей. Во вторых, неопределенность, связанная с нахождением точки контакта, может привести к ошибкам при нахождении величины деформации образца и определении модуля Юнга. Кроме того, каждый из описанных теоретических подходов к анализу силовых кривых имеет ряд ограничений. В настоящей работе для анализа силовых кривых использовалась модель Герца. Предпочтение этой модели было отдано в силу следующих причин: во всех экспериментах вклад сил адгезии был невелик по сравнению с контактной силой давления; вычисление энергии взаимодействия зонд-образец для применения более сложных моделей являлось трудной и не всегда выполнимой задачей; основной интерес уделялся не абсолютным значениям модуля Юнга, а относительным механическим характеристикам поверхности.

Трудности, связанные с неопределенностью формы зонда и необходимостью нахождения точки контакта могут быть преодолены, в случае если требуется определить не абсолютные, а относительные значения локального модуля Юнга. Для этого необходимо для каждой точки анализируемого участка поверхности записать силовую кривую в

координатах и провести их анализ. Возможность построения

такого рода массивов и проведения силового картирования поверхности

А = РУ> К2

(1)

заложена в конструкции современных АСМ. В случае применения силового картирования не так важна величина модуля упругости, как его изменение при сканировании от точки к точке и во времени. Поскольку силовое картирование является новой опцией, то методы анализа массивов силовых кривых, а также соответствующее программное обеспечение еще недостаточно развиты. Действительно, для того чтобы построить карту распределения механических характеристик по поверхности образца, на основании записанного массива силовых кривых, необходимо каждой кривой поставить в соответствие некоторую величину, характеризующую эту силовую кривую. Обычно в качестве такой величины выбирают отклонение кантилевера при фиксированном

положении кантилевера. То есть массиву силовых кривых {AZc,(AZp)|

ставится в соответствие массив (N - количество элементов в массиве силовых кривых, обычно эта величина составляет 64x64 силовых кривых). В силу значительной неопределенности связанной с нахождением точки контакта эта величина недостаточно полно отображает локальные характеристики поверхности.

^аш оригинальный подхо, аш оригинальный подхо

дд

к силовому картированию заключается в к силовому картированию заключается в

вычислении той работы, которая затрачивается на деформацию вычислении той работы, которая затрачивается на деформацию

ВДВШ8 § ШШ8Й18111; Ш Ш8?8Й ЙШ ШШ ЖШ I

Для этого рассмотрим силовую кривую в координатах д2с(0) (рис. 4).

Рис. 4. Силовые кривые в координатах &Хс(Ц), записанные для жесткого и мягкого образцов при подводе зонда к поверхности.

Отметим что площадь под силовой кривой представляет собой работу А, которую система совершает при деформации образца. В случае мягких, деформируемых образцов эта величина существенно отлична от нуля. В случае жестких образцов, поверхность не деформируется и работа

практически равна 0. Карта распределения величины А по поверхности может быть использована для сравнения упругих характеристик различных точек поверхности. Действительно, в случае контакта сферического зонда и плоского образца по теории Герца:

Р^В-Л? (2)

где - сила давления на образец, а

(3)

где Е - локальный модуль Юнга, Я, - радиус кривизны зонда, а„ - модуль Пуассона образца. Тогда работа силы F

А = ]р<Ю = --В-4й> , о ^

А, _ а А, \-<т\)

где А/ и А2, ¿1 и Ы2, Е1 и Е2,

соответственно работа, деформация, локальный модуль Юнга и модуль Пуассона для двух различных точек 1 и 2 анализируемого участка

поверхности. Величину

К №

можно определить из условия равенства

сил давления в точках 1 и 2: откуда

А, (4) и окончательно получаем — = ——=--— (4)

А* 1-<т,2)2

Формула (4) может быть использована для сравнения упругих характеристик различных участков поверхности, исходя из значений величины А, которая может быть непосредственно определена по силовым кривым АСМ которые записаны в координатах Zc(D) для сравниваемых участков поверхности. Следует отметить, что такой подход по сравнению с методом определения абсолютных значений модуля Юнга позволяет избежать ошибок, связанных с неопределенностью формы

зонда и с необходимостью точного нахождения точки контакта. Кроме того, он не зависит от жесткости кантилевера.

При проведении силового картирования поверхности обычно получают массив силовых кривых с размерностью не менее 64 х 64, для достижения приемлемого пространственного разрешения. Очевидно, что для обработки таких объемов информации необходимо специальное программное обеспечение, поскольку описанные операции перехода к координатам вычисления работы при деформации, определения

работы и величины силы адгезии не входят в стандартный пакет обработки данных современных атомно-силовых микроскопов. Разработанное нами программное обеспечение NanoScale Explorer помимо базовых операций по обработке АСМ изображений позволяет также работать с массивами силовых кривых и графически интерпретировать результаты. Программа позволяет выполнять следующие операции:.

Анализ силовых кривых

1. Масштабирование силовых кри вых

2. Преобразование координат от

дгсогр) к ьхсф), где о=дгр -д2с

3. Вычисление площади под силовой

кривой дгсф), соответствующей работе совершаемой ■ при деформации образца (величина А)

4. Построение карты распределения величины А по поверхности

5. Вычисление силы адгезии по силовой кривой отвода

6. Вычисление работы силы адгезии

7. Построение карты распределения силы адгезии по поверхности

8. Определение . среднего значения величины А и силы адгезии по кадру.

9. Определение тангенса угла наклона силовой кривой

10. Возможность изменения калибровочного коэффициента_

Базовые операции

1. Масштабирование

2. Вычитание плоскости постоянного наклона

3. Усреднение

4. Медианная фильтрация

5. Усреднение по строкам

6. Быстрое преобразование Фурье

7. Трехмерная! реконструкция поверхности

8. Построение гистограмм

9. Возможность определения уровня • подложки.

10. Построение сечений и определение расстояний,

11.Возможность определения углов

12. Определение средней высоты

13.Вычисление основных статистических моментов

14.Определение коэффициента

корреляции для двух различных кадров

В Главе III настоящей работы приводятся экспериментальные данные исследования наноструктурированных полимерных систем при помощи методики силового картирования. В первой части, главы описываются результаты исследования блоксополимеров, поскольку эти объекты являются удобными моделями для тестирования методики силового картирования. В качестве модельной системы для осуществления силового картирования был выбран наноструктурированный полимер -триблочный стирол-бутадиен-стирол (СБС) блоксополимер. Уникальность СБС блоксополимеров связывают с процессом микрофазного разделения, вследствие несовместимости (ограниченной совместимости) компонентов блоков. Это явление приводит к тому, что СБС пленка содержит включения полибутадиена в матрице полистирола, что делает ее идеальной системой для тестирования предложенного подхода к силовому картированию.

В процессе работы при помощи силовых кривых АСМ было проведено исследование распределения локальных упругих характеристик поверхности СБС пленок. При этом поверхность пленки сначала сканировалась в режиме постоянного контакта для снятия топографической карты, после чего выбирался определенный участок поверхности, и для выбранного участка производилось снятие массива силовых кривых, который в дальнейшем использовался для исследования поверхностного распределения механических и адгезивных свойств.

