Структура хлоропластных генов ячменя psob, psbc, psoh, psoe и psof, кодирующих полипептиды фотосистемы II тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

г :

О1* 54)

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БКООРГАШЧЕСКОЙ КМ им.Ы.М.ЙЕМЯКША

На правах рунотлси УДК 577.113.5

Андреева Александра Владимирэпна.

СГР5КГУ?л ХЛОРСПЛАСТКЫХ ПэтОЧ ЯЧМЕгл рзЪВ, рак;, рзон, рз'ок и ра^У,

кодаруи&х аол/лЕптяа ЙОТОСЙСТЕШ П.

02.00.10 - Биоорганмчоская химия, хкьжя природных. и физиологически згливнкх Ресвств

АВТОРЕФЕРАТ дяосэртации па соисканио ученой степени кандидата химрлеагмх наук

ЖС?<ВА - 1591

Работа выполнена в Институте бисоргакической химии имени М.М.Шейнина Академии наук СССР

Научные руководители-

академик Ю.А. ОВЧШЖОВ доктор химических наук Б.А. ЕФИМОВ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук М.С.Одинцова доктор химических наук Н.Г.Абдулгев

Ведущ&я организация - Институт почвоведения и фотосинтеза А?! СССР.

дании специализированного совета Д СС2 35 01 по застите диссертация на соискание учёной степени доктора наук при Институте бисоргакической химии им.М.М.Шемякина АН СССР по адресу: ¡17871 ГСП Москва-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией мокно ознакомиться ь библиотеке Института биооргзничськоЯ химии им.М.Ы.Шемякина Академии наук СССР.

Защита состоится

и

час. на эасе-

Азтореферат разослан

УчЗнай секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

В. А. НЕСМЕЯНОВ

_____Актуальность проблемы. Исследование процесса фотосинтеза

^рт?щ»йярт&алябт собой одну из фундакэнтзлькых проблем биологии. У высзиП растений процессы фотосинтеза локализованы в хлоропласт ах. Эти оргакэллы обладают собственном геномом, я непосредственно в ido: кодируется значительная чссгь белков, ответственных за фэто-сиктэг,, в том числа полипептады Яятосистемы II. Анализ структурно - фусздцональной организации хлороцластных генов представляет значительный интерес как в фундаментальном отноиении (в частности, для понимания организации геномов в целом я их молекулярной эволюции), так и с практической точки зрения (например, создание сортов гербнцидоустойчивых сельскохозяйственных растений методами гензой нняэнерин, так как именно фотосистема II является мишенью для некоторых гербицидов, блокирующих процесс фотосинтеза и применяемых в сельском хозяйстве).

За последние несколько лет в этом направлении памзтилось значительнее продвижение ветрЭд благодаря тому, что были определены полные куклеотидные последовательности хлоропластнкх гэеомоз двух растений, а именно: печеночного мха ¡lorchantia polymorpha и сосудистого растения Nlcotlana tabacun (табака), а позднее ещЭ одного представителя семейства однодольных - риса {Oryza sativa).

В &то кс время был накоплен богатый фактический материал о структурной организации гонов фотосистемы II у двудольных растений, а также у циансбактерий и одноклеточных зелЗяых водорослей. Однако, для однодольных растений, в том числе для культивируемых злаков, этот вопрос оставался малоизученным.

Таким образом, установление структуры генов, кодируют! полипептиды фотосистемы II ячменя (Ногй&ия vulgare), является существенным вкладом в указанную область исследований.

Цель работа. На ¿тощая работа является частью исследований по установлению первичной структуры полипептидов фотосистемы II ячменя, проводимых в группе белковой инженерии КВХ ик. М.Ы. Шаыя-ккна АН СССР. Работа посвящена определению нукяеотидныг последовательностей геноз psbB, psbH. psbS, psbí. а такзе фрагмента гена psbC. •

Научная новизна и дргктачеекзя ценность работы. На основа вектора pBSM13+ получен набор тюиомбинаЕТннх плэгмвд, содержащих гены рзЬВ и psbH, psbS и рзЬР, а такке фрагмент гена рзЬС. Определены полные нуклеотидные последовательности этих генов и примыкающих к ним оолас-тей, что позволило вывести аминоггаслотага последовательности полипоптидкьк цепей и провеете сравнительный анализ

со структурами этих шяипептвдов из 7 видов наземных растений и цианобактерик ЗупесТюсузИэ 6803 . 3 результате вилслнения настоящей работы созданы условия для ярозэдензя дальнейших исследований по получению мутантных геног Оелкоз фотосистемы II и их экспрессии. Математическая обработка полученных данннх представляла бц интерес с точки зрения проблем молекулярной эволюции растительных геномов.

Публикации. По материалам диссертация опубликованы четыре статьи.

Обгёи работы, Диссертация изложена на страницах и состой? из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной часта и выводов. Список цитируемой литературы включает наименований.

ВВЕДЕНИЕ

Фотосистема II осуществляет перенос электронов от молекул вода на молекулы хинонового производного, при этом создагтся трансмем-с5раннзя]~раэность электрохимических потенциалов и выделяется кислород. Фотосистема II является Оелково-шгкентнкм комплексом, состоящим из внемэмбранной части и интегрированного в мемСраяу так называемого "ядра". Внемембранный кислсрод-выделянций комплекс включает в себя не менее тр5х растворимых полипептадов. а "ядро" - не менее 10 суйединкц звдрофэбной природы размером от 4 до 47 кД, с которыми связано около 50 молекул хлорофилла с, причём с двумя наиболее крупными суО-ьедкницами, хлорофилл-связывающими белками СРа-1 (47 кД) и СРа-2 (43 кД), ассоциировано 20-21 и 26 молекул хлорофилла а,соответственно. До недавнего времени полагала, что компонентом комплекса "ядпа", связыващим хлорофилл реакционного центра, является белок СРа-1. Однако, опубликованные в 1987 году, данные Кааба и Сато свидетельствуют, что минимальный реакционный центр фотосистема II состоит из четырёх полипептидов: Оелка Б1 (32 кД), Б2 (33 кД) и двух полипетидов цитохрома Ъ65Э. Еопрос о функциональном значении СРа-1 и СРа-2 остабтся открытым.

Исследование функциональной роли полипептидных компонентов фотосистемы Т1 непосредственно связано с выяснением деталей их структур. Гидрофобная природа относительно крупных полипептидов затрудняет определение аминокислотной последовательности значительной части этих белков методами белковой химии, поэтому перспективным является выведение структур полипептидов из нуклзотид-ных последовательностей их генов, тем более, что гены, кодирующие

-а~

полнлептиды фотосистемы II, находятся з относительно просто организованной ДНК хлорспластоз.

В качестве источников генов рзЬВ, рзЬС, рэЬН, рзЬЕ и рзЬ?, кодирующих некоторые полтэппуш фотосистемы II ячменя, использовали плазмз-'^и.сории рНусР, любезно предоставленные д-ром Т.Х.Н. Эл-лисом (Англия). Плазмнда этой серии сшш получаны на основе вектора рАТ 153 и несли фрагменты (РзП- РзН) хлорозласткого генома ячменя, в дальнейшем оСозначенше Р1, Р2 и т.д. Физическая карга хлоропластной ДНК ячменя прэдстазлена на рис.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ К Тенн рвЬЗ и рвЬЯ

А/ Клонирование и секвенирование генов рэЪВ и рзЬН

Фрагмент хлоропластноЯ ДНК ячменя Р2 (см. рис. 2), предположительно содержавший гены рзЬВ и рэЬН, вырезали из плазмидо рНтсР2 и подвергали рестриктяому анализу с последующи?.*, разделением полученных фрагментов электрофорезом з агарознсм геле. Бены, содержащие кскошэ Г8ны, кдентифицировали йлэттингом с использованием в качество гиОридкзанионной пробы клонированного фрагмента (1160 п.о.) гена шкната рзЪЗ, любезна предоставленного д-ром р.глерр-мзнном (ФРГ). '

По результатам гибриднзацта (с учЗгом литературных данных) бала построена рестриктная карта фрагмента Р2 хгоропластноЯ ДНК ячменя, приведЭнная на рис.2.

