Структурно-функциональное изучение гомологичных фрагментов факторов дифференцировки PEDF и HLDF тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М. М. ШЕМЯКИНА И Ю. А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи УДК 577.112.6; 577.322.4

ЖОХОВ СЕРГЕЙ СЕРГЕЕВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ГОМОЛОГИЧНЫХ ФРАГМЕНТОВ ФАКТОРОВ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ РЕБГ И НЫЖ

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА 2004

Работа выполнена в лаборатории белков гормональной регуляции Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

кандидат химических наук Костанян Ирина Александровна

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, проф. Габибов Александр Габибович

доктор биологических наук Башкатова Валентина Германовна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Кафедра биоорганической химии

Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 14 января 2004 г. в 10 часов на заседании Специализированного совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН по адресу: 117997 ГСП-7 Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан "■/{? " декабря 2003 г.

Ученый секретарь

специализированного совета,

доктор химических наук /[/М .

В. А. Несмеянов

2<=>9С

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одной из актуальных проблем современной биоорганической химии является поиск и структурно-функциональные исследования новых белковых факторов дифференцировки. Нарушение процессов нормального созревания клеток и их превращения в дифференцированные, функционально активные формы является ключевой стадией патогенеза многих злокачественных новообразований. Вещества, индуцирующие дифференцировку клеток, находят широкое применение в терапии опухолей как сами по себе, так и в сочетании с цитостатиками - агентами, вызывающими гибель делящихся клеток.

Как правило, белковые факторы дифференцировки представляют собой относительно крупные молекулы. Для многих из них помимо способности индуцировать дифференцировку клеток показано наличие целого ряда других биологических активностей. К таким многофункциональным факторам дифференцировки относятся факторы HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor) и PEDF (Pigment Epithelium-Derived Factor).

Фактор HLDF с молекулярной массой 8,2 кДа, выделенный из культуральной среды промиелоцитарной лейкемической линии клеток человека HL-60, обработанных полностью-транс-ретиноевой кислотой, ингибирует пролиферацию клеток данной линии и индуцирует их дифференцировку в зрелые гранулоциты, а также повышает выживаемость клеток этой линии при различных повреждающих воздействиях. Фактор PEDF с молекулярной массой 50,1 кДа, впервые выделенный из культуральной среды клеток пигментного эпителия сетчатки глаза человека, является фактором дифференцировки опухолевых клеточных линий нейронального происхождения и эмбриональных нейронов. Он также обладает нейропротекторным и антиангиогеняым действием, является регулятором клеточного цикла и апоптоза. При сравнительном компьютерном анализе первичных структур факторов HLDF и PEDF были обнаружены гомологичные области молекул этих факторов; данная область молекулы фактора HLDF содержит фрагмент, отвечающий за его дифференцирующее и протекторное действие.

Установление взаимосвязи структурных особенностей белка и его функциональных характеристик имеет принципиальное значение для понимания молекулярных механизмов его функционирования. Перспективным подходом для

изучения белков с широким спектром активностей является исследование их коротких фрагментов, обладающих биологической активностью. Пептид TGENHR (HLDF-6) представляет собой фрагмент фактора HLDF, отвечающий за его дифференцирующую активность; пептид TQVEHR (PEDF-6) - гомологичный ему фрагмент молекулы PEDF. Изучение сходств и различий функциональных свойств данных пептидов на ряде биологических объектов будет способствовать пониманию особенностей функционирования самих факторов, а также того, насколько структурное подобие фрагментов молекул обусловливает сходство функциональных характеристик.

Цели и задачи исследования

Цель настоящего исследования - сравнительное изучение функциональной роли гомологичных фрагментов молекул факторов HLDF и PEDF при их действии на различные биологические объекты.

Основные задачи исследования:

- идентификация гомологичных фрагментов факторов HLDF и PEDF;

- выяснение характерных особенностей дифференцирующего действия факторов HLDF и PEDF, а также их гомологичных фрагментов в виде индивидуальных пептидов, на опухолевые и эмбриональные ткани;

- изучение молекулярных механизмов действия гексапептидов HLDF-6 и PEDF-6, соответствующих по структуре гомологичным фрагментам HLDF и PEDF на клетки линии HL-60;

- in vivo и in vitro изучение протекторного действия пептидов HLDF-6 и PEDF-6, а также проявления нейропротекгорного действия на уровне поведения животных.

Научная новизна

Идентифицированы гомологичные 18-членные области молекул факторов HLDF и PEDF, установлена их роль в дифференцирующем действии факторов как на клетки линии HL-60, так и на эктодерму эмбрионов Xenopus laevis на стадии ранней гаструлы. Предположена регуляторная роль протеолиза пептидной связи 382l-383t в молекуле PEDF, в наибольшей степени подверженной действию сериновых протеиназ. Выяснена роль фактора PEDF в комплексном дифференцирующем действии белков стекловидного тела глаза на эмбриональную ткань. Изучен

характер взаимодействия пептидов НЬБР-б и РЕБР-б с клетками НЬ-60 и их влияние на биосинтез вторичных мессенжеров в этих клетках. Впервые показано нейропротекторное действие пептидов НЬЦР-б и РЕИР-б на клетки Пуркинье червя мозжечка крыс при индуцированной гипоксии.

Практическая пенность результатов работы

В данной работе впервые показано дифференцирующее действие факторов Н1Л)Р, РЕОБ на опухолевые и эмбриональные ткани и участие в этом действии гомологичных аминокислотных последовательностей факторов. Это открывает возможности для применения белков, содержащих данные последовательности, при создании противоопухолевых препаратов, а также корректоров эмбрионального развития.

Результаты, полученные при исследовании нейропротекторного действия пептидов ШЛЖб и РЕО¥-6, открывают возможности создания препаратов для терапии ряда нейродегенеративных заболеваний.

Апробапия работы

Материалы диссертации были доложены на II Биофизическом конгрессе (Москва, 1999); на международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии - 2000» (ГГ+МЕ'2000, Гурзуф, Украина 2000); на Международном симпозиуме РЕ№-2000, организованном Федерацией Международных Нейрологических Обществ (Брайтон, Великобритания); на П1 Съезде российского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); на VI Чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва -Пущино, 2002); на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ. Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на ш страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, экспериментальная часть (материалы и методы), выводы. Материал иллюстрирован рисунками и 9 таблицами. Библиографический указатель содержит Ш цитированных работ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Идентификация гомологичных фрагментов молекул факторов Н1Л№ и РЕВР, отвечающих за их дифференцирующее действие на клетки НЬ-60 и эктодерму эмбрионов Хепорт 1аеш на стадии ранней гаструлы.

Фактор дифференцировки ШЛЗР состоит из одной полипептидкой цепи, содержащей 54 аминокислотных остатка. Как было показано ранее, он индуцирует дифференцировку клеток линии НЬ-60 в зрелые гранулоциты (Костанян И. и др., Биоорг. химия, 1995, 21,243-248). Данная активность фактора обусловлена наличием в структуре молекулы шестичленного фрагмента ^ТОЕКНЛ46. Гексапептид с последовательностью ТСБЫНЯ, получивший название НШИ-б, также способен индуцировать дифференцировку клеток НЬ-60.

Нами был проведен сравнительный компьютерный анализ первичной структуры фактора Н1Х)Р и других известных к настоящему времени факторов дифференцировки белковой природы. Согласно результатам анализа, молекула фактора РЕОИ содержит фрагмент, состоящий из 18 аминокислотных остатков, имеющий гомологию с фрагментом молекулы Н1ЛЖ Фактор РЕВБ имеет молекулярный вес 50,1 кДа и состоит из одной полипептидной цепи, содержащей 418 аминокислотных остатков. РЕЭР является многофункциональным фактором. Он индуцирует дифференцировку клеток нейробластомы и эмбриональных нейробластов в зрелые нейроны. Кроме того, было показано его нейропротекторное, антиангиогенное действие и участие в регуляции клеточного цикла. Аминокислотная последовательность фактора РЕОИ представлена на рис. 1, а.

Гомологичные фрагменты факторов ШЛЯ1 и РЕОБ показаны на рис. 1, б. Фрагмент фактора Н1Л5Р, представляющий собой С-концевую область молекулы, включает в себя фрагмент ^ТОЕМНЯ46, обеспечивающий дифференцирующую активность фактора на клетках линии НЬ-60. Гомологичный фрагмент фактора РЕОР расположен в С-концевой части молекулы, функциональная роль которой к настоящему времени не установлена.

Наличие в молекуле РЕИР фрагмента гомологичного

дифференцирующему фрагменту ""ТОЕМНИ46 молекулы НИХ)Р, явилось основанием

(а)

МОАЬУЬЬЬСЮАЫЛЗНЗЗСО

Ш 1 > 1 I

21 ЫРАЗРРЕЕОЗРПРПБТСАЪУЕЕЕБРРРЮ/РтакЬАААУЗЫРОУБЬУКУЕЗ 70

1 1 П

71 5МВРТТИУЫЗРЬЗУАТАЬ8АЬЗЬСА0ЕПТЕБ11ННАЬУтЫЗБР01На 120

и 11 Xii4J.il 11 1

121 Г¥КЕЬЬПТУТАР0ЮПЖ5АЗЯ1УРЕККЬН1КЗЗРУАРЬЕКЗУСТКРНУЬТ 170

1 1 1111 и : 1

171 СМРКЬПЬОЕ1тОТОАОМКСК1АКЗТКЕ1РОЕ131ЬЬЬОУАНРКСОНУТК 220

1 11 и 1 1 1 и 1

221 РОЗЕКТЗЬЕПРУЬВЕЕКТтаУРММЗВРКАУЬНУСЬБЭОЬЗСКХАОЬРЬТв 270

11 1 111 11

271 ЗМЗИРРЬРЬЮ/ТОМЬТЫЕЕЗЬТЗЕРХНОХОНЕЬКТООАУЬТ/РКЬКЬЗ 320

1 1 1111 1 111 321 УЕСЕТОК8ЬОЕМКЪОЗЬРОЗРПРЗК1ТСКР1КЬТОУЕННАСКЕ»гаЕОСАа 370

1 111 111

371 ТТРЗРСЬОРАНЬТРРЬРУНЪ№РР1РУЬНРТРТОАЬЬРЮК1ЬРРЕОР 418

(б) РЕРР:

НЫ)Р:

349

37

КР1 ф +

КЕЬ-

^^^-РЕТШЕ 366

л А т л

]Св1РУ1№С 54

Рисунок 1. (а) Первичная структура фактора РЕОР человека.

Фрагмент, гомологичный области молекулы НЫ5Р, выделен жирным шрифтом (остатки 349-366). Участок связывания с рецептором на клетках ретинобластомы и нейронах выделен курсивом (остатки 78-121).

— пептидная связь 382Ь-383Т, в наибольшей степени подверженная действию сериновых протеиназ. С-концевой фрагмент молекулы, отщепляемый при протеолизе данной связи, подчеркнут (остатки 383-418).

1 - пептидные связи, расщепляемые при исчерпывающем гидролизе трипсином.

1 - пептидные связи, расщепляемые при исчерпывающем гидролизе химотрипсином.

(б) Гомологичные фрагменты молекул факторов РЕОР и Н1ЛЖ

Ф - идентичные аминокислотные остатки.

+ - равноценная замена (лейцин-изолейцин).

Инверсным шрифтом выделен фрагмент молекулы НЬОР, обеспечивающий его дифференцирующее действие, и соответствующий ему фрагмент молекулы РЕОР. Данные фрагменты представляют собой последовательности биологически активных пептидов НЦЖб и РЕЭР-б, соответственно.