На рис. 5 г приведена карта распределения величины А по участку поверхности СБС пленки а на рис. 5а и 5в показана топография того же участка полученная в режиме постоянного контакта и в режиме снятия силовых кривых соответственно. При этом светлые области на топографической карте соответствуют включениям полистирола (ПС),.. а темные - включениям полибутадиена (ПБ). Для области, представленной на рис.5а был получен массив, состоящий из 64x64 силовых кривых и, параллельно с топографией, были построены распределения работы и адгезионной силы по поверхности образца (рис. 5 г,б).

A - Топография СБС пленки полученная в режиме постоянного контакта, при минимально возможной силе взаимодействия зонд-образец

Б - Распределение силы адгезии зонда АСМ к образцу по поверхности СБС пленки (Анализируется тот же участок поверхности, что и на рис А и В) Сила адгезии для полибутадиена составляет а для

полистирола (1 71 ±0,05 нН)

В - Топография поверхности СБС пленки полученная в режиме силового картирования Разрешение 64x64 точки

Г - Распределение работы при деформации по поверхности СБС пленки (Анализируется тот же участок поверхности, что и на рис А и В) Стрелками отмечены включения ПБ(1) и ПС(2) Анализируя силовые кривые для ПБ и ПС получаем модуль Юнга для ПБ Е=(2,1 ±0,4)* 10* Па, а для ПС Е=(1,0 ±0,3)4 О9 Па.

Рис. 5 Распределение топографических, механических и адгезивных свойств по поверхности наноструктурированного СБС блоксополимера

В АСМ принято, что светлые участки по высоте превосходят темные участки В соответствии с принятыми нами обозначениями для отображения результатов силового картирования, темные области

означают малую величину работы при деформации, а светлые - большую. При построении карт адгезии аналогично более светлые области означают более высокую силу адгезии зонда АСМ к поверхности образца. Таким образом, на рис. 5г темные области соответствуют малой величине работы системы. Хорошо видно, что рис. 5в является инвертированным по отношению к рис. 5г. Коэффициент корреляции между этими двумя картами (картой топографии и картой распределения работы при деформации) составляет -0,67, между картами топографии и картой распределения силы адгезии составляет -0,71. Таким образом, во-первых, включения полибутадиена соответствуют более мягким областям, и во-вторых для этих областей сила адгезии зонда АСМ к поверхности больше чем для случая полистирола. Это означает что включения полистирола жестче, чем включения полибутадиена (этот факт, вообще говоря, является предсказуемым результатом, поскольку объемный модуль Юнга для полибутадиена меньше соответствующей величины для полистирола), что подтверждает работоспособность предложенного подхода.

Во второй части главы ГГ приведены результаты исследования многослойных самоорганизующихся пленок на основе амфифильных полиэлектролитов, сформированных по технологии «слой-за-слоем», которые широко применяются в биотехнологиях. Процесс нанесения покрытий по технологии СЗС дает возможность создавать комплексы полиэлектролитов поликатион-полианион, осуществляя последовательное нанесение молекулярных слоев, и таким образом обеспечивая беспрецедентный уровень контроля химического состава и функциональности формируемых конструкций. Важнейшей стадией разработок по промышленному применению СЗС технологий является оптимизация методов формирования такого рода конструкций как по физическим параметрам процесса (температура, время, состав среды), так и по химическому составу полиэлектролитов. Используемые для этой цели методы контроля толщины и однородности пленок не позволяют судить о характере распределения включений и физико-химических свойств пленок в нанометровом диапазоне, в то время как для большинства потенциальных приложений СЗС конструкций это знание абсолютно необходимо. Методы

ACM и ССС могут быть эффективно использованы для решения этой задачи. В работе были исследованы два вида пленок поликатион/полианионгпленки в которых к качестве полианиона использовался полианетолсульфонат натрия, а к качестве поликатиона -полидиметилдиаллинаммоний- хлорид (образец А) и пленки в которых в качестве полианиона использовалась полиакриловая кислота, а в качестве поликатиона - полютилвинилпиридин (образец В).

Полианетол-сульфонат натрия

Полидиметилдиашшл Полиакриловая

аммонии-хлорид

CHj —сн-£н- г

(Q3~SC?Ni

I осн, я ^

Ф =

HjC

сыг-(-©

OJj

-jcHj —сн^-

«р* о он

Вначале получали данные о топографии поверхности в режиме АСЫ после чего строилась карта распределения механических и адгезивных свойств по поверхности пленки и анализировалась их взаимосвязь с топографическими особенностями. На рис. 6 приведена топография СЗС пленок для образцов А и В. Хорошо видно, что пленка А имеет более гомогенную структуру, чем пленка В, что количественно выражается в большей шероховатости поверхности (таблица 1)

Рис. 6. Топография СЗС пленок Образец А(слева), образец В (справа) Образец В характеризуется большей шероховатостью поверхности

we-'й " V» 'i "

■f fc J i > 1 л». Ч

»4^4 * * »

Распределение механических и адгезивных свойств по поверхности для образца А гомогенно, а для образца В гетерогенно. Из гистограммы распределения работы при деформации, видно что эти гистограммы имеют в случае В два пика, а в случае А один пик при (рис. 7). Аналогичная ситуация наблюдается и с силой адгезии зонда к поверхности пленки

Рис. 7 Гистограмма распределения работы при деформации по площади 1мкм2 поверхности СЗС пленок для образца А(слева) и образца В (справа).

Следовательно, у образца В можно выделить четко выраженные «жесткие» и «мягкие» области соответствующие участкам с маленькой и большой работой при деформации соответственно. Анализ топографических карт записанных параллельно с силовым картированием поверхности позволяет говорить о том, что более жесткие участки пленки на карте распределения работы, соответствуют холмикам на топографической карте. Корреляция карт топографии и работы составляет -0,63, а карт адгезии и топографии -0,65. Графически, этот результат представлен на рис. 8, причем для удобства восприятия карты работы при деформации и адгезии были инвертированы. Данные по обоим образцам, включая точечные оценки значений модуля Юнга, посчитанных по соответствующим силовым кривым сведены в таблицу 1.

Образец А В

Количество бислоев 16 16

Шероховатость поверхности (нм) 1 5

Работа при деформации (эВ) 0.53±0.11 Область 1 Область 2

0 24±0.13 0 53±0.16

Модуль Юнга (Па) (3.9*1.1)10' (1.9*0.6)-10* (8 2±2.3)-10'

Сила адгезии (нН) 1.4±0.3 • 2.7±0.4 3.8±0.4

Таблица 1. Поверхностные свойства СЗС пленок

Рис. 8 Взаимосвязь топографических, механических и адгезивных свойств для образа В.

А - топография поверхности СЗС пленки.

В - Распределение работы при деформации по поверхности СЗС пленки, для того же участка. Силовые кривые, снятые в точках 1 и 2 приведены слева, внизу. С - Распределение силы адгезии по поверхности пленки для того же участка.

