Структура и свойства микрорасслаивающихся водных растворов неэлектролитов и состояние пептидов и белков в этих растворах тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.14 ВАК РФ

2

I

6

и им

МА П

Санкт-Петербургский государственный университет

Жуковский Михаил Андреевич

СТРУКТУРА И СВОЙСТВА МИКРОРАССЛАИВАЮЩИХСЯ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ НЕЭЛЕКТРОЛИТОВ И СОСТОЯНИЕ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ В ЭТИХ РАСТВОРАХ.

Специальность 01.04.14 - теплофизика и молекулярная физика.

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук.

1997

Работа выполнена в НИИ Физики Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель:

Доктор физико-математических наук, профессор

А. А. ТРУСОВ

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук

А. Л. ТИМКОВСКИЙ

Кандидат биологических наук

О. П. РЕЗУНКОВА

Ведущая организация:

ГосНИИ особо чистых биопрепаратов,

г. Санкт-Петербург

Г

Защита диссертации состоится " Ь?.." ..[A/f^tk^l^....... 1997 г.

в IM... час. на заседании диссертационного совета Д.063.57.32 по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора физико-математических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская набережная, 7/9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета. ^ /\

Автореферат разослан "

. mir.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор физ.-мат. наук, профессор

В. А. СОЛОВЬЁВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Водные растворы неэлектролитов представляют собой особый класс систем, обладающих весьма специфическими свойствами, отличающими их от других растворов. Многие характерные свойства водных растворов неэлектролитов в значительной степени обусловлены особенностями водной сетки водородных связей. В последние десятилетия при исследовании водных растворов неэлектролитов было обнаружено и исследовано спектроскопическими, термодинамическими, рентгеновскими и другими методами явление микрорасслаивания ряда растворов в области средних концентраций. Микрорасслаивающиеся растворы, оставаясь макроскопически гомогенными, на микроскопическом уровне обнаруживают ярко выраженную гетерогенность и состоят из микрообдастей, содержащих только молекулы воды или только молекулы неэлектролита. Явление микрорасслаиваггая заслуживает весьма пристального внимания по следующим причинам. Во-первых, способность образовывать микрорасслаивающиеся растворы можно отнести к числу необычных свойств вода, отличающих воду от других жидкостей, и, следовательно, исследование явления микрорасслаивания водных растворов неэлектролитов необходимо для понимания механизмов молекулярных процессов в широком классе водных систем. Во-вторых, явление микрорасслаивания водных растворов представляет интерес в некоторых разделах молекулярной биофизики. В частности, водные растворы неэлектролитов широко используются в качестве растворителей биологически активных соединений, и свойства михрорасслаивающихся растворов, несомненно, должны проявляться в характере микроокружения молекул растворённых веществ, в их сольватации, способно ста к агрегации, а, следовательно, и в биологических свойствах молекул. Наконец, микрообласти воды представляют собой уникальный пример особого состояния воды, находящейся в замкнутом ограниченном окружении, приобретающей в последние годы всё больший интерес в молекулярной физике, биофизике и энзимологии.

Цель работы.

Цель предпринятого в настоящей работе исследования предусматривала изучение особенностей водной сетки водородных связей в чистой воде и в микрорасслаивагощихся водных растворах неэлектролитов, определение структуры и свойств некоторых микрорасслаивагощихся растворов, а также установление состояния пептидов и белков в этих растворах.

Научная новизна работы.

Автором работы предложен и использован новый метод анализа температурной деформации спектральных контуров полос поглощения воды. Применение этого метода к анализу температурной деформации обертонной полосы поглощения молекул £ЮО позволило автору получить новые убедительные аргументы в пользу континуальной концепции структуры воды.

Впервые методом инфракрасной спектроскопии исследованы структура и свойства воды в микрорасслаивающемся растворе вода-диоксан во всём интервале концентраций с использованием метода инфракрасной спектроскопии. Обнаружено особое состояние воды в водных микрообластях, характеризующееся повышенной прочностью водородных связей. Впервые исследована последовательность молекулярных процессов в микрорасслаивающемся растворе при изменении состава раствора. Показано принципиальное различие свойств двух микрорасслаивающихся систем, - вода-диоксан и вода-диметилсульфоксид (ДМСО).

Впервые исследовано состояние молекул аминокислоты триптофана в микрорасслаивающемся растворе вода-ДМСО с использованием метода флуоресценции. Предложен и использован новый метод обработки спектров флуоресценции, основанный на представлениях о вынужденной подвижности молекул растворителя вблизи возбуждённых молекул триптофана в наносекундном диапазоне. Применение этого метода позволило определить характер микроокружения молекул триптофана и дать количественную оценку времени вынужденной релаксации молекул воды.

Впервые методом флуоресценции исследовано состояние в микрорасслаивающемся растворе вода-ДМСО двух белков, трипсиногена и лизоцима. Сделаны выводы о характере изменений конформации белков в растворе.

