Стабилизация тирозиназы в водно-органических системах для создания ферментных электродов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

\ \

ШИПОВСКОВ Степан Васильевич

СТАБИЛИЗАЦИЯ ТИРОЗИНАЗЫ В ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ЭЛЕКТРОДОВ

02.00.15 катализ 03.00.23 биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М В. Ломоносова и на кафедре аналитической химии Лундского университета (Швеция).

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Левашов А.В.

доктор химических наук, профессор Клячко HJL

доктор химических наук, профессор Ямсков И.А. доктор химических наук, профессор Ярополов А.И.

Ведущая организация:

Институт Биоорганической Химии им. М.М Шемякина й Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится ю оз.

2003 г. в 16 ч на заседании диссертационного совета Д 501 001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, ауд. 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ Автореферат разослан августа 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фенолы и их производные относятся к группе опасных органических соединений загрязняющих окружающую среду Одним из основных источников фенолов и их производных являются отходы промышленной переработки древесины.. Другим источником производных фенолов - алкилфенолов, являются продукты деградации неионных поверхностно-активных веществ -алкилфенолполиэтоксилатов (АФПЭ), применяемых в быту, текстильной, пищевой и лако-красочной промышленностях для обработки поверхностей металлов и в качестве диспергирующих агентов и эмульгаторов В процессе ирригации сточных вод АФПЭ и продукты их деградации попадают в почву и водоемы и вследствие своей химической устойчивости накапливаются в речных и морских отложениях. В связи с этим, разработка высокоэффективных методов анализа/определения фенолов в окружающей среде представляет собой актуальную биотехнологическую задачу Одним из ее решений является создание биосенсоров на основе электрохимических методов, т.е. разработка высокочувствительных ферментных электродов. Одним из ферментов, на основе которого создаются ферментные электроды для определения фенолов и их производных, является тирозиназа - медьсодержащая оксидоредукгаза, катализирующая окисление фенолов и их производных кислородом воздуха Биосенсоры на основе тирозиназы уже применяются для мониторинга сточных вод в промышленности, однако данные сенсоры требуют продолжительной и сложной пробоподготовки, основным этапом которой является концентрирование определяемых веществ в органических растворителях, таких как ацетонитрил, этанол и их смеси, с последующим растворением в традиционной для ферментов водной системе. Данные биосенсоры также имеют ряд недостатков, связанных с ограниченной диффузией субстратов в пленках/системах иммобилизованных ферментов и протеканием неферментативной полимеризации продуктов реакции в водных средах, что затрудняет анализ и приводит к снижению чувствительности сенсора.

Возможность работы сенсора в органических средах позволяет повысить эффективность определения фенолов. В частности, переход от водных сред неводным средам может дать следующие преимущества в анализе, а именно:

упростить процедуру пробоподготовки за счет уменьшения количества/времени ее этапов;

- уменьшить, так называемые, «диффузионные ограничения», благодаря большей растворимости кислорода/фенолов во многих органических средах по сравнению с водой;

- избежать отравления сенсора продуктами неферментативной рН - зависимой реакции полимеризации.

Таким образом, одним из путей развития биосеносоров на основе тирозиназы для определения фенолов является разработка методов стабилизации каталитической активности и увеличение операционной стабильности тирозиназы как в полярных, так и неполярных органических системах, что позволит получить иммобилизованный Препарат фермента для практического использования в биоэлектрокатализе.

Целью исследования явилось изучение каталитической активности тирозиназы в водных и водно-органических средах, как в полярных, так и в неполярных растворителях, с последующей стабилизацией каталитической активности фермента. В качестве органических сред были выбраны органические растворители, широко применяющиеся при пробоподготовке фенол-содержащих образцов, октан, в качестве неполярного органического растворителя, ацетонитрил и водно-этанольные смеси - в качестве полярных органических растворителей. Дальнейшей целью работы являлась адаптация стабилизированного препарата тирозиназы для целей биоэлектрокатализа. Для этого была разработана методика иммобилизации тирозиназы на поверхности золотого электрода с сохранением каталитической активности фермента и с возможностью его использования в органических средах. Была разработана система «чернил» на основе органического растворителя содержащего стабилизированный фермент, для распыления на поверхность твердого носителя с использованием спрэй-технологии, как наиболее экспрессивной и воспроизводимой методики получения электродов методом трафаретной печати.

Научная новизна В работе впервые получены и исследованы нековалентные комплексы тирозиназы с катионным полиэлектролитом полибреном, характеризующиеся повышенной каталитической активностью и стабильностью в водных и водно-органических средах. Для комплексов тирозиназы с полибреном

было обнаружено расширения рН-профиля ферментативной реакции за счет левого плеча, позволяющее использовать фермент в области кислых рН. При рН 4.5 каталитическая активность тирозиназы в комплексе с полибреном (в молярном соотношении 1:100) в 3 раза превышала активность свободного фермента Для полученных комплексов тирозиназы с полибреном впервые был показан стабилизационный эффект комплексообразования в водных и в водно-этанольных системах и эффект активации фермента в области умеренных концентраций полярного органического растворителя (до 40%), когда каталитическая активность тирозиназы в комплексе увеличивалась до 10 раз. Это позволило впервые разработать ферментный электрод на основе тирозиназы в комплексе с полиэлектролитом функционирующий в водной и водно-этанольной среде и обладающий высокой биоэлектрокаталитической активностью и высокой операционной стабильностью. Для стабилизации каталитической активности тирозиназы в октане использовался метод включения фермента в систему обращенных мицелл. Каталитическая активность тирозиназы, соллюбилизованной в системе обращенных мицелл в октане при степени гидратации обращенных мицелл 25 была соизмерима с активностью в водной среде. Это позволило впервые разработать ферментный электрод на основе тирозиназы в системе иммобилизованных обращенных мицелл функционирующий как в водной среде, так и в ацетонитриле Впервые продемонстрирована принципиальная возможность использования тирозиназы, включенной в систему обращенных мицелл, для создания электродов методом трафаретной печати при прямом распылении органических «чернил», содержащих каталитически активный фермент, на поверхность электрода

Значимость полученных результатов Стабилизация/активация тирозиназы в водных и водно-органических средах, достигнутая при формировании нековапентных комплексов или при включении тирозиназы в систему обращенных мицелл в октане, позволяет использовать этот фермент в качестве биокатализатора успешно работающего в нетрадиционных средах, как в условиях гомогенного, так и гетерогенного катализа (в случае иммобилизованного фермента).

Теоретическая значимость работы связана с развитием представлений о принципах и механизмах стабилизации каталитически активных форм фермента, реализующихся при образовании нековапентных комплексов тирозиназы с

з

полиэлектролитом и при включении фермента в системы обращенных мицелл с различными характеристиками.

Практическая значимость работы обусловлена необходимостью создания высокочувствительных электродов для определения фенолов и их производных в окружающей среде. Ферментный электрод на основе тирозиназы, включенной в систему обращенных мицелл, позволяет определять фенольные соединения непосредственно в органической среде, тем самым избегая части этапов пробоподготовки. Распыление тирозиназы в системе обращенных мицелл на поверхность носителя позволяет повысить экспрессность и воспроизводимость получения электродов методом трафаретной печати и тем самым воспроизводимость анализа. •

Апробация работы; Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: Международная конференция студентов и аспирантов "Менделеев-97" (Москва, Россия, 1997), Международная конференция студентов и аспирантов "Ломоносов-98" (Москва, Россия, 1998); NATO-Advanced Study Institute (NATO-ASI) "Enzymes in Heteroatom Chemistry. A Green Solution for Chemical Problems" (Berg en Dal (Nijmegen), The Netherlands, 1999); XVI International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics (Bratislava, Slovakia, 2001); XTV International Symposium "Surfactant in Solutions" (Barcelona, Spain, 2002); XVII Meeting on ERMIS "Electrode Reaction Mechanism and Interfacial Structure" (Köningstein (Dresden), Germany, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения (7 глав), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 144 ссылок. Работа изложена на 114 страницах, содержит 37 рисунков и 2 таблицы.

fío введении рассматриваются актуальность поставленной задачи и обсуждаются цели настоящей работы.

В обзоре литературы, состоящем из четырех разделов, рассмотрены основные типы водно-органических систем для исследования ферментативного катализа и закономерности ферментативной активности в них, методы стабилизации ферментов

и закономерности формирование нековалентных комплексов ферментов с полиэлектролитами Также в литературном обзоре описаны свойства тирозиназы, методы очистки, иммобилизации фермента на носителях и применение тирозиназы для разработки биосенсоров.

В экспериментальной части перечислены препараты и реагенты, использовавшиеся в работе, и описаны экспериментальные методы исследования, методы определения кинетических параметров ферментативной активности тирозиназы в нековалентных комплексах с полибреном в водных и водно-этанольных средах и в системе обращенных мицелл. Также описаны использованные в работе методы иммобилизации тирозиназы. Описаны процедуры подготовки поверхности электродов и электрохимические методы измерений циклических вольтамперограмм и амперометрия при постоянном потенциале электрода.

В результатах и обсуждении, состоящем из семи разделов, изложены полученные в работе экспериментальные данные и их обсуждение.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Нековалентные комлексы тирозиназы с полибреном

1.1. Каталитическая активность комплексов в водных растворах: рН -зависимость

Образование нековалентных комплексов фермент-полиэлектролит, как метод стабилизации ферментов в полярных водно-органических смесях, было ранее детально описано на примере а-химогрипсина и катионного полиэлектролита -полибрена(поли(1,5-диметил-1,5-диазаундеканметилен)бромида).