Таким образом, применение комбинированного метода АСМ и ССС, основанного на вычислении работы системы при деформации, для каждого анализируемого участка поверхности, дает возможность проанализировать поверхностное распределение топографических, механических и адгезивных свойств для различных наноструктрурированных полимерных систем. При этом в ряде случаев могут быть определены абсолютные и относительные значения поверхностного модуля Юнга, как например в случае СБС пленок. Применение методов силовой спектроскопии для исследования двух различных СЗС пленок позволило выявить их различные механические и топографические свойства. При этом была обнаружена корреляция механических свойств с топографией исследуемых пленок. Полученные результаты показывают большой потенциал методов АСМ и сканирующей силовой спектроскопии для всестороннего исследования и контроля качества формируемых полимерных конструкций в нанометровом диапазоне, а разработанное программное обеспечение NanoScale Explorer, реализующее подход к силовому картированию, описанный в главе II, позволяет значительно повысить эффективность анализа массивов силовых кривых и упростить интерпретацию полученных экспериментальных данных.

В Главе IV диссертационной работы приведены результаты исследования вирусных частиц при помощи методов АСМ и ССС и исследована возможность применения АСМ для идентификации и детектирования опасных для человека вирусов, при проведении анализа проб питьевой воды. В качестве модельных вирусов использовали полиовирус типа 1 вакцинного штамма Сэбина Lse2ab, обезьяний ротавирус S А 11 и аденовирус 6 типа штамма TosШ.

Описана методика нанесения вирусов на подложки, не обладающие иммунологической специфичностью, получены высококачественные АСМ изображения модельных вирусов и определены их морфологические характеристики (рис. 9). За счет применения метода ССС и методики силового картирования было также проведено исследование механических характеристик модельных вирусов. Отметим, что эти измерения производились одним и тем же зондом, что позволило сравнить относительные характеристики, модельных вирусов, при этом, при заданной силе максимального давления (1 нН) аденовирус оказался «жестче» чем ротавирус. Полученные данные о морфологических и механических характеристиках модельных вирусов представлены в таблице 2.

Наименование Форма Высо>а (нм) Диаметр (нм) Модуль Юнга (Па)

АСМ ЭМ АСМ ЭМ

Аденовирус икосаэдр 75 70-90 82 70-90 2,7*108

Ротавирус икосаэдр 65 70 75 70 1Ч0"

Вирус полиомиелита икосаэдр 29 24 31 28 -

Наименование Форма Высота (нм) Длина (нм) Модуль Юнга (Па)

АСМ ЭМ АСМ ЭМ

Вирус табачной мозаики цилиндр 16 18 300 300 3*10у

Х-вирус картофеля цилиндр 10 13 490 500 7*10"

Таблица 2. Морфологические и механические характеристики некоторых вирусов на основании данных электронной микроскопии и ЛСМ

А - вирусы полиомиелита адсорбированные на поверхность слюды из капли препарата. Сканирование осуществлялось в режиме постоянного контакта. Размер кадра 1.2 х 1.2 мкм2

Б -ротавирусы адсорбированные на поверхность слюды из капли препарата. Сканирование

осуществлялось в режиме

постоянного контакта. Размер кадра 1.2 х 1.2 мкм2

В -аденовирусы адсорбированные на поверхность золота из капли препарата. Сканирование

осуществлялось в режиме

постоянного контакта. Размер кадра 1.2 х 1.2 мкм2

Рис. 9 АСМ изображения модельных вирусов

Неорганические подложки обладают высокой биологической стабильностью, доступны, дешевы, легко регенирируются. Их использование позволяет исследовать морфологию вирусных частиц при помощи АСМ работающего в режиме постоянного контакта. Вместе с тем, набор характеристик, который описывает вирусную частицу, может быть расширен не только за счет использования режима снятия силовых кривых, но и благодаря применению подложек обладающих иммунологической специфичностью к анализируемому объекту. При этом связывание вирусов со специфическими антителами, иммобилизованными на подложке, представляет собой реакцию антиген-антитело в твердой

фазе, которая аналогична реакциям в стандартном иммуноферментном анализе. В настоящей работе была исследована поверхность пленок ленгмюр-блоджетт(ЛБ) комплексов антитело-амфифильный

полиэлектролит(АПЭ) на различных стадиях проведения анализа и отработаны режимы АСМ исследования вирусов при использовании таких подложек (рис. 10).

А - ЛБ пленка комплекса антитело-АПЭ после добавления образца аденовируса На поверхности пленки сформирован дефект. Добавление образца аденовируса привело к изменению средней толщины пленки с 12 нм до 14 нм Размер кадра 3,0 х 3,0 мкм2

Б - Отдельные вирусные частицы на поверхности пленки комплекса антитело-АПЭ. Размер кадра 1,5 х 1,5 мкм2

Рис. 10 Топография ЛБ пленок комплекса антитело-АПЭ после добавления образца аденовируса Материал подложки - золото

АСМ анализ образцов после нанесения антигена, и промывки в детергенте для удаления тех белковых агентов, которые не образовали прочного комплекса с антителами, позволяет судить о наличии или отсутствии иммунной реакции, по изменению морфометрических характеристик наблюдаемых пленок Параметрами, по которым производится анализ, является толщина пленки до и после добавления антигена и наличие целых вирусных частиц на поверхности пленки

Помимо повышения информативности анализа, использование специфических подложек позволяет решить задачу фиксации вируса на

поверхности для проведения АСМ исследования, в тех случаях, когда необходимо надежное закрепление вируса на поверхности подложки.

Таким образом, использование АСМ и ССС позволяет производить визуализацию и идентификацию ряда вирусов, адсорбированных на не специфических подложках, по их морфологическим и механическим характеристикам, а в случае использования специфических подложек, позволяет судить о наличии или отсутствии иммунной реакции. Более того, атомно-силовая микроскопия дает возможность получать данные о целостности исследуемых вирусных частиц и их распределении на поверхности подложки. Высокая скорость и простота приготовления образцов делает . целесообразным, применение атомно-силового микроскопа на начальном этапе анализа концентрированных водных проб с целью получения информации для увеличения эффективности дальнейшей аналитической процедуры.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Создано оригинальное многофункциональное программное обеспечение NanoScale Explorer для анализа данных СЗМ, позволяющее в частности проанализировать данные ССС, повысить эффективность и упростить интерпретацию полученных результатов. Программа позволяет анализировать массивы силовых кривых и строить карты распределения механических характеристик по поверхности образца.

2. Разработана методика силового картирования, позволяющая определять относительные локальные механические характеристики поверхности, исходя из величины работы, затрачиваемой на деформацию поверхности образца.

3. При помощи разработанной методики силового картирования-определены поверхностные наномеханические свойства наноструктурированного блоксополимера стирол-бутадиен-стирола.

4. Продемонстрирована возможность применения разработанной методики силового картирования для исследования распределения поверхностных свойств для различных типов СЗС конструкций, а также для контроля качества формируемых покрытий. Проанализирована взаимосвязь механических свойств с топографическими особенностями поверхности для различных типов СЗС конструкций.

5. Разработаны методики наблюдения модельных вирусов в АСМ и выработаны рекомендации о возможности применения АСМ на начальных этапах анализа водных проб на предмет обнаружения опасных вирусов.

6. Показана возможность проведения АСМ исследования вирусов полиомиелита, ротавируса и аденовируса как на не специфических подложках, так и на подложках, обладающих иммунологической специфичностью к анализируемому объекту и определена микромеханика отдельных вирусных частиц при помощи метода ССС.