Впервые исследовано состояние синтетического пептида Фёльша и амилоидного пептида Ар(1-40) в микрорасслаивающемся растворе гексафторпропанола. Также впервые обнаружено двойное излучение включённого в молекулу полипептида в растворе триптофана, обязанное осцилляторам 'Ьа и 'Ц,.

Научная и практическая ценность работы.

Предложенный автором новый метод анализа температурных деформаций спектральных контуров может быть использован при исследованиях широкого класса систем с водородными связями. Результаты исследований состояния пептидов и белков в микрорасслаивающихся растворах могут быть использованы в биотехнологии и в мицеллярной энзимолоши. Результаты исследований амилоидного пептида АР(1-40) могут найти применение

в медицине для понимания происхождения и лечения болезни Альцгеймера.

Апробация работы.

Основные результаты работы были доложены и обсуждены на следующих научных совещаниях: на X Менделеевской дискуссии "Периодический закон и свойства растворов", Санкт-Петербург, 1993; на 1 Международной конференции "Проблемы ноосферы и устойчивого развития", Санкт-Петербург, 1996; на научном семинаре Департамента биофизики Стокгольмского университета, 1995.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ в научных журналах и сборниках.

Объем и структура.

Диссертационная работа изложена на 102 страницах машинописного текста, включает 32 рисунка и список цитируемой литературы, содержащий 111 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I.

В данной главе рассмотрены и проанализированы литературные данные, охватывающие, в основном две проблемы. В первой части главы прослежено развитие представлений о микрогетерогенности растворов неэлектролитов. Первая информация о микрорасслаивании была получена при рентгеновском исследовании растворов ацегон-вода и фенол-вода, и по результатам исследований, в которых отчётливо наблюдались признаки аддитивного наложения компонентов, высказано предположение о наличии в растворе небольших областей со структурами, близкими к структурам чистых компонентов. В дальнейшем был значительно расширен класс изученных систем, и к исследованиям были привлечены спектроскопические, термодинамические и диэлектрические методы. Исследования позволили оценить размеры микрообластей воды, определить интервал концентраций неэлектролита, соответствующий микрорасслаиванию и сделать некоторые выводы об особом состоянии воды в водных микрообластях. В то же время, многие существенные черты процесса микрорасслаивания остаются до настоящего времени неизученными.

Во второй части главы проанализированы литературные данные о состоянии белков в микрорасслаивающихся водных растворах. В литературе описаны случаи, которые можно разделить на три класса:

1) Добавка неэлектролита приводит к существенным изменениям структуры белка, сопровождающимся утратой функциональной активности. 2) Добавка неэлектролита приводит к малосущественным изменениям структуры и активности белка. 3) Во влиянии примеси неэлектролита на белок каким-то образом проявляется процесс микрорасслаивания. Наличие микрорасслаивания растворителя во многих случаях весьма отчётливо проявляется в свойствах растворённых белков, - в их активности, характере сольватации, в спектроскопических свойствах. В ряде случаев обнаруживаются отчётливые указания, на преимущественное взаимодействие молекул белков с водным компонентом системы. Однако, авторы этих работ, как правило, не связывают наблюдаемые ими эффекты с явлением микрорасслаивания. Сколько-нибудь систематические и целенаправленные исследования состояния белков в микрорасслаивающихся растворителях к настоящему времени отсутствуют.

Глава 2.

Во второй главе диссертации приводится описание методики эксперимента. В качестве объектов исследования использовались диметилсульфоксид и диоксан фирмы Merck, аминокислота триптофан фирмы Reanal, белки трипсююген и лизоцим фирмы Sigma, а также пептид 31-р, синтезированный в Гёгеборгском университете и амилоидный пептид Aß(l-40), предоставленный Каролинским институтом (Стокгольм). Спектроскопические исследования проводились на следующих спектральных приборах: спектры поглощения в инфракрасной области регистрировались на спектрофотометрах Beckman Acta М-7 и Perkm Elmer 621. Спектры флуоресценции триптофана и белков исследовались на спектрофлуориметре Hitachi-850. Спектры флуоресценции пептидов измерялись в интервале длин волн между 300 нм и 450 нм на спектрофотометре Perkin Elmer LS-50 с использованием компьютера IBM 286. Спектры кругового дихроизма пептидов измерялись на спектрополяриметре Jasco J-720 с использованием компьютера IBM-486. Центрифугирование с использованием фильтров Centricon -100 проводилось на ультрацентрифуге Sorvall RC2-B с ротором SS-34 при ускорении 1000 g.

Глава 3.