6 данной работе исследованы кинетические характеристики свободной тирозиназы и нековалентных комплексов тирозиназы с полибреном (молекулярный вес 6500 Да) в зависимости от рН среды. Зависимости дифенолазной активности нативной тирозиназы и тирозиназы в комплексах имеют сходный вид (рис. 1). Однако для комплекса полибрен (ПБ)/тирозиназа в молярном соотношении 100.1, комплекс 100 (кривая 4, рис 1), бьша показана максимальная каталитическая

активность тирозиназы, значительно превышающая каталитическую активность немодифицированного фермента при рН < 6.5.

30

2 в

2.6

и

■Я 2.4

гг

20

* гвЬ-/// «•«

2

Л к ¡1

г

\

/

--с 44.6 ;

[ПЕДОТирозиназа)

юо гоо зоо 4оо! ъоо

4.5

5.0

55 60

рН

6.5

70

Рис 1. рН зависимость дифенольной - каталитической активности нативной тирозиназы (1 - •) и тирозиназы в комплексах с полибреном при различном содержании полибрена Молярные соотношения [ПБ]/[тирозиназа] (2- О) 101; (3 - ■) 50 1. (4 - □) 100 1, (5 - ▲) 200.1, (6 - Д) 500 1. 4 мМ нитрат -фосфатный буфер. Вставка зависимость каталитической активности тирозиназы от степени модификации тирозиназы при различных рН

При этом, монотонное увеличение каталитической активности тирозиназы в комплексе 100 наблюдается при всех исследованных значениях рН (вставка рис 1); при этом константа Михаэлиса оказывается на порядок ниже, чем для тирозиназы в свободной форме (0.3 мМ и 4 мМ, соответственно (см. табл. 1)). Уменьшение

значения Кт может быть связано с увеличением локальной концентрации субстрата вблизи активного центра тирозиназы в комплексе с полибреном. Таким образом, нековалентный комплекс полиэлектролита с ферментом играет важную роль в регуляции Кт.

Как видно из рис. 1, каталитическая активность тирозиназы в комплексе 100 при рН 4.5 почти в 3 раза выше чем для тирозиназы в свободной форме, 570 с"1 и 195 с*1 , соответственно (табл. 1), что дает возможность эффективной разработки тирозиназных биосенсоров для работы в кислых средах. При этом, расширение профиля каталитической активности тирозиназы за счет левого плеча в более кислую область позволяет избежать спонтанной радикальной полимеризации продуктов реакции, и тем самым отравления поверхности биосенсора, приводящей к инактивации фермента.

Таблица 1.

Значения Кт и k2 для нэтивной тирозиназы и тирозиназы в комплексе 100 при рН 4.5

рН 4.5 рН 6.5

¿2, С"' Кт, мМ кг, с'

нативкая тирозиназа 5.2 195 4.0 760

комплекс 100 1.4 570 0.3 710

1.2. Каталитическая активность комплексов тирозиназы с полибреном в водно -этанальных смесях

Этанол и водно-этанольные смеси используются в аналитической химии при экстракции - концентрировании фенолов и их производных, как один из этапов пробоподготовки. Затем экстрагированные вещества растворятся в воде для последующего анализа. Очевидно, что создание препарата фермента способного функционировать в водно-этанольных системах позволит проводить анализ фенолов непосредственно на стадии концентрирования. Для этого каталитическая активность свободной тирозиназы и комплексов тирозиназы с полибреном была изучена в водно - этанольных смесях в широком диапозоне концентраций этанола, до 95% об.

Каталитическая активность нативной тирозиназы в водно - этанольной смеси имеет вид кривой с максимумом (рис. 2, кривая 1). При низких концентрациях этанола, не превышающих 20%, каталитическая активность тирозиназы уменьшается, затем возвращается к исходному значению при содержании этанола в системе до 40%. По-видимому, эта активация фермента связана с увеличением локальной концентрации пирокатехина вблизи фермента.

Этанол, % об.

Рис 2. Зависимость дифенольной - каталитической активности фермента от содержания тшгола в водно — зтанольных смесях для нативной тирюиназы (1 - •) и для тирозиназы в комплексах с полибреном при различном содержании полибрена Молярные соотношения [ПБ]/|тиразиназа] (2 - О) 10 1; (3 - ■) 50 1, (4 - □) 100 1; (5 - А) 200.1, (6 - А) 500.1 Вставки* зависимость каталитической активности тирдоиназм от степени модификации тирозиназы при содержании этанола от 0% до 50%' • - 0%, О - 10%, ■ - 20%, □ - 30%,

Л - 40%, Л - 50% и при содержании этанола от 50% до 90%: • - 0%, О - 50%, ■ - 60%, □ - 70%, ▲ - 8 %, Л-90%

(0

£

*

40 60 Этанол, % об.

100

Рис. 3 Зависимость наблюдаемой констаты специфичности окисления пирокатехина в водно - этанольных смесях от содержания этанола для нативной тирозиназы (I - •) и тирозиназы в комплексе с полибреном Молярные соотношения [ПБ]/[Тирозиназа) (2 - О) 10:1, (3 - ■) 50.1, (4 - □) 100.1, (5 - ▲) 200.1, (6 - Д) 500 1. Вставка: зависимость наблюдаемой константы Михаэлиса в реакции окисления пирокатехина в водно - этанольных смесях от содержания этанола для нативной тирозиназы и тирсзиназы в комплексе с полибреном Обозначения соответствуют основному рисунку

При концентрациях этанола 40% - 70% наблюдается сохранение активности тирозиназы на высоком уровне, что может являться эффектом суммирования двух

«противоположных» процессов: с одной стороны - увеличения локальной концентрации субстрата, приводящего к увеличению скорости реакции, с другой -инактивации фермента из-за увеличения содержания органического растворителя в системе. При увеличении содержания этанола до 95% активность свободной тирозиназы снижется в 10 раз (рис. 2, кривая 1).

Образование нековапентного комплекса 100 приводит к увеличению каталитической активности фермента при всех концентрациях этанола (вставки на рис. 2) и приводит к значительной стабилизации тирозиназы в области низких концентраций этанола - до 20% (рис. 2, кривая 4).

Следует отметить, что зависимость каталитической активности тирозиназы в комплексе с молярным соотношением полибрен/тирозиназа 500.1 (комплекс 500) имеет несколько иной профиль по сравнению с другими комплексами. В диапазоне концентраций этанола 60% - 95%, где наблюдается уменьшение каталитической активности фермента вследствие инактивации свободной тирозиназы и тирозиназы в большинстве исследованных комплексов с полибреном, комплекс 500 сохраняет каталитическую активность постоянной. Это свидетельствует о существенном стабилизационном эффекте в комплексе 500 при высоких содержаниях этанола

На вставке рис. 3 представлены зависимости величин Кт в реакции окисления пирокатехина от концентрации этанола для тирозиназы и комплексов тирозиназы с полибреном. Для нативной тирозиназы Кт резко уменьшается при переходе к этанол - содержащим средам (до 10% содержания этанола), что также может быть обусловлено изменением конформации белка. При концентрациях этанола от 10% до 90% величина Кт увеличивается во всем диапазоне концентраций. Для тирозиназы в комплексе с полибреном, в молярном соотношении 1:50 и 1:100, в диапазоне концентраций этанола от 0% до 60%, значение Кт существенно ниже, чем для нативной формы и для других комплексов (рис. 3, вставка: кривые 3 и 4). Указанное снижение величины Кт обуславливает увеличение константы специфичности (соотношение между наблюдаемой константой скорости и константой Михаэлиса, кг/Кщ) в 10 раз (рис. 3, кривые 3 и 4). Отметим, что в водно-органических смесях параметр Кт не всегда можно однозначно интерпретировать, так как эффективность связывания субстрата зависит от распределения его между ближайшим к ферменту слоем растворителя и объемом раствора. В то же время, увеличение Кт при

увеличении концентрации органических растворителей - характерное явление для ферментов, в случае, когда образование фермент-субстратного комплекса определяется, главным образом, гидрофобными взаимодействиями.

Таким образом, анализируя полученные данные, можно сказать, что образование нековалентных комплексов тирозиназы с катионным полиэлектролитом (полибреном) приводит к:

увеличению каталитической активности тирозиназы в водных растворах при кислых рН, т.е. наблюдается положительный активационный эффект комплексообразования; - сохранению каталитической активности фермента в полярном органическом растворителе (этаноле) вплоть до 70% его содержания, т.е. наблюдается положительный стабилизационный эффект комплексообразования.

Оба этих эффекта сопровождаются уменьшением кажущийся константы Михаэлиса и наиболее выражены для комплекса 100. Полученные результаты позволяют создать биосенсоры на основе нековалентных комплексов тирозиназы с полибреном для определения фенолов и их производных как в водной среде так и в

I

полярных органических средах < . .

2. Каталитическая активность тирозиназы в системе обращенных мицелл

Наряду с полярными водно-органическими средами, на различных этапах пробоподготовки при анализе фенолов используются и неполярные органические растворители, такие как октан. Поэтому разработка системы на основе октана, в которой фермент сохранил бы свою каталитическую активность, является актуальной биоаналитической задачей.