Две зоны, содержавшие фрагменты (ВяпШ-ВатП; 4,6 тне.п.о.) и (Крп1-Ра1;1; 5,2 тис.п.о), вырезали из игарозкого геля и фрагменты клонировали з плазмиду рВБМ! 3-(2ога1:а£епе; США.) по сайт; ВатНТ и в плазшзду рР.ЗМ13+ но сайтам Крп1-Рзг1. Отбор кленов .фоводили гибридизацией 1п зНи с тем хв меченым зопдом, а после выделения плазуидноа ДИК - рестапстным анализом. Так были получены плазмида рВЗ к рВ2, несущие Ваяй!-фрагмент в обеих ориентация!, и р31, нэ-сутдая КрЩ-РзМ-фрагмент.

Нуклзогадиуя носледовательность клонированных фрагментов ДИК определяли методом тэрмезлрования синтеза цепи на одноцепочечной ДНК-1.;атр:ще в присутствии дидззохеинунлеотидев по Сзнгэру.

Для. определения нуклеотвдкой последовательности искомых генов были отобраны плазмзди рВ1 и рВЗ. Выбранный намя метод "дадацисн-ных мутантоз" по Хеникоффу значительно упростил подготовку ДНК к

JaU \/><tr

Ркс. 1. Рестриктнак карта хлоропластной ДНК. кчыоня. Скобкой обозначены инвертированные повтора в хлоропластом геко».:а ячменя. Показаны фрагменты^ полученный при обработке PstI (PI) и SalC-I (SX). Размера фрагментов дзкк в тыс.п.о. (Day i., Ellis С.Н.К., 1905)- Hi карте показаны локализация и направленно транскрипции генов фогоскстэми II: psbA, psbB, рзЬС, psbE, psbP, pcbJ, рвЬЦ, psbL, 8 I5K® OPC 33, OPC i3 и гены petB, petD цитсхроьшого Г/Ьб ком!ьлекса. Звёздочками обозначена гекы, содерг:ащие. катрены.

Табл. 1. Структуры юштатичееккк олитокукластвдоз - прайнероз и зондов, кспользоаанкнх для определения куклаотидаой последовательности генов фотослстеш II. Плотным шрифтом обозначен нуклзо-тид, не соответствующей аналогичному нуклеотиду в хлоропластной ДНК ячменя.

СТРУКТУРА. ЧИСЛО

СШГОНУОЕОТЭДА ЗВЕНЬЕВ

F2B В 1 UP CCACC-TTGW-A/.ACGACGGCCAGT 24

2 HOP GCAAA'AGCTATGACCAIGATTACGCC 27

1 CI GAGGfCAXQUGCGCAVCG 19

2 С2 TATCATGCACTTCTCGGACС 20

PSB С 3 СЗ TGGATTGTTAGTGTGGACGATTT 23

4 СО CATTAGGTGCAAGACGGTGG 20

5 С4 CCAACTATACAAATCGAACC 20

б С5 ATTAACTGAATACCTAAAAT 20

1 F0 ATGTCTGGAAGCACGGGAGAACGTTCKDraGCT 33

2 F2 ACCGACCGTTTTGATTCTTTAG 22

3 F3 TCCTTGTCGGCm'CCGTGAA 21

■ PSB Е 4 F4 TTAT CG1TGG A'PG AACTG 18'

5 F5 AATGAACAAAATGTTGAATT 20

6 F6 TCTAGCATGACCAATTGATA 20

7 И ATCAATTUGTCATGCTAGA 19

8 F8 CIATAGAGATGAACCGAATC 20

-S-

ЕлоШ [3S.73.W5..... cekj Si Jfuiasa

Рис. 2. Рэстриктная карта фрагмента F2 хлоропластноЯ ДНК :рысил и схема получения двух серий "делвциошмх нутантов" для определения яуклзотидноа последовательности генов рвЬЗ н рзШ.

Обозначения: Е - Eco RI; Р - P3tl; Н - HincLIII; В - BamKI; Зга - Smal; К - Kpnl; Sc - SacI; X - Xbal; UP - универсальный прэймер; RUP - обратной униворсалышИ промер (см. табл. 1); gggj - зкзсш; gg^j - иитрош.

секвеннроваки. так как отпала необходимость в делении гена на субфрагменты . их последующем клонировании.

Получение "дч-эционных мутантов" проводили по схеме, представленной на рис.1. Ллазмиды рВ1 и рВЗ расщепляли двумя скдоауклеа-заии рестрикции (Xhol, Kpnl б случае рЕ1 и SalGI, SphI в случае рВЗ), кахдая Ез которых имела по одному участку узнавания. В реакционную смесь, содержащую линейную молекулу с выступающими 5'-к 3*- концами, добавляли экзонуклеазу III E.coll (ExoIII) и отбирали аликвоты через равные промекутки времени, получая таким образом набор фрагментов с 5' -концевым;; дэлециямк различной протя-жЗнности. Обработкой SI-нуклеазой удаляли 5*- и 3*-выступающие концы и проводили лигаровакие. Аликютами лигазных смесей трансформировали клетки E.coll MV 1193. Было отобрано по 24 проипводных от рВ1 и рЕЗ конструкций, содержавших исксшй О^рогмент хлоропластной ДНЕ; в обеих ориентация*, с делениями различной про т я кг ;ш о с ти кпк с 5'-, -так к с 3'-конца гена раЬВ.

Использование векторов pBSM13+ и. pBSM13- позволило получать одноцэпочетаую матрицу, минуя этап переклонирования в фаговый вектор. В качестве праймеров были взяты так называемое "прямой" (UP) и "обратный" (P.Uí) универсальные праймары, представляющие собой 24 и 27-звенше синтетические олигонуклеотиды, соответственно (см. табл. 1).

Нуклеотидная последовательность KpnI-PatI-фрагмента хлоропластной ДНК ячменя длиной 5,2 тыс.п.о. приведена на рис.3; кроме генов psbB и рзЪБ, данный фрагмент содержит гены petB и, частично, petD, ходарукзцие белки цитохромного I/Ьб когшлекса.

Б/ Структура генов рзЪВ и рзЬН и примыкащэт. к ним областей хлоропластной ЛКК

Анализ показанной на рис.3 последовательности выявил гены рзЬВ, psbH, petB и, частично, petD. Продукт гена psbB (47 кД хлорофилл-связнваидий белок СРа-1) кодируется 508 кодснами. Район между генами рзЪЗ и psbH составляет 553 п.о. Идентифицированы две открытке рамки считывания (ОРС): 0РС38 и 0РС43, гомологичные обнаруженным в хлоропластной ДНК печбночного мха Ыагchant ta poly-тогрГиа транскрибируемым 0РС35 и 0РС43. 0РС38 расположена на расстоянии 154 п.о. от терминирующего кодона гена psbB на той se цепи, что и psbB, тогда как 0РС43 находится на противоположной цепи между 0PC3S и геном psbH.

