Совместное квантовохимическое и молекулярно-механическое исследование моделей ферментативных реакций тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи

р £ 0 г| УДК 541.128:577.15:577.311

р г";!!

О /iL.it \O-jo

ВАСИЛЬЕВ Владислав Викторович

СОВМЕСТНОЕ КВАНТОВОХИМИЧЕСКОЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-МЕХАНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МОДЕЛЕЙ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

02.00.15 - Химическая кинетика и катализ.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 1993г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии Сибирского отделения Российской академии наук.

Научный руководитель:

кандидат химических наук

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических,наук, профессор

доктор химических наук

А. А. Близнюк

Г.М. ЖидомироЕ

Э.Г. Малыгин

Ведущая организация:

Новосибирский институт химической кинетики и горения СО РАН

заседании Специализированного совета К 002.13.01 в Новосибирском институте катализа СО РАН по адресу: Новосибирск-90. пр. Акад. Лаврентьева, 5, Институт катализа СО РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института катализа СО РАН.

Автореферат разослан "_"_ 1993 г.

Защита состоится

года в

часов на

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В.А. Семиколенов

обшая характеристика работы

Актуальность проблемы. Ферменты представляют собой специфические и высокоэффективные катализаторы химических реакций, протекающих в живой клетке. Гак, например, добавка незначительной концентрации фермента (10"7-1 С-9 М) приводит к ускорению катализируемой им реакции между двумя субстратами иногда более чем в I010 раз. В последнее время достигнут значительный прогресс в изучении пространственной структуры и / механизма действия ферментов. Он стал возможен благодаря развитию новых экспериментальных методик, а,также теоретических подходов. Экспериментальное исследование ферментативных реакций связано со значительными трудностями и не позволяет изучить вклад отдельных составляющих в каталитическую эффективность. Поэтому теоретическое рассмотрение моделей ферментативных реакций является актуальным.

Хорошо известно, что неэмпирические расчеты в расширенных базисах, а также современные полуэмпирические методы (MHDO/M, ami , рмз , mndo/d) позволяют корректно описывать электронную * структуру, энергетику межмолекулярного взаимодействия и поверхность потенциальной энергии (ППЭ) химических реакций. Однако их применение, несмотря на появление быстродействующих ЭВМ, ограничено сравнительно небольшими системами (несколько десятков атомов), и последовательное изучение моделей ферментативных реакций в настоящее время невозможно.

С другой стороны, метод молекулярной механики (метод атом-атомных потенциалов) позволяет получить не только надёжные данные о конформационных свойствах молекул, насчитывающих несколько тысяч атомов, но и статистическую информацию из расчётов методами молекулярной динамики, Монте .Карло и стохастической ("броуновской") динамики. Вместе с тем форма потенциальных функций для расчёта энергии не позволяет изучать процессы, сопровождающиеся разрывом и образованием химических связей, а также значительным перераспределением электронной плотности.

Таким образом, актуальной является задача создания методики, которая бы соединяла вычислительную мощь молекулярной

механики с возможностью изучать реакционнуп способность кванговохимиче сними ^этоди.ш. Это позволило бы вкйти ■ на качественно новый уровень в исследованиях реакций в растворах и в активных центрах биологических молекул.

Цель работы. В настоящей работе были поставлены следующие научные задачи:

1. Разработка гибридного подхода, объединявшего кванговохимический и молекулярно-механический методы и пригодного для моделирования больших молекулярных систем.

2. Разработка параметризации метода и её апробация б расчётах широкого ряда заряженных и нейтральных комплексов с водородными связями, для которых имеются экспериментальные данные и результаты неэмпирических расчётов.

3. Исследование с помощь» разработанной методики детального механизма катализа одного из ферментов, представляющего интерес для теории ферментативного катализа. Б качестве, конкретного примера был высран эволюцнонно совершенный фермент ацетилхолинэстераза (АХЭ), обладающий необычайно высокой каталитической активностью.

Научная новизна. Разработан гибридный кванговохимический/ молекулярно-механический (КХ/ММ) потенциал, предназначенный для моделирования больших молекулярных систем. Осуществлена параметризация гибридного КХ/ММ метода с использованием экспериментальных данных по энтальпиям взаимодействия в комплексах с водородными связями (Н-связями). Для проверки адекватности гибридной КХ/МЛ схемы выполнено систематическое исследование энергетики взаимодействия и геометрии большого числа заряженных и нейтральных коплексов с Н-связями. Впервые проведено детальное исследование механизма образования тетраэдрического интермедиата (ТИ) в . активном центре (АД)-фермента »щетилхолинэстеразы. Выявлено, что •ключевую роль в понияении энергии аастиваши реакции играет электростатическая комплиментарность фермента переходному состоянию (ПС).

