Специфичность естественных анти-углеводных антител человека в норме тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Учреждение Российской академии наук ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

На правах рукописи

4853098

Обухова Полина Сергеевна

Специфичность естественных анти-углеводных антител человека в норме

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 5 сен 2011

Москва 2011

4853098

Работа выполнена в лаборатории углеводов Учреждения Российской академии наук Институт бноорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Бовин Николай Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Мягкова Марина Александровна

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Габибов Александр Габибович

Ведущая организация: ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Защита диссертации состоится 30 сентября 2011 г. в _К) часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997 ГСП-7 Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 25 августа 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор физико-математических наук В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Антитела, циркулирующие в крови здорового человека и продуцируемые в отсутствие явной антигенной стимуляции, называются естественными антителами (EAT). Они отличаются от адаптивных антител, а их продукцию осуществляет особая популяция CD5+ В-клеток. Предполагают, что EAT являются компонентом врождённого иммунитета и служат первой линией защиты против патогенов. Предполагаются и другие их функции, в частности, регуляторные. При определённых условиях EAT участвуют в развитии аутоиммунных заболеваний. Значительная часть EAT направлена к гликанам - компонентам гликолипидов, гликопротеинов и полисахаридов. Необходимость изучения анти-гликановых EAT диктуется их несомненной важностью для трансфузиологии и трансплантационной медицины. Тем не менее, репертуар изученных анти-гликановых антител ограничивается EAT против антигенов групп крови (в основном, системы ABO), ксено- и опухолеассоциированных антигенов, а эпитопная специфичность остается малоизученной. Систематическое изучение репертуара и специфичности анти-гликановых антител, а также выявление их функциональных мишеней, несомненно, являются актуальными задачами. Наконец, знание истинной специфичности EAT в норме необходимо для изучения патологических процессов человека, таких как аутоиммунные реакции и онкотрансформация.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось детальное исследование анти-гликановых, в первую очередь, естественных антител человека в норме (то есть у здоровых доноров).

Предполагалось решить следующие задачи:

1. максимально подробно изучить репертуар анти-гликановых антител;

2. выделить антитела с помощью гаптен-специфической аффинной хроматографии и картировать их эпитопную специфичность;

3. объяснить эффект толерантности ауто-антител к ауто-антигенам, в частности, антигенам групп крови системы ABO.

Научная новизна. Систематически изучен репертуар специфичности анти-гликановых EAT крови здоровых доноров. Показано сходство профилей

специфичности EAT разных индивидуумов. Выявлены антитела с неизвестными ранее специфичностями, в том числе направленные к коровым участкам гликанов. Показано, что уровень антител к ксеноантигену Galal-3GaIß на порядок ниже, чем считалось раньше. Дано экспериментальное объяснение факту сосуществования гистоантигена группы крови А, с одной стороны, и аутологичных анти-А EAT, с другой стороны.

Практическая значимость. Естественные антитела, направленные к дисахариду Lec, специфичность которых охарактеризована в данной работе, способны избирательно связываться с клетками опухоли молочной железы; полученные данные могут быть использованы в диагностических целях. Установлено, что для полного удаления группоспецифических анти-А и анти-В антител (это необходимо при несовместимых трансплантациях и трансфузиях) адсорбенты могут быть сконструированы с использованием соответствующих трисахаридных лигандов. Найдены оптимальные условия элюции анти-гликановых антител с аффинного адсорбента, что может быть востребовано при масштабированном выделении терапевтических и диагностических антител.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах. Основные материалы диссертации были представлены на следующих международных конференциях: XVI зимняя молодёжная научная школа (Москва, 2004), VII Чтения, посвящённые памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2004), The Joint meeting of the Society for glycobiology and the Japanese society for carbohydrate research (Гонолулу, 2004), The 4th International congress on Autoimmunity (Будапешт, 2004), The 2nd ISN Special Neurochemistry Conference on Neural Glycoproteins and Glycolipids (Антигуа, 2006), 2-я Московская международная конференция «Иммунофизиология: аутоиммунитет в норме и патологии» (Москва, 2008), XXII зимняя молодёжная научная школа (Москва, 2010), The 7th International Congress on Autoimmunity (Любляна, 2010).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 179 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов, заключения и списка цитируемой литературы, включающего 290 ссылок. Диссертация содержит 51 рисунок, 11 таблиц и 4 приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Исследование гликансвязывающего профиля антител с помощью гликочипа (printed glycan array, PGA) и иммуноферментного анализа (ИФА). В ИФА использовались гликаны (Glyc), связанные с РАА (поли[Ы-(гидроксиэтил)акриламидом]) через спейсер: аминопропильный (sp3), аминоэтильный (sp2) или глицинамидный (-NHCOCH2NH2), обозначенный здесь как NHGly; в PGA гликаны были присоединены к стеклянной поверхности чипа через дополнительный полиэтиленгликолевый спейсер, см. Таблицу 1.

Таблица 1. Список некоторых гликанов и медиана связывания сывороточных антител в PGA. Значимый уровень связывания: RFU' > 10s. Серым выделены гликаны, которые были использованы в виде аффинных адсорбентов для выделения EAT. (*) - гликаны, антитела к которым в литературе не описаны, (н.т.) - не тестировали.

Обозначение Формула Медиана, RFU*Iff5

3'-0-SuLec 3-0-Su-Gaipi-3GlcNAcp-sp3 * 134.2

3'SiaLec Neu5Aca2-3Gaipi-3GlcNAcp-sp3 » 75.0

Fs-2 GalNAcal-3GalNAcP-sp3 53.9

4'-0-SuLN 4-0-Su-Gaipi-4GlcNAcp-sp3 * 51.5

Fuca3GlcNAc Fucal-3GlcNAcp-sp3 44.0

Fuca4G!cNAc FucaI-4GlcNAcP-sp3 * 43.0

aLN Galal-4GlcNAcP-sp3 * 43.0

Adi Ga)NAcal-3Galp-sp3 * 36.3

Lec Gaipi-3GlcNAcp-sp3 * 35.8

LNT Gaipi-3GlcNAcpl-3Gaipi-4GlcP-NHGly * 32.1

B«rt Galal-3 (Fucal-2)Gaip-sp3 31.3

LNnT Gaipi-4GlcNAcPl-3Gaipi-4Glcp-NHGly * 29.5

Pk GalaI-4Gaipi-4GlcP-sp2 * 24.8

LeBLac Fucctl-2Gaipi-3(Fucal-4)GlcNAcpi-3Gaipi-4Glcp-NHGly * 23.7

А(Г( GalNAcal-3(Fucal-2)Gaip-sp3 18.4

Pi Galal-4Gaipi-4GlcNAcP-sp2 * 17.0

Lac Gaipi-4GlcP-sp3 12.2

Bdi Galal-3Galp-sp3 11.9

Hal Fucal-2Gaip-sp3 * 10.9

A (type 2) GalNAcal-3(Fucal-2)Galpl-4GlcNAcP-sp3 7.6

"AB" GaINH(ceH3b с IMA)al-3(Fucal-2)Gal(^OCH,CIi..clJ,\H,\c * H.T.

3'SiaLeA Ncu5Aca2-3Gaipi-3(Fucal-4)GlcNAcP-sp3 3.7

LeB Fucal-2Gaipi-3(Fucal-4)GlcNAcP-sp3 2.1

i Gaipi-4GlcNAcPl-3Gaipi-4GlcNAcP-sp2 1.5

LN Gaipi-4GlcNAcP-sp3 1.4

Le* Fucal-4(Gaipi-3)GlcIVAcp-sp3 1.1

H(type2) Fucal-2Gaipi-4GlcNAcp-sp3 * 0.9

Lex Gaipi-4(Fucal-3)GlcNAcp-sp3 * 0.9

1 Относительные единицы флуоресценции.

Среди использованных гликанов были как природные (их большинство) -наиболее часто встречающиеся и биологически значимые, так и неприродные.

В результате исследования индивидуальных сывороток крови от 106 доноров на гликочипе со 199 гликанами обнаружены ранее неизвестные EAT (Таблица 1, см. *). В ИФА исследовано 530 сывороток крови здоровых доноров (как индивидуальных, так и пулированных по 10-50 образцов); пулирование проводилось в соответствии с группой крови по системе ABO. Гликан-связывающие профили индивидуальных сывороток соответствовали профилям, полученным для сывороточных пулов в ИФА, и в большинстве случаев совпадали с профилями PGA.

2. Аффинная хроматография сывороток крови. Необходимость выделения антител из сывороток крови продиктована следующими соображениями. Во-первых, факт связывания в тест-системе антител нативной сыворотки с крупным гликаном может быть ошибочно интерпретирован, если на самом деле антитела направлены не к нему, а к его небольшому фрагменту. Во-вторых, нельзя исключить маскировку антител в сыворотке крови муцинами или анти-идиотипическими иммуноглобулинами [Spalter et al. (1999) Blood. 93 (15): 4418-24].

В представленной работе использовано 13 аффинных глико-адсорбентов (Таблица 1), синтезированных на основе аминосефарозы (sepharose 6FF), к которой лиганд (0.5 мкмоль/мл) присоединён через РАА. Выбор именно этих гликанов был обусловлен их высоким (или наоборот, очень низким в случае Lex) уровнем связывания в PGA, а также особой значимостью для решения поставленной в данной работе задачи - объяснить природу толерантности аутологичных EAT.

Условия нанесения сыворотки на адсорбент и условия элюции антител с него оптимизировали с особой тщательностью, чтобы избежать: 1) неполноты выделения антител, искажающей истинный профиль поликлональных антител; 2) изменения нативной конформации иммуноглобулинов (Ig), которое может исказить специфичность антител; 3) неспецифического захвата посторонних антител и посторонних белков. Мы выбрали такое объёмное соотношение адсорбент/сыворотка (1 : 13), когда используемый адсорбент" находился в

" 1 мл глико-адсорбента способен связать до 1.6 мг Ig

заведомом избытке по отношению к сывороточным антителам. Благодаря этому, связанными оказывались как шо. так и 1§М; как высоко-, так и низкоаффинные. Неадсорбированный материал проверялся на отсутствие антител изучаемой специфичности (Рис. 1).

• Лл"РАА

160 аз 40 30 20

Разведение сыварсгти

В_-РАА Д -РАА -■РМ

160 00 40 30 20

Разведение сыворотки

Рис. 1. ИФА сыворотки крови группы В до (1) и после (2) аффинной хроматографии на БерИагозе.

В качестве отрицательного контроля выбран адсорбент без углеводного лиганда (РАА-зерЬагозе). Элюаты антител с глико-адсорбента истощали на РАА-верЬагозе для удаления неспецифических белков и связавшихся с сефарозой. Щелочной вариант элюции (ТтОН, 0.2 М, рН 10.4) оказался предпочтительным по сравнению с другими вариантами (с использованием кислотного буферного раствора, повышенной ионной силы, хаотропных ионов, а также их сочетания) как в отношении сохранения активности и специфичности антител, так и в отношении полноты элюции (-75%). Концентрацию антител в полученных элюатах оценивали спектрофотометрически при X = 280 нм. Как показано на Рис. 2, 1§М преобладали над 1§0.

■

204 кОЬ^ ■

116 м

Э6

МиГ

а-щль ЦВ б7

54

%

» __- Я

-I

1дС 1дМ 1дА (1) (2) *(3) "(4)

Рис. 2. 808-электрофорез. (1)

и (2) - первичные элюаты анти-Н^ антител, выделенных из сывороток крови групп О и АВ, соответственно, (3) - стандартный набор белков, (4) -сывороточный альбумин человека. Полоса ^А в образцах исследуемых антител на электрофореграмме не видна.

С помощью количественного ИФА с использованием калибровочных кривых для стандартных препаратов и ^А человека, было определено

весовое соотношение изотипов Как правило, наблюдалось преобладание (до 10 раз) 1§М над и тем более - над ^А. В некоторых случаях, например, в элюатах анти-А антител из пулированных сывороток группы В, показано небольшое преобладание по массе над ^М, возможно, из-за "естественной" дополнительной аллоиммунизации (например, беременности), перенесённой некоторыми здоровыми донорами в течение жизни. Концентрация анти-гликановых антител, рассчитанная после их выделения из исходной сыворотки с помощью количественного ИФА, попала в сравнительно узкий диапазон, порядка 1-10 мкг иммуноглобулинов в 1 мл сыворотки крови.

3. Оценка аффинности выделенных антител. Аффинность ЕАТ оценивали с помощью ИФА в тесте ингибирования мономерным гликаном взаимодействия антител с 01ус-РАА. На Рис. 3.1 антитела расположены в ряд по увеличению константы аффинности Кд. Диапазон величин КА находился в пределах 1 - 46х103 М"1. Кроме того, была определена авидность выделенных антител, под которой мы здесь подразумеваем способность связываться с поливалентным антигеном (в данном случае, с С1ус-РАА). Эта информация даёт представление о кооперативности связывания антител с поливалентными антигенами, к которым относятся природные антигены. Из исследованных популяций антител наиболее авидными при физиологических условиях

оказались анти-Аа, (доноры группы крови В), наименее - анти-Н^ (доноры групп О и АВ), Рис. 3. Видно, что авидность и аффинность не коррелируют.