Данная глава посвящена некоторым нерешённым вопросам структуры чистой воды. Существующие в литературе различные точки зрения на характер молекулярных процессов в водных растворах полностью определяются различием концепций структуры чистой воды, которых придерживаются авторы работ. Это относится и к

процессам микрорасслаивания, для правильной интерпретации которых необходимо решить принципиальные вопросы, касающиеся структуры чистой воды и проявлений этой структуры в инфракрасных спектрах поглощения. В первую очередь это касается обертонных и составных полос поглощения воды, которые и послужили в данной работе основным инструментом для исследования процессов микрорасслаивания. В данной работе доказывается, что высокочастотные компоненты обертонных полос поглощения воды обязаны не разорванным водородным связям, а, в согласии с континуальной концепцией структуры воды, относятся к единому непрерывному распределению водородных связей по энергиям. Для доказательства этого положения была исследована и проанализирована температурная деформация полосы поглощения первого обертона 2v(OH) вблизи 7000 см-1, обязанная молекулам НИО в растворе, содержащем 50 мл ШО в 1л БгО. Спектры поглощения регистрировались в интервале 10 - 90° С с температурным шагом Ю°С. Для доказательства континуальной природы полосы были использованы два способа, один из которых уже неоднократно применялся ранее другими авторами, а второй предложен и использован в данной работе впервые. Оба способа основываются на принятой в континуальной концепции записи формы контура

1(у) = г 1 (Т) Р(у) ехр [-Ь(у-уц)/кТ], (1)

где Z(T) - статистический интеграл, Р(у)=\У[Е(у)]Г(у), Г(у) - фактор интенсивности, \У(Е) - энергетическая плотность состояний, уц частота колебаний свободных ОН-групп, и Ь - коэффициент в эмпирической корреляции между энергией водородной связи и частотой колебаний, равный Ь =0,06-0,07 кДж/мояь сиг1. Первый способ состоит в вычислении и построении графика функции температурной деформации контура

9М = [(кТ,)-1 - (№)-']-> 1п [1:00/1, (у)], (2)

где 11(у) и 1г(у) - экспериментальные контуры спектральной полосы при температурах Т1 и Тг. Из формул (1) и (2) следует, что для любой пары температур график этой функции должен представлять собой прямую линию, наклон которой для полосы первого обертона должен быть равным величине Ь<=Ь/2=0,030-0,035 кДж/моль см-'.

Как показано в работе, графики функций температурной деформации для любых пар температур оказались прямолинейными, и среднее значение наклона прямых составляет величину 0,034 кДж/моль см-1, в хорошем согласии с предсказанным значением. При этом прямолинейные участки графика функции <р(у) охватывают весь

б

контур полосы, не обнаруживая никаких особенностей при переходе к высокочастотной компоненте. Эти результаты свидетельствуют о том, что вся обертонная полоса, включая и её высокочастотную компоненту, принадлежит к единому непрерывному распределению по энергиям водородных связей.

Второй способ доказательства континуальной природы контура заключается в следующем. На контуре полосы в её низкочастотной части выбирается некоторая фиксированная частота уо, и далее на том же контуре в области больших частот, включая и высокочастотную компоненту, выбирается ряд частот у;, причём V, возрастает с увеличением номера Между каждой парой частот V, и уо имеется разность частот Д\ч=у;-уо и соответствующая разность энергий водородной связи ДЕ=Ь1Дм.

Из формулы (3) с учётом корреляции между энергией Е и сдвигом частоты Е = Ь(у - у„) следует

1п(1о/1.) = 1п(Ро/ РО + ДЕДТ, (3)

где 10 и - эксганкции, измеренные на частотах у0 и у{ на одном и том же контуре при фиксированной температуре Т, ДЕ1 - разность энергий водородных связей для двух ОН-осцилляторов, поглощающих на указанных частотах. Из формулы (3) следует, что для данной пары частот у0 и VI график функции

1п(10/И) = Г(1ЛсТ) (4)

должен представлять собой прямую линию с наклоном, равным ДВ. Очевидно, что при увеличении Д^ = VI - у0 величина наклона графика 1п(1(/10=Г(1/кТ) должна возрастать. Выполненные в работе исследования показали, что эта закономерность выполняется. Определив по наклонам прямых набор шести величин ДЕ1, мы отложили их на графике в зависимости от соответствующих разностей частот Ду,. График ДЕ1 = С (Ду$ представляет собой проходящую через начало координат прямую линию, наклон которой равен 0,032 кДж/моль см-1, т.е. хорошо согласуется с ожидаемой величиной коэффициента корреляции Ь].

По нашему мнению, можно считать доказанным, что высокочастотные компоненты в спектрах поглощения в о.бертонной области не относятся к свободным ОН-группам, а принадлежат единому непрерывному распределению по энергиям водородной связи. Этот вывод даёт теоретическую основу для интерпретации спектральных эффектов в микрорасслаивающихся растворах.

Глава 4.