Одним из возможных решений можно считать систему обращенных мицелл' ПАВ - вода — октан, используемую в качестве среды для ферментативной реакции. Из рис. 4 видно, что профиль каталитической активности тирозиназы, в зависимости от степени гидратации мицелл, имеет два максимума: при степенях гидратации и^ 12 и 25. Пик каталитической активности при и>о 25 более выражен и константа скорости ферментативной реакции соизмерима с водной системой. Следует отметить, что профиль Кт от степени гидратации при степени гидратации 25 имеет минимум, что может быть обусловлено повышением локальной концентрации субстрата и, в

следствии этого, величина константы специфичности к<м1Кт в мицеллах несколько превышает водный уровень (рис. 4).

Рис. 4 Зависимость (•) каталитической активности тиртиназы (¿са(, с'1) и (О) консгаты специфичности (коц/Кщ) от степени гидратации обращеных мицелл 0.1 М АОТ в октане. Штрих-линия соответствуют каталитической активности и специфичности тврозиназы в водном 4 мМ цтрат^-фоефатном буфере, рН 6 5

3. Биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в водных растворах

В основе работы тирозиназного электрода лежит реакция восстановления кислорода, катализируемая тирозиназой в присутствии фенолов: при этом хинон, образующийся в процессе ферментативного цикла, электрохимически восстанавливается/регенерируется на электроде, тем самым завершая биоэлектрокаталитический цикл, далее снова вступая в ферментативную реакцию (рис. 5). Для определения оптимальных условий биоэлектрокатализа была исследована рН зависимость реакции восстановления кислорода, катализируемая тирозиназой иммобилизованной на поверхности электрода. В качестве медиатора -переносчика электронов между электродом и активным центром фермента использовался пирокатехин. При сравнении рН зависимостей каталитической активности тирозиназы в гомогенной фазе и тирозиназы адсорбированной на электроде, в гетерогенной системе получен сдвиг оптимума каталитической активности на 0.5 единиц рН в более кислую область. «Кислый» сдвиг рН оптимума, наблюдаемый для иммобилизованного фермента, в некоторой степени позволяет

ослабить негативное влияние неферментативной реакции полимеризации на эффективность определения фенолов.

Рве 5. Принципиальная схема биоэлектрокаталигического восстановления кислорода 02 катализируемого тирозиназой в присутствии пирокатехина в качестве второго субстрата

Так как рН 6.0 представляет рН оптимум биоэлектрокатализа иммобилизованной тирозиназой, то все последующие электрохимические измерения были проведены при рН 6.0.

На рис. 7 приведены типичные циклические вольтамперограммы полученные для золотого электрода в водном буферном растворе в отсутствие и в присутствие пирокатехина и для. электрода, модифицированного тирозиназой (физическая адсорбция). В отсутствие тирозиназы, электрохимическое окисление -восстановление пирокатехина наблюдается в диапазоне потенциалов +300 + -100 мВ (рис. 7, кривая 2). Для электродов, модифицированных тирозиназой, в присутствии пирокатехина в качестве медиатора наблюдается каталитическая волна восстановления кислорода, т.е. исчезновение пика окисления пирокатехина и увеличение тока восстановления сопровождающиеся трансформацией пика восстановления пирокатехина (рис. 7, кривая 2) в каталитическую волну восстановления кислорода (рис. 7, кривая 3).

в

г

Рис б. Зависимость каталитической активности тирозиназы от рН для гомогенного катализа (•) и для тирозиназы иммобилизованной на поверхности золотого электрода (о); 4 мМ цитрат - фосфатный буфер. Биоэлектрокаталический отклик Т1фозиназного электрода определялся по максимуму каталитического тока восстановления кислорода на циклических вольтамперограммах в присутствии КБхЮ"4 М пирокатехина, при скорости развертки потенциала 50 нВ с'1.

Наличие каталитической волны восстановления кислорода подразумевает, что пирокатехин, вовлеченный в ферментативный цикл, более не окисляется на поверхности электрода при потенциалах +200 мВ - +300 мВ, а окисляется тирозиназой в процессе восстановления ферментом кислорода воздуха (рис. 5). С увеличением концентрации пирокатехина возрастает эффективность биоэлектрокатализа восстановления кислорода, что позволяет получить калибровочную зависимость максимального тока биоэлектрокатализа от концентрации пирокатехина (вставка рис. 7). Зависимость электрохимического сигнала от концентрации пирокатехина линейна в диапазоне концентраций от 0.05 мМ до 0.17 мМ. При этом скорость реакции определялась диффузией субстрата к поверхности электрода. При концентрациях пирокатехина больших 0.17 мМ калибровочная кривая выходит на насыщение, что позволяет определить величину предельного каталитического тока (-5.5 мкА для рассматриваемой системы). Существенным недостатком исследованной системы золото|тирозиназа была нестабильность биоэлектрохимического сигнала: фермент полностью десорбировался с поверхности электрода в раствор в течение 25 мин.

Рис. 7. Циклические вальтамцерограммы для золотого электрода (1, 2) и электрода модифицированного тироэиназой (3)в 4 мМ цитрат - фосфатом буфере, рН б 0; (2), (3) в присутствии 1 5х!0"*М пирокатехина, скорость развертки потенциала 50 мВ с1. Вставка: Калибровочная зависимость максимального электрохимического отклика золотых электродов модифицированных тирозиназой от концентрации пирокатехина, полученная из вольтамперограмм, при 0 мВ

В ацетонитриле и в этаноле была получена полная инактивация фермента Таким образом, для стабилизации ферментного электрода в органическом растворителе была выбрана система обращенных мицелл АОТ. Кроме того, предполагалось, что эффект «преконцентрирования» субстрата в органической среде мицеллярного слоя позволит увеличить чувствительность метода анализа.

4. Биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в комплексе с полиэлектролитами в водной и в водно-этанольных системах

Как было показано, тирозиназа в комплексах с полибреном в молярном соотношении полибрен:тирозиназа 100:1 (комплекс 100) характеризуется повышенной каталитической активностью по сравнению со свободным ферментом (часть 1). Принимая во внимание повышенную стабильность и активность комплекса 100 в расширенной области рН и концентраций этанола, была исследована биоэлектрокаталитическая активность комплекса 100 иммобилизованного на графитовых электродах Полученные данные сравнивались с биоэлектрокаталитической активностью свободной тирозиназы в тех же условиях.

Гидрофильный характер комплексов фермента с полиэлектролитом предопределил выбор графита в качестве электродного материала для эффективной иммобилизации на носителе.

14-

Т" 10 -

1

12 -

8 -

в

4

5

в

7

8

рн

Рис 8 Зависимость биоэлектрокаталигической активности свободной тирозиназы (•) и тирозиназы в комплексе 100 (О), при иммобилизации на поверхности графитового электрода, 4 мМ цитрат-фосфатный буфер Биоэлектрокаталигический отклик элеетродов определялся по максим ому каталитического тока восстановления кислорода на циклических вольтамперограммах в присутствии 3.35х10"5 М пирокатехина, при скорости развертки потенциала 50 мВ с'1. Данные исправлены на ток в фоновом электролиге.

На рис. 8 приведены рН-зависимости биоэлектрокатапитической активности свободной тирозиназы и тирозиназы в комплексе 100, при их иммобилизации на поверхности графитовых электродов. Как видно из рис. 8, для комплекса 100 наблюдается расширение рН-оптимума биоэлектрокатапитической активности по сравнению со свободным ферментом, иммобилизованным на поверхности графита. Эти данные находятся в качественном соответствии с данными, полученными для гомогенного катализа (рис. 1). При этом, биоэлектрокаталитическая активность комплекса 100 выше активности свободного фермента, а стабильность сигнала ферментного электрода на основе комплекса 100 существенно превышет стабильность электродов, модифицированных свободной тирозиназой. Тирозиназа в комплексе 100, иммобилизованная на поверхности графита, была

биоэлектрокатапитически активна (сохранение до 90% от исходной активности) в течение недели. Графитовые электроды, модифицированные свободной тирозиназой, показали непрерывное 10% уменьшение сигнала в течение каждых 20 мин вследствие смыва тирозиназы с поверхности электрода, что значительно усложняло исследования рН зависимости.

Таким образом, использование нековапентного комплекса тирозиназы с полибреном, комплекса 100, позволило существенно повысить стабильность и, в определенной степени, активность тирозиназного электрода в области рН 4.5-7.0.

Этанол, % об.

Рис 9 Зависимость биоэлекгрокаталитической активности свободной тарозиназы (•) и тирочин.тш в комплексе 100 (О) иммобилизованных на поверхности графитового электрода от содержания этанола в водно-этанольных смесях. Биоэлектрокаталягаческий отклик электродов определялся по максимому каталитического тока восстановления кислорода на циклических вольтамперограммах в присутствии 6.7х10"5 М пирокатехина, цри скорости развертки потенциала 50 мВ с'1. Данные вставлены на ток в фоновом электролите

При переходе к водно-зтачольным смесям, наблюдалось уменьшение биоэлектрокаталитической активности тирозиназы, как в свободной форме, так и в комплексе 100. С увеличением содержания этанола до 40%, активность тирозиназного электрода уменьшалась в 2 раза (комплекс 100) и в 2.5 раза (свободная тирозиназа). При высоких концентрациях этанола - 95% тирозиназа, как в свободной форме, так и в комплексе 100, полностью теряла биоэлектрокатапитиескую активность. Однако для комплекса 100 был получен существенный

стабилизационный эффект в области малых концентраций этанола (до 20%), когда биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в комплексе 100 не менялась и сохранялась близкой к исходной активности, характерной для водных растворов (рис. 9). При этом, стабильность сигнала ферментного электрода, приготовленного с использованием комплекса 100, значительно превышала стабильность простого тирозиназного электрода. Это позволяет использовать электроды созданные на основе нековапентных комплексов тирозиназы с полиэлектролитами многократно в течение продолжительного времени для анализа фенолсодержащих образцов в средах с малым содержанием этанола до 20%.

5. Биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в системе обращенных мицелл в водной среде.

Наличие оптимума каталитической активности тирозиназы в системе обращенных мицелл при степени гидратации 25 (раздел 2), обусловило проведение дальнейших экспериментов при этой величине степени гидратации.

Были разработаны несколько схем иммобилизации тирозиназы, наиболее эффективной оказалась схема приведенная на рис. 10. Процедура модификации электродов тирозиназой включенной в систему обращенных мицелл состояла из трех этапов:

а) включение тирозиназы в систему обращенных мицелл приготовленных с использованием смеси низкомолекулярного и высокомолекулярного органических неполярных компонентов: октан и природный каучук;

б) нанесение тирозиназы включенной в систему обращенных мицелл, в смеси неполярных органических компонентов, на поверхность золотого электрода;

в) заключительный этап: после испарения октана из нанесенного слоя, содержащая тирозиназу пленка дополнительно стабилизировалась нафионовой мембраной, образующейся после нанесения раствора нафиона в этаноле.

Пленка, содержащая тирозиназу в обращенных мицеллах с каучуком и покрытая сверху слоем нафиона, обеспечила эффективный и стабильный биоэлектрокатализ тирозиназой в водном растворе: данные по

биоэлектрокаталитической активности тирозиназы, иммобилизованной согласно схеме приведенной на рис 10, представлены на рис. 11.

ЛОТ октан

Шфчук

ЛОТ

аыдпрж октан

фермент войл

о о о

ОаюяояО

ООО

о°о°о° оажо

[золотой электрод

ОиОсж^ш-У<20 Си

I золотой электрод

с

-I золо/лой электрод

золотой электрод

Рис 10 Процедура получения препаратов тирозиназы включенной в систему иммобилизованных обращенных мицелл

Из циклических вольтамперограмм, полученных при различных концентрациях пирокатехина, была построена калибровочная зависимость эффективности биоэлектрокатализа от концентрации пирокатехина (вставка рис. 11) Амперометрический отклик полученный в системе стабилизированной нафионовой мембраной сравним с данными полученными в обращенных мицеллах без нафиона, однако электроды дополнительно стабилизированные нафионом, сохраняли постоянную биоэлектрокатапитическую активность (см. табл. 2).

Рис 11. Циклические вольтамперограммы для золотых электродов, модифицированных «пустыми» обращенными мицеллами с каучуком и стабилизированными нафионом (1, 2) и мицеллами содержащими тирозиназу (3), (2), (3) в присутствии 0 5x1 ГГ4 М пирокатехина 4 мМ цитрат - фосфатный буфер, рН 6 О, скорость развертки потенциала 50 мВ с'1. Вставка: Калибровочная зависимость электрохимического отклика в системе от концентрации пирокатехина

6. Биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в ацетонитриле

Результаты по стабилизации тирозиназы на поверхности электрода, полученные в водной среде, позволили предположить, что тирозиназа, иммобилизованная в системе обращенных мицелл, должна быть устойчива также и в других полярных растворителях. Принимая во внимание, что одним из основных органических растворителей, использующихся в пробоподготовке для анализа фенолов, наряду с октаном и этаном, является ацетонитрил, последующие исследования проводились в ацетонитриле. Для сохранения постоянной ионной силы и поддержания необходимой электропроводности ацетонитрила использовалась органическая соль - тетрабутиламмоний перхлорат - (CiHy+NClC^

На вставке рис. 12 представлены вольтамперограммы, соответствующие окислению - восстановлению пирокатехина на золотом электроде в ацетонитриле. Обратимость пиков окисления-воостановления пирокатехина на электроде в ацетонитриле (рис. 12) по сравнению с водной средой (рис. 7) меньше и характеризуется расстоянием между пиками 750 мВ и 60 мВ, в ацетонитриле и в воде, соответственно. Уменьшение обратимости пиков в ацетонитриле может

объясняться изменением физико-химических параметров среды, таких как диэлектрическая проницаемость, полярность и т.д Обратимость пиков окисления -восстановления пирокатехина в ацетонитриле на электродах модифицированных каучуком и нафионом оказывается еще ниже, чем на немодифицированных золотых электродах. Так, пик восстановления пирокатехина смещается в еще более отрицательную область потенциалов, а пик окисления смещается в область потенциалов образования поверхностных оксидов золота Тем не менее, для электродов, модифицированных тирозиназои в мицеллах, в присутствии пирокатехина получена явно выраженная каталитическая волна восстановления кислорода (рис. 12, кривая 3).

Рис 12 Циклические вольтамперограммы для -золотого электрода, модифицированного «пустыми» обращенными мицеллами с каучуком покрытые нафионом (1,2) и при включении тирозкназы (Ч), (2), (3) в присутствии 1.5x10"' М пирокатехина Ацегонетрил, содержащий 4 мМ (СДУ^ИСЮ,,, скорость развертки потенциала 500 мВ с*' Вставка циклические вольтамперограммы для золотого элекрода в ацегоншриле содержащем 4 мМ (СДОДМСЮ« в присутствии 1 5x10-4 М пирокатехина, скорости развертки (1) 50 и (2) 500 мВ с'1

Ь'иоэлекгрохимический отклик ферментных электродов в ацетонитриле оказался выше, чем в водной системе (рис. 11 и рис. 12), и был сравним с активностью тирозиназы, адсорбированной непосредственно на золотом электроде (рис. 7, табл. 2). Это может объясняться большей растворимостью кислорода воздуха в ацетонитриле по сравнению с водой.

Таким образом, сохранение каталитической активности тирозиназы, включенной в обращенные мицеллы на электроде в среде ацетонитрила позволяет определять фенолы непосредственно в органической фазе, с неменьшей чем в водной среде чувствительностью определения.

7. Использование спрэй-технологии для иммобилизации тирозиназы на твердых носителях (электроде)

Одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений в биотехнологии является миниатюризация биосенсоров, т.е. уменьшение геометрических размеров сенсоров, в перспективе направленное на разработку новых чип - технологий. При миниатюризации биосенсоров должны быть решены как минимум две задачи: скорость и воспроизводимость изготовления биосенсора и его удешевление. В биоэлектрохимии удешевления ферментного электрода можно добиться за счет уменьшения количества биоматериала, наносимого на поверхность электрода и за счет удешевления стоимости самой электропроводящей подложки.

Одним из решений задачи миниатюризации является метод трафаретной печати, использующийся для создания ферментных электродов. Для этого готовятся «чернила» на основе графитового порошка, содержащие фермент. «Чернила» через специальную «маску» наносятся на подложку. Однако, получаемые таким образом ферментные электроды, как правило, плохо воспроизводимы и требуют высоких концентраций фермента. Использование спрей-технологии, т.е. технологии аэрозольного распыления как метода физической иммобилизации фермента на твердом носителе, позволяет уменьшить толщину наносимого слоя, а значит и количество израсходованного фермента. В свою очередь, спрей-технология имеет ряд ограничений, таких как стабильность вещества в диспергированном состоянии и устойчивость в органическом растворителе, который используется как основная фаза аэрозоля.

Для стабилизации фермента при изготовлении «чернил» может быть использована разработанная методика получения каталитически активного препарата фермента в системе обращенных мицелл (часть 5). Схема иммобилизации тирозиназы, адаптированная для процедуры изготовления электродов методом

(

трафаретной печати, приведена на рис. 13. Как и схема, представленная на рис. 10, схема представленная на рис. 13 состоит из 3 этапов:

а) создание «чернил». Для этого в содержащий фермент мицеллярный раствор, приготовленный на основе смеси неполярных соединений, добавляли взвесь графитового порошка в октане;

б) аэрозольное распыление полученных «чернил» на твердый носитель;

* в) распыление раствора нафиона в этаноле для получения нафионовой

мембраны.

1

[золотой электрод

золотой электрод

золотой электрод1

Золотой электрод

Рис 13 Процедура нанесения графитовых «чернил», содержащих тиротиназу в системе обращенных мицелл, на твердый носитель

На рис. 14 представлены данные амперометрических измерений на тирозиназных электродах приготовленных по схеме приведенной на рис. 13. Амперометрические измерения проводились при значении потенциала -50 мВ, соответствующем оптимуму биоэлектрокаталитической активности системы, определенному из циклических вольтамперограмм (вставка рис 14) Амперометрический отклик при пошаговом введении в систему 10 мкМ пирокатехина составил 0.6-0.8 мкА, что соответствует чувствительности 2.25±0.25 А

М"1 см"2, с пределом обнаружения пирокатехина 0.1 мкМ Электроды, полученные методом трафаретной печати, с использованием спрей-технологии распыления тирозиназы на твердый носитель, сохраняли каталитическую активность в течение 2 часов, о чем свидетельствовало постоянство изменения амперометрического сигнала при введении

о -1

!"2 -3

-4

-5

Рис 14 Амперометрические калибровочные зависимости, полученные в режиме размешивания, при пошаговом впрыскивании 10 мкМ пирокатехина в систему Кривая 2 - ачперомепрический сигнал после 2 ч хранения электрода при компатной температуре Эксперимент проводили ттрк -50 мВ, в 4 мМ нитрат -фосфатном буфере, рН 6 0 Вставка циклические вольтамперограммы для золотого электрода, модифицированного по схеме приведенной на рис. 13, в отсутствие (I) и в присутствие (2) 4 мкМ пирокатехина Эксперимент Гфоводили в тех же условиях 'пр и на основном рисунке, скорость развертки потенциала 50 мВ с"'.

