Структура хлоропластных генов ячменя psbB, psbC, psbH, psbE и psbF, кодирующих полипептиды фотосистемы II тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Андреева, Александра Владимировна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
1991
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
АКАДЕМИЯ НАУК СССР
ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ УЖСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им.М.М.ЩЭйЯКИНА
На пробах рукописи УДК 577.113.5
Андреева Александра Зладгелкрэпна.
СТРУКТУРА ХЛ0РСШ1АСТКЫХ ГКО1! ЯЧгЛЕНЛ рзЪВ, ргЪС, рэон, рзЪЕ к рас?, КОЛЙРУИЙХ ПОЛИГ^ЕПТИДЫ ФОТОСИСТЕМЫ II.
02.00.10 - Биооргашиеская хшяя, химия природных и физиологически сп:тивнкх рчществ
А ВТ ОГ.ЕФЕРА? диссертации на соискглгло ученой степени кандилЕта хиьжчокзк наук
МОСКВА - 1991
Работа наполнена в Институте Оиоорганической химии иыени М.М.Шемякина Академии наук СССР
Научи не руководители
академик Ю.А. ОВЧИННИКОВ
доктор химических наук В.А. ЕФИМОВ
Официальные оппоненты: доктор биологических наук М.С.Одинцова доктор химических наук Н.Г.Абдулгев
Ведущая организация - Институт почвоведения и фотосинтеза АН СССР.
Защита состоится им-^'лу 1991 г. в час. на заседании специализированного совета Д 002 35 01 по защите диссертация на соискание учЗной степени доктора наук при Институте Сисоргаккческой химии им.М.М.Шемякина АН СССР по адресу: ¡17871 ГСП Москва-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.
С диссертацией мокао ознакомиться ь библиотеке Института биооргзнической химии им.М.М.Шемякина Академии наук СССР.
Автореферат разослан "'/У" ер&б^счл^и 1991г.
Учёний секретарь специализированного совета кандидат химических наук
Актуальность проблемы. Исследование процесса фотосинтеза представляет собой одну из фундамэнталькых проблем биологии. У высмх растений процессы фотосинтеза локализованы в хлоропласта*. Эти органеллы еолздают собственным геномом, и непосредственно в них кодируется значительная часть белков,'ответственных за фото-синтаз, в том числе полипептады фотосистемы II. Анализ структурно - фугссциональной организащш хлоропластных генов представляет значительный интерес как з фундаментальном отношении (в частности, для понимания организации геномов в целом и их молекулярной эволюции), так и с практической точки зрении (например, создание сортов гербицидоустойчивых сельскохозяйственных растений методами генной инженерии, так как именно фотосистема II является мишенью для некоторых гербицидов, блокирующих процесс фотосинтеза и применяемых з сельском хозяйстве).
За последние несколько лет в этом направлении наметилось значительное продвижение вперед благодаря тому, что были определены полные куклеотидные последовательности хлоропластных геномов двух растений, а именно: печеночного мха Marchantía polymorphe! и сосудистого растения Nlcotiana tahaevn (табзка), а позднее ещЭ одного представителя семейства однодольных - риса (Oryza sativa).
В это кс врокя был накоплен богатый - фактический материал о структурной организации генов фотосистемы II у двудольных растений, а такие у цканобактерий и одноклеточных зелёных водорослей. Однако, для однодольных растений, в том числб для культивируемых злаков, этот вопрос оставался малоизученным.
Таким образом, установление структуры генов, кодирующих полипептиды фотосистемы II ячменя (Hordaim vulgare), является существенным вкладом в указанную область исследований.
Цель работа. Настоящая работа является частью исследований по установлений первичной структуры полипептидов фотосистемы II ячменя, проводимых в груше белковой инженерии КЕХ им. М.М. Шемякина АН СССР. Работа посвящена определении нуклеотидных последовательностей геноз psbB, psbH. рзЬЕ, psbF, а тахж? фрагмента гена psbC.
Научная новизна я практическая ценность работа. lía основе вектора pBSH13+ получек набор рзког-бинактних плазмвд, содержащих гена рэЬЗ и psbH, psbE и psb?, а таккэ фрагмент гена рзЬС. Определены полные нуклеотидные последопательности этих генов и прчмыка-юкх к ша! областей, что позволило вывести аминокислотные последовательности полнпаптидкых цепзй и провести сравнительный анализ
сэ структурами этих полипептидов из 7 видов наземных растений и цианобактерии Зупес1хосузХ 1э 6803 . 3 результате выполнения настоящей работы созданы условия для проведения дальнейших исследований по получению мутантпых генов белков фотосистемы II и их экспрсс-сии. Математическая обработка полученных данннх представляла бы интерес с точки зрения проблем молекулярной эволюции растительных
гококов.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы четыре статьи.
Объёц работе. Диссертация изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, обсукдекия результатов, экспериментальной часта и выводов. Список цитируемой литературы включает /6 3 наименований.
ВВЕДЕНИЕ
Фотосистема II осуществляет перенос .электронов от молекул воды на молекулы хинонового производного, при этом создается трансмем-брзшая/разность электрохимических потенциалов и выделяется кислород. Фотосистема II является белково-пигментным комплексом, состоящим из внемэмбранной части и интегрированного в мембрану так называемого "ядра". Енемэмбранный кислсрод-выделяксдай комплекс включает в себя но мэнее трбх растворимых полипептидов, а "ядро" - не менее ¡0 субъединкц хвдрофобной природа размером от 4 до 47 кД, с которыми связано около 50 молекул хлорофилла а, причём с двуия наиболее крупными субъединицами, хлорофилл-связыващм.к белками СРа-1 (47 кД) и СРа-2 (43 кД), ассоциировано 20-21 и 26 молекул хлорофилла а,соответственно. До недавнего времени полагали, что компонентом комплекса "ядра", связывающим хлорофилл реакционного центра, является белок СРа-1. Однако, опубликованные в !98? году, данные Нанба и Сато свидетельствуют, что минимальный реакционный центр фотосистемы II состоит из четырбх пелипептидов: белка Б1 (32 кД), Б2 (33 кД) и двух полипетидов цитохрома Ь55Э. Еопрос о функциональном значении СРа-1 и СРа-2 остаётся открытым.
Исследование функциональной роли полипептидных компонентов фотосистемы II непосредственно связано с выяснением деталей их структур. Гидрофобная природа относительно крупных полипептидов затрудняет определение аминокислотной последовательности значительной части этих белков методами белковой химик, поэтому перспективным является выведение структур полипептидов из нугслэогид-ных последовательностей их генов, тем более, что гены, кодирующие
полипептиды фотосистемы II, находятся в относительно просто организованной ДНН хлорсгхластов.
В качестзе источников генов рзЬВ, рэЬС, psbH, рзЬЕ и psbF, кодирующих не;;эторуэ полипэптиды фотосистемы II ячменя, использовали плазмг^л.сории pHYcP, любезно предоставленные д-ром Т.Х.Н. Эл-лисом (Англия). Плазг-шда этой серии были получены на gchobs вектора рАТ 153 и несли фрагменты (PstI- PstI) хлороштсткого генома ячменя, в дальнейшем обозначенные Pi, Р2 и т.д. Физическая карта хлоропластной ДЕЖ ячменя представлена на рис.1.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОВСУЖДЕКГЕ 1. Гены psbB и psbH
А/ Клонирование и секвенирование генов psbB и psbH
Фрагмент хлоропластной ДНК ячменя Р2 (см. рис. 2), предполони-тельно содержавший гены рзЬВ и psbH, вырезали из плазмида pHvc?2 и подвергал! рэстриктному анализу с последующи?.; разделением полученных фрагментов электрофорезом в агарозном геле. Зоны, содержащие искомые гены, идентифицировали блэттингом с использованием е качестве гибридизационной пробы клонированного фрагмента (1160 п.о.) гена ШЕяата psbB, любезно предоставленного д-ром Р.Г.Херр-манном (ФРГ). '
По результатам гибридизации (с учбтом литературных данных) бала построена рестриктная карта фрагмента Р2 хлоропластной ДНК ячменя, приведЗнная ка рис.2.