1 СТиСАСГТСССАТСТТОГАСООСАаТСАаАССАаАСАГАССОСТСАТСТСССОССаТССГ 61 ■ТТТаССЗаТТАСОСАССАСССОСТСАСТАОСТСААС АааАССаАСАССТОАГАОАААСАаА 1 21 АСОСАСХ'ССАОСЙ СС'ГСАААА4САССАТСАТАСАСТА,иТСАОТААСТТааСАССАТСАА

раЬ В ■*

ИОЬРГСУНУНТУУЬНВРОКЬЬ 181 ТССаТТ'ГаССТТСС-ТАТССТаТТСАТАСТС-ТССГАТТаААТаАТССОССТСОАТТаСТТТ

ЗУН1ИНТАЬУЗ(}ИАОЗЫА1.У 241 ССаТССАТАТААТССАСАСАаСТСГЛСТГГСТСаТТССаСТааСТСААТСаСТТТАТАСО

ЕЬЛУРОРБПРУЬБРКИАаОЫ 301 ААТТАСОАС£Т'ГТТСАТССС!?СТСАТССТатаСГССАТССАЛТСТСОАСАОААаСГАТСГ

РУГР?ИТАЬСХ 'ГВЗЯГ0С№31 361 ТСа^ААтаССССТСАГОАСТССТТГАЦС.АА^ААСССАГТССГааССТСОТГааАСГАТТТ

ЗООТУ!!1¥-РС1?ГЗУ(ЗОУААТН 421 САСаАСаААСТаТАЛСАААТСССОаТАТтаССАаТТАГОААСаТСТСОСАОСа'АСаСАТА

1УР30ЬСУ1,ААГИН1¥УУЯВЬ 481 таатотот^стаост'ЕСТСтгтстгассАассАГОТоссАттасотАТАТТсосАсстАа

ЕГРБПЕЕТаКРЗЬБЬРКГРО 541 ^-ААТАТТСТСТаАТСАаССОАСССаААААСССТСТТТааАТТТОСССААСАТСТТ'ГааАА

1ньрьасуасророарнуто 601 ТТСАетГАТТТОтаССАОС-аОТСаСГТССт'СССТТГОССССАГГТСАТСТААСООСТТ

ьуарахиузБруоьтакУОА 661 ТСТАТСС-ГССТаСОАТАТССаТАТСОСАТССТТАТОСАОТААСТСОААААСТАСААССТй

УКРАНОАЕОРИРРУРСОХАЗ 721 ТАААТССАОССТ&СОаТОСАОААССтТЙАТССГТТг'аТТССОССССОААТАССТТСТС

НК1АА0Т1,011,АС1,РН11ЗУК 781 АТСАТАГГаСТаСССОГАСЛТТССаГАТАтаАССОСССГТАТ'ГССАТСТТАаТОТССОТО

PPQAI.yKGIiRMGNIBiEVI.SS 8",1 СОССТСААССТСТАО'АГАиг.аАаЧАСС^АТССаСААГАИОАААСЯ'СТАСа'ТТССАСТА ДХЛАУРРА, APVVAGГÍÍWYGS

901 стАТсосгастсж^т^аоАссм-тсагАС'СгсстссААса'Ата'Х'сатАТСостсАа

Аттр1ЕЪраргнуа!ГБао5Гт 961 СААССАССССААТСОААТТАТГТССаССТАСТСаГТАТСАСТааОА'ТСАОСаАТАС'ти QQSIYRRySNGLAENbSI.SE 1021 АССААСАААТАТАТСаААСАС.ТТАаОААТаОТТТАСССаААААТСТГАСТТТАТСАОААО

АГ?ЗКХРЕК.ЬАРУБУ1СНМРА 1081 СЗТГ-а'ГСТААААТТСССаАААААТТАСССТОТАТаАТГАТАГТССТААТААТССааСАА

Х001РНАвЗЫПЫСВОХАУО*Г 1141 маоассАТТАтгсАОАССсс-аотсААТсаАСААГСссалтооААТАастсгтсаАгаот

ЬОНРУРЙОК20КЕЬР7ЯНМР 1201 ТАааАСАРСССаГСТТТАОАаАТАААОААаСАСОГОАССТТТТТСТЛСОССОТАТаССТА Т1?РЗЗ'ГР?7УЪУП1!Еа1УНА1>

1261 С'т'тттсаАААСАТТгсссатасттттсогАОА'гсАССАСсаААтгаттАОАОсааАСС

УРРНЙА25КУЗУЕ0УСУ2УЕ 1321 ТТССгаТТАаААСАССАОААТССАААГАТАОТСТГСААСААСТАОСССТААСОСТОаАСТ

?УаОЕЬИОУНУЗХ1РАТУККУ 1 381 ТСТАССОТаОССААСТГААТСаАОТАААТТАТТС'РОАТССТССРАСТа'ГАААААААТАТО

Рис.3. Нуклеотздная пос.чедопаталыюсгь фрахиекта хлормшастисЗ ДНК ячианя, содерзаг.ого гака рсЬЗ и рвШ, а такте рэ1В, рэгБ, ОРС 33. 0РС43. Сверху куклзотидной последовательности кодкрукцей цепи показаны соответствующие ей амяиокаслэгныа последовательксстя, ПодчЗркнута предполагаемые рибосомсзазызавдне сайты, а таиз -35 к -10 участки промотора. Стрелками обозначена потенциальные вторичные структуры. Терминирующие кодиш обозначены "*". Курсивом сЗозначекн функционально зца'жмые элементы иктрснов ре1В и

-ß-

ARÏÎSQLGEIPE. LBRATLKSD 1 441 CGAGGCGlTCTCAATTAGGGC!^UÏT'T'XTa.U.a'TAGACCGCGGÎACÏ?TÛA.<LÂTCCaATG

GYÏRSSTRGtfFTPOHATFAL 1501 GTGrrTTOGGCAGCAGrCCAAGCGGTTCGTTCAGTTTTGGTGA.TGGTACCÏ-IÏGCTTÏGG

LPPPGIIIWHC ARTLFRDYPA 1 5ó1 TCTTCTOXa^CGGACACAÎTTGGCATGGCGCTAaAJlCAïrCTTCCGAGATGTTCTrGCÏG

GIDPD.LDAQYEF GTPQK YGD 1621 GTAPTGATCOAGAT-îa'GOAÏGOTCA/XTGGAATTÎGGAACATECCiAJUAGiGGGAGÀTC

PTÎEKQAV® I631 CMCTACÀAAGAÂACAGGCAGI'CaGATÀCACAri?aTTATGGTATCîraCACCTCÏCn^ 1741 ïïGATïTGACÀœCTCCCATCCTOTOÎTCGACïCTre^

1801 GCC^A.^GA0AAÀTGjJiTAGGTG73GAAGl'l-AS/J^^GbbVA^UACgACGATGGAAT0T OPf 38

H

1861 ATGGAAC-CAKGGTTTATACGT-ICCraTTAGmiCC-ACTTTAGGaATAATg'grrrTOGgf

1921 ATCTgCTI0CGAG^aC4CCTAAGG^TCCA0CAAGTCCMCTAAAAGA4gAJUAgAAjra

л

1981 САта'РААСГААОААСТСГ^ЦСЛОАТАСОЦООАСТ^СТй'ЛЦТТАА AIJTAGTCTCCGgGT'IG

2041 TTCOAATüGATCTCCS^TTGrrGAGAGGGi-rGCüCjUACGCGGTATATAÄGGCAiCACCC

♦ от/ 43 К

3001 AGTAA.i.GCl,?ACAAGIAAACSAGAT4'rGG>-GA^GGCGAGT¿AAG-IgGCTG!iraCCArT^g

2161 ÎATAGiJlTÏTCAAGATrACAATGGAÏCTAGGAJL^AGATGGTGTAT-raACAACrACAAOGG

Гь И -* А Т Q Т Y Е

2221 AATÀGTATA0AAAG!ICAACACCAATGAÎTAAA5ATAA'XTTATGGCTA.CACAAACCGTTGA DSSKÏRPKRTGAGSLLKÎLÎÎ 2281 AGAÎAGÏXCÎAAACCTAGGGGAAAAGGAAGrGGïGCAGGPAGÏ'rTACÏGAAACCCTTG^ S E Y G X V Ä I G W G î ï P ï H G Y A M 2341 TïCGGAATATG'IGAAAG'ïCGGCCCGGGïTGGGGûACTAGrCCTTT'I'A'IGGGGGTCGCAAÎ A Ь F A I ? L S IIXSIYNSS ILL 2401 СССТГТА^ТССОГАТАГТССТАТСЗ'АТдАГТтаАаАААХ'И?А^АА,гТСТ1'СОАта-Г1АСТ