1)

2)

■ ■■ill

^ Ф О^ Ф ^Р Ф J* ^ " »» ^ Н

Рис. 3. Аффинность (1) и авидность (2) выделенных анти-гликановых антител, определённые при 37°С. Аффинность оценивалась как величина КА в тесте ингибирования мономерным (не конъюгированным) гликаном, а авидность - как величина (1/С), обратная концентрации антител, дающей интенсивность OD = 1.5 в ИФА для прямого связывания с Glyc-PAA. На оси ОХ указаны гликаны-лиганды, на которых выделяли антитела (в скобках - группа крови доноров, А' - сыворотка группы крови А, истощенная на B,n-sepharose).

На примере двух образцов анти-А[п антител, выделенных из сывороток групп В и А (выделение и специфичность этих антител описаны в главе 4.1), определено влияние степени поливалентности антигена на авидность антител. Для этого, ингибирование проводили двумя типами гликополимеров - "лёгким" (А,п-РАА30к0а) и "тяжёлым" (Atr,-PAA1000kDa). Соотношение величин КА здесь было следующим: AtrrPAA1000 / Atn-PAA30/ мономер Atri = 125 : 4 : 1 для анти-Aö-i антител, выделенных из сывороток группы В, и 19 : 2 : 1 для анти-Ат антител, выделенных из сывороток группы А. Таким образом, первые (т.е. алло-антитела) значительно более чувствительны к степени поливалентности антигена, чем вторые (т.е. ауто-антитела).

4. Эпитопная специфичность аффинно-выделенных антител.

Углеводная специфичность выделенных антител была детально исследована в ИФА (несколько десятков гликанов), а также с помощью PGA (несколько сотен гликанов). В тестах с клетками и тканями определяли возможную функциональную значимость некоторых из них.

4.1. Алло- и ауто-реактивные естественные антитела к А- и Ii-антигенам системы ABO. Антитела формально классифицировали как алло и ауто, опираясь только на АВО-статус донора, т.е. сыворотка крови группы В содержит алло-антитела, а сыворотка группы А - ауто-антитела к А-антигену. В соответствии с правилом Ландштайнера, в сыворотках крови присутствуют только алло-антитела, а ауто-антител быть не должно. В противоречии с этим, Spalter и др. описали ауто-антитела, выделенные из сывороток группы А с помощью адсорбента Atn-sepharose. Их специфичность была проанализирована только с помощью А- и В-трисахаридов [Spalter et al., 1999]. Эти данные противоречат исследованиям Rieben и др., согласно которым у человека нет В-лимфоцитов, способных продуцировать ABO ауто-антитела (IgG) [Rieben et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22(10): 2713-7].

Для того, чтобы разрешить возникшее противоречие, из сывороток крови групп А и В мы выделили с помощью адсорбента Au-i-sepharose анти-А (то есть, как ауто-, так и алло-) антитела"1. Ауто-антитела (Рис. 4.1) слабее, чем алло-антитела (Рис. 4.4) связывались с Atn. Кроме того, они проявили активность по отношению к B-антигенам; поэтому ауто-антитела были выделены на Atri-sepharose из сывороток крови группы А, истощённых на В1п-адсорбенте, и получен профиль, изображенный на Рис. 4.2. Его анализ показал, что эпитопом анти-А ауто-антител, на самом деле, является дисахаридный фрагмент GalNAccxl-3Galß-. Принципиально то, что эти антитела в более сложных олигосахаридах GalNAcal-3(Fucotl-2)Galßl-X,v (к которым относятся все природные гликаны, в том числе А-тетрасахариды типов 1, 2 и 3) не были способны узнавать "свой" дисахаридный эпитоп (Рис. 4.1 и 4.2). В то же время, эти антитела полностью связывались с Adí-sepharose (Рис. 4.3). Напротив, анти-А алло-антитела одинаково хорошо связывались с трисахаридной детерминантой GalNAcal-3(Fucal-2)Galß- и А-тетрасахаридами типов 1, 2 и 3, то есть со всеми вариантами GalNAcotl-3(Fuccd-2)Galßl-X (Рис. 4.4). Анти-А[п алло-антитела, истощённые на Adi-sepharose, сохраняли способность взаимодействовать как с A-три-, так и с А-тетрасахаридами (Рис. 4.5).

'" Аналогично были исследованы анти-В антитела. " Где X - любой моно- или олигосахаридный фрагмент.

1.

4.

а

2.

II

Л

з.

Рис. 4. Специфичность анти-А,п антител, выделенных на Ат-эерЬагозе. ИФА. На оси ОХ обозначены гликаны, которые были иммобилизованы на твёрдой фазе. 1. Ауто-антитела из сывороток группы А, С^ ~ 0.9 мкг/мл; 2. ауто-антитела из Ви-истощённых сывороток группы А, С16 ~ 0.7 мкг/мл; 3. ауто-антитела, лишенные анти-А^ субпопуляции, С^ ~ 3.5 мкг/мл; 4. алло-антитела из сывороток группы В, С^ ~ 0.8 мкг/мл; 5. алло-антитела, лишенные анти-А^ субпопуляции, С^ ~ 1.5 мкг/мл.

Наконец, aHTH-Atn ауто-антитела, в отличие от алло-антител, не агглютинировали A-эритроциты даже при высоких концентрациях (20 мкг/мл), на порядок превышающих концентрацию данных антител в сыворотке.

Антитела, аналогично выделенные из сывороток крови группы В, но не на Atr¡-, а на A(type 2)-sepharose, взаимодействовали как с минимальным (А-трисахаридом), так и с функциональными (А-тетрасахаридами типов 1, 2 и 3) фрагментами A-антигена. В то же время, необходимым и достаточным эпитопом иммунологически значимых анти-А алло-антител является именно А1г1, т.к. узко специфической субпопуляции антител к тетрасахариду A(type 2) не обнаружено. Это следует из данных рисунка 4.5: анти-А tn алло-антитела после дополнительной аффинной хроматографии на A(type 2)-sepharose не изменили специфичность. Отсутствие субпопуляции с исключительной специфичностью к А-тетрасахариду важно с практической точки зрения, так как позволяет использовать более простой трисахарид для удаления антител при АВО-несовместимой трансплантации органов.

Таким образом, анти-Ащ алло-антитела направлены к доступным внешним участкам природного А-гликана, в то время как ауто-антитела узнают внутренний, всегда скрытый в природном гликане, эпитоп А-дисахарида (Рис. 5). То есть, анти-А антитела из сыворотки крови группы А (формально ауто) не являются группоспецифическими, и не имеют никакого отношения к системе ABO. То же самое справедливо и для анти-В антител доноров группы крови В.

A-mempacaxapud: GalNAcg1-3(Fuca1 -2) Galü1-4GlcNA с В-

A-mpucaxapud: GalNAc<x1-3(Fuc<z1-2)Galft-

Рис. 5. Эпитопы анти-А алло- и ауто-антител.

4.2. Антитела, выделенные на Adj-sepharose. Как отмечено выше, выделенные анти-Ат антитела перекрестно взаимодействовали с А-дисахаридом GalNAcal-3Gaip (Adl). В отличие от В-дисахарида, А-антиген не найден у млекопитающих в нефукозилированным виде, и поэтому не относится к ксено-антигенам. Однако широко представлен близкий аналог Adl, а именно антиген Форссмана, терминированный дисахаридом GalNAcal-3GalNAcp (Fs-2). Для того, чтобы выяснить эпитопную специфичность субпопуляции анти-Аа, антител, она была выделена с помощью Adi-sepharose из сывороток доноров как А, так и В групп. В элюатах были обнаружены антитела с широкой реактивностью по отношению к гликанам, родственным Adl, в том числе и к Fs-2. Интересно, что антитела, выделенные на Adi-sepharose из сывороток группы В, узнавали А-тетрасахариды (типов 1, 2 и 3), в отличие от антител, выделенных из сывороток группы А, то есть наблюдалась некоторая зависимость их специфичности от группы крови донора.

4.3. Анти-Bdi (Galal-3Gaip) и анти-aLN (Galal-4GlcNAcP) антитела.

При изучении специфичности ксенореактивных антител, направленных против Bd.-эпитопа, в сыворотке крови здоровых доноров, всех без исключения, обнаружен необычно высокий уровень антител к другому дисахариду, а именно aLN. Интересно было выяснить, связываются ли эти иммуноглобулины с Bdl и являются ли они ксенореактивными. Для этого из сывороток крови доноров группы О были выделены антитела на аффинных адсорбентах Ваг и aLN-sepharose. Выделенные антитела перекрёстно взаимодействовали, соответственно, с aLN или Bdi. В результате последующих аффинных хроматографии на aLN- или Bdl-sepharose сывороток, уже истощённых на Bdl-или aLN-sepharose, были получены неперекрывающиеся субпопуляции анти-aLN и анти-Ва, антител. Субпопуляция анти-Вд EAT взаимодействовала со всеми гликанами, содержащими мотив Galal-3Gaip (Рис. 6.1). В то же время, взаимодействия с Galal -4GlcNAcP не было вовсе. Таким образом, полученные антитела специфичны именно к Galal-3Gaip эпитопу; содержание их в сыворотке крови -10 мкг/мл. По литературным данным (вошедшим в учебники и обзоры по ксенотрансплантации) эти антитела составляют 1-2% всех иммуноглобулинов, то есть 50-100 мкг/мл [Galili U. (2005) Immunol Cell Biol. 83(6): 674-86]. Таким образом, общепринятая величина является сильно завышенной.

Рис. 6. (1) Специфичность антител, выделенных с помощью адсорбента Bdi-sepharose из сывороток крови группы О, истощённых на aLN-sepharose. (2) Специфичность антител, выделенных с помощью адсорбента aLN-sepharose из сывороток крови группы О, истощённых на Bdi-sepharose. ИФА, концентрация Ig 0.5 мкг/мл. Доверительные интервалы-стандартные отклонения от среднего арифметического OD разных образцов.

Что касается аффинно выделенных анти-aLN антител, то они были монореактивными, то есть взаимодействовали только с дисахаридом Galal-4GlcNAcß (Рис. 6.2). Их концентрация в сыворотке соответствует также величине около 10 мкг/мл. С помощью проточной цитофлуориметрии была исследована их цитотоксичность по отношению к свиным клеткам, содержащим Bdi-3nHTonv. Цитотоксичности не наблюдалось, что позволило сделать вывод об отсутствии ксенореактивности. Это согласуется с литературными данными: последовательность Galal-4GlcNAcß не найдена в тканях млекопитающих.

4.4. Антитела к "АВ"-эпитопу. Несмотря на то, что природа групп крови А и В системы ABO изучается давно, до начала настоящего исследования было непонятно, что с молекулярной точки зрения представляет собой "АВ"-эпитоп, который узнают некоторые моноклонапьные антитела, одинаково взаимодействующие с антигенами А и В, но не связывающиеся с фрагментом Fucal-2Galß [Mollicone et al. (1987) Rev. Fr. Transfus. Immunohematol. 30: 601-8; Voak D. and Path F.R.C. (1989) Transfus. Sei. 10: 5-13]. Естественные антитела к

v Цитотоксичность выделенных антител исследован Dr. R. Rieben в Университете Берна (Швейцария).

такому эпитопу до настоящего исследования практически не были изучены, но они должны учитываться в трансфузиологии.

Мы предположили, что "АВ"-эпитоп максимально удалён от сайта различия А- и В-трисахаридов. Конформационно трисахариды А и В практически идентичны, а единственное их структурное отличие находится в положении С-2 остатка Gala (в А-трисахариде в этом месте располагается группа NHAc, а в В-трисахариде - гидроксил). Учитывая все это, был "сконструирован" "АВ"-антиген, представляющий собой РАА-гликоконъюгат А-трисахарида, где трисахарид (без ацетильной группы) присоединён к полимеру через азот при атоме С-2 остатка GalNHa (Рис. 7). Такая конструкция максимально затрудняет взаимодействие антител с сайтом различия А и В эпитопов, и в то же время, хорошо экспонирует предполагаемый "АВ"-эпитоп.

Рис. 7. Молекулярная модель "АВ"-антигена, sp = -NH(CH2)3NHAc.

Средний уровень взаимодействия исходных сывороток здоровых доноров группы крови О (разведение 1/20) в ИФА с "АВ"-трисахаридом оказался низким (OD = 0.32±0.20) по сравнению с группоспецифическими А- и В-трисахаридами (OD = 1.67±0.26 и 1.29±0.16, соответственно), но значимым (Рис 8.1). Однако, для антител, выделенных на "AB"-sepharose из сывороток крови группы О, наблюдалось одинаковое взаимодействие с А- и В-антигенами (три-и тетрасахаридами) и с "АВ"-эпитопом. Связывание с общими структурами этих гликанов (Hj, и Fuca) было на фоновом уровне (Рис. 8.2). Полученный результат подтвердил предположенную молекулярную природу "АВ"-гликотопа и доказал существование EAT к нему в сыворотке крови здоровых доноров. Изученные нами анти-"АВ" EAT не являются артефактом, т.е. следствием денатурации молекул Ig, как считалось ранее [Dodd et al. (1967) Immunology. 12(1): 39-52].

AB ЭПИ70П

J , 2-NH

связь с PAA

TM

: - A(typs2), B(type2)

K) 40 30 20

Разведение сыворотхи

О

1 2 3 4 5 6 7 Концентрация иммуноглобулинов, мкг/мл

Рис. 8. ИФА: (1) пулированной сыворотки крови группы О от 12 здоровых доноров и (2) антител, выделенных из этого пула на "AB"-sepharose.