р-88 0 4

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В

СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. T.E.Ignatyuk, I.A.Golutvin, I.A.Kabanov, N.S.Nasikan, A.L.Suvorov, S.N.Virjasov, S.G.Ignatovn. "Characterization of enteroviruses by means of atomic force microscopy". Nanotechnologies in the area of physics, chemistry and biotechnology. Proceedings of the Fifth ISTC Scientific Advisory Committee Seminar, 2002, P. 295-298.

2. Игнатюк Т.Е., Суворов А.Л., Голутвин И.А., Насикан Н.С. Кабанов И.А. «Анализ энтеровирусов в водных объектах в атомно-силовом микроскопе» в трудах 50Г0 международного конгресса ЭКВАТЭК, регистрационный номер 0320200464 в НТЦ «информ. регистр»

3. Т.Е. Игнатюк, И.А. Голутвин, Н.С. Насикан, О.Е. Иванова, Т.П. Еремеева. "Применение атомно-силовой микроскопии для детектирования кишечных вирусов", Вопросы вирусологии, 2003, N 6.

4. Голутвин И.А., Насикан Н.С, Игнатюк Т.Е. «Новые подходы к исследованию вирусов при помощи сканирующей зондовой микроскопии» Препринт ИТЭФ №18-03, 2003, 13 с.

5. Т.ЕЛгнатюк, И.А.Голутвин, Н.С.Насикан, А.Л.Суворов, О.Е.Иванова, Т.П.Еремеева. "Использование атомно-силовой микроскопии для детектирования и идентификации энтеровирусов в водных пробах" Поверхность: синхротронные, рентгеноструктурные и нейтронные исследования, 2004, N 2, с. 38-42 .

6. А.В. Большакова, И.А. Голутвин, Н.С. Насикан, И.В. Яминский «Определение механических свойств поверхности блоксополимеров методами атомно-силовой микроскопии» Высокомолекулярные соединения, 2004, N 9, в печати

7. Golutvin I.A. «Scanning Force Spectroscopy of Nanostructured Polymer Systems» Proceedings of the International ITEP Winter School of Physics, 2004, in press

Подписано к печати 20.04.04 Формат 60 х 90 1/16

Усл. печ. л. 1.5 Уч.-изл. л. 1.1 Тираж 100 Заказ 499

Отпечатано в ИТЭФ, 117218, Москва, Б. Черемушкинская, 25

Введение.

Глава 1.

• Фундаментальные принципы атомно-силовой микроскопии (обзор литературы).

1.1 Устройство и принцип работы АСМ постоянного контакта

1.2 Взаимодействие зонда АСМ и поверхности образца.

1.2.1 Силы Ван-дер-Ваальса.

1.2.2 Капиллярные силы.

1.2.3 Гидрофобный эффект.

1.2.4 Минимизация силы взаимодействия зонда и поверхности.

1.3 АСМ прерывистого контакта.

1.4 АСМ модуляции силы.

1.5 АСМ в жидкой среде.

1.6 Применение АСМ для исследования биологических объектов.

1.7 Режим снятия силовых кривых и метод ССС.

1.8 Применение АСМ и ССС для исследования полимерных систем.

Глава II.

Определение механических характеристик поверхности при помощи АСМ и ССС (теоретическая часть).

2.1 Силовые кривые АСМ.

2.2 Теория контактных деформаций.

2.2.1 Теория Герца.

2.2.2 Теория Джонсона-Кендалла-Робертса (ДКР).

2.2.3 Теория Дерягина Муллера Топорова (ДМТ). щ 2.2.4 Теория Магиса-Дагдейла (МД).

2.2.5 Трудности связанные с применением теории контактных деформаций для интерпретации данных АСМ и ССС.

2.2.6 Силовое картирование поверхности.

2.3 Программное обеспечение NanoScale Explorer.

2.3.1 Анализ силовых кривых в программе NanoScale Explorer.

2.3.2 Определение усредненного калибровочного коэффициента

Глава III.

Исследование поверхностных свойств нанострукгурированных * полимерных систем при помощи методов АСМ и ССС.

3.1 АСМ блоксополимеров.

3.1.1 Материалы и оборудование.

3.1.2 Результаты АСМ исследования пленок СБС блоксополимера. 71 3.1.3 Силовое картирование СБС блоксополимера.

3.2 АСМ самоорганизующихся многослойных пленок на основе амфифильных полиэлектролитов.

3.2.1 Материалы и оборудование.

3.2.2 Формирование многослойных полимерных пленок.

3.2.3 Силовое картирование многослойных пленок полиэлектролитов.

Глава IV.

Атомно-силовая микроскопия вирусов.

4.1 АСМ вирусов на неспецифических подложках.

4.1.1 Материалы и оборудование.

• 4.1.2 Нанесение вирусных частиц на поверхность подложки.

4.1.3 Результаты АСМ исследования вирусов.

4.2 АСМ вирусов на подложках обладающих иммунологической специфичностью.

4.2.1 Материалы и методы.

4.2.2 Результаты АСМ исследования вирусов.

4.3 Исследование микромеханики вирусов при помощи метода ССС

Стремительное развитие биотехнологий обуславливает необходимость создания инструментов и методов для изучения характеристик биологических и полимерных систем в нанометровом диапазоне. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) является одним из основных инструментов для исследования поверхности различных систем с разрешением порядка нескольких нанометров. С момента своего появления в 1986 году [1] АСМ прочно заняла свое место среди других высокочувствительных методов анализа поверхности. Благодаря своей универсальности и возможности работы с широчайшим спектром различных поверхностей, атомно-силовой микроскоп является на сегодняшний день одним из самых распространенных представителей семейства сканирующих зондовых микроскопов, которых объединяет наличие микроскопического зонда, осуществляющего сканирование выбранного участка поверхности. Метод АСМ возник как продолжение метода сканирующей туннельной микроскопии (СТМ), который появился в 1981 году[2,3], при этом в случае АСМ взаимодействие между зондом и образцом носит силовой характер. На основе атомно-силового и туннельного микроскопов лишь за двадцать лет существования возникли многочисленные методы исследования поверхности различных объектов и их локальных физических свойств, например, такие как магнитно-силовой микроскоп, оптический ближнепольный микроскоп [4-6]. Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) объединяет все эти методы и постоянно пополняется новыми, что говорит о широких возможностях и перспективности метода СЗМ. Конструкция современных АСМ такова, что один прибор позволяет реализовать несколько методов СЗМ, такие приборы получили название многомодовых АСМ. АСМ позволяет достигать разрешения порядка нескольких нанометров в плоскости образца и разрешение порядка 0.1 нм по нормали к поверхности образца, а различные режимы работы прибора дают возможность строить топографические карты поверхности, оценивать распределение сил трения между зондом и образцом, исследовать вязко-упругие характеристики поверхности, и строить тем самым многомерный образ анализируемых объектов, отражающий не только их топографию, но и в ряде случаев особенности внутренней организации.