Практическая ценность. Разработан комплекс программ ЕН1ЖЕ-92, позволяющий проводить расчёты физико-химических свойств больших молекулярных систем с помощью гибридной кванговохимической/молекулярно-механичеекрй схемы - мыш/орьэ,

r:i/0VL3 и pMj/opis. Комплекс iipcrpt"-:.; ориеткроввл на изучен) хпиичуских pepr.iürt п г.*л:::-*,т.'.,с ::>затг<аг; ,

Ацробкшя T-^ort. Резулкпл' работа доклаишалис. а? Всесоюзном coB'jv.-.-f'T'i пэ наготове'¡ хп'11'?; (К?ла*"т>, 9J) к Всэсою&ноЯ KOES-ípei&n. * гк> т^орот^эсхсй оргг.уическо;; хит:-; (Волгоград, 9П,-

Публикации, По ¡птерпале.ч дгиссортсл.::! опублп:ог/.".'о 7 печатках pa.5ov.

Оое5м и струг.т;'рз рэботп. Диссертация состоит из евэдотгг:* четнрех глав, вавожэв и списка цитируемо" литературы. Работа изложена на 157 страпяпзх, содер-;? 80 раст.ясов и 30 таб.*.;^. Спксог ir.iTHp:,-:"!'.«:; литератур:! вкличпэт июпйновегих.

СОЯЕРКАНКЗ РАЕОГН

Во введении обосноттаотся актуальность тега, формулируотег; задачи исследования и дпсо краткое сохерсаи-.э диссертации по

глав a i.

Б первой гд-жэ сэдерянтся обзега литературы. Коатно представлены основное кошеггции ¿«эрксл. атишюго катализа, прич2м большоз вниигявз уд-злэно идэкм, появигнкмея а последние IO-IS лет к иэ успеагих волк» г сбяеиззсстняа коногрь?ии. Кратко списывается метохи!;»* неэмпирических, по.-узнпфзгсаски-t к гнбридгзг: КХ/'МЫ расчетоз мэдчлэй оэрглзнтагжзкг.. рексщ:,;. Рассмотрь-ет результаты расчётов реакционных проазееоз в АН феркэптоз. На основе расчётных дачян;: проводится анализ концегпзй ферментативного катализа и рассматриваются методические аспекты при моделировании 'сложных биологический объектов.

Во второй главе огнсаш расчЭтнаэ схе?н полу эмпирических мзтодов mndo/m, АМ1 и РМЗ. эмпирического метода атом-атемшк потенциалов OPIS/amber, и гибридного кх/мм подхода (его схема и параметризация), а также комплекс програчад EHZY1ÍE-92.

На основе анализа гибридных КХ/ММ схем предложено выражение для расчйта взаимодействия между остовами КХ атомов и атомами мм области:

[А . . В. . 1 1

где индексы 1 и о пробегают по КХ и ММ атомам, соответственно, - заряд остова КХ атома, - заряд ММ агома, а^ и -выражаются через параметры Леннарда-Джонса и с; AiJ -' си = Ац = С а = 4ср6.

Поправки к матричным элементам гамильтониана имеют вид:

= £ (2) 3

где Ч] - заряд ММ атома, р и ^ - атомные орбитали КХ атома. SJ -я-орбиталь, которая приписывается каждому ММ атому. Таким образом, каждому атому КХ системы приписываются ММ параметры Леннарда-Джонса - с и о, а каждому ММ атому - КХ параметры из тоо-схет - « и с0 - для расчёта двухэлектронных двухцентровых интегралов втвт> и остов-остовного взаимодействия в

(I) и (2). Кроме того, нами вводился дополнительный параметр - 5 - для калибровки электростатического взаимодействия между КХ и ММ областями, который получали при оптимизации функции:

т) = I - ьн^Ц) |*р (3)