При 2 ч хранении тирозиназных электродов при комнатной температуре электрокаталитическая активность электродов составила более 80 % от начальной, что, несомненно, позволяет использовать электроды, полученные методом трафаретной печати при спрэй-распылении тирозиназы на твердый носитель, многократно.

Суммированные биоэлектрокаталитические данные частей 4-7 представлены в таблице 2. Как следует из данных, тирозиназа, иммобилизованная на поверхности золотого электрода как напрямую, так и включенная в систему обращенных мицелл,

в систему равных количеств пирокатехина.

Время, с

сохраняет свою каталитическую активность. Однако фермент вымывается с поверхности электрода. Биоэлектрокатапитическая активность электродов, модифицированных тирозиназой в системе обращенных мицелл и дополнительно стабилизированная пленкой нафисна сравнима с активностью тирозиназы, физически адсорбированной на поверхности электрода в водных средах и выше в ацеггонитриле по сравнению с водной средой. При этом, в ацетонитриле электрод, модифицированный тирозиназой в мицеллах, демонстрирует чувствительность и стабильность определения пирокатехина превышающие полученные ранее в водных средах.

Таблица 2. Электрохимический отклик от электродов модифицированных, соответствующий максимуму

каталитического восстановления кислорода** при концентрации пирокатехина 0.15 мМ

Модификация /условия Тирозиназа, водпый буфер, ОмВ Тирозиназа в мицеллах, водный буфер, +50 мВ. Тирозиназа в мицеллах с каучуком, водный буфер, -50 мВ Тирозиназа в системе обращенных мицелл содержащих каучук и стабилизированы дополнительно пафиоиовой мембраной

водный буфер, -150 мВ адето нитрил, -500 мВ графитовый порошок, водный буфер, -50 мВ

1, мкА -45 -40 -2 5 -2.9 -4 3 -3 5

Стабильность во времени * 25 мин 10мин 20 мин 2ч 2ч 2ч

* сохранение до 80% активности

** Длимые получены из циклических вольтамнерограмм при скорости развертки 50 мВ с'1.

ВЫВОДЫ

1. Впервые получены и ксследованы комплексы тирозйназы с полибреном, в молярных соотношениях тирозиназа/полибрен 1:10 - 1:500. Найдено, что в комплексах с полибреном тирозиназа сохраняет каталитическую активность в водных и водно-этанольных смесях в широком диапазоне содержания спирта - до 70% об Показано, что тирозиназа в составе комплекса с полибреном 1:100 характеризуется повышенной каталитической активностью (в 2 - 10 раз) по сравнению со свободным ферментом.

2. Тирозиназа сохраняет каталитическую активность при включении ее в систему обращенных мицелл в октане. Исследована зависимость каталитической

активности тирозиназы в реакции окисления пирокахетина от степени гидратации мицелл в системе АОТ - вода - октан Найдено, что зависимость максимальной скорости реакции от степени гидратации АОТ описывается кривой с двумя максимумами, что указывает на возможность функционирования фермента в виде различных олигомерных форм. Положение максимумов каталитической активности соответствует степеням гидратации 12 и 25. При степени гидратации 25 каталитическая активность тирозиназы соллюбилизированной в системе обращенных мицелл соизмерима с каталитической активностью тирозиназы в водной системе.

3. Исследована каталитическая активность тирозиназы физически иммобилизованной на твердом носителе в водной и органической средах. Показана высокая каталитическая активность фермента в водных растворах и полная инактивация тирозиназы в «сухом» ацетонитриле и этаноле.

4 Разработан тирозиназный электрод для определения фенолов в водно-этанольных смесях и основанный на иммобилизованной на носителе тирозиназе в нековапентном комплексе с полибреном. Показано, что биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в комплексе выше, чем биоэлектрокаталитическая активность свободной тирозиназы. Разработанные электроды обладают значительно более высокой стабильностью при хранении (в десятки раз) и операционной стабильностью (в сотни раз) по сравнению со свободной тирозиназой как в водных, так и в водно-органических смесях.

5 Разработан тирозиназный электрод для определения фенолов в органических средах и основанный на тирозиназе в системе обращенных мицелл, иммобилизованных в каучуке. Показано, что каталитическая активность тирозиназы в системе иммобилизованных обращенных мицелл, дополнительно стабилизированных нафионовой мембраной, в «сухом» ацетонитриле выше, чем в водной среде.

6. Впервые показана принципиальная возможность использования аэрозольной спрэй-технологии для получения биосенсоров методом трафаретной печати путем прямого распыления на носитель органических «чернил». Для этого разработана методика стабилизации тирозиназы обращенными мицеллами, включенными в графитизированные органические «чернила».

Список работ по теме диссертации:

1. С.В. Шиповсков. // Включение лакказы в систему обращенных мицелл для изготовления ферментного электрода. Международная конференция «Ломоносов - 98», Москва, 1998, с. 23.

2. Shipovskov S., Belova А, Klyachko N. // Laccase alteration for biosensors International conference "NATO-ASI 1999: Enzymes in heteroatom chemistry. A green solution of chemical problems", Berg en Dal, The Netherlands, 1999, June 19-30, p. 119.

3. Shipovskov S., Ferapontova E., Smirnov S, Belova A., Koroleva O., Levashov A., Klyachko N. // Effect of pH on laccase electroreduction on gold and on reduction with substrate of different nature. XVI International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 1-6 June 2001, Bratislava, Slovakia, p. 24.

4. Shipovskov S., Belova A , Klyachko N. // Adaptation of laccase for enzyme electrode. XVI International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 1-6 June 2001, Bratislava, Slovakia, p. 132.

5. Shipovskov S., Ferapontova E., Ruzgas Т., Levashov A. // Implementation of tyrosinase-revensed micelles system for bioelectrochemical detection of phenolics in aqueous and acetonitrile media XIV International Symposium "Surfactant in Solution", Barcelona, Spain, 2002, June 9-14, p. 174.

6. Shipovskov S., Ferapontova E., Ruzgas Т., Levashov A. // Stabilization of tyrosinase by reversed micelles for bioelectrocatalysis in dry organic media. Biochimica et Biophysica Acta 2003, v. 1620 (1-3), p. 119-124.

7. Shipovskov S , Christenson A., Ruzgas Т., Levashov A. // Development of biosensor by spraying enzyme in reverse micelles VII Meeting of ERMIS "Electrode Reaction Mechanism and Interfacial Structure", Koningstein, Germany, 2003, April 3-6, p. 23.

8 Shipovskov S., Levashov A. // Tyrosinase-polybrene noncovalent complexes in water-ethanol mixtures. Biotechnology & Bioengineering2003, v. 84, p. 168-172.

9. Shipovskov S., Levashov A // Entrapping of tyrosinase in a system of reverse micelles. Biocatalysis and Biotransformation 2003, v. 21, p. 391-396.

ООП Фшф-та МГУ Зак 85-100-

I i

I

V

í

}

i

loo?-к

P13 6 2 4

1. Список сокращений

2. Введение

3. Обзор литературы

3.1. Стабильность ферментов в органических средах

3.1.1. Гомогенные растворы ферментов

3.1.2. Гетерогенные системы, содержащие фермент

3.2. Подходы к стабилизации ферментов в органических средах

3.3. Нековалентные комплексы полиэлектролитов

3.3.1. Интерполиэлектролитные комплексы

3.3.2. Белок - полиэлектролитные комплексы

3.3.3. Каталитические свойства и стабильность ферментов в 32 комплексе с полиэлектролитом

3.4. Тирозиназа - полифенолоксидаза

3.4.1. Физиологическая роль тирозиназы, методы очистки и 35 механизм катализа

3.4.2. Тирозиназа в органических средах

3.4.3. Некоторые аспекты применения тирозиназы в биосенсорах

4. Постановка задачи

5. Экспериментальная часть

5.1. Реагенты и приборы

5.2. Методы

5.2.1. Приготовление комплекса фермента с поликатионом

5.2.2. Определение каталитической активности тирозиназы в водных 48 растворах

5.2.3. Определение каталитической активности тирозиназы в системе 48 обращенных мицелл

5.2.4. Определение каталитической активности нативной тирозиназы 49 и в нековалентных комплексах с полиэлектролитами в водно-этанольной системе

5.2.5. Модификации элетродов и проведения электрохимических измерений

6. Результаты и обсуждение

6.1. Нековалентные комплексы тирозиназа с полибреном

6.1.1. Каталитическая активность комплексов в водных растворах: 52 рН - зависимость

6.1.2. Каталитическая активность комплексов тирозиназа с 57 полибреном в водно - этанольных смесях

6.2. Каталитическая активность тирозиназы в системе обращенных 65 мицелл

6.3. Биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в водной среде: 67 рН - зависимость

6.4. Биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в комплексе с 73 полиэлектролитом в водных и водно-этанольных системах

6.5. Биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в системе 79 обращенных мицелл в водной среде

6.6. Биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в ацетонитриле

6.7. Использование спрэй технологии для иммобилизации тирозиназы 91 на твердом носителе (электроде)

