Структура и некоторые биологические свойства липидов А из морских грамотрицательных бактерий родов Marinomonas и Chryseobacterium тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ВОРОБЬЕВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

Струггтурп и некоторые биологические свойства липидов А 1-з морских грамотрицательных бактерий родов Маппотопаз

и СЬгуэеоЬааопит

02.00.10-биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток-2006 г.

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской Академии Наук

Научный руководитель;

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Красикова И.Н.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Каминский В.А. кандидат химических наук, старший научный сотрудник Назаренко Е.Л.

Ведущая организация:

Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН '

Защита состоится «_ » ноября 2006 г. в 10 часов на заседании

диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН, Факс: (4232) 314-050, e-mail: science@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан « 10 у> октября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук

старший научный сотрудник

Прокопенко Г.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Инфекционные болезни относятся к числу самых распространенных патологий у человека. Антропогенная трансформация окружающей среды способствует появлению новых патогенов и новых инфекционных заболеваний. Даже в странах с развитой системой здравоохранения смертность от этих болезней очень - высока. В последние годы наблюдается снижение эффективности использования традиционных методов лечения и профилактики бактериальных инфекций. Это в первую очередь связано с тем, что в результате генетической изменчивости бактерий появляются штаммы, устойчивые к действию антибиотиков, а также штаммы с измененным антигенным составом, что помогает патогенам избегать иммунной реакции хозяина и снижает эффект от использования современных вакцин.

Особое место среди бактериальных инфекций занимают заболевания, вызванные грамотрицательными бактериями (ГОБ). Важной причиной смертности при системной грамотрицательной инфекции является эндотоксический шок (эндотоксемия). Это осложнение возникает в результате накопления в крови человека эндотоксинов, уникальных компонентов наружной мембраны (НМ) ГОБ, что приводит к неконтролируемой активации иммунной системы, синтезу большого количества эндогенных цитокинов эффекторными клетками организма хозяина и, в конечном счете, к серьезным нарушениям в организме, таким как гипотония и полиорганная дисфункция.

Несмотря на значительный прогресс в антимикробной химиотерапии, количество летальных исходов при эндотоксемии остается неприемлемо высоким. Современная медицина не располагает специфическими терапевтическими препаратами против эндотоксического шока, поэтому существует потребность в развитии новых подходов к лечению этого состояния. В основе одного из них лежит понимание того, что медиатором заболеваний, вызванных ГОБ, являются эндотоксины. В связи с этим весьма актуальным становится использование антагонистов эндотоксинов, ограничивающих выделение или иммунологическую реактивность последних. Потенциальным кандидатом на роль антагонистов эндотоксинов являются сами эндотоксины. В химическом плане они представляют собой липополисахариды (ЛПС), включающие наряду с О-полисахаридом (О-ПС) и олигосахаридом кора липидный домен, называемый липидом А {ЛА), который считается эндотоксическим центром ЛПС.

Наиболее распространенным структурным вариантом ЛА, проявляющим ярко выраженные эндотоксические свойства, является дифосфорилированный дисахарид глюкозамина (GlcN), имеющий шесть остатков жирных кислот (ЖК). С другой стороны, производные ЛА, имеющие низкую степень фосфорилирования и ацилирования, проявляют слабую эндотоксическую активность (или не проявляют вовсе), что делает возможным их использование в качестве антагонистов эндотоксинов. В настоящее время проводится обширный поиск объектов, являющихся источниками ЛА необычных структурных форм. Особенности строения ЛА во многом определяются условиями культивирования ГОБ. В этом плаке большой интерес представляют морские бактерии, которые в силу особых условий обитания (повышенное содержание солей, низкая температура, высокое гидростатическое давление, неравномерное поступление питательных веществ) могут синтезировать ЛА с низким эндотоксическим потенциалом.

Цель работы. Поиск потенциальных антагонистов эндотоксинов среди ЛА морских ГОБ.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

1. получены в индивидуальном состоянии ЛА из бактерий Marínomonas communis АТСС 27118т, Marínomonas mediterránea АТСС 700492т, Chryseobacteríum indoltheticum CIP 103168х и Chryseobacteríum scophthalmum CIP 1041997;

2. установлены структуры указанных выше соединений;

3. изучены некоторые биологические свойства ЛПС и ЛА из бактерий М. communis, М. mediterránea и С. indolthetícum, а именно: токсичность; способность индуцировать синтез фактора некроза опухоли альфа а (ФНО а) в клетках крови человека; способность ингибировать синтез ФНО а, индуцированный ЛПС патогенных бактерий.

Научная новизна и практическая ценность работы. Установлены структуры ЛА из ранее не изучавшихся морских бактерий М. communis, М. mediterránea, С. indoftheticum и С. scophthalmum. В составе молекул ЛА из бактерий рода Marinomonas обнаружена новая ацилоксиалкановая кислота, состоящая из двух остатков 3-гидроксидекановой кислоты. Впервые описан ЛА (ЛА из М. mediten-anea), не содержащий нормальных ЖК. Впервые из клеток диких, не мутантных, штаммов С. indoltheticum и С. scophthalmum выделен ЛА с моносахаридной структурой.

Впервые показано, что ЛПС из морских бактерий М. communis, М. mediterránea и С. indoltheticum имеют гораздо более высокие 50%-ные летальные дозы, чем ЛПС из наземных Yersinia pseudotuberculosis и Escherichia coU, и являются слабыми индукторами синтеза ФНО а. Установлено, что ЛПС из М. communis является антагонистом эндотоксинов универсального типа действия, что делает перспективным дальнейшее комплексное изучение ЛПС из М. communis в качестве потенциального антагониста эндотоксинов.

Апробация результатов. Материалы диссертационной работы были представлены на: конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Научно-образовательного центра ДВГУ «Морская биота» (Владивосток, Россия, 2002 г.), the lllrd German-Polish-Russtan Meeting on Bacterial Carbohydrates (Wroclaw, Poland, 2004), Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (Владивосток, Россия, 2004 г.), the IVth European Conference On Natural Products (París, France, 2005), Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates (Rostock. Germany, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 6 тезисов докладов на конференциях.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, литературного обзора, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 292 цитируемые работы. В литературном обзоре дана общая характеристика эндотоксинов, описан механизм их действия на иммунокомпетентные клетки человека, рассматриваются особенности строения ЛА из бактерий различной видовой принадлежности, проводится анализ влияния структуры ЛА на его биологические свойства. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 37 рисунков.

Используемые сокращения: ГЖХ - газо-жидкостная хроматография; ГОБ -грамотрицательные бактерии; ЖК - жирные кислоты; ЛА - липид А; ЛХ - липид X; ЛПС - липополисахарид; МС - масс-спектрометрия; НМ - наружная мембрана; О-ПС - О-полисахарид; ФНО а - фактор некроза опухоли альфа; GlcN - глюкозамин; SDS-ПААГ-апектрофорез - электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к.х.н. И.Н. Красиковой за неоценимую помощь и внимание в процессе написания работы, а также чл.-корр. РАН В.Е. Васьковскому и академику В.А. Стонику за всестороннюю поддержку. Автор выражает благодарность д.х.н. Т.Ф. Соловьевой за помощь и ценные советы в процессе работы с публикациями и диссертацией, к.х.н. В.В. Исакову и к.х.н. А.С. Дмитренку за проведение ЯМР-экспериментов, П.С. Дмитренку и О.П. Моисеенко за проведение масс-спектрометрических исследований, д.б.н. АЛ. Дроздову за консультации при постановке метода электронной микроскопии, к.б.н. Н.М. Горшковой

и к.б.н. О.И. Недзшковской за наращивание микробной массы, к.х.н. В.А. Хоменко за помощь в проведении SDS-ПААГ-электрофореза, д.х.н. П.А. Лукьянову и к.х.н. И.В. Чикаловец за полезные консультации при проведении экспериментов по индукции ФНО a, a также проф. К.Р.Г. Раетцу за полезное обсуждение работы по ЛА из бактерий рода Chryseobacteríum.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 02-04-49466, № 05-04-48504), Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология", ДВО РАН (гранты № 03-3-А-05-081, № 03-3-Г-05-040, № 05-3-А-05-061).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Объекты и методы исследования

В работе использовали штаммы морских бактерий М. communis АТСС 27118т, М. mediterránea АТСС 700492т, С. indoltheticum CIP 103168т и С. scophthaimum CIP 104199т из Коллекции Морских Микроорганизмов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН.

Бактерии выращивали в аэробных условиях при комнатной температуре с интенсивным перемешиванием на жидкой питательной среде, содержащей морскую воду. После отделения от культуральной жидкости центрифугированием клетки последовательно обрабатывали ацетоном, ЕЮН и дважды смесью CHCI3-MeOH (2:1),

ЛПС выделяли экстракцией обезжиренных бактериальных клеток 45%-ным горячим водным PhOH по методу Вестфаля (ЛПС-PW) или последовательной обработкой смесью РЬОН-СНС1з-петролейный эфир (ЛПС-РСР) по методу Галаноса и 45%-ным горячим водным PhOH. Капсульный полисахарид (КПС) получали экстракцией бактерий водой при температуре 100 вС. Анализ препаратов ЛПС, КПС и лизатов клеток проводили с помощью электрофореза в 9-25%-ных градиентных гелях с додецилсульфатом натрия (SDS-ПААГ-электрофорез) с последующим окрашиванием ионами серебра.

ЛА из бактерий рода Marínomonas получали гидролизом ЛПС 1%-ной АсОН. Для выделения ЛА из бактерий рода Chryseobacteríum использовали гидролиз обезжиренных клеток 10%-ной АсОН с последующей экстракцией смесью СНС1з-ЕЮН. ЛА очищали с помощью колоночной хроматографии на сефадексе LH-20 и силикагеле (ЛА из М. communis, С. indoltheticum, С. scophthaimum) или ионообменной хроматографии на колонке с СЕРВАЦЕЛ ДЭАЭ 52 (ЛА из М mediterránea).

Свободные ЖК получали щелочным гидролизом ЛА 6 М NaOH. Для выделения ЖК со сложноэфирным типом связи ЛА подвергали слабой щелочной обработке 0,12%-ной NH4OH. Анализ метиловых эфиров ЖК осуществляли с помощью газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) и ГЖХ-масс-спектрометрии (МС). Моносахариды идентифицировали в виде ацетатов полиолов, используя ГЖХ- и ГЖХ-МС анализ. Абсолютную конфигурацию GlcN определяли ГЖХ его ацетилированного (R)-(-)-2-октилгликозида.

MALDI-TOF-MC проводили на масс-спектрометре Bruker Biflex til с азотным лазером (337 нм), FAB-MC - на масс-спектрометре высокого разрешения AMD 604S с энергией Cs+8 кВ.

Спектры ЯМР на ядрах 1Н, 13С и 31Р записывали на спектрометрах Bruker Avance DRX-500, Bruker Avance DPX-300 и Bruker DMX-750. Полное отнесение сигналов в спектрах 'Н- и 13С-ЯМР было сделано с помощью методик COSY, TOCSY, NOESY, НМВС и HSQC. Образцы растворяли в смеси CDCI3-CD3OD; спектры записывали при 25 °С. В качестве стандартов при регистрации химических сдвигов использовали тетра метил сил ан (для 13С- и 1Н-ЯМР-спектров) (SH 0,00, 5С 0,00) и 85%-ную ортофосфорную кислоту (для 31Р-ЯМР-спектров) (5Р 0,00).

Для электронной микроскопии использовали клетки С. indoltheticum, негативно окрашенные фосфорно-вольфрамовой кислотой (электронный микроскоп JEM 7А), и ультратонкие срезы клеток (микротом Ultracut), фиксированные в 2,5%-ном глутаральдегиде на какодилатном буфере с добавлением NaCI с дофиксацией в 4%-ном 0s04 на какодилатном буфере и заключенные в смесь эпон-аралдит (электронный микроскоп JEM-100SX).

Токсичность ЛПС и ЛА проверяли на мышах линии С-57, сенсибилизированных D-галактозамином по методу Галаноса. 50%-ные летальные дозы (LDso) рассчитывали по методу Новотного.

Индукцию синтеза ФНО а изучаемыми препаратами проводили in vitro в пластиковых стерильных круглодонных 96-луночных планшетах на цельной крови человека, разбавленной в пять раз питательной средой. Активность препаратов исследовали в концентрациях от 0,1 до 100000 нг/мл. Содержание ФНО а определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем. Статистический анализ полученных данных проводили с помощью t-критерия Стьюдента.

2. Липиды А из бактерий рода Marinomonas 2.1. Структура липида А из Marinomonas commun/s АТСС 27118т

Согласно данным общего химического анализа, очищенный ЛА из М. communis состоит из двух остатков GlcN, одной фосфатной группы и пйти остатков ЖК (табл. 1).

Таблица 1. Химический состав липидов А из M. commun/s, M. mediterránea, С.

indoltheticum и С. scophthalmum.

Компонент Содержание Компонент Содержание

мкмоль/2 мкмоль GlcN мкмоль/1 мкмоль GlcN

M. сот. M. med. С. ind. С. scophth.

10: 0 0,40

12 : 0 0,59 З-ОН-изо-15:0 0,54 0,31

12 : 1 - 0,15 д:-15 :1 0,08 О.Ю

З-ОН-10:0 3,03 4,15 I З-ОН-изо-15 : О2 0,62 0,41

ЖК1 - 0,36 З-ОН-иэо-17 :0 0,67 0,65

ДМ0 :1 0,78 0.1 Дг-17 :1 0,31 0,32

1ЖК З-ОН-Ю : : О2 3,81 4,25 2 З-ОН-шо-17 : О2 0,98 0,97

1ЖК 4,80 4.76 1 ЖК 1,60 1,38

Р 1.01 1,88 Р 0,74 0,70

GlcN 2.00 2,00 GlcN 1,00 1,00

1 ЖК-неидентифицированная кислота;

2 2 ЖК 3-ОН- = сумма 3-ОН- и Д2- (продукт дегидратации 3-ОН-кислот в условиях гидролиза) кислот.

Данные спектроскопии ЯМР подтверждают дисахаридную структуру ЛА: в 1Н- и 13С-спектрах присутствуют по два сигнала аномерных атомов Н1, Н1' и CI, С1величины химических сдвигов которых (5,42, 4,65 и 94,5, 102,5 м.д. соответственно; табл. 2) свидетельствуют о том, что восстанавливающий и не восстанавливающий концы глюкозам и нобиоэы находятся в а- и (З-пиранозидных формах.

Положение сигналов атомов Н2, Н2' и С2, С2' ЛА из М. communis (4,16, 3,66 и 52,6, 56,6 м.д., табл. 2), которые в сравнении с сигналами таких же атомов незамещенного GlcN резонируют в более сильном и более слабом полях соответственно, указывает на наличие связей углерод-азот в ациламиногруппах обоих остатков GlcN. Анализ этой части спектра позволяет также сделать заключение о присутствии ацильного

заместителя при СЗ-атоме восстанавливающего конца ЛА и отсутствии такового при СЗ'-атоме ОТсЫН: ацилирование гидроксильной группы при СЗ-атоме С!с1М1 сдвигает сигнал С2-атома в сильное поле (в сравнении с незамещенным ОсЫ). О присутствии заместителя при СЗ-атоме свидетельствует и положение сигнала протона НЗ, который находится в более слабом поле (5,20 м.д.), чем сигнал НЗ'-атома {3,43 м.д.), расположенный в области резонанса протонов незамещенного остатка С1сЫ (3,5-4,5 м.д.).