для предположения, что фактор РЕБР может индуцировать дифференцировку клеток линии НЬ-60, подобно НЬОР. Результаты тестирования активности РЕОИ на клетках НЬ-60 методом НВТ-теста свидетельствуют о том, что фактор действительно вызывает дифференцировку клеток этой линии. Его эффект проявляется во всех испытанных концентрациях от Ю'10 до 10"6 М (Рис. 2, в).

Согласно высказанной нами гипотезе, действие фактора РЕОР на эту клеточную линию должно быть обусловлено наличием в полипептидной цепи фрагмента 354Т<ЗУЕШ.359. Для проверки этой гипотезы был проведен исчерпывающий гидролиз препарата РЕОР смесью трипсина и химотрипсина (1:1). В дальнейшем полученный гидролизат был испытан в МВТ-тесте на клетках НЬ-60. По данным анализа первичной структуры РЕОР, ни одна из пептидных связей внутри фрагмента 354ТС2УЕН1135' не является сайтом действия данных протеиназ, и он должен присутствовать в гидролизате в составе семичленного пептида ЬТОУЕНЯ. (Рис. 1, а). В качестве отрицательного контроля в данном эксперименте использовались гидролизаты овальбумина и бычьего сывороточного альбумина (БСА). Как видно из рис. 2, б, гидролизат РЕОР индуцирует дифференцировку клеток, гидролизаты двух других белков - не индуцируют. Следовательно, полученные результаты не исключают возможность, что действие РЕОР на клетки НЬ-60 обеспечивается фрагментом 354Т(2УЕ1Ж359.

— 70 ■

£ 65-

I 60

I 55

5 50-

I

| 40 ■

1 35 • | 30 Ё 25.

2 20.

-ни*

-РЕОР

т_тТг7ТГг7

0 10 "10* 10* 10*

(а)

70 -, 65 -00 -55 50 45 -40 35 -30 -25 20

—О—

—т— Овальбумии —Д— БСА

0 10™ 10* 10* (в)

70 —,

65

60_

55

50

45

40

35

30

25

20

-НШР-б - РЕОР-6

Концентрация индуцирующего агента, М

т ГГТТТ7~ТТТ7 0 10й 10* 10* 10' 10* (В)

Рисунок 2. Изменение количества №ЗТ-положительных клеток НЬ-60 при индукции их дифференцировки под действием: (о) факторов ШЛЗР и РЕОР; {б) гидролизатов фактора РЕОР, овальбумина и БСА, полученных при исчерпывающем гидролизе смесью трипсина и химотрипсина (1:1); (в) гексапепгвдов 'ГОЕМЖ (ШЛЭР-6) и ТС?УЕГО (РЕОР-6).

Рисунок 3. Гистологические срезы эксплантатов эктодермы эмбрионов X. подвергнутых действию (в) фактора НЮТ; (б) пептида ПРОР-6; (в, г) фактора РЕОР; (д) пептида РЕОР-6; (е) контрольные эксплантаты, не обработанные индуцирующими агентами. Срезы изготовляли через 5 суток после действия индуцирующих агентов

Для окончательного подтверждения данной гипотезы был синтезирован гексапептид со структурой TQVEHR, получивший название PEDF-6. Методом NBT-теста показано сходство дифференцирующего действия гексапептидов HLDF-б и PEDF-6 на клетки HL-60 (Рис. 2, в).

Ранее в нашей лаборатории были синтезированы 8 гомологов пептида HLDF-6 с различными точечными мутациями или делениями одного из аминокислотных остатков. Ни один из этих гомологов не обладает дифференцирующей активностью на клетках HL-60, за исключением пептида YGENHR, т.е., пептида HLDF-б с заменой N-концевого треонина на тирозин (Костанян И. и др., Биоорг. химия, 2000, 26,505-511).

Изучено дифференцирующее действие факторов HLDF и PEDF, а также пептидов HLDF-б и PEDF-6 на эктодерму эмбрионов шпорцевой лягушки Xenopus laevis на стадии ранней гаструлы (ЭРГ), на которой она наиболее восприимчива к действию различных индукторов дифференцировки. При наличии внешних индукционных воздействий эксплантаты ЭРГ могут дифференцироваться в различные ткани как эктодермального, так и мезодермального происхождения; при их отсутствии из эксплантатов ЭРГ формируется атипичный эпидермис. Фактор HLDF, как и пептид HLDF-б, вызывал образование в эктодерме клеток крови (Рис. 3, а, б). Фактор PEDF главным образом индуцировал формирование в ЭРГ морфологически очерченных нервных образований, а также небольшого количества клеток крови (Рис. 3, в, г). Пептид PEDF-б вызывал образование только мезенхимы (Рис. 3, д). В контрольной группе эксплантатов, как и предполагалось, формировался атипичный эпидермис (рис. 3, е). Таким образом, если за индукционное воздействие фактора HLDF, приводящее к образованию в ЭРГ клеток крови, отвечает фрагмент молекулы 4ITGENHR46, то для индукционного действия PEDF, приводящего к образованию клеток крови, вероятно, необходима определенная конформация фрагмента 354TQVEHR359, которая существует в составе полноразмерной молекулы фактора, т.е., отличная от той, которую имеет пептид PEDF-6. В то же время за индукцию нервных образований, по-видимому, отвечает фрагмент молекулы PEDF 78V-12IT, который, по литературным данным, обеспечивает действие фактора на клетки ретанобластомы (Alberdi Е. et al., J. Biol. Chem., 1999,274,31605-31612).

2. Сравнительное изучение протекторного действия пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на нейроны червя мозжечка крыс и клетки линии HL-60 при индуцированной химической гипоксии.

Протекторное действие, заключающееся в поддержании жизнедеятельности и функциональной активности определенных типов клеток при целом ряде повреждающих воздействий, является функциональной особенностью факторов HLDF и PEDF. В данной работе исследовано протекторное действие пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на клетки Пуркинье червя мозжечка крыс (in vivo) и клетки HL-60 (in vitro) при химической гипоксии, индуцированной введением азида натрия -агента, блокирующего ферменты дыхательной цепи митохондрий.

Червь мозжечка (vermis cerebelli) является областью головного мозга, участвующей в реализации целого ряда поведенческих реакций, в частности, формирования условного обстановочного страха, вкусового отвращения, неофобии, а также долговременного угашения акустической стартл-реакции (АСР), т.е., уменьшения выраженности реакции животных на внезапные звуковые стимулы (Supple W. et al., Physiol. Behav., 1987,39, 579-586). При химической гипоксии червя в этом отделе увеличивается процент гиперхромных клеток Пуркинье - клеток со сниженной функциональной активностью, имеющих интенсивную темную окраску на гистологических срезах. При совместном действии азида натрия и одного из пептидов HLDF-6 или PEDF-6 количество гиперхромных клеток оказывается меньшим по сравнению с животными, обработанными только азидом натрия (Табл. 1). Таким образом, оба пептида способны в определенной степени поддерживать функционально активное состояние этих клеток в условиях гипоксии.

Изучено восстановительное действие пептидов на формирование у крыс условного обстановочного страха и долговременное угашение АСР - поведенческих реакций, нарушаемых при гипоксии червя. Проявление данных реакций оценивали по продолжительности периода полной неподвижности («замирания») крыс при помещении в экспериментальную камеру (т.е., при внезапной смене обстановки), а также давлению на платформу камеры при резком разгибании конечностей в ответ на генерируемые звуковые импульсы. В норме при повторных испытаниях (через 24 часа после первичных) период «замирания» удлиняется вследствие обстановочного страха, а амплитуда АСР снижается в результате долговременного угашения.

Таблица 1. Влияние пептидов ШДЛЧ) и РЕОР-б на количество гиперхромных клеток Пуркинье (%) на гистологических срезах червя мозжечка крыс при нанесении раствора азида натрия на этот отдел.

Агенты, наносимые на червь мозжечка Количество гиперхромных клеток Пуркинье (%)

Азид натрия 63±3

Азид натрия + НЬОР-б 42±4*

Азид натрия + РЕОР-6 47±б*

Контроль 25±6

Азид натрия наносили в концентрации 10"3 М, пептиды ШЛЖб и РЕОР-б - в концентрации 10"* М. Срезы изготовляли через 8 суток после нанесения иа червь мозжечка животных указанных агентов. Приведены средние значения по группе из 8 животных. * р<0,05 - достоверное различие по сравнению с группой, обработанной азцдом натрия.

Таблица 2. Влияние пептидов ЩВР-б и РЕП?-6 на формирование условного обстановочного страха и долговременное угашение АСР у крыс при химической гипоксии, червя мозжечка, индуцированной азидом натрия.

Агенты, наносимые на червь мозжечка Продолжительность периода полной неподвижности («замирания»), сек Давление на платформу камеры при проявлении АСР (отн. ед.)

Первичные испытания Повторные испытания Первичные испытания Повторные испытания

Азид натрия 77±18 94±20 492+58 509±5б

Азид натрия+НЬОР-б 87±10 137±13* 445+52 25б±29*

Азид натрия+РЕОР-б 83±16 129±17* 524±5б 580±49

Контроль 68±12 123±21* 463±46 350±31*

Азид натрия наносили в концентрации 10"' М, пептиды Н1Л5Р-6 и РЕОР-6 - в концентрации 10"4 М. Первичные испытания проводились через 5 суток после инъекций указанных агентов, повторные испытания - через 24 часа после первичных. Приведены средние значения по группе из 8 животных. Данные по давлению на платформу камеры приведены к стандартной массе крысы - 250 г.

* р<0,05 - достоверное различие по сравнению с соответствующим показателем в той же группе, полученным при первичных испытаниях.

У группы животных, на червь мозжечка которых наносили раствор азида натрия, ни формирования условного страха, ни долговременного угашения АСР не наблюдалось. Пептиды HLDF-6 и PEDF-6 восстанавливали формирование условного страха у таких животных до уровня контрольной группы, в то время как долговременное угашение АСР восстанавливал только пептид HLDF-6 (Табл. 2).

Также изучено влияние пептидов на выживаемость клеток HL-60 в условиях химической гипоксии, индуцированной азидом натрия. Количество жизнеспособных клеток в культуре определяли методом МТТ-теста (табл. 3). Под действием пептида HLDF-6 количество клеток, выживающих в условиях гипоксии, достоверно повышается, в то время как пептид PEDF-6 не оказывает влияния на выживаемость клеток.

По литературным данным известно, что азид натрия может вызывать как апоптотическую, так и некротическую гибель клеток. В концентрациях 150 мМ и выше он вызывает некроз. При концентрациях азида натрия порядка 1 мМ тип гибели клеток зависит от содержания в среде глюкозы: в ее присутствии клетки гибнут преимущественно по апоптотическому типу, в отсутствии глюкозы преобладает некроз (Bal-Price A., Brown G., J. Neurochem., 2000, 75, 1455-1464). Культуральная среда RPMI-1640, используемая нами для культивирования клеток HL-60, содержит глюкозу, поэтому в проведенных экспериментах большинство клеток, скорее всего, погибает вследствие апоптоза. Как отмечается в более ранней публикации Lotem J. и Sachs L. {Blood, 1992, 80, 1750-1757), такие цитотоксические соединения, как азид натрия, винкристин, циклогексимид и др. вызывают апоптоз лейкемических клеток миелоидного ряда.

Таблица 3. Влияние пептидов Н1Л)р-б и РЕОР-6 на выживаемость клеток линии НЬ-60 в условиях гипоксии, индуцированной азидом натрия (данные МТТ-теста).

Концентрация азида натрия Количество жизнеспособных клеток (% от контроля)

Контроль HLDF-6 (1 мкМ) PEDF-6 (1 мкМ)

ОмкМ 100±2 105±5 97±3

10 мкМ 79±2 98±4* 82±4

ЗОмкМ 55±4 63±3* 54±2

100 мкМ 15+5 36±4* 18±3

* р<0,05 - достоверное различие по сравнению с контролем при соответствующей концентрации азида натрия.