4.5. Анти-Ьес и aHTH-3'-0-SuLec антитела. Гликаны Ьес-группы, а именно сам дисахарид Galßl-3GlcNAcß, его сульфатированное З-0-Su-Galßl-3GlcNAcß (3'-0-SuLec) и сиалилированное Neu5Aca2-3Galßl-3GlcNAcß (3'SiaLec) производные, продемонстрировали высокий уровень взаимодействия с сыворотками в PGA и ИФА. Кроме того, отмечена высокая корреляция между этими тремя гликанами при анализе большого числа образцов сывороток крови. Для выяснения природы такой корреляции, была выполнена аффинная хроматография четырёх пулов сывороток крови, а также индивидуальных сывороток, с использованием адсорбентов Lec- и 3'-0-SuLec-sepharose. Эпитопная специфичность антител, выделенных на нейтральном и сульфатированном лигандах, была практически одинаковой. Профили взаимодействия аффинно выделенных анти-Ьес и aHTH-3'-0-SuLec антител, определенные с помощью 32 гликанов в ИФА, были идентичны и похожи на профили, полученные с помощью PGA. Высокое связывание наблюдалось с шестью олигосахаридами: Lec, 3'-0-SuLec, 3'SiaLec, GlcAßl-3GlcNAcß, Fucß l-3GlcNAcß и Le'"3:Le'. а уровень взаимодействия с Gieß и GlcNAcß был ниже. Вклад каждого из классов иммуноглобулинов во взаимодействие с гликанами в ИФА был определён отдельно. Как и ожидалось, самую широкую реактивность показали антитела IgM-класса, более узкую - IgA, и самую узкую - антитела IgG-класса.

Интересной особенностью рассматриваемых антител явилось то, что они очень слабо или совсем не связывались с дисахаридным фрагментом LeL в составе тетрасахаридов общей структуры Lec-X-X (в частности,

Galßl -3 GlcNAcß 1 -3Galß 1 -4Glcß-, Galß 1 -3GlcNAcß 1 -3Galß 1 -4GlcNAcß- и

Са1р1-ЗС1сНАср1-6Са1(31-4С1сЫАс(3-); то есть, правильнее их обозначать как анти-Ьес(сН). Этот факт позволяет считать, что данные антитела не способны связываться с углеводными цепями нормальных клеток, то есть не относятся к ауто-антителам. Учитывая все полученные результаты, эпитоп, с которым взаимодействуют анти-Ьес ЕАТ, реконструирован следующим образом (Рис. 9).

Область взаимодействия анти-Leс антител

R'O

Hex1-3GlcNAcß,

где Hex - гексоза: Galß или GIcAß

Рис. 9. Эпитоп анти-Ьес антител. R = -СООН или -СН2ОН; R' = Н, сульфат или остаток сиаловой кислоты.

Ранее было показано, что углеводные цепи с кором типа 1, то есть Galßl-3GlcNAcß- (Lec), выявляются в 72% случаев рака молочной железы с помощью моноклональных антител, специфичность которых была определена как анти-Lec [Rye et al. (1995) Glycobiology. 5: 385-9]. Высокий уровень сывороточных анти-Le0 антител - с одной стороны, и наличие на опухоли соответствующего антигена - с другой стороны, позволяют сделать предположение, что эти ЕАТ играют надзорную роль, то есть узнают и элиминируют ранние опухолевые клетки. Для подтверждения вышесказанного, методом проточной цитофлуориметрии установлено, что анти- Lec EAT действительно способны связываться с опухолевыми клетками, а реагент на основе поликлональных анти-Ьес антител может быть использован для гистохимического определения заболевания"'' '.

11 Эта часть исследования проводилась совместно с Лабораторией иммунологии гемопоэза (Онкоцентр им. H.H. Блохина, Москва, Россия).

'" Тот факт, что антитела не способны взаимодействовать с тетрасахаридами с терминальным фрагментом Lec, но в то же время находят его в опухоли, мы объясняем аберрантным представлением антигена на опухолевых клетках.

4.6. Анти-ЬевЬас антитела. По данным анализа сывороток крови с помощью PGA гексасахарид LeBLac, т.е. Fuca 1 -4(Fuca 1 -2Gaip 1 -3)GlcNAc|31 -3Galpl-4GlcP-, попал в группу умеренно связывающих гликанов (RFU-24 х Ю5), в то время как тетрасахарид LeB, т.е. Fucal-4(Fucocl-2Gaipi-3)GlcNAcp-, - в группу несвязывающих гликанов с величиной RFU на порядок ниже, см. Таблицу 1. Этот факт на первый взгляд удивителен, так как согласно общепринятым представлениям терминальная часть гликанов является антигенной детерминантой, a LeB известен как "хороший" антиген и иммуноген [Lemieux et al. (1981) Biochemistry. 20: 199-205]. Выделение антител с помощью гексасахаридного адсорбента LeBLac-NHGly-sepharose позволило объяснить этот парадокс.

Аффинно выделенные антитела исследовали с помощью прямого и ингибиторного ИФА, а также PGA. Обнаружено, что они направлены к внутренней, коровой части гликана LeBLac, а именно Gaipi-4Glcp-. Ингибиторный анализ с использованием ряда замещенных производных лактозы показал, что некоторые из заместителей не препятствуют, или даже содействуют взаимодействию антител, а другие препятствуют или полностью предотвращают связывание с антителами (Таблица 2).

Таблица 2. Заместители в GalßMGlcß- (Lac), влияющие на способность к взаимодействию с антителами, выделенными на LeBLac-sepharose.

Благоприятствует или не препятствует взаимодействию антител Препятствует или полиостью отменяет взаимодействие антител

Сайт замещения в Lac Заместитель Сайт замещения в Lac Заместитель

С-2 Galß Fuca- С-3 Galß Su

С-3 Galß Gala-, GIcNAcß-, Neu5Aca- С-4 Galß Gala-, GalNAcß-

С-1 Gieß -NH-X, где Х-пептид С-6 Galß Su, Neu5Aca-, Neu5Acß-

С-6 Gieß Su С-1 Gieß -0(CH2)2NH2, -0(CH2)3NH2

С-2 Gieß -NHAc

Обобщение результатов ИФА и PGA позволяет сделать вывод о наличии, по крайней мере, двух субпопуляций aHTH-LeBLac EAT, обе связываются с внутренним мотивом -3Gaipi-4Glcp-, но игнорируют терминальную часть

углеводного лиганда LeBLac, а именно тетрасахарид Fucocl-4(Fucal-2Galßl-3)GlcNAcß- (LeB).

Природная мишень выделенных антител пока неизвестна. Мы предполагаем, что ею может быть составной эпитоп, в который входит остаток -Lac- гликосфинголипидов и пептидные последовательности белков, расположенных рядом на мембране.

4.7. Антитела, выделенные на фрагментах Н-антигена: Hdi и H(type 2)

Гликопротеины и гликолипиды человеческих эритроцитов несут большое количество Н-эпитопов, представленных, главным образом, терминацией Fucotl-2Galßl-4GlcNAcß, то есть H (type 2). Это справедливо для здоровых доноров всех групп крови системы ABO, кроме редкого фенотипа Бомбей1"". Соответственно, анти-Н антитела у доноров групп крови А, В, AB и О должны полностью отсутствовать, иначе они вызывали бы агглютинацию эритроцитов. Однако, согласно данным PGA, среди здоровых доноров встречаются носители антител против трисахарида H(type 2), хотя их мало (4 из 106 изученных доноров). В то же время, с дисахаридом Fucal-2Galß (Hdj) у ~70% доноров наблюдается связывание на среднем уровне (RFU = 10.9 * 105), Таблица 1.

Несмотря на то, что дисахарид Fucal-2Galß и трисахарид Fucal-2Galßl-4GlcNAcß структурно родственны (один является фрагментом другого), антитела, выделенные из сывороток крови на соответствующих глико-адсорбентах, оказались разными по специфичности. Данные ИФА, PGA и теста агглютинации эритроцитов человека показали, что анти-Щ антитела: 1) не взаимодействуют с терминальным моносахаридным остатком дисахарида, то есть Fuca; 2) не узнают фрагмент Fucal-2Galß- в составе более сложных гликанов, в том числе трисахарида Fucal-2Galßl-4GlcNAcß-; 3) связываются примерно на одинаковом уровне с дисахаридом Fucal-2Ga!ß- и моносахаридами Galß- и GalNAcß- (все в виде спейсерированных sp3 гликозидов); 4) не агглютинируют эритроциты человека, то есть, среди широкого разнообразия углеводных мотивов гликокаликса "не находят" ни одного комплементарного. Таким образом, выделенные на Щ-адсорбенте антитела узнают довольно странный эпитоп, а именно остаток ß-D-Gal, в

vl" Лица этого фенотипа не способны экспрессировать Н-антиген, но они имеют в сыворотке крови естественные антитела против Н-антигена [Le Pendu J. (1983) Am. J. Hum. Genet. 35: 484-496].

котором замещение по С-2 и С-6 лишь снижает связывание, в то время как замещение по С-1 полностью его отменяет (аналогично тому, как анти-Ьес не связываются с Ьес-Х-Х, см. выше).

Антитела, выделенные на НОуре 2)-5ерИаго8е, не обнаружили достоверного специфического взаимодействия с Н(1уре 2) при физиологических температурных условиях в ИФА. Связывание появилось при понижении температуры (10°С), однако узнаваемым эпитопом был Са1Р1-4С1сНАсР, то есть, внутренний фрагмент трисахарида. Отметим в то же время, что антитела не связывались с терминальным дисахаридом Риса1-20а1(3, то есть они не являются истинными анти-Н. Полученные данные по специфичности выделенных антител можно объяснить следующим образом (Рис. 10).

1) ш 2) т,

Рис. 10. Модель, объясняющая отсутствие взаимодействия анти-Н^, антител с Н-трисахаридом и более сложными клеточными гликоконъюгатами. В дисахариде Fucal-2Gal(3- (1) вращение по гликозидной связи разрешено (показано стрелкой). В сложных гликанах (2) остаток X расположен близко к остатку Fue, и поэтому он "замораживает" одну из возможных конформаций Fucal-2Galp-,

В дисахариде Fucal-2Gaip имеет место относительно большая степень свободы вращения по гликозидной связи (Рис. 10.1, показано стрелкой), что не мешает узнаванию анти-Нй антителами своего эпитопа Gaip. В три- (или более) сахариде Fucccl-2Galpl-X остаток X (Рис. 10.2) расположен близко к остатку Fue, что затрудняет вращение вокруг связи Fue-Gal и стерически мешает взаимодействию анти-Hdi антител с Gaip. Напротив, антитела, аффинно выделенные на H(type 2)-адсорбенте, не взаимодействуют с Hd¡.

Физиологический смысл охарактеризованных антител в настоящее время неясен, но, по всей видимости, они не имеют клинического значения и не являются истинными ауто-антителами.

4.8. Антитела, выделенные на Lex-sepharose. Согласно данным анализа сывороток крови с помощью ИФА и PGA, антитела к трисахариду Gaipi-4(Fucccl-3)GIcNAc(3 (Lex) не обнаруживаются (OD < 0.1 и RFU = 0.9 х 105, соответственно, ИФА и PGA), то есть это один из наиболее "молчащих" гликанов в отношении связывания антител крови. Интересно было проверить, существуют ли, тем не менее, анти-Ьех EAT, скрытые в цельной сыворотке за счёт маскирующих факторов. Результаты показали, что на Lex-sepharose выделяются иммуноглобулины, содержание которых составляет менее 0.5 мкг в 1 мл сыворотки крови. Они взаимодействовали в ИФА очень слабо (OD < 0.5) лишь с некоторыми гликанами, содержащими GlcNAcp, в том числе и с Lex. Анализируемая концентрация выделенных иммуноглобулинов в ИФА (1.4 мкг/мл) была выше сывороточной в три раза. Таким образом, специфичных (или низкоспецифичных, но аффинных) ауто-антител к антигену Lex в сыворотке крови действительно нет.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование, проведенное с помощью ИФА и PGA, с использованием десятков и сотен гликанов, показало наличие в сыворотке крови человека широкого репертуара анти-гликановых EAT. Антитела, узнающие ~60 гликанов, характерных для гликопротеинов и гликолипидов человека, формально являются ауто-антителами. Уровень некоторых из них (~10 мкг/мл), а также аффинность (КА) порядка 104-105 М"1 подразумевают возможность аутоиммунной реакции. Возникает естественный вопрос о причинах толерантности этих антител к собственным клеткам организма при физиологических условиях. Использованная в данной работе методология гаптен-специфической хроматографии с последующим картированием специфичности выделенных антител даёт на него ответ. Во-первых, число аутологичных специфичностей EAT значительно (в разы) меньше величины 60, так как одна и та же популяция антител связывается с общим эпитопом нескольких гликанов, например, Le° / SuLec / SiaLe0. Во-вторых, детальный анализ специфичности говорит о стерическом запрете взаимодействия EAT с нормальными гликанами клетки. Действительно, анти-А ауто-антитела, несмотря на способность реагировать с синтетическим А-трисахаридом, лишены возможности узнавать тот же трисахарид в составе какой-либо более длинной А-цепи нормальных клеток. Точно так же, анти-Ьес антитела не способны связываться с Lec-дисахаридом в составе сложных гликанов типа Lec-X-X, а значит, не могут взаимодействовать с нормальными собственными гликанами организма. Наконец, антитела, направленные против коровых гликановых мотивов, таких как Lac, без затруднений взаимодействуют с ними в идеальных условиях искусственной тест-системы, однако они не должны узнавать их на нормальной клетке, где эти эпитопы экранированы соседними молекулами. По-видимому, истинных функциональных ауто-антител к нормальным гликанам человека в крови нет. С другой стороны, установлен факт взаимодействия анти-Ьес антител с опухолевыми клетками. Если он окажется не уникальным случаем и подтвердится при изучении других антител, это даст основание полагать, что такие анти-гликановые EAT узнают аутологичный антиген в аберрантном состоянии, то есть функция данных EAT состоит в надзоре за трансформацией собственных клеток.