Следует отметить, что задачу неразрушающего воздействия во время АСМ - эксперимента, а также иммобилизации изучаемого объекта на поверхности твердой подложке, предстоит решать исследователю для каждого выбранного объекта заново, так как, зачастую, ранее разработанные методики изучения не всегда успешно подходят для нового объекта. Методическая часть экспериментальной работы: выбор подложки, режимов и условий сканирования, занимает большую часть времени и не менее важна, чем полученные в результате успешно проведенного эксперимента данные.

Топографическая информация, полученная при помощи АСМ, может быть дополнена информацией о локальных поверхностных свойствах объекта за счет применения метода сканирующей силовой спектроскопии (ССС) [7]. Этот метод является естественным продолжением метода АСМ и основан на возможности измерения отклика поверхности образца в ответ на приложенную силу давления со стороны зонда микроскопа. Учитывая, что величина этой силы составляет всего несколько наноньютонов (нН), метод ССС позволяет исследовать локальные микро- и наномеханические свойства поверхности, а возможность построения карты поверхностного распределения этих свойств параллельно с получением информации о топографии существенно расширяет набор характеристик описывающих исследуемый объект. Такая информация особенно интересна при анализе образцов с пониженной механической жесткостью поверхности, т.е. биологических и полимерных систем. Актуальность темы диссертационной работы обусловлена необходимостью разработки новых методов для исследования поверхностного распределения топографических механических и адгезивных характеристик полимерных и биологических систем в нанометровом диапазоне при помощи комбинации АСМ и ССС. Выбор объектов исследования (наноструктурированных блок сополимеров, многослойных самоорганизующихся пленок на основе амфифильных полиэлектролитов, сформированных по технологии «слой-за-слоем» (СЗС) и вирусных частиц) объясняется растущим интересом к разработке новых функциональных материалов, на основе СЗС технологий для биомедицинских приложений, а также необходимостью развития новых диагностических подходов для обнаружения опасных для человека болезнетворных агентов.

Цели диссертационной работы:

- Исследование методами АСМ и ССС поверхностного распределения механических и топографических свойств наноструктурированных полимерных систем и изучение полимерных пленок сформированных по технологии «слой-за-слоем»

- Получение новой информации о морфологических и структурных свойствах отдельных вирусных частиц на основе данных АСМ и ССС

- Исследование возможности применения АСМ и ССС на начальных этапах анализа образцов на предмет обнаружения опасных вирусов

- Разработка новых подходов для исследования локальных механических характеристик поверхности методами АСМ и ССС

Для достижения поставленных целей был проведен ряд экспериментальных исследований, представленных в диссертационной работе, а также было разработано многофункциональное программное обеспечение, позволяющее в значительной степени повысить эффективность анализа и упростить интерпретацию экспериментальных данных.

Структура работы

Работа состоит из четырех глав и заключения.

В первой главе описаны основные принципы атомно-силовой микроскопии и дан обзор основных режимов работы многомодовых АСМ. Также в первой главе приведены литературные данные по применению АСМ для исследования полимерных и биологических систем.

Во второй главе описаны принципы ССС и приведены основные теоретические модели, которые используются для вычисления локальных механических характеристик поверхности на основе данных АСМ. Кроме того, описан оригинальный подход к исследованию поверхностного распределения механических характеристик, основанный на вычислении работы затрачиваемой на деформацию поверхности образца и представлены основные функции разработанного программного обеспечения NanoScale Explorer.

В третьей главе приведены результаты исследования поверхностных свойств наноструктурированных полимерных систем: блоксополимеров и многослойных пленок полиэлектролитов, сформированных по технологии «слой-за-слоем» при помощи методов АСМ и ССС.

Четвертая глава посвящена исследованию морфологических и механических характеристик модельных вирусов на различных типах подложек и изучению возможности применения АСМ и ССС для анализа водных проб на предмет обнаружения опасных вирусов.

Основные результаты диссертационной работы сформулированы в Заключении.

Научная новизна работы

1. Впервые проведено силовое картирование наноструктурированного блоксополимера стирол-бутадиен-стирола и изучены его поверхностные наномеханические свойства.

2. Впервые исследовано распределение механических и адгезивных свойств многослойных СЗС конструкций в нанометровом диапазоне и изучена взаимосвязь механических свойств с топографическими особенностями поверхности для различных типов СЗС конструкций

3. Впервые проведено АСМ исследование вирусов полиомиелита, ротавируса и аденовируса и определена микромеханика отдельных вирусных частиц при помощи метода ССС.

Практическая значимость работы

1. Разработана методика силового картирования, позволяющая определять относительные локальные механические характеристики поверхности, исходя из величины работы, затрачиваемой на деформацию поверхности образца.

2. Создано оригинальное многофункциональное программное обеспечение для анализа данных СЗМ, позволяющее в частности проанализировать данные ССС, повысить эффективность и упростить интерпретацию полученных результатов.

3. Разработаны подходы к исследованию распределения поверхностных свойств для различных типов СЗС конструкций, а также для контроля качества формируемых покрытий.

4. Разработаны методики наблюдения модельных вирусов в АСМ и исследована возможность применения АСМ для анализа водных проб на предмет обнаружения опасных вирусов. За счет применения метода ССС расширен набор характеристик описывающих отдельную вирусную частицу.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на семи международных конференциях: 5h ISTC Scientific Advisory Committee Seminar "NANOTECHNOLOGIES in the area of physics, chemistry and biotechnology (St. Petersburg, 2002), 5th International Congress "ECWATECH-2002 water:ecology and technology (Moscow, 2002), 1-st International Congress "BIOTECHNOLOGY -state of the art and prospects of development (Moscow, 2002), International Workshop on Micro Robots, Micro Machines and Micro Systems.International Advanced Robotics Program (Moscow, 2003), 1st FEMS Congress of European Microbiologists (Ljubljana, Slovenia,2003), 12th International Conference on Scanning Tunneling Microscopy/Spectroscopy and Related Techniques (Eindhoven, The Netherlands, 2003), 7th INTERNATIONAL MOSCOW SCHOOL OF PHYSICS (Otradnoye, 2004).

Публикации

Основные результаты диссертации отражены в 7 научных работах, из них: две статьи опубликованных в реферируемых журналах, 2 опубликованных доклада на международных конференциях, 1 статья в виде внутренней публикации ИТЭФ и 2 статьи приняты к печати.

Заключение

Атомно-силовая микроскопия является одним из наиболее перспективных методов исследования органических систем, позволяющим исследовать топографию поверхности с высоким разрешением. Применение метода сканирующей силовой спектроскопии расширяет набор характеристик описывающих ту или иную систему за счет информации о ее поверхностных механических и адгезивных свойствах. При этом, для практического внедрения такого комбинированного метода АСМ и с ССС необходимо наличие соответствующих подходов к анализу массивов силовых кривых и специализированного программного обеспечения. Анализ силовых кривых основанный на определении величины работы которая совершается при деформации поверхности и специально разработанное программное обеспечение NanoScale Explorer позволили применить комбинированный метод АСМ и ССС (который был протестирован при определении поверхностных свойств наноструктурированного блок-сополимера стирол-бутадиен-стирола) для исследования двух классов объектов: многослойных самоорганизующихся упорядоченных пленок на основе полиэлектролитов сформированных по технологии СЗС и вирусных частиц содержащихся в питьевой воде.