3. Изучение молекулярных механизмов действия пептидов НЮР-б и РЕБР-б на клетки НЬ-60.

С целью детального исследования механизмов действия пептидов ШЛЗР-б и РЕЭР-б мы изучили их влияние на некоторые системы, участвующие во внутриклеточной передаче информационного сигнала в клетках, в том числе, на системы биосинтеза вторичных мессенжеров. В качестве наиболее подходящего объекта для данных исследований были использованы клетки линии НЬ-бО.

Методом радиолигандного связывания было установлено, что на поверхности клеток НЬ-60 не существует специфических рецепторов пептидов НЮТ-б и РЕБР-б. Связывание пептидов с клетками наблюдалось при +37°С, но не при 0°С. Полученные значения констант диссоциации составляли ~10"3М. Вследствие таких высоких значений констант диссоциации, а также большого числа мест связывания пептидов (п~1012 на одну клетку) мы предположили, что они неспецифически взаимодействуют с липидными компонентами клеточной мембраны, изменяя ее физико-химические свойства.

-ДГ

Рисунок 4. Влияние пептидов Н1ЛЗР-6 и РЕОР-6 на анизотропию поляризации флуоресценции зонда (3-актрилвинилфосфатидилхолина), встроенного в липосомы из 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилхолина.

-Аг - уменьшение анизотропии поляризации флуоресценции по сравнению с контролем (суспензией липосом, не содержащей пептида).

Взаимодействие пептидов HLDF-6 и PEDF-6 с липидными мембранами изучалось на модельной системе - липосомах из фосфатидилхолина, содержащих флуоресцентный зонд. Под действием пептида HLDF-6 наблюдалось уменьшение анизотропии поляризации флуоресценции зонда (рис. 4), что указывает на увеличение подвижности липидов в структуре липосомы. Предположительно, биологические эффекты данного пептида могут осуществляться путем разупорядочивания жидкокристаллической структуры липидного бислоя клеточной мембраны. Влияние пептида PEDF-6 на анизотропию флуоресценции незначительно, причем максимальный эффект наблюдался при концентрации пептида 10"8 М, в то время как максимальное дифференцирующее действие на клетки HL-60 пептид оказывает в концентрации 10"6 M (см.выше). Характер взаимодействия этого пептида с клетками к настоящему времени не выяснен. Не исключена возможность, что его эффекты реализуются с участием липидов другой природы, чем фосфатидилхолин.

При действии на клетки HL-60 большинства хорошо изученных факторов дифференцировки изменяется активность ферментов биосинтеза вторичных мессенжеров - аденилатциклазы и фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазыС (Thomas G. et al., Anticancer Res., 1986, 6, 857-860; G eny В. et al., FEBS Lett., 1988, 233, 239-243). В настоящей работе исследовано влияние пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на активность указанных ферментов.

Влияние пептидов на активность аденилатциклазы оценивали по изменению внутриклеточной концентрации цАМФ в клетках, инкубируемых с пептидом, по сравнению с контролем. Как видно из табл. 4, при действии пептида на клетки в среде культивирования RPMI-1640, содержащей 7% сыворотки теленка, пептид HLDF-б оказывает ингнбиторное влияние на аденилатциклазу, в то время как пептид PEDF-6 не проявляет значимого эффекта на ее активность.

При проведении исследований в среде RPMI-1640 без сыворотки пептид HLDF-6 также снижает активность аденилатциклазы, однако относительная величина эффекта в этом случае меньше, чем при наличии сыворотки (Табл. 4). Это, вероятно, свидетельствует о наличии одновременно двух ингибиторных эффектов пептида на аденилатциклазу, один из которых опосредован каким-либо компонентом сыворотки, скорее всего, интерлейкином 1, на связывание которого с клетками HL-60 влияет пептид HLDF-б (Костанян И. и др., Биоорг. химия, 2000, 26, 505-511).

Таблица 4. Изменение концентрации цАМФ в клетках НЬ-60 под действием пептидов НЮТ-б и РЕОР-б.

Пептид Количество цАМФ в образце (пМоль)

В среде ИРМ-1640 + 7% сыворотки теленка В среде RPMI-1640 без сыворотки *

HLDF-6(1 мкМ) 4,54±0,29* 7,52±0,59*

PEDF-б (1 мкМ) 6,61±0,23 8,29±0,б8

Контроль б,85±0,32 9,15±0,43

Исследуемые образцы содержали по 107 клеток НЬ-бО. Время действия пептидов - 20 мин. * р<0,05 - достоверное различие по сравнению с контролем.

"При проведении исследований в среде без сыворотки клетки были предварительно промыты данной средой для удаления компонентов сыворотки, содержащихся в среде культивирования.

Таблица 5. Изменение активности аденилатциклазы в выделенных мембранах клеток линии НЬ-60 под действием пептида Н1ЛЭР-6 в присутствии агентов, влияющих на активность данного фермента.

Используемый препарат мембран; модифицирующие агенты Активность аденилатциклазы, пМоль цАМФ/(минхмг белка)

Контроль HLDF-6(1 мкМ)

Мембраны клеток НЬ-60 - 1,44±0,0б 1,20±0,07*

Форскоиин (1 мкМ) 3,25±0,14 3,32±0,1б

р,7-имидо-ГТФ (10 мкМ) 1,49±0,09 1,30+0,04*

Морфин (10 мкМ) 1Д9±0,08 1,06±0,03»

Мембраны, солюбилизированные CHAPS (10 мкМ) 3,08±0,19 2,97+0,10

Мембраны хронически морфинизированных клеток HL-60* 4,01 ±0,20 3,52±0,11*

"При хронической морфинизации клетки в течение 24 часов культивировали в среде, содержащей 1 мкМ морфина, затем проводили выделение мембран. * р<0,05 - достоверное различие по сравнению с соответствующим контролем.

Активность аденилатциклазы в препарате выделенных мембран клеток HL-60 также снижается под влиянием пептида HLDF-6. В присутствии форсколина эффект пептида на данном препарате не наблюдается, однако он сохраняется в присутствии негидролизуемого аналога ГТФ - р,у-имидо-ГТФ (Табл. 5). Полученные данные позволили предположить, что мишенью действия пептида в аденилатциклазной системе является G-белок; вероятнее всего, усиливается взаимодействие каталитической субъединицы аденилатциклазы с белками класса G„ ингибирующими активность аденилатциклазы. Поскольку пептид увеличивает подвижность липидов в мембране, вероятно, его эффект на аденилатциклазу связан с повышением подвижности а-субъединицы G,- белка, которая пальмитилирована и локализована на поверхности плазматической мембраны (Duncan J., Gilman A., J. Biol. Chem., 1996,271,23594-23600). Согласно Gudi S. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 2515-2519), активация G-белков, связанных с мембраной, может происходить в отсутствии рецептора при уменьшении степени упорядоченности жидкокристаллической структуры липидного бислоя, возникающем при механическом стрессе. В пользу нашего предположения об активации G-белка путем изменения подвижности мембранных липидов под действием пептида HLDF-6 говорит и тот факт, что эффект пептида на аденилатциклазу в препарате мембран клеток HL-60, солюбилизированных детергентом CHAPS, не проявляется (табл. 5).

Согласно литературным данным, ингибиторное действие G,-белков на аденилатциклазу не проявляется в присутствии активированных стимуляторных G-белков (класса Gs) и форсколина, что объясняется неустойчивостью четырехкомпонентного комплекса 0,-аденилатциклаза-форсколин-05 (Dessauer С. et al., J. Biol. Chem., 2002, 277, 28823-28829). Таким образом, ингибиторный эффект пептида HLDF-6, который проявляется на фоне базальной активации аденилатциклазы 05-белками, в присутствии форсколина не наблюдается.

G,-белки принимают участие в «суперактивации» аденилатциклазы, характерной для состояния физической зависимости от наркотиков. Во многих типах клеток, таких как нейробластома, лимфома, адипоциты и др. при однократной кратковременной обработке морфином (острой морфинизации) наблюдается снижение уровня синтезируемого цАМФ, в то время как при длительной обработке (хронической морфинизации) уровень цАМФ оказывается повышенным по сравнению с контролем. Такое повышение получило название «суперактивации» аденилатциклазы. Для развития «суперактивации» необходимо наличие в клетках ц-

опиоидных рецепторов и G,-6ejncoB; это явление блокируется коклюшным токсином, нарушающим функционирование G,-белков (Avidor-Reiss Т. et al., J. Biol. Chem., 1997,272,5040-5047).

Исследовано влияние пептида HLDF-6 на активность аденилатциклазы в препарате мембран клеток HL-60 при острой (в присутствии 10 мкМ морфина) и хронической морфинизации. В обоих случаях активность аденилатциклазы под действием пептида снижается (Табл. 5). Таким образом, при действии пептида «суперактивация» аденилатциклазы при хронической морфинизации проявляется в меньшей степени, чем при его отсутствии. Поскольку «суперактивация» аденилатциклазы является одним из проявлений состояния физической зависимости от наркотиков, можно предположить, что ингибирование активности этого фермента пептидом HLDF-6 является одним из механизмов снятия этим пептидом состояния физической зависимости от морфина, которое было ранее продемонстрировано in vivo на крысах (Литвинова С. и др., Бюяя. жсп. биол. и мед., 2003,135,155-157).

В работе проведено изучение влияния пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на активность фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С в клетках HL-60. Активность этого фермента определяли по изменению концентрации радиоактивно меченых инозитолмоно- и днфосфатов в клетках, культивируемых в присутствии меченого инозитола в течение 24 часов до действия пептидов. Результаты представлены в табл. б. При действии пептидов наблюдалась некоторая тенденция к понижению активности фосфолипазы С, однако различия с контролем не достигали уровня статистической достоверности.

Для лучшей визуализации эффектов пептидов была проведена стимуляция фосфолипазы С тетрафторидом алюминия. В присутствии этого агента наблюдалось заметное снижение активности фосфолипазы С под действием пептида PEDF-б, в то время как пептид HLDF-6 не проявлял эффекта (Табл. 6).

Известно, что тетрафторид алюминия активирует фосфатидилинозитол-специфическую фосфолипазу Ср посредством стимуляции Gq-белков (Yan Y. et al., J.Biol. Chem., 1997, 272, 11924-11927). Поэтому пептид PEDF-б, вероятнее всего, оказывает ингибирующее действие через белки именно этого класса либо путем непосредственного увеличения их ГТФазной активности, либо усиливая взаимодействие Осц-субъединицы с каким-либо белком семейства RGS (regulator of G-protein signaling), по-видимому, белком RGS4. Большинство известных белков

семейства RGS повышают ГТФазную активность G-белков, ускоряя их переход из активного состояния в неактивное за счет стабилизации конформации Ga-субъединицы, при которой происходит гидролиз ГТФ. Белок RGS4 усиливает ГТФазную активность Gq-белков, взаимодействуя с участком Ga,-субъединицы, где происходят конформационные перестройки при переходе из ГДФ- в ГТФ-связанное состояние (Steme-Marr R. et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, 6050-6058). В присутствии тетрафторида алюминия сродство RGS4 к Gaq-субъединице значительно повышается. Таким образом, этот белок ингибирует стимуляцию тетрафторидом фосфолипазы CP; при его суперэкспрессии стимуляции PLCP этим агентом вообще не происходит. Возможно, пептид PEDF-6 каким-то образом способствует взаимодействию Got, и RGS4.

Таблица 6. Изменение концентрации радиоактивно меченых инозитолмоно- и дифосфатов в клетках НЬ-60 под действием пептидов ШЛ5Р-6 и РЕОР-6.