Как отмечалось выше в обзоре литературы (глава 1), в некоторых водно-органических смесях в области средних концентраций наблюдается явление микрорасслаивания. В последние годы обнаружено, что молекулы белков, растворённых в микрорасслаивающихся жидкостях, в некоторых случаях размещаются внутри водных микрообластей и, следовательно, находятся в чисто водном окружении. Предварительные исследования показали, что отмеченное выше явление не является универсальным. В ряде случаев во всём интервале концентраций молекулы белков не находятся только в водном окружении, а вступают во взаимодействие также и с неводным компонентом раствора. Отсюда можно заключить, что процессы микрорасслаивания не являются однотипными, но они характеризуются какими-то различиями в разных по составу микрорасслаивающихся жидкостях. Для выяснения этих различий мы предприняли сравнительное исследование двух систем, различающихся состоянием белков в этих системах: ДМСО-вода и диоксан-вода. Исследования проводились на инфракрасной полосе поглощения воды с максимумом при 5180 см-1, обязанной валентно-деформационному колебанию молекул воды. Общий характер спектральных изменений при изменении состава раствора оказался качественно сходным для обеих исследованных систем. При малых концентрациях диоксана X = 0,1 полоса поглощения, присущая объёмной воде, смещена в низкочастотную сторону по сравнению с полосой в чистой воде вследствие стабилизации воды неполярными радикалами молекул диоксана. При концентрациях диоксана между Х=0,3 и Х=0,8, соответствующих микрорасслаиванию раствора, в спектрах поглощения наблюдается относительно узкая полоса поглощения микрообластей воды. Эта полоса, так же как и в системе ДМСО-вода, состоит из двух перекрывающихся компонентов: узкой высокочастотной полосы поглощения молекул воды, находящихся на поверхности водных микрообластей и взаимодействующих своими протонами с молекулами неводнош компонента раствора, и более широкой и низкочастотной полосы, обязанной поглощению внутренней воды микрообластей, молекулы которой взаимодействуют только между собой. С уменьшением общего содержания воды в растворе размеры водных микрообластей уменьшаются, что приводит к уменьшению вклада в суммарную полосу низкочастотного компонента внутренней воды.

В рамках нашего исследования особый интерес представляет спектральное положение полос поглощения внутренней и поверхностной воды в обеих исследованных системах. Полученные нами полосы поглощения внутренней и поверхностной воды в водных

микрообластях позволяют сформулировать следующие закономерности:

I. В каждой из исследованных систем полоса поглощения внутренней воды смещена в низкочастотную сторону по отношению к полосе поверхностной воды. Следовательно, молекулы внутренней воды участвуют в более прочных водородных связях, чем молекулы поверхностной воды, независимо от химической природы окружающего неэлектролита. 2. Полосы поглощения поверхностной воды в разных системах характеризуются противоположными знаками смещения по отношению к полосе чистой воды. Положения этих полос в спектре согласуются с тем известным фактом, что водородные связи вода-ДМСО прочнее, а связи вода-диоксан - слабее, чем связи между молекулами объёмной воды. З.В обеих исследованных системах полосы поглощения внутренней воды смещены в низкочастотную сторону по отношению к полосе поглощения обычной воды. Этот последний результат свидетельствует о том, что внутренняя полоса в микрообласгях воды в обеих системах находится в особом "жёстком" состоянии, близком к переохлаждённой воде и характеризующемся повышенной прочностью водородных связей.

Большой интерес для понимания механизма микрорасслаивания представляет установление последовательности различных стадий этого процесса при постепенном изменении состава раствора. Анализ концентрационных изменений спектров позволил прийти к следующим выводам, которые можно рассматривать как фазовую диаграмму микрорасслаивающегося раствора:

1. 0<Х<0,3. В этом интервале концентраций происходят сложные процессы, не сопровождающиеся микрорасслаиванием, - стабилизация объёмной воды гидрофобными радикалами молекул неэлектролитов и образование межкомпонентных водородных связей вода-неэлектролит.

2. При концентрации Х=0,3 относительно небольшие по размеру ассоциаты молекул неэлектролита собираются в более или менее крупные группировки, внутри которых находятся микрообласги воды. Величина Х=0,3 является нижней границей процесса микрорасслаивания. 3. 0,3<Х<0,5. В этом интервале концентраций сосуществуют объёмная вода и водные микрообласти, окружённые неэлектролитом. С увеличением концентрации неэлектролита происходит постепенное увеличение числа микрообластей воды за счёт объёмной воды. Данный интервал концентраций можно назвать областью неполного михрорасслаивання. 4. При концентрации неэлектролита Х=0,5 в растворе исчезает объёмная вода, т.е. завершается процесс микрорасслаивания. 5.0,5 < Х<0,7. Этот интервал концентраций является областью полного микрорасслаивания. Вся вода, присутствующая в растворе, находится в форме водной микрофазы. При увеличении концентрации неэлектролита происходит

уменьшение размеров водных микрообластей. 6. При концентрации неэлектролита Х=0,7 в фазе неэлектролита появляются моно мерные молекулы воды, вовлечённые только в две, а не четыре водородных связи. 7. 0,7<Х<0,9. В этом интервале концентраций в фазе неэлектролита сосуществуют микрообласги воды и моно мерные молекулы воды. С ростом концентрации X размеры микрообластей уменьшаются.