где ¿я|хр - энтальпия взаимодействия в ¿-том заряженном комплексе с Н-связью, Ди^IЧ1 - рассчитанная энтальпия взаимодействия при данном В качестве тестовых дилеров были выбраны Шд---н2о, сн3?Шу--нго, сн3ш3---сн3ок, н2с---11г„1;+ (катион имидазола), сн3соо~"-н2о, сн3соо_-"1ш (имидазол) и СН^СОО-*• "СН^С'Н, т.к. Н-связи этих типов широко распространены в биологических молекулах. Калибровка электростатического взаимодействия происходила при расчёте интегралов

Фм ММ 2

таким образом, что каждый член . + Р0 > ,

¿=0-2, умножался на € и интеграл I«о^н! «им^Л например, имел форму:

<'seiisen|sx!i!W —: • (4>

I (Rh * UPT + PH0*)2

Било получено значение параметра 5 0,035 при использовании штос И АМ1, И 0,097 для РМЗ.

Достоинством комбинированных КХ/ММ методов MNDO/OPLS, Ai'ii /opls и pm3/opls является возможность проводить расчёты больших систем за разумное время. Поэтому одно из применений гибридной КХ/ММ схемы, включенной в комплекс программ enzyme-92, - возможность поиска структур, отвечавшие наиболее глубокому минимуму на поверхности потенциальной энергии (ППЭ), при этом используется процедура стохастического поиска глобального минимума. Показано, что для кластеров средних размеров алгоритм сходится к очень хорошему локальному минимуму за разумное время.

3 комплексе программ enzyme-92 предусмотрена также возможность моделирования ферментативных реакций. Исходные кристаллографические координаты белка считываются в формате Брукхэйвенского банка белковых структур. Входные данные проверяются на наличие нестандартных или химически модифицированных а/к, генерируются координаты недостающих атомов. Программа eiizyme-92 позволяет сгенерировать недостающие прогоны, поставить в соответствие каждому атому каждой аминокислоты заряд и параметры Ван-дер-Ваальсового взаимодействия, "вырезать" из массива координат белка КХ область для последующих КХ/ММ расчётов. При этом аминокислотные (а/к) остатки, принимающие непосредственное участие в химическом превращении, моделируются квантовохимически, а остальная часть бежа - методом молекулярной механики.

В третьей главе проводится проверка адекватности гибридных MNDO/opls, am1/opls и PM3/OPLS методов для расчёта энтальпий взаимодействия и геометрии большого числа заряженных и нейтральных комплексов с Н-связями. Рассчитанные энтальпии Н-связей и геометрии сопоставлены с экспериментальными данными и

Таблица I

Средние ошибки при расчёте энергий Н-с.вязей (ккал/моль)1 для заряженных и нейтральных комплексов согласно гибридным кх/мм (mndo/opls, ami/opis и рмз/opls) и "чистым" квантовохимическим imndo/m, ami и рмз) методам*.

Число

Типы н-связей камЕго mnd0/h mndo/opls ami ami/opls рмз рмз/opls

'типа

Заряженные димеры

-NH+.. ,.0- 18 2.02 1. 76 4.84 1. 62 6. 00 2.04

-NH+•■ . .0= 6 1.95 3. 06 5, .37 2. 32 4. 27 3.38

но- 14 5.26 3 . 36 8, .07 3. 11 5. 28 3.22

HN- 1 6.65 2. 46 4. ,85 1. 39 2. 34 2.77

-NH + .. ..N- 6 1 .69 4 . 39 6, .64 3. 78 4. 96 5.54

-NH + ' • • •N«C- 5 2.50 4 . 95 9, .46 5. 00 3. 53 4.89

-NH+-, . • S- 4 3. 16 2 . 68 1. .17 5. 60 0.90 5.85

HS- 1 2.36 2 . 54 2, .95 2. 96 г. 07 2.59

Hal-.. ,.но- 6 6.00 5, 29 1. .60 4. 58 3. 34 4.97

-NH + .. • >На1 - 2 2.35 2. 61 2. ,57 2. 54 2. 49 2.37

Общая средняя ощи<;ка: 63 3.29 3 .25 5 . 57 , 3. 14 4. 64 3.58

Нейтральные димерыь

-0...Н0- 10 1 .10 1.92 ¡0. 88 3. .88 2. ,05 ; 1. 06 2. 77 1 •81;0.

-он... .N- 5 3.59 1.51 ; 1 • 12 5. .34 2, ,84 ¡1- 20 4 . 21 1 . 45;1.