Концентрация пептида Включение [лН]-инозитола в инозитолмоно- и дифосфаты, % от контроля

Без стимуляции AUY При стимуляции A1F4"

HLDF-6 PEDF-6 HLDF-6 PEDF-6

Контроль 100,0±2,8% 126,1 ±6,7%

10ЛМ 97,2±7,7% 101,1±1,9% 128,3±8,1% 116,6±5,6%

lff'M 92,5±2,5% 93,3±б,6% 124,4±5,8% 114,6±2,8%*

10"5М 94,8±4,3% 91,0±6,1% 125,6±5,2% 99,5±6,7%*

* р<0,05 - достоверное различие по сравнению с контролем при стимуляции тетрафторидом алюминия.

4. Компьютерное моделирование пространственной структуры молекулы РЕОК. Регуляторная роль протеолиза связи 382Ь-383Т в молекуле РЕВЕ

Многофункциональность фактора РЕОР обусловлена наличием в молекуле, существующей в нативной конформации, одновременно нескольких активных центров, одним из которых является, как сказано выше, фрагмент ЗЯТС}УЕ1Ж35!>, соответствующий пептиду РЕОР-6. В данной части работы с помощью

компьютерного моделирования пространственной структуры молекулы PEDF показано положение этого фрагмента на поверхности белковой глобулы, а также предложен один из механизмов регуляции активности фактора, реализуемый, возможно, в живых организмах in vivo.

Фактор PEDF на основании особенностей первичной и пространственной структуры был отнесен к семейству серпинов - ингибиторов сериновых протеиназ (SERPIN - SERine Protease INhibitor), однако ингибиторным действием на сериновые протеиназы он не обладает (Steele F. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993, 90, 15261530). Подобно другим белкам семейства серпинов, молекула PEDF имеет глобулярную структуру с выступающей наружу петлей - так называемой «серпиновой петлей». В ее центральной части содержится пептидная связь 382L-3s3T; в наибольшей степени подверженная гидролитическому действию целого ряда сериновых протеиназ (Becerra S. et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 25992-25999). Функциональная значимость протеолиза молекулы по этой связи до настоящего времени оставалась невыясненной.

PBDF-6

.-fit- --■ Va ■■ л * V - .-..

СП

f

Vi

. 'л СП

V» * л^г

* mJí^T

. PEDF-6

4'кш

■ ' ^л'Х .....

л

г

V

а

Рисунок 5. Компьютерные модели пространственной структуры полноразмерной молекулы РЕОР человека (я) и «неполной» молекулы РЕЭР ('М-382Ь), образующейся при ограниченном протеолизе молекулы по связи ЗНЬ-ЗИТ (б). РЕБР-б - фрагмент '"ТСЗУЕНЯ559, соответствующий пептиду РЕВР-6; СП - «серпиновая петля», содержащая связь N - М-концевой фрагмент молекулы, экспонированный из белковой глобулы

Согласно нашим наблюдениям, фактор PEDF, находящийся в водном растворе, в ходе нескольких последовательных процедур замораживания и оттаивания препарата постепенно утрачивает дифференцирующую активность на клетках HL-60 и ЭРГ X. laevis. После 20 циклов замораживания и оттаивания активность на обоих типах клеток исчезает полностью. Анализ инактивированного таким образом препарата PEDF методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле показал, что вместо полосы с молекулярной массой 50 кДа, соответствующей PEDF, появляется полоса, соответствующая белку с молекулярной массой 46 кДа. Это указывает на то, что при многократном замораживании и оттаивании препарата PEDF происходит ограниченный протеолиз молекулы. Анализ N-концевой аминокислотной последовательности данного препарата PEDF выявил только последовательность TPLDYHLNQPFIFVLRD..., идентичную первичной структуре фрагмента 383Т-418р молекулы PEDF; в то же время известно, что на N-конце секретируемой формы PEDF находится остаток пироглутаминовой кислоты (Petersen S. et al., Biochem. J., 2003, 374, 199-206). Появление данной последовательности свидетельствует о том, что в результате многократного замораживания и оттаивания препарата PEDF происходит единственный разрыв полипептидной цепи по упомянутой выше связи 382L-383T. При отщеплении от С-концевой части молекулы фрагмента 383Т-4'8Р молекулярный вес молекулы уменьшается примерно на 4 кДа, что наблюдается при анализе данного препарата методом SDS-электрофореза.

Ранее с помощью метода кругового дихроизма было показано, что протеолиз связи в рекомбинантном PEDF приводит к некоторому изменению общей

эллиптичности, что свидетельствует о конформационных перестройках молекулы (Stratikos Е. et al., Protein Science, 1996, 5, 2575-2582). Мы предположили, что перестройки затрагивают С-концевую область молекулы, расположенную вблизи «серпиновой петли»; именно в этой области расположен фрагмент 354TQVEHR35'.

С целью проверки этого предположения была сконструирована компьютерная модель пространственной структуры молекулы полноразмерного PEDF, а также «неполной» молекулы PEDF ('M-3,2L) (Рис. 5). Модель структуры полноразмерного PEDF сконструирована на основе гомологии первичной структуры PEDF и трех белков семейства серпинов с пространственной структурой, установленной методом рентгеноструктурного анализа. Модель структуры «неполной» молекулы PEDF ('М-382L) строилась по гомологиям с этими же белками, укороченными в результате протеолиза соответствующих связей в их серпиновых петлях. Обе модели хорошо

согласуются с подобной моделью пространственной структуры полноразмерной молекулы PEDF, представленной в публикации Alberdi Е. et al. (Biochemistry, 1998, 37, 10643-10652). В частности, в ней так же, как и в построенных нами моделях, остатки 134К, 137К, 141R, 149R, 189К, 191К, 2|2Н, 2|4К, участвующие в образовании гликозаминогликан-связывающего кластера, сближены друг с другом.

Согласно представленной нами модели, в полноразмерной молекуле PEDF помимо «серпиновой петли» из глобулы экспонирована еще одна петля, состоящая из 24 аминокислотных остатков 343F-366E. Эта петля полностью включает в себя область молекулы 349К-366Е, гомологичную С-концевому участку молекулы HLDF, поэтому она получила название «HLDF-подобной петли». В середине этой петли расположен фрагмент 354TQVEHR359 (Рис. 5, а). В пространственной структуре «неполной» молекулы PEDF ('М-382Ь) эта петля отсутствует, а указанный фрагмент расположен внутри глобулы и, следовательно, не может оказывать дифференцирующее действие на клетки (Рис. 5, 6). Таким образом, конформационные перестройки молекулы PEDF при протеолизе связи 3S2L-3e3T являются причиной потери акгавности фактора на изученных нами объектах.

В данной работе впервые показана регуляторная роль протеолиза связи 382L-383Т в «серпиновой петле» молекулы PEDF. Аминокислотные остатки, входящие в состав фрагмента 383т-418р, отделяемого при протеолизе данной связи, участвуют в поддержании нативной конформации молекулы. Действительно, согласно данным Shao Н. et al. (Eur. J. Biochem., 2003, 270, 822-831), при точечных мутациях отдельных остатков фрагмента Т- Р нарушается секреция PEDF из клеток-продуцентов вследствие измененной конформации молекулы.

На основании результатов экспериментов на ЭРГ X. laevis (см. выше), можно сказать, что «HLDF-подобная петля» PEDF, содержащая фрагмент 354TQVEHR359, выполняет двоякую роль при индукционном действии фактора на эмбриональную ткань: с одной стороны, данный фрагмент индуцирует образование клеток крови, с другой стороны - остатки, входящие в состав петли, выполняют вспомогательную роль при индукции нервных тканей под действием фрагмента молекулы 78V-12IT. Взаимодействие PEDF с ЭРГ имеет более сложный характер, чем в случае опухолевых клеток, поскольку в составе ЭРГ имеются клетки, находящиеся на разных стадиях развития. Возможно, расщепление связи 382L-383T в молекуле PEDF является одним из регуляторных механизмов, обеспечивающим проявление качественно разных активностей PEDF на клетках, находящихся на разных стадиях.

5. Роль фактора РБОР в индукционном действии стекловидного тела глаза быка на эктодерму эмбрионов Хепория 1аеп&.

Фактор РЕОР экспрессируется в большинстве тканей млекопитающих и птиц. Для выделения природного биологически активного РЕОР в большинстве случаев используются среды, наиболее богатые этим фактором - культуральная среда клеток пигментного эпителия и стекловидное тело глаза.

Стекловидное тело, ввиду многообразия содержащихся в нем белковых факторов, оказывает целый комплекс индукционных воздействий на ЭРГ X. 1ает5. Под его влиянием в эксплантатах возникают, главным образом, нервные ткани и различные ткани мезодермального происхождения (поперечнополосатые мышцы, клетки крови и мезенхимы). Мы показали, что препарат очищенного фактора РЕОР оказывает два типа индукционных воздействий на ЭРГ - вызывает главным образом формирование нервных образований и небольшого количества клеток крови. Представляло интерес выяснение роли фактора РЕОР в нейроиндукционной активности стекловидного тела: является ли он основным белком, вызывающим индукцию нейрональных тканей, или же их образование определяется также наличием в составе стекловидного тела других белков.

Известно, что гомология первичных структур РЕОР человека и быка составляет 88,6%. Это дало нам возможность использовать поликлональные кроличьи антитела, специфические к РЕОР человека, для блокирования РЕОР в составе стекловидного тела быка. Препарат очищенных антител использовали в разведениях 1:1000 и 1:3000 (концентрация белка в исходном препарате - 50 мг/мл). Предварительно было показано, что данные антитела не обладают собственным индукционным действием на ЭРГ.

В присутствии антител индукция нервных образований под действием стекловидного тела не наблюдалась (Табл. 7). В то же время происходило усиление индукции тканей мезодермального происхождения (поперечнополосатых мышц, клеток крови и мезенхимы): количество клеток данных типов на гистологических срезах эксплантатов, обработанных стекловидным телом в присутствии антител, было значительно большим.

Таблица 7. Клеточные типы, образующиеся в эксплантатах ЭРГ X. /аеук под действием стекловидного тела глаза быка. Влияние поликлональных специфических антител против РЕОР на индукционное действие стекловидного тела.

Индуктор дифференцировки Общее число эксплантатов Число эксплантатов, содержащих данные типы тканей

Нервные ткани Ткани мезодермального происхождения

мезенхима поперечнополосатые мышцы клетки крови

Стекловидное тело (контроль) 15 12 15 13 7

Стекловидное тело + антитела (1:1000)* И 0 11 11 6

Стекловидное тело + антитела (1:3000)* 12 0 12 И 5

* Препарат очищенных антител использовали в разведении 1:1000 или 1:3000. Концентрация белка в исходном препарате - 50 мг/мл.

Следовательно, PEDF является единственным фактором в составе стекловидного тела, индуцирующим образование в ЭРГ нервных тканей. Усиление индукции образования тканей мезодермального происхождения при блокировании действия PEDF происходит, вероятно, потому, что присутствующие в стекловидном теле мезодермализующие факторы конкурируют с PEDF связывание с клетками ЭРГ.

Существует ряд врожденных зрительных патологий, при которых наблюдается избыточное образование кровеносных сосудов в сетчатке и их врастание в стекловидное тело, такие как диабетическая ретинопатия и ретинопатия недоношенных детей. В стекловидном теле пациентов, страдающих этими патологиями, отмечается значительное снижение уровня PEDF (Tombran-Tink J., Barnstable С., Trends Mol. Med., 2003, 6, 244-250). Известно, что эндотелиальные клетки, формирующие кровеносные сосуды, имеют мезодермальное происхождение в эмбриогенезе. Поскольку при блокировании действия PEDF в стекловидном теле с помощью антител происходит усиление индукции мезодермальной дифференцировки эмбриональной ткани, то, очевидно, при снижении уровня PEDF в стекловидном теле эмбриона происходит усиленная индукция образования эндотелиальных клеток в прилежащих тканях, прежде всего, в сетчатке. Это, в свою очередь, ведет к аномальному разрастанию сосудов и, следовательно, к нарушениям зрения.