Две зоны, ссдер-дакпие фрагменты (ВагШ-ВапШ ; 4,6 тыс.п.о.) и (Kpnl-Fotl; 5,2 тыс.п.о), вырезали из игарозкого геля и фрагменты клонировали в плазмиду pBSMl3-(Stratagene; США) по сайт; Bairffî _ и в плазмиду pBSKi 3+ ira сайтам Kpnl-Рзг!. Отбор кленов .фоводшш гибридизацией in situ с тэм se меченым зондом, а после выделения елззукдноЯ днк - рестрнкгпым анализом. Так были получены плазмкдн рВЗ к рВ2, кесущко BamHI-фрагмент в обеих ориентация^, и рВ1, несущая Kpnl-Pstl-KjparMeHT.
Нуклзотаднуи последовательность клонированных фрагментов ДНК определяв методом термиизгрования синтеза ценя за одкоцепочечной ДНК-катр'лцэ з присутствии дидезоксинуклеотидсв по Сзнгзру.
Для определения нуклеотидпоЗ последовательности искомых генов были отобрана плас-мидн р31 к рВЗ. Бнброккй. нами метод "делециои-пых мутантов" по згеникоффу значительно упростил подготовку ДКК к
Рис. 1. Рестриктная карта хлороплэстной ДНК. ячменя. Скобкой обозначат инвертирооаша^е повторы в х-юрсплгстном гекои:з ячмзня. Показаны фрагменты, полученный при сЗраОстке ?stl (PJ ) и SalC-I (SI). Размера фрагментов дает в тыс.п.о. (Day A., Ellis ii.H.N., 1985)- На карте показаны локализация и направление транскрипции генов фотосжстэмц II: psbA, рвЪВ, psbC, рзЬЕ, рвЬР, pebj, рвЪН, psbL, а тоже ОРС 3S, ОРС 43 и гены petB, petD цитохрокшого 1/Ьб комплекса. Звёздочками обозначены гены, содержащие интроны.
Табл. 1. Структура сжтеигчесглх олигонуклеотадоз - врзйызроз и эондов, использованных для определения нуклвотидной аоследоиа-тельности генов фотосистем II. Плотным шрифтом обозначен нуклзо-тид, не соответствующий аналогичному нуклзотиду в хлоропластной ДНК ячменя.
СТРУКТУРА ЧИСЛО
ОЛИГОНУКЛЕОТИДА ЗВЕНЬЕВ
PSB в 1 UP CC-ACGTTGTAAAACGACGGCCAGT 24
2 ГОЛ? GCAAACAGCTATGAGCATGATTACGCC 27
1 CI GAGCTCA'IGTAGCCCATGC 19
2 С2 TATCATGCACTTGTCGGACG 20
PSB с 3 СЗ TGGATTGTTAGTGTGGACGAT1T 23
4 СО CATTAGCTCCAAGACGCTGG 20
5 С4 GCAAGTATACAAATGGAACC 20
б СБ ATTAAGTGAATACCTAAAAT 20
1 РО AIGTCTCGAAGCACCGGAGAACGiTCTTTTGCT 33
2 F2 ACCGACCGTTTTGATTCTTTAG 22
3 РЗ TCCTTGTCGGCTTTCCGTGAA 21
■ PSB Е 4 F4 TTATCGTTGGATCAAGTG 18'
5 ?5 AATGAACAAAATGTTGAATT 20
6 F6 TCTAGCATGACCAATTGATA 20
7 FT ATCAAT'i'GGTCATGCTAGA 19
8 F8 CTATAGAGATGAACCCAATC 20
Рис. 2. Рзсгршстная карта фрагмента F2 глоропластной ДНК ячпекл и схема получения двух cap:ifî "делецконшх иуталтов" для опре-дэлеиня нукдаоиздкой последовательности генов psbB и psbK.
Обозначения: Е - Eco RI; Р - P3tl; H - HlndlII; В - BamHI; Sm - Smal; К - Kpnl; 3c - SacI; X - Xbal; UP - универсальный прэймер; RUP - обратный унишрсалышИ лраЯмор (см. табл. 1); gggi - зкосни; Sg^ - нитрона.
секвенированп, так как отпада необходимость в делении гена на субфрагментк i их последующем клонировании.
Получение "д&геционных мутантов" проводили по схеме, представленной на рис.1. Ллазмиды pBt и рВЗ расщепляли двумя скдонуклоа-зами рестрикции (Xhol, Kpnl в случае рБ1 и SalGI, SphI в случае рВЗ), какдэя из которых имела по одному участку узнавания. В реакционную смесь, содержащую линейную молекулу с выступавдими 5'-к S'- концами, добавляли экзонуклеазу III E.coít (ExoIII) и отбирали аликвоты через равные промекутки времени, получая таким образом набор фрагментов с 5'-концевыми делениями различной протя-кЗнности. Обработкой SI-нуклеазой удаляли 5'- и 3'-выступавдие концы и проводили лигирование. Аликвотами лигазных смесей транс-формировэли клетки E.coli MV1193. Было отобрано по 24 производных от рВ1 и рЕЗ конструкций, содерз;авлшх искомый фрагмент хлорапла-стной ДНК в обеих ориектациях с делениями различной протяженности кнк с 5'-, так к с 3'-конца гена р&ЪВ.
Использование векторов p3SM13+ и.рВБМ13- позволило получать одноценочечную матрицу, минуя этап переклокированпя в фаговый вектор. В качестве праймеров были взяты так называемые "прямой" (UP) и "обратный" (P.UF) универсальные праймеры, представляющие собой 24 я 27-звенше синтетические олигонуклеотиды, соответственно (см. табл. 1).
Нуклеотидная последовательность Kpnl-Раti-фрагмента хлоропластной ДНК ячменя длиной 5,2 тыс.п.о. приведена на рис.3; кроме геноз рзЬБ и рзЬН, данный фрагмент содержит геш petB и, часптч-но, petD, кодирующие белки цитохромного Г/Ьб комплекса.
Б/ Структура генов рзЬВ и рзЬН и примыкающие к ним областей хлоропластной ДКК
Анализ показанной на рис.3 последовательности выявил гены рзЬВ, рзЬН, petB и, частично, petD. Продукт гена psbB (47 кД хлорофилл-связывающий балок CFa-1) кодируется 508 кодснами. Район между генами роМЗ и psbH составляет 553 п.о. Идентифицированы две открытые pai.cc;: считывания (ОРС): 0РС38 и 0РС43, гомологичные обнаруженным в хлоропластной ДНК печбночного мха Marchantía poly-morp-из, транскрибируемым 0РС35 и 0РС43. 0РС38 расположена на расстоянии 154 п.о. от терминирующего кодона гена psbB на той se цепи, что и psbB, тогда как 0РС43 находится на противоположной цепи между 0FC3S и геном psbH.