Таковы основные этапы процесса микрорасслаивания, которые оказались качественно сходными для обеих исследованных нами систем. Особый интерес представляет тот факт, что в системе ДМСО-вода внутренняя вода микрообластей обладает наибольшей "жёсткостью" среди других микрорасслаивающихся систем. Вследствие этого именно система ДМСО-вода была использована нами в дальнейших исследованиях для выяснения состояния в этой системе молекул аминокислот и белков.

Глава 5.

Для понимания влияния состава растворителя на флуоресценцию белка необходимо предварительно выяснить характер мшфоокружения ароматических хромофоров в

микрорасслаивающейся смеси, а также установить, какое влияние оказывает состав растворителя на флуоресценцию непосредственно контактирующих с ним аминокислотных остатков. Для решения этих вопросов мы предприняли исследование флуоресценции триптофана в водных растворах ДМСО. Общий характер изменений спектров флуоресценции триптофана в водных растворах ДМСО в зависимости от мольной доли неэлектролита X состоит в том, что при увеличении концентрации ДМСО максимум полосы флуоресценции вначале смещается в область коротких длин волн, а затем направление смещения полосы сменяется на противоположное. Интенсивность флуоресценции при увеличении концентрации ДМСО монотонно возрастает, причём на концентрационной зависимости интенсивности флуоресценции при некоторых концентрациях ДМСО наблюдаются достаточно резкие изменения наклона.

В соответствии с существующими в литературе представлениями, изменение положения максимума полосы флуоресценции может быть обусловлено одной из двух причин: изменением, полярности растворителя, и изменением подвижности молекул растворителя. Анализ экспериментальных данных позволил заключить, что влиянием полярности растворителя в рассматриваемом случае можно практически полностью пренебречь. Влияние подвижности молекул растворителя на положение максимума полосы флуоресценции описывается формулой

MU - 1/L. xf

- =1+-, (5)

1/A.m " 1Л- TR

где тг - время жизни возбуадённого состояния молекулы флуорофора, tr - время переориентации молекул растворителя в ближайшем окружении молекулы флуорофора, Я.га - длина волны максимума спектра флуоресценции, h. и Ло - значения Х,п при та« тг и tr » xt соответственно. Изменения собственной подвижности молекул растворителя (порядок величины 10п с), не могут служить непосредственной причиной смещения спектров флуоресценции триптофана при изменении мольной доли ДМСО. Известно, что в полярных растворителях фотовозбуждение триптофана сопровождается вынужденной переориентацией молекул его микро окружения, приводящей к образованию стехио метр и ческо го комплекса в возбуждённом состоянии, или эксиплекса. Формирование зксиплекса происходит за время жизни возбуждённого состояния триптофана, т.е. времена вынужденной релаксации молекул растворителя в ближайшем окружении возбуждённого триптофана находятся в том же наносекундном диапазоне, что и время жизни возбуждённого состояния триптофана. Считая вполне естественным предположение о том, что при изменении собственной подвижности молекул растворителя соответственным образом будет изменяться и вынужденная подвижность микроокружения возбуадённого триптофана, можно принять наиболее простое предположение о линейной связи между временем собственной вращательной релаксации молекул растворителя ts и временем вынужденной переориентации молекул растворителя tr, которое может быть записано в виде те = a-ts, где а - некоторый постоянный коэффициент пропорциональности. Исходя из этого предположения, мы проверили выполнимость формулы (5), которая может быть переписана в виде

тг

fOW = 1 + --(6)

a-ts

где f(/.m) - функция от длины волны максимума полосы флуоресценции, стоящая в левой части формулы (5). Мы проверили выполнимость формулы (6), используя в качестве -ts времена релаксации молекул воды и молекул ДМСО, а также средние по ансамблю времена релаксации. Результаты проверки выполнимости формулы (6) показали, что экспериментальные данные наилучшим образом согласуются с теоретической формулой только в том случае, если в качестве времён собственной релаксации молекул растворителя при любом составе раствора принимаются времена релаксации молекул воды. Полученные нами результаты позволили определить время

вынужденной релаксации молекул воды в ближайшем окружении возбуждённого триптофана: тн = 0,61 не, хорошо согласующееся с имеющимися в литературе данными о длительности короткоживущего состояния возбуждённого триптофана в водном растворе порядка 0,50,6 не. Вся совокупность изложенных выше данных позволяет утверждать, что в системах вода-ДМСО при любом составе раствора триптофан находится в микроокружешш, состоящем только из молекул воды. По-видамому, в системе вода-ДМСО молекулы триптофана встраиваются в микрообласти воды.