ВЫВОДЫ:

1. Идентифицированы гомологичные фрагменты молекул факторов дифференцировки HLDF и PEDF. Показано, что данные фрагменты отвечают за дифференцирующее действие факторов на клетки линии HL-60 и эктодерму эмбрионов Xenopus laevis на стадии ранней гаструлы.

2. Установлено протекторное действие гомологичных гексапегггадов TGENHR (HLDF-6) и TQVEHR (PEDF-6) на клетки Пуркинье червя мозжечка крыс при индуцированной химической гипоксии. Показано восстановление под действием данных пептидов поведенческих реакций крыс, нарушаемых при гипоксии червя мозжечка in vivo.

3. Показано, что пептид TGENHR увеличивает количество клеток линии HL-60, жизнеспособных в условиях индуцированной химической гипоксии, в то время как пептид TQVEHR не обладает подобным действием.

4. Установлено различное действие пептидов TGENHR и TQVEHR на системы биосинтеза вторичных мессенжеров в клетках HL-60. Пептид TGENHR ингибирует активность аденилатциклазы, пептид TQVEHR понижает активность фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С при ее стимуляции тетрафторидом алюминия.

5. С помощью компьютерного моделирования пространственной структуры молекулы PEDF показана локализация фрагмента 3*TQVEHR359, отвечающего за действие фактора на клетки линии HL-60. Предположена регуляторная роль протеолиза связи 382l-383T в молекуле PEDF.

6. Установлено, что PEDF является единственным фактором в составе стекловидного тела глаза, вызывающим индукцию нервных образований в эмбриональной ткани.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Костанян И.А., Жохов С.С., Астапова М.В., Драницына С.М., Богачук А.П., Байдакова Л.К., Родионов И.Л., Баскин И.И., Голубева О.Н., Томбран-Тинк Дж., Липкин В.М. Биологическая роль фрагмента нейротрофного фактора из пигментного эпителия: структурно-функциональная гомология с фактором дифференцировки клеток линии HL-60. Биоорганическая химия, 2000, т. 26, стр. 563-570.

2. Голубева О.Н., Костанян И.А., Жохов С.С., Томбран-Тинк Дж., Липкин В.М. Роль нейротрофного фактора дифференцировки из пигментного эпителия в индукционной активности стекловидного тела. Доклады Академии Наук, 200!, т. 376, стр. 407-410.

3. Костанян И.А., Жохов С.С., Астапова М.В., Баскин И.И., Голубева О.Н., Липкин В.М., Томбран-Тинк Дж. Регуляторная роль С-концевого фрагмента PEDF. Тезисы II Биофизического конгресса, Москва, 23-27 августа 1999 года. Москва, 1999, т. 1, стр. 43.

4. Костанян И.А., Жохов С.С., Астапова М.В., Драницына С.М., Богачук А.П., Байдакова Л.К., Родионов И.Л., Баскин И.И., Голубева О.Н., Томбран-Тинк Дж., Липкин В.М. Биологическая роль фрагмента нейротрофного фактора из пигментного эпителия: структурно-функциональная гомология с фактором дифференцировки клеток линии HL-60. Тезисы международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии - 2000 (ГГ+МЕ'2000), Украина, Крым, Гурзуф, 1-10 июня 2000 года, стр. 72.

& Kostanyan I.A., Zhochov S.S., Astapova M.V., Bogachuk A.P, Lipkin V.M., Baskin I.I., Golubeva O.N., Tombran-Tink J. The structural and functional homology between PEDF and HLDF. The regulatory role of serpin loop in PEDF function. European Journal of Neuroscience, 2000, Vol. 12, Supplement 11, p. 329.

6. Жохов C.C., Артамонов И.Д., Костанян И.А., Астапова М.В., Баскин И.И., Голубева О.Н., Липкин В.М. Функциональная роль «HLDF-подобной петли» нейротрофного фактора дифференцировки PEDF. Тезисы научных докладов, III Съезд Биохимического Общества, Санкт-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002 года, стр. 373.

7. Костанян И.А., Жохов С.С., Астапова М.В., Молотковская И.М., Сторожева З.И., Пропган А.Т., Липкин В.М. Сравнительное изучение молекулярных механизмов действия гомологичных гексапептидов HLDF-6 и PEDF-6. Тезисы научных докладов, III Съезд Биохимического Общества, Санкт-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002 года, стр. 547.

8. Жохов С.С., Костанян И.А., Астапова М.В., Артамонов И.Д., Голубева О.Н., Баскин И.И., Сторожева З.И., Липкин В.М. Факторы дифференцировки HLDF и PEDF человека. Механизмы биологического действия гомологичных гексапептидов TGENHR и TQVEHR. Тезисы докладов VI чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, Москва - Пущино, 25 ноября -2 декабря 2002 года, стр. 57.

9. Жохов С.С., Костанян И.А., Гибанова Н.В., Сурина Е.А., Сторожева З.И., Пропшн А.Т., Липкин В.М. Гомологичные гексапептиды HLDF-6 и PEDF-6, обладающие дифференцирующим и нейропротекторным действием. Тезисы докладов Российского симпозиума по химии и биологии пептидов, Москва, 17-19 ноября 2003 г., стр. 22.

§20 903

Подписано в печать 05.12.2003 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 пл. Тираж 75 экз. Заказ №114 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к.102

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ:ФАКТОР ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ РЕБР, ОБЛАДАЮЩИЙ НЕЙРОТРОФНЫМ И АНТИАНГИОГЕННЫМ

ДЕЙСТВИЕМ.

1. Идентификация фактора РЕБР в различных типах клеток.

1.1. Идентификация РЕББ в культуральной среде клеток пигментного эпителия сетчатки глаза человека.

1.2. Идентификация РЕОР (ЕРС-1) в культуре легочных фибробластов. Зависимость уровня экспрессии РЕОР от возраста клеточной культуры.

1.3. Идентификация РЕОР мыши (каспина - коллаген-связывающего серпина).

2. Особенности структуры РЕОР и кодирующего его гена.

2.1. Установление первичной структуры РЕОР человека и его кДНК.

2.2. Принадлежность РЕОР к семейству неингибиторных серпинов.

2.3. Наличие в РЕОР связи, высокочувствительной к действию сериновых протеиназ.

2.4. Асимметричное расположение положительных и отрицательных зарядов в молекуле РЕОР. Кристаллическая структура РЕОР.

2.5. Строение и свойства гена рей/человека.

2.6. Распространенность и эволюционная консервативность фактора РЕОР.

2.7. Рекомбинантный РЕОР.

3. Дифференцирующее действие РЕОР и его влияние на метаболизм.

3.1. Дифференцирующее действие РЕОР на эмбриональные ткани. Влияние РЕОР на метаболизм глиальных клеток.

3.2. Дифференцирующее действие РЕОР на опухолевые клетки.

3.3. Влияние РЕОР на накопление меланина и активность тирозиназы в клетках пигментного эпителия сетчатки глаза.

4. Нейропротекторное действие РЕОР.

4.1. Протекторное действие РЕОР на нейроны сетчатки глаза.

4.2. Протекторное действие РЕОР на гранулярные клетки мозжечка крыс.

4.3. Протекторное действие РЕОР на нейроны гиппокампа.

4.4. Протекторное действие РЕОР на двигательные нейроны спинного мозга.

5. Антиангиогенное действие РЕОР.

5.1. Корреляция уровня РЕОР и УЕОР с ангиогенезом в сетчатке. Влияние содержания кислорода в окружающей среде на экспрессию РЕОР.

5.2. Изменения уровня РЕОР при зрительных патологиях, связанных с избыточным ангиогенезом.

5.3. Возможные механизмы антиангиогенного действия РЕОБ.

6. Взаимосвязь между структурой и функциональными свойствами РЕОР. Идентификация рецептора РЕОР.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Идентификация гомологичных фрагментов молекул факторов НЬОР и РЕОР, отвечающих за их дифференцирующее действие на клетки НЬ-60 и эктодерму эмбрионов Хепория ¡аеугя на стадии ранней гаструлы.

1.1. Структурная гомология фрагментов молекул факторов НЬОР и РЕОР. Сравнительное изучение дифференцирующего действия факторов НЬОР и РЕОР на клетки линии НЬ-60.

1.2. Сравнительное изучение индукционного действия факторов НЬОР и РЕОР, а также пептидов НЬОР-6 и РЕОР-6 на эктодерму эмбрионов^ \ae\is.

2. Сравнительное изучение протекторного действия пептидов НЬОР-6 и РЕОБ-б на нейроны червя мозжечка крыс и клетки линии НЬ-60 при индуцированной химической гипоксии.

2.1. Протекторное действие пептидов на клетки червя мозжечка крыс. Восстановление под действием пептидов поведенческих реакций, нарушаемых при химической гипоксии червя мозжечка.

2.2. Влияние пептидов НЬОР-6 и РЕОР-6 на выживаемость клеток линии НЬ-60 при индуцируемой химической гипоксии.

3. Изучение молекулярных механизмов действия пептидов НЬВР-6 и РЕЭР-б на клетки линии НЬ-60.

3.1. Определение характера взаимодействия пептидов с клетками. Влияние пептидов на подвижность липидов в мембранных системах.

3.2. Влияние пептидов Н1ЛЗР-6 и РЕОР-б на активность аденилатциклазы в клетках линии НЬ-60 и выделенных клеточных мембранах.

3.3. Влияние пептидов НЫ)Р-6 и РЕЭР-б на активность фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С.

4. Компьютерное моделирование пространственной структуры РЕОР. Регуляторная роль протеолиза связи

382Ь383Т в молекуле РЕЭР.

5. Роль фактора РЕОР в индукционном действии стекловидного тела глаза быка на эктодерму эмбрионов Хепорш \ae\is.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ).

1. Материалы.

1.1. Реактивы.

1.2. Сорбенты.

1.3. Протеолитические ферменты.

1.4. Факторы дифференцировки, антитела, клеточные линии.

1.5. Буферные растворы.

1.6. Растворы для индукции дифференцировки эмбрионов Хепорш 1аеч1з и гистологической обработки тканей.

2. Методы.

2.1. Культивирование клеток линии НЬ-60.

2.2. Определение дифференцирующей активности.

2.3. Исчерпывающий гидролиз белков смесью трипсина и а-химотрипсина.

2.4. Синтез пептидов.

2.5. Дополнительная хроматографическая очистка синтезированных пептидов.

2.6. Индукция дифференцировки эктодермы эмбрионов Хепорш \aevis на стадии ранней гаструлы.

2.7. Гистологическая обработка дифференцированной эктодермы Хепорш 1аеУ1Я.

2.8. Содержание экспериментальных животных.

2.9. Изучение влияния пептидов на поведенческие реакции крыс, зависимые от функций червя мозжечка.

2.10. Определение количества гиперхромных клеток Пуркинье червя мозжечка крыс.

2.11. Определение количества жизнеспособных клеток HL-60 методом МТТ-теста.

2.12. Радиолигандный анализ.

2.13. Получение липосом, содержащих флуоресцентный зонд.

2.14. Изучение влияния пептидов на анизотропию поляризации флуоресценции зонда в липосомах.

2.15. Хроническая морфинизация клеток HL-60.

2.16. Выделение и солюбилизация мембран клеток HL-60.

2.17. Изучение влияния пептидов на активность аденилатциклазы в клетках HL-60 и препарате выделенных мембран клеток HL-60.