1 СТОСАСТТОССАМТТТТАССОСАаХСАСАОСАСАОАТАССССТОАТаТСССОСаСТССТ 61 ТТТаССаТТАСССАССАССССОТСАСТАССТСААСАССАСССАСАССТаАТАаАААСАОА 121 АСССАСТССАССйССГСАААААСАССАТСАТАСАСТАААТСАОТААаТТаОСАССАССАА ргЪ В
маъряукунтууьивраньь
181 ТОСаттааССТТОС-гАТСОТаГТСАТАСТОТССТАГТОААТСАТОССССТССАТТССТТТ
ЗУНХЫНТАЬУЗОЧУАОЗМАЬУ 241 СОаТОСАТАТААТОСАСАСАаСТСТАОТТТСТССТТОааОТСССТСААГООСТГТАТАСО ЕьлурврзвруьвРкиАаам
301 ААТТАССАСТТгаТСАТСССТСТСА.ТССТСТТСТССАТССААТаТССАСАПААСйГАТОТ
РУ1РРМТАХ|С1ТВЗК00Я31 361 ТССТААТа?СССТГСАТаАСТССТТТАСа.1иТААССОАТТССТСаСОТСОТТаОАСТАТта
э а О Т V Т N • Р 01№ЗУа07ААТН 421 САСаАССА4.СТСТААСАААТОЦСааТАТТТаОАиТТАТаА_А.СаТСТаССАССТАСССАТА
1УРБ0ЬСРЬАА1№Н\¥УУ»ВЬ 481 'Ггс-тстгт-тстааст'гатсетгст-гоасАССОАГСтос-САтгссотАа'АГТсссАСстАС
Е1РЗВ311ТСКР31,В1,РК1Р0 541 АААТАТТСТСТОАТСАСССОАСОСОААААСССТСТТТСОАТТТССССААОАТСГО'ГССгАА
1НЬРЬА0УАСР0Р0АРНУТ0 601 ТТСАХТ-ТАТТТС'ТТССАОС-аОТСаСМОСТтаООСТТТСССаСАТТТОАТСТААСОССа?!
ЬУСРаХИУЭВРУОЬТОКУОА. 661 ТСТАТОС-ТССТССОАТАТСООТАТССОАТССТТАТ'ОСАСТААОТСОААААСТАСААССТй
УКРАИ0АЕ0?ВРРУР001А5 721 ТАААТССАаССТССОСГаСАСААСС-т-ТОАТССТТТТСТТССОСаССаААТАССТТСТО
НН1ААЙТЬа1ЬАСЬРНЬБУК 701 АТСАТАТТОСТаСОСОГАСАгТОССТАТАТТАССОСОСТТАТТССАТСтеАаТОТССОТО
РРОАЬ5ГКОЬНМСН1ВГУЬ35 811 СОСОТСААССТСТАТАТАААГ,ОАТТАССТАТСООСААТАТТСАААС?ОТАСТтаССАСТА
ЯГААУРРА. АР УУАОТМЯУОБ 901 отАТСоса?остсттт,тасАос№тсотАС,гтаса'ООААса,Ата'Х'сатАтсс.отсАО
ЖТТР1Е1.РОРТ11УЧЯПаОгТ' 961 СААСаАССССААгСОААТТАТгаСССССТАСТСОТТАТСАаТОСаАТСАаааАТАСТТТО qqeiy rrysnglaenlsi.se 1021 АаСААОАААТАгАТСОААСАС.ТТАаСААТСОТТТАСССаААААТСТТАСгаТАТСАСААО
АИ8КХРЕК1.АРУВУ1СМНРА 1081 С2ТС-ОТСТААААТТССССАААААТТАСССТТТТАТОАТТАТАТТССТААО?ААТСССОСАА
ХООЬРКАС5МСНСВС1АУСК 1141 АА0ССС0АТТАТТ0А0А0С0ааСТСААТС0АСААТСа0аАГГ,СААТАаСТ0ТТ0ПАТ0СТ
ЬОНРУРИВКЕОКЕЬРУККИР 1201 ТАООАОАГССССТСТГТАОАСАТАААСААаСАСОТаАССТТТТГСГАСаСССТАТСССТА
ТРРЕТРРУУЬУВКЕСГУНАВ 1261 С'ГТТгТТТаАААСАТТТССССТТОТТТтеСТАСАТСАССАаССААГТСгТАСАОСООАСС
УРРИКАЗЭКУвУЕОУСУгУЕ 1321 таССТТТТАОААОАООАОААТССАААТАТАОТСТТОААСААОТАСаССТААСООТООАОТ
РУСОЕЬМОУКУЗВРАТУККУ 1381 ТСТАТСОТСОСОААС'ТТААТСОАОТАААТТАТТСТСАТССТССТАСТСГАААААААТАТС
Рис.3. Нуклеотвднзя последовательность фрагмента хяоропластноЗ ДНК ячиекл, содержащего гэкы рзЪЗ и реЬН, а такт» рэ^В, рвго, ОРС 33. 0РС43. Свергу нуклеоткдной последовательности кодирующей цепи показаны соответствующие ей гмкиокислотгша последовательности , Подчёркнута предполагаемые рибосомсвазызающие саЯтк, а также -35 и -10 участки промотора. Стрелками обозначены потенциальные вторичные структуры. Терминирующие кодогш обозначена "*". Курсивом обозначена функционально значимые элементы интронов регв и ре1:В.
ARRSQLC E 1Г-Е. LDRATLKSD 1 441 CGAGGCGTTCTCAATTAGGG3A,'JLTTTTTGAATTAGACCGGGCTACTTTGA.UTCCGAT0
GVFRSSPRGWFxPGHATFAb 1501 GTGTTTTTCGCAGCAGTGCAAGCGGT^GGTTCACraTTGGTOATGCTACC'MTGCTTT'GC
LPFPGIIIWHC-ARTLPRDVPA 1561 TCTTCTT'rTTCGGACACATTTGGCATGGCGCTAGAACATTCTTCCGAGATGïTTTTGCïG
GIDPDLDAQVEPGTPQKVGD 1621 GTAMGATCOAGAIITl'GGATGCTCAiGTGGAATTirGGAACATTCQAAAAAGI'GGGAGATC
PTÏKEQAV* 1631 CAACTACAAAGAAACAGGCAGÏCîGATACACAT2GTTATGGTATCTTÏOACCTCTCl''i,"ra? 1741 TTGATITGASÁ^CTCCCATCCTTTOTTTnACTCTTT^CT^CTTíAyA^GGGAAAT'TO'T
1801 ÜCC^TGACA>J>tgaataggtgtggaagtoat^V;G?G^¿AA^JUÜCAGGATGGA¿'1-C,J orf 33 -*
1861 ATGGAAGCATIÜ0TTa?4TACGTrCCTa'TTAGTia;CC-ACTTTAGGaATAATOTT?TTCGg,J
1921 ATCTgCraOCGAGiUÜCAgCTAAGO^TCCAOCAACTCCAACTjAAAGAAgAAAATAAIira
9
1981 GAl,^g,AAGÏÀAGAAGgGT(j'JCÀûAÏÀGG(jGGACT'TCT'P^UTTAAA'^'rAOTCri?CCGTGTTG
2041 TTOOAATûGATOTCCl'i'.U.TTGïTC-AGAGGGa"rGCûCAAACGCGGTAÏATAAGGCASACCC
♦ ОТ/ 43 M
3001 AGTA;aOSTTACAAOa'AAACCAGA?4TGGtGATCGCGACTiAAGTa'GCTGTOa'SC¿TT?'r
2161 tatagajltxïcaagattacaatggaïcta.ggaaaagatggtotatttacaactacaacgg
gab H -+ A T Q T V E
2221 AATAGTATACAAAGTCAA0ACCAAIGAÏTAAATATAATTTA5GGCTACACAAACCGTÏGA dsökprpkrtgagsl'lkplm 2281 AGATAGraCïAAACCTAGGCCAAAACGiUOTGGTGCAGGTAGTTTACTGAAACCOTTGAA s e у g к v a p g ïï g ? t p f h g v a и 2341 TTCGGAATATGGGAAAGTCGCCCCGGGÎTGGGGGACTACTCOTTTÎAÏGGGGGTCGCAAÎ'
alfaiflsiileiynssill
2401 GGCTTTAï'TCGCTAgATTCGTÂTCyA'rCAxl^'TAGAAAX'l^ATAATTCTl'COAT'rTIACT
d g i l t к » 2461 GGATCGAAT^I-TMCCAATTAGGmCTAC?MCgj¡AAACTAGGAAGTCAOAGim'^TCg