Во второй части данной главы были исследованы спектры флуоресценции двух белков в водных растворах димеггилсулъфоксида, -трипсиногена и лизоцима. Характер изменений длины волны максимума флуоресценции и интенсивности флуоресценции для обоих белков является качественно сходным: при увеличении мольной доли ДМСО у обоих белков длина волны максимума полосы флуоресценции и интенсивность флуоресценции возрастают при увеличении мольной доли ДМСО. При любом составе водного раствора ДМСО полосы флуоресценции белков сохраняют значительно более коротковолновое положение, чем полосы флуоресценции денатурированных белков. Этот факт свидетельствует о том, что белки в водных растворах ДМСО не денатурируют. Кроме того, в водных растворах ДМСО все спектральные изменения происходят при значительно больших концентрациях неэлектролита, чем в других системах. В диссертации показано, что совокупность полученных результатов не может быть объяснена на основе существующих в настоящее время

представлений о причинах изменений длины волны и квантового выхода флуоресценции, - влияния полярности окружения хромофора и подвижности молекул этого окружения. Этот вывод потребовал выработки некоторого принципиально нового подхода, позволяющего понять механизм наблюдаемых изменений. В литературе имеются указания на то, что в водно-органических смесях, содержащих ДМСО, происходит геометрическое сжатие молекулы белка. Основываясь на этих результатах, в диссертации была принята гипотеза, согласно которой это сжатие обуславливует изменения флуоресценции белков в растворах ДМСО-вода. Представление о сжатии молекул белка в области средних концентраций ДМСО согласуется с установленной ранее повышенной структурированностью воды в водных микрообластях. С предлагаемой гипотезой полностью согласуется и тот факт, что изменения характеристик флуоресценции белков в водных растворах ДМСО происходят именно в интервале концентраций ДМСО, соответствующем микрорасслаиванию этих растворов. В диссертации приводятся качественные и количественные доказательства того, что принятая гипотеза о сжатии молекул белков является физически обоснованной и объясняет как направление

спектрального смещения полосы флуоресценции, так и наблюдаемое на эксперименте увеличение квантового выхода флуоресценции исследованных белков.

Глава 6.

Ещё одной микрорасслаивающейся системой, исследованной в диссертационной работе, послужили водные растворы гексафторпропанола (ГФП). Специфика данного этапа исследования состояла в том, что, в отличие от предыдущих разделов работы, в которых исследовалось состояние триптофана и белков, встраивающихся в водные микрообласга, здесь в качестве объекта исследования и зонда состояния раствора были использованы пептиды, обладающие гидрофобными свойствами, и, следовательно, более склонные к встраиванию в микрообласти спирта: синтетический модельный пептид Фёлыпа (или пептид 31-р), содержащий 31 аминокислотный остаток, - СЕзБЕзЬзУЛ^УЬз^бКа, и амилоидный р-пептид человека А|3(1-40), аминокислотная последовательность - КШ-ОАЕРЯНОЗСУЕУШдКЬУРРАЕОУОЗЫКСАШЬМУООУУ-СООН, являющийся одним из важнейших компонентов бляшек, играющих ключевую роль в нейропатологии болезни Альцгеймера. В работе исследовалось состояние двух указанных пептидов в смесях воды с гексафторпропанолом (ГФП) методами флуоресценции и кругового дихроизма. При исследовании температурных изменений спектров флуоресценции пептида 31-р в смесях ГФП-вода при концентрациях ГФП 5% и 1% наблюдаются следующие основные закономерности: 1) уменьшение квантового выхода с ростом температуры; 2) наличие двух максимумов, - коротковолнового, или "голубого", и длинноволнового, или "красного". При комнатной температуре "голубой" максимум имеет длину волны Хтм = 335 нм, а "красный" - Хшм = 350 нм. Отношение интенсивности "красного" максимума к "голубому" увеличивается с ростом температуры. Положение "красного" максимума с ростом температуры смещается в длшшоволновую сторону, тогда как положение "голубого" максимума остаётся практически неизменным. Некоторые из наблюдаемых, эффектов являются достаточно необычными. Контуры полос флуоресценции белков и пептвдов, как правило, бесструктурны и весьма слабо изменяются с температурой.

Уменьшение квантового выхода с ростом температуры является хорошо известным эффектом, объясняющимся наличием температурозависимых процессов безызлучательных переходов возбуждённых молекул в основное состояние.