выводы

1. Изучен репертуар естественных анти-углеводных антител сыворотки крови здоровых доноров. Выявлены антитела с неизвестными ранее специфичностями, в том числе антитела, направленные к коровым участкам гликанов.

2. Предложен метод картирования специфичности поликлональных антиуглеводных антител, заключающийся в гаптен-специфической хроматографии с последующим твердофазным анализом аффинно-выделенных антител. Определены константы их аффинности. Показано, что содержание изученных антител в сыворотке крови составляет -1-10 мкг/мл.

3. Из сыворотки крови лиц с группой крови А выделены антитела, связывающиеся с трисахаридным антигеном А. Показано, что эти иммуноглобулины не имеют отношения к системе ABO и не являются истинными ауто-антителами. Предложено объяснение отсутствия взаимодействия этих антител с природными A-антигенами. На примерах нескольких других естественных антител показана общность данного явления.

4. Установлено, что для полного удаления из сыворотки крови анти-А или анти-В антител достаточными лигандами в составе аффинного адсорбента являются соответствующие трисахариды.

5. Доказано существование естественных антител системы ABO к "АВ"-эпитопу, общему для А- и В-антигенов.

6. В сыворотке всех здоровых доноров обнаружены антитела к дисахариду Galal-4GlcNAcp, не взаимодействующие с другими aGal-эпитопами, в том числе с ксеноантигеном Galal-3Gaip. Доказано, что уровень антител к Galotl-3Gaip у здоровых доноров на порядок ниже, чем считалось раньше.

7. Выделены и охарактеризованы антитела к дисахариду Lec, способные специфично связываться с клетками опухоли молочной железы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Статьи

1. Korchagina E.Yu., Pochechueva T.V., Obukhova P., Formanovsky A.A., Imberty A., Rieben R„ Bovin N.V. Design of the blood group AB glycotope // Glycoconjugate Journal. 2005. V. 22. P. 125-131.

2. Obukhova P., Rieben R., Bovin N. Normal human serum contains high levels of anti-Galalphal-4GlcNAc antibodies // Xenotransplantation. 2007. V. 14. №6. P. 627-35.

3. Селина O.E., Чинарев A.A., Обухова П.С., Бартковиак А., Бовин Н.В., Марквичева Е.А. Альгинат-хитозановые микросферы для специфической сорбции антител // Биоорг. химия. 2008. Т. 34. № 4. С. 522-529.

4. Huflejt М.Е., Vuskovic М„ Vasiliu D., Xu H., Obukhova P., Shilova N., Tuzikov A., Galanina O., Arun В., Lu K., Bovin N. Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges // Mol. Immunol. 2009. V. 46. №15. P. 3037-49.

5. Удалова Я.А., Бовин H.B., Обухова П.С., Шилова Н.В., Ковригина A.M., Тимошенко В.В., Галанина O.E., Кадагидзе З.Г., Летягин В.П., Тупицын H.H. Мембранная экспрессия Lec на клетках рака молочной железы // Опухоли женской репродуктивной системы. 2009. № 3-4. С. 43-48.

Тезисы докладов на конференциях

1. Обухова П.С., Корчагина Е.Ю., Бовин Н.В. Выявление скрытых в нативных сыворотках человека естественных антиуглеводных аутоантител // Тезисы докладов и стендовых сообщений XVI зимней молодёжной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - М., 2004. С. 66.

2. Селина O.E., Обухова П.С. Полимерные микросферы на основе природных полисахаридов для специфического связывания антиуглеводных антител // Тезисы докладов и стендовых сообщений XVI зимней молодёжной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - М., 2004. С. 68.

3. Обухова П.С., Бовин Н.В. Сыворотка здорового человека содержит анти-Galal-4GlcNAc антитела // Тезисы докладов и стендовых сообщений VII чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова. - М., 2004. С. 65.

4. Obukhova P., Bovin N.V. Normal human serum contains anti-alpha-Gall-4GlcNAc antibodies // 4th International congress on Autoimmunity. - Budapest, Hungary. Autoimmunity Rev. 2004. V. 3. № 2. P. 102.

6. Korchagina E., Pochechueva E., Obukhova P ., Imberty A., Rieben R. and Bovin N. Design of the Blood Group AB Glycotope // Abstracts submitted for the Joint meeting of the Society for glycobiology and the Japanese society for carbohydrate research. - Honolulu, Hawaii. 2004. P. 1096-1097.

7. Bovin N., Obukhova P. Unbound and hidden antibodies to carbohydrate antigens in normal serum // Abstracts of the 2nd ISN Special Neurochemistry Conference on Neural Glycoproteins and Glycolipids. - Antigua, West India. J. Neurochem. 2006. V. 99. № 1. P. 1-35.

8. Обухова П.С., Корчагина Е.Ю., Бовин H.B. Сыворотки здоровых доноров содержат аутоантитела к антигену группы крови Н(О) - дисахариду Fucal-2Gal // Материалы 2-ой Московской международной конференции «Иммунофизиология: аутоиммунитет в норме и патологии» ред. А.Б.Полетаева и А.Н.Данилова. - М., Издание Медицинского исследовательского центра «Иммункулус». 2008. С. 97.

9. Обухова П.С., Корчагина Е.Ю., Бовин Н.В. Естественные анти-А и анти-В антитела системы АВО: алло- и аутоантитела имеют разную эпитопную специфичность // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXII зимней молодёжной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - М., 2010. С. 17.

10.Obukhova P.S., Korchagina E.Y., Bovin N.V. ABO blood group antibodies: allo-and autoantibodies differ dramatically by epitope specificity // The 7th International Congress on Autoimmunity. - Ljubljana, Slovenia. 2010. [http://www.abstractserver.com/autoimmunity2010/planner/sp.php?go=abstract&a ction=abstract_iplanner&absno= 13 81 &].

Автор выражает свою признательность проф. д.мед.н. Н.Н. Тупицыну (Онкоцентр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва, Россия) за сотрудничество в исследовании свойств aHTH-Lec естественных антител, Dr. R. Rieben (Университет Берна, Швейцария) за сотрудничество в изучении ксено-антител, Dr. О. Blixt (Университет Копенгагена, Дания) и Dr. М. Huflejt (фирма Cellexicon, США) за печать гликочипов, а также к.х.н. И. Родионову (ФИБХ РАН, Пущино, Россия), к.х.н. В. Пискареву (ИНЭОС РАН, Москва, Россия) и к.х.н. JI. Кононову (ИОХ РАН, Москва, Россия) за предоставленные образцы гликанов и гликоконъюгатов.

Заказ Ла 265-1/08/2011 Подписано в печать 24.08.2011 Тираж 120 экз. Усл. пл. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 Ц^у.) www.cfr.ru; e-maii.info@cfr.ru

Список сокращений.

Словарь терминов.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Происхождение EAT.

1.1.1. Стимулы к возникновению EAT.

1.1.2. Регуляция экспрессии EAT на уровне В клеток.

1.1.3. Филогенетические аспекты стабильности EAT.

1.1.4. Этапы появления и экспрессии EAT в онтогенезе человека.

1.2. Естественные ауто-антитела. Феномен их существования у здоровых людей.

1.3. Почему образуются патогенные ауто-антитела?.

1.4. EAT к углеводным группоспецифическим антигенам крови.

1.4.1. Система групп крови ABO.

1.4.2. Система Н.

1.4.3. Система Lewis.

1.4.4. Система 1.

1.4.5. Система Р.

1.4.6. Алло-ЕАТ к внесистемным углеводным структурам у человека.

1.5. Анти-гликолипидные не группоспецифические ауто-антитела в норме и патологии.

1.5.1. Ауто-ЕАТ к гликолипидам в нормальной сыворотке крови.

1.5.2. Патогенные и предвещающие ауто-антитела к гликолипидам.

1.6. Антитела к опухолеассоциированным антигенам (ОАА) в норме и патологии.

1.6.1. Антигены TF, Tn, SiaTn и SiaTF и антитела к ним.

1.6.2. Анти-Ьес антитела.

1.6.3. Антитела к опухолеассоциированным ганглиозидам.

1.7. Анти-углеводные ксено-ЕАТ.

1.7.1. Анти-aGal EAT.

1.7.2. Анти-Fs.

1.7.3. AHTH-Neu5Gc.

1.7.4. Другие ксено-ЕАТ.

1.8. Функции естественных антител.

Антитела, циркулирующие в крови нормальных индивидуумов и продуцируемые в отсутствие явной специфической антигенной стимуляции, называют естественными [Coutinho, 1995]. Многие из них направлены к углеводам (гликанам) — компонентам гликолипидов, гликопротеинов и полисахаридов. Наиболее важными с медицинской точки зрения являются естественные антитела, связывающиеся с углеводными алло-антигенами системы ABO, ксено-антигенами, опухолеассоциированным антигенами. Они участвуют в процессах отторжения алло- или ксенотрансплантатов, в случае возникновения онкологического заболевания влияют на его течение.

Исследования 1970-х годов показали, что естественный или преиммунный репертуар антител включает преимущественно полиреактивные антитела, способные узнавать как свои, так и чужеродные антигены. В 1980-х годах из нормальной сыворотки изолированы два типа антител [Avrameas, 1995]:

1) антитела, взаимодействующие с двумя и более неродственными антигенами (для них характерно высокое сывороточное содержание, но низкая аффинность);

2) антитела, специфичные к единственному антигену (ведут себя подобно адаптивным антителам, обычно высокоаффинны).

Анти-углеводные антитела сыворотки крови трудно изучать из-за высокой степени гетерогенности крови, содержащей не только белки, но также гликозаминогликаны, липопротеины и т.д., а также из-за широкого репертуара специфичности антител. На помощь в решении этой проблемы приходит гликочипный вариант твердофазного анализа (Printed Glycan Array, PGA), который в настоящее время бурно развивается. По многим параметрам PGA имеет преимущество перед традиционным твердофазным иммуноферментным анализом (ИФА), в частности, при исследовании нативных сывороток крови наблюдается очень низкий фоновый уровень, а главное, возможен одновременный анализ антител к нескольким сотням иммобилизованных гликанов. Однако PGA имеет ряд собственных и общих с ИФА ограничений. В частности, факт связывания в тест-системе антител нативной сыворотки с крупным гликаном может быть ошибочно интерпретирован, если на самом деле антитела направлены не к нему, а к его небольшому фрагменту. Кроме того, несмотря на разнообразие и изобилие естественных анти-углеводных антител, некоторые могут остаться незамеченными в тестах с нативной сывороткой, т.к. они могут быть маскированы муцинами или анти-идиотипическими иммуноглобулинами [Spalter, 1999], или их связывание с гликаном в твердофазном анализе конкурентно ингибируется собственными углеводными цепями иммуноглобулинов [Huflejt, 2009].

Целью данной работы являлось детальное исследование репертуара анти-гликановых, в первую очередь, естественных антител человека и эпитопной специфичности некоторых из них.

В связи с вышеизложенным были поставлены следующие задачи:

1. максимально подробно изучить репертуар анти-гликановых антител;

2. выделить антитела с помощью гаптен-специфической аффинной хроматографии и картировать их эпитопную специфичность;

3. объяснить эффект толерантности ауто-антител к ауто-антигенам, в частности, антигенам групп крови системы ABO.

выводы

1. Изучен репертуар естественных анти-углеводных антител сыворотки крови здоровых доноров. Выявлены антитела с неизвестными ранее специфичностями, в том числе антитела, направленные к коровым участкам гликанов.

2. Предложен метод картирования специфичности поликлональных антиуглеводных антител, заключающийся в гаптен-специфической хроматографии с последующим твердофазным анализом аффинно-выделенных антител. Определены константы их аффинности. Показано, что содержание изученных антител в сыворотке крови составляет —1-10 мкг/мл.

3. Из сыворотки крови лиц с группой крови А выделены антитела, связывающиеся с трисахаридным антигеном А. Показано, что эти иммуноглобулины не имеют отношения к системе ABO и не являются истинными ауто-антителами. Предложено объяснение отсутствия взаимодействия этих антител с природными A-антигенами. На примерах нескольких других естественных антител показана общность данного явления.

4. Установлено, что для полного удаления из сыворотки крови; анти-А или анти-В антител достаточными лигандами в составе аффинного адсорбента являются соответствующие трисахариды.

5. Доказано существование естественных антител системы ABO к "АВ"-эпитопу, общему для А и В-антигенов.

6. В сыворотке всех здоровых доноров обнаружены антитела к дисахариду Gala 1 -4GlcNAcP, не взаимодействующие с другими aGal-эпитопами, в том числе с ксеноантигеном Galal-3Gaip. Доказано, что уровень антител к Galal-3Gaip у здоровых доноров на порядок ниже, чем считалось раньше.