Общая средняя ошибка: 15 1.93 1 . 75 ;0. 91 4. .37 2. , 38;1. 08 3. 25 1 . 66;0.

•> Hai- - галоген-анион. Hai- - соединения рсн3 и с1сн3,

* Для гибридных КХ/ММ расчётов нейтральных комплексов средние ошибки даны для случаев, когда ММ часть системы является донором и акцептором протона, соответственно.

результатами неэмпирических расчётов. Рассчитанные средние ошибки в определении энергий Н-связей как гибридными MNDO/OPLS, AM1/OPLS и PM3/OPLS методами, так и "чистыми" полуэмпирическими MNDO/M, ami и РИЗ схемами представлены в таблице I.

Следует особенно подчеркнуть, что во многих случаях смешанные КХ/ММ ' схемы достигают лучшего согласия с экспериментом, чем "чистые" полуэмпирические методы. Особенно для комплексов с Н-связями -NH+-"0-, -НН+>*-0= и -0Н---_0-, которые играют важную роль и широко распространены в биологических системах.

Помимо энергетических характеристик гибридные КХ/ММ схемы хорошо воспроизводят и геометрические параметры Н-комплексов. Например, они правильно воспроизводят геометрии и относительные энергии различных конфигураций для димеров: NhJ^-HjO, СНзШз---НгО, кс00~---н20, НСОО~---НСООН, NH3---NH4, Р~---НгО, С1~-"Н20 и H20-"H20, что находится в хорошем согласии с данными неэмпирических расчётов в расширенных базисах. При этом важно отметить, что ошибочное предпочтение метода АМ1 структурам с бифуркационными Н-свяэями отсутствует в гибридных AM1/OPLS расчётах.

В четвёртой главе изучается профиль поверхности потенциальной энергии реакции образования тетраэдрического интермедиата в , АЦ ацетилхолинэстеразы, при этом три каталитических аминокислотных (а/к) остатка - серин-200, гистидин-440 и глутамин-327, а также субстрат (метилацетат) моделировались квантовохимически (РМЗ), а оставшиеся 5161 атомов белка - методом молекулярной механики (OPtS/AMBER). Таким образом, исследовался процесс:

Серин-200 Гистидин-440

Глутамин-32'5'

Серин-200 Гистидин-440

Н3С4 (Г~$

о д Н-1У + >-н—о—с

V \

НзС/с\0- Глутамин-327

Схема I

Прежде всего, чтобы понять механизм активации серинового остатка, нас интересовало состояние каталитической триады Сер200_гис440_глу327 в свободном ферменте. Для этого были исследованы четыре возможных состояния каталитической триады (см. табл. 2) с учётом белкового окружения и без него.

Таблица 2

Относительные энергии (в ккал/моль) различных состояний каталитической триады Сер-Гис-Глу в АХЭ и в газовой фазе согласно комбинированным РМЗ/ОРЬЗ расчётам с оптимизацией положения а/к остатков.

Состояние триады В ферменте В газовой фазе

Сер0---Гис°---Глу_ о,о о,о

Сер-...гис + '--Глу" 17,19 39,48

Сер"---Гис°---Глу° 25,95 34,63

Сер°...ГИС----Глу° 27,25 4 ,97

Как видно из таблицы 2, перенос - протона с серина на гистидин является не выгодным по энергии. Однако в ферменте эта разница значительно меньше (на 22 ккал/молы, чем в газовой фазе. Другая интересная особенность - состояние Сер°-Гис.~-Глуи е газовой фазе сравнимо по энергии (разница - всего 5 ккал/моль) с наинизшей по энергии конфигурацией. Ситуация коренным образом меняется при учёте белкового окружения - теперь уже состояние Cep0-Гиc--ГлyL', становится наивысшим по энергии (см. табл. 2).

Такое влияние белкового окружения объясняется тем, что в зоне АЦ белком создаётся электростатический потенциал (ЭСП), имеющий выраженный минимум в области гистидина (см. рис. I и 2). Тем самым, ЭСП белка значительно стабилизирует образующийся при

Ser-200

His-440

\y н-

оГ^ I

¿нз ch3

/ \ ■4

■h

o-

Glu-327

1

С Ф

4

С

с

¿етраэдрический интермедиат в активном центре АХЭ

й4

!f4s

Ri = Оу- Ne ; Iî2= Ng- О ; г,= 0Y-H ; r2=H-N£; r3=N5-H

Рис. I Расчётная модель и обозначения атомов.