Таблица 2. Данные спектров 1Н-, 13С-, и 31Р-ЯМР липида А из М. communis.

Положение 5С 6Н J, Гц

GlcNI GlcNII GlcNI GlcNII GlcNI GlcNII

1 94,5 102.5 5.42 дд 4.65 д 3,3; 7,0 8,5

2 52,6 56,6 4,16 м 3.66 дд 8,5; 10,4

3 74,8 75,4 5,20 дд 3.48 дд 9,2; 10,7 8,6; 10,4

4 69,8 71,5 3,43 т 3.38 дд 10.4; 9.2 8,6; 10,0

5 73,8 77,0 4,16 м 3,31 ддд 10,0; 4,9; 2,4

6а 69,4 69.5 3,88 дд 3,75 дд 6,7; 11,9 6,7;11,9

6э 4,05 м 3,88 дд 2,4;11,8

ЖК-2 ЖК-2' ЖК-2 ЖК-2'

CONH 172,2 173,3

2 (а-2) 42,5 41,7 2,50 м 2,62 м

3 (р-2) 71,8 72,4 5,19 м 5.28 м

4 (у-2) 34,9 34,9 1,60 м 1,57 м

5 (5-2) 26,1 27,9 1,29 м 1,29 м

ЖК-R ЖК-RI ЖК-R ЖК-RI

СОО 174.6 173.1

2 (а'-2) 35,0 43.1 2,30 м 2,46 м

3(Э'-2) 25,8 69,5 1.62 м 4,05 м

4 (v'-2) 30,0 37,9 1,38 м 1,51 м

жк-з

СОО 173,1

2 (а-3) 43,1 2,46 м

3(Р-3) 69.5 4,05 м

4 (v-3) 37,9 1,51 м

0 14,2 0,89 т 6,5

си-1 23,4 1,33 м

ш-2 32.5 1,29 м

(СН2)п 29,8-29,9 1,30 м

Сигналы метиновых протонов Н4, НЗ', и Н4', а также двух метиленовых протонов Нб' находятся в области 3-4 м.д. (табл. 2), что свидетельствует об отсутствии заместителей при атомах С4, СЗ', С4' и С6'. Корреляция протонов Нба и Нбэ с С6'-атомом при 68,6 м.д. в HSQC-спектре указывает на V—»-6-гликозидную связь между остатками GlcN.

В спектре 31Р-ЯМР ЛА из М. communis наблюдается один сигнал, величина химического сдвига которого (0,36 м.д.) предполагает, что фосфатная группа находится при С1-атоме. Расщепление сигнала H1 (Jh 1, р 7,0 Гц), сдвиг сигнала С1 в слабое поле, а также дублетные ситалы С1- и С2-атомов (Jci, р 3,4 и Jc2, р 7,0 Гц) хорошо согласуются с таким предположением.

Анализ ЖК ЛА из М. communis показал наличие декановой (10 : 0), додекановой (12: 0) и четырех остатков (Р)-З-гидроксидекановой (З-ОН-Ю : 0) кислот. В соответствии с этим, в HSQC-спектре • присутствуют три (один - двойной интенсивности) а-СН2-мультиплета при 42,5, 43,1 и 41,7 м.д. (табл. 2) в виде индивидуальных кросс-пиков. COSY-спектр ЛА из М. communis содержит один сигнал двойной интенсивности ß-CH-протонов (4.05 м.д.) от двух остатков незамещенной кислоты З-ОН-Ю : 0. который образует COSY-кросс-пики с мультиплетами а-СН2 при 2,46 м.д. и сигналами у-СН2 при 1,51 м.д. Сигналы при 5,19 и 5,28 м.д., перекрестно взаимодействующие с мультиплетами а-СН2 (2,50 и 2,62 м.д.) и сигналами у-СН2 (1,60 и 1,57 м.д.), принадлежат протонам ß-CH от двух остатков 3-ацилоксидекановой кислоты. Протоны ß-2- и ß-2'-CH ацилоксиалкановых кислот коррелируют с С-атомами, резонирующими при 71,8 и 72,4 м.д., в то время как протоны ß-З'- и ß-2"-CH остатков незамещенных З-ОН-Ю : 0 кислот коррелируют с С-атомом, имеющим величину химического сдвига 69 м.д., что хорошо согласуется с присутствием в ЛА из М. communis двух ацилокси- и двух гидроксиалкановых кислот. Отсутствие в спектре сигналов при 44 и 39 м.д., характерных для С2-атомов амидносвязанных 3-гидроксиалкановых кислот и ацилоксиалкановых кислот со спожноэфирным типом связи соответственно, свидетельствует, во-первых, о том, что изучаемый ЛА не содержит /V-связанных 3-гидрокси- и О-связанных ацилоксиалкановых кислот, и, во-вторых, о том, что обе ацилоксиалкановые кислоты имеют амидный тип связи.

Для определения распределения остатков ЖК на молекуле ЛА была использована двумерная НМВС-спектроскопия. Кросс-пик между протоном Н2 GlcN и сигналом С1 (при 172,2 м.д.) одной из кислот З-ОН-Ю : 0 указывает на присутствие гидроксикислоты (ЖК-2, табл. 2) в положении С2 глюкозаминобиозы. Кросс-пики ме>еду ß-CH-протоном ЖК-2 и С1-атомом ЖК-2. с одной стороны, и ß-CH-протоном ЖК-2 и С1-атомом при 174,6 м.д., с другой, подтверждают замещение гидроксильной группы ЖК-2 остатком другой ЖК (ЖК-R). Место присоединения второй ацилоксиалкановой кислоты (ЖК-RI) этим методом определить не удалось, так как химические сдвиги С1-атомов трех остатков ЖК (173,2, 173,1 и 173,1 м.д. для ЖК-3, ЖК-2' и ЖК-RI соответственно, табл. 2) были очень близки.

Более точно положение остатков ЖК на молекуле ЛА из М. communis было определено с помощью MC. В FAB-масс-спектре отрицательных ионов (рис. 1(a)) присутствуют два пика равной интенсивности (при 1281,90 и 1253,90 m/z), соответствующие двум типам молекулярных ионов [/W-H]" пентаацилированного ЛА, содержащего два остатка GlcN, одну фосфатную группу, четыре остатка кислоты 3-ОН-10 : 0 и по одному остатку 12 : 0 или 10 : 0 кислот.

Наряду с сигналом пентаацилированного ЛА в спектре присутствовали пики, соответствующие его тетра- (m/z 1111,85, 1099,99, 1093,81, 1081,99 и 1065,47) и триацильным (m/z 929,80 и 911,34) производным (рис. 1 (а)). Согласно данным ТСХ ЛА, использованный для MC, был гомогенным препаратом. Следовательно, де-О-ацилированные производные являются результатом частичной деградации ЛА в условиях FAB-MC. Потеря остатков кислоты З-ОН-Ю : 0 приводит к образованию пиков при m/z 1111,85, 1093,81 и 1065,47, удаление 12:0 или 10:0 кислот - к появлению в спектре пиков при m/z 1099,99 и 1081,99. Триацильные производные (m/z 929,80 и 911,34) получаются в результате одновременного отщепления двух остатков ЖК: 12 : 0 (или 10 : 0) и З-ОН-Ю : 0. Таким образом, анализ этой части спектра позволяет говорить о том, что нормальные ЖК и, по крайней мере, один остаток кислоты 3-ОН-10:0 имеют сложноэфирный тип связи.

3

5

§

со

0,70

0.50

(а)

[Mir Н]*

1М, - Н]

485.41 '502.43

1253.9

1281.9

н OJO . '

s 751-74 .

о'|й1Ы

779,55

1093.81

1081.9;

700

уа.ЩЩш jiij о* ДЩ

ноо

m/z

[M|+Na]+ [Mn+Na]+ тш

1278.06/

500 600

П00

1323 09

m,'z"

Рис. 1. FAB-масс-спектры (а) отрицательных и (б) положительных ионов липида А из М. communis. Здесь и далее спектры регистрировали в смеси CHCI3-MeOH (2:1, по

объему).

В спектре FAB-MC положительных ионов (рис. 1(6)) присутствуют пики при т/г 502,43 и 485,41, которые, по-видимому. являются фрагмент-ионами невосстанавливающего остатка GlcN, образующимися в результате расщепления гликозидной связи. Анализ этой части спектра позволяет говорить о том, что GlcNII несет два остатка кислоты З-ОН-Ю : 0 (один - с амидным типом связи, другой - со спожноэфирным), которые находятся в положении С2' (согласно данным ЯМР (табл. 2), гидроксильные группы при атомах С3\ С4' и С6' этого остатка GlcN не замещены).

Основываясь на совокупности полученных данных, мы предлагаем следующий вариант структуры ЛА из М. communis (рис. 2(a)).

R - 10 : 0 или 12 : 0

Рис. 2. Структуры липидов А из (а) М. communis и (б) М. mediterránea.

2.2. Структурная характеристика липида А из Marínomonas mediterránea

АТСС 700492т

Совокупность данных химического анализа (табл. 1). FAB-MC (рис. 3) и 31Р-ЯМР спектроскопии (рис. 4(а)) указывает на присутствие в ЛА из М. mediterránea двух фосфатных групп, отсутствие нормальных ЖК (необычная, ранее не встречавшаяся структурная особенность) и высокую степень гетерогенности.

\ $98,24

0.80-

5

-а

'0.60

4й

§0.40

0.20

0.00!

500

515.64

62G

21>

2GlcN

3(3-0н-10:0)

2Р

2GícN

4(3-ОИ~Ю:0)

•1010.01 1180.16

21>

2GlcN

2(3-(Ж-10;0)

840.3 ' -З-ОН-10:

2Р

2GícN

5(3-ОН-Ю:С)

-3-ОН-10;0

1350.27

-3-ОН-10:0 '

- ЗОН12:1

1530.0 1548.57

600

800

1000

1200

1400

m/z

1600

Рис. 3. FAB-масс-спектр отрицательных ионов липида А из М. mediterránea.

В FAB- (рис. 3) и MALDI-TOF-масс-спектрах отрицательных ионов этого ЛА наблюдаются пики, соответствующие молекулам дифосфорилированного дисахарида GlcN с пятью (m/z 1350,3), четырьмя (m/z 1180,2), тремя (m/z 1010,0) и двумя (m/z 840,3) остатками ЖК. Часть молекул липида А из М. mediterránea имеют гексаацильный тип структуры (сигналы низкой интенсивности, m/z 1546,6 и 1530,0). Эти данные позволяют говорить о том, что два (из пяти) остатка З-ОН-Ю : 0 имеют амидный тип связи, 3 других, -сложноэфирный.

В 1ЭС-ЯМР-спектре ЛА из М. mediterránea (рис. 4(6)) в области резонанса аномерных атомов углерода наблюдаются два сигнала (95,0 и 101,3 м.д.), свидетельствующие об а- и р-конфигу рации восстанавливающего и «©восстанавливающего концов дисахарида GlcN соответственно. Сдвиг сигнала С2-атома восстанавливающего конца глюкозаминобиозы в сильное поле свидетельствует о присутствии ацильного заместителя при СЗ-атоме. Величина химического сдвига С2'-атома указывает на отсутствие заместителя при СЗ'-атоме. Область резонанса С6-атомов представлена одним сигналом (62,5 м.д.), что является доказательством р-(1'—*6)-связи между остатками GlcN.

Анализ спектра в области резонанса С2-атомов 3-гидроксиалканоеых кислот (38-44 м.д.) подтверждает наличие 5 остатков кислоты З-ОН-Ю : 0, три из которых имеют сложноэфирный тип связи (41,6, 41,9 и 42,0 м.д.). два других - амидный (40,5 м.д. двойной интенсивности). Отсутствие в спектре ЛА сигнала с величиной химического Сдвига 44 м.д. указывает на присутствие ацильных заместителей при гидроксильных

группах обеих амид несвязанных ЖК. Напротив, гидроксильные группы спожноэфирносвязанных ЖК не замещены, поскольку в спектре не обнаружен сигнал с величиной химического сдвига 38 м.д.

(а)

+0,29'

-1,60

-5 0 5

(б)

Л-GlcN CV

П. с

«-GCIN С1

С6'

t».

С2'

С2

wléft

^ о ^о

<5 tn

О ОС <0

I1C)

100

ад 63

Т*"

62

55

45

<10

М.Д.

Рис. 4. (а) 31Р- и (б) 13С-ЯМР-спектры липида А из М. mediterránea (области аномерных, С6- и С2-кольцевых атомов, а также С2-атомов 3-гидроксиалкановых кислот).

Таким образом. ЛА из М. mediterránea имеет следующую структуру (рис. 2(6», которая отличается от структуры ЛА из М. communis степенью фосфорилирования и жирнокислотным составом. Тем не менее, следует отметить одну особенность, характерную для ЛА из всех бактерий рода Marínomonas, изученных к настоящему времени: присутствие в составе их молекул необычной амидносвязанной ацилоксиалкановой кислоты, которая ранее в составе ЛА не встречалась, состоящей из двух остатков 3-гидроксидекановой кислоты.

Следует сказать, что некоторые патогенные микроорганизмы наземного происхоодения также синтезируют недоацилированные и недофосфорилированные ЛА, которые помогают бактериям избегать защитной реакции организма хозяина. Низкая степень ацилирования и фосфорилирования ЛА морских непатогенных бактерий, по-видимому, связана с их адаптацией к условиям обитания. Известно, что ЛПС многих морских бактерий, в отличие от ЛПС наземных видов, которые, как правило, являются ЛПС S-типа, не имеют в составе своих молекул О-ПС и части олигосахарида кора, т.е. являются ЛПС R-типа. Высокий выход ЛА из ЛПС бактерий М. communis и М. vaga (20,7 и 24,8 % соответственно) предполагает, что ЛПС этих бактерий содержат короткие О-полисахаридные фрагменты или не содержат их вообще. Присутствие ЛПС R-типа в клетках морских микроорганизмов делает их поверхность более липофильной, что может способствовать агрегации клеток и делать их жизнь в морской воде более комфортной. Возможно, сочетание укороченного углеводного фрагмента и недоацилированного ЛА обеспечивает гидрофобно-гидрофильный баланс молекулы ЛПС, необходимый для поддержания нормальной структуры НМ бактерий.