2521 ATCCAAAAAAGCC'XXTCTAGTTTAAGCTCïACATTTCTAGATATTATGGTAGïTCCACCG
pet В ■* M s
2581 CGGAATTTTTTÎGTTTCGGTAÎCTCTGG^TÀTGAGTGTGTGAGTÏ'GÎTAGA-ATÏGATCG
2641 a?ATTGATAATACATAGAAAGGGCCÏGrCATCTCTAÏCAJlGA.TGATTCT^TTCGTÇAGA5
2701 ATTATTTATICTAGTATCTG(jAACACGAAÀgAGATAGAGTGGATCAAAAAAAATGgAACT
2761 ATGATTCATACÎCACTATTAAOACCTCGCAACGAGAGTGAAAAATTCAAGTAGTTOTTAA
2321 AÎAAAAATAAAAAACAAATTTTCTTCCTTACAAra^^
2881 TTCTATCGATîTTGTCGAGTCATTACAGTGATTCMTT'rOAATAAATGArrATCAAGCqG
2941 TTCTTATl'CGAAGAACÇCxTGCCTCTTGTCTiGGTTGAGÀCTAAATCAgCGTGGGTCTAG
3301 TATGAATCTAAGGTTTTAATTGAACïGATTGATAGGAICACAACAAGATAATïTCTATAT
3061 TACGCATAAAAAAAAATCCAAAATAGGGAAGAGAAAAGTGAAGAAGCCTCTAAÏGACCAA 3121 CATAAGGGAAÂGGAAGAAAGAAAGACGCÇCCAACTTGAGATTaiTTTGGqATTATOÀgOAO
3181 AAAGMGASATTCCGGATTTTTTTTATT-TGCTATCTTCAAGGCAAATCGACCCGATTCAG 3241 TGGCTGATGAAGTTTTGAACCMTTTTCTAATATTOGTTGAAAAT-TTG'TGTGTa-TCTGCT mlcisytölrßßr^Xv t 3301 TC/jGCCGTACG AG АТС AAATTTTCATATACGCC^CTT AG AGGGCCGCGTGGGTTAGT1} AC
ylnKVYDWFEERLEIQAIAD 3361 CTATCTCAATAAAOÎATATGAT-TCGTTTGAGGAACGTCTTGAGATÎCAGGCAATTGCGGA DITSXYYPPHVNIFYCLGGI
3421 TGATATAACTAGTAAATAl'GTTCCTCGGCATGTCAÁCATATTTT/TTGTTTACGGGGAAT TLTCFLVQVATGFAIÍTFYYR 3481 TACACOTACTTGTïTiCTAGÎACAAGTCGCTAGGGGOTrTGCl'ATGACTTTTTACTAGCG PTYTEAFSSVQYIMTEANFG 3541 ACCAACCGTTACAGAGOCTTTTTCCTCGGTTCAATACATAATGACCGAGGCCAACÏTTGG WLIRSYHRVSASKMVLMMIL 3601 TTGGTTAATCCGATCAGrTCATCGATGGTCAGCAAGTATGATGíT^TTTAATGATGATCCT H V F R V У L T G G P К. " " a î T Г 7 3661 GCATGÏAaSTCGTGTGTATCTCACAGGGGGAl-iTAAAAAACCCCGTGilATl'AAClU'GUUi TGYYLAYLTASFGYTGYSLP 3721 GACAGGTOTGGTTTTGOCTQTTMaACTCCATCAîTTGGTGTAACTMTTATTCTTTOCC ÏÏDQIGYÏÏAVKIVTGVPDAIP
3781 ÏTGGGATOAAACTGGCTATTGGGCAGTCAAAATTGÏGACAGGTGTACCTGACGGCATTCC VIGSPLVELLRGSASVGQST 3841 GGTAATAGGATCGCCTTTAGTGGAGTTArTACGCGGAAGTGCTAGTGTGGGCCAATCCAC LTRFYSLHTFVLPLLTAVFH 3901 №rOACrCGÏErraATAGTTTACATACCTTTGTACTGCCTCTGCTTACTGCCGTATTTAT
LMHFPMIRKQGISGPL* 3961 GTTAATGOAC'TTTCCAATGATACGTAAGOAAGGTATrrOGGGTCCTTTAÎAGGGAAGGCA 4021 TATCATAûAGAA^CÎAATTGT'CATATATCATAa'CGGGÎAGG'PTGTGGTAOTrCATTGOT 4081 ACA-VGOATGGCT-IAl^GTAAAATAACACATGTCATTTGOATACïTCÏÇTTCAAraCCGAA
pat D M
4141 GTATTTTTATACGATAC/JU.TAG1VJGA.«.GT0?AATTTTACGAAAGAAAAAAGC-9GGATTAÍ
4201 GGGAGTGTGTGACTTQAATTAT'ig¿tt'tggccatgcagataa^.gaat,rGGATCTGCC¿CA
4261 TTAGAATTCACAACCAAAGGTGgCTCCGCATCCAATCAACAgGTAAGTCCÇCTACOiPAGG
4321 AAGGATAGqCTGGTTOAO'l-JGACGAGAATA'DT'mCTAIGATCATACCGCAACGATGTCAl?
4381 CCATGAACAGGCTCCGTAAGATCCCATÀGAGTGGAAATGGAAÎCAGTCATGTGACATGAT
4441 CCAATTC^CTAl'TTAgTACACTTACTTTTTATTATAGTATGGAAlTGOAayrCA^TTTCT?
4501 tgcaicgattgtgatocgcaatactaicggagtaaaagaagggaictaaggaagaatgta
4561 GGCTAAACriTraGATTTTTTAX^AGTAACAAGTAAATAra^GTTTGGAGGTAAGAAAO
4621 TTGCGATATTGAGGGGAÎAAATACCAACTAATCAAGAGACATGAGACAATCCACAAAGCA
4681 AiTGATCATGATCAAATîTGTAACGCCACTTGGATATTGAGCATTTACCCATAAGAATAG
4741 GATTATÎTTCAATGAGTAGTGGTACGTGCAACTTTGGAAAAGAG,UTCTGATAA,\GCTTT'
4801 TTTTGTCÏAGAGTCAÏTGAGTCATTATATACCTTAAÏO.'CTATTAAGGATCTÏCCGCGC-'ÎC
m s q s í
4861 riiArSTO^rrCACTCTTGCTCa^GœGGATGAKATAAATTCTCÀTGTCCœTTCCTTTa
qqwilksspioiTKKPDLND 4921 GGGQATGGAT'CCTAAAGAGTTCACC^ATCCQAATAACAAAGAAACCAGACTT-A-AATGATC
PVLRAKLAKGHGHNYYGEPA 4981 OTGTATTAAGAGCTAAATTAGCÏAAAGGC-ATGGGACATAAÏTAT'TACGGGGAACCCGCAT
WPHDLLYIFPVVILGTIACN 5041 GGCCCAACGATCTTTTATATATTT-XTCCAGTAGTAATTCTAGGTACTATTGOATGTAATG
VGLAYLEPSMIGEPADPFAT 5101 TAGGTTTAGCGGTTCTCGAGCCATCAATGATTOGTGAACCGGOAGACCCGTTTGOAACTO
PLEILPEWY-FFPYFQILRTYp 5161 CTOraGGAAATATTACCCGAGTGGTACTTCTTTCCCG'îGTTTCAAATACTCCGTACGGTACC
-!Ü-
Ген рзЬН содержит 73 кодона, и его продукт имеет молекулярную массу 7,8 кД. Последовательность CAA, расположенная церед инициирующим кодоном на расстоянии 6 п.о., может функционировать б качестве рнбосшсЕязыванщего участка.
Район мекду генами рзЬН и peíB содорлит возможный интрон класса II длиной 754 п.о. Возможные рибосомсвязываэдие последовательности, GGA и CAG, располокены перед участками инициации трансляции апопротекнов хштохрома Ъб на расстоянии 215 и 222 кодонз, соответственно. Предполагаемые рибосомсвязываыдиэ сайты, AAGG и AAA, обнаружены такг.е на расстоянии 10 и 8 п.о. от инициирующих кодонов сплаЕсироьашэтй и носплайсированной форм pctD-кодируьтцей последовательности, соответственно.