2.18. Определение количества цАМФ в пробах.

2.19. Определение внутриклеточной концентрации инозитолмоно- и дифосфатов в клетках линии HL-60.

2.20. Выделение стекловидного тела глаза быка.

2.21. Измерение концентрации белка методом Бредфорд.

2.22. Определение N-концевых аминокислотных последовательностей.

2.23. SDS-электрофорез белков в полиакриламидном геле.

2.24. Компьютерное моделирование пространственной структуры молекулы PEDF.

2.25. Статистическая обработка экспериментальных результатов.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Одной из актуальных проблем современной биоорганической химии является поиск и структурно-функциональные исследования новых белковых факторов дифференцировки. Нарушение процессов нормального созревания клеток и их превращения в дифференцированные, функционально активные формы является ключевой стадией патогенеза многих злокачественных новообразований. Вещества, индуцирующие дифференцировку клеток, находят широкое применение в терапии опухолей как сами по себе, так и в сочетании с цитостатиками - агентами, вызывающими гибель делящихся клеток.

Как правило, белковые факторы дифференцировки представляют собой относительно крупные молекулы. Для многих из них помимо способности индуцировать дифференцировку клеток показано наличие целого ряда других биологических активностей. К таким многофункциональным факторам дифференцировки относятся факторы HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor) и PEDF (Pigment Epithelium-Derived Factor).

Фактор HLDF с молекулярной массой 8,2 кДа ингибирует пролиферацию клеток промиелоцитарной лейкемической линии человека HL-60 и индуцирует их дифференцировку в зрелые гранулоциты, а также повышает выживаемость клеток этой линии при различных повреждающих воздействиях. Фактор PEDF с молекулярной массой 50,1 кДа является фактором дифференцировки опухолевых клеточных линий нейронального происхождения и эмбриональных нейронов. Он также обладает нейропротекторным и антиангиогенным действием, является регулятором клеточного цикла и апоптоза. При сравнительном компьютерном анализе первичных структур факторов HLDF и PEDF были обнаружены гомологичные области молекул этих факторов; данная область фактора HLDF содержит фрагмент, отвечающий за его дифференцирующее и протекторное действие.

Установление взаимосвязи структурных особенностей белка и его функциональных характеристик имеет принципиальное значение для понимания молекулярных механизмов его функционирования. Перспективным подходом для изучения белков с широким спектром активностей является исследование их коротких фрагментов, обладающих биологической активностью.

Данная работа является частью структурно-функциональных исследований, проводимых в лаборатории белков гормональной регуляции Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, направленных на изучение механизмов действия фактора дифференцировки НЬЭР и пептида НЬБР-б, соответствующего фрагменту молекулы НЬЭР 41ТСЕ>ЩК46, обеспечивающему его дифференцирующую активность, а также гомологичных белков и их фрагментов.

Целью данной работы явилось сравнительное изучение функциональной роли гомологичных фрагментов молекул факторов НЬБИ и РЕОИ при их действии на различные биологические объекты.

Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю, кандидату химических наук И.А. Костанян и заведующему лабораторией белков гормональной регуляции, члену-корреспонденту РАН В.М. Липкину за постоянное внимание к данной работе и помощь в ее проведении, а также кандидату химических наук И.Д. Артамонову, кандидатам биологических наук О.Н. Голубевой и З.И, Сторожевой за помощь, поддержку и ценные советы в работе. Автор также признателен кандидату химических наук И.Л. Родионову за синтез пептидов.

ФАКТОР ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ РЕОЕ, ОБЛАДАЮЩИЙ НЕЙРОТРОФНЫМ И АНТИАНГИОГЕННЫМ ДЕЙСТВИЕМ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Фактор PEDF (Pigment Epithelium-Derived Factor - фактор, выделенный из пигментного эпителия) был впервые идентифицирован в культуральной среде клеток пигментного эпителия сетчатки глаза. К настоящему времени известно, что этот белок экспрессируется почти во всех тканях млекопитающих и птиц и выполняет множество функций. К числу функций PEDF относится:

1) дифференцирующее действие на эмбриональные и опухолевые клетки;

2) протекторное действие на зрелые нейроны и другие клетки, входящие в состав нервной ткани; 3) антиангиогенная активность - ингибирование образования новых сосудов.

Многофункциональность и широкая распространенность фактора PEDF явилась причиной того, что он был идентифицирован и выделен из различных источников независимо несколькими группами ученых. Вследствие этого он изначально получил разные названия.

выводы.

1. Идентифицированы гомологичные фрагменты молекул факторов дифференцировки HLDF и PEDF. Показано, что данные фрагменты отвечают за дифференцирующее действие факторов на клетки линии HL-60 и эктодерму эмбрионов Xenopus laevis на стадии ранней гаструлы.

2. Установлено протекторное действие гомологичных гексапептидов TGENHR (HLDF-6) и TQVEHR (PEDF-6) на клетки Пуркинье червя мозжечка крыс при индуцированной химической гипоксии. Показано восстановление под действием данных пептидов поведенческих реакций крыс, нарушаемых при гипоксии червя мозжечка in vivo.

3. Показано, что пептид TGENHR увеличивает количество клеток линии HL-60, жизнеспособных в условиях индуцированной химической гипоксии, в то время как пептид TQVEHR не обладает подобным действием.

4. Установлено различное действие пептидов TGENHR и TQVEHR на системы биосинтеза вторичных мессенжеров в клетках HL-60. Пептид TGENHR ингибирует активность аденилатциклазы, пептид TQVEHR понижает активность фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С при ее стимуляции тетрафторидом алюминия.

5. С помощью компьютерного моделирования пространственной структуры молекулы PEDF показана локализация фрагмента 354TQVEHR359, отвечающего за действие фактора на клетки линии HL-60. Предположена регуляторная роль протеолиза связи L- Т в молекуле PEDF.

6. Установлено, что PEDF является единственным фактором в составе стекловидного тела глаза, вызывающим индукцию нервных образований в эмбриональной ткани.

1. Tombran-Tink J., Johnson L.V. Neuronal differentiation of retinoblastoma cells induced bymedium conditioned byhuman RPE cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1989, Vol. 30, p. 1700-1707.

2. T ombran-Tink J., C hader G .J., Johnson L .V. P EDF: a p igment epithelium-derived factor with potent neuronal differentiative activity. Exp. Eye Res., 1991, Vol. 53, p. 411-414.

3. Cunha-Vaz J.G. The blood-ocular barriers. Surv. Ophthalmol., 1979, Vol. 23, p. 279-296.

4. Miller S., Steinberg R.H. Potassium transport across the frog retinal pigment epithelium. J. Membr. Biol., 1982, Vol. 67, p. 199-209.

5. Zinn K.M., Benjamin-Henkind J.V. In The Retinal Pigment Epithelium, ed. K.M. Zinn and M.F. Marmor, Harvard University Press, Cambridge, 1979, p. 3-31.

6. Schweigerer L., Malerstein B., Neufeld G., Gospodarovicz D. Basic fibroblast growth factor is synthesized in cultured retinal pigment epithelial cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, Vol. 143, p. 934-940.

7. Campochiaro P.A., Suggs R., Grotendorst G., Hjelmeland L. Retinal pigment epithelial cells produce PDGF-like proteins and secrete them into their media. Exp. Eye Res., 1989, Vol. 49, p. 217-227.

8. Steele F., Chader G.J., Johnson L.V., Tombran-Tink J. Pigment epithelium-derived factor: Neurotrophic activity and identification as a member of the serine protease inhibitor gene family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, Vol. 90, p. 15261530.

9. Tombran-Tink J., Li A., Johnson M.A., Johnson L.V., Chader G.J. Neurotrophic activity of interphotoreceptor matrix on human Y79 retinoblastoma cells. J. Comp. Neurol., 1992, Vol. 317, p. 175-186.

10. Wu Y-Q., Notario V., Chader G.J., Becerra S.P. Identification of pigment epithelium-derived factor in the interphotoreceptor matrix of bovine eyes. Protein Expr. Purif., 1995, Vol. 6, p. 447-456.

11. Pignolo R.J., Cristofalo V.J., Rotenberg M.O. Senescent WI-38 cells fail to express EPC-1, a gene induced in young cells upon entry into the Go state. J. Biol. Chem., 1993, Vol. 268, p. 8949-8957.

12. Tresini M., Mawal-Dewan M., Cristofalo V.J., Sell C. A phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor induces a senescent-like growth arrest in human diploid fibroblasts. Cancer Res., 1998, Vol. 58, p. 1-4.

13. Coljee V.W., Rotenberg M.O., Tresini M., Francis M.K., Cristofalo V.J., Sell C. Regulation of EPC-1/PEDF in normal human fibroblasts is posttranscriptional. J. Cell. Biochem., 2000, Vol. 79, p. 442-452.

14. Pignolo R.J., Francis M.K., Rotenberg M.O., Cristofalo V.J. Putative role for EPC-1/PEDF in the GO growth arrest of human diploid fibroblasts. J. Cell. Physiol., 2003, Vol. 195, p. 12-20.

15. Grove G.L., and Cristofalo V.J. Characterization of the cell cycle of cultured human diploid cells: effects of aging and hydrocortisone. J. Cell. Physiol., 1977, Vol. 90, p. 415-422.

16. Ross J. Control of messenger RNA stability in higher eukaryotes. Trends Genet., 1996, Vol. 12, p. 171-175.

17. Tombran-Tink J., Shivaram S.M., Chader G.J., Johnson L.V., Bock D. Expression, secretion and age-related downregulation of pigment epithelium-derived factor, a serpin with neurotrophic activity. J. Neurosci., 1995, Vol. 15, p. 4992-5003.

18. Palmieri D. Watson J.M., Rinehart C.A. Age-related expression of PEDF/EPC-1 in human endometrial stromal fibroblasts: implications for interactive senescence. Exp. Cell Res., 1999, Vol. 247, p. 142-147.

19. Martin G.M., Sprague C.A., Epstein C.J. Replicative lifespan of cultivated human cells. Effect of donor age, tissue, and genotype. Lab. Invest., 1970, Vol. 23, p. 86-92.

20. Boyd J. A., Kaufman D.G. Expression of transforming growth factor beta 1 by human endometrial carcinoma cell lines: inverse correlation with effects on growth rate and morphology. Cancer Res., 1990, Vol. 50, p. 3394-3399.

21. Stratikos E., Alberdi E., Gettins P.G., Becerra S.P. Recombinant human pigment epithelium-derived factor (PEDF): characterization of PEDF overexpressed and secreted by eukaryotic cells. Protein Sci., 1996, Vol. 5, p. 2575-2582.

22. Petersen S.V., Valnickova Z., Enghild J.J. Pigment-epithelium-derived factor (PEDF) occurs at a physiologically relevant concentration in human blood: purification and characterization. Biochem. J., 2003, Vol. 374, p. 199-206.

23. Carrell R.W., Pemberton P.A., Boswell D.R. The serpins: evolution and adaptation in a family of protease inhibitors. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1987, Vol. 52, p. 527-535.

24. Travis J., Salvesen G.S. Human plasma proteinase inhibitors. Annu Rev. Biochem., 1983, Vol. 52, p. 655-709.

25. Huber R., C arrell R .W. Implications of the three-dimensional structure o f alpha 1-antitrypsin for structure and function of serpins. Biochemistry, 1989, Vol. 28, p. 8951-8966.

26. Hunt L.T., Dayhoff M.O. A surprising new protein superfamily containing ovalbumin, antithrombin-III, and alpha 1-proteinase inhibitor. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1980, Vol. 95, p. 864-871.