Наличие в спектрах флуоресценции пептида 31-р двух максимумов мы относим к излучению осцилляторов 'Ьь ("голубой" максимум) и 'Ьа ("красный" максимум). Основными аргументами в пользу

предложенного отнесения двух компонент спектра флуоресценции пептида 31-р являются следующие экспериментальные факты:

1) Как известно, фторированные спирты индуцируют в пептидах и белках образование ос - спиралей, причём степень спиральности уменьшается с ростом температуры. В работе были измерены спектры кругового дихроизма растворов пептида 31-р при различных температурах. В спектрах КД присутствует изодихроичная точка, свидетельствующая о наличии двух состояний, - а - спираль и клубок. Степень спиральности с ростом температуры уменьшается, т.е. равновесие спираль-клубок смещается вправо. При этом аминокислотные остатки триптофана переходят из относительно гидрофобного внутрипентидного окружения в более полярный растворитель. Известно, что при переходе из неполярного окружения в более полярное окружение, излучающее состояние 'Ьъ сменяется состоянием 'Ьа. С этим фактом согласуется наблюдающееся в наших исследованиях относительное уменьшение интенсивности "голубой" полосы (состояние 'Ьь) и увеличение интенсивности "красной полосы" (состояние !Ьа) при увеличении температуры. Существование двух дискретных состояний подтверждается также наличием изосбестической точки в спектрах флуоресценции, нормированных по квантовому выходу.

2) Ещё одним аргументом в пользу предложенной нами интерпретации является смещение "красной" полосы в длинноволновую сторону при увеличении температуры. Эксперименты по сепарированию растворов пептида 31-р с использованием фильтров показали, что молекулы пептида образуют агрегаты, содержащие не менее 26 молекул в одном агрегате. Несмотря на это, аминокислотные остатки триптофана остаются доступными растворителю. Это было показано нами в экспериментах по тушению флуоресценции пептида 31-р гидрофильными тушителями (акриламидом, ионами I- и Си2+). Тушение хорошо описывается моделью Штерна-Фольмера и не обнаруживает никаких указаний на наличие остатков триптофана, не доступных растворителю. По-видимому, при увеличении температуры аминокислотные остатки триптофана, излучающие "красную" полосу, переходят во всё более полярное окружение (либо вследствие разрыхления клубка, либо вследствие частичного распада агрегатов), и этот переход приводит к смещению полосы излучения 'Ьа - осциллятора в длинноволновую сторону.

3) Наконец, одним из наиболее убедительных аргументов в пользу отнесения компонент спектра флуоресценции к осцилляторам 'Ь» и 'Ьь являются результаты измерения степени поляризации флуоресценции. Исследования показали, что степень поляризации практически не зависит от концентрации ГФП и от длины волны флуоресценции. В то же время, обнаруживается отчётливая зависимость степени

поляризации от длины волны возбуждающего света. При длине волны возбуждения 280 нм степень поляризации варьирует вблизи 0,08, а при возбуждающем свете с длиной волны 300 нм степень поляризации существенно выше (около 0,20). Полученные результаты вполне согласуются с отнесением двух компонент спектра флуоресценции к двум осцилляторам, - 'Га и 'Ьь. При длине волны 280 нм возбуждаются оба осциллятора, и взаимный перенос энергии возбуждения между этими осцилляторами, ориентированными по отношению друг к другу ортогонально, приведёт к низкому значению степени поляризации. При длине волны 300 нм поглощает возбуждающий свет и излучает "красную" компоненту спектра флуоресценции только осциллятор 'Ьа, и совпадение направления излучающего и поглощающего осцилляторов приводит к большему значению степени поляризации.

В работе также было проведено исследование пептида 31-р и амилоидного р-пептида Ар(1-40) при различных соотношениях ГФП и воды. Было обнаружено наличие следующих эффектов: I) Уменьшение интенсивности флуоресценции при увеличении объёмной доли ГФП. 2) Существование "голубого" и "красного" максимумов. 3) Относительное уменьшение интенсивности "голубого" максимума и увеличение интенсивности "красного" максимума при увеличении объёмной доли ГФП. Суммарная полоса флуоресценции смещается в длинноволновую сторону при увеличении объёмной доли ГФП в интервале 5-30 об. % ГФП. Нами также были исследованы спектры кругового дихроизма растворов пептида 31-р при различных объёмных долях ГФП. Сопоставление направления смещения полосы и степени спиральности для пептида 31-р свидетельствует об отсутствии корреляции между этими эффектами, которая была отмечена выше для температурных изменений спектров флуоресценции и степени спиральности при малых концентрациях спирта. Причина перераспределения интенсивностей в спектре флуоресценции в пользу "красной" полосы при увеличении объёмной доли ГФП, по нашему мнению, объясняется следующим образом. Проведённые нами опыты по сепарированию с помощью фильтров растворов пептида 31-р с различным содержанием ГФП показали, что при увеличении концентрации спирта агрегаты молекул ГФП частично разрушаются. Таким образом, при увеличении объёмной доли ГФП, вследствие распада агрегатов молекул пептида 31-р, эти молекулы переходят из неполярного окружения, существующего внутри агрегатов, в более полярный растворитель. Как отмечалось выше, переход из менее полярного к более полярному окружению излучающее состояние 'Ьь сменяется состоянием 'Ьа, что и приводит к перераспределению интенсивностей в спектре флуоресценции в пользу "красной" компоненты. Этот процесс происходит в интервале объёмных долей ГФП между 5% и 30%.