йн троны геноз petB и petD могут служить моделью "некласскче-скш.г кнтронов II класса:
1 ). последовательность GTGTGAC на 5'-конце интрона полностью соответствует предполагаемой последовательности GYGYGNC, где Y - пиримидин, H - любой нуклеотид;
2) последовательности СТАТСТСААТ и СТАТСССААТ на З^-концах иктроноЕ соответственно petB и petD идеально согласуются с последовательностью YTAYYNYNAY;
3) имеется характерней потенциальная шпилька длиной 14 п.о. GAGCKiïïHTRNNRNgaaaNTNNYAygYîraNGTTY, где R - пурин, а мелкие шрифтом обозначены неспаренные нуклеотиды. У иктрона гена petB ячменя эта шпилька отличается одной заменой типа транзиции и одной -• типа трансверсии, у интрока гена petD ячменя - одной трансверсиокнсй заменой.
Ме:зду генами рзЬН и petB ячменя идентифицирован промоторный элемент: TTGAGA-17 л.о.-ТА&ГАТ, который близок но структуре к функционально определённому промотору оперона atpBE кукурузы и отличается единственной нуклеотидной заменой и удлинённым на 1 п.о. расстоянием. Второй промоторподобный элемент ТТССТА-18 л.о.-ТАТААТ обнаружен внутри гена рзЬН. Ни мекду генами petB и petD, ни внутри них промоторподобных элемеьтов не выявлено. Эти данные хорошо согласуется с результатами анализа нуклеотидной послздсва-тельности этого района у кукурузы.
В/ Структура пелипептидов
Для полипептедних цепей CPs-1 (продукт гена рзЬВ) характерно высокое содерхсапие гидрофобных аминокислотных остатков (41 Sí.
-ï [-
Этот белок имеет 6 участков выраженной гидрофобности, существующих, вероятно, в вида трансмембранных а-спиралей длиной 22-25 аминокислотных остатков. В СРа-1 иглеется характерный гидрофильный сегмент между предполагаемыми V и VI трансмвмбранными тяжами. Его ,<даша составляет 37% от общей длшш белковой цепи в СРа-1. В ряде работ было показано, что эта гидрофильная перетяжка экспонирована в лшзм и участвует во взаимодействии ядра фотосистемы II с 33 кД полкпепткдом кислород-вкдэляэдэго комплекса.
В табл.2 представлен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей продуктов генов фотосистемы II. Анализ данных табл.2 (I) показывает, что все 17 Тгр и 14 His СРа-1 абсолютно консервативны. Значительной консервативностью обладают остатки Туг, Pro, Gin. В СРа-1 пары остатков His, находятся в трансмембранных сегментах, трияда образуют характерную структуру: два остатка Н1з на расстоянии 13 аминмскслотнух: остатков. Полагают, что остатки Hia обусловливают координационную связь с центральным атомом Mg псрффикозого цикла хлорэфилла. Тякже вероятными участниками этого процесса могут быть остатки Тгр и Gin (показано участие остатков Gin в лиганд?;ровании молекул хлорофилла в свето-собирэющем комплексе Ch'lcroflexus curant îoc'js . Кснсорвгтгоюсть остатков Pro опрэдэляет кёсткий характер укладки перзтягзк, ь^-ступакигас в .тален и строму, что обеспечивает взаимодействие с другими компонентами фотосистемы II.
Аминокислотная последовательность простата гена psbH (табл.2, разд.VI) мекээ консервативна, наибольшей ззркабельностыэ обладает 36-члеккый N-концевой участок, содержащий большое количество заряженных групп. Сосфорщсфуемйй остаток Iftr3 абсолютно консервативен. Этот бзлок содержит, вероятно, о дан трзягаяялбранный сегмент (с 42' по 58 амккпаюлотныэ остатки). К-конец зтого белка зкспсзирозен на схромальпсй поверхности '^глэ;лидной мембраны.
2. Ген рэЬС
А/ Клонирование и секвешфовазке
Частичная информация о перзичной структуре гена рзЬС ячменя ухз иу^лась в литература; тайнами ракзэ были определены первые 50 нухлэотидов 5'-кс;щзвого участка гэна, совпадавшие с 3'-конце-внм участком гена psDD; по данным Оливера и Паульсенз были кзве-
стны также последние 50О нуклеотидов 3'-концевого участка гена psbC.
Для получения недостающей информации мы использовали плазмиду pHvcP3 с фрагментом хлоропластной ДНК ячменя длиной 18,4 тыс. п. о., который содержит полнорязмерную копию гена psbD и значительную часть гена рзЪС. Для того, чтобы выделить искомую часть гена рзЬС, эту плазмнду обрабатывали эндонуклеаэой рестрикции SacI, удаляя, таким образом, большую часть фрагмента РЗ, а оставшуюся часть плаэмиды с помощью лигазы превращали в кольцевую молекулу. Полу чешую конструкцию подвергали i-идролизу PstI, что позволило получить фрагмент (Pstl-PstI) длиной 950 п.о., который был клонирован в векторе рВЗЫ1Э+. Отбор клонов проводили гибридизацией с тем ке меченым фрагментом (Pst-Fst), а после выделения плазмядной ДНК - рестриктным анализом. В дальнейшем использовались плаэмиды pESCI и рВ302, содэркавшие этот фрагмент в обеих ориентациях.
Для определения нуклеотидной последовательности этого фрагмента была выбрана одна из разновидностей '*дидезокси"-матода - метод "смещающегося праймера". Наряду с праймерамн, структура которых в точности соответствовала структуре участков гена ячменя, нами были использованы олигонуклеотиды, последовательности которых были взяты из аналогичного гена других растений и могли только частично совпадать с искомой структурой. Этот подход позволил нам ускорить процесс секвеютрования за счбт одновременного синтеза прай-меров и определения структуры различных участков интактного фрагмента. В табл.1 приведены структуры синтетических олигонуклеоти-дое - праймероз и зондов.
На рис.4 представлена стратегия определения первичной структуры искомой части гена рзЬС ячменя, а на рис.5 показана егс нукле-отидиая последовательность.
Б/ Структура гена рзЪС
Этот ген кодирует продукт длиной 473 &*.шюкислотных остатка (см. рас.4) и, возможно, транскрибируется вместе с гзнсн рзЫ) (геном полипептада D2 фотосистемы II), с которым имеет 50 общих п.о. Для гена psbD были идентифицирована 2 возможных набора про-моторшх последовательностей , которые могли бы являться промоторами и для рзЪО. Две другие промоторподобные -35 и -10 последовательности находятся перед геном рзЬС, внутри гена psbD. ATG-кодо-
-тз-
Р*1
ых
р-ьп -* .)«■-' I
рвЬС
гоопа
Ы1
Рис.. Л. Сгратах'яя определения нуклеотнднсЯ последовательности искового учсотка гена рзЬС *хлорспластной ДНК ячкеая. Пунктиром обозначен -конец гена рзРС, который не входит з состав фрагмента РЗ. Заштрхиовак фрагмент гена рвЪС, структура которого была определена ранее. Стрелками обозначены синтетические олнгонухлеотиды, йспользовакныэ при определении первичной структуры.
САС-ОАТСАСССТ
МК1ЬУЗЬЙ.НРУНУЕТЬРНСТ 1 АТОААААТСТТАТАТТСССТСАЛОАСОТТСТАССАСОТ'ССАААСССТСТТТААТСОААСТ
РУЬАСНБЧВТТСРАИИАСЯА 61 ТТС2ТТ1ТЛССТ0СТС0Т0АССААСАЛЛССАССССС1-ТТС0ТТССТС-00СТС004ЛТССС
Рис. Ъ. Нуклеотядаая последовательность фрагмента хлорсплвст-ноЯ ДНК ячменя, содержащего 3'-концевой фрагмент гена раЬВ и ген рэЬС. Сверху нуклеотидней последовательности кодлрукщуй цепи показана соответствующие ей аминокислотные тоследователъностцПодчбр-кнуты предполагаете пибосомсвязывакщие сайты, а тахже -10 участок промотора. Плотным шрифтом выделен терминирующий кодон гена рзЬБ. .