7. Выделены и охарактеризованы антитела к дисахариду Le , способные специфично связываться с клетками опухоли молочной железы.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность к.х.н. А.Б. Тузикову, к.х.н. Г.В. Пазыниной, к.х.н. Н.В. Шиловой, к.х.н. М.Ю. Новаковскому, к.х.н. Е.Ю. Корчагиной, к.х.н. O.E. Галаниной (Лаборатория углеводов, ИБХ РАН, Москва, Россия) за помощь в работе и конструктивные обсуждения результатов, а также всему коллективу Лаборатории углеводов; к.х.н. И. Родионову (ФИБХ РАН, Пущино, Россия), к.х.н. В. Пискареву (ИНЭОС РАН, Москва, Россия) и к.х.н. Л. Кононову (ИОХ РАН, Москва, Россия) за предоставленные образцы гликанов и гликоконъюгатов; проф. д.м.н. H.H. Тупицыну (Онкоцентр им. Блохина, Москва, Россия) за сотрудничество в о исследовании свойств анти-Le естественных антител; Dr. R. Rieben (Университет Берна, Швейцария) за сотрудничество в изучении ксено-антител, Dr. О. Blixt (Университет Копенгагена, Дания) и Dr. М. Huflejt (фирма Cellexicon, США) за печать гликочипов; а также руководителю диссертационной работы проф. д.х.н. Н.В. Бовину за постоянную поддержку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование, проведенное с помощью ИФА и PGA, с использованием десятков и сотен гликанов, показало наличие в сыворотке крови человека широкого репертуара анти-гликановых ЕАТ. Антитела, узнающие ~ 60 гликанов, характерных для гликопротеинов и гликолипидов человека, формально являются ауто-антителами. Уровень некоторых из них (~10 мкг/мл), а также аффинность (КА) порядка 104-105 М"1 подразумевают возможность аутоиммунной реакции. Возникает естественный вопрос о причинах толерантности этих антител к собственным клеткам организма при физиологических условиях. Использованная в данной работе методология« гаптен-специфической хроматографии с последующим картированием1 специфичности выделенных антител даёт на него ответ. Во-первых, число аутологичных специфичностей EAT значительно (в разы) меньше величины 60,г так как, одна и та же популяция антител связывается с общим эпитопом

С С с нескольких гликанов, например, Le / SuLe / SiaLe\ Во -вторых, детальный анализ специфичности говорит о стерическом; запрете взаимодействия EAT с нормальными, гликанами клетки. Действительно, анти-А ауто-антитела, несмотря, на. способность реагировать с синтетическим А-трисахаридом, лишены возможности взаимодействовать с тем же трисахаридом в составе какой-либо более длинной А-цепи нормальных клеток. Точно так же, антир л

Le антитела не способны связываться с Le -дисахаридом в составе сложных гликанов типа Le -Х-Х, а значит, не могут быть истинными антителами по отношению к нормальным собственным гликанам организма. Наконец, антитела, направленные против коровых гликановых мотивов, таких какХас, без затруднений взаимодействуют с ними в идеальных условиях искусственной тест-системы, однако они не должны узнавать их на нормальной клетке, где эти эпитопы экранированы соседними молекулами. По-видимому, истинных функциональных ауто-антител к нормальным гликанам человека нет. С другой стороны, установлен факт взаимодействия aHTH-Lec антител с опухолевыми клетками. Если он окажется не уникальным случаем и подтвердится при изучении других антител, это даст основание полагать, что такие анти-гликановые EAT узнают аутологичный антиген в аберрантном состоянии, то есть функция данных EAT состоит в надзоре за трансформацией собственных клеток.

1. Agrawal В., Krantz M.J., Parker J., Longenecker B.M. Expression of MUC1 mucin on activated human T cells: implications for a role of MUC1 in normal immune regulation // Cancer Research. 1998. V. 58. № 18. P. 4079-4081.

2. Ahmed S.A. et al. Estrogen induces the development of autoantibodies and promotes salivary gland lymphoid infiltrates in normal mice // J. Autoimmun. 1989. V. 2. № 4. P. 543-52.

3. Ailus K., Palosuo T. IgM class autoantibodies in human cord serum // J. Reprod. Immunol: 1995. V. 29. № 1. P. 61-7.

4. Alaniz M.E., Lardone R.D., Yudowski S.L., Farace M.I., Nores G.A. Normally occurring human anti-GMl immunoglobulin M antibodies and the immune response to bacteria // Infect. Immun. 2004. V. 72. № 4. P. 2148-5 Г.

5. Alarcon-Segovia D., Llorente L., Ruiz-Arguelles A. Autoantibodies that penetrate into living cells // Autoantibodies. Elsevier Science. 1996. P. 96102.

6. Anthony R.M., Ravetch J.V. A novel role for the IgG Fc glycan: the antiinflammatory activity of sialylated IgG Fes // J. Clin. Immunol. 2010. V. 30 (Suppl 1). P. S9-14.

7. Apostolopoulos V., Sandrin M.S., Mackenzie I.F. Carbohydrate/peptide mimetics: effect on MUC1 cancer immunotherapy // J. Mol. Med. 1999. V. 77. P. 427-436.

8. Arnold J.N., Wormald M.R., Sim R.B., Rudd P.M., Dwek R.A. The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins // Annu Rev Immunol. 2007. V. 25. P. 21-50.

9. Auf der Maur C., Hodel M., Nydegger U.E. and Rieben R. Age dependency of ABO histo-blood group antibodies: reexamination of an old dogma // Transfusion. 1993. V. 33. P. 915-918.

10. Avrameas S. and Ternynck T. The natural autoantibodies-system: between hypotheses and facts // Mol. Immunol. 1993. V. 30. № 12. P. 1133-1142.

11. Avrameas S. Natural autoantibodies: from 'horror autotoxicus' to 'gnothi seauton' // Immunol. Today. 1991. V. 12. № 5. P. 154-9.

12. Bailly P., Bouhours J.-F. P blood group and related antigens. In: Cartron J.-P., Rouger P. (Eds.), Blood CelF Biochemistry, 1995. V.6: Molecular Basis of Major Human Blood Group Antigens. Plenum Press, New York, NY, P. 299329.

13. Baumgarth N., Tung J.M., and Herzenberg L.A. Inherent specificities in natural antibodies: a key to immune defense against pathogen invasion // Springer Seminars in Immunopathology. 2005. V. 26. № 4. P. 347-362.

14. BCSDB (Bacterial Carbohydrate Structure Database). URL: http://www.glyco.ac.ru/bcsdb/.

15. Berland R., Wortis H.H. Origins and functions of B-l cells with notes on the role of CD5 // Annu. Rev. Immunol. 2002. V. 20. P. 253-300.

16. Berneman A., Belec L., Fischetti V.A. and Bouvet J.-P. The specificity patterns of human immunoglobulin G antibodies in serum differ from those in autologous secretions // Infection and Immunity. 1998. V. 66. № 9. P. 41634168.

17. Bernstein F. Ergebnisse einer biostatischen zusammenfassenden Betrachtung über die erblichen Blutstrukturen des Menschen // Klein. Wschr. 1924. V. 3. P. 1495-1497.

18. Bezkorovainy A., Springer G.F., Desai P.R. Physicochemical properties of the eel anti-human blood-group H(O) antibody // Biochemistry. 1971. V. 10. № 20. P. 3761-3764.

19. Besredka A.M. // Ann. Inst Pasteur. 1901. V. 15. P. 758 -63.

20. Blanco L.P., Dirita V.J. Antibodies-enhance interaction of Vibrio cholerae with intestinal M-like cells // Infect. Immun. 2006. V. 74. № 12. P. 6957-64.

21. Blixt O. et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2004. V. 101. P. 17033-17038.

22. Boes M., Prodeus A.P., Schmidt T., Carroll M.C., Chen J. A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection // J. Exp. Med. 1998. V. 188. № 12. P. 2381-6.

23. Bouvet J.P. and Dighiero G. From natural polyreactive autoantibodies to ä la carte monoreactive antibodies to infectious agents: is it a small world after all? // Infect. Immun. 1998. V. 66. № 1. P. 1-4.

24. Bovin N.V. Polyacrylamide-based neoglycoconjugates as tools in glycobiology // Glycoconjugate J. 1998. V. 15. P. 431-446.

25. Brändlein S., Pohle T., Ruoff N., Wozniak E., Müller-Hermelink H.K., Vollmers H.P. Natural IgM antibodies and immunosurveillance mechanisms against epithelial cancer cells in humans // Cancer Res. 2003. V. 63. № 22. P. 7995-8005.

26. Bray J., Lemieux R.U., McPherson T.A. Use of a synthetic hapten in the demonstration of the Thomsen-Friedenreich (T) antigen on neuraminidase-treated human red blood cells and lymphocytes // J. Immunol. 1981. V. 126. №5. P. 1966-9.

27. Brockhausen I., Yang J.M., Burchell J., Whitehouse C., Taylor-Papadimitriou J. Mechanisms underlying aberrant glycosylation of MUC1 mucin in breast cancer cells // Eur. J. Biochem. 1995. V. 233. № 2. P. 607-17.

28. Buchs J.P., Nydegger U.E. Development of an ABO-ELISA for the quantitation of human blood group anti-A and anti-B IgM and IgG antibodies // J. Immunol. Methods. 1989. V. 118. № 1. P. 37-46.

29. Burnet F.M. // The clonal selection theory of acquired' Immunity. -Cambridge Univ. Press. England. 1959.

30. Butschak G., Karsten U. Isolation and characterization of Thomsen-Friedenreich-specific antibodies from human serum // Tumor Biol. 2002. V. 23. P. 113-122.

31. Carroll M.C, Prodeus A.P. Linkages of innate and adaptive immunity // Curr. Opin. Immunol. 1998. V. 10. № 1. P. 36-40.

32. Castronovo V., Colin C., Parent B., Foidart J.M., Lambotte R., Mahieu P. Possible role of human natural anti-Gal antibodies in the natural antitumor defense system // J. Natl. Cancer Inst. 1989. V. 81. № 3. P. 212-6.

33. Casali P., Notkins A.L. CD5+ B lymphocytes, polyreactive antibodies and the human B-cell repertoire // Immunol. Today. 1989. V. 10. № 11. P. 364-8.

34. Casali P., Schettino E.W. Structure and function of natural antibodies // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1996. V. 210. P. 167-79.

35. Chen H., Diakun K.R., Milgrom F. Cardiotoxicity of Forssman antibodies in in vitro perfusion experiments // Immunol. Commun. 1984. V. 13. № 6. P. 571-6.

36. Cheng H.M. Natural cryptic autoantibodies // Autoimmunity. 1998. V. 27. P. 99-108.

37. Clausen H., Hakomori S. ABH and related histo-blood group antigens; immunochemical differences in carrier isotypes and their distribution // Vox Sang. 1989. V. 56. № 1. P. 1-20.

38. Clausen H., Hakomori S., Graem N., Dabelsteen E. Incompatible A antigen expressed in tumors of blood group О individuals: immunochemical, immunohistologic, and enzymatic characterization // J. Immunol. 1986. V. 136. № l.P. 326-30.

39. Cohen I.R., Norins L.C.- Antibodies of the IgG, IgM, and IgA classes in, newborn and adult sera reactive with gram-negative bacteria // J. Clin. Invest. 1968. V. 47. № 5. P. 1053-62:

40. Cooke W.D., Orr A.S., Wiseman.B.L., Rouse S.B., Murray W.C., Ranck S.G. Human cord blood contains an IGM antibody to the 41KD flagellar antigen of Borrelia burgdorferi // Scand. J. Immunol. 1993. V. 38. № 4. P: 407-9.

41. Coomber D.W., Hawkins N.J., Dalley D., Ward R.L. The significance of anti-sialyl-Tn antibodies in patients with colorectal and breast cancer // Neoplasma. 1998. V. 45. № 1. P. 12-6.

42. Cooper D.K.C. Xenoantigens and xenoantibodies // Xenotransplantation. 1998. V. 5. P. 6-17.

43. Cooper M.D., Alder M.N. The evolution of adaptive immune systems // Cell. 2006. V. 124. №4. P. 815-22.

44. Cooper D.K.C. et al. Identification of alpha-galactosyl and other carbohydrate epitopes that are bound by human anti-pig antibodies: relevance to discordant xenografting in man // Transpl. Immunol. 1993. V. 1. № 3. P. 198-205.

45. Coutinho A., Kazatchkine M.D. and Avrameas S. Natural autoantibodies // Current Opinion in Immunology. 1995. V. 7. P. 812-818.

46. Curvall M., Lindberg В., Lonngren J., Ruden U., Nimmich W. Structural studies of the Klebsiella О group 8 lipopolysaccharide // Acta Chem. Scand. 1973. V. 27. № 10. P. 4019-21.

47. Dabelsteen E., Gao S. ABO blood-group antigens in oral cancer // J. Dent. Res. 2005. V. 84. P. 21-28.

48. Daniels G. and Bromilow I. // Essential guide to blood groups. Second Edition. Wiley-Blackwell, Oxford, UK. 2010. pp. 111.

49. D'Adamo P.J. (http://www.dadamo.com/scienceminorgroups.htm).

50. Deicher H. Uber die Erzeugung heterospezifisher haemagglutinine durch Injection artfremden Serum//Z .Hyg. 1926. V. 106. P. 561.

51. Dighiero G., Rose N.R. Critical self-epitopes are key to the understanding of self-tolerance and autoimmunity // Immunol. Today. 1999. V. 20. № 9. P. 423-428.

52. Ditzel H.J., Itoh K., Burton D.R. Determinants of polyreactivity in a large panel of recombinant human antibodies from HTV-l infection // J. Immunol. 1996. V. 157. № 2. P. 739-49.