D G I L T К * 2461 GGATGGAAm^AACCAATTACGTOTCTAÜITAAC^AAACCfAGGAAGTCAGAG'm'^TCC

2521 ATCGAAAAAAGCCîTTGTAGTTTAAGQTCX'ACAïrTCTAGATATTATGGTAG'rTCCACCG

peí S -» M S

2531 Cr.GAAgTTI'TraGTTÏGGGTAJCTCrGGAArATGAGTGIGTGACTTGrTAGAAgCCGATCg

2641 TAgTGA^AATACATAGAAAGGGCCl'GTfAX'CTCTATCAAaAIGATaCT.ilat'JCG^CAGAa!

2701 ATTArraATTCTAGTArCTGqAACACGAAAgAGATAGAGrCGATOAAAAAAAATGGAACg:

2761 ATGATTCAiUraCACTATTAAGACCTCGCAACCAaACîGAJUUASTCAAGTAGMOTTAA

2321 ATAAAJUTAAAAAACAAAîaTTCraCOÎÏACAATlOT^

2881 TÎCTA'ICGAKTTGTCGAG'TGATÏAGACTGATTCAATTTCAATAAJLTGATTAïCAAGCqG

2941 TTCTrATaCGAAGAACqGrrGCGITTTGTTl'iGCTT-GAGACTAAATCA-TGGTGGCTGTAG

3301 T^GAAÏCTAAGGTTTrAATIGAACrGATTOATAGGAïCACAACAAGATAA'TÏTCTATAT

3061 TACGCATAAAAAAAAATCCAAAATAGGGAAGAGAAAAGTCAAGAAGCOTCTAAÏCACCAA 3121 CA'JAAGGGAi.àGGAAGAAAGAAAGACGCqCOAACX'TGAGATgrraTGGCATTATCAgQAC

3181 AAAGAACATATTCCGGAmTTTO'TAa'TTGCTATCTTCAAGGCAAAÏCGACCCGATTCAG 3241 TGGGTGATGUGr^íGUCGrrTa'TTCTAATATTGGTTaAAAATíTGTGTGraíCrGCT mkfsytalrggrglYt 3301 TG^CŒCGTAiXAGATGAMTTTTCATATACCXX'jpTTAGlLGGGGCGCG'ZGGGTTàGTTAC

ylnKVYDWFEEHLEIQAIAD 3361 giaîctcaataa^uïatatgattgqîttgaggaacgtcïigagattcaggcaatrgcgga

DITSKYVPPHVNIFYCLGGI 3421 TaATArAACTAQTAAAa'ATQTTCCÎCCCQATGrCAÀCATATOTr^TTO'ITTACGGCGAAr TLTCFLVQVArGFAMTFYYR 3481 TACACTTACTTGTTTTCTAGTACAAG'rCGCïAGGGGTrTTGCTATGACTTTTTACTACCG PTYTEAFSSV QYIMTEANFG 3541 ACCAACCGTTACAGAGGCTTTTTCCTCGGTTCAATACATAATGACCGAGGCOMCTTTGG WLIRSVHRVS ASK MVLMMIL 3601 TTGOTTAATCCGATCAGrrCATCGATCGrCAGCAAGTATGATGn^rTAATGATGATCCT H V F R V Y L T G G F К 'Л И В 7- Т Т. 7 3661 GCATGTATraCGTGTGrATCTCACAGGGGGAlYrAAAAAACCCCCrGAArïAACrïGûG-r TGVYLAVLÏASFGVTGYSbP 3721 GACAGGTGTGGrTTTGGCTGTTTrGACTGCATCATTTGGTGTAACTGGTTATTClTTGCC ÏÏDQIGYffAVKIVTGVPDAIP

3781 ÏTGGCATCAAA?ÎGGCTATTGGGCAGTOAAAATTGTGACAOGTGTAOCÏGAOGCCA?TCO

VIGSPLVELLRGSASVGQST 3041 GGrAATAGGATCGCCOTAGTGGAGTTArTACGCGGAAGTGCTAGTGTGGGCCAATCCAC LTRFYSLHTFVL? L L T A V F M 3901 rMGACICOaTTTTAEAGTXTACArACCraTGTACTGGCTC^GOaiTACTGCCGTATTTAT LMHFPMIRKQGISGPL*

3961 GTT,U.TGGACri^CCAATGAÏ4CGrAAGGAAGG,PATTTGGGGTCGTT'iA?AGGGAAuGCA 4021 TArCAa\iaAGAA2TCTAATTCTCArATATCATAÎ.'CGGGTAGGTTCTGGTAIM!TCAM!GCT 4081 ACMGCATGGCr-fAîTGTAAMTAACACAÏGTCATTTGGATACÏTCTÇraCAACTCCGAA

pet D - и

4141 GTAT-yiTTATACGATAOJJUTACl'rGA^GTTAAITTTACGAAAGAAAAAAOGÇCGATTAT

4201 CGGAGTGTGTCACTTGAATTATTGAraTGGCCATGCAGATAA.^GAATTGGATCTGCCACA

4261 TTACAATTCAOAACCAAAaGTG^CTCCGCATCCAATCAACAl'GTAAGTOCCO-TACOTAGG

4321 AAGGATAGqCIGG^OACTIGACGAGAArA'JTTTCTATGATCATAOCGCAACCATGTCAg

4381 CCATGAACAGGCl'CCGTAAGATCCCA'JAGAGTGGAAArGGAAgOAGTCATGTGAGATGAT

4441 CCAAraC^CTAl'TTArJACACmcraTraATTATAGrATGaAAA.TGCA'JTOA'irraCgr

4501 TGCATCGATTGrCATOCGCAAjACrATCGGAGTAAAAGAAGGQATCPAAGGAAGAATGaJA

4561 GGCTAAAOTTTïrGATrTTTMSAGTAAOAAGTAAArATTTTGTTTGGAGGTAAGAAAO 4621 TTGCGATATTGAGGOGATAAATACCAACrAATCAAOAGACATGAGACAATCCACAAAGCA 4681 ATTGATCATGATCAAATTTGTAACCCCACTTGGÁTATTGAGCATTTACCCATAAGAATAG 4741 GATTArXTTCAATGAGIPAGTGGTAGGTGCAACTrrCGAAAAGAOAArCTGATAAAGCrrT 4801 TïTÏGSCSAGAGTCATTGAGÏCATTA'PArACCTrAAÏl'CTAriAAGGATCTTCCGCGGTG

ra s q з í

qqwilkssplDlTKKPDLND 4921 GGGGATGGATCC!TAMGACTrCACO?ATCCÇAAi?AACAAAGAAACCAGAC!rrAAA!rGATO

PVLRAKLAKGMGHNYYG 2PA 4SS1 CTGrATT.UCAGCTAAATTAGCTAAAGGGATGGGACAICAATTAa'-TACGGGGAACCCGCAT

WPNDLLYIFPVVILGTIACN 5041 GCCCCAACGATCTTTTATATAITŒrTCCAGTAGrAATTCTAGGrACTAOTGOAïGrAATG

VGLAVLEPSMIGEPADPFAT 5101 TAGGÏTTAGCGGrTCTCGAGOOATCAATGATTGGTOAACCGGCAGACCCGTTTGCAACTC

PLEILPEWYFFPYFQILRÏYp 5161 CTTTGGAAATAXTACCCGAGrGGTAMTCMTCCCGTGrTTCAAATACTCCGTACGGTACC

Ген рзЬН содержит 73 кодона, и его продукт имеет молекулярную массу 7,8 кД- Последовательность G АЛ, располскенная перед иншм-ирующим кодоном на расстоянии 6 п.о., может функционировать Б качестве рибосомсвязывакщего участка.

Район менду генами psbH и petB содоркит возмокный интрон класса II длиной 754 п.о. Возможные рибосомсвязывавдие последовательности, GGA и САС, расположены перед участками инициации трансляции апопротекюв аитохрома Ьб на расстоянии 215 и 222 кодона, соответственно. Предполагаемые рибосомсвязнвавдмэ сайты, AAl'.G и AAA, обнарунены такав на расстояши 10 и 8 п.о. от инициируюцих кодонсз сплайсироьанной и носплайсированной форм регв-кодируьчцей последовательности, ссответстаэнно.