-Т4-
RLINLSGKLLGAHVAHAGLI 121 agacttatcaatttgtccggtaaactacttggacctcacgtagcccatgccogattaatc
V F W A G А К ti L P E Y A ¡i F Y P E К P 181 C-TATTCTGGC-CCGGAGCAJlTGAACCÍATTTGAAGTGGCCCA'M}TCGTACCAGAAAAüOCC
MYEGGI, ILLPHLATLGÏÏGVG 241 ATGTATGAACAAGGGTTGATTTTACTTCCACACTTAGCTACTCTACGTTGGGGAGTAGGG
PGGEVLDTFPYFV5GYLHLI 301 CCAGGGGGGGAAGTTCTAGATACÎTTT'CCAO.ACTSTGTATWGGCGTACÏTCACCTA^TT
SSAVLG^GGIYHALLGPETL 361 TCCTCCCOAGTCTTAGGCTTCGGTGGCATTTATCACGCGCTTCTGGGACCCGAGACTCT"?
EESFPFFCYVWKDRNKMTTÏ 421 GAAGAATCTQ^^CCATTCTTTGGTTATGTCCGGAAAGATAGAAATAAAATGACTACAATX'
LGIHLILLGLGAPLLVLKAL 481 TTGGGTATTCACTTAATTTTGTTAGGTCTAGGÎGCTTTTCTTCTAGTACTCAAGGOTOTT
YFGGVYDTffAPGGGBVRKIT 541 TATTTTGGCGGTGTATATGATACCTGGGCCCCTGCGOGGGGAGATGTiAGAAAAATTACC
NLTLSPSVIPGkYLLKSPPGG 601 AATSTGACCCTTACTCGCAGi'GTTATATTTGGTTATTTACTAAAASCTGuSTTTGGGGGA
EGW'IVSVDDLEBIIGGHVWL 661 GAAGGGTGGATTGTTAGTGTAGATGATTTAGAAGATATAATTGGTGGAOATGTATGGTTQ
G F I О У F G G I К H I I H К P L R V A 721 ggttïtatttgtgtatîtggggoaatctggoatattttaagcaaaccctïogcatgggcï
rrafvwsgeaylsyslaals
781 CGCCGTGCATTTGTATGGTCTGGAGAAGCTTÀCTTG'TCTTATAGTTTAGCTGCTTTATCT
yfgfiàccfvwfnntaypse
841 GTOTT'TGGTTTTATCGCTTGTÏGTTTÏ'GTATGGTTGAATAAÏAGAGCTTATTGGÀGTÛAG
FYGPTGPEASQAQAFÏFLVR 901 TTTTATGCACCCACCGGGCOABAAGOTTCTCMaCTCAAGCAÏ-Ta'ACTmTCTAGTTAGA
BQRLGANYGSAQGPTGLGKY 961 GACCAGCGTCTTGGAGCTAATGTGGGATCCGCTCAAGGACCCACAGGTTTAGÜG.¡uU.TAT
LIP. SPTGEVIPGGEïMRF?.' D 1021 CTAATCOGTTCCCCAACTGGGGAGGTIATCl^'X'OOAGGGGAA-iÛTÀTGCGTTTT'XGGGAC
LRAPÏÏLEPLRGPNGLDI SRL 1081 CTTCGTCCTCCATGGTTAGAACOTGTAAGGGGCCOCAi.CGGa'T-TGGACTTGAGTAGGTTG
К К D I Q P W Q E R R S A E Y К ï H A P 11 41 AAAAAAGACATACAACCTTGGCAAOAACGGCGCirCAGCAGAATA'pa'PGACCCACGCTOCî
L G S L N S V G G Y A T. S I N Л Y M Y V 1201 TTAGGCTCÏ-reAAATTCCGTGGGTGGCGTAGCC-ACCGAC-ATCAATGÛAGTTAATTATGTC
SPRSWLSTSHFYLGFFFFVG 1261 TCTCCTAGAAGTTGGTTATûAACMCTCATTTÏGrrCTAGGAi'ECTTCeîraTTGTGGGC
HLffHAGRARAAAAGPEKGID 1321 CATTTÁTGGCATCCAGGÁAGAGCCCGAGCTCCTGCÁGCAGGTXTTGAAAAGGOAATC-GáT
RBLEPVLYKKPLN*
1381 CGTGATTTGGAACOTGTTCTTTACATGAACCCTCTTAACTAA
риспг. (скончзнив ).
ну гена рзЬС предшествует потенциальный участок связывания рибосом (см. ркс.4). За этим кодоном расположена вторая последовательность > комплементарная 3'-концу 16S рРНК, а через 9 нукластидоз после нэЗ, в той же рамке считывания, что и АТС, находится GTG-кодон, который может служить инициатором трансляции, по-крайне? мере у E.colt. Тот факт, что белок СРа-2 (продукт psbG), выделяемый из тилаксидов, по данным Мяхеля начинается с Tfcri 5, не противоречит предположению, что инициирующим кодоном является на ATG, a GTG, и в этом случае в результате посттрансляционной модификации будет удаляться дипептид Ket-Glu.
В/ Структура полшептида
Для полипзптидной цепи СРа-2 (продукт гена рзЬС) содержание гидрофобных аминокислотных остатков составляет 44%, Этот бе.чок имеет ту же схему строения, что и СРа-1. Как к в СРа-1, в С?а-2 имеется характерный гидрофильный сегмент между предполагаемыми V и VI трансмембранными тяжами. Его длина составляет 28% от общей длины белковой цепи в СРа-2. Анализ данных табл.2 (II) показывает, что консервативны все 17 Erp и 13 Н1з процессирован-ванной цели СРа-2. Значительной консервативностью обладают остатки Туг, Pro, Gin. К в СРа-1, и в СРа-2 пары остатков Я1з, находящиеся в транскембрзнных сегментах, триады образуют характерную структуру: два остатка Kls на расстоянии 13 аминокислотных остатков.
3. Гены psfcE и peb?
А/ Клонирование и секвенирсвание генов рзЬЕ и рзЬР
На основании данных Хирда о локализации этих гонов у пшеница была выбрана илазмвда рН7сР4, содержащая фрагмент Р4 длиной 13,5 тыс.п.о. (см.рис. 1). Этот фрагмент бкл подвергнут рестриктному анализу с последующим разделением полученных субфрагмептов электрофорезом в агарозном геле. Зоны, содержавшие эти гены, идентифицировали блоттингом с использованием в качестве гибридизанионной пробы - меченого олигонуклеотида й(АТСТСТСиААССАССССАСА-АССТТСТТТтеоТ), соответствующего 5*-концевому участку гена рзЬЕ пшеницы. Были отобраны зоны, соответствующие Бз1гЛ1- фрагментам и
Т А ET ТА Е Е А
_L__L_!_L_LJ__i i i
I i dbüK _Т~Гра5Р~Г|" psbL I ~1 psbJ " )
PO > F2> FS> F6>
< F3 <F4 < F7 < F8
100 200 300 400 500 600 700 800
X--X--X-X-X-—X-X-X-X
Pkc.6. Рвстрнкткая карта гвнсз рв'оВ, pebF, psbLs pebJ (0РС40) июрсгыастнай ДНК ячиеня в стратегия опрэдэлакая нукдеотядаой последовательности этих генов. Условные обозначения: T-Taql, A-Alul, E-EcoRI. Стрелками обозначены синтетические олигонуклаотнда, использованные при определении первичной структуры.