53. Dodd B.E., Lincoln P.J., Boorman K.E. The cross-reacting antibodies of group O sera: immunological studies and possible explanation of the observed facts // Immunology. 1967. V. 12. № 1. P. 39-52.

54. Donath J., Landsteiner K., Münch. Medizin. Wschr. 1904. V. 51. P. 15901593.

55. Duk M. et al. Specificity of human anti-NOR antibodies, a distinct species of "natural" anti-a-galactosyl antibodies // Glycobiology. 2003. V. 13. № 4. P. 279-284.

56. Duk M. et al. Anti-alpha-galactosyl antibodies recognizing epitopes terminating with alpha 1,4-linked galactose: human natural and mouse monoclonal anti-NOR and anti-Pi antibodies // Glycobiology. 2005. V. 15. №2. P. 109-18.

57. Dupont M. Contribution a l'étude des antigens des globules rouges // Archives of Int. Med. Exp. 1934. V. 9. P. 133-167.

58. Durandy A., Thuillier L., Forveille M., Fischer A. Phenotypic and functional characteristics of human newborns' B lymphocytes // J. Immunol. 1990. V. 144. № l.P. 60-5.

59. Dziarski R. Autoimmunity: polyclonal activation or antigen induction? //1.munol. Today. 1988. V. 9. № 11. P. 340-2.148

60. Ehrlich P. and Morgenroth J. in The Collected Papers of Paul Ehrlich, Fifth Communication. Pergamon Press. 1957. V. 2. P. 246-255.

61. Ehrlich P., Morgenroth J.V. // Berl. Klin. Wschr. 1900. V. 37. P. 453-458.

62. Elluru S.R. et al. Modulation of human dendritic cell maturation and function by natural IgG antibodies // Autoimmun. Rev. 2008. V. 7. № 6. P. 487-90.

63. Ezzelarab M., Ayares D., Cooper D. Carbohydrates in xenotransplantation // Immunol. Cell Biol. 2005. V. 83. P. 396^104.

64. Fearon D.T., Locksley R.M. The instructive role of innate immunity in the acquired immune response // Science. 1996. V. 272. № 5258. P. 50-3.

65. Feizi T., Childs R.A., Hakomori S.I., Powell M.E. Blood-group-Ii-active gangliosides of human erythrocyte membranes // Biochem. J. 1978. V. 173. № l.P. 245-54.

66. Feizi T. The blood group Ii system: a carbohydrate antigen system defined by naturally monoclonal or oligoclonal autoantibodies of man // Immunol. Commun. 1981. V. 10. № 2. P. 127-56.

67. Fung P.Y., Longenecker B.M. Specific immunosuppressive activity of epiglycanin, a mucin-like glycoprotein secreted by a murine mammary adenocarcinoma (TA3-HA) // Cancer Res. 1991. V. 51. № 4. P. 1170-6.

68. Furuhata T. On the heredity of human blood groups // Japan Med. World. 1927. V. 7. P. 197-209.

69. Gaillard B.A., Thomas J.M., Nell L.J., Marcus D.M. Antibodies against ganglioside GT3 in sera of patients with type 1 diabetes mellitus // J.Immunol. 1989. V. 142. P.3826-3832.

70. Galili U. The alpha-gal epitope and the anti-Gal antibody in xenotransplantation and in cancer immunotherapy // Immunol. Cell Biol. 2005. V. 83. № 6. P. 674-86.

71. Galili U., Anaraki F., Thall A., Hill-Black C., Radic M. One percent of human circulating B lymphocytes are capable of producing the natural anti-Gal antibody // Blood. 1993. V. 82. № 8. P. 2485-93.

72. Galili U., Clark M.R., Shohet S.B. Excessive binding of natural anti-alpha-galactosyl immunoglobin G to sickle erythrocytes may contribute to extravascular cell destruction // J. Clin. Invest. 1986a. V. 77. № l.P. 27-33.

73. Galili U., Flechner I., Knyszynski A., Danon D., Rachmilewitz E.A. The natural anti-alpha-galactosyl IgG on human normal senescent red blood cells // Br. J. Haematol. 1986b. V. 62. № 2. P. 317-24.

74. Galili U., LaTemple D.C. Natural anti-Gal antibodies as a universal augmenter of autologous tumor vaccine immunogenicity // Immunology Today. 1997. V. 18. № 6. P. 281-285.

75. Galili U., Macher B.A., Buehler J., Shohet S.B. Human natural anti-alpha-galactosyl IgG. II. The specific recognition of alpha (l-3)-linked galactose residues // J. Exp. Med. 1985. V. 162. № 2. P. 573-82.

76. Galili U., Rachmilewitz E.A., Peleg A. and Flechner I. A unique natural human IgG antibody with anti-a-galactosyl specificity // J. Exp. Med. 1984. V. 160. P. 1519-1531.

77. Gellert M. Recent advances in understanding V(D)J recombination // Adv. Immunol. 1997. V. 64. P. 39-64.

78. George J., Shoenfeld Y. Natural autoantibodies I I Autoantibodies, Elsevier Science. 1996. P. 534-539.

79. Ginsburg V. Enzymatic basis for blood groups in man. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 1972. V. 36. P. 131-49.

80. Gmeiner J. The ribitol-phosphate-containing lipopolysaccharide from Proteusmirabilis, strain D52. Investigations of O-specific chains, // European Journal of Biochemistry. 1977. V. 74. P. 171-180;

81. Gollogly E., Gastronovo V. A possible role for the alpha 1—>3 galactosyl epitope and the natural anti-gal antibody in oncogenesis // Neoplasma: 1996. V. 43. № 5. P. 285-9.

82. Good A.Hi et al. Identification of carbohydrate1 structures that bind' human? antiporcine antibodies: implications for discordant xenografting in humans // Transplant. Proc, 1992. V. 24. № 2. P; 559-62.

83. Gorska S., Grycko P., Rybka J., Gamian A. Exopolysaccharides of lactic acid bacteria: structure and biosynthesis // Postepy Hygieny i Medyciny Doswiadczalnej. 2007. V. 61. P. 805-818.

84. Grubb R. Correlation between Lewis blood group and secretor character in man //Nature. 1948. V. 162. № 4128. P. 933.

85. Grundbacher F.J. Human X chromosome carries quantitative genes for immunoglobulin M // Science. 1972. V. 176. № 32. P. 311-2.

86. Hakomori S., Wang S.M., Young W.W. Isoantigenic expression of Forssman glycolipid in human gastric and colonic mucosa: its possible identity with "Alike antigen" in human cancer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. № 7. P. 3023-7.

87. Hakomori S. Glycosphingolipids in cellular interaction, differentiation, and oncogenesis //Annu. Rev. Biochem. 1981. V. 50. P. 733-64.

88. Hakomori S. Tumor-associated carbohydrate antigens // Ann. Rev. Immunol. 1984. V. 2. P. 103-126.

89. Hakomori S. Antigen structure and genetic basis of histo-blood groups A, B and O: their changes associated with human cancer // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1473. № 1. P: 247-66.

90. Hamadeh R.M., Estabrook M.M., Zhou P., Jarvis G.A., Griffiss J.M. Anti-Gal binds to pili of Neisseria meningitidis: the immunoglobulin A isotype blocks complement-mediated killing//Infect. Immun. 1995a. V. 63. P. 4900-6.

91. Hamadeh R.M., Galili U., Zhou P., Griffiss J.M. Anti-alpha-galactosyl immunoglobulin A (IgA), IgG, and IgM in human secretions // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1995b. V. 2. P. 125-31.

92. Han B.W., Herrin B.R., Cooper M.D., Wilson J.A. Antigen recognition by variable lymphocyte receptors // Science. 2008. V. 321. № 5897. P. 1834-7.

93. Hanganutziu M. Hemagglutinines heterogenetiques apres injectior de serum de cheval // Compt. Rend. Soc. Biol. 1924. V. 91. P: 1457-59.

94. Hari Y. et al. The complement-activating capacity of maternal IgG antibodies to blood group A in paired mother/child serum samples // Vox Sang. 1998. V. 74. № 2. P. 95-100.

95. Hay F.C., Nineham L.J., Torrigiani G., Roitt I.M. "Hidden" IgG antiglobulins in normal human serum // Clin. Exp. Immunol. 1976. V. 25. № 2. P. 185-90.

96. Hayakawa K., Asano M. et al. Positive selection of natural autoreactive B cells // Science. 1999. V. 285. № 5424. P. 113-6.

97. Hayashi S., Ogawa S., Takashima Y., Otsuka H. The neutralization of pseudorabies virus by anti-alpha-galactosyl natural antibody in normal serum // Virus Res. 2004. V. 99. №1.P. 1-7.

98. Hellberg A., Chester M.A., Olsson M.L. Two previously proposed P1/P2-differentiating and nine novel polymorphisms at the A4GALT (Pk) locus donot correlate with the presence of the PI blood group antigen // BMC Genet. 2005. V. 6. P. 49.

99. Hensel F. et al. Characterization of glycosylphosphatidylinositol-linked molecule CD55/decay-accelerating factor as the receptor for antibody SC-1-induced apoptosis // Cancer Res. 1999. V. 59. № 20. P. 5299-306.

100. Higashi H., Naiki M., Matuo S., Okouchi K. Antigen of "serum sickness" type of heterophile antibodies in» human sera: «identification as gangliosides with N-glycolylneuraminic acid // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977. V. 79. №2. P. 388-95.

101. Higashihara T., Takeshima T., Anzai M., Tomioka M., Matsumoto K., Nishida K., Kitamura Y., Okinaga K., Naiki M. Survey of Hanganutziu and Deicher antibodies in operated patients // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1991. V. 95. №2-3. P. 231-5.

102. Hoeppner W., Fischer K., Poschmann A., Paulsen H. Use of synthetic antigens with the carbohydrate structure of asialoglycophorin A for the specification of Thomsen-Friedenreich antibodies // Vox Sang. 1985. V.48. № 4. P. 246-53.

103. Hows J., Beddow K., Gordon-Smith E., Branch D.R., Spruce W., Sniecinski I., Krance R.A., Petz L.D. Donor-derived red,blood cell antibodies and immune hemolysis after allogeneic bone marrow transplantation // Blood. 1986. V. 67. № l.P. 177-81.

104. Huflejt M.E. et al. Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges // Mol. Immunol. 2009. V. 46. № 15. P. 3037-49.

105. Hughes R.A. Inflammatory neuropathies // Baillieres Clin. Neurol. 1994. V.3.№ l.P. 45-72.

106. International Society of Blood Transfusion (ISBT). URL: http://blood.co.uk/ibgrl/

107. Itoh Y., Matsuzawa S. Nihon Hoigaku Zasshi. Anti-A-like and anti-B-like cold auto-hemagglutinins in a patient with malignant lymphoma and healthy individuals // 1989: V. 43. № 4. P. 332-6.

108. Jansson P.E., Lindberg A.A\, Lindberg B1., Wollin R. Structural"studies on the hexose1 region of the core in lipopolysaccharides from Enterobacteriaceae // Eur. J.Biochem. 1981. V. 115.№3.P. 571-7.

109. Jefferis R. Glycosylation of natural and recombinant antibody molecules // Adv. Exp. Med. Biol. 2005. V. 564. P. 143-8.

110. Jerne N.K. Towards a network theory of the immune system // Ann1. Inst. Pasteur Immunol. 1974. V. 125. P. 373-89.

111. Kaise S., Yasuda T. et al. Antiglycolipid antibodies in normal and pathologic human sera and synovial fluids // Vox Sang. 1985. V. 49. № 4. P. 292-300.

112. Kamiya K., Arisawa T. et al. Are autoantibodies against Lewis antigens involved in the pathogenesis of Helicobacter pylori-induced peptic ulcers? // Microbiol. Immunol. 1999. V. 43. № 5: P. 403-8.

113. Kano K., Merrick J.M. and Milgrom F. Classification of human heterophile antibodies. Int. Arch. Allergy Appl. Immun. 1984; 73: 373-377.

114. Kano K., Milgrom F. Heterophile antigens and antibodies in medicine // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1977. V. 77. P. 43-69.

115. Kaplan M.E., Kabat E.A. Studies on human antibodies. IV. Purification and properties of anti-A and anti-B obtained by absorption and elution from insoluble blood group substances //J. Exp. Med. 1966. V. 123. P. 1061-81.

116. Kasaian M.T., Casali P. Autoimmunity-prone B-l (CD5 B) cells, natural antibodies and self-recognition// Autoimmunity. 1993. V. 15. P. 315-329.154

117. Kay L.A., Locke D. Distribution of immunoglobulin G subclasses in anti-A and anti-B sera // J. Clin. Pathol. 1986. V. 39. № 6. P. 684-7.

118. Kay M.M., Bosman G.J. Naturally occurring human "antigalactosyl" IgG antibodies are heterophile antibodies recognizing blood-group-related substances // Exp. Hematol. 1985. V. 13. № 11. P. 1103-12.

119. Kearney J.F., Vakil M., Dwyer D.S. Idiotypes and autoimmunity // Ciba Found. Symp. 1987. V. 129. V. 109-22.

120. Kidd J.G. and Friedewald W.F. A natural antibody that reacts in vitro with a sedimentable constituent of normal tissue cells: I. Demonstration of the phenomenon // J. Exp. Med. 1942. V. 76. P. 543.