3. Бактерии рода Chryseobacterium 3.1. Структура липидов А из Chryseobacterium indoltheticum CIP 103168т и Chryseobacterium scophthalmum CIP 104199х

Используя традиционный подход, в основе которого лежит гидролиз 1%-ной АсОН предварительно выделенных из клеток ЛПС, получить ЛА из бактерий С. indoltheticum и С. scophthalmum не удалось. В то же время жесткий щелочной гидролиз этих бактерий привел к выделению 3-гидроксиалкановых кислот с высоким выходом (0,31 и 0,39 % на вес обезжиренных клеток С. indoltheticum и С. scophthalmum соответственно), что можно расценивать как косвенное доказательство присутствия в них ЛА-содержащих фрагментов. Обработка клеток 10%-ной АсОН с последующей экстракцией смесью CHCI3-MeOH, которая ранее успешно применялась для получения моно- и дифосфорилированных производных ЛА из Yersinia pseudotuberculosis, привела к выделению препаратов (0,65 и 0,60 % на вес обезжиренных клеток С. indoltheticum и С. scophthalmum соответственно), содержащих D-G!cN, фосфорную кислоту и ЖК, что указывает на их принадлежность к ЛА. Основными ЖК были (Я?)-3-гидрокси-13-метилтетрадекановая (З-ОН-изо-15 : 0) и (Я)-3-гидрокси-15-метилгексадекановая (3-ОН-иэо-17 : 0) (табл. 1).

Таблица 3. Данные 1H-, 13С-, и 31Р-ЯМР липидов А из С. Indoltheticum и

С. scophthalmum.

Положение 5Н [(мульт.), J (Гц)] ÖC [J (Гц)]

GIcN С. indoltheticum С. scophthalmum С. indoltheticum С. scophthalmum

1 5,58 [уш.] 5,48 [уш ] 95,27 [6,7] 94,00 [4,8]

2 4,23 [дд, 5,3,10,0] 4,11 [ДД] 52,33 [7,6] 51,56(7,68]

3 5,19 [т. 10.0] 5.08 [т] 74,09 73,17

4 3,60 [дд, 10,0, 8,7] 3,45 [дд] 68,85 68,54

5 4,00 [м] 3,83 [м] 73,70 73,08

6а 3,93 [м] 3,66 [м] 62,03 61,43

6э 3,70 [дд, 11.0, 5,2] 3,75 [дд]

Жирные кислоты

CONH 173,71 173,12

а-2а 2,33 [м] 2,14 [м] 44,05 43,36

а-2Ь 2,25 [дд. 9,7, 13.8] 2,23 [дд]

Р-2 3.93 [м] 3,83 [м] 69.28 68,08

У-2 1.45 [м] 1.37 [м] 37,86 37,18

СОО 173,42 172.66

а-За 2,51 [дд. 3,7, 15,5] 2,41 [дд] 42,74 42.03

а-ЗЬ 2,45 [дд. 9,0, 15,5] 2,33 [дд]

Р-З 3.99 [м] 3,89 [м] 68,85 68,33

У-Э 1.48 [м] 1.38 [м] 37,55 36,82

(СНг)п 1.25 [м] 1,15 [м] 30,37 29,42

(0-2 1,15 [м] 1,05 [м] 39,51 38,78

ш-1 1.52 [м] 1,43 [м] 28.70 28,09

м-СНз 0.87 [д, 6,8] 0,78 [д] 22,26 22,26

Спектр 31Р-ЯМР: 6Р -0,83 м.д. (С. indoltheticum)-, ÖP -0,61 м.д. (С. scophthalmum).

В FAB-масс-спектрах отрицательных ионов очищенных образцов ЛА из С. indoltheticum и С. scophthalmum (рис. 5(з) и 5(6) соответственно) присутствовали пики молекулярных ионов [М-Н]* при m/z 766,31 и 766,2, состоящих из фосфата GIcN, ацилированного кислотами З-ОН-шо-15 : 0 и З-ОН-изо-17 : 0. Возможные структуры,

соответствующие этим ионам, имеют молекулярную формулу СзаНЬдО^МР и молекулярную массу 767,50 Да,

1.8-

i

â 1.4

(а)

[M(GlcN+3-OH-U30-15:0+3-ОН-ШО-17:0+Н3 РОА )-Н]*

са

о о

S

о

S

108

4-

(б)

о*

766.31

/

[М-Н]"-3-ОН-шо-15:0

___510.« 526.17

508.1 ; /

1 ! .. IL.,

UlMÉl

200 300 400 500

600

700

800 900 ш/z

526.14

^.Цуп!;'

-3-ОНчш-15:0

766.2

400 450 500

I III Bill Lit iL II j . il 11 I ... И ц ( 1* il In

550 600 650 ' 700 750 m/z

Рис. 5. РАВ-масс-спектр отрицательных ионов (а) лип ид а А из С. ¡гнЗоНЬеИсит и (6) С. зсорМЬа/тит, показывающий распределение остатков жирных кислот на молекуле

глюкозам ина.

Наряду с пиками диацильного ЛА в спектрах обоих соединений наблюдаются пики при m/z 526,14 и 526,17, соответствующие моноацильным производным, которые, видимо, образуются в результате частичной деградации (отщепление кислоты 3-ОН-изо-15 : 0) в условиях FAB-MC. Образование фрагмент-иона при m/z 526,14 в результате Collision Activated Dissociation (CAD) эксперимента с пиком молекулярного иона при m/z 766,97 ЛА из С. indoltheticum указывает на сложноэфирный тип связи кислоты З-ОН-иэо-15 : 0. Слабая щелочная обработка обоих ЛА привела к выделению З-ОН-изо-15 : 0 кислоты. Совокупность этих данных дает возможность утверждать, что З-ОН-шо-15 : 0 кислота имеет сложноэфирный тип связи, З-ОН-шо-17 : 0 - амидный.

Более детальная структурная характеристика изучаемых ЛА была получена с помощью одномерной и двумерной спектроскопии ЯМР. В 13С-ЯМР-епектре обоих ЛА (табл. 3) присутствуют 6 сигналов в области резонанса С-атомов С1с1М, что подтверждает их моносахарид ну ю природу. Поскольку спектры ЛА из бактерий С. ¡п<ЗоИЬеИсит и С. зсорМЬа1тит были идентичны, дальнейшее их описание проводится на примере ЛА из С. ¡п(ЗоиЬеНсит. Сдвиг в слабое поле сигналов Н1 (5,58 м.д.), Н2 (4,23 м.д.) и НЗ (5,20 м.д.) указывает на замещение гидроксильных и аминогрупп при атомах.01, СЗ и С2. Сигналы остальных протонов в1сМ (Н4, Н5, Нба и Нбэ) находятся в области 3,60-3,90 м.д., что свидетельствует об отсутствии заместителей при соответствующих гидроксильных группах. Корреляция сигналов НЗ, Н4, Н5 с индивидуальными углеродными резонансами при 74,09, 68,85, 73,7 м.д. и сигналов Нба и Нбэ с сигналом Сб-атома при 61,6 м.д. подтверждает отсутствие заместителей в положениях С4 и Сб. В тоже время сдвиг сигналов атомов С2 и СЗ в сильное и слабое поля соответственно демонстрирует наличие ацильного заместителя при СЗ-атоме. Малая (^1, 2) 3.3 Гц) и большие (*/<2, з>, >4з, ■*> и 5) 9-11 Гц) величины констант расщепления и положение сигналов атомов С1 (95,27 м.д.) и С2 {52,70 м.д.) указывают на то, что ОсЫ изучаемых ЛА имеет а-аномерную конфигурацию с аксиальными протонами Н2-Н5.

Корреляция Н2 протона в НЗОС-ЯМР-спектре со сдвинутым в сильное поле (52,7 м.д.) С2-атомом указывает на наличие связи углерод-азот в ациламиногруппе ЛА из С. ¡п<ЗоШ1еИсит. Сдвиг сигналов С1 и Н1, а также расщепление сигналов СТ (Лс1, р - 5,5 Гц), С2 (Лег, р - 8,2 Гц) и Н1 (^Н1, р = 6,7 Гц) свидетельствуют о замещении С1-атома фосфатной группой. В соответствии с этим 31Р-спектры изучаемых ЛА содержат по одному сигналу (-0,83 и -0,61 м.д. соответственно).

Два сигнала в области резонанса карбонильных групп (около 174 м.д.) и кросс-пики сс-СН2 (2,45 и 2,51 м.д.; 2,25 и 2,33 м.д.). р-СН (3,93 и 3,99 м.д.) и у-СН2 (1,45 и 1,48 м.д.) протонов с сигналами С-атомов при 44,05, 42,74, 69,28, 68,85 и 37,86 и 37,55 м.д. указывают на наличие сложноэфирно- и амид несвязанных 3-гидроксиалкановых кислот изо-серии (о присутствии кислот шо-серии свидетельствуют сигналы при 22,96 и 39,51 м.д. для четырех терминальных СН3-групп и двух (о>-1) СН-групп соответственно). Согласно полученным данным, ЛА из С. ¡гхЗоМеИсит и С. асорЬМаклит представляют собой 1-фосфат О-ФсИ, ацилированный остатками (Я)-3-ОН-изо-15 : 0 и (Я)-З-ОН-шо-17 : 0 кислот при С2- и СЗ-атомах соответственно (рис. 6(а)) и, таким образом, обладают моносахаридной структурой.

Рис. 6. Структуры липидое А из (а) С. indoltheticum и С. scophthalmum и (б) липида X из £. со/У К-12,

3.2. Некоторые особенности состава наружной мембраны бактерий рода

Chryseobacterium

Как видно из рис. 6, ЛА из С. indoltheticum и С. scophthalmum структурно подобны биосинтетическому предшественнику ЛА, так называемому липиду X (ЛХ), выделенному из мутантного штамма Е. coli. Следует сказать, что некоторое количество ЛХ (около 0,01 % от общего количества хлороформ-растворимых фосфор-содержащих веществ) всегда присутствует в клетках грамотрицательных бактерий, но его содержание резко повышается (до 3,4-6,5 %) у мутантных штаммов Е. coli. Высокое содержание ЛХ-подобного ЛА у бактерий диких штаммов обнаружено впервые.

Накопление ЛХ в клетках мутантных бактерий коррелирует с дефицитом фосфатид ил глицерин а (ФГ), одного из трех основных фосфолипидов (ФЛ) НМ ГОБ. Исследование состава ФЛ С. indoltheticum и С. scophthalmum с помощью ТСХ (рис. 7) показало отсутствие у них ФГ.

|

<ГО

;t

ф.)

Г

... Ii

ФЭ

%г г

ЛФЭ

(о)

Рис. 7. Двумерная хроматография фракции фосфолипидов из (э) С. ¡пбоНЬеНсит и (б)

5. (урЫтипит. Проявление пластин: 1 - парами Н2ЗС>4; 2 - нингидрином; 3 -молибдатным реагентом. ФГ - фосфатид ил глицерин; ФЭ - фосфатид ил этанол амин; ДФГ-дифосфатидилглицерин; ЛФЗ - лизофосфатидилэтаноламин.

По-видимому, существует определенная связь между синтезом ЛА и наличием в бактериях ФГ: в отсутствие последнего синтезируется ЛА с моносахарид ной структурой. Однако, если в pgrsB-дефицитном штамме Е. со// отсутствие ФГ есть результат направленной мутации, то отсутствие ФГ в клетках С. indoltheticum и С. scophthalmum является особенностью липидного состава этих микроорганизмов (и, возможно, бактерий рода Chryseobacterium в целом; согласно литературным данным С. defluvii sp. также не содержит ФГ). Есть еще одна особенность, которая отличает бактерии С. indoltheticum и С. scophthalmum от мутантных клеток Е. со//: первые, несмотря на отсутствие ФГ и ЛА (в его классическом структурном варианте), сохраняли свою жизнеспособность на протяжении всего жизненного цикла, тогда как у Е. coli уже после 3 ч наблюдалась остановка роста.

Следует сказать, что ЛХ легко извлекается экстракцией мутантных клеток Е. coli смесью СНС1з-Ме0Н-Н20, тогда как ЛА из бактерий рода Chryseobacterium можно выделить только после гидролиза последних 10%-ной АсОН, что указывает на существование сильной, возможно, химической связи ЛХ-подобного ЛА с другими компонентами НМ. Обычно ЛА является частью ЛПС. Однако необычная структура ЛА из бактерий рода Chryseobacterium, способ, который использовался для их выделения, ставят вопрос о присутствии ЛПС в НМ этих микроорганизмов.

В условиях SDS-ПААГ-электрофореза лизаты исходных и обезжиренных клеток С. indoltheticum и С. scophthalmum проявлялись в виде одиночных полос, совпадающих по подвижности с R-ЛПС из Е. coli (рис. 8(a), линии 2,3 и 9). Однако их слабая интенсивность (в сравнении с полосами R-ЛПС клеточного лизата V. pseudotuberculosis (рис. 8(a), линия 1), указывает на низкое содержание ЛПС в клетках изучаемых бактерий. Обработка обезжиренных клеток смесью РСР, позволяющая извлекать R-ЛПС, привела к получению незначительных количеств ЛПС-РСР (0,13 и 0,50 % на сухой вес С. indoltheticum и С. scophthalmum соответственно). Экстракция клеток горячим водным фенолом была более эффективной: выходы ЛПС из водной и фенольной фаз (ЛПС-PW) составили 8,30 и 5,34 % для С. indoltheticum и С. scophthalmum соответственно.

?.

?

i :!

Ь V ■ ■ .

" .V- 'I®5'

(а): лизат клеток У. pseudotuberculosis (1); лизаты клеток С. indoltheticum: исходные (2), обезжиренные (3), обезжиренные после выделения ЛПС (4); ЛПС из С. indoltheticum: ЛПС-РСР (5) ЛПС-PW (6), О-ПС (7); ЛА (8); ЛПС из £ со// (9).

(б): ЛПС-PW (1), КПС (2), О-ПС КПС (3) из С. indoltheticum.

I 2 3 4 5 б 7 8 9

1 2 3

Рис. 8. SDS-ПААГ-электрофорез лизатов клеток, ЛПС, О-ПС и КПС из С. indoltheticum. Образцы ЛПС и О-ПС наносили по 10,9 мкг, лизатов клеток - по 36,5 мкг.

На электрофореграммах PW- и РСР-экстракты из С. Ыо1№еНсит обнаруживались в виде полос, окрашивающихся ионами серебра. Они совпадали по подвижности между собой и с полосами клеточных лизатов (рис. 8(а), линии 5, 6) и исчезали после

гидролиза экстрактов 1%-ной АсОН (О-ПС и ЛА, рис. 8(а), линии 7, 8). На первый взгляд, данные ЗОЗ-ПААГ-электрофореза указывают на присутствие ЛПС К-типа е клетках бактерий рода СЬгузеоЬас1епит. Однако анализ PW- и РСР-экстрактов этих бактерий показал, что они практически не содержат ЖК. в том числе 3-гидроксиалкановых кислот, обязательных компонентов всех изученных к настоящему времени ЛПС, и из них не выделяется (С. /лс/о/№е?/сиш) или выделяется в незначительных количествах (0,04 % на вес сухих бактерий С. зсорЫЬа1тит) ЛА. Учитывая чувствительность метода ЗОЗ-ПААГ-электрофореза (для обнаружения 14-ЛПС достаточно 0,1 мкг образца), можно говорить о крайне низком содержании ЛПС в клетках изучаемых бактерий.