7. Выводы

Фенолы и их производные относятся к группе опасных органических соединений загрязняющих окружающую среду. Одним из основных источников фенолов и их производных являются продукты переработки древесины и отходы целюлозо-бумажной промышленности. Другим источником производных фенолов - алкилфенолов, являются продукты деградации неионных поверхностно-активных веществ - алкилфенолполиэтоксилатов (АФПЭ), применяемых в быту, текстильной, пищевой и лако-красочной промышленностях для обработки поверхностей металлов и в качестве диспергирующих агентов и эмульгаторов. В процессе ирригации сточных вод АФПЭ и продукты их деградации попадают в почву и водоемы и вследствие своей химической устойчивости накапливаются в речных и морских отложениях.В связи с этим, разработка высокоэффективных методов анализа/определения фенолов в окружающей среде представляет собой актуальную биотехнологическую задачу. Одним из ее решений является создание биосенсоров на основе электрохимических методов, т.е. разработка высокочувствительных ферментных электродов. Одним из ферментов, на основе которого создаются ферментные электроды для определения фенолов и их производных, является тирозиназа - медьсодержащая оксидоредуктаза, катализирующая окисление фенолов и их производных кислородом воздуха.Биосенсоры на основе тирозиназы уже применяются для мониторинга сточных вод в промышленности, однако данные сенсоры требуют продолжительной и сложной пробоподготовки, основным этапом которой является концентрирование определяемых веществ в органических растворителях, таких как ацетонитрил, этанол и их смеси, с последующим растворением в «дружественной» для ферментов водной системе. Данные биосенсоры также имеют ряд недостатков, связанных с ограниченной диффузией субстратов в пленках/системах иммобилизованных ферментов и протеканием неферментативной полимеризации продуктов реакции в водных средах, что затрудняет анализ и приводит к снижению чувствительности сенсора.Возможность работы сенсора в органических средах позволяет повысить эффективность определения фенолов. В частности, переход от водных сред неводным средам может дать следующие преимущества в анализе, а именно: упростить процедуру пробоподготовки за счет уменьшения количества/длительности ее этапов; - уменьшить, так называемые, «диффузионные ограничения», благодаря большей растворимости кислорода/фенолов во многих органических средах по сравнению с водой; - избежать отравления сенсора продуктами неферментативной реакции полимеризации, которая является рН - зависимой и можно предположить ее нивелирование в органических средах. Таким образом, одним из путей эволюции биосеносоров на основе тирозиназы для определения фенолов является разработка методов стабилизации каталитической активности и увеличение операционной стабильности тирозиназы как в полярных, так и неполярных органических системах, что позволит получить иммобилизованный препарат фермента успешно применяемый в биоэлектрокатализе.Целью настоящей работы является изучение закономерностей поведения тирозиназы как в гомогенных, так и в гетерогенных водноорганических средах и разработка путей стабилизации фермента для целей биоэлектрокатализа.

1. Впервые получены и исследованы комплексы тирозиназы с полибреном, в молярных соотношениях тирозиназа/полибрен 1:10 - 1:500.Найдено, что в комплексах с полибреном тирозиназа сохраняет каталитическую активность в водных и водно-этанольных смесях в широком диапазоне содержания спирта — до 70% об. Показано, что тирозиназа в составе комплекса с полибреном 1:100 характеризуется повышенной каталитической активностью (в 2 - 1 0 раз) по сравнению со свободным ферментом.2. Тирозиназа сохраняет каталитическую активность при включении ее в систему обращенных мицелл в октане. Исследована зависимость каталитической активности тирозиназы в реакции окисления пирокахетина от степени гидратации мицелл в системе АОТ - вода - октан. Найдено, что зависимость максимальной скорости реакции от степени гидратации АОТ описывается кривой с двумя максимумами, что указывает на возможность функционирования фермента в виде различных олигомерных форм. Положение максимумов каталитической активности соответствует степеням гидратации 12 и 25. При степени гидратации 25 каталитическая активность тирозиназы соллюбилизированной в системе обращенных мицелл соизмерима с каталитической активностью тирозиназы в водной системе.3. Исследована каталитическая активность тирозиназы физически иммобилизованной на твердом носителе в водной и органической средах.Показана высокая каталитическая активность фермента в водных растворах и полная инактивация тирозиназы в «сухом» ацетонитриле и этаноле.4. Разработан тирозиназный электрод для определения фенолов в водно этанольных смесях и основанный на иммобилизованной на носителе тирозиназе в нековалентном комплексе с полибреном. Показано, что биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в комплексе выше, чем биоэлектрокаталитическая активность свободной тирозиназы. Разработанные электроды обладают значительно более высокой стабильностью при хранении (в десятки раз) и операционной стабильностью (в сотни раз) по сравнению со свободной тирозиназой как в водных, так и в водно-органических смесях.5. Разработан тирозиназный электрод для определения фенолов в органических средах и основанный на тирозиназе в системе обращенных мицелл иммобилизованных в каучуке. Показано, что каталитическая активность тирозиназы в системе иммобилизованных обращенных мицелл, дополнительно стабилизированных нафионовой мембраной, в «сухом» ацетонитриле выше, чем в водной среде.6. Впервые показана принципиальная возможность использования аэрозольной спрэй-технологии для получения биосенсоров методом трафаретной печати путем прямого распыления на носитель органических «чернил». Для этого разработана методика стабилизации тирозиназы обращенными мицеллами, включенными в графитизированные органические «чернила».Автор выражает глубокую благодарность: • д.х.н. проф. А.В. Левашову за постоянное внимание и оптимизм в ^ обсуждении результатов; • д.х.н. проф. Н.Л. Клячко за интерес и помощь в освоении экспериментальных методов биохимии и энзимологии; • проф. Т. Рузгасу (кафедра Аналитической Химии, Лундский Университет

(Швеция)) за сотрудничество и за предоставленную возможность проведения части экспериментов; • к.х.н. н.с. Е.Э. Ферапонтовой (кафедра Аналитической Химии, Лундский Университет (Швеция)) за помощь в постановке и обсуждение ' ^ электрохимических экспериментов; • К.Х.Н., н.с. П.В. Самулееву (кафедра Неорганической Химии, Лундский Университет (Швеция)) за обсуждение тезисов; • проф. К.Т. Рейману (кафедра Аналитической Химии, Лундский Университет (Швеция)) за безупречное знание английского языка и «орлиный глаз».• А. Кристенсону (кафедра Аналитической Химии, Лундский Университет

(Швеция)) за помощь в разработке спрэй-метода и за отстаивание общих •*^ ^ интересов в неравной борьбе с «датским монстром».• проф. Е. Домингес (кафедра Аналитической и Инженерной Химии, Университет Алкалы (Испания)) за возможность проведения предварительных экспериментов; • сотрудникам и «выпускникам» кафедры Химической Энзимологии Химического Факультета МГУ за обучение, помощь и «поддержку» в работе; • родителям, родственникам и друзьям за проявленное терпение и понимание.

1. Левашов, А.В., Клячко, Н.Л. (2001) Мицеллярная энзимология: методология и технология. Язе. АН. Сер. Хим. 50,1718-1732.

2. Lee, M.Y., Dordick J.S., (2002) Enzyme activation in nonaqueous media. Current Opinion in Biotechn., 13, 376-384.

3. Klibanov, A.M. (2001) Improving enzymes by using them in organic solvent. Nature (London). 409, 241-246.

4. Khmelnitsky, Y.L., Rich, J.O. (1999) Biocatalysis in nonaqueous solutions. Current Opinion in Chem. Biol., 3, 47-53.

5. Mozhaev, V.V. (1998) Engineering stability of enzjmies in system with organic solvents. Progress in Biotechn., 15, 355-363.

6. Mozhaev, V.V., Berezin, LV., Martinek, K. (1988) Structure-stability relationship in proteins: fundamental tasks and strategy for the development of stabilized enzyme catalysts for biotechnology. CRC Critical Reviews in Biochemistry, lb, 235-281.

7. Гладилин, A.K., Левашов, A.B. (1996) Катализ надмолекулярными фермент- полимерными комплексами (ассоциатами) в органических средах. Успехи биол. химии, 36,141-161.

8. Шульц, Г., Ширмер, Г. (1982) Принципы структурной организации белков. Мир, Москва, 354 с.

9. Wangikar, P.P., Michels, Р.С, Clark, Р.С, Dordick, J.S. (1997) Structure and function of subtilisin BPN solubilized in organic solvents. / Am. Chem. Soc, 119,70-76. v^'

10. Vakurov, A.V., Gladilin, A.K., Partridge, J., Mozhaev, V.V., Levashov, A.V., Hailing, P. (1996) Non-covalent enzyme-polyelectrolyte complexes as self-buffered catalysts for use in low-water organic media. Biotechnol. Tech., 10, 621-624.

11. Bundy, H.F., Moore, R.L. (1966) Chymotrypsin-catalyzed hydrolysis of m-, p- and o-nitroanilides ofN-benzoyl-L-tyrosine. Biochemistry, 5, 808-811.

12. Sakurai, H, Shinohara, K., Hisabori, Т., Shinohara, K. (1981) Enhancement of adenosine triphosphatase activity of purified chloroplast coupling factor 1 in an aqueous organic solvent. J. Biochem., 90, 95-102.

13. Fink, A.L. (1974) The effect of dimethyl sulfoxide on the interaction of proflavine with a-chymotrypsin. Biochemistry, 13, 277-280. -лг" X

14. Levitsky, V., Lozano, P., Gladilin, A., Iborra, J.L. (1998) Stability о immobilized enzyme-polyelectrolyte complex against irreversible inactivation by organic solvents. Prog. Biotech., 15,417-422.

15. Zaks, A., KJibanov, A.M. (1988) The effect of water on enzyme action in organic media. J. Biol Chem., 263, 8017-8021.