27. Tone M., Kikuno R., Kume-Iwaki A., Hashimoto-Gotoh T. Structure of human alpha 2-plasmin inhibitor deduced from the cDNA sequence. J. Biochem. (Tokyo), 1987, Vol. 102, p. 1033-1041.

28. Perez-Mediavilla L.A., Chew C., Campochiaro P.A., Nickells R.W., Notario V., Zack D.J., Becerra S.P. Sequence and expression analysis of bovine pigment epithelium-derived factor. Biochim. Biophys. Acta, 1998, Vol. 1398, p. 203-214.

29. Becerra S.P., Palmer I., Kumar A., Steele F., Shiloach J., Notario V., Chader G.J. O verexpression o f fetal h uman p igment epithelium-derived factor i n E scherichia coli. J. Biol. Chem., 1993, Vol. 268, p. 23148-23156.

30. Marshall C.J. Evolutionary relationships among the serpins. Phil. Trans. Soc. Lond. B, 1993, Vol. 342, p. 101-119.

31. Doolittle R.F. Angiotensinogen is related to the antitrypsin-antithrombin-ovalbumin family. Science, 1983, Vol. 222, p. 417-419.

32. Evans D.L., McGrogan M., Scott R.W., Carrell R.W. Protease specificity and heparin binding and activation of recombinant protease nexin I. J. Biol. Chem., 1991, Vol. 266, p. 22307-22312.

33. Monard D., Niday E., Limat A., Soloman F. Inhibition of protease activity can lead to neurite extension in neuroblastoma cells. Prog. Brain Res., 1983, Vol. 58, p. 359-364.

34. Becerra S.P., Sagasti A., Spinella P., Notario V. Pigment epithelium-derived factor behaves like a noninhibitory serpin. Neurotrophic activity d oes not require the serpin reactive loop. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, p. 25992-25999.

35. Shao H., Schvartz I., Shaltiel S. Secretion of pigment epithelium-derived factor. Mutagenic study. Eur. J. Biochem., 2003, Vol. 270, p. 822-831.

36. Alberdi E., Hyde C.C., Becerra S.P. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) binds to glycosaminoglycans: analysis of the binding site. Biochemistry, 1998, Vol. 37, p. 10643-10652.

37. Meyer C., Notari L., Becerra S.P. Mapping the type I collagen binding site on pigment epithelium-derived factor. Implications for its antiangiogenic activity. J. Biol. Chem., 2002, Vol. 277, p. 45400-45407.

38. Yasui N., Mori T., Morito D., Matsushita O., Kourai H., Nagata K., Koide T. Dual-site recognition of different extracellular matrix components by anti-angiogenic/neurotrophic serpin, PEDF. Biochemistry, 2003, Vol. 42, p. 3160-3167.

39. Simonovic M., Gettings P.G., Volz K. Crystal structure of human PEDF, a potent antiangiogenic and neurite-growth-promoting factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, Vol. 98, p. 11131-11135.

40. Sweeney S.M., Guy C.A., Fields J.B., San Antonio J.D. Defining the domains of type I collagen involved in heparin- binding and endothelial tube formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, Vol. 95, p. 7275-7280.

41. Tombran-Tink J., Pawar H., Swaroop A., Rodriguez I., Chader G.J. Localization of the gene for pigment epithelium-derived factor (PEDF) to chromosome 17pl3.1 and expression in cultured human retinoblastoma cells. Genomics, 1994, Vol. 19, p. 266-272.

42. Isobe M., Emanuel B.S., Givol D., Oren M., Croce C.M. Localization of the gene for human p53 tumor antigen to band 17p 13. Nature, 1986, Vol. 320, p. 84-86.

43. McDonald J.D., Danehsvar L., Willert J.R., Matsumura K., Waldman F., Cogen P.H. Physical mapping of chromosome 17pl3.3 in the region of a putative tumor suppressor gene important in medulloblastoma. Genomics, 1994, vol. 23, p. 229-232.

44. Matsuda M., Tanaka S., Nagata S., Kojima A., Kurata T., Shibuya M. Two species of human CRK cDNA encode proteins with distinct biological activities. Mol. Cell. Biol., 1992, Vol. 12, p. 3482-3489.

45. Phillips N.J., Ziegler M., Radford D.M., Fair K.L., Steinbrueck T., Xynos F.P., Donis-Keller H. Allelic deletion on chromosome 17pl3.3 in early ovarian cancer. Cancer Res., 1996, Vol. 56, p. 606-611.

46. Pignolo R.J., Rotenberg M.O., Cristofalo V.J. Analysis of EPC-1 growth state-dependent expression, specificity, and conservation of related sequences. J. Cell. Physiol., 1995, Vol. 162, p. 110-118.

47. Bilak M.M., Corse A.M., Bilak S.R., Lehar M., Tombran-Tink J., Kuncl R.W. Pigment epithelium-derived factor protects motor neurons from chronic glutamate-mediated degeneration. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 1999, Vol. 58, p. 719728.

48. Karakousis P., John C., Behling K., Surace E., Smith J., Hendrickson A., Tang W.-X, Bennett J., Milam A.H. Localization of pigment epithelium derived factor (PEDF) in developing and adult human ocular tissues. Mol. Vis., 2001, Vol. 7, p. 154163.

49. Wu Y-Q., Becerra S.P. Proteolytic activity directed towards pigment epithelium-derived factor in vitreous humor of bovine eyes: implications of proteolytic processing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1996, Vol. 37, 1984-1993.

50. Houenou L.J., D'Costa A.P., Linxi L., Turgeon V.L., Enyadike C., Alberdi E., Becerra S.P. Pigment epithelium-derived factor promotes the survival and differentiation of developing spinal motor neurons. J. Comp. Neurol., 1999, Vol. 412, p. 506-514.

51. Jablonski M.M., Tombran-Tink J., Mrazek D.A., Iannaccone A. Pigment epithelium-derived factor supports normal development of photoreceptor neurons and opsin expression after retinal pigment epithelium removal. J. Neurosci., 2000, Vol. 20, p. 7149-7157.

52. Jablonski M.M., Tombran-Tink J., Mrazek D.A., Iannaccone A. Pigment epithelium-derived factor supports normal Müller cell development and glutamine synthetase expression after removal of the retinal pigment epithelium. Glia, 2001, Vol. 35, p. 14-25.

53. Sugita Y., Becerra S.P., Chader G.J., Schwartz J.P. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) has direct effect on the metabolism and proliferation of microglia and indirect effect on astrocytes. J. Neurosci. Res., 1997, Vol. 49, p. 710-718.

54. Brodeur G.M., Maris J.M., Yamashiro D.J., Hogarty M.D., White P.S. Biology and genetics of neuroblastomas. J. Pediatr. Hematol. Oncol., 1997, Vol. 19, p. 93-101.

55. Linet M.S., Ries L.A., Smith M.A., Tarone R.E., Devesa S.S. Cancer surveillance series: recent trends in childhood cancer incidence and mortality in the United States. J. Natl. Cancer Inst., 1999, Vol. 91, p. 1051-1058.

56. Brodeur G.M. Schwann cells as antineuroblastoma agents. New Engl. J. Med., 1996, Vol. 334, p. 1537-1539.

57. Guillery R.W. Neural abnormalities in albinos. Trends Neurosci., 1986, Vol. 9, p. 364-367.

58. Abul-Hassan Kh., Walmsley R., Tombran-Tink J., Boulton M. Regulation of tyrosinase expression and activity in cultured human retinal pigment epithelial cells. Pigment Cell Res., 2000, Vol. 13, p. 436-441.

59. Cayouette M., Smith S.B., Becerra S.P., Gravel C. Pigment epithelium-derived factor delays the death of photoreceptors in mouse models of inherited retinal degenerations. Neurobiol. Dis., 1999, Vol. 6, p. 523-532.

60. Cao W., Tombran-Tink J., Chen W., Mrazek D., Elias R., McGinnis J.F. Pigment epithelium-derived factor protects cultured retinal neurons against hydrogen peroxide-induced cell death. J. Neurosci. Res., 1999, Vol. 57, p. 789-800.

61. Taniwaki T., Becerra S.P., Chader G.J., Schwartz J.P. Pigment epithelium-derived factor is a survival factor for cerebellar granule cells in culture. J. Neurochem., 1995, Vol. 64, p. 2509-2517.

62. Araki T., Taniwaki T., Becerra S.P., Chader G.J., Schwartz J.P. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) differently protects immature but not mature cerebellar granule cells against apoptotic cell death. J. Neurosci. Res., 1998, Vol. 53, p. 7-15.

63. Taniwaki T., Hirashima N., Becerra S.P., Chader G.J., Etcheberrigaray R., Schwartz J.P. Pigment epithelium-derived factor protects cultured cerebellar granule cells against glutamate-induced neurotoxicity. J. Neurochem., 1997, Vol. 68, p. 26-32.

64. DeCoster M.A., Schabelman E., Tombran-Tink J., Bazan N.G. Neuroprotection by pigment epithelium-derived factor against glutamate toxicity in developing primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res., 1999, Vol. 56, p. 604-610.

65. Tombran-Tink J. Function, age-related expression and molecular characterization of PEDF, a neurotrophic serpin secreted by human RPE cells. Degenerative Diseases of the Retina, Edited by Robert E. Anderson et al., Plenum Press, New York, 1995.

66. Yamashita H., Horie K., Yamamoto T., Nagano T., Hirano T. Light-induced retinal damage in mice. Hydrogen peroxide production and superoxide dismutase activity in retina. Retina, 1992, Vol. 12, p. 59-66.

67. Clement M.V., Ponton A., Pervaiz S. Apoptosis induced by hydrogen peroxide is mediated by decreased superoxide anion concentration and reduction of intracellular milieu. FEBS Lett., 1998, Vol. 440, p. 13-18.

68. Yabe T., Wilson D., Schwartz J.P. NF-kappaB activation is required for the neuroprotective effects of pigment epithelium-derived factor (PEDF) on cerebellar granule neurons. J. Biol. Chem., 2001, Vol. 276, p. 43313-43319.

69. Mao X., Barger S.W. Neuroprotection by dehydroepiandrosterone-sulfate: role of an NFkappaB-like factor. Neuroreport, 1998, Vol. 9, p. 759-763.

70. Tamatani M., Mitsuda N., Matsuzaki H., Okado H., Miyake S., Vitek M.P., Yamaguchi A., Tohyama M. A pathway of neuronal apoptosis induced by hypoxia/reoxygenation: roles of nuclear factor-kappaB and Bcl-2. J. Neurochem., 2000, Vol. 75, p. 683-693.

71. Choi J.S., Kim J.A., Kim D.H., Chun M.H., Gwag B.J., Yoon S.K., Joo C.K. Failure to activate N F-kappaB promotes apoptosis of retinal g anglion c ells following optic nerve transection. Brain Res., 2000, Vol. 883, p. 60-68.

72. Post A., Crochemore C., Uhr M., Holsboer F., Behl C. Differential induction of NF-kappaB activity and neural cell death by antidepressants in vitro. Eur. J. Neurosci., 2000, Vol. 12, p. 4331-4337.•

73. Tamatani M., Che Y.H., Matsuzaki H., Ogawa S., Okado H., Miyake S., Mizuno T., Tohyama M. Tumor necrosis factor induces Bcl-2 and Bcl-x expression through NFkappaB activation in primary hippocampal neurons. J. Biol. Chem., 1999, Vol. 274, p. 8531-8538.

74. Glasgow J.N., Wood T., Prerz-Polo J.R. Identification and characterization of n uclear factor k appaB b inding s ites i n t he murine b cl-x p romoter. J. N eurochem., 2000, Vol. 75, p. 1377-1389.

75. Tanaka M., Ito S., Kiuchi K. Novel alternative promoters of mouse glial cell line-derived neurotrophic factor gene. Biochim. Biophys. Acta, 2000, Vol. 1494, p. 6374.