1ш троны геноз petB и petD могут слукить моделью "ненласскче-еккх" кнтронов II класса:

1 ) последовательность GTGÎGAC на 5'-конце интрона полностью соответствует предполагаемой иослодоватзльности GYGYGrJC, где У • гпгршидпн, fi - любой нуклеотид;

2) последовательности СТАТСТСААТ и СТАТСССААТ на 3-концах кктронсв соответственно petB и petD идеально согласуются с последовательностью ТГАТОШШ;

3) имеется характерная потенциальная шпилька длиной 14 п.о. GAGCKtfiHTRJnffiNgaaaNTWiyAygYMNGTTY, где В - пурин, а мелким шрифтом обозначены несгаренные нунлеотиды. У кктрона гена petB ячменя эта шпилька отхиазтея одной заменой типа транзицш: и одной типа трансверсж!, у ингрока гена petD ячменя - одной трансьерсиокной заменой.

Мззду генами рзШ к petB ячменя идентифицирован промоторньй элемент: ÎTGAGA-17 л.о.-ТАЮАТ, который близок по структуре к функционально определенному промотору опорона atpBE кукурузы и отличается единственной нуклеотидной заменой и удлиненным на 1 п.о. расстоянием. Второй гсромогерподобный элемент ТТССТА-18 и.о.-ТАТААТ обнаружен ьнутрк гена рзЬН. Ки между генами petD и petD, ни внутри них промоторподобкых элементов не выявлено. Эти данные хорошо согласуйся с результатами анализа нуклеотидной послздсва-тельности этого района у кукурузы.

В/ Структура пелмгаптидов

Для полипептидннх цепей CPs-1 (продукт гена рзЬБ) характерно высокое содеркапие гидрофобкас аминокислотных остатков (41%).

-и-

Этот белок имеет 6 участков выраженной гидрофоОности, существующих, вероятно, в вида гряксмвмбранных «-спиралей липкой 22-25 ашшокислотны? остатков. В СРа-1 имеется характерный гидрофильный сегмент шхду предполагаемыми V и. VI трансмемОршньми тяжами. Его длина составляет 37% от общей длины белковой цепи в СРа-1. В ряде работ было показано, что эта гидрофильная пере тяпка экспонирована в лямзп и участвует во взаимодействии ядра фотосистемы II с 33 кД полкпапткдом кислород-выделяющэго комплекса.

В табл.2 представлен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей продуктов генов фотосистемы II. Анализ данных табл.2 (I) показывает, что все 17 Тгр и 14 His СРа-1 абсолютно консервативны. Значительной консервативностью обладают остатки Туг. Pro, Gin. В СРа-1 пары остатков His, находящиеся в трансмэм-браншх сегкоптах, триады образуют характерную структуру: два остатка Hia на расстоянии 13 амшюкксло'гшгх: остатков. Полагают, что остатки Е1з обусловливают координационную связь с центральным атомом fig порффинового цикла хлорофилла. Тяккэ вероятными участниками этого процесса могут быть остатки Тгр и Gin (показано участие остатков Gin ч лкгандгроваыжг молекул хлорсфк.1ла в еввто-ссбиракцек: комплзнсэ CMcroflexus curantIcicus. Кснсорвз'л-^ность остатков Pro опрэдэляо-т жёсткий характер укладш перзтягек, Ъи. -ступающих в лк-.ен и стрему, что сбеспечвъэет взаимодействие с другнж кемпонэнтейм фотосистемы II.

Амггокислотная последовательность продукта гена рзЬН (табл.2, разд.VI) мекзэ коноэрватиЕна, наибольсей заркабельностыз обладает ЗЦ-членный Я-концс-вой участок, содержащий большое количество за-рякешшх групп. Фссфорилкруемчй остаток ТйгЗ абсолютно консервативен. Этот бзлок содзрзит, вероятно, один тргяешмбранный сегмент (с 42' по БВ амкшхсислотныэ остатки). -конец этого белка экспонирован на с/рокальксй поверхности ".'гла'.лйдной; мембран}!.

2. Ген раЬС

А/ Клонирование и секвоыфованне

Частичная информация о первичной структуре гена psbC ячденя ухе имвласъ з литературе; так>нами ранее были определены первые 50 нуклеотидов 5'-кстщзвого участка гена, совпадаашкв с 3'-концевым участком гень рзМ); гга дашгзл Олхзера и Пау.ньсенз были изве-

стны такке по ело дни э 5Ш нуклеотидов 3'-концевого участка гена psbC.

Для получения недоставдей информации мы использовали плазмиду рНтсРЗ с фрагментом хлоропластной ДНК ячменя длиной 18,4 тыс. п. о., который содержит полноразмерную копию гена psbD и значительную часть гена рзЬС. Для того, чтобы выделить искомую часть ганз рзЬС, эту плазмиду обрабатывали эндонуклеазой рестрикции SacI, удаляя, таким образом, большую часть фрагмента РЗ, а оставшуюся часть плазмиды с помощью лигазы превращали в кольцевую молекулу. Полученную конструкцию подвергали пщролизу PstI, что позволило получить фрагмент (Pstl-PstI) длиной 950 п.о., который был клонирован в векторе рБЭМ13+. Отбор ионов проводили гибридизацией с тем зке меченым фрагментом (?at-Pst), а после выделения плазмкдной ДНК - рестриктным анализом. В дальнейшем использовались плазмиды pESCI и pBSC2, содэржавшие этот фрагмент б обеих ориентациях.

Для определения нуклеотидной последовательности этого фрагмента была выбрана одна из разновидностей "дадезокси"-метода - метод "смэщахгдзгося праймера". Наряду с праймерамк, структура которых в точности соответствовала структуре участков гена ячменя, нами были использованы олигонуклеотиды, последовательности которых были взята из аналогичного гена других растений и могли только частично совпадать с искомой структурой. Этот подход позволил нам ускорить процесс секвеннрования за счёт одновременного синтеза гграй-мзров и определения структуры различных участков интактного фрагмента. В табл.! приведены структуры синтетических олигонуклеоти-дос - праймеров и зовдоз.

На рис.4 представлена стратегия определения первичной структуры искомой часта гена рзЬС ячменя, а на рис.5 показана его нуклеотидная последовательность.

Б/ Структура гена psbG

Этот ген кодирует продукт длиной 473 аминокислотных остатка (см. рлс.4) и, возможно, транскрибируется вместе с генсм psbD (геном полипептида D2 фотосистема II), с которым имеет 50 ебщнх п.о. Для гена psbB были идентифицированы 2 возможных набора про-моторшх последовательностей , которые могли бы являться промоторами и для рзЪС. Две другие промоторподобные -35 и -10 последовательности находятся перед геном рзЬС, внутри гена psbD. ATG-кодо-

-тз-

ш

ч 3 i -í *

гт • ' 1 ' '

P»bD .

i. Snl I

pebC

MI

ñio. ¿. Стратошя опрзделения цукпеотиднсй последовательности ксксиого участка гена рзЬС - хлореилостнсй ДНК ячменя. Пунктиром обозначен 3'-конец гена рзЬС, который не входит в состав фрагмента РЗ. Заштрихован фрагмент гена рвЪС, структура которого была определена раяэе. Стрелками обозначены скнтетичеокиэ олигонухлеотиды, использованные при определении первичной структуры.

CAGGATCAGCCT

KKIXYSLH.RFYHVETLFNGT 1 ATGAAAATOTOATATTCCCTGAGGA^TTCTACOACGT'GGAAACGCTCTTTAATGGAAC'IÍ

FVLAGRDQETTGFAWWAGNA 61 FTCGTTITÁGCTGGTCGTGACCAAGAJACCACCGGCl-FTGCTTGGIGGGCTGGGÁAT'CCC

Кис. b~. Нуялеотяднвя последовательность фрагмента хлорошшст-ноЯ ДНК ячнзня, содерагдаго 3*-концевой фрагмент гена рзЬВ и ген psbC. Сверху яузелеотидней последовательности кодирующей цепи показана соответотвукоще ей аминокислотные"последовательностцПодчЭр-кнуты предполагаете рибосомсвязыватие сайтк, а также "-10 участок промотора. Плотным ирафтом выделен терминирующий кодон гена pebD. .