16. Kuhl, P., Hailing, P.J. (1991) Salt hydrates buffer water activity during chymotrypsin-catalysed peptide synthesis. Biochim. Biophys. Acta, 1078, 326-334.

17. Eisenbach, M., Caplan, S. R., Tanny, G. (1979) Interaction of purple membrane with solvents. 1. Applicability of solubility parameter mapping. Biochim. Biophys. Acta, 554, 269-280.

18. Jackson, M., Mantsch, H.H. (1991) Beware of proteins in DMSO. Biochim. Biophys. Acta, 1078, 231-235.

19. Veluicelebi, G., Sturtevant, J.M. (1979) Thermodynamics of the denaturation of lysosyme in alcohol-water mixtures. Biochemistry, 18, 1180-1186.

20. Gething, M.-J., Sambrook, J. (1992) Protein folding in the cell. Nature, 355, 33-44.

21. Murphy, A., Fagain, CO. (1996) Stability characteristics of chemically-modified soluble trypsin./. Biotechnol. 49, 163-171.

22. LeJeune, K.E., Mesiano, A.J., Bower, S.B., Grimsley, J.K., Wild, J.R., Rassel, A.J. (1997) Dramatically stabilized phosphotriesterase-polymers for nerve agent degradation, ^/ог'ес/гио/. Bioeng., 54, 105-114.

23. Clark, D.S., Shubhada, S., Sundaram, P.V. (1995) The role of pH change caused by the addition of water-miscible organic solvents in the destabilization of an enzyme. Enzyme. Microb. Technol, 17, 330-335.

24. Fitzpatrick, P.A., Klibanov, A.M. (1991) How can the solvent affect enzyme action in organic solvents? J. Am. Chem. Soc, 113, 3166-3171.

25. Parida, S., Dordick, J.S. (1991) Substrate structure and solvent hydrophobicity control lipase catalysis and enantioselectivity in organic media. J. Am. Chem. Soc, 113,2253-2259. ч/ -s^

26. Valivety, R.H., Hailing, P.J., Macrae, A.R. (1992) Reaction rate with lypase catalyst shows similar dependence on water activity in different organic solvents. Biochim. Biophys. Acta. 1118,218-222.

27. Affleck, R., Xu, Z.-F., Suzava, V., Focht, K., Clark, D.S., Dordick, J.S. (1992) Enzymatic catalysis and dynamics in low-water environments. Proc. Natl. Acad. Sol t/.5.A, 89,1100-1104.

28. Ghatorae, A.S., Bell, G., Hailing, P.J. (1994) Inactivation of enzyme by organic solvents: new technique with well-defined interfacial area. Biotechnol. Bioeng., 43,331-336.

29. Blanco, R., Rakels, J.L.L., Guisan, J.M., Hailing, P.J. (1992) Effect of thermodynamic water activity on aminoacid ester synthesis catalyzed by agarose-chymotrypsin in 3-pentanone. Biochim. Biophys. Acta, 1156, 67-70.

30. Hailing, P.J. (1992) Salt hydrates for water activity control with biocatalysts in organic media. Biotechnol Tech., 6, 271-276.

31. Hailing, P.J. (1990) High affinity binding of water by proteins is similar in air and in organic solvents. Biochim. Biophys. Acta, 1040, 225-228.

32. Gorman, L.S., Dordick, J.S. (1992) Organic solvents strip water off enzymes. Biotechnol. Bioeng., 39, 392-397.

33. Dong, A., Meyer, J.D., Kendrick, B.S., Manning, M.C., Сафетег, J.F. (1996) Effect of secondary structure on the activity of enzymes suspended in organic solvents. Arch. Biochem. Biophys., 334,406-414.

34. Zaks, A., Klibanov, A.M. (1988) Enzymatic catalysis in nonaqueous solvents. J. Biol. Chem., 263,3194-3201.

35. Affleck, R., Haynes, C.A., Clark, D.S. (1992) Solvent dielectric effects on protein dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 5167-5170.

36. Griebenow, K., Klibanov, A.M. (1997) Can conformational changes be responsible for solvent and excipient effects on the catalytic behavior of subtilisin Carsberg in organic solvents? Biotechnol. Bioeng., 53, 351-362.

37. Partridge, J., Hutcheeon, G.A., Moore, B.D., Hailing, P.J. (1996) Exploiting hydration hysteresis for high activity of cross-linked subtilisin crystals in acetonitrile. J. Am. Chem. Sac, 118,12873-12877. Ч/^ V -

38. Жоли, М. (1968) Физическая химия денатурации белков М.: Мир, 364 с.

39. Khmelnitsky, Yu.L., Kabanov, A.V., Klyachko, N.L., Levashov, A.V., Martinek, K. (1989) Enzymatic catalysis in reverse micelles. In: Structure and Reactivity in Reverse Micelles (Pileni, M.P., ed.), Elsevier, Amsterdam, 230-261.

40. Levashov, A.V., Klyachko, N.L. (1995) Micellar enzymology for enzyme engineering. Ideas and realization. Annals N. Y. Acad. Sci., 750, 80-84.

41. Mittal, KL., Lindman, B. (1984) Surfactants in solution. New York: Plenum Press.

42. Day, R.A., Robinson, B.H., Clarke, J.H.R., Doherty, J.V. (1979) Characterization of water-containing reversed micelles by viscosity and dynamic light scaterring methods. J. Chem. Soc, Faraday Trans. I, IS, 132-139.

43. MuUer, N. (1975) A multiple-equilibrium model for the micellization of ionic surfactants in nonaqueous solvents. J. Phys. Chem., 79,287-291.

44. Yamashita, Т., Yano, H., Harada, S., Yasunaga, R. (1982) Kinetic studies of the micelle system of octilammonium alkanoates in hexane solution by the ultrasonic absorbtion method. Bull. Chem. Soc. Japan, 55, 3403-3406.

45. Lindman В., Stilbs P., Moseley M. E. (1981) Fourier transform NMR self-diffusion and microemulsion structure. J. Colloid Interface Sci., 83, 569-582.

46. David, G.G., Morris, D.F., Short, E.L. (1981) Aggregation of a hquid cation exchanger. J. Colloid Interface Sci., 92, 226-232.

47. Cebula, D.J., Myers, D.Y., Ottewill, R.H. (1982) Studies of microemulsions. Part

48. Scattering studies of water-in-oil microemulsions. Colloid Polym. Sci., 260, 96-107.

49. Wong, M., Thomas, J.K., Gratzel, M. (1976) Fluorescence probing of inverted micelles. The state of solubilized water clusters in alkane/diisooctylsulphosuccinate (Aerosol ОТ) solution. J. Am. Chem. Soc, 98, 2391-2397.

50. Мартинек, К., Левашов, А.В., Клячко, Н.Л., Березин, И.В. (1977) Катализ водорастворимыми ферментами в органических растворителях. Стабилизация фермента путем включения в обращенные мицеллы. Докл. - ^ Акад. Наук СССР, 236, 920-923.

51. Levashov, A.V., Khmelnitsky, Yu.L., Klyachko, N.L., Chemyak, V.Ya., Martinek, K. (1982) Enzymes entrapped into organic solvents. Sedimentation analysis of ; the protein - AOT - water - octane system. J. Colloid Interface Sci., 88, 444-457.

52. Левашов, A.B., Клячко, Н.Л., Пантин, В.И., Хмельницкий, Ю.Л., Мартинек, К. (1980) Катализ водорастворимыми ферментами, включенными в обращенные мицеллы ПАВ в неводных растворителях. Биоорг. Хим., 6, 929-943.

53. Хмельницкий, Ю.Л., Левашов, А.В., Клячко, Н.Л., Мартинек, К. (1984) Коллоидный раствор воды в органическом растворителе -микрогетерогенная среда для химических (ферментативных) реакций. Усп. Хим., 53,545-565.

54. Левашов, А.В., Пантин, В.И., Мартинек, К., Березин, И.В. (1980) Кинетическая теория реакций, катализируемых ферментами, солюбилизованными в органических растворителях с помощью ПАВ. Докл. Акад. Наук СССР, 252, 133-136.

55. Мартинек, К., Хмельницкий, Ю.Л., Левашов, А.В., Березин, И.В. (1982) Субстратная специфичность алкогольдегидрогеназы в коллоидном растворе воды в органическом растворителе. Докл. Акад. Наук СССР. 263, 737-741.

56. Kurganov, V.I., Tsetlin, L.G., Malakhova, E.A., Lankin, V.Z., Levashov, A.V., Martinek, K. (1985) A novel approach to study the action of water-insoluble inhibitors on enzymic reactions. J. Biochem. Biophys. Methods, 11, 177-184.

57. Khmelnitsky, Yu.L., Welch, S.H., Clark, D.S., Dordick, J.S. (1994) Salts dramatically enhance activity of enzymes suspended in organic solvents. J. Am. Chem. Soc, 116,2647-2648.

58. Rich, J.O., Dordick, J.S. (1997) Controlling subtilisin activity in organic media by imprinting with nucleophiUc substrate. J. Am. Chem. Soc, 119, 3245-3252.

59. Березин, И.В., Антонов, B.K., Мартинек, К. (1976) Иммобилизованные ферменты. М.: МГУ, т. 1-2.

60. Martinek, К., Mozhaev, V.V. (1985) Immobihzation of enzymes: an approach to fundamental studies in biochemistry. Adv. Enz. Rel. Ar. Mol. Biol, 57,179-249.

61. Березин, И.В., Клячко, Н.Л., Левашов, A.B., Мартинек, К., Можаев, В.В., Хмельницкий, Ю.Л. (1997) Биотехнология, т. 7, Иммобилизованные ферменты. М.: ВШ.