1. Binnig G., Quate C.F., Gerber С Atomic force microscopy // Phys. Rev. Lett. — » 1986. -v.56.-8.- pp.930-933.

2. Binnig G., Rohrer H. Scanning tunneling microscopy // Helv. Phys. Acta., - 1982.-V. 55.-pp. 726-735.

3. Binnig G., Rohrer H., Gerber C , Weibel E. Tunneling through a controllable vacuum gap // Appl. Phys. Lett. -1982. - v. 40. - pp. 178-180.

4. Saens J. J., Garcia N., Grutter P., Meyer E., Heinzelmann H., Wiezendanger R., Rosenthaler L., Hidber H. R, Guntherodt H. J. Observation of magnetic forces by the atomic force microscope // J. Appl. Phys. -1987. - v. 63. - pp. 4293-# 4295.

5. Durug U., Pohl D. W., Rohrer F. Near field optical scanning microscopy // J. Appl. Phys. -1986. -V. 59. - pp . 3318-3327.

6. Hu J., Xiao X.-D., Ogletree D. F., Salmeron M. Imaging the condensation and evaporation of molecularly thin film of water with nanometer resolution // Science. -1995. - v. 268. - pp. 267-269.

7. Химическая энциклопедия, издательство «БОЛЬШАЯ РОССИЙСКАЯ ЭНЦИКЛОПЕДИЯ» Москва 1992, в 5 томах

8. F. London, // Z. Phys. Chem., -1930, - v. В11, - pp. 222.

9. Галлямов М.О. «Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот и тонких органических пленок» диссертация канд. Физико-математических наук 01.04.07: МГУ, 1999. 228 с. *

10. Е. М. Лифшиц, // ЖЭТФ, -1955, - т. 29, - ее. 94. # 13. и. Hartmann, Theory of van der Waals microscopy // J. Vac. Sci. Technol. B, -1991, - V. 9, - No 2, - pp. 465-469.

11. A. Адамсон, Физическая химия поверхностей. - М.: Мир, 1979. -568 с.

12. J. Т. Woodward, J.A.N. Zasadzinski, and P. К. Hansma, Precision height measurements of freeze fracture replicas using the scanning tunneling microscope //J. Vac. Sci. Technol B, -1991, - v. 9, - No 2, - pp. 1231-1235.

13. J.N. Israelachvili, Intermolecular and Surface Forces. - London: Academic Press, 1985.-296 p.

14. V. V. Yaminsky and B. W. Ninham, The hydrophobic force: the lateral enhancement of subcritical fluctuations // Langmuir, -1993, - v. 9, - pp. 3618.

15. Nanoscope Ilia manual guide- / Digital Instruments, USA

16. Bustamante C, Vesenka J., Tang C.L. et al. Circular DNA molecules imaged in air by scanning force microscopy. //Biochemistry, 1992, V. 31, P. 22

17. Guthold M., Bezanilla M., Erie D.A. et al. Following the assembly of RNA polymerase-DNA complexes in aqueous solutions with the scanning force microscope. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, V.91 N26, P. 12927

18. Onishi S., Hara M., Furuno Т., Sasabe H., Imaging two-dimensional crystals of catalase by atomic force microscopy. // Jpn. J. Appl. Phys., 1996, V. 35, p.6233

19. Uvarov V. Yu., Ivanov Yu. D., Romanov A.N. et al. Scanning tunneling microscopy study of cytochrome P450 2B4 incorporated in proteoliposomes. //Biochimie, 1996, v.78, p. 780

20. Simmons D.A.R. Immunochemistry of Shigella flexnery O-antigens: a study of structural and genetic aspects of the biosynthesis of cell-surface antigens. //Bacteriological Reviews, 1971, V. 35 N2, P.l 17

21. Пермяков H.K., Ананян M.A., Сороковой В.И., Лускинович П.Н. Сканирующая зондовая микроскопия и медико-биологическая нанотехнология: история и перспективы. // Архив патологии, 1999 J^ 25, с. 9

22. Ваго A.M., Miranda R., Carrascosa J.L. //IBM J. Res. Dev., 1986, v. 30, p.380

23. Weisenhom A.L., Drake В., Prater C.B. et al. Immobilized proteins in buffer solution at molecular resolution by atomic force microscopy. // Biophys., 1990, V. 58,P. 1251.

24. Radmacher M., Fritz M., Cleveland J.P. et al. Imaging adhesion forces and elasticity of lysozyme adsorbed on mica with the atomic force microscope. // 1.angmuir, 1994, V. 10 № 10, P. 3809.

25. Worcester D.L., Miller R.G., Bryant P.J. Atomic force microscopy of риф1е membranes. //J. Of Microscopy, 1988, V. 152, Pt 3, P. 817.

26. Muller D.J., Schabert F.A., Buldt J., Engel A. Imaging purple membranes in aqueous solutions at sub-nanometer resolution by atomic force microscopy, // Boiphys., 1995, V.68,P. 1681.

27. Durbin S.D., Carlson W.E. Lysozyme crystal growth studied by atomic force microscopy. // Journal of Crystal Growth, 1992, V. 122, P. 71.

28. Land T.A., Malkin A.J., Kuznetsov Yu. G., De Yoreo J.J. Mechanisms of protein crystal growth: An atomic force microscopy study of canavalin crystallization. // Phys. Rev. Lett., 1995, V. 75, P. 2774.

29. McPherson A., Malkin A., Kuznetsov Y. The science of macromolecular crystallization. // Structure, 1995, V. 3, P. 759.

30. Lee G.U., Kidwell D.A., Colton R.J. Sensing streptavidin-biotin interactions with atomic force microscopy. // Langmuir, 1994, V. 10, № 2, P. 354.

31. Kuznetsov Yu.G., Malkin A.J., Glantz W., McPherson A.//J. of Cryst. Growth. 1996. V. 168. P. 63-73.

32. Malkin A. J., Land T.A., Kuznetsov Yu.G., McPherson A., and De Yoreo J.J. //Phys. Rev. Let. 1995. V.75. N. 14. P. 2778-2781.

33. Drygin Yu.F., Gallyamov M.O., Yaminsky I.V, // Presentation Abstracts, 1997 International NanoScope Users' Conference, Santa Barbara, California, -p.39

34. Mantovani J.D., Allison D.P., Warmack R.J., Ferrel T.L. et al //J. of Microscopy. 1990. V. 158.Ptl.P. 109-116.

35. Lyubchenko B.L., Jacobs, Lindsay S.M. //Nuclear Acids Research. 1992. V. 20. N. 15. P. 3983-3986.

36. Falvo M.R., Washburn S., Superfine R et al // Biophysical Journal. 1997. V. 72. P. 1396-1403.

37. Kiselyova O.I., Galyamov M.O., Nasikan N.S. et al //"Frontiers of Multifunctional Nanosystems" (Eds. Buzanaeva E.V., Scharff P. - Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 2002, 500 pages), pp. 321-330.

38. Kiselyova O.I., Nasikan N.S., Yaminsky I.V. et al // Physics of Low- Dimensional Structures. 2001. V. 3/4. P. 167-174.