-Т4-

42 48 54 60 66 72 Т8 84 90

RLINLSGKLLGAHVAHAGLI AGACTTArCAATTTGrCCGGTAAACrACrTGCACCTGACGTAGCCCATGCCaGATTAATC

V F W A G A M Е L F Е V А II F V Р Е К Р GTATTCTGGGCCQGAOCAATGAACOiATTrGAAGTGGGOOATTTCGTACCAGAAAAÜCCC

MYEGGJ. IbLPHLATIGWGVG ATGTATGAACAAGGGmAEiOTAOTCCACACTTAGOTAC'rOTACGTTaQGGAGTAGGG

Р С G Е V L D î F Р Y F V 3 G V L К Т. I COAGGGGGGGAAGTTOTAGATAC'rCTTCCAOlAOmGTATGîaGCGTACïTCACCï.'.JVTT

SSAV1GFGG IYHALLG PETL ТССТСССгАСГСТГАОССТГСССГООСАМгАгСАСССОСТТСТаС.ОАСССОАОАСТСП-а!

EESFPFFCYVWKDRNKKTTI GAAGAArCÏTÏTCCATÏGTTÎGGrTATG'I!CaiGGAJU.GATAGAAAÎAÀAAÏGACT-ACÀATji

LGIHIILLGLGAFLLVLKAL тассогАтасАстаААтатготеАсототАаагосттатсттсгАстАСтсААСосгетт

YPGGVYDr WAPCCGDVRKIÎ ÏArairGGCGGTGrATATGATACCïGGGCCCCïGCGtGGGGAGATGT'AAGAAAAATÏACC

NLTLSPSVIFGvïILKSPFGG AATa'TGACCCTTAGTCCCAGSûrTATA'mîGGMAraTACTAAAAairûCÏITr'GGGGGA

EGWIVSVDDIEEIIGGHVWL GAAGGGTCGATïGTÎAGTGTAGAi'GATTTAGAAGArAÏAATSGG'fGGAGA-XGïAÎGC-T-XG

G F I С V F G G I К H I L R К P 1- R W A GGTîîTATrTGTGrAîîïïGGCGOAAT'raGGCATAPrra/J.CCAJJlCCCÏ-ICGOATGGaOT

RRAÏVWSGEAYLSYSLAALS CGCCGTGCAÏ'TTGTATGGTCTGGAGAAGGITACTTGTGCTAÏAGraSÂSCÏQCSTïAïC'T

VFGFIACCFVÏÏFNNTAYPSE GÏCm'CGïKmAT'CGCÏTGliGTMÏGTAi^

FYGPTGPEASQAQAFTÏLVR TTTTATGGACCCAGCGGGCCAGAAGCTÏCTOAAGCTCAAGCAESa'ACÏÏTÏCI'AGTOÀGA

DQRIGANVGSAQGPÏGIGKY GACCAGCGTCTÏGGAGCTAATGÏGGGATCCGCÏCAAGGACCCACAGGÎÏ'TAGûGAAÀirAT

LÎP, SPTGEVIFGGEÏMRFffD CT/^TCCarTCCCCAACîGGGQAGC-TïATCrïïGGAGGGCA/„iûa,AïGCGi:KKr'XGGGAC

LRAPWLEJLRGPKGLDLSRb CTTCGÏGCîCCAïGGïrAGAACCTCŒAAGGGGCCaCAACGGÏKÎGGACa'TGAGTAGG'ïTG

KKDIQPWQERRSAEYMTHA? AAAAAAGACATACAAûCTTGGCAAGAACGGCGGTCAGÛAGAATATA'iGACCCACGC'ïCCI

L G S L M S V G G V A Г. E X К A Y H Y V TTAGGCl'CïTïAAATî'ôCGTG&GTGGCGEAGCGÂCCGAGArCAAIGCAGTrAA'CTATGÏO

SÏRSVJLSÏSHÏYLGFFFPVG œCTCCTAGAAGraGGrTATÛAACrTCÏCATTaœGM^^

HIWHAGRARAAAAGFEKGIP CATïTAT'GCCAïCCAGGÀAGAGCQCGAGGSGQrGCAGCAGûï'ï-TTGAAAAGGGAATCGâT

RDLEPVLYKÏiPblîï CGïGAÎÏTGGAACCiOGïTCrTTACATGAACCCT'CTiAACÏAA

■рисТ~~Ь. (скскчанкв ).

-Го-

ну гена рэЬС предшествует потенциальной участок связывания рибосом (см. рис.4). За этим кодоном расположена вторая последовательность, комплементарная З'-концу 163 рРНК, а через 9 нуклостилоз после но5, в той же рамке считывания, что и ATG, находится GTG-ксдон, который монет слукить инициатором трансляции, по-нраЯней мер? у E.coli. Тот факт, что белок СРа-2 (продукт psbC), выделяемый из тилаксидов, но дгпньи l/ахвля начинается с Tfcri5, не противоречит нрэддалскениэ, что иницикрувиим кодоном является не ATG, a GTG, и в этом случае в результате посттрансляционной модификации будет удзляться дапептид Ket-Glu.

В/ Структура полшептида

Для полипзптидной цепи CPa-ü (продукт гена рзЪС) содержание гидрофобных аминокислотных остатков составляет 44%. Этот белок имеет ту хе схему строения, что и СРа-1. Как и в СРа-1, в' СРа-2 имеется характерный гидрофильный сегмент между предполагаемыми V и VI трансмймбрашами тяжами. Его длина составляет 23% от общей длннн белковой цэпи в СРа-2. Анализ данных табл.2 (II) показывает, что консервативны все 17 Тгр и 13 His працоссирован-ванной цепи СРа-2. Значительной консервативностью обладают остатки Туг, Pro, Gin. К в СРа-1, и в ОРа-2 пары остатков His, находящиеся б трекскембрзнных сегментах, трижды образуют ха-рактернуг структуру: даа остатка Kis на расстоянии 13 аминокислотных остатков.

3. Tewj psfcE и pab?

А/ Клонирование и секвенирсвание генсв рзЬЕ и рзЪР

На основании данных Хирда о локализации этих гоноз у пшеницы была выбрана плазмида рНтсР4, содержащая фрагмент Р4 длиной 13,5 тыс.п.о. (см.рис. !). Этот фрагмент был подвергнут рестринтному анализу с последующим разделением полученных субфрагмептов электрофорезом в агарозном геле. Зоны, содержавшие эти гены, идентифицировали блоттангом с использованием в качестве гибридизанионной пробы - меченого ожгонуклеотида с!(АТОТСТСОААССАССОСАОА-АССТТСТТТТОСТ), соответствующего 5'-концевому участку гена рзЬЕ пшеницы. Вили отобрали зоны, соогЕетствувдгэ БшгШ- фрагментам и

Т АВТТА S £ А

_L__i__I_L_'•!__' i i

I I psdk _~1 Г~рв5Р~Т~|' psbL I ~| psbJ I

FO > F2> Í5> P6>

< F3 <F4 < F7 < У8

100 200 300 400 5 CO 600 700 800 i--x--x-x-x--X-x-r-x

Рис.6. Рестрнкткая карта генов рвоЕ, рв№, pabL, pabJ (0РС40) хдорсляастнса ДНК кчмйея и стратегия опрздалашк кукааотадЕо£ по-слсдоватальносиг этнг генов. Условные обозначения: T-Taql, A-Alul, E-EcoRI. Стрелками обозначены синтетичзскиз олигонуклеотвда, использованные при определении первичной структуры.