ГЪ Е —► S G S I G
1 AATCAAgrOOTTTTTGAATGTACAAAAATTTTOGGAGgTOAGCATGTOTQGAAGOACGGO
BRSFADIITSIRYWVIHSIT 61 AGAACGTTCTTTTGCTGATATiAT'iACCAGTAI-ICGATACTüGGTTATTGATAGCATTAC ILSLFIA GWLP'VSTGLAYDV 121 TATACCraCCCTATTCATTGOGGGTTGGTTATTTGTCAGTACGGGTraAGCTTATGACGT FGSPRPNEYFSESRQGIPLI 131 GTMGGAAGTCCTAGGCCAAACGAASATaaCACGGAAAGCCGACAAGGAAT-rCCGTTAAT
TDR^DSLEQLDEI'SRSF* 241 AACCGACCGTraTGATTCTTTAGAAOAACirCGAl'GAATgTAGTAGAgCCTgllTAGGAGGO
pab F —*
MTIDßTYPIFTVRW'LAIH 301 OCTCAATGACOATAGATCGAACOTATCCTACMraACAGTGCGATGGCTGGCSATTCACG
GLAVPTVFFLGS ISAiiQFIQ 361 GACTAGCTGTACCTACTGTTTTxTTCTTGGGATCAATASCAGCAATGCAGraö'ATCCAAC
рзЬ £ —»
R * KTQSMPNEQNT
421 GATAAACCAAATTCCAACTATAGAACTATGACAOAATCAAACCCGAATGAACAAAACGTT E L N R T SLYWGIiLLIPVIIAVL 431 GAATTGAATCGTACCAGTraATAGTGGGGO^ATTACTCAraaiTTGTACM
FSNYFFN* 541 TTTTCCAATiACTSCTTCAATTGAGAüAAAGAAACAGACiTAAI^^ 601 ATOTGGAAAGATACCATCCTTATAACÄUCCCATGAOTGTiTraiGTCTCTAGCATGACCAA
ГЬ J —*
ADTTGRIPL 661 raGATAAAATGTGGAGGAAAGTAGGGGAAATGGCCGATACTACTGGAAGAATTCCTCTTT
SLIGTYAGI PVIGLVGVFFY 721 GGC'IGATAGGTACTGTAGCTGGTATTCCTGTGATTGGTTTAGTAGGTGTTiMCTTTTATG
GSYSGLGSSL« 781 GTTCATATTCTGGAITGGGl-TCATCTCTATAG
Рис.7. Нуклзотадная последовательность pebS, psbF, psbL (0PC40), psbJ (0PC3S) хлореллаCTH&ü ДНК гтагзнз." Сверху нуклзогвд-иой последовательности кодирующей цзпк показаны соответствуюкдэ ей аминокислотные последовательности. Подчеркнуты предполагаемые ркбосомсвязьшакцие сайты. %
-Т7-
£со1471 - фрагментам длиной около 4,2 тно.п.о. и 3 тыс.п.о. соответственно. Фрагменты элюировали из агарозного геля и клонировали в рВЗН13+. Отбор клонов проводили гибридизацией in situ с тем ка 33-звеншм слигонуклеотидом, а после выделения плазмвдной ДНК -растриктннм анализом. Для дальнейшей работы были отобраны плазмк-ды pBSE1 и pBSI2, содержавши Есо1471-фрагмэнт е обоих ориентацс-ях, а танка плазмида рВЗ'ЕЗ, имевшая ВалШ - фрагмент в прямой ориентации относительно 1ас-прсмстора вектора pBSM13+.
Для определения нуклеотидной последовательности этих генов нами был использован тот se подход, что и при секЕвнкрованки гена рзЪС. Рестриктнся карта генов рзЬЕ, рзЪР, рзЪ'Ь (0РС38> и pstoJ (0FC40) хлоропластной ДНК ячменя и стратегия определения нуклзо-тидной последовательности приведены на рис.6, а на рис.7 показаны пуклеотиднио последовательности этих генов.
Б/ Структура генов рзЬЕ и psbF
Анализ нуклеотидной последовательности, представленной на рис. 7, выявляет 4 открытые рамки считывания (ОРС), организованные в следующую структуру:
0РС83-1О п.о.-0РСЗЭ-22 п.о.-0РС38-125 п.о.-0РС40.
По данным Вестхофра все ОРС транскрибируются в виде единой матричной РНК размером 1100 оснований. Эти открытые рачки считывания соответствуют генам рзЬЕ, рзЬР, рзЪЬ (ОРСЗЗ), рзЪ-Т (0РС40). В литературе существуют разночтения в обозначении 0РС38.
Опубликованная структура фрагмента пшеницы (Б54п.о.) включает в себя генн рзЬЕ, рзЬР и часть гена psbL. Выявлено единственное различие: в 3 позиции 5'! кодона (G]и) гена рзЬЕ ("G" - у пшекшк, "А" - у ячменя.) Сравнение соответствующих нуклеотидннх последовательностей ячменя и табака показало, что эти гены имеют следующий процент гомологии: рзЪЕ - 92,4$, psbF - 91,6$, pabL (0PC3S) - Э4%, psbJ (0РС40) - 91%. На расстоянии 6-12 нуклеотидов перед иницкирущими кодона;,я генов psbE, рзЬГ, psbJ (0РС40) рассоложены последовательности, комплементарные 3!-концевому участку 16S pFHK и, вероятно, являпциеся участками связывания рибосом, причём у pabF эта последовательность перекрывается со стоп-кодоном гена рзЬЕ. Такая организация этого района хлоропластной ДНК у ячменя полностью соответствует его организации во всех изученных видах растений.
2 ....................A............................................................................G..
4 ........................................................................N........................CA.
...................TA..L... ..............К..... ...V
1 IYFSGI£FIJUITftí^VYWDLEIFSDÍ^TCVT3IJ3J.PKlFGIKU'^
5> ,, ................
4 iirrrri'ririiiiiiii.i.-c...........::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::;::
5 .......................с.....................s.................................p..:...v........R____
T .M...........................................S.................................P.CS...V.............
3 ..L...L..............L.R.....................S..L..A.........F.....I...........P.A..................
9 ..L...1____V....F....L.V.P...E3A.....H.......5.LL........L..V*'...U..........H. .P.A. E. .PA. .H.. К.. .WA
1 DPTTKKQAV»
2 ....П....»
Л____RR. .A«
5.....R..A«
7____RR.G.»
8.....R.VI»
9 .IS.R.E.»
Табл. S(I). (см. стр. SO)
i
1 fflüAACTI£ILACmn£VKPFQPAYKGIiMCNimXS5SmVFFAAm
2 .....................................................................................................
4 ..........................................................................................D..........
5 ...............:.........................................................................А.....Q.... CE
s '.'.'.'.'.'.ï.'.v.'.'.'.......s- ': :::::::v...............iiiiiiiiiiiiÂiiiriiiiiiiiiiiiFiiriID"iîrsskIП.I.II
g......I»..I...:::í::::É____А.............................я............,...K....E..Q...dsq...G.A...
1 AKSKipmjiraïiGmn'AKKifRAûssmNCDGmcTOHPvywjKKiraJVRPJîKOT
2 ...................................................................................-................
Д .......................................................................................................................'........
5 ............"... ..................т ...CD..........................
7 ................ ' ......... .....т.................... ....I.CD..........................
8 ............................A......... À ''it Ñ' ."'.'"..'..........О..........................
9 .......ï......V..S........T.A.HS.....ЧЕЛ...i.К.......E.....N.......IMT.AD.V----I...;S...F----T----S
1 ТОСШХПГГБЮЛГга^АНРдаСЕИ'ЕШиТ^^
2 .........S........................................................................................
4 .........S.............A...........................................................................
3 .........S.............A......................................................................A...L.
T.........S.............A................................S.............S................V.....A...X.
6......D..SF............A.......F.............................................................A...L.
9____A.D.QTF.N.SD...F ..KA....G.DF.TE.FN......T...........V.............S..........V..G.EE.....V.A...
J
4
ь ..Т..... ...... ....и...........
ь
7 .Т..... ..Р... ....LT...........
В ......Q. ..Р... ----U.G.........