Особый интерес в рамках нашего исследования представляет собой поведение спектров флуоресценции пептида 31-р в концентрационном интервале, соответствующем микрорасслаиванию растворов. В интервале мольных долей ГФП между 30% и 80% спектры флуоресценции остаются практически неизменными. Этот факт свидетельствует о том, что в этом интервале концентраций молекулы пептида 31-р встраиваются в микрообласти спирта, и, следовательно, независимо от состава раствора, находятся практически в одном и том же микроокружении, состоящем только из молекул ГФП, что и приводит к неизменности спектральных характеристик.

Уменьшение интенсивности флуоресценции пептида 31-р, наблюдающееся при увеличении мольной доли ГФП, по-видимому, обусловлено увеличением полярности и уменьшением микровязкости окружения остатков триптофана при переходе пептида из состава агрегатов в растворитель вследствие разрушения агрегатов, существующих при низких концентрациях ГФП.

Нами также было исследовано состояние в микрорасслаивающихся водных растворах ГФП амилоидного пептида ЛР(1-40). Исследования, проведённые с использованием метода кругового дихроизма, показали, что степень спиральности амилоидного пептида Ар(1-40) сохраняет стабильное значение во всём интервале концентраций, соответствующем микрсрасслаиванию растворов ГФП-вода. Этот факт свидетельствует о том, что молекулы амилоидного пептида Ар(1-40) встраиваются в микрообласти спирта, и, следовательно, независимо от состава раствора находятся в одном и том же микроокружении, состоящем только из молекул ГФП. В отличие от пептида 31-р, сохраняющего высокую степень спиральности даже при очень низких концентрациях ГФП (0,1 %), спиральная структура амилоидного пептида АР(1-40) быстро разрушается при уменьшении концентрации ГФП ниже 10-12 %. Разрушение спиральной структуры пептида Ар(1-40) происходит приблизительно при той же концентрации ГФП, при которой нормированный первый момент полосы флуоресценции пептида 31-р начинает смещаться в коротковолновую сторону. Можно предположить, что ниже этой концентрации ГФП в смесях ГФП-вода полностью исчезают микрообласти спирта и воды, и молекулы пептидов переходят из спиртового в водное окружение. У пептида АР(1-40) присутствие в его окружении молекул воды вызывает "денатурацию" (разрушение спиральной структуры), в то время как молекулы более гидрофобного пептида 31-р предохраняют себя от структурной дестабилизации, образуя агрегаты.

выводы

1. Получены новые спектроскопические подтверждения правильности континуальной модели структуры воды. Показано, что высокочастотные компоненты в спектрах поглощения и комбинационного рассеяния принадлежат единому непрерывному распределению по энергиям водородных связей.

2. Исследованы закономерности процессов микрорасслаивания в системах вода-диметилсульфоксид и вода-диоксан. Обнаружено особое состояние воды в водных микрообластях, изучена последовательность молекулярных процессов при изменении состава растворов.

3. Показано, что в микрорасслаивающемся растворе вода-ДМСО молекулы аминокислоты триптофан во всём концентрационном интервале встраиваются в водные микрообласти и в процессе флуоресценции образуют эксиплексы только с молекулами воды.

4. Методом флуоресценции исследовано поведение двух белков, -трипсиногена и лизоцима, - в растворах ДМСО-вода. Предложена интерпретация наблюдаемых закономерностей, основанная на представлении о геометрическом сжатии молекул белков в водных микрообластях.

5. Исследовано состояние пептидов 31-р и Ар(1-40) в микрорасслаивающихся растворах гексафторпропанола. Впервые обнаружено одновременное ' излучение осцилляторов 'La и 1 Lb в растворах полипептидов, изучены закономерности этого излучения в зависимости от температуры и состава раствора.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. А. П. Жуковский, Н. В. Ровнов, М.А.Жуковский. Журн. структур, химии. Т. 34. С. 83. 1993.

2. А. П. Жуковский, Н. В. Ровнов, С. В. Сорвин, М. А. Жуковский. X Менделеевская дискуссия "Периодический закон и свойства растворов". С. 47. 27-30 Сентября 1993. Санкт-Петербург.

3. А. П. Жуковский, Л. В. Шурупова, М. А. Жуковский. Журн. структур, химии. Т. 36. С. 467. 1995.

4. А. П. Жуковский, Н. В. Ровнов, М.А. Жуковский. Проблемы ноосферы и устойчивого развития. Материалы 1 Международной конференции. 9-15 Сентября 1996 г. Санкт-Петербург. С. 155.

5. А. П. Жуковский, В. М. Бакулев, М. А. Жуковский, Н. В. Ровнов. Журн. структур, химии. Т. 38. С. 103. 1997.