ГЬ Е —► S С S Т G

1 AAICAATTOCTraraGAATGrAOAAAAArgTTOGOAGTTOAGOATGTCTCGAAGQACGGG

ERSPADIITSIRYWVIHSIT 61 AGAACGT'rCTmCOIGATAnUT'rACCACTAT-PCGArAOTÜGGTTAMCATAGCATTAC ILCLÍ IA GWLP'YS TG LAYBY 121 TATACCrTCCCTATTCATTGOGGGMGGMAaOTGTCAGílACGCGTTSAGCraAíEGACGT FGSPRPNEYF'ÍESRQCIPXI 131 Gm^GGAAGTOCTAGGCCAAA.CCAATArK!CAOGGAAAGCCaACAAGGAAiriCCGraAAT

2? D К ^ ОБЬЕОЪОЕУЗКБ?5* 241 AACCGACCGCTraGATOCTrgAGMOAACTCGM'GAA!rga!AGgAGATCCa>I^AGGAGGC

p3Ö P —►

MTIDRTYPIPTYRViLAIH 301 ncíCAATGACOATAGATCGAACOTATCOTAEKSírACAGTGCGATGGCPGGCl'AraCACG

GIAVPTVFFLGS ISAUQÍIQ 361 GACTAaCTGTACC,rACTGTCTaTraC5>rGÜGASCMI'ATGAGCAATCCÁGra6¿TCGAAC

psb L —*

R * IÍIQSNPNEQKY

421 GiTAAACCAAATTOCAACTATAGAAOTATGAOACAAl'CAAACCCGAATGAACAAAASGra

elnrtslywclblify lavl 4S1 GmTC^TCGTACCAGaraATAC5GGGGXOTATXACTCAm^PGCPAGTTG&TG'rTr'i,A

FSNYFPN* 541 ra-ttocaappa ott cracmttgagag aaagaaagag aotaataag аагтстомарс с с 601 amtggaaagataggatgc'xtataag'i4cgga3:gactgtk:fí-XGl,c2ctagga,i'gaccaa

ГЬ J —»

ADFCGRIPL 661 TTGAgAAAArGSGGAGGAAAGrAGGGGAAAX'GGGGGATAOTACTGGAAGAAJTCCIQggg

SLIGI'VAGIpyiCLVGVFFY 721 0GCfíGATAGG'ÍACTGa,AGC5G0TATTCCTGÍGATÍGGTlTAGTAGCTGmíCraraA'r-G

gsysgiigssx* 781 ctocatatrc-tggaiigggttoatctctarag

Рис.7. Нуклаотадная последоззтельнссть pEbS, psb?, pcbL (CPC40), pebJ (QPC3S) хлоропласгвоа ДДК ячшея. Сверху нуклэотцц-ной последовательности кодирующей: цепи показаны соответствукчсэ ей аминокислотные последовательности. ПодчЭрккуты предполагаемое ркбосоысвязызакцие сайты. t

-Т7-

£COl47I - ÎparfiQUTBM длиной около 4,2 тис.п.о, и 3 тыс.и.о. соог-БбтстБэ:шо. Фрагменты элюгровали из агарозного геля и клонировали в pBSH13+. ОтОср клоное проводили гибридизацией in si tu с тем у.ь 33-звеннш сянгонуклеотидом, а после выделения плазкидной ДНН -рзстриктннм анализом. Для дальнейшей работы Сшм стоораш илззми-ды pESK1 к pBSE2, ссдерхавкате Ecol471-фрагмэнт в обеих орквнтацк-ях, в такха плазмида pBSJS, имевшая Bairfil - фрагмент в прямой ориентации относительно 1ас-Ерсмстора вектора p3SM12^-.

Для определении нуклеотидной последовательности stiec генов наш Сил использсгак тот sa подход, что и ттрл секвенлровании гена рэЬС. Рестрихтная карта генов рзЪ2, psbF, рзЫ (0РС38^ и psbJ (0PC4Q) хдсроаластной ДНК ячменя и стратегия определения нухлзо-тидной последовательности приведены на рис.6, a на рис.7 показаны иу^леотидгиэ последовательности этих генов.

Б/ Структура генов psbE и рзЫ*

Анализ нуклоотадной последовательности, представленной на рис. 7, выявляет 4 открытые ракки считывания (ОРС), организованные в следующую структуру:

0РС83-1О П.О.-0РС39-22 П.О.-0РС36-125 П.О.-0РС40.

По даши,! Вестзоффа все ОРС транскрибируются в зидо едяной матричной РНК размером 1100 оснований. Эти ог.фытне рамки считывания соответствует генам psbE, psbF, рзЫ СОРСЗЗ), pstJ (0РС40). П литературе существуют разночтения в обозначении 0РС38.

Опубликованная структура фрагмента пшеницы (554п.о.) включает в себя теш psbE, рзЬР и часть гена рзЫ. Выявлено единственное различие: в 3 позиции 5-1 кодона (GJu)- гена psbE ("G" - у шеншк, "А" - у лчмоня.) Сравнение соответствующих нуклеотидннх последовательностей ячменя я табака показало, что эти гены имеют следу-эдий процент гомологии: рэЪЕ - 92,45, psbF - 91,6%, рзЫ. (0РС38) - 34%, psbJ (0РС40) - 91S. На расстоянии 6-12 нуклеотидов перед инициирующими кодонамн генов psbE, psbF, psbJ (0РС40) расположены последовательности, комплементарные 3!-концевому участку 16S рРНК и, вероятно, являющиеся участками связывания рибосом, причём у psbF эта последовательность перекрывается со стсп-кодоном гена psbE. Такая организация этого района хлоропластной ДНК у ячменя полностью соответствует его организации во всех изученных видах растений.

г

\ UGIi'WV^mYUroFGR^mVîn'ALVSmcSRiLYH^ViDPSDP^

г ....................а............................................................................е..

4 ........................................................................N........................CA.

5 ..............................А.........................................H.......Т................CA,

1 ................1..........А.........................................H.......T...I.D.S........CA.

8 ...................IA..I................................................к.......Т.Е....А..........V.

9 ...................1...L......Л............I..S..A..H.........L...A...V.S..N...VT.E.CU)..P..y______А.

ï ['.'.'.'.'.'.'.'.".'.'.'.'.'.Y.'.'.','.'.'.с'.

з .......................с.....................s.................................p..;...v.......'.r '."

7 .M...........................................s.................................P.CS...Y............

8 ..L...L..............L.R.....................S..L..A.........F.....X...........P.A..................

9 . .L.. -L----V----F... .L. V.P.. .ISA.....К.......D.Ii........I. .VU.. .Ц..........H. .Р.А.Е. ,РЛ. .H. .N.. .VVA

1 ASSK3TEMAETOÏIGffl№AKKIJRAtSlŒNGECIAVCî^HPV?M>Krc

4 ! '. \ ! !.' ! ! ' '........................• >. • ...........................• • • • • -..................

5 ............'....................i........... .......... .CD..........................

7 ................ ' . T....................... I GD..........................

8 ..................."!"!'..!.a........'..'. 'к 'к""ii.....i......'."'.'.____О..........................

9 .......T......V..S........T.A.NS.....QE.I...ÍÍK..!....¿.....N.......Iläl.AD.V....1...:S—P. —T... .S

1 тСШСтаБГОАтеШАПКОЬСЕЫ'ШМИ^ЕСТ?

г.........s.........................................................................................

4.........S.............A...........................................................................

5 .........S.............A......................................................................A...L.

7.........S.............A................................S.............S................V.....A...I.

8......D..SP............A.......F.............................................................A...b.

9____A.D.OTP.N.SD...P..KA....G.DF.TE.FN......T...........V.............S..........V..G.EE.....V.A...

I CfITKKQAV»

г ....п....»

Л____RR. .A»

5.....R..A»

7____RR.С. о

8.....R.VI«

9 .1E.R.E.«

Та(5л. 2(1)- (««• 0ТР- й0>

i

1 1Ш1МСТ1£1ЬАСШ0£УКРРЧГ&УКСШО1ЕТУЬ55£1МУИХА?^АСТЩГС^

2 .....................................................................................................

4 ..........................................................................................d....................„

5 ...............;.........................................................................А.....Q--------CD

7 ....................S....................................................................А.....в.F.. i

а ......I..........................V...........................А................F.....D. .Ш5К........