Что касается природы веществ, экстрагируемых из бактерий фенол-содержащими системами растворителей, мы предположили, что они могут быть КПС. Действительно, исследование строения клеточной стенки бактерий С. ¡пс!о1И1еИсит с помощью электронной микроскопии ультратонких срезов клеток, а также клеток, негативно контрастированных фосфорно-вольфрамовой кислотой, показало наличие капсулы толщиной около 0,12 мкм на поверхности микроорганизма. КПС, выделенный кипячением бактериальных клеток с водой, в ЭОЗ-ПААГ-электрофорезе давал полосу, которая совпадала по подвижности с полосой ЛПС-Р\М (рис. 8(6), линии 2 и 1 соответственно) и исчезала после обработки КПС 1%-ной АсОН (рис. 8(6), линия 3). Более того, КПС и так называемые ЛПС («ЛПС») имели одинаковый моносахаридный состав (манноза, глюкоза, 3-дезоксигексоза, две 2-амино-2-дезоксипентозы, глюкозамин и галактоза мин), что подтверждает сходную химическую природу этих веществ. КПС и «ЛПС» из бактерий С. зсорМ11а1тит также были подобны.

Таким образом, полученные результаты позволяют говорить об отсутствии (или незначительном содержании) ЛПС в его классическом структурном варианте в клетках морских бактерий С. ¡п¿оНЬеИсит и С. эсорШИа/тит. Эти бактерии не синтезируют ФГ, а ЛА, выделенные из них, имеют моносахарид ну ю структуру. Биологическое значение столь значительных изменений в составе НМ бактерий С. ¡пбоНЬеИсит и С. эсорМЬа/тит пока остается невыясненным.

4. Некоторые биологические свойства липидов А из бактерий родов С/)/узеоЬас1е/7ит и Маппотопаз

Проведенная нами характеристика ЛА из морских бактерий показала, что они имеют ряд особенностей (низкая степень ацилирования и фосфорилирования, необычное распределение остатков ЖК на глюкозам и нобиозе, моносахаридный тип структуры), которые позволяют рассматривать их в качестве потенциальных антагонистов эндотоксинов.

Таблица 4, Определение острой токсичности ЛПС из бактерий М. сommunis,

М. mediterránea и С. indoltheticum.

Вещество Кол-во умерших животных/общее кол-во животных при введении следующих доз изучаемых соединений (мкг/мышь) LD50 мкг/мышь

0,004 0,04 0.4 4 40

С. indoltheticum ЛПС 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 >12

С. indoltheticum ЛА 0/4 0/4 0/4 0/4 Н.О.* >12

М. communis ЛПС 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 12,65

М, mediterránea ЛПС 0/4 0/4 0/4 2/4 Н.О.* 2,73

У. pseudotuberculosis Л ПС 0/3 1/3 2/3 3/3 Н.О.* 0,06

Е. coli ЛПС 1/4 3/4 4/4 4/4 Н.О.* 0,012

* - н.о. означает «не определяли».

Следует сказать, что известные к настоящему времени антагонисты эндотоксинов обладают слабой токсичностью. Изучение ЛПС из бактерий М. communis, М. mediterránea показало (табл. 4), что они имели значительно более высокие 50%-ные летальные дозы (2,73 и 12,65 мкг/мышь соответственно), чем ЛПС из У. pseudotuberculosis и £ со// (0,06 и 0,012 мкг/мышь соответственно). ЛПС и ЛА из С. indoltheticum были не токсичны при всех исследуемых дозах.

Токсические свойства ЛПС связывают с их ФНО а-индуцирующей активностью. На рис. 9 представлены данные по индукции синтеза ФНО а в клетках цельной крови человека ЛПС и ЛА из М. communis, М. mediterránea и С. indoltheticum.

. с £

60 Oí

. 400

■в-j

С

ra <

О X

е о

200

(а)

1-ЛПС ИЗ со/1

2-"Л ПС" из С. mdolitietícum

3-ЛПС ИЭ М, niedíieiranea

4-ЛПС из М. communis

i ■—"t........—i—1—i • 1 i1—■—

0 1 100

С ЛПС, нг/мл

1 0000

t; 60 Oí X

ь. Ж

с 4 0 0 «

л

с

« 20(Н <

О

9 О

(б)

1-ЛПС ИЗ Е. cotí

2-ЛА из М. communis

3-ЛА иэ С. indoltheticum

2 3

0 i 100 С препарата, нг/мл

1 0 000

Рис. 9. Индукция синтеза ФНО а (а) ЛПС из М. communis, М. mediterránea и С. indoltheticum и (б) ЛА из М. communis и С. indoltheticum в пробах цельной крови человека. Здесь и далее данные представлены в виде М ± СО, где М - средняя арифметическая трех экспериментов, каждый из которых сделан в триплете, СО — стандартное отклонение. Различия меэду пробами с исследуемыми препаратами и контрольной пробой считали достоверными при * - рс0,01, ** - р<0,02, *** - р<0,05.

ЛПС из М. communis был не активен во всех исследуемых концентрациях. ЛПС из М. mediten-anea и С. indoltheticum начинали индуцировать синтез ФНО а в дозах 100 и 10 нг/мл соответственно (для сравнения, синтез ФНО а под действием ЛПС из £ со/У начинался при концентрации менее 0,1 нг/мл, рис. 9(а)). Максимальное количество ФНО а синтезировалось под действием ЛПС из М. mediterránea (1 мкг/мл) и С. indoltheticum (10 мкг/мл). ЛА из М. communis и С. indoltheticum (ЛА из М mediterránea в этом тесте не изучался) не проявляли ФНО а-индуцирующую активность (рис. 9(6)).

Известно, что максимальной эндотоксической активностью обладают ЛА, молекулы которых имеют два остатка GlcN, две фосфатных группы и шесть остатков ЖК. т.е. такие, как ЛА из £ со//. Любое отклонение в сторону увеличения или уменьшения степени ацилирования ЛА приводит к значительному изменению его эндотоксической активности. Из изученных нами ЛА наиболее близким по структуре ЛА из £ coli является ЛА из М. mediterránea (рис. 2(6)). Однако доля молекул ЛА с гексаацильным типом структуры в ЛПС из М. mediterránea невелика (рис. 3), что объясняет его значительно более низкую индуцирующую активность по сравнению с активностью ЛПС из Е. coli.

Эндотоксическая активность ЛПС и ЛА зависит не только от степени ацилирования, но и от того, как ацильные заместители распределяются в молекуле ЛА. Так, ЛА из Salmonella spp. и Pseudomonas aerations, у которых отсутствует остаток ЖК в положениях СЗ' и СЗ соответственно, проявляли слабую эндотоксическую активность.

1S

Это может объяснять, почему ЛА и ЛПС из М. communis не индуцировали синтез ФНО а даже в максимально высоких концентрациях. По-видимому, определенный вклад в низкую эндотоксическую активность изучаемых препаратов вносит отсутствие в составе их молекул фосфатной группы: удаление одной из фосфатных групп ЛА из S. typhimurium приводило к снижению его эндотоксической активности более чем в 1000 раз по сравнению с исходным, дифосфорилированным ЛА.

Наиболее активным индуктором синтеза ФНО а из всех проверенных нами образцов оказался «ЛПС» из С. indoltheticum. Следует еще раз подчеркнуть, что препарат, который мы называем ЛПС, по-видимому, ЛПС не является (см. гл. 3). Следовательно, достаточно высокая индуцирующая способность этого препарата определяется не липидным фрагментом его молекулы, который у него отсутствует, а какими-то другими особенностями его состава или структуры.

В отличие от «ЛПС», ЛА из С. indoltheticum не индуцировал синтез ФНО а в клетках крови человека (рис. 9(6)). Как описывалось выше, в структурном плане он подобен биосинтетическому предшественнику ЛА и некоторым синтетическим моносахаридным аналогам ЛА. известным своей низкой эндотоксической активностью, что хорошо согласуется с полученными нами данными.

Таким образом, изучаемые нами ЛА и ЛПС из морских бактерий оказались слабыми индукторами синтеза ФНО а в клетках крови человека. Следует сказать, что все известные к настоящему времени антагонисты эндотоксинов на основе ЛА практически не индуцируют синтез цитокинов в клетках крови человека и проявляют слабую токсичность. Высокие 50%-ные летальные дозы ЛПС и ЛА из М. communis и ЛА из С. indoltheticum в сочетании с их низкой индуцирующей способностью позволяют предполагать, что они могут быть антагонистами эндотоксинов, т.е. препятствовать связыванию эндотоксинов со специфическими рецепторами на клетках-мишенях макроорганизма, тем самым ингибируя синтез ФНО а и, в конечном итоге, предотвращая процессы, ведущие к развитию патофизиологических реакций. В связи с этим, мы изучили способность этих соединений ингибироеать индуцированный ЛПС из Е. coli (в концентрации 10 нг/мл) синтез ФНО а (рис. 10(a)).

При максимально высоких концентрациях (10 и 100 мкг/мл) ЛА из С. indoltheticum ингибировал синтез ФНО а на 16,0 и 40,7 %. ЛА из М. communis, несмотря на свою низкую ФНО а-индуцирующую активность, обладал слабыми ингибирующими свойствами (рис. 10 (а)). При концентрациях 10 и 100 мкг/мл содержание ФНО а под действием этого препарата уменьшалось всего на 19,8 и 24,5 % соответственно. В отличие от ЛА, ЛПС из М. communis проявлял ярко выраженные антагонистические свойства (рис. 10 (а)): ингибирование синтеза ФНО а наблюдалось уже при концентрации 10 нг/мл, достигая максимального значения (80%-ное ингибирование) при концентрации 1000 нг/мл. Несовпадение биологической активности ЛА из М. communis и соответствующего ЛПС, может объясняться тем, что гидрофильный ЛПС и гидрофобный ЛА по-разному ведут себя в водных растворах.

Следует отметить, что увеличение содержания ЛПС из М. communis в пробе приводило к снижению его ингибирующей активности. В результате, при концентрации ЛПС 100 мкг/мл содержание ФНО а было всего на 18 % ниже, чем в контрольной пробе. Интересно, что подобный эффект (уменьшение ингибирующей активности с увеличением концентрации ингибитора) был отмечен для дифосфорилированного производного ЛА из Е. coli, имеющего тетраацильный тип структуры. Возможно, это объясняется тем, что при высоких концентрациях ингибитора в реакционной среде образуются смешанные мицеллы, в результате чего активность индуктора (ЛПС из Е. coli) существенно возрастает.

и 350 с

250

j

с

<в

¿ tea

х

е

О 50

1-ЛПС ms М. conunwus

2-ЛА из М. communis

3-ЛА из С, indoüheticum

1000 100000

(а) 01 10

4 ' С препарата, нг/мл

560

w 460

*

С

а э о о

■е

л

с 200 та

г

О

100

о

1-ЛПС йэ S, mirtn+sota

2-ЛПС из V. pi9udotut>ercufosis

3-ЛПС мэ Е. coif

. . 0.1 1 0 10 00 1 00 000 ^ 'С Л П С из М, communis, иг/мл

1-ЛПС иэ £.co!t +1000 иг/мл

ЛПС из М. communis

2-ЛПС иаС. coli

1 10 100 1006 10000 \ ' СЛПС из £ еод нг/нп

Рис. 10. (а) Ингибирование ЛПС и ЛА из М. communis и ЛА из С. indoltheticum индуцированного 10 нг/мл ЛПС из Е. coli 055: В5 синтеза ФНО а. (б) блокирование ингибирования ЛПС из М. communis индуцированного синтеза ФНО a увеличивающимися концентрациями эндотоксина (ЛПС из Е. со// 055: В5) и (в) ингибирование ЛПС из М. communis индуцированного ЛПС из

У. pseudotuberculosis (10 нг/мл), S. minnesota R7 (10 нг/мл) и ЛПС из Е. coli 055: В5 (10 нг/мл) синтеза ФНО а в пробах цельной крови человека, (б): * -р<0,05 при сравнении данной пробы с предыдущей; # - р<0,05 при сравнении данной пробы с контрольной (с соответствующей дозой ЛПС из £ coli).

Следует сказать, что уже при десятикратном увеличении содержания ЛПС из Е. соЯ в тест-системе ингибирование уменьшалось на 15 % (рис. 10(6)). При концентрации индуктора 10 мкг/мл ингибирование составляло всего 40 %. Эти данные свидетельствуют о том, что ЛПС из М. communis, по-видимому, является конкурентным ингибитором эндотоксинов.

Поскольку за синтез провоспалительных цитокинов отвечает ЛА, присутствующий во всех эндотоксинах, логично предположить, что конкурентный ингибитор должен эффективно блокировать биологическую активность любого токсичного ЛПС, независимо от его структуры. Действительно, как следует из данных, приведенных на рис. 10(e), ЛПС из М. communis блокироует синтез ФНО а, индуцированный ЛПС из разных бактерий: У. pseudotuberculosis (ЛПС S-формы, LD5o = 0,06 мкг/мышь, табл. 5), Salmonella minnesota R7 (ЛПС R-формы) и £. со// 055: В5 (ЛПС S-формы, LDso = 0,012 мкг/мышь, табл. 5). Эти данные, а также зависимость ингибирующего действия ЛПС из М. communis от концентрации индуктора (рис. 10(6)), хорошо согласуются с общепринятой концепцией, что стимуляция иммунокомпетентных клеток эндотоксинами осуществляется через взаимодействие последних с рецепторами, специфичными к ЛА.

Таким образом, ЛПС и ЛА из морских бактерий являются слабыми индукторами синтеза провоспалительных цитокинов, таких как ФНО а. Более того, проведенные эксперименты продемонстрировали, что ЛПС из М. communis является антагонистом эндотоксинов универсального типа действия. Следует отметить, что ингибирующая активность ЛПС из М. communis проявлялась при гораздо меньших концентрациях, чем в случае хорошо известного синтетического антагониста эндотоксинов Е-5531. Для Е-5531 50%-ное ингибирование синтеза ФНО а, индуцированного 10 нг/мл ЛПС из Е. cotí, наблюдалось при концентрации 3765 нг/мл, тогда как с ЛПС из М. communis аналогичный эффект наблюдался при концентрации менее 100 нг/мл. Это делает перспективным дальнейшее комплексное изучение ЛПС из М. communis в качестве потенциального антагониста эндотоксинов.

ВЫВОДЫ

1. Из морской грамотрицательной бактерии Marinomonas communis АТСС 27118т выделен липид А необычной структуры - 1-фосфат р-1>6-связанного дисахарида D-глюкозамина, ацилированного остатками редких короткоцепочечных (Я)-3-додеканоилоксидекановой (или (Я)-З-деканоилоксидекановой) и (R)-3-гидроксидекановой кислот в положениях 2 и 3 соответственно и (R)-3-{(R)-3-гидроксидеканоил}оксидекановой кислоты в положении 2'.