62. Matsushima, А., Kodera, Y., Hiroto, М., Nishimura, Н., Inada. Y. (1996) Bioconjugates of proteins and polyethylene glycol: potent tools in biotechnological processes. J. Mol. Cat. B: Enzym. 2, 1-17.

63. Ke, Т., Wescott, C.R., Klibanov, A.M. (1996) Prediction of the solvent dependence of enzymatic prochiral selectivity by means of structure-based thermodynamic calculations. J. Am. Chem. Soc., 118, 3366-3374.

64. Wescott, C.R., Noritomi, H., Klibanov, A.M. (1996) Rational control of enzymatic enantioselectivity through solvation thermodynamics. / Am. Chem. Soc, 118, 10365-10370.

65. You, L., Arnold, F.A. (1994) Directed evolution of subtilisin E in Bacillus subtilis to enhance total activity in aqueous dimethylformamide. Protein Eng., 9, 77-83.

66. Moore, J.C, Arnold, F.H. (1996) Directed evolution of a para-nitrobenzyl esterase for aqueous-organic solvents. Nature Biotechn., 14,458-467.

67. Изумрудов, В.А., Зезин, А.Б., Кабанов, В.А. (1983) Реакции образования нестехиометричных полиэлектролитных комплексов. Вые. Мол. Соед. А, 25,1972-1978.

68. Бакеев, К.Н., Изумрудов, В.А., Касаикин, В.А., Зезин, А.Б. (1987) Влияние низкомолекулярного электролита на тушение люминесценции в растворах ч ^ НПЭК. Вые. Мол. Соед. Б. 29, 424-428.

69. Бакеев, К.Н., Изумрудов, В.А., Зезин, А.Б., Кабанов, В.А. (1987) Кинетика и механизм реакции образования полиэлектролитных комплексов. Докл. Акад. Наук СССР, 299, 1405-1408.

70. Dubin, P.L., Ross, T.D., Sharma, I., Yegerlehner B.E. (1987) Coacervation of 1 polyelectrolyte-protein complexes. ^ СУ iSywp. Ser. 342, 162-169.

71. Изумрудов, B.A., Зезин, А.Б., Кабанов, В.А. (1984) Кинетика макромолекулярного обмена в растворах комплексов глобулярных белков с полиэлектролитами. ДоА г^. Акад. Наук СССР, 291, 1150-1154.

72. Lopez, R.A., Arce, А., Barra, H.S. (1990) Effect of polyanions and polycations on detyrosination of tubulin and microtubules at steady state. Biochim. Biophys. Acta. 1039,209-217.

73. Mekras, С I. (1989) Inhibition of pepsin by polyions and c.d. studies. Int. J. Biol. Macromol. 11,207-212.

74. Gibson T.D., Woodward J.R. (1990) Stabilization against protein denaturation during drying using cationic polyelectrolytes and cyclic polyols. PCT Int. Appl, 23.

75. Lawton J.B., Mekras C.I. (1985) The effect of polycations on the activity of pepsin. J. Pharmacy Pharmacol, 37 396-400. ч^

76. Eicken, С, Gerdemann, С , Krebs, В. (2001) Catechol oxidase. In: Handbook of Metalloproteins. (Editors: A. Messerschmidt, R. Huber, T. Poulos, K. Weghardt.) 2,1319-1329.

77. Witkop, C.J. (1985) Inherited disorders of pigmentation. Clin. Dermatol, 3, 70-134

78. Rodakiewicz-Nowak, J. (2000) Phenol oxidizing enzymes in water-restricted media. Topics in Catalysis 11,419-434.

79. Whitaker, J.R. (1994) Polyphenol oxidase. FoodSci. Technol 61, 543-556.

80. Mason, H.J., Fowlks, W.B., Peterson, E.W. (1955) Oxygen transfer and electron transport by the phenolase complex. J. Am. Chem. Soc, 11,2914-2915.

81. Mayer, A.M., Harel, E. (1979) Polyphenol oxidases in plants. Phytochemistry, 18, 193-275.

82. Sommer, A., Neeman, E., Steffens, J.C, Mayer, A.M., Harel, E. (1994) Import, targeting, and processing of a plant polyphenol oxidase. Plant. Physiol, 105, 1301-1311.

83. Walker, JR, Ferrar, PH. (1998) Diphenol oxidases, enzyme-catalyzed browning and plant disease resistance. Biotechnol Genet. Eng. Rev., 15, 457-498.

84. Thipyapong, P., Hunt, MD, Steffens, JC. (1995) Systematic wound induction of potato Solanum Tuberosum polyphenol oxidase. Phytochemistry, 40, в1Ъ-Ы6.

85. Kertesz, D., Zito, R. (1965) Mushroom polyphenol oxidase. I. Purification and general properties. Biochim. Biophys. Acta, 96, 447-462.

86. Uiterkamp, A.J.M.S., Evans, L.H., Jolley, R.L., Mason, H.S. (1976) Adsorption and circular dichroism spectra of different forms of mushroom tyrosinase. Biochim. Biophys. Acta., 453, 200.

87. Solomon, E.I., Lowery, M.D. (1993) Electronic structure contribution to function in bioorganic chemistry. Science, 259, 1575-1581.

88. Solomon, EL, Sundaram, UM., Machonkin, ТЕ. (1996) Multicopper oxidases and oxygenases. Chem. Rev. 96, 2563-2605.

89. Brown, R.S., Male, K.B., Luong, H.T. (1994) A substrate recycling assay for phenolic compounds using tyrosinase and NADH. Anal. Biochem., 222, 131-139. u

90. Espin, JC, Garcia-Ruiz, PA., Tudela, J., Garcia-Canovas, F. (1998) Study of stereospecificity in mushroom tyrosinase. Biochem. J., 331, 547-551.

91. Kermasha, S., Вас, H., Bisakowski, B. (2001) Biocatalysis of tyrosinase using catechin as substrate in selected organic solvent media. J. Mol. Cat. B: Enzymatic, 11, 929-938.

92. Burton, SO. (1994) Biocatalysis with polyphenol oxidase: a review. Catalysis Today, 22,459-487.

93. Khbanov, A.M. (1989) Enzymatic catalysis in anhydrous organic solvents. Trends Biochem. Sci., 14,141-144.

94. Gupta, N.M. (1992) Enzyme function in organic solvent. Eur. J. Biochem., 203, 25-32.

95. Chang, S.C, Rawson, K., McNeil, C.J. (2002) Disposable tyrosinase-peroxidase bi-enzyme sensor for amperometric detection of phenols. Biosens. Bioelectr., 17,1015-1023.

96. Campanella, L., Favero, G., Persi, L., Sammartino, M.P., Tomassetti, M., Visco, G. (2001) Organic phase enzyme electrodes: applications and theoretical studies. Anal.Chem.Acta., 426, 235-247.

97. Campanella, L., De Santis, G., Favero, G., Sammartino, M.P., Tomassetti, M. (2001) Two OPEEs (organic phase enzyme electrodes) used to check the percentage water content in hydrophobic foods and drugs. Analyst, 126, 1923-1928.

98. Chen, Т., Embree, H.D., Brown, E.M., Taylor, M.M., Payne, G.F. (2003) Enzyme-catalyzed gel formation of gelatin and chitosan: potential for in situ applications. Biomaterials, 24, 2831-2841.

99. Hoare, J.P. (1984) A cyclic voltammetry study of the gold-oxygen system. J. Electrochem. Soc. 131, 1808-1815.

100. Khmelnitskiy, Y.L., Levashov, A.V., Klyachko, N.L., Martinek, K. (1988) Engineering of biocatalytic systems in organic media with low water content. Enzyme Microb. TechnoL, 10,710-724. \L^I - О

101. Matsushima, A., Okada, M., Inada, Y. (1984) Chymotrypsin modified with polyethylene glycol catalyzes peptide synthesis reaction in benzene. FEBS Lett., 178, 275-277.

102. Kudryashova, E.V., Artemova, T.M., Vinogradov, A.A., Gladilin, A.K., Mozhaev, V.V., Levashov, A.V. (2003) Stabilization and activation of chymotrypsin in water-organic solvent systems by complex formation with oligoamines. Protein Eng., 16, 303-309.

103. Thiele, В., Gunter, K., Schwunger, M.S. (1997) Alkylphenol ethoxylates: Trace analysis and envirormiental behaviuor. Chem. Rev., 97, 3247-3272.

104. Willner, I., Katz, E. (2000) Integration of layered redox proteins and conductive supports for bioelectronic applications. Ang. Chem. Int. Ed, 39, 1181-1218.

105. Kulys, J., Schmid, R.D. (1990) A sensitive enzyme electrode for phenol monitoring, ^wa/. Lett., 23, 589-597.

106. Schultze, J.W., Bressel, A. (2001) Principles of electrochemical micro- and nano- system technologies. Electrochim. Acta, 47, 3-21.

107. Dock, E., Ruzgas, T. (2003) Screen-printed carbon electrodes modified with cellobiose dehydrogenase; amplification factor for catechol vs. reversibility of ferricyanide, Electroanalysis, 15,492-498.

108. Wang, J., Fang, L., Lopez, D. (1994) Amperometric biosensor for phenols based on a tyrosinase-graphite-epoxy biocomposite. Analyst, 119, 455-458.

109. Albareda-Sirvent, M., Merko9i, A., Alegret, S. (2000) Configuration used in the design of screen-printed enzymatic biosensors. A review. Sens. Act. В., 69, 153-163.