9 ......IV..I......Т....Е____А...............................M................К____E..4...DSÍ...G.A...

'■> ..T.................U................'.'.".'.'.".......................................................

¿ .................-Jk.T....................::::::::.......................................:

T ■ T........P........LT..................................................................

ñ......Q....P........U.G..........................................................................

9 ••T.s.....SP.V..S.-.SHVC...IPS......;:;:;;::;:•;:::::;;¡:;::::::

' FccmmrovscvmissivixiFc<;iYWj,crm£ESFTmYvE!D№№

3 ii................................y................................£................................

4 .. ............................. .................................................................

5

6

7

8

..I. .IV.

.Í..F..

.Y.....

.f.....

.?.....

.y.UF.

Л..Г. .V.

■ YS5.

■ K...

.X.q,

............!.S...

............I.....

............i.....

■ N.I.Y......C...1,

ittTLSJv/CTsm^rpccœezvsreiimîiiraftTL^^

3

4

Ь 6 'F* ...I............ ...IL........... .......S. С .IL...... .IL...... ..L...... .. L...... ......G...____ ____P... ____P...

7 fl • V. ...I...С........ .....I .V. • IL...... ..L...... . .1...... ......С..Д____ ____P...

9 N.Al.......А____ .... I. .NIBÍ... ...I.I .L, .IS...... .....G. . . .1.1..... ......G...IM.. •SV... ____r...

.........................................«..........................................................

......Ï....S...............IA............а...з.л...........y-o...........

LGSIiíSVCGVATEItUVÜíY ÍFr£^l^H?\T£y№A-GIMl*C4AKAAAACKl¡Ki;iDR0L!!!>VL'nafPUl« ...........I................t....................................•

......t..

.I.DV.E?...

____С____

'.'.'.А.'л'.'.'.'.'.'.'..-Í-

.............У____S.T...»

.............F....S.T...»

............ET..T.F.FD.D«

Табл. 3(11). (см. стр. 20)

-PO-

ni

1

6

а

1 CmnDKBCSLSOLBEFSRSFa

2 ......................•

5 ......Ú...P...........S»

6......S...............•

8 BV----С..H____I...TK..«

9 KL.IIAS.ÏD<Q.IQÎ?1W»

I?

1 vrioa——roi?wra(UKsuvPTra?bGsi2iBaH<№» г

5

6 8

9 .ATQKFi«Rr.

......V... ......7... ......V... V * .....S........ .....S........ .....S..А.....

1 UAOTICRIPLSLIGTVACIÎVICLVOTFÏCS'ÏSCUBSI.«

г ...................a................ — »

5 ...........i.......L,л .i.i.............«

6 ..И........Г.......V____I.L............V*

8 ..N____V...........L......Г.............•

'I

1 kUTor/ix6sxp№XR?CAC£iJX?iM5^

г

5 7

0 »

......R.K..........

...H..RSG.R..AV.D.. ...S. .RS...P.TV.A.. III.TP.ÎHC.KS.I.DI.

Hi

V____

V____

v..yv

ÏKSSILLDCIÎ.TH» ----V.........

1

г

5

7

8

9.........VSVSÜ»

.sa.»

-SSL.

Vil

г.....................................

5 «....................................."

6 .!!"s!'!il.У.'.'.'.'..'..'.У.........«

8 ...Г...К.5............................•

Табл. 2. Сравнение ыгагоккслопЕа последовательностей продуктов генов раЬЗ (I), рзЬС (II), реЪ2 (Ш), peb? (IV), pabJ (V), pBt)H(VI), pgbL (VII), ячменя (Kordsua Tulgara) (1 ) с продукте^ этих генов зводззцконно - отлетшх групп оргаЕкзиоа: 2 - рога (Secale cereale), 3 - пвекица (Triticiua aestirum), i, - кукуруза (Zea mais), 5 - табак (Nicotians tabaoua),. S -горох (Pisan sativum),7 - шпинат (Spinacea oieraoea), 3 - печ5ночный мох (Marchantía polymorphs), 9 - цианобактерия (Syneohooystis 6503). Предполагаемые мембранные доизны подчеркнуты, делащпг отмечаю: как "-", стоп-кодсны - как

-?г-

В/ Структура полипептидов

Полигмптадиые продукты 9 кД и 4 кД, кодируемые генами роЪ2 и рзЬ?. связывает гем щгеохрома Ь-59 (табл.2, III, IV). Продукт гена озЬЕ содержат одааственный гидрофобяый тля длиной 26 аминокислотных остатков (с 19 по 44 остатки). Этот трансмембранный тяа, существующий, вероятно, в виде в-сшгрялк, ограничен по-лоЕИтельно зарнкенным Arg18 и отрицательно заряженным Лзр45. Продукт гена рзЪ7 также содержит единственный гидрофобный доке:: для-ной 25 ашнскислотяях оетотков, ограниченный пояснительно заря-кеннкми Arg12 и Arg38. Оба апопротеина содеркат крайне консервативные остатки His <Hls£2 я His17), расположенные вблизи стро-малькой повэрхнссти тилокоидной мзмбракы и координирующие ион ггелеза тема цитохрот«а G-концевоО сегмент большой оубъедини-

ницы, зкспонированкый з строку, частично экранирован гидрофзлъш-ншш белками кислородаыделящего комплекса.

Продукты генов рзЫ, и psbJ (табл.2, 7, VII) содеркат по одному гидрофобному сегменту и, вероятно, яачявтся интегральными мембранными белками, один раз пересэнаяцими мембрану тилаксидов. Точная локализация и функция продуктов этих генов в настоящее время не ясны. \

ВЫВОДЫ.

1. На основа вектора pBSiJI 3+ получена серия рекомбинантных плаз-мид, содержащих геш хлоропластной ДНК ячменя, кодирующие полипептида фотосистемы II.

2. Установлена нуклеотидная последовательность фрагмента хлоро-плостной ДНК ячменя (5,2 тыс.п.о.), содержащего гон рэЬВ, который кодирует хлорофилл-СЕязывадцую субъедишщу 47 кД и ген рзЬН, кодирующий фосфопротеин с молекулярным весом 7,8 кД.

3. Установлена нуклеотидная последовательность генов psfcE и рзЬР, кодирующих субъеднници 9,3 и 4,4 кД апопротеина цитохрома b559* а такх8 Фрэгмэнта гена рзЬС, кодирующего хлорофиллсвязы-вапцую субъедиотцу 43 кД.

4. ПроведЭн сравнительный анализ аминокислотных последовательностей этих полипептидов со структурами соответствующих полипептидов других видов растений. Все исследованные полипептиды характеризуются высокой консервативностью первичной структуры.

Основные результаты диссертации кзлозгеаы в следук^х статьях:

1. S.Y.Rererdatto, A.V.AndreevE, А.А.Вигуакоуа, O.G.Chakh-makhcheva, and V.A.Efijnov. Nucleotide sequence of the barley ctilorcplaat psbC gene. - Hucl. Acids Res. 1939, V.17, N 10, p. 3S96.

2. S.V.Reverdatto, A.V.Anireera, A.A.Buryakova, О.О.СйаМаваИг-ctieva, and V.A.Eiimov. Nucleotide sequence of the 5.2 kbp barley chloroplaat DNA fragment, containing psbB - pabH -petB - petD gene cluster. - Nucl. Aeicl3 Res. 1989, V.17, N 7, p. 2859.

3. S.V.Reverdatto, A.V.Andree?a, A.A.Buryakova, O.G.ChaMioaXh-ciieva and V.A.Eflmor. nucleotide sequences of the barley chloroplast рэЬЕ, psbF genes and flanking regions. - Nucl. Acids Res. 1939, V.1Tj N T, p. 2858.

4. Ефимов 3.A., Андреева А.В., Рэвердатто С.В., Чахмахчева О.Г. Фотосистема II ячменя. Нуклеоткдяая последовательность генов psoB, psbC, psbK , psb?, рзЬН и примыкающих к ним областей хлоропластной ДНК. ^\Биоорган. химия 1S91, з печати. у