39. Gerba C.P., Rose J.B. // Drinking water microbiology. Springer-Verlag, New York. 1990. P. 380-395.

40. E.L. Florin, V.Y. Moy, H.E. Gaub, Science 264 (1994) 415.

41. U. Dammer, O. Popescu, P. Wagner, D. Anselmetti, H.J. Giintherodt, G.N. Misevic, Science 267 (1995) 1173.

42. G.U. Lee, L.A. Chrisey, R.J. Colton, Science 266 (1994) 771.

43. Weisenhom, A.L., Hansma P.K., Albrecht T.R., Quate C.F., //Appl. Phys. Lett. 1989,54,2651-2653

44. Bumham N.A., Colton R.J. // J. Vac. Sci. Technol. 1989, A7(4), 2906-2913

45. Weisenhom, A.L., Maivald P., Butt H.J., Hansma P.K. //Phys. Rev. B: Condens. Matter 1992,45, 11226-11232

46. Bumham N.A., Colton R.J., Pollock H.M., J. vac. Sci. technol. 1991, A9, 2548- 2556

47. Noy, A, Vezenov D.V., Kayyem J.F., Meade T.J., Lieber CM. 1997 //Chem. Biol. 4, 519-527

48. Weisenhom A.L., Khorsandi M., Kasas S., Gotzos, V. and Butt H.-J. 1993 // Nanotechnology 4, 106-113

49. Radmacher M., Fritz M., Cleveland J.P., Walters D.A. and Hansma P.K. 1996 // Biophys. J. 70, 556-567

50. Shroff S.G., Saner D.R., Lai R., 1995 Am. J. Physiol. 269 C286-292

51. Antonik, M.D.; D'Costa, N.P., Hoh, J.N. 1997 // IEEE Eng. Med. Biol. 16, 66-

52. Heuberger, M., Dietler, G., Schlapbach L 1994 // Nanotechnology 5, 12-23

53. Heuberger, M., Dietler, G., Schlapbach L 1996 // J. Vac. Sci. Technol. В14 1250-1254

54. Maivald P., Butt, H-J., Gould, S.A.C., Prater C.B., Drake В., Gurley J.A., Elings V.B., Hansma P.K. 1991 //Nanotechnology 2, 103-106

55. Grafstroem S., Neitzert M., Hagen Т., Ackermann J., Neumann R., Ptobst O., Wortge M. 1993 //Nanotechnology 4, 143-151

56. Xu W., Mulhem P.J., Blackford B.L., Jericho M.H., Firtel M., Beveridge T.J. 1996 //J. Bacteriol. 178, 3106-3112

57. Rho, J.Y., Tsui T.Y., Pharr G.M. 1997 //Biomaterials 18 1325-1330

58. D.E. Laney, R.A. Garcia, S.M. Parsons, and H.G. Hansma. 1997. Changes in the elastic properties of cholinergic synaptic vesicles as measured by atomic force microscopy. //Biophys. J. 72:806-813.

59. Nakajima, K.; Yamaguchi, H.; Lee, J.-C; Kageshima, M.; Ikehara, Т.; Nishi, T. // Jpn. J. Appl. Phys., Part 1 1997, 36, 3850-3854.

60. Nie, H. Y.; Motomatsu, M.; Mizutani, W.; Tokumoto, H. ThinSolid Films 1996, 273, 143-148.

61. Friedenberg, M. C; Mate, С M. Langmuir 1996, 12, 6138- 6142. 125-131.

62. Kajiyama, Т.; Tanaka, K.; Ge, S. R.; Takahara, A. Prog. Surf Sci. 1996, 52,1-52.

63. Rief M., Oesterhelt F., Heymann В., Gaub H.E. Single molecule force spectroscopy on polysaccharides by atomic force microscopy. // Science. - 1997. -V. 275.-pp. 1295-1297.

64. Howard, A. J.; Rye, R. R.; Houston, J. E. J. Appl. Phys. 1996,79, 1885-1890

65. Ovemey, R. M.; Leta, D. P.; Pictroski, C. F.; Rafailovich, M. H.; Liu, Y.; Quinn, J.; Sokolov, J.; Eisenberg, A.; Ovemey, G. Phys. Rev. Lett. 1996, 76, 1272-1275.

67. F. Caruso, R. A. Caruso, and H. Mohwald, Science 282, 1111 (1998)

68. Dacher, G.; Schlenoff, J.B. Multilayer Thin Films. Sequential Assembly of Nanocomposite Materials, New York, 2003, 524 p.

69. Jones, A.H.; Lvov, Y.M. Cell Biochem. Biophys. 2003, v. 39(1), pp. 22-43.

70. Wu A., Yoo, D., Lee J.-K., Rubner M.F., //J. Am Chem Soc. 1999. 121, 4883

71. Onitsuka O., Fou, A.C., Ferreira M, Hsieh B.R, Rubner M.F., //J Appl. Phys. 1996,80,4067

72. Decher G., Lehr B, Lowack K.,Lvov Y., Schmitt J. //Biosens. Bioelectron. 1994, 9,677

73. Onda, M., Lvov Y, Ariga K., Kunitake T. //Biotechnol. Bioeng. 1996

74. Yoo D., Shiratori S.S., Rubner M.F. //Macromolecules 1998, 31, 4309

75. Ostrander, J.W.; Mamedov, A.A.; Kotov, N.A. J. Am. Chem. Soc. 2001, v. 123(b), pp. 1101-1110.

76. Dubas, S.T.; Schlenoff, J.B. Langmuir, 2001, v. 17, pp. 7725-7727.

77. M. Y. Gao, С Lesser, S. Kirstein, H. Mohwald, A. L. Rogach, and H. Weller, J. Appl. Phys. 87, 2073 (2000)

78. M. R. Linford, M. Auch, and H. Mohwald, J. Am. Chem. Soc. 120,178 (1998)

79. C. Kallinger, M. Hauder, A. Haugeneder, U. Lemmer, W. Spirkl, J. Feld- mann,U. Scherf, A. Harth, E. Gugel, and K. Mullen, Synth. Met. 101,185 (1999).

80. F. Caruso and H. Mohwald, J. Am. Chem. Soc. 121, 6039 (1999)

81. Kotz J. Polyelectrolyte Complexes(Overview). Polymeric Materials Encyclopedia, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1996; p. 5762

82. Y. Lvov, G. Decher, and G. Sukhorukov, Macromolecules 26, 5396 (1993).

83. O. Onitsuka, A. C. Fou, M. Ferreira, B. R. Hsieh, and M. F. Rubner, // J. Appl. Phys. 80,4067(1996).

84. Mendelsohn J.D., Barrett C.J., Chan V.V., Pal A.J., Mayes A.M., Rubner M.F. "Fabrication of Microporous Thin Films from Polyelectrolyte Multilayers" //Lanhmuir 2000, 16, 5017-5023

85. M. Breit, M. Gao, G. von Plessen, U. Lemmer, and J. Feldmann // JOURNAL OF CHEMICAL PHYSICS 2002, 8, 117, 3956

86. V. V. Tsukuruk, V. N. Bliznuyuk, and D. Visser, Macromolecules 30,6615 (1997)

87. Tsukruk V.V., Huang Z., Chizhik S.A., Gorbunov V.V., "Probing of micromechanical properties of compliant polymeric materials" //J. of Mat. Science, 1998, 33, 4905-4909

88. Ducker W.A., Senden T.J., Pashley R.M. Direct measurement of colloidal forces using an atomic force microscope // Nature. - 1991. - v. 353. - pp. 239-241.