121. Kim Y.S., Gum J., Brockhausen I. Mucin» glycoproteins in neoplasia // Glycoconj. J. 1996. V. 13. № 5. P. 693-707.

122. Kimber I., Moore M. Lysis of alloantibody-sensitized human erythrocytes by peripheral blood* mononuclear cells: heterogeneity of effector populations // J. Clin. Lab. Immunol. 1981. V. 5. №1. P. 41-6.

123. King J.and Laemmli U.K. // J. Mol. Biol. 1971. V. 62. P. 465-473.

124. Kinjo Y., Tupin E., Wu D. et al. Natural killer T-cells recognize diacylglycerol antigens from pathogenic bacteria // Nat. Immunol. 2006. V. 7. P. 978-986.

125. Koeckert H.L. A study of mechanism of human isohemagglutination // J. Immunol. 1920. V. 5. P. 536.

126. Koga M., Yuki N., Ariga T., Hirata K. Antibodies to GD3, GT3, and O-acetylated species in Guillain-Barre and Fisher's syndromes: their association with cranial nerve dysfunction // J. Neurol. Sci. 1999. V. 164. № 1. P. 50-5.

127. Koscielak J. A hypothesis on the biological role of ABH, Lewis and P blood group determinant structures in glycosphingolipids and glycoproteins // Glycoconjugate J. 1986. V. 3. P. 95-108.

128. Krause I., Blank M. et al. Cross-reactive epitopes on beta2-glycoprotein-I and Saccharomyces cerevisiae in patients with the antiphospholipid syndrome // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2007. V. 1108. P. 481-8.155

129. Lalezari P., Jiang A.F., Kumar M., Lalezari I. Carbohydrate-specific antibodies in normal human sera. I. Characterization of specificity for beta-D-glucose // Vox Sang. 1984. V. 47. № 2. P. 133-45.

130. Landsteiner K. // The specificity of serological reactions. New York., Dover Publications Inc. 1962. P. 164.

131. Landsteiner K. The Nature and Specificity of Antibodies // The Specificity of Serological Reactions. Cambridge., Harvard University Press. 1945. P. 127.

132. Landsteiner K. Uber Agglutionserscheinungen normalen menschlichen Blutes // Wein. Klein. Wschr. 1901'. V. 14. P. 1132-1134.

133. Landsteiner K. Zur Kenntniss der antifermentativen, lytischen und agglutinierenden Wirkungen des Blutserums und der Lymphe // Zentr. Bacteriol. 1900. V. 27. P. 357-366.

134. Landsteiner K. and Mitt D.H. Observations on the human blood group. Irregular reactions on the human bloodngroups. Irregular reactions. Isoagglutinins in sera of group IV. The factor A. // J. Immunol. 1926. V. 11. P. 221.

135. Lekakh I.V., Bovin N.V., Bezyaeva G.P., Poverenny A.M. Natural hidden autoantibodies react with negatively charged carbohydrates and xenoantigen Bdi // Biochemistry (Mosc). 2001. V. 66. P. 205-210.

136. Lemieux R.U., Baker D.A., Weinstein W.M., Switzer C.M. Artificial antigens. Antibody preparations for the localization of Lewis determinants in tissues//Biochemistry. 1981. V. 20. P. 199-205.

137. Le Pendu J. A hypothesis on the dual significance of ABH, Lewis and related antigens // J. Immunogenet. 1989. V.16. № 1. P. 53-61.

138. Le Pendu J. et al. H-deficient blood groups of Reunion Island. II. Differences between Indians (Bombay Phenotype) and whites (Reunion phenotype) // Am. J. Hum. Genet. 1983. V. 35. P. 484-496.

139. Levine P. Illegitimate blood group antigens PI, A, and MN (T) in malignancy-a possible therapeutic approach with anti-Tja, anti-A, and anti-T // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1976. V. 277. P. 428-35.

140. Levine P. Self-nonself concept for cancer and diseases previously known as "autoimmune" diseases (illegitimate transferases/plasma exchange) // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. № 11. P. 5697-701.

141. Levine P., Koch E.A. The rare human isoagglutinin anti-Tja and habitual abortion// Science. 1954. V. 120. № 3111. P. 239-41.

142. Li Q., Anver M.R., Li Z., Butcher D.O., Gildersleeve J.C. GalNAcal-3Gal, a new prognostic marker for cervical cancer // Int. J. Cancer. 2010 V. 126. № 2. P.459-68.

143. Litman G.W. Relationship between structure and function of lower vertebrate immunoglobulins // Adv. Exp. Med. Biol. 1975. V. 64. P. 217-28.

144. Mackay I.R., Larkin L., Burnet F.M. Failure of autoimmune antibody to react with antigen prepared from the individual's own tissues // Lancet. 1957. V. 273. №6986. P. 122-3.

145. Madi A. et al. Organization of the autoantibody repertoire in healthy newborns and adults revealed by system level informatics of antigen microarray data//Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2009. V. 106. P. 14484-9.

146. Malkoff G.M. Beitrag zur Frage der Agglutination der rothen Blutkörperchen // Deutsche Medicinische Wohlenschrift. 1900. V. 26. P. 229-231.

147. Malykh Y.N., Schauer R., Shaw L. N-Glycolylneuraminic acid in human tumours // Biochimie. 2001; V. 83. № 7. P. 623-34.

148. Marion T.N., Tillman D.M., Jou N.T., Hill R.J. Selection of immunoglobulin variable regions in autoimmunity to DNA // Immunol. Rev. 1992. V. 12. P. 123-49.

149. McKane W., Lee J., Preston R. et al. Polymorphism in the human anti-pig natural antibody repertoire // Transplantation. 1998. V. 66. P. 626-633.

150. McMorrow I.M., Comrack C.A., Sachs D.H., DerSimonian H. Heterogeneity of human anti-pig natural antibodies cross-reactive with the Gal(alphal,3)Galactose epitope // Transplantation. 1997. V. 64. P. 501-10.

151. Merrick J.M., Zadarlik K., Milgrom F. Characterization of the Hanganutziu-Deicher (serum-sickness) antigen as gangliosides containing N-glycolyl-neuraminic acid // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1978. V. 57. P. 477-80.

152. Milland J. and Sandrin M.S. ABO blood group and related antigens, natural antibodies and transplantation // Tissue Antigens. 2006. V. 68. P. 459-466.

153. Miller E.B., Rosenfield R.E., Vogel P., Haber G., Gibbel N. The Lewis blood factors in American Negroes // Am. J. Phys. Anthropol. 1954. V. 12. № 3. P. 427-43.

154. Mirilas P., Fesel C., Guilbert B., Beratis N.G., Avrameas S. Natural antibodies in childhood: development, individual stability, and injury effect indicate a contribution to immune memory // Jl Clirn Immunol. 1999; V. 19. №?2-: P; 109^15;

155. Moran A.P. Relevance of fucosylation and Lewis antigen expression in the bacterial gastroduodenal pathogen Helicobacter pylori // Carbohydrate Research. 2008. V. 343. № 12. P. 1952-1965.

156. Mori T., Fujii G., Kawamura A., Yasuda T., Naito Y., Tsumita T. Forssman antibody levels in sera of cancer patients // Immunol. Commun. 1982. V. 11. № 3. P. 217-25.

157. Mostafa G.A., Ibrahim D.H., Shehab A.A., Mohammed A.K. The role of measurement of serum autoantibodies in prediction of pediatric neuropsychiatrie systemic lupus erythematosus // J. Neuroimmunol. 2010. V. 227. P. 195-201.

158. Mourant A.E. A "new" human blood group antigen of frequent occurrence // Nature. 1946. V. 158. P. 237-238.

159. Mouthon L., Haury M., Lacroix-Desmazes S., Barreau C., Coutinho A., Kazatchkine M.D. Analysis of the normal human IgG antibody repertoire.159

160. Evidence that IgG autoantibodies of healthy adults recognize a limited and conserved set of protein antigens in homologous tissues // J. Immunol. 1995. V. 154. № 11. P. 5769-78.

161. Murakami H., Lam Z., Furie B.C., Reinhold V.N., Asano T., Furie B. Sulfated glycolipids are the platelet autoantigens for human platelet-binding monoclonal anti-DNA autoantibodies // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. № 23. P. 15414-19.

162. Naiki M., Kato M. Immunological identification of blood group Pk antigen on; normal human? erythrocytes and' isolation of anti-Pk with- different affinity // Vox Sang. 1979. V. 37. № 1. P. 30-38.

163. Nemazee D.A., Bürki K. Clonal deletion of B lymphocytes in? a transgenic mouse bearing anti-MHC class I antibody genes II Nature. 1989. V. 337. № 6207. P: 562-6.

164. Nevinsky G.A., Buneva V.N. Catalytic antibodies in healthy humans and patients with autoimmune and viral diseases // J. Cell. Mol. Med. 2003. V. 7. № 3. P. 265-76.

165. Nores G.A., Dennis R.D., Helling F. and Wiegandt H. Human heterophile antibodies recognizing epitopes present on insect glycolipids // J. Biochem. 1991. V. 110. P. 1-8.

166. Nores G.A., Lardone R.D., Comin R., Alaniz M.E., Moyano A.L., Irazogui F J. Anti-GMl antibodies as a model of the immune response to self-glycans //Biochim. Biophys. Acta. 2008. V. 1780. № 3. P. 538-545.

167. Ochsenbein A.F. and Zinkernagel R.M. Natural antibodies and complement link innate and acquired immunity // Immunology Today. 2000. V. 21. № 12. P. 624-630.

168. Oriol R., Opelz G., Chun C., Terasaki P.I. The Lewis system and kidney transplantation // Transplantation. 1980. V. 29. P. 397-400.

169. Oriol R., Mollicone R., Coullin P., Dalix A.M., Candelier J.J. Genetic regulation of the expression of ABH and Lewis antigens in tissues // APMIS Suppl. 1992. V. 27. P. 28-38.

170. Orntoft T.F., Greenwell P., Clausen H., Watkins W.M. Regulation of the oncodevelopmental expression of type 1 chain ABH and Lewis(b) blood group antigens in human colon by alpha-2-L-fucosylation // Gut. 1991. V. 32. № 3. P. 287-93.

171. Parekh R.B. et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG // Nature. 1985. V. 316. № 6027. P. 452-7.

172. Parker W., Bruno D., Holzknecht Z.E., Piatt J.L. Characterization and affinity isolation of xenoreactive human natural antibodies // The Journal of Immunology. 1994. V. 153. P. 3791-3803.

173. Parker W., Lin S.S., Yu P.B., Sood A., Nakamura Y.C., Song A., Everett M.L., Piatt J.L. Naturally occurring anti-alpha-galactosyl antibodies: relationship to xenoreactive anti-alpha-galactosyl antibodies // Glycobiology. 1999. V. 9. №9. P. 865-73.

174. Parker W., Piatt J.L. Xenoreactive human natural antibodies // Autoantibodies. Elsevier Science, 1996. P. 846-851.

175. Plomp J.J., Willison HJ. Pathophysiological actions of neuropathy-related anti-ganglioside antibodies at the neuromuscular junction«// J. Physiol. 2009. V. 587. № 16. P. 3979-99.

176. Poletaev A.B., Stepanyuk V.L., Gershwin M.E. Integrating immunity: the immunculus and self-reactivity // J. Autoimmun. 2008. V. 30. P. 68-73 .

177. Pollara B., Litman G.W., Finstad J., Howell J., Good R.A. The evolution of the immune response. VII. Antibody to human "O" cells and properties of the immunoglobulin in lamprey // J. Immunol. 1970. V. 105. № 3. P. 738-45.

178. Quarles R.H., Ilyas A.A., Willison H.J. Antibodies to glycolipids in demyelinating diseases of the human peripheral nervous system // Chem. Phys. Lipids. 1986. V. 42. P. 235-48.

179. Race C. and Watkins W.M. The enzymic products of the human blood group A and B genes in the serum of 'Bombay' Oh donors It FEBS Letters. 1972. V. 27. P. 125-130.

180. Race R.R., Sanger R. // Blood group in Man. 6th edn. Oxford, Blackwell Scientific Publications. 1975.

181. Regner M., Lambert P.-H. Autoimmunity through infection or immunization//Nature immunology. 2001. V. 2. № 3. P. 185-188.

182. Rieben R., Buchs J.P., Fliickiger E., Nydegger U.E. Antibodies to histo-blood group substances A and B: agglutination titers, Ig class, and IgG subclasses inhealthy persons of different age categories // Transfusion. 1991. V. 31. № 7. P. 607-15.

183. Rye P.D., Bovin N.V., Vlasova E.V., Walker R.A. Monoclonal antibody LU-BCRU-G7 against a breast tumour-associated glycoprotein recognizes the disaccharide Galpl-3GlcNAc // Glycobiology. 1995: V. 5. P. 385-389.

184. Rye P.D., Walker R.A. Prognostic value of a breast cancer-associated glycoprotein detected by monoclonal antibody LU-BCRU-G7 // Eur. J. of Cancer. 1994. V. 30A. № 7. P. 1007-1012.

185. Rydberg L., Bengtsson A., Samuelsson O., Nilsson K., Breimer M.E. In vitro assessment of a new ABO immunosorbent with synthetic carbohydrates attached to sepharose // Transpl. Int. 2005. V. 17. № 11. P. 666-72.

186. Schachter H., Michaels M.A., Tilley C.A., Crookston M.C., Crookston J.H. Qualitative differences in the N-acetyl-D-galactosaminyltransferases produced by human A1 and A2 genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. V. 70. № 1. P. 220-224.