Electrostatic Potential

in the AChE Active Site

Potential (kcal/mol)

Or*

O(S.t) H(S»t) NE(Hlt) ND(Hls) HO(Hll) O(Olu)

Atoms of the AChE Catalytic Triad

Рис. 2

Форма ЭСП в активном центре АХЭ.

переносе протона имидазолий катион. Другой важный фактор -

изменение ЗСП вдоль линии От(Сер) - МЕ(Гис), которое способствует переносу протона с серина на гистидин (см. рис. 2). Становится понятным также, почему состояние Сер°-Гис_-Глу^ энергетически невыгодно в ферменте: во-первых, форма ЭСП будет препятствовать переносу протона с атома на(Шз) гистидина на 0(С1и) глутамина; во-вторых, значительный по величине отрицательный ЭСП значительно дестабилизирует имидазол-анион (см. рис. 2).

После этого нами был исследован путь реакции образования ТИ как в АЦ АХЭ, так и в газовой фазе (Схема I).

Хорошо известно, что в газовой фазе взаимодействие между карбонильными соединениями и отрицательно заряженными нуклеофилами протекает безбарьерно и образующийся ТИ более стабилен, чем исходные реагенты. Таким образом, для активации серина в АЦ АХЭ необходимо перенести протон на гистидин, и высота энергетического барьера переноса протона будет определяшим фактором при образовании ТИ. Профиль энергии образования (распада) ТИ в АД АХЭ и в газовой фазе представлен на рисунке 3.

Reaction Paths

In the AChE and In the Vacuum

l9Mn»-»vbllrat* ¿Utaac*. angitroms

■в"Ев»Т1п» Bai Pbaie

рис. 3

Профиль ППЭ при образовании ТИ в ферменте и в газовой фазе.

Первое, что следует отметить - это то, что учёт белкового окружения коренным образом меняет протекание реакции. Например, в газовой фазе образующийся ТИ менее стабилен, чем исходные реагенты (наиболее стабильная структура в данном случае - ион-дипольный комплекс при расстоянии от серина до субстрата «3.0 А), а энергия актива-.™ реакции образования ТИ составляет,43.3 ккал/моль. Совершенно иная картина наблюдается в ферменте, где образующийся ТИ более стабилен, чем исходные реагенты. При этом, энергия активации образования ТИ - 16.2 ккал/моль. Таким образом, понижение энергии активации реакции образования ТИ при переходе от газовой фазы к ферменту составляет 27 ккал/моль.

Одна из причин высокой каталитической активности, как это уже обсуждалось вше. - увеличение по абсолютной величине ЭСП фермента, имеющего отрицательный знак, вдоль линии, соединяпаей Оу кислород серина с азотом гистшшна (см. рис. 2). Другая важная составляющая каталитической эффективности АХЭ - "оксиани-онная полость" ("oxyanion hole"), образованная N-H группами пептидных связей s/E qiy-118, Gly-119 и Aia-201 (ту-. 4).

TI

Sei

Gly-118

Ala-201

Gly-119

Рис. 4. ТИ в активном центре АХЭ.

Образование трёх водородных связей между карбонильным кислородом субстрата и и-н группами пептидных связей вышеназванных а/к (см. рис. 4.13, длины Н-связей - 2.636, 2.760 и 2.793 А для Оу-пв, С1у-119 и А1а-201 , соответственно) способствует переносу части отрицательного заряда с кислорода серина на карбонильный кислород субстрата при переходе протона на гистидин. Как видно из рисунка 5, перенос отрицательного

заряда на карбонильный кислород субстрата по мере образования ТИ в белке значительно больше, чем в газовой фазе. А хорошо известно, что значения энергий Н-связей в заряженных и нейтральныхсистемах существенно различаются. Таким образом, за счёт образования Н-связей между карбонильным кислородом субстрата с н-н группами.амидных связей "оксианионной полости" в ферменте достигается дополнительная стабилизация ПС при образовали ТИ.

На основе полученных результатов и их обсуждения можно сделать следующие выводы:

I) Между элементами каталитической триады в свободном АХЭ существуют сильные Н-связи, а форма ЭСП вдоль линии, соединяющей

Charge Change on the OS Atom Along the Reaction Path

Charge El/St Potential, !kcal/mol) • 0.21-1100

Рис. 5

Изменение заряда (в единицах заряда электрона, левая ось ОУ) и ЭСП (правая ось ординат) на атоме 03 (см. рис. I) субстрата в ходе реакции образования ТИ.