У ..T.S... •SP.V. S.-.SMVG...IPS...
1 РссБяшлттесгайгвгХУгдрсопшихсртЕЕот
2 ::::::::::::::::::::
s.....i...................i...........:::::: ::::::
6 .....i...............................................................:.s____y.......i...............
7 .....1...
8 ____IV...
9 .A...T.I.
.F..V.
• YSS
.К... • X.Q.
............1.....
............Л.....
.N.I.Y......C...L.
UP.
1 MLTbSPSVIKYUÄSPPGCJSariVSVDDLEDIICCmnn, СР1СТ1ХКШ11ЬТКР?АИАК5Ш^М$СЕАтГЗт15У^иССттЯАтЕ
■ G.
I............
P.....IL...........
V.....I...C........
.....G.............
P..N.Al.......A....
........H..
.....I.. ЮМ.
.......S...L
.......S..IL
.......S..IL
.....I .V..IL
.......S..1.
■ L..........
.L..........
.L..........
■ L..........
.1.1.........
■C....
• C____
■С..Д. .G.IA. .C...1«
r.v
.R.P.
.. .P. ...P. .. .P.
mPTGPiJlS«A3AFmVRDQRLGANVCS» öCWinXÄmfcmEV lKGCt-Ш^
...................................и..........................................................
. .К.G____
................. ..................IM......I....
......¿""s;:;:;......................&¡. ..s..i....
¿¿jÙsVGGVATÏIMiWfrV SPFSm^KI^
.i............ , . , iL».................................ч*'
. .К-----
■ DK. I<N.
.I.DV.Sf..
'.'.'.л'.'.А'.'.'.'.'......L.......................KT..T.F.PD.D«
из
I
Тайл. 2(11). (см. стр. 20)
-?G-
1 ¡escsicmjADimiKimiHsnraiJucai^reimiOTKSPHvmimsE
2 ь 6 a
9
1 GIPLITDBRDSLSILDEFSRS?«
2 ......................•
5 ......0...P...........В»
6......С................
8 EY____G..N____I...IK..»
9 EL. IIAE.YDfQ. 102ЭТК}«
IV
i лгыж——«PEPrwBiiasbiVfTvmssisiisHes»
г
5
6 8
9 .ATQNFNQHT.
..л...
...V... .V.T.
...s.....
...s.....
...S..A.. S...V.A.A
1 UAOTCRIPLirLIGTVAGIPVIGLVGVmGSXSCbGSSL»
г ...................A................—.
5 ...........1.......L./..I.I.............»
6 ..N........I.......V____I.L............V»
8 . .N____V...........L......I.............•
VI.
1 UAlXHra)SSKPRPiam^GSmri«SEiffiVA?<3fGTIPriCTAiiALPiI?LSin.KI
г
5
7
8 9
R К
y.'.N.'.RSG'.R.'.iv'.b'.'. ...S..BS...P.TV.A.. IID.TP.TKG.XS.I.DI.
L____
L____
1..Ш
V____
V____
V..V7
1 YKSSILLDGILTN»
2____V........«
5 .............•
7 ..........sa..
8 ..........sa.»
9 .........vsvsa«
VII
t KT2S;^KEaNVElK?rSI.TCGIiI.I7VUVIJSIfiF7ii»
г ......................................*
5 .......................................
6.....s................................»
8 ...F...K.S............................•
Табл. 2. Сравнение Е^гне:скслотны1 последовательностей продуктов генов psbS (I), рзЪС (II), рсЬ2 (III), psb? (IV), psbJ (V), psbH(YI), psbi (VII), ячненя (Ногйеия vulgare) (1 > с продуктша этих генов эволвцконно - отлкчшх групп организмов: 2 - рога. (Secale cereale), 3 - пшеница (Tritlcua aestivum), 4 - кукуруза (Zea mais), 5 - табак (Nicotians tabaoum), б -горох (Pioum sativun),? - ншнэт (Spinacea oleraoea), 3 - печ5ночны!г мох (liarchantia polymorphs), 9 - цианобактерия (Synechooystis 6803). Предполагаемые мембранные домзны подчеркнуты, делецки отаечекк как "-", стоп-кодоны - как
В/ Структура ползтептидов
Полаиёптадкые продукты Э кД и 4 кД, кодируемые генами рзЬЕ и рзЪ?, связавгат тем цитохрома Ь-^ (табл.2, III, IV). Продукт гена озЪЕ содержит единственный гидрофобный тяж длиной 26 ашнозшсдотных остатков (с 19 по 44 остатки). Этот трансмембран-еы2 тяа, существуэдий. вероятно, в виде а-спиралл, ограничен положительно заряхенным Arg18 и отрицательно заряженным Азр45. Продукт гена рзЪ? такгэ содержат единственный гидрофобный домен длиной 25 аминокислотных остстков, ограниченный полсгитблъно заряженными Arg12 и Arg3. Оба апопротеина содержат крайне консервативные остатки His (Н1з22 и Н1з17), расположенные всжзи стро-мальноп поверхности тилакоидной мембраны и координирующие ион железа гена цитохроыа Ъ^-д. С-концевой сегмент большой субъедини-ницн, экспонирований в стрс.му, частично экранирован гидрофилыш-нымй белками кислородвыделявдего комплекса.
Продукты генов psbL и psbJ (табл.2, У, VII) содеркат по одному гидрофобному сегменту и, вероятно, являются интегральными мем-орак-кми белками, одан раз пересекающими мембрану тилаксидов. Точная локадисация и функция продуктов этих генов в настоящее время не ясны. »
ЗАВОДЫ.
1. На основе вектора pBSHI 3+ получена серия рвкомбинантных плаз-мид, содэргэщих ге1ш хлоропластной ДНК ячменя, кодирувдие полипептиды фотосистемы II.
2. Установлена нуклеотидная последовательность фрагмента хлоро-пластной ДНК ячменя (5,2 тыс.п.о.), содержащего ген psbD, который кодирует хлорофилл-связывакщую субъединицу 47 кД и гея рзЬН, кодирующий фосфопротеин с молекулярным весом 7,8 кД.
3. Установлена нуклеотидная последовательность генов рэЪЕ и psbi, кодирующих субъединицы 9,3 и 4,4 кД апопротеина цитохрома b559" а таккэ Фрагмента гена рзЬС, кодирующего хлорофиллсвязы-вапцую субъедипицу 43 кД.
4. Проведбн сравнительный анализ аминокислотных последовательностей этих полипептидов со структурами соответствующих полипептидов других видов растений. Все исследованные полипептида характеризуются высокой консервативностью первичной структуры.
Основные результаты диссертации изложены в следувози статьях:
1. S.V.Reverdatto, A.V.Andreeva, A.A.Buryakova, O.G.Chakh-rcakhcheva, and V.A.Efimov. Nucleotide sequence of the barley chloroplast psbC gene. - Nucl. Acids Res. 1989, V.17, N 10, p. 3S96.
2. S.V.Reverdatto, A.V.Andreeva, A.A.Buryakova, O.G.ChakhmaKh-cheva, and V.A.Eflniov. Nucleotide sequence of the 5.2 kbp barley chloroplast DNA fragment, containing psbB - psbH -petB - petD gene cluster. - Nucl. Acids Res. 1989, V.17, N 7, p. 2859.
}. S.V.Reverdatto, A.V.Andreeva, A.A.BuryaKova, O.G.ChaklmaMi-cheva and V.A.Eflmov. Nucleotide sequences of the barley chloroplast psbE, psbF genes and flanking regions. - Hucl. Acids Res. 1939, V.17; N T, p. 2858.
4. Ефимов 3.A., Андреева А.В., Ревердатто С.П., Чахмахчева О.Г. Фотосистема II ячменя. Нуклеоткдная последовательность генов psbB, psbC, рзЬЕ , psbF, psbH и примыкающих к ним областей хлоропластной ДНК. ~^\Виоорган. химия 1S91, в печати. J