187. Schatz D.G., Oettinger M.A., Schlissel M.S. V(D)J recombination: molecular biology and regulation // Annu. Rev. Immunol. 1992. V. 10. P. 359-83.

188. Schulkind M.L., Robbins J.B., Clem L.W. Reactivities of shark 19S and 7S IgM antibodies to Salmonella typhimurium // Nat. New Biol. 1971. V. 230. № 14. P. 182-3.

189. Schwarting G.A., Kundu S.K., Marcus D.M. Reaction of antibodies that cause paroxysmal cold hemoglobinuria (PCH) with globoside and Forssman glycosphingolipids // Blood. 1979. V. 53. № 2. P. 186-92.

190. Serafini-Cessi F., Conte R. Precipitin reaction between Sda-active human Tamm-Horsfall glycoprotein and anti-Sda-serum // Vox Sang. 1982. V. 42. № 3. P. 141-4.

191. Sewell H.F., Chambers L., Maxwell V., Matthews J.B., Jefferis R. The natural antibody response to E. coli includes antibodies of the IgD class // Clin. Exp. Immunol. 1978. V. 31. № 1. P. 104-10.

192. Shoenfeld Y., Isenberg D.A. The mosaic of autoimmunity // Immunol. Today. 1989. V. 10. №4. P. 123-6.

193. Shoenfeld Y., Zandman-Goddard G. // Autoimmune diseases "The enemy from within". Bio-Rad Pub., Herculs, CA. USA. 2003.

194. Simister N.E. Placental transport of immunoglobulin G // Vaccine. 2003. V. 21. №24. P. 3365-9.

195. Singhal A., Hakomori S. Molecular changes in carbohydrate antigens associated with cancer//BioEssays. 1990. V. 12. P. 223-230.

196. Slovin S.F., Keding S.J., Ragupathi G. Carbohydrate vaccines as immunotherapy for cancer // Immunol, and Cell Biol. 2005. V. 83. P. 418-28.

197. Smorodin E.P., Kurtenkov O.A., Sergeyev B.L., Lilleorg A.L., Chuzmarov V.I. Antibodies to tumor-associated carbohydrate epitopes in sera of cancer patients and blood donors //Exp. Oncol. 2001. V. 23. P. 109-13.

198. Smorodin E.P., Kurtenkov OA., Sergeyev B.L., Pazynina G;V., Bovin NV. Specificity of human anti-carbohydrate IgG antibodies as probed- with polyacrylamide-based glycoconjugates // Glycoconj. J. 2004. V. 20. P. 83-9.

199. Sorette M!P:, Galili U., Clark MiRL Comparison of serum; anti-band; 3" and anti-Gall antibody binding' to density-separated' human- red blood cells // Blood. 1991. V. 77; № 3. P. 628-36.

200. Spalter S.Hi, Kaveri S V., BonnimE., Mani J.-C., Cartron Ji-P:, Kazatchkine M.D. Normal human serum contains natural antibodies reactive with autologous ABO blood group antigens // Blood. 1999. V. 93. P. 4418-4424.

201. Spitalnik S; Gowlës J, .Gox JMT, Blumberg N. Neutralization of Lewis bloodi group antibodies by synthetic immunoadsorbents // Am. Ji Glin. Pathol. 1983. V. 80: №4. Pi 63-5;

202. Spitalnik S., Gowles J., Cox M.T., Blumberg N. Detection of IgG anti-Lewis (a) antibodies in cord sera by kinetic Elisa// Vox Sang. 1985; V. 48. P. 235-8.

203. Spitalnik S., Pfaff W., Cowles J., Ireland J.E., Scornik J.C., Blumberg N. Correlation of humoral immunity to Lewis blood group antigens with renal transplantation rejection // Transplantation. 1984. V. 37. P. 265-268.

204. Spitalnik P.F., Spitalnik S.L. The P blood group system: biochemical, serological, and clinical aspects // Transfus. Med. Rev. 1995. V. 9. P. 110-22.

205. Springer G.F. Relation of blood group active plant substances to human blood groups // Acta Haemotologica, 1958. V. 20. P. 147-155.

206. Springer G.F. Blood-group and Forssman antigenic determinants shared between microbes and mammalian cells // Prog. Allergy. 1971. V. 15. P. 9-77.

207. Springer G.F. T and Tn, general carcinoma autoantigens // Science. 1984. V. 224. P. 1198-1206.

208. Springer G.F, Desai P.R. Tn epitopes, immunoreactive with ordinary anti-Tn antibodies, on normal, desialylated human erythrocytes and on Thomsen-Friedenreich antigen isolated therefrom // Mol. Immunol. 1985. V. 22. № 11. P. 1303-10.

209. Springer G.F., Desai P.R., Murthy M.S., Scanlon E.F. Human carcinoma-associated precursor antigens of the NM blood group system // J. Surg. Oncol. 1979. V. 11. № 2. P. 95-106.

210. Springer G.F., Horton R.E. Blood group isoantibody stimulation in man by feeding blood group-active bacteria // J. Clin. Invest. 1969. V. 48. P. 1280-91.

211. Springer G.F., Williamson P. and Brandes W.C. Blood group activity of Gram-negative bacteria // J. Exp. Med. 1961. V. 113. P. 1077-93.

212. Stewart J. Immunoglobulins did not arise in evolution to fight infection // Immunol. Today. 1992. V. 13. № 10. P. 396-400.

213. Sun J.B. Autoreactive T and B cells in nervous system diseases // Acta Neurol. Scand. Suppl. 1993. V. 142. P. 1-56.

214. Szulman A.E. and Markcus D.M. The histological distribution of the blood group substances in man as disclosed by immunofluorescence VI. The Lea and Leb antigens during fetal development // Laboratory Investigations. 1973. V. 28. P. 565-574.

215. Szulman A.E. Evolution of ABH blood group antigens during embryogenesis //Ann. Inst. Pasteur Immunol. 1987. V. 138. P. 845-847.

216. Tangvoranuntakul P., Gagneux P., Diaz S., Bardor M., Varki N., Varki A., Muchmore E // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. № 21. P. 12045-50.

217. Thompson S.C., Mandel T.E. Fetal pig pancreas. Preparation and assessment of tissue for transplantation, and* its in vivo development and function in athymic (nude) mice // Transplantation. 1990. V. 49. № 3. P. 571-81.

218. Thomsen O., Friedenreich V., Worsaae E. Über die Möglichkeit der Existenz zweier neuer Blutgruppen: auch ein Beitrag zur Beleuchtung sogenannter Untergruppen // Acta Pathologica Microbiologica Scandinavica. 1930. V. 7. P. 157-190.

219. Tomer Y., Sherer Y., Shoenfeld Y. Autoantibodies. Autoimmunity and cancer // Oncology Reports. 1998. V. 5. P. 753-761.

220. Tupitsyn N.N., Kadagidze Z.G., Tuichev I.K. Relationship between semiquantitative and quantitative parameters of local immune response in gastric cancer // Experimental Oncology. 1995. Y. 17. № 1. P. 31-6.

221. Uhlenhuth P. Festchrift zum sechzigsten Gebutstage von Robert Koch. Gustav Fisher. Jena. 1903. P. 49-74.

222. Yani J., Elluru S., Negi V.S., Lacroix-Desmazes S., Kazatchkine M.D., Bayary J., Kaveri S.V. Role of natural antibodies in immune homeostasis: IVIg perspective // Autoimmun. Rev. 2008. V. 7. № 6. P. 440-4.

223. Varki A. N-glycolylneuraminic acid deficiency in humans // Biochimie. 2001. V. 83. №7. P. 615-22.

224. Voak D., Path F.R.C. Monoclonal antibodies in blood group serology // Transfus. Sei. 1989. V. 10. P. 5-13.

225. Wang J. et al. Fc-glycosylation of IgGl is modulated by B-cell stimuli // Mol. Cell. Proteomics. 2011. V. 10. № 5. Ml 10.004655.

226. Watkins W.M. The ABO blood group system: hystorical background // Transfusion Medicine. 2001. V. 11. P. 243-265.

227. Watkins W.M., Greenwell P., Yates A.D. The genetic and enzymic regulation of the synthesis of the A and B determinants in the ABO blood group system // Immunol: Commun. 1981. V. 10. № 2. P. 83-100.

228. Westerlind U., Hagback P., Duk M., Norberg T. Synthesis and inhibitory activity of a di- and a trisaccharide corresponding to an erythrocyte glycolipid responsible for the NOR polyagglutination // Carbohydr. Res. 2002. V. 337. № 17. P. 1517-22.

229. Willison H.J., Paterson G., Veitch J., Inglis G., Barnett S.C. Peripheral neuropathy associated with monoclonal IgM anti-Pr2 cold agglutinins // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 1993. V. 56. № 11. P. 1178-83.

230. Wilson G.S., Miles A.A. // Topley and Wilsons Principles of Bacteriology and Immunity. 4th ed. London, Arnold. 1961. V. 2. P. 1239-1242.

231. Winer M.A. and Terryberry J.W. Glycolipid (excluding ganglioside) autoantibodies // Autoantibodies. Elsevier Science. 1996. P. 314-324.

232. Xu Y., Lorf T., Sablinski T. et al. Removal of anti-porcine natural antibodies from human and nonhuman primate plasma in vitro and in vivo by a Galalphal-3Galbetal-4betaGlc-X immunoaffinity column // Transplantation. 1998. V. 65. №2. P. 172-9.

233. Yamamoto F., McNeill P.D., Yamamoto M., Hakomori S., Harris T. Molecular genetic analysis of the ABO blood group system: 3. Ax and B(A) alleles //Vox Sang. 1993. V. 64. P. 171-174.

234. Yamamoto» F. Molecular genetics of the ABO histo-blood group system // Vox Sang. 1995. V. 69. № 1. P. 1-7.

235. Yang Z., Bergstrom J., Karlsson K.A. Glycoproteins with Galalpha4Gal are absent from human erythrocyte membranes, indicating that glycolipids are the sole carriers of blood group P activities // J. Biol. Chem. 1994. V. 269i P. 14620-4.

236. Yasuda T., Ueno J., Naito Y., Tsumita T. Antiglycolipid antibodies in human sera//Adv. Exp. Med. Biol. 1982. V. 152. P. 457-65.

237. Yates A.D., Watkins W.M. The biosynthesis of blood group B determinants by the blood group A gene-specified alpha-3-N-acetyl-D-galactosaminyltransferase //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. V. 109. № 3. P. 958-65.

238. Yokota M., Warner G.A., Hakomori S. Blood group A-like glycolipid and a novel Forssman antigen in the hepatocarcinoma of a blood group O individual //CancerRes. 1981. V. 41. № 10. P. 4185-90.

239. Yoshimura N., Sawada T., Furusawa M. and Fuchinoue S. Expression of xenoantigen transformed human cancer cells to be susceptible to antibody-mediated cell killing // Cancer Lett. 2001. V. 164. P. 155-160.

240. Young W.W., Hakomori S.-I., Levine P. Charachterization of anti-Forssman (anti-Fs) antibodies in human sera: their specificity and possible changes in patients with cancer // J. Immunol. 1979. V. 123. P. 92-96.

241. Yu P.B., Holzknecht Z.E. et al. Modulation of natural IgM binding and complement activation by natural IgG antibodies: a role for IgG anti-Gal alphal-3Gal antibodies // J. Immunol. 1996. V. 157. № 11. P. 5163-8.

242. Yuki N. Glycotope mimicry between human ganglioside and bacterial lipopolysaccharide induces autoimmunite neuropathy // TIGG. 1999. V. 11. P. 345-353.

243. Zanetti M:, Lenert G., Springer G.E. Idiotypes of pre-existing human anticarcinoma anti-T and anti-Tn antibodies // Int. Immunol; 1993. V. 5. P. 113-9.

244. Zhu A. and Hurst R. Anti-N-glycolylneuraminic acid antibodies identified in healthy human;serum // Xenotransplantation; 2002. V. 9. P. 376—381.

245. Галактионов B.F. Иммунология. М., Изд-во МГУ. 1998. С. 480.

246. Лапенков М.И. Анти-АВН-Lewis моноклональные антитела; Получение, определение эпитопной специфичности и применение в судебной медицине // Автореферат докторской диссертации. М., ООО «МАКС Пресс». 2002.

247. Лондон Е. С. //Архив биол. наук. 1901. Т. 9; № 1. С. 82-127.

248. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. // Иммунология, М., "Мир". 2000.

249. Сигнеев В.И., Тихомирова Е.В., Жукова О.В. Генофонд и геногеография народонаселения // Под ред. Ю. Г. Рычкова: Том 1. Генофонд населения России и сопредельных стран.- СПб., Наука. 2000. С. 611.

250. Сидорова Е.В. Лекция «Неспецифические и полиспецифические иммуноглобулины». НИИ им. Гамалеи, 21 апр. 2009.

251. Смородин Е.П. и др. Иммуноферментный анализ IgM-антител к гаптену Томсена-Фриденрейха (TF) в онкодиагностике. Сравнение данных,полученных с помощью четырех TF-гликоконъюгатов // Биоорг. химия. 1997. Т. 23. № Ю. С. 795-799.

252. Тупицын H.H., Галанина O.E., Бовин Н.В., Гадецкая H.A., Шелепова В.М., Короткова О.В., Кадагидзе З.Г. Снижение уровня специфических антител к углеводному антигену Le у больных раком молочной железы // Иммунология. 2008. Т. 29. № 2. С. 94-97.