2. Липид А из бактерий М. mediterránea АТСС 700492т не содержит нормальных жирных кислот и представляет собой 1,4*-дифосфат глюкозаминобиозы, ацилированный остатками (/?)-3-{(Я)-3-гидроксидеканоил}оксидекановой кислоты в положениях 2. 2' и (Я)-3-гидроксидекановой кислоты в положении 3. Липиды А бактерий рода Marinomonas — первые представители соединений этого класса, содержащие необычную 3-ацилоксиалкановую кислоту, состоящую из двух остатков (/?)-3-ги д р о ксид ека н о в о й кислоты.

3. Впервые из диких, не мутантных, штаммов морских бактерий Chryseobacteríum indoltheticum CIP 103168т и С. scophthalmum CIP 104199т выделен липид А моносахарид ной природы: 1-фосфат D-глюкозамина, ацилированный остатками (R)-3-гидрокси-изо-пентадекановой и (Я)-3-гидрокси-изо-гептадекановой кислот в положениях 2 и 3 соответственно.

4. Показано, что липиды А из бактерий М. communis, М. mediterránea и С. indoltheticum, а также липополисахарид из М, communis проявляют низкую токсичность.

5. Липиды А из М. communis и С. indoltheticum, а также липоплисахарид из М. communis не индуцируют синтез фактора некроза опухоли альфа клетками периферической крови человека при всех изученных концентрациях. Липиды А из М. communis и С. indoltheticum в дозе 10000 нг/мл ингибируют индуцированную липополисахаридом из Escherichia cóli продукцию фактора некроза опухоли альфа на 50 %. Липополисахарид из М. communis в концентрации 1000 нг/мл ингибирует индуцированный синтез фактора некроза опухоли альфа на 80 % и является антагонистом эндотоксинов универсального типа действия.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Тихонова Е.В. Структурное изучение липида А морских протеобактерий рода Marinomonas // Фундаментальные исследования морской биоты. Биология, химия и биотехнология. Материалы конференции студентов, аспирантов и молодых ученых НОЦ ДВГУ «Морская биота». Владивосток. 2002. С. 105-107.

2. Vorobeva E.V., Dmitrenok A.S., Dmitrenok P.S.. Isakov V.V., Krasikova I.N. The structure and some biological properties of lipid A from marine proteobacterium Marinomonas communis ATCC 27118T // Abstracts of the lllrd German-Polish-Russian Meeting on Bacterial Carbohydrates. Wroclaw, Poland, October 6-9. 2004. P. 54-55.

3. Krasikova I.N., Vorobeva E.V., Dmitrenok A.S., Dmitrenok P.S., Isakov V.V. Uncommon Escherichia coli lipid X-like lipid A from the marine bacterium Chryseobacterium indoltheticum CIP 103168T // Abstracts of the lllrd German-Polish-Russian Meeting on Bacterial Carbohydrates. Wroclaw, Poland, October 6-9. 2004. P. 52-53.

4. Воробьева E.B., Красикова И.Н., Дмитренок A.C., Дмитренок П.С., Исаков В.В., Недашковская О.И., Соловьева Т.Ф. Структура необычного липида А из морской бактерии Chryseobacterium indoltheticum CIP 103168т // Тезисы докладов Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии». Владивосток, 16-18 ноября. 2004 г. С. 88.

5. Воробьева Е.В., Дмитренок А.С., Дмитренок П.С., Исаков В.В., Красикова И.Н., Соловьева Т.Ф. Структура необычного липида А из морской бактерии Marinomonas communis ATCC 27118т//Биоорган, химия. 2005. Т. 31. №4. С. 404-413.

6. Krasikova I.N., Vorobeva E.V., Isakov V.V., Dmitrenok A.S., Dmitrenok P.S., Nedashkovskaya O.l. Marine Gram-negative bacteria - a potential source of uncommon strucrure lipid A's // Abstracts of the IVth European Conference On Natural Products. Paris. France, September 12-16. 2005. OC08,

7. Воробьева E.B., Красикова И.Н., Соловьева Т.Ф. Влияние липополисахаридов и липидов А из некоторых морских бактерий на индукцию спонтанного и индуцированного липополисахаридом из Escherichia coli синтеза ФНО-а клетками периферической крови человека // Биохимия. 2006. Т. 71. № 7. С. 936-944.

8. Воробьева Е.В., Красикова И.Н., Дмитренок А.С., Дмитренок П.С., Исаков В.В., Недашковская О.И., Соловьева Т.Ф. Характеристика необычного липида А моносахаридной природы из морской бактерии Chryseobacterium scophthalmum CIP 104199х И Биоорган, химия. 2006. Т. 32. № 5. С, 538-545.

9. Krasikova I.N., Vorobeva E.V., Volk A.S., Solov'eva T.F. The influence of Eipopolysaccharides and lipid As from some marine bacteria on spontaneous and induced by Escherichia coli LPS TNF-a release from peripheral human blood cells // Abstracts of the Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates. Rostock, Germany, October 4-8. 2006. P. 27.

Соискатель

Воробьева Е.В.

ВОРОБЬЕВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

Структура и некоторые биологические свойства липидов А из морских грамотрицательных бактерий родов Маппотопаэ

и СЬгувеоЬа^епит

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Зак, № 178п, Формат 60x84 Усл. п. л. 1.0. Тираж 100 экз. Подписано в печать 06.t0.2006 г. Печать офсетная с оригинала заказчика.

Отпечатано в типографии ОАО «Дальпрнбор» 690105, г. Владивосток, ул. Бородинская, 46/50, тел.: 32*70-49

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

11.1. МЕХАНИЗМЫ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЭНДОТОКСИНОВ И СТРАТЕГИИ ПО ИХ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ.

11.2. СТРУКТУРА ЛИПИДА А.

11.2.1. Общая характеристика липида А.

11.2.2. Варианты липида А, имеющие модификации в структуре гидрофильной части молекулы.

11.2.2.1. Вариации в углеводной части молекулы липида А.

11.2.2.2. Наличие остатков фосфорной кислоты.

11.2.3. Характеристика гидрофобной части молекулы липида А.

11.2.3.1. Качественный состав жирных кислот липида А.

11.2.3.2. Количественный состав жирных кислот липида А.

11.2 А. Бактерии, не содерэ/сащие липида А.

II.2.5. Взаимосвязь структуры и биологических свойств липида А.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

111.1. ЛИПИДЫ А ИЗ БАКТЕРИЙ РОДА MARINOMONAS.

III. 1.1. Структура липида А из Marinomonas communis

АТСС 27118'.

III. 1.2. Структурная характеристика липида А из Marinomonas mediterránea АТСС 700492Т.

111.2. СТРУКТУРА ЛИПИДОВ А ИЗ БАКТЕРИЙ РОДА CHRYSEOBACTERIUM.

111.3. НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ СОСТАВА НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ

БАКТЕРИЙ РОДА CHRYSEOBACTERIUM.

III.3. НЕКОТОРЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛИПИДОВ А И ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ ИЗ БАКТЕРИЙ РОДОВ СHR YSEOBA CTERIUM И MARINOMONAS.

IV. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

V. ВЫВОДЫ.

V. ВЫВОДЫ

1. Из морской грамотрицательной бактерии Marinomonas communis АТСС 27118Т выделен липид А необычной структуры - 1-фосфат (3-1'—»6-связанного дисахарида D-глюкозамина, ацилированного остатками редких короткоцепочечных (К)-3-додеканоилоксидекановой (или (Л)-З-деканоилоксидекановой) и (У^)-З-гидроксидекановой кислот в положениях 2 и 3 соответственно и (i?)-3-{(i?)-3-гидроксидеканоил}оксидекановой кислоты в положении 2'.

2. Липид А из бактерий М. mediterránea АТСС 700492 не содержит нормальных жирных кислот и представляет собой 1,4'-дифосфат глюкозаминобиозы, ацилированный остатками (Я)-3-{(/?)-3-гидроксидеканоил}оксидекановой кислоты в положениях 2, 2' и (К)~ 3-гидроксидекановой кислоты в положении 3. Липиды А бактерий рода Marinomonas -первые представители соединений этого класса, содержащие необычную 3-ацилоксиалкановую кислоту, состоящую из двух остатков (Я)-З-гидроксидекановой кислоты.

3. Впервые из диких, не мутантных, штаммов морских бактерий Chryseobacterium in

Т Т doltheticum CIP 103168 и С. scophthalmum CIP 104199 выделен липид А моносахаридной природы: 1-фосфат £)-глюкозамина, ацилированный остатками (/?)-3-гидрокси-изо-пентадекановой и (^)-З-гидрокси-шо-гептадекановой кислот в положениях 2 и 3 соответственно.

4. Показано, что липиды А из бактерий М. communis, М. mediterránea и С. indoltheti-сит, а также липополисахарид из М. communis проявляют низкую токсичность.

5. Липиды А из М. communis и С. indoltheticum, а также липоплисахарид из М. communis не индуцируют синтез фактора некроза опухоли альфа клетками периферической крови человека при всех изученных концентрациях. Липиды А из М communis и С. indoltheticum в дозе 10000 нг/мл ингибируют индуцированную липополисахаридом из Escherichia coli продукцию фактора некроза опухоли альфа на 50 %. Липополисахарид из М. communis в концентрации 1000 нг/мл ингибирует индуцированный синтез фактора некроза опухоли альфа на 80 % и является антагонистом эндотоксинов универсального типа действия.

1. Baumgartner J.-D., Calandra Т. Treatment of sepsis. Past and future avenues // Drugs 1999. V. 57. №2. P. 127-132.

2. Opal S.M., Yu Jr. R.L. Antiendotoxin strategies for the prevention and treatment of septic shock. New approaches and future directions // Drugs 1998. V. 55. № 4. P. 497-508.

3. Morrison D.C., Ryan L.J. Endotoxins and disease mechanisms // Annu. Rev. Med. 1987. V. 38. №4. P. 417-432.

4. Kato H., Haishima Y., Iida Т., Tanaka A., Tanamoto K. Chemical structure of lipid A isolated from Flavobaclerium meningoseplicum lipopolysaccharide // J. Bacteriol. 1998. V. 180. №15. P. 3891-3899.

5. Kumins N.H., Hunt J., Gamelli R.L., Filkins J.P. Partial hepatectomy reduces the en-dotoxin-induced peak circulating level of tumor necrosis factor in rats // Shock 1996. V. 5. № 5. P. 385-388.

6. Cross A., Opal S.M. Therapeutic intervention in sepsis with antibody to endotoxin: is there a future? // J. Endotox. Res. 1994. V. 1. № 1. P. 57-59.

7. Wilkinson S.G. Bacterial lipopolysaccharides themes and variations // Progr. Lipid Res. 1996. V. 35. №3. P. 283-343.

8. Книрель Ю.А., Кочетков H.K. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А // Биохимия 1993. Т. 58. № 2. С. 166-200.

9. Rietschel Е.Т., Brade Н., Hoist О. Bacterial endotoxin: chemical constitution, biological recognition, host response, and immunological detoxification // Curr. Topics in Microbiol. Immunol. 1996. V. 216. № 1. C. 39-81.

10. Kawata Т., Bristol J.R., Rossignol D.P. E5531, a synthetic non-toxic lipid A derivative blocks the immunobiological activities of lipopolysaccharide // British J. Pharmacol. 1999. V. 27. № 5. P. 853-862.

11. Tanamoto К. Production of nontoxic lipid A by chemical modification and its antagonistic effect on LPS action // Prog. Clin. Biol. Res. 1998. V. 397. № 3. P. 269-280.

12. Ray M.K., Kumar G.S., Shivaji S. Phosphorylation of lipopolysaccharides in the Antarctic psychotroph Pseudomonas syringae: a possible role in temperature adaptation // J. Bacte-riol. 1994. V. 176. № 14. P. 4243-4249.

13. Kawahara K., Tsukano H., Watanabe H., Lindner В., Matsuura M. Modification of the structure and activity of lipid A in Yersinia pestis lipopolysaccharide by growth temperature // Infect. Immun. 2002. V. 70. № 8. P. 4092-4098.

14. Красикова И.Н., Бахолдина С.И., Хотимчеико C.B., Соловьева Т.Ф. Влияние температуры роста и плазмиды pVM82 на жирнокислотный состав липида A Yersinia pseudotuberculosis II Биохимия 1999. Т. 64. № 4. С. 404-411.

15. Beutler В., Poltorak A. The sole gateway to endotoxin response: how LPS was identified as tlr4, and its role in innate immunity // Drug Metabol. Disposit. 2001. V. 29. № 4. P. 474-■478.

16. Mayer H., Bhat U.R., Masoud H., Radziewska-Lebrecht J., Widemann C., Krauss J.H. Bacterial lipopolysaccharides // Pure Appl. Chem. 1989. V. 61. № 7. P. 1271-1282.

17. Nikado H., Nakae T. The outer membrane of gram-negative bacteria // Adv. Microb. Physiol. 1979. V. 20. P. № 2. 163-250.

18. Bayston K.F., Cohen J. Bacterial endotoxin and current concepts in the diagnosis and treatment of endotoxemia // J. Med. Microbiol. 1990. V. 31. № 2. P. 73-83.

19. Rietschel E.T., Brade H. Bacterial endotoxins // Scientif. Amer. 1992. V. 267. № 2. P. 5461.

20. David S.A. Towards a rational development of anti-endotoxin agents: novel approaches tosequestration of bacterial endotoxins with small molecules // J. Mol. Recogn. 2001. V. 14. № 6. P. 370-387.

21. Dinarello C.A. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1996. V. 216. № 2. P. 133-165.

22. Bone R.C. Gram-negative sepsis: a dilemma of modern medicine // Clin. Microbiol. Rev. 1993. V. 6. № 1. P. 57-68.

23. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология: Пер. с англ. М.: Мир, 2000 (Roitt I., Brostoff G., Male D. Immunology. London; Philadelphia; St. Louis; Sydney; Tokio: Mosby, 1998).

24. Amura C.R., Silverstein R, Morrison D.C. Mechanisms involved in the pathogenesis of sepsis are not necessarily reflected by in vitro cell activation studies // Infect. Immun. 1998. V. 66. №11. P. 5372-5378.

25. Diks S.H., van Deventer S.J.H., Peppelenbosch M.P. Lipopolysaccharide recognition, internalization, signaling and other cellular effects // J. Endotox. Res. 2001. V. 7. № 5. P. 335-348.

26. Marra M.N., Wilde C.G., Griffith G.E., Snable J.L., Scott R.W. Bactericidal/permeability-increasing protein has endotoxin-neutralizing activity // J. Immunol. 1990. V. 144. № 2. P. 662-666.

27. Tobias P.S., Mathison J.C., Ulevitch R.J. A family of lipopolysaccharide binding proteins involved in responses to Gram-negative sepsis // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. № 27. P. 13479-13481.

28. Vesy C.J., Kitchens R.L., Wolfbauer G., AlbersJ.J., Munford R.S. Lipopolysaccharide-binding protein and phospholipid transfer protein release lipopolysaccharides from gramnegative bacterial membranes // Infect. Immun. 2000. V. 68. № 5. P. 2410-2417.

29. Kirkland T.N., Finley F„ Leturq D., Moriarty A., Lee J.D, Ulevitch R.J., Tobias P.S. Analysis of lipopolysaccharide binding by CD14 // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. № 33. P. 24818-24823.