серин и гистидин (см. рис. 2), способствует передаче протона с серина на гистидин и активации серинового гидроксила для последующей атаки карбонильного углерода субстрата;

2) Образование трёх сильных Н-связей между карбонильным кослородом образовавшегося ТИ и к-Н группами амидных связей "оксианионной полости" АХЭ способствует стабилизации ТИ и понижает энергетический барьер при его образовании (см. рис. 4);

3) Наблюдается электростатическая комплиментарность фермента переходному состоянию реакции, что, по-видимому, является одним из главных условий для эффективного катализа (см. рис. 3);

41 Вышеназванные факторы, а также стерическая комплиментарность фермента переходному состоянию являются причиной необратимого ингибирования фермента фосфорорганическими соединениями. Образующийся при этом фосфоэфир идеально моделирует ТИ в АЦ фермента.

Т.к. нуклеофильное замещение у атома углерода карбонильной группы лежит в основе многих биохимических процессов, то предложенный механизм стабилизации ПС имеет, по-видимому, достаточно общий характер.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Разработан гибридный кх/мм потенциал (ШТОО/ОРЬв, АМ1/ОР1£ и рмз/орьб), предназначенный для корректного описания взаимодействия между КХ и ММ подсистемами.

2. Создан комплекс программ ЕЫгУМЕ-92, позволяющий проводить совместные КХ/ММ расчёты систем, включапцих до 400 АО (КХ область) и 6000 ММ атомов (ММ область). Комплекс программ ориентирован на моделирование химических реакций в АЛ ферментов.

3. Изучено влияние белкового окружения на стабилизацию переходного состояния в активном центре фермента. Показано, что электростатическая комплиментарность фермента переходному состоянию приводит к понижению энергии активации на 27 ккал/моль.

ücEoíLioe содешаыкз диссертшки опубл?г:овезс » ш»ота:

I Ъоклаг A.A., Васильев З.Б. // нзвквтоьс—sis«wecKO-исслздоваегса '•кбтадиткчвсвоь триат" свриыоыи» игитеез. // tísEZix. оио.-огкя. 1SÓ7. Т.21. ГЗ. C.607-oIö. Е:.;?;льеЕ Б.В., BoííTl;. ■ A.A. // fipj.^jiei..:: ь;;тодл ¡•лла^удярнсиц механизм для исследования систлг с сильны;. . всдорогтооа связгк,... // £ущ. £иа. химии. 1931. ï.ôo. ; V c.2i09-2iïc-

'о. ьйокльеи Е.б., Бл'лзех;; a.a., Во^т;;::: a.a. // УчОг оер:/г,.го;>' г. квэлтоБо-хюя«ес:с:-:х расчета кзтопс.: молекуллрпэч ьохьзйкк. // ÏJ3. во!;л. | Вовсошл. сэвовеиия пэ mtssaoao-.-»sa, Казань, 1991, С. 804,

1. Васильев В.В., Близнец a.a., Бойтаг. A.a. // Методика уч'ь~'л вкчяакя белкового окружения на риагаши в активных центра; ■i// Тез. докл. ПэрвоЗ: Всесозззн, гляг^зреишв! п& ■.'аоругической оргеп:»чэской хкиии, So/гоград, 1931, С. 84.

5. YcaiJyev V.T., Voityuk A.A. // Mulecular bsctianixs ( -Iculstioiis of Sybt«K3 T.rith Strong Hyäroe;en Bcmáj. // Kol. Strust. 1992. V.265. P.179-1B'-

6. vp-3ilyev v.t., Bliznyuk a.a., Voityuk a.a. // а сотыпза. quantum Clisnical/Moiecular Lsinanical Study of Hydrcgssv-Soriüeä Syaie¡53. // Int. J. 'Quant. Chem. 1992. V.<4. Р.8Э7-930,

7. Yasilyev T.V. // leipotddrsJ. Intenssdlate i'omr'ticxi 1n Acylation btep oí AestylchoLinbe tcrsee А Combin«;* Quantum Cntmical end Molecular üechanicbl koâji. // ТИЮСНЕЫ, in ргеьг..