89. O'Shea S.J., Welland M.E., Rayment T. Solvation forces near a graphite surface measured with an atomic force microscope // Appl. Phys. Lett. - 1992. - v. 60. -pp. 2356-2358.

90. Butt H.-J. Measuring electrostatic, van der Waals, and hydration forces in electrolyte solutions with an atomic force microscope. // Biophys. J. - 1991. — v. 60.-pp. 1438-1444.

91. Frisbie CD,, Rozsnyai L.F. Noy A., Wrighton M.S., Lieber CM. Functional group imaging by chemical force microscopy. // Science. - 1994. - v. 265. - pp. 2071-2074.

92. Lee G.U., Chrisey L.A,, Colton R.J. Direct measurement of the forces between complementary strands of DNA. // Science. - 1994. - v. 266. - pp. 771-773.

93. Hinterdorfer P., Baumgartner W., Gruber H.J., Schilcher K., Schindler H. Detection and localization of individual antibody-antigen recognition events by atomic force microscopy. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. - v. 93. - pp. 3477-3481.

94. Butt. H.J., Jaschke M., Ducker W. Measuring surface forces in aqueous electrolyte solution with the atomic force microscope //Bioelectrochemistry and Bioenergetics 1995, 38, 191-201

95. Herz H. // J. Reine Angew. Math. -1882, - v. 92. - pp. 156.

96. Sheddon LN. // Int.J.Eng.Sci. - 1965. - v. 3. - pp. 47-57.

97. Ландау Л.Д., Лифшиц E.M. Теория упругости. М.: Наука,1987.

98. Johnson K.L., Kendall К., Roberts A.D., Proc. Roy. Soc. London A324 301 (1971)

99. Джонсон К.Л., Механика контактного взаимодействия (М.: Мир, 1987)

100. Carpick R.W., Agrait N., Ogletree D.F., Salmeron M., //J.Vac Sci. Technol В14 1289(1996)

101. Maugis D., Barguins M. 111. Phys. D.16 1843(1983)

102. Maugis D., //Langmuir V. 11. 679(1995)

103. B.V. Deryagin, V.M. Muller, Toporov Y.P. //J. Coll. Interface Sci., V, 53, 314 (1975)

104. Muller V.M., Yushenko V.S., Deryagin B.V. //J. Coll. Interface Sci., V. 77, 91 (1980)

105. Muller V.M., Yushenko V.S., Deryagin B.V. //J. Coll. Interface Sci., V. 92, 92 (1983)

106. Maugis D. //J. Colloid. Interface Sci. V. 150 243(1992)

107. Domke J., Radmacher M. // Langmuir. 1998. V. 14. P. 3320.

108. H.J. Butt, Jaschke M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy //Nanotechnology V.6 (1995) 1-7

109. Dunn, R. C; Hotom, G. R.; Mets, L.; Xie, X. S. J. Phys. Chem.1994, 98, 3094.

110. Karim, A.; Satija, S. K.; Han, С С; Slawecki, Т. М.; Kumar,S. К.; Russell, Т. P. Polym. Prepr. (Am. Chem Soc, Div.Polym. Chem.) 1994, 71, 280.

111. Sung, L.; Douglas, J. F.; Han, С Phys. Rev. Lett. 1996,76,4368.

112. McEvoy, R.; Krause, S.; Wu, P. Polymer 1998,39, 5223.

113. Hasegawa, H.; Hashimoto, T. Polymer 1992,33,475.

114. Winograd, N. Anal. Chem. 1993,65, 622A.

115. Bar, G.; Thomann, Y.; Brandsch, R.; Cantow, H. J.; Whangho,M. H. Langmuir 1997, 13, 3807.

116. Bar, G.; Thomann, Y.; Brandsch, R.; Whangho, M. H. Lang-muir 1998, 14, 1219.

117. Zhang, D.; Gracias, D. H.; Ward, R.; Gauckler, M.; Tian, Y.;Shen, Y. R.; Somarjai, G. A. J. Phy. Chem. B. 1998, 102, 6225.

118. McLean, R. S.; Sauer, B. B. Macromolecules 1997, 30, 8314.

119. Akhremitchev, В. В.; Mohney, В. К.; Marra, К. G.; Chapman,T. М.; Walker, G. Langmuir 1998,14, 3976.

120. Sauer, В. В.; McLean, R. S.; Thomas, R. R. Langmuir 1998,14,3045.

121. Bierwagen, G. P.; Twite, R.; Chen, G.; Tallman, D. E. Prog.Org. Coat. 1997, 32, 25.

122. Интернет учебник Макрогалерея http://www.psrc.usm.edu/russian/sbs.htm

123. Филонов А.С., Гаврилко Д.Ю., Яминский И.В. Программное обеспечение «ФемтоСкан» для обработки трехмерных изображений. М.: Центр перспективных технологий, 2001. (http://www.nanoscopy.net)

124. Raghavan D., Gu X., Nguyen Т., VanLandingham М., Karim А., Mapping Polymer Heterogeneity Using Atomic Force Microscopy Phase Imaging and Nanoscale Indentation //Macromolecules 2000, 33, 2573-2583

125. Li H., Nadarajah A., Pusey M. Determining the molecular growth mechanism of protein crystal faces by atomic force microscopy //Acta Cryst., D55 1036-1045

126. Кнорре Д.Г., Мызина Д. «Биологическая химия» М.: Высш. шк. 2002

127. Яминский И.В., Большакова А.В., Логинов Б.А. и др. // Поверхность: рентгеновские, синхротронные и рентгеновские исследования 1999, 7,

128. A. Адамсон, Физическая химия поверхностей. - М.: Мир, 1979. -568 с.

129. К. В. Blodgett and I. Langmuir, // Phys. Rev., -1937, - v. 51, - pp. 964.

130. Barmin A.V., Eremenko A.V., Sokolovsky A.A., Chernov S.F., Kurochkin I.N. //Biotechnol. Appl. Biochem. 1994.V.18. P. 369-376.

131. Barmin A.V., Eremenko A.V., Kurochkin I.N., Moskvina N.A.// Biotechnol. And Bioengineering 1994. V.44. P. 849-853.

132. Бабицкая Ю.И., Будашов И.А., Курочкин И.Н., Чернов Ф.И Биол. Мембраны 1996. Т. 13. вып. 6. 634-641

133. Wang J., Lin Y., Eremenko A.V., Kurochkin LN., Mineeva M.F. //Anal. Chem. 1993.V. 65. P. 513-516.

134. Павельев А.Б., Курочкин И.Н., Чернов Ф. // Биол. Мембраны 1998. Т. 15. вып. 3. 342-348.

135. Курочкин И.Н., Будашов И.А., Павельев А.В., Денисов А.К., Скрипнюк В.В., Шабанов Г.А. // Сенсорные Системы, 1998., т. 12, вып. 1, 122-134.