30. Wright S.D., Ramos R.A., Tobias P.S., Ulevitch R. J., Mathison J. C. CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein // Science 1990. V. 249. №4975. P. 1431-1433.

31. Ziegler-Heitbrock H.W., Ulevitch R.J. CD14: cell surface receptor and differentiation marker // Immunol. Today 1993. V. 14. № 3. P. 121-125.

32. Viriyakosol S., Mathison J.C., Tobias P.S., Kirkland T.N. Structure-function analysis of CD14 as a soluble receptor for lipopolysaccharide // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 5. P. 3144-3149.

33. Gegner J.A., Ulevitch R.J., Tobias P.S. Lipopolysaccharide (LPS) signal transduction and clearance. Dual roles for LPS binding protein and membrane CD14 // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 10. P. 5320-5325.

34. Tobias P.S., Soldau K,, Gegner J.A., Mintz D., Ulevitch R.J. Lipopolysaccharide binding protein-mediated complexation of lipopolysaccharide with soluble CD 14 // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. 18. P. 10482-10488.

35. Pugin J., Heumann I.D., Tomasz A., Kravchenko V.V., Akamatsu Y., Nishijima M., Glauser M.P., Tobias P.S., Ulevitch R.J. CD14 is a pattern recognition receptor // Immunity 1994. V. 1. № 6. P. 509-516.

36. Antal-Szalmas P. Evaluation of CD 14 in host defence // Eur. J. Clin. Invest. 2000. V. 30. №2. P. 167-179.

37. ITaziot A., Chen S., Ferrero E., Low M.G., Silber R., Goyert S.M. The monocyte differentiation antigen, CD 14, is anchored to the cell membrane by a phosphatidylinositol linkage // J. Immunol. 1988. V. 141. № 2. P. 547-552.

38. Goyert S.M., Ferrero E., Rettig W.J., Yenamandra A.K., Obata F., Le Beau M.M. The CD 14 monocyte differentiation antigen maps to a region encoding growth factors and receptors // Science 1988. V. 239. № 4839. P. 497-500.

39. Simmons D.L., Tan S., Tenen D.G., Nicholson Weller A., Seed B. Monocyte antigen CD 14 is a phospholipid anchored membrane protein//Blood 1989. V. 73. № 1. P. 284-289.

40. Lemaitre B., Nicolas E., Michaut L., Reichhart J.M., Hoffman J.A. The dorsoventral regulatory gene cassette Spaetzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Droso-phila adults // Cell 1996. V. 86. № 6. P. 973-983.

41. Cantrell D., O'Neill L., Welham M. Signal transduction during innate and adaptive immunity // Biochem. Society Transact. 2001. V. 29. № 5. P. 853-859.

42. Shimazu R., Akashi S., Ogata H., Nagai Y., Fukudome K., Miyake K., Kimoto M. MD-2, a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4 // J. Exp. Med. 1999. V. 189. № 11. P. 1777-1782.

43. Ogata H., Su I., Miyake K., Nagai Y., Akashi S., Mecklenbrauker I., Rajewsky K., Kimoto M., Tarakhovsky A. The Toll-like receptor protein RP105 regulates lipopolysaccharide signaling in B cells // J. Exp. Med. 2000. V. 192. № 1. P.- 23-30.

44. Moran A. Structure-bioactivity relationships of bacterial endotoxins // J. Toxicol. Toxin Rev. 1995. V. 14. № 1. P. 47-83.

45. Leturcq D.J., Moriarty A.M., Talbott G., Winn R.K., Martin T.R., Ulevitch R.J. Antibodies against CD14 protect primates from endotoxin-induces shock // J. Clin. Invest. 1996. V. 98. №7. P. 1533-1538.

46. Leturcq D.J., Moriarty A.M., Talbott G., Winn R.K., Martin T.R., Ulevitch R.J. Therapeutic strategies to block LPS interactions with its receptor // Prog. Clin. Biol. Res. 1995. V. 392. P. 473-477.

47. Gallay P., Heumann D., Le Roy D., Barras C., Glauser M.-P. Mode of action of anti-lipopolysaccharide-binding protein antibodies for prevention of endotoxemic shock in mice //Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994. V. 91. № 17. P. 7922-7926.

48. Siegel J.P. Antiendotoxin antibodies //Ann. Intern. Med. 1995. V. 122. № 4. P. 315-316.

49. David S.A., Bechtel B., Annaiah C., Mathan V.I., Balaram P. Interaction of cationic amhpiphilic drugs with lipid A: implications for development of endotoxin antagonists // Biochim. Biophys. Acta 1994. V. 1212. № 2. P. 167-175.

50. Rustici A., Velucchi M., Sironi M., Ghezzi P., Quataert S., Green B., Porro M. Molecular mapping and detoxifivation of the lipid A binding site by synthetic peptides // Science 1993. V. 259. № 5093. P. 361-365.

51. Westphal 0., Liideritz O. Chemische erfoschung von lipopolysacchariden gram-negativer bacterien//Angew. Chem. 1954. B. 66. S. 407-417.

52. Gmeiner J., Simon M., Liideritz O. The linkage of phosphate group and 2-keto-3-deoxyoctonate to the lipid A component in a Salmonella minnesota lipopolysaccharide // Eur. J. Biochem. 1971. V. 21. № 3. P. 355-356.

53. Galloway S.W., Raetz C.R.H. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. № 11. P. 6394-6402.

54. Krasikova I.N., Bakholdina S.I., Solov'eva T.F. A rapid method for the preparation of lipid A from Yersinia pseudotuberculosis // Russian J. Bioorgan. Chem. 1999. V. 25. № 3. P. 257-261.

55. Hamidi A.E., Tirsoaga A., Novikov A., Hussein A., Caroff M. Microextraction of bacterial lipid A: easy and rapid method for mass spectrometric characterization // J. Lipid Res. 2005. V. 46. P. 1773-1778.

56. Gmeiner J., Liideritz O., Westphal O. Biochemical studies on lipopolysaccharides of Salmonella R mutants. 6. Investigation on the structure of the lipid A component // Eur. J.

57. Biochem. 1969. V. 7. № 3. P. 370-379.

58. Sledjeski D.D., Weiner R.M. Hyphomonas spp., Shewanella spp., and other marine bacteria lack heterogeneous (ladderlike) lipopolysaccharides // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. № 7. P. 2094-2096.

59. Westphal 0., Gmeiner J., Luderitz 0., Tanaka 0., Eichenberger E. Chemistry and biology of the lipid A component of enterobacterial lipopolysaccharides // Colloq. Int. C. N. R. S. 1969. V. 174. P. 69-79.

60. Strain S.M., Fesik S.W., Armitage I.M. Characterization of lipopolysaccharide from a hep-toseless mutant of Escherichia coli by carbon 13 nuclear magnetic resonance // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. № 5. P. 2906-2910.

61. Qureshi N., Takayama K., Heller D., Fenselau C. Position of ester groups in the lipid A backbone of lipopolysaccharides obtained from Salmonella typhimurium II J. Biol. Chem. 1983. V. 258. № 12. P. 12947-12951.

62. Chan S., Reinhoid V.N. Detailed structural characterization of lipid A/ Electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry // Anal. Biochem. 1994. V. 218. № 1. P. 6373.

63. Johnson R.S., Her G.-R., Grabarek J., Hawiger J., Reinhoid V.N. Structural characterisation of monophosphoryl lipid A homologs obtained from Salmonella mininesota Re595 lipopolysaccharide//J. Biol. Chem. 1990. V. 265. № 14. P. 8108-8116.

64. Wy C.A., Goto M., Young R.I., Myers T.F. Prophulactic treatment of endotoxic shock with monohosphoryl lipid A in newborn rats // Biol. Neon. 2000. V. 77. P. 191-195.

65. Trent M.S, Pabich W., Raetz C.R.H., Miller S.I. A PhoP/PhoQ-induced lipase (PagL) that catalyzes 3-O-deacylation of lipid A precursors in membranes of Salmonella lyphimurium II J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 12. P. 9083-9092.

66. Babinski K.J., Ribeiro A.A., Raetz C.R.H. The Escherichia coli gene encoding the UDP-2,3-diacylglucosamine pyrophosphatase of lipid A biosynthesis // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 29. P. 25937-25946.

67. Crowell D.N., Anderson M.S., Raetz C.R.H. Molecular cloning of the genes for lipid A disaccharide synthase and UDP-N-acetylglucosamine acyltransferase in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1986. V. 168. № 1. P. 152-159.

68. Radika K., Raetz C.R.H. Purification and properties of lipid A disaccharide synthase of Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. № 29. P. 14859-14867.

69. Garrett T.A., Kadrmas J.L., Raetz C.R.H. Identification of the gene encoding the Escherichia coli lipid A 4'-kinase. Facile phosphorylation of endotoxin analogs with recombinant lpxK// J. Biol. Chem. 1997. V. 272. № 35. P. 21855-21864.

70. Ray B.L., Raetz C.R.H. The biosynthesis of gram-negative endotoxin. A novel kinase in Escherichia coli membranes that incorporates the 4'-phosphate of lipid A //J. Biol. Chem. 1987. V. 262. №3. P. 1122-1128.

71. Brozek K.A., Hosaka K., Robertson A.D., Raetz C.R.H. Biosynthesis of lipopolysaccharide in Escherichia coli. Cytoplasmic enzymes that attach 3-deoxy-D-manno-octulosonic acidto lipid A // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. № 12. P. 6956-6966.

72. Belunis C.J., Raetz C.R.H. Biosynthesis of endotoxins. Purification and catalytic properties of 3- deoxy-D-manno-octulosonic acid transferase from Escherichia coli II J. Biol. Chem. 1992. V. 267. № 14. P. 9988-9997.

73. Gronow S., Brade H. Lipopolysaccharide biosynthesis: which steps do bacteria need to survive?Ill Endotox. Res. 2001. V. 7. № 1. P. 3-23.

74. Karow M., Georgopoulos C. Isolation and characterization of the Escherichia coli msbB gene, a multicopy suppressor of null mutations in the high-temperature requirement gene htrB // J. Bacteriol. 1992. V. 174. № 3. P. 702-710.

75. Brozek K.A., Raetz C.R.H. Biosynthesis of lipid A in Escherichia coli. Acyl carrier protein-dependent incorporation of laurate and myristate // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. № 26. P. 15410-15417.

76. Clementz T., Bednarski J.J., Raetz C.R.H. Function of the htrB high temperature requirement gene of Escherichia coli in the acylation of lipid A: HtrB catalyzed incorporation of laurate // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. № 20. P. 12095-12102.

77. Tharanathan R.N., Weckesser J., Mayer H. Structural studies on the D-arabinose-containing lipid A from Rhodospirillum tenue 2761 // Eur. J. Biochem. 1978. V. 84. № 2. P. 385-394.

78. Hoist O., Borowiak D., Weckesser J., Mayer H. Structural studies on the phosphate-free lipid A of Rhodomicrobium vannielii ATCC 17100 // Eur. J. Biochem. 1983. V. 137. № 1. P. 325-332.

79. Urbanik-Sypniewska T., Seydel U., Greek M., Weckesser J., Mayer H. Chemical studies on the lipopolysaccharide of Rhizobium meliloti 10406 and its lipid A region 11 Arch.

80. Microbiol. 1989. V. 152. № 4. 527-532.

81. Pokrywka M., Viazanko K., Medvick J., Knabe S., McCool S., Pasculle A.W., Dowling J.N. A Flavobacterium meningosepticum outbreak among intensive care patients // Am. J. Infect. Control 1993. V. 21. № 3. P. 139-145.

82. Moran A.P. Biological and serological characterization of Campylobacter jejuni lipopoly-saccharides with deviating core and lipid A structures // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1995. V. 11. №2. P. 121-130.

83. Choma A. Sowinski P. Characterization of Mesorhizobium huakuii lipid A containing both D-galacturonic acid and phosphate residues // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. № 7. P. 1310-1322.

84. Wilkinson S.G., Taylor D.P. Occurrence of 2,3-diamino-2,3-dideoxy-D-glucose in lipid A from lipopolysaccharide of Pseudomonas diminuta II J. Gen. Microbiol. 1978. V. 109. № 2. P. 367-370.

85. Carrion M., Bhat U.R., Reuhs B., Carlson R.W. Isolation and characterization of the lipopolysaccharides from Bradyrhizobium japonicum IIJ Bacteriol. 1990. V. 172. № 4. P. 1725-1731.

86. Roppel J., Mayer H., Weckesser J. Identification of a 2,3-diamino-2,3-dideoxyhexose in the lipid A component of lipopolysaccharides of Rhodopseudomonas viridis and Rhodop-seudomonaspalustris II Carbohydr. Res. 1975, V. 40. № 1. P. 31-40.

87. Ahamed N.M., Mayer H., Biebl H., Weckesser J. Lipopolysaccharide with 2,3-diamino-2,3-dideoxyglucose containing lipid A in Rhodopseudomonas sulfoviridis II FEMS Microbiol. Lett. 1982. V. 14. № 1. P. 27-30.

88. Mayer H., Bock E., Weckesser J. 2,3-Diamino-2,3-dideoxyglucose containing lipid A in the Nitrobacter strain X14 // FEMS Microbiol. Lett. 1983. V. 17. № 1-3. P. 93-96.

89. Kumada H., Haishima Y., Umemoto T., Tanamoto K. Structural study on the free lipid A isolated from lipopolysaccharide of Porphyromonas gingivalis II J. Bacteriol. 1995. V. 177. №8. P. 2098-2106.

90. Tanamoto K., Kato H., Haishima Y., Azumi S. Biological properties of lipid A isolatedfrom Flavobacterium meningosepticum // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2001. V. 8. № 3. P. 522-527.

91. Weintraub A., Zahringer U., Wollenweber H.-W., Seydel U., Rietschel E.T. Structural characterization of the lipid A component of Bacteroides fragilis strain NCTC 9343 lipopolysaccharide // Eur. J. Biochem. 1989. V. 183. № 2. P. 425-431.

92. Moran A.P., Lindner B., Walsh E.J. Structural characterization of the lipid A component of Helicobacter pylori rough- and smooth-form lipopolysaccharides // J. Bacteriol. 1997. V. 179. №20. P. 6453-6463.

93. Hashimoto M., Asai Y., Tamai R., Jinno T., Umatani K., Ogawa T. Chemical structure and immunobiological activity of lipid A from Prevotella intermedia ATCC 25611 lipopolysaccharide // FEBS Lett. 2003. V. 543. № 1-3. P. 98-102.

94. Silipo A., Lanzetta R., Garozzo D., Cantore P.L., Iacobellis N. S., Molinaro A., Parrilli M., Evidente A. Structural determination of lipid A of the lipopolysaccharide from Pseudomonas reactans II Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 2498-2505.

95. Lehmann V., Redmond J., Egan A., Minner I. The acceptor for polar head groups of the lipid A component of Salmonella lipopolysaccharides II Eur. J. Biochem. 1978. V. 86. № 2. P. 487-496.

96. Volk W.A., Galanos C., Lüderitz O. The occurrence of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose as a constituent in Salmonella lipopolysaccharide preparations // Eur. J. Biochem. 1970. V. 17. № 2. P. 223-229.

97. Soncini F.C., Groisman E.A. Two-component regulatory systems can interact to process multiple environmental signals // J. Bacteriol. 1996. V. 178. № 23. P. 6796-6801.

98. Gunn J.S., Miller S.I. PhoP-PhoQ activates transcription of pmrAB, encoding a two-component regulatory system involved in Salmonella typhimurium antimicrobial peptide resistance // J. Bacteriol. 1996. V. 178. № 23. P. 6857-6864.

99. Gunn J.S., Lim K.B., Krueger J., Kim K., Guo L., Hackett M., Miller S.I. PmrA-PmrB-regulated genes necessary for 4-aminoarabinose lipid A modification and polymyxin resisresistance // Mol. Microbiol. 1998. V. 27. № 6. P. 1171-1182.

100. Groisman E.A., Kayser J., Soncini F.C. Regulation of polymyxin resistance and adaptation to low-Mg2+ environments //J. Bacteriol. 1997. V. 179. № 22. P. 7040-7045.

101. Hase S., Rietschel E.T. The chemical structure of the lipid A component of lipopolysaccha-rides from Chromobacterium violaceum NCTC 9694 // Eur. J. Biochem. 1977. V. 75. № 1. P. 23-34.

102. Sidorczyk Z., Zahringer U., Rietschel E.T. Chemical structure of the lipid A component of the lipopolysaccharide from a Proteus mirabilis Re-mutant // Eur. J Biochem. 1983. V. 137. №1. p. 15-22.

103. Guo L., Lim K.B., Poduje C.M. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides // Cell 1998. V. 95. № 2. P. 189-198.

104. Suda Y., Ogawa T., Kashihara W., Oikawa M., Shimoyama T., Hayashi T., Tamura T., Kusumoto S. Chemical structure of lipid A from Helicobacter pylori strain 206-1 lipopolysaccharide // J. Biochem. 1997. V. 121. № 6. P. 1129-1133.

105. Tegtmeyer B., Weckesser J., Mayer H., Imhoff J. F. Chemical composition of the lipopoly-saccharides of Rhodobacter sulfidophilus, Rhodopseudomonas acidophila, and Rhodop-seudomonas blasticall Arch. Microbiol. 1985. V. 143. № 1. P. 32-36.

106. Rietschel E.T. Absolute configuration of 3-hydroxy fatty acids present in lipopolysaccha-rides from various bacterial groups // Eur. J. Biochem. 1976. V. 64. № 2. P. 423-428.

107. Nikado H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. V. 67. № 4. P. 593-656.

108. Bishop D.G., Hewett M.J., Knox K.W. Occurrence of 3-hydroxytridecanoic and 3-hydroxypentadecanoic acids in the lipopolysaccharides of Veillonella H Biochim. Biophys. Acta 1971. V. 231. №2. P. 274-276.

109. Wilkinson S.G., Caudwell P.F, Lipid composition and chemo taxonomy of Pseudomonas putrefactions (Alteromonas putrefactions) II J. Gen. Microbiol. 1980. V. 118. № 2. P. 329

110. Чернявская E.H., Васюренко З.П. Жирнокислотный состав липополисахаридов бактерий родов Klebsiella и Enterobacter И 1983. Т. С. 39-43.

111. Iida Т., Haishima Y., Tanaka A., Nishiyama K., Saito S., Tanamoto K. Chemical structure of lipid A isolated from Comamonas testosteroni lipopolysaccharide // Eur. J. Biochem. 1996. V. 237. №.5. P. 468-475.

112. Masoud H.,Weintraub S.T., Wang R., Cotter R., Holt S.C. Investigation of the structure of lipid A from Actinobacillus actinomycetemcomitans strain Y4 and human clinical isolate PO 1021-7 // Eur. J. Biochem. 1991. V. 200. № 3. P. 775-781.

113. Kawahara K., Moll Ii., Knirel Y.A., Seydel U., Zaehringer U. Structural analysis of two glycosphingolipids from the lipopolysaccharide-lacking bacterium Sphingomonas capsulata // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. № 6. P. 1837-1846.

114. Salimath P., Weckesser J., Strittmatter W., Mayer H. Structural studies on the non-toxic lipid A from Rhodopseudomonas spaeroides ATCC 17023 // Eur. J. Biochem. 1983. V. 136. №1. P. 195-200.

115. Rietschel E.T., Luderitz О., Volk W.A. Nature, type of linkage, and absolute configuration of (hydroxy) fatty acids in lip polysaccharides from Xenyhomonas sinensis and related strains//! Bacteriol. 1975. V. 122. №3. P. 1180-1188.

116. Wilkinson S.G., Galbraith L., Lightfoot G.A. Cell walls, lipids, and lipopolysaccharides of Pseudomonas species II Eur. J. Biochem. 1973. V. 33. № 1. P. 158-174.

117. Wilkinson S.G., Galbraith L. Studies of lipopolysaccharides from Pseudomonas aeruginosa II Eur. J. Biochem. 1975. V. 52. № 2. P. 331-343.

118. Bryn K., Rietschel E.T. L-2-hydroxytetradecanoic acid as a constituent of Salmonella lipopolysaccharides (lipid A) // Eur. J. Biochem. 1978. V. 86. № 2. P. 311-315.

119. Gibbons H.S., Lin S., Cotter R.J., Raetz C.R.H. Oxygen requirement for the biosynthesis of the S-2-hydroxymyristate moiety in Salmonella typhimurium lipid A // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 42. P. 32940-32949.

120. Guo L., Lim K.B., Gunn J.S., Bainbridge В., Darveau R.P., Hackett M., Miller S.I. Regula

121. Regulation of lipid A modifications by Salmonella (yphimurium virulence genes phoP-phoQ // Science 1997. V. 276. № 5310. P. 250-253.

122. Arata S., Hirayama T., Kasai N., Itoh T., Ohsawa A. Isolation of 9-hydroxy-(-tetradecalactone from lipid A of Pseudomonas diminuta and Pseudomonas vesicularis II FEMS Microbiol. Lett. 1989. V. 51. № 1. P. 219-222.

123. Choma A. Fatty acid composition of Mesorhizobium huakuii lipopolysaccharides. Identification of 27-oxooctacosanoic acid // FEMS Microbiol. Lett. 1999. V. 177. № 2. P. 257262.

124. Vadam V., Kannenberg E.L., Haynes J.G., Sherrier D.J., Datta A., Carlson R.W. A Rhizo-bium leguminisarum AcpXL mutant produces lipopolysaccharide lacking 27-hydroxyoctacosanoic acid // J. Bacterid. 2003. V. 185. № 6. P. 1841-1850.

125. Carlson R.W., Busch M., Mayer H. Distribution and phylogenetic significance of 27-hydroxyoctacosanoic acid in lipopolysaccharides from bacteria belonging to the a-2 subgroup ofProteobacteria// J. Syst. Bacteriol. 1991. V. 41. № 2. P. 213-217.

126. Kropinski A.M.B., Lewis V., Berry D. Effect of growth temperature on the lipids, outer membrane proteins, and lipopolysaccharides of Pseudomonas aeruginosa PAO I I J. Bacteriol. 1987. V. 169. № 5. P. 1960-1966.

127. Kumar G.S., Jagarmadham M.V., Ray M.K. Low-temperature-induced changes in composition and fluidity of lipopolysaccharides in the antarctic psychrotrophic bacterium Pseudomonas syringae II J. Bacteriol. 2002. V. 184. № 23. P. 6746-6749.

128. Carty S.M., Sreekuraar K.R., Raetz C.R.H. Effect of cold shock on lipid A biosynthesis in Escherichia coli. Induction at 12 °C of an acyltransferase specific for palmitoleyl-acyl carrier protein // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. № 14. P. 9677-9685.

129. Zhou Z., White K.A., Polissi A., Georgopoulos C., Raetz C.R.H. Function of Escherichia coli MsbA, an essential ABC family transporter, in lipid A and phospholipid biosynthesis // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. № 20. P. 12466-12475.

130. Caroff M., Aussei L., Zarrouk H., Perry M.B., Karibian D. Contribution of 252Cf-plasmadesorption mass spectrometry to structural analysis of lipids A: examples of non-conservatism in lipid A structure // J. Endotox. Res. 1999. V. 5. № 1. P. 86-89.

131. Bath U.R., Kontrohr T., Mayer H. Structure of Shigella sonnei lipid A // FEMS Microbiol. Lett. 1987. V. 40. № 2. P. 189-192.

132. Masoud II, Lindner B., Weckesser J., Mayer H. The structure of lipid A component of Rhodocyclus gelatinosus Dr2 // System. Appl. Microbiol. 1990. V. 13. P. 227-233.

133. Moran A.P., O'Malley D.T., Kosunen T.U., Helander I.M. Biochemical characterization of Campylobacter fetus lipopolysaccharide // Infect. Immun. 1994. V. 62. № 9. P. 3922-3929.

134. Goldman R.C., Doran C.C., Kadam S.K., Capobianco J.O. Lipid A precursor from Pseudomonas aeruginosa is completely acylated prior to addition of 3-deoxy-D-manno-octulosonate // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. № 11. P. 5217-5223.

135. Mohan S., Raetz C.R.H. Endotoxin biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa: enzymatic incorporation of laurate before 3-deoxy-D-manno-octulosonate // J. Bacteriol. 1994. V. 176. №22. P. 6944-6951.

136. Rietschel E.T., Wollenweber H.-W., Russa R., Brade IT, Zahringer U. Concepts of the chemical structure of lipid A // Rev. Infect. Dis. 1984. V. 6. № 4. P. 432-438.

137. Tsukioka D., Nishizawa T., Miyase T., Achiwa K., Suda T., Soma G.-I., Mizuno D. Structural characterization of lipid A obtained from Pantoea agglomerans lipopolysaccharide // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 149. № 2. P. 239-244.

138. Helander I.M., Hirvas L., Touminen J. Vaara M. Preferential synthesis of heptaacyl lipopolysaccharide by the ssc permeability mutant of Salmonella typhimurium I I Eur. J. Biochem. V. 204. №3. P. 1101-1106.

139. Roy A.M., Coleman J. Mutations in firA, encoding the second acyltransferase in lipopolysaccharide biosynthesis, affect multiple steps in lipopolysaccharide biosynthesis // J. Bacteriol. 1994. V. 176. № 6. P. 1639-1646.

140. Bishop R.E., Gibbons H.S., Guina T., Trent M.S., Miller S.I., Raetz C.R.H. Transfer of palmitate from phospholipids to lipid A in outer membranes of Gram-negative bacteria // EMBO J. 2000. V. 19. № 19. P. 5071-5080.

141. Brozek K.A., Bulawa C.E., Raetz C.R.H. Biosynthesis of lipid A precursors in Escherichia coli. A membrane- bound enzyme that transfers a palmitoyl residue from a glycerophos-pholipid to lipid X//J. Biol. Chem. 1987. V. 262. № 11. P. 5170-5179.

142. Красикова И.Н., Капустина H.B., Исаков В.В., Горшкова Н.М., Соловьева Т.Ф. Установление структуры липида А из морской грамотрицательной бактерии Pseudoalteromonas haloplanktis АТСС 14393т // Биоорган. Хим. 2004. Т. 30. №. 4. С. 409-416.

143. Caroff М., Deprun С., Richards J.С., Karibian D. Structural characterization of the lipid A of Bordetellapertussis 1414 endotoxin II J. Bacteriol. 1994. V. 176. № 16. P. 5156-5159.

144. Somerville J.E., Cassiano L., Bainbridge B. Cunningham M.D., Darveau R.P. A novel Escherichia coli lipid A mutant that produces an anti-inflammatory lipopolysaccharide I I J. Clin. Invest. 1996. V. 97. № 2. P. 359-365.

145. Basu S.S., White K.A., Que N.L., Raetz C.R.H. A deacylase in Rhizobium leguminosarum membranes that cleaves the 3-O-linked beta-hydroxymyristoyl moiety of lipid A precursors //J. Biol. Chem. 1999. V. 274. №16. P. 11150-11158.

146. Ernst R.K., Guina Т., Miller S.I. How intracellular bacteria survive: surface modifications that promote resistance to host innate immune responses // J Infect Dis. 1999. V. 179. № 2. P. 326-330.

147. Zarrouk H., Karibian D., Bodie S., Perry В., Richards J.C., Caroff M. Structural characterization of the lipids A of three Bordetella bronchiseptica strains: variability of fatty acid substitution//J. Bacteriol. 1997. V. 179. № 11. P. 3756-3760.

148. Kawahara K., Uchida K., Aida K. Isolation of an unusual lipid A type glycolipid from Pseudomonaspaucimobilis II Biochim. Biophys. Acta 1982. V. 712. № 3. P. 571-575.

149. Kawahara K., Seydel U., Matsuura M., Danbara H., Rietschel E.T., Zahringer U. Chemical structure of glycosphingolipids isolated from Sphingomonas paucimobilis II FEBS Lett. 1991. V. 292. № 1,2. P. 107-110.

150. Kawasaki S., Moriguchi R., Sekiya K., Nakai Т., Ono E., Kume K., Kawahara K. The cell envelope structure of the lipopolysaccharide-lacking gram-negative bacterium Sphingomo

151. Sphingomonaspaucimobilis II J. Bacteriol. 1994. V. 176. № 2. P. 284-290.

152. Schultz C.P., Wolf V., Lange R., Mertens E., Wecke J., Naumann D., Zahringer U. Evidence for a new type of outer membrane lipid in oral spirochete Treponema denticola // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. № 25. P. 15661-15666.

153. Scudo F.M., Sacchi L., Freudenberg M.A., Grigolo A., Galanos C. On the absence of lipolysaccharides in endocellular symbionts of cockroaches and its evolutionary implications // Endocytobiosis Cel. Res. 1996. V. 11. № 2. P. 119-127.

154. Cinco M., Banfi E., Balanzin D., Godeas C., Panfili E. Evidence for (lipo)oligosaccharides in Borrelia burgdorferi and their serological specificity // FEMS Microbiol. Irnmun. 1991. V. 76. № 1. P. 33-38.

155. Steeghs L., Den Hartog R., Den Boer A., Zomer B., Roholl P., Van der Ley P. Meningitis bacterium is viable without endotoxin //Nature 1998. V. 392. № 2. P. 449-450.

156. Steeghs L., de Cock H., Evers E., Zomer B., Tommassen J., van der Ley P. Outer membrane composition of a lipopolysaccharide-deficient Neisseria meningitidis mutant // EMBO J. 2001. V. 20. № 24. P. 6937-6945.

157. Alving C.R. Lipopolysaccharide, lipid A, and liposomes containing lipid A as immunologic adjuvants // Immunobiology 1993. V. 187. № 3-5. P. 430-446.

158. Glauser M.P., Zanetti G., Baumgartner J.-D., Cohen J. Septic shock: Pathogenesis // Lancet 1991. V. 338. № 8769. P. 732-736.

159. Yamamoto A., Ochiai M., Kataoka M., Toyoizumi H., Horiuchi Y. Development of a highly sensitive in vitro assay method for biological activity of endotoxin contamination in biological products // Biologicals 2002. V. 30. № 2. P. 85-92.

160. Tanamoto K. Dissociation of endotoxic activities in a chemically synthesized lipid A precursor after acetylation // Infect. Immun. 1995. V. 63. № 2. P. 690-692.

161. Golenbock D.T., Randolph Y., Hampton Q., Qureshi N., Takayama K., Raetz C.RH. Lipid A-like molecules that antagonize the effects of endotoxins on human monocytes // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. № 29. P. 19490-19496.

162. Tanamoto K., Azumi S. Salmonella-type heptaacylated lipid A is inactive and acts as an antagonist of LPS action on human line cells // J. Immunol. 2000. V. 164. № 6. P. 31493156.

163. Ribi E. Beneficial modification of the endotoxin molecule // J. Biol. Response 1984. V. 3. № 1. P. 1-9.

164. Qureshi N., Takayama R., Ribi E. Purification and structural determination of nontoxic lipid A obtained from the lipopolysaccharide of Salmonella typhimurium II J. Biol. Chem.1982. V. 257. № 19. P. 11808-11815.

165. Nair B.C., Mayberry W.R., Dziak R., Chen P.B., Levine M.J., Hausmann E. Biological effects of a purified lipopolysaccharide from Bacteroides gingivalis II J. Periodont. Res.1983. V. 18. № l.P. 40^19.

166. Muotiala A., Helander I.M., Pyhala L., Kosunen T.U., Moran A.P. Low biological activity of Helicobacter pylori lipopolysaccharide // Infect. Immun. 1992. V. 60. № 4. P. 1714— 1716.

167. Flad H.-D., Loppnow H., Rietschel E.T., Ulmer A.J. Agonists and antagonists for lipopoly-saccharide-induced cytokines // Immunobiol. 1993. V. 187. № 3-5. P. 303-316.

168. Strittmatter W., Weckesser J., Salimath P.V., Galanos C. Nontoxic lipopolysaccharide from Rhodopseudomonas spaeroides ATCC 17023 // J. Bacteriol. 1983. V. 155. № 1. P. 153

169. Fujiwara T., Ogawa T., Sobue S., Hamada S. Chemical, immunobiological and antigenic characterizations of lipopolysaccharides from Bacteroides gingivcdis strains // J. Gen. Microbiol. 1990. V. 136. № 2. P. 319-326.

170. Vandenplas M.L., Carlson R.W., Jeyaretnam B.S., McNeill B., Barton M.H., Norton N., Murray T.F., Moore J.N. Rhizobium Sin-1 lipopolysaccharide (LPS) prevents enteric LPS-induced cytokine production // J. Biol. Chern 2002. V. 277. № 44. P. 41811-41816.

171. Matsuura M., Kiso M., Hasegawa A. Activity of monosaccharide lipid A analogues in human monocytic cells as agonists or antagonists of bacterial lipopolysaccharide // Infect. Immun. 1999. V. 67. № 12. P. 6286-6292.

172. Munford R.S. How do animal phagocytes process bacterial lipopolysaccharides? // APMIS 1991. V. 99. №6. P. 487-491.

173. Asai N., Arata S., Hashimo J., Akiyama Y., Tanaka C., Egawa K., Tanaka S. Pseudomonas diminuta LPS with a new endotoxic lipid A stucture // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. V. 142. №3. P. 972-978.

174. Proctor A.R., Will J.A., Burhop K.E., Raetz C.R.H. Protection of mice against lethal en-dotoxemia by a lipid A precursor // Infect. Immun. 1986. V. 52. № 3. P. 905-907.

175. Loppnow H., Brade H., Durrbaum I., Dinarello C.A., Kusumoto S., Rietschel E.T., Flad H.-D. Interleukin 1 induction-capacity of defined lipopolysaccharide partial structures // J. Immunol. 1989. V. 142. № 9. P. 3229-3238.

176. Takayama K., Qureshi N., Ribi E., Cantrell J.L. Separation and characterization of toxic and nontoxic forms of lipid A // Rev. Infect. Dis. 1984. V. 6. № 4. P. 439-443.

177. Baldridge J.R., Crane R.T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines// Methods 1999. V. 19. P. 103-107.

178. Wy C.A., Goto M., Young R.I., Myers T.F. Prophulactic treatment of endotoxic shock with monohosphoryl lipid A in newborn rats // Biol. Neon. 2000. V. 77. № 2. P. 191-195.

179. Christ W.J., Asano O., Robidoux A.L.C., Perez M., Wang Y., Dubuc G.R., Gavin W.E., Hawkins L.D., McGuinness P.D., Mullarkey M.A., Lewis M.D., Kishi Y., Kawata T, Bristol J.R., Rose J.R., Rossignol D.P., Kobayashi S., Hishinuma I., Kimura A., Asakawa

180. N., Katayama K., Yamatsu I. E5531, a pure endotoxin antagonist of high potency // Science 1995. V. 268. P. 80-83.

181. Sato K., Yung C.Y., Fukushima A., Saiki I., Takahashi T.A., Fujihara M., Tono-oka S., Azuma I. A novel synthetic lipid a analog with low endotoxicity, DT-5461, prevents lethal endotoxemia// Infect. Immun. 1995. V. 63. № 8. P. 2859-2866.

182. Moule A.L., Wilkinson S.G. Composition of lipopolysaccharides from Alteromonas putri-faciens (Shewanellaputrefaciens) II J. Gen. Microbiol. 1989. V. 135. № 11. P. 163-173.

183. Svetashev V., Vysotskii M.V., Ivanova E.P., Mikhailov V.V. Cellular fatty acids of Alteromonas species // System Appl. Microbiol. 1995. V. 18. № 1. P. 37-43.

184. Ivanova E.P., Onyshchenko O.M., Christen R., Lysenko A.M., ZhukovaN.V., Shevchenko L.S., Kiprianova E.A. Marinomonas pontica sp. nov., isolated from the Black Sea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 275-279.

185. Prabagaran S.R., Suresh K., Manorama R., Delille D., Shivaji S. Marinomonas ushuaiensis sp. nov., isolated from coastal sea water in Ushuaia, Argentina, sub-Antarctica // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 309-313.

186. Yoon J.-H., Kang S.-J., Oh T.-K. Marinomonas dokdonensis sp. nov., isolated from sea water//Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. № 11. P. 2303-2307.

187. Macian M.C., Arahal D.R., Garay E., Pujalte M.J. Marinomonas aquamarina sp. nov., isolated from oysters and seawater // Syst. Appl. Microbiol. 2005. V. 28. № 2. P. 145-150.

188. Gauthier M.J., Breittmayer V.A. The Prokaryotes: the genera Alteromonas and Marinomonas // (Balows A., Truper H.G., Dworkin M., Harber H., Schleifer K.-H. eds.) New York: Springer-Verlag, 1992. P. 3046-3070.

189. Ivanova E.P., Zhukova N.V., Svetashev V.l., Gorshkova N.M., Kurilenko V.V., Frolova

190. G.M., Mikhailov V.V. Evaluation of phospholipid and fatty acid compositions as chemo-taxonomic markers of Alteromonas-Wke Proteobacteria // Curr. Microbiol. 2000. V. 41. № 5. P. 341-345.

191. Romanenko L.A., Uchino M., Mikhailov V.V., Zhukova N.V., Uchimura T. Marinomonas primoryensis sp. nov., a novel psychrophile isolated from coastal sea-ice in the Sea of Japan// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. № 7. V. 53. P. 829-832.

192. Капустина H.B., Красикова И.Н., Исаков B.B., Горшкова Н.М., Соловьева Т.Ф. Структура липида А из липополисахарида морской у-протеобактерии Marinomonas vaga АТСС 27119Т // Биохимия 2004. Т. 69. № 4. С. 504-510.

193. Baumann L., Baumann P., Mandell M., Allen R.D. Taxonomy of aerobic marine eubacteria // J. Bacteriol. 1972. V. 110. № 1. P. 402-429.

194. Van Landschoot A., De Ley J. Intra- and intergeneric similarities of the rRNA cistrons of Alteromonas, Marinomonas (General nov.) and some other Gram-negative bacteria // J. Gen. Microbiol. 1983. V. 129. № 10. P. 3057-3974.

195. Solano F., Sanchez-Amat A. Studies on the phylogenetic relationships of melanogenic marine bacteria: proposal of Marinomonas mediterranea sp. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. V. 49. P. 1241-1246.

196. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides: extraction with phenol-water and further applications of the procedure // Meth. Carbohydr. Chem. 1965. V. 5. P. 83-91.

197. Jennings H.5 Smith I.C. Polysaccharide structures using carbon-13 nuclear magnetic resonance //Methods Enzymol. 1978. V. 50. № 1. P. 39-50.

198. Ribeiro A.A., Zhou Z., Raetz C.R.H. Multi-dimensional NMR structural analyses of purified lipid X and lipid A (endotoxin) // Magn. Reson. Chem. 1999. V. 37. № 9. P. 620-630.

199. Silipo A., Lanzetta R., Amoresano A., Parrilli M., Molinaro A. Ammonium hydroxide hydrolysis: a valuable support in the MALDI-TOF mass spectrometry analysis of lipid A fatty acid distribution // J. Lipid Res. 2002. V. 43. № 14. P. 2188-2195.

200. Baltzer L.H., Mattsby-Baltzer I. Heterogeneity of lipid A: structural determination by I3C31and P NMR of lipid A fractions from lipopolysaccharide of Escherichia coli Olll // Biochemistry 1986. V. 25. № 12. P. 3570-3573.

201. Forsberg C.W., Casterton J.W., MacLeod R.A. Separation and localization of ceil wall layers of a gram-negative bacterium // J. Bacteriol. 1970. V. 104. № 3. P. 1338-1353.

202. Bernardet J.-F., Nakagawa Y., Holmes B. Proposed minimal standards for the describing new taxa of the family Flavobacteriaceae and emended description of the family // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. №. 9. P. 1049-1070.

203. Woese C.R., Yang D., Mandelco L., Stetter K.O. The flexibacter-flavobacter connection // System. Appl. Microbiol. 1990. V. 13. № 22. P. 161-165.

204. Campbell L.L., Williams O.B. A study of chitin-decomposing microorganisms of marine origin // J. Gen. Microbiol. 1951. V. 5. № 5. P. 894-905.

205. Mudarris M., Austin В., Segers P., Vancanneyt M., Hoste В., Bernardet J.F. Flavobacte-rium scophthalmum sp. nov., a pathogen of turbot (Scophthalmus maximus L.) // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. V. 44. № 5. p. 447-453.

206. Красикова И.Н., Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф. Быстрый способ получения липида А из бактерии Yersinia pseudotuberculosis // Биоорган. Химия. 1999. Т. 25. № 4. С. 293-298.

207. Rooney S.A., Goldfme Н., Sweeley С.С. The identification of trans-2-tetradecanoic acid in hydrolisates of lipid A from Escherichia coli // Biochim. Biophys. Acta 1972. V. 270. P. 289-295.

208. Wollenweber H.-W., Rietschel E.T. Analysis of lipopolysaccharide (lipid A) fatty acids // J. Microbiol. Meth. 1990. V. 11. №33. P. 195-211.

209. Nishijima M., Raetz C.R.H. Membrane lipid biogenesis in Escherichia coli: identification of genetic loci for PG-synthetase and construction of mutants lacking PG // J. Biol. Chem. 1979. V. 254. №. 16. P. 7837-7844.

210. Nishijima M., Bulawa C.E., Raetz C.R.H. Two interacting mutations causing temperature-sensitive phosphatidylglycerol synthesis in Escherichia coli membranes // J. Bacteriol. 1981. V. 145. № l.P. 113-121.

211. Nishijima M., Raetz C.R.H. Characterization of two membrane-associated glycolipids from an Escherichia coli mutant deficient in phosphatidylglycerol // J. Biol. Chem. 1981. V. 256. №20. P. 10690-10696.

212. Raetz C.R.H., Dowhan W. Biosynthesis and function of phospholipids in Escherichia coli //J. Biol. Chem. 1990. V. 265. № 3. P. 1235-1238.

213. Huijbregts R.P.H., Kroon A.I.P.M., Kruijff B. Topology and transport of membrane lipidsin bacteria // Biochim. Biophys. Acta 2000. V. 1469. P. 43-61.

214. Matsui Y., Suzuki S., Suzuki Т., Takama K. Phospholipid and fatty acid compositions of Alteromonas putrefaciens and A. haloplanktis // Lett. Appl. Microbiol. 1991. V. 12. № 2. P. 51-53.

215. Kampher P., Dreyer U., Neef A., Dott W., Busse H.-J. Chryseobacterium defluvii sp. nov., isolated from wastewater // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. № 2. P. 93-97.

216. Orskov I., Orskov F., Jann В., Jann K. Serology, chemistry, and genetics of О and К antigens of Escherichia coli II Bacterial Rev. 1977. V. 41. № 3. P. 667-710.

217. Troy F.A. The chemistry and biosynthesis of selected bacterial capsular polymers // Annu. Rev. Microbiol. 1979. V. 33. № 3. P. 519-560.

218. Altman E., Brisson J-R., Gagne S. M., Perry M. B. Structure of the capsular polysaccharide of Actinobacilluspleuropneumoniae serotype 5b // Eur. J. Biochem. 1992. V, 204. № 2. P. 225-230.

219. Gygi, D., Rahman, M.M., Lai, H.-C., Carson, R., Guard-Petter, J., Hughes C. A cell-surface polysaccharide that facilitates rapid population migration by differentiated swarm cells of Proteus mirabilis // Mol. Microbiol. 1995.17. № 6. P. 1167-1175.

220. Aschauer IT, Grab A., Hildebrandt J., Schuetze E., Stuetz P. Highly purified lipid X is devoid of immunostimulatory activity // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. № 16. P. 9159-9164.

221. Golenbock D.T., Will J.A., Raetz C.R.H. Proctor R.A. Lipid X ameliorates pulmonary hypertension and protects sheep from death due to endotoxin // Infect. Immun. 1987. V. 55. № 10. P.2471-2476.

222. Danner R.L., Joiner K.A., Parillo J.E. Inhibition of endotoxin-induced priming of human neutrophils by lipid X and 3-Aza-lipid X // J. Clin. Invest. 1987. V. 80. № 3. P. 605-612.

223. Schwartz B.S., Monroe M.C., Bradshaw J.D. Endotoxin-induced production of plasminogen activator inhibitor by human monocytes is autonomous and can be inhibited by lipid X // Blood 1989. V. 73. № 8. P. 2188-2195.

224. Sibley C.H., Terry A., Raetz C.R.H. Induction of kappa light chain synthesis in 70Z/3 В lymphoma cells by chemically defined lipid A precursors // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. № 11. P.5098-5103.

225. Зубков B.A., Назаренко E.JI., Иванова Е.П., Горшкова Н.М., Горшкова Р.П. // Биоорган. химия 1999. Т. 25. № 3. С. 290-292.