76. Friedman W.J., Thakur S ., Seidman L., Rabson A.B. Regulation of nerve growth factor mRNA by interleukin-1 in rat hippocampal astrocytes is mediated by NFkappaB. J. Biol. Chem., 1996, Vol. 271, p. 31115-31120.

77. Rothstein J.D., Martin L., Kuncl R.W. Decreased glutamate transport by the brain and spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis. Nat. Engl. J. Med., 1992, Vol. 326, p. 1464-1468.

78. Kuncl R.W., Bilak M.M., Bilak S.R., Corse A.M., Royal W., Becerra S.P. Pigment epithelium-derived factor is elevated in CSF of patients with amyotrophic lateral sclerosis. J. Neurochem., 2002, Vol. 81, p. 178-184.

79. Ferrara N., Davis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocr. Rev., 1997, Vol. 18, p. 4-25.

80. Klagsbrun M., Vlodavsky I. Biosynthesis and storage of basic fibroblast growth factor (bFGF) by endothelial cells: implication for the mechanism of action of angiogenesis. Progress in Clin, and Biol. Res., 1988, Vol. 266, p. 55-61.

81. DiPietro L.A., Nebgen D .R., Polverini P .J. Downregulation o f endothelial cell thrombospondin 1 enhances in vitro angiogenesis. J. Vase. Res., 1994, Vol. 31, p. 178-185.

82. Dawson D.W., Volpert O.V., Gillis P., Crawford S.E., Xu H.-J., Benedict W., Bouck N.P. Pigment epithelium-derived factor: a potent inhibitor of angiogenesis. Science, 1999, Vol. 285, p. 245-248.

83. Smith L.E. Wesolowski E., McLellan A., Kostyk S.K., D'Amato R., Sullivan R., D'Amore P.A. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1994, Vol. 35, p. 101-111.

84. Stellmach V., Crawford S., Zhou W., Bouck N. Prevention of ischemia-induced retinopathy by the natural ocular antiangiogenic agent pigment epithelium-derived factor. Proc. Natl. Acad .Sci. USA, 2001, Vol. 98, p. 2593-2597.

85. Gao G., Li Y., Zhang D., Gee S., Crosson C., Ma J.-X. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Lett., 2001, Vol. 489, p. 270-276.

86. Ogata N., Nishikawa M., Nishimura T., Mitsuma Y., Matsumura M. Unbalanced vitreous levels of pigment epithelium-derived factor and vascular endothelial growth factor in diabetic retinopathy. Am. J. Ophthalmol., 2002, Vol. 134, p. 348-353.

87. Holekamp N.M., Bouck N., Volpert O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. Am. J. Ophthalmol., 2002, Vol. 134, p. 220-227.

88. Ogata N., Tombran-Tink J., Jo N., Mrazek D., Matsumura M. Upregulation of pigment epithelium-derived factor after laser photocoagulation. Am. J. Ophthalmol., 2001, Vol. 132, p. 427-429.

89. Wang L., Schmitz V., Perez-Mediavilla A., Izal I., Prieto J., Qian C. Suppression of angiogenesis and tumor growth by adenoviral-mediated gene transfer of pigment epithelium-derived factor. Mol. Ther., 2003, Vol. 8, p. 72-79.

90. Dhanabal M., Ramchandran R., Waterman M.J., Lu H., Knebelmann B., Segal M., Sukhatme V.P. Endostatin induces endothelial cell apoptosis. J. Biol. Chem., 1999, Vol. 274, p. 11721-11726.

91. Jimenez BVolpert O.V., Crawford S .E., Febbraio M., Silverstein R.L., Bouck N. Signals leading to apoptosis-dependent inhibition of neovascularization by thrombospondin-1. Nat. Med., 2000, Vol. 6, p. 41-48.

92. Bouck N. PEDF: anti-angiogenic guardian of ocular function. Trends in Mol. Med., 2002, Vol. 8, p. 330-334.

93. Krammer P.H. CD95's deadly mission in the immune system. Nature, 2000, Vol. 407, p. 789-795.

94. Gerber H.P., Dixit V., Ferrara N. Vascular endothelial growth factor induces expression of the antiapoptotic proteins Bcl-2 and Al in vascular endothelial cells. J. Biol. Chem., 1998, Vol. 273, p. 13313-13316.

95. Carmeliet P. Basic concepts of (myocardial) angiogenesis: role of vascular endothelial growth factor and angiopoietin. Curr. Interv. Cardiol. Rep., 1999, Vol. 1, p. 322-325.

96. Aoudjit F., Vuori K. Matrix attachment regulates Fas-induced apoptosis in endothelial cells: a role for c-flip and implications for anoikis. J. Cell. Biol., 2001, Vol. 152, p. 633-644.

97. Hutchings H., Maitre-Boube M., Tombran-Tink J., Plouet J. Pigment epithelium-derived factor exerts opposite effects on endothelial cells of different phenotypes. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, Vol. 294, p. 764-769.

98. Alberdi E., Aymerich M.S., Becerra S.P. Binding of pigment epithelium-derived factor (PEDF) to retinoblastoma cells and cerebellar granule neurons. Evidence for a PEDF receptor. J. Biol. Chem., 1999, Vol. 274, p. 31605-31612.

99. Alberdi E.M., Weldon J.E., Becerra S.P. Glycosaminoglycans in human retinoblastoma cells: heparan sulfate, a modulator of the pigment epithelium-derived factor-receptor interactions. BMC Biochem., 2003, Vol. 4, p. 1.

100. Bilak M.M., Becerra S.P., Vincent A.M., Moss B.H., Aymerich M.S., Kuncl R.W. Identification of the neuroprotective molecular region of pigment epithelium-derived factor and its binding sites on motor neurons. J. Neurosci., 2002, Vol. 22, p. 9378-9386.

101. Baehner R.L., Nathan D.G. Quantitative nitroblue tetrazolium test in chronic granulomatous disease. Nat. Engl. J. Med., 1968, Vol. 278, p. 971-976.

102. Nieuwkoop P.D. The organization center of the amphibian embryo: its origin, spatial organization, and morphogenetic action. Adv. Morphog., 1973, Vol. 10, p. 1-39.

103. Palmer G. Current issues in the chemistry of cytochrome с oxidase. J. Bioenerg. Biomembr., 1993, Vol. 25, p.145-151.

104. Leaton R.N., Supple W.F. Cerebellar vermis: essential for long-term habituation of the acoustic startle response. Science, 1986, Vol. 232, p. 513-515.

105. Supple W.F., Leaton R.N., Fanselow M.S. Effects of cerebellar vermal lesions on species-specific fear responses, neophobia, and taste-aversion learning in rats. Physiol. Behav., 1987, Vol. 39, p. 579-586.

106. Storozheva Z.I., Pletnicov M.V. Habituation of acoustic startle in rats a functional ablation study. Neuroreport, 1994, Vol. 5, p. 2065-2068.

107. Есипова З.Я. «Ультраструктура коры головного мозга и гиппокампа крыс в раннем постреанимационном периоде после тотальной ишемии». Бюлл. экспер. биол. и медиц., 1988, Т. 105, № 4, стр. 494-497.

108. Iselt М, Holtei W, Hilgard P. The tetrazolium dye assay for rapid in vitro assessment of cytotoxicity. Arzneimittelforschung, 1989, Vol. 39, p.747-749.

109. Khare S., Banai Y., Gokulan K., Smith R. 3rd, Linthicum D.S., Modiano J.F. Early changes in metabolism of leukemic cell lines upon induction of apoptosis by cytotoxic drugs. Eur. J. Pharmacol., 2003, Vol. 465, p. 23-30.

110. Bal-Price A., Brown G. Nitric-oxide-induced necrosis and apoptosis in PC12 cells mediated by mitochondria. J. Neurochem., 2000, Vol. 75, p. 1455-1464.

111. LotemJ, SachsL. Hematopoietic cytokines inhibit apoptosis induced by transforming growth factor beta 1 and cancer chemotherapy compounds in myeloid leukemic cells. Blood, 1992, Vol. 80, p. 1750-1757.

112. Tallarida R.J. Pharmacologic methods for identification of receptors. Life Sci., 1988, Vol. 43, p. 2169-2176.

113. Levi M„ Wilson P., Nguyen S., Iorio E., Sapora O., Parasassi T. In K562 and HL60 cells membrane ageing during cell growth is associated with changes in cholesterol concentration. Mech. Ageing Dev., 1997, Vol. 97, p. 109-119.

114. Thomas G., Chomienne C., Balitrand N., Schaison G., Abita J.P., Baulieu E.E. Granulocytic differentiation induced by retinoic acid in HL-60 cells is associated with changes in adenylate cyclase activity. Anticancer Res., 1986, Vol. 6, p. 857-860.

115. Geny B., Le Peuch C., Cost H., Basset M., Cockcroft S. Phorbol esters inhibit inositol phosphate and diacylglycerol formation in proliferating HL60 cells. Relationship to differentiation. FEBS Lett., 1988, Vol. 233, p. 239-243.

116. Weitzmann M.N., Savage N. Cyclic adenosine 3',5'-monophosphate, a second messenger in interleukin-1 mediated K562 cytostasis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993, Vol. 190, p. 564-570.

117. Insel P.A., Ostrom R.S. Forskolin as a tool for examining adenylyl cyclase expression, regulation, and G protein signaling. Cell. Mol. Neurobiol., 2003, Vol. 23, p. 305-314.

118. Duncan J.A., Gilman A.G. Autoacylation of G protein alpha subunits. J. Biol. Chem., 1996, Vol. 271, p. 23594-23600.

119. Gudi S., Nolan J.P., Frangos J. Modulation of GTPase activity of G proteins by fluid shear stress and phospholipids composition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1998, Vol. 95, p. 2515-2519.

120. Dessauer C.W., Chen-Goodspeed M., Chen J. Mechanism of G alpha i-mediated inhibition of type V adenylyl cyclase. J. Biol. Chem., 2002, Vol. 277, p. 28823-28829.

121. Taussig R., Tang W.J., Hepler J.R., Gilman A.G. Distinct patterns of bidirectional regulation of mammalian adenylyl cyclases. J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, p. 6093-6100.

122. Sunahara R.K., Dessauer C.W., Gilman A.G. Complexity and diversity of mammalian adenylyl cyclases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1996, Vol. 36, p. 461480.

123. Thomas J.M., Hoffman B.B. Adaptive increase in adenylyl cyclase activity in NG108-15 and S49 cells induced by chronic treatment with inhibitory drugs is not due to a decrease in cyclic AMP concentrations. Cell. Signal., 1992, Vol. 4, p. 417-428.

124. Parsons W.J., Stiles G.L. Heterologous desensitization of the inhibitory A1 adenosine receptor-adenylate cyclase system in rat adipocytes. Regulation of both Ns and Ni. J. Biol. Chem., 1987, Vol. 262, p. 841-847.

125. Avidor-Reiss T., Nevo I., SayaD., Bayewitch M., Vogel Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem., 1 997, Vol. 2 72, p. 5040-5047.

126. Nestler E.J., Hope B.T., Widnell K.L. Drug addiction: a model for the molecular basis of neural plasticity. Neuron, 1993, Vol. 11, p. 995-1006.

127. Yan Y., Chi P.P., Bourne H.R. RGS4 inhibits Gq-mediated activation of mitogen-activated protein kinase and phosphoinositide synthesis. J. Biol. Chem., 1997, Vol. 272, p. 11924-11927.

128. Watson N., binder M.E., Druey K.M., Kehrl J.H., Blumer К,J. RGS family members: GTPase-activating proteins for heterotrimeric G-protein alpha-subunits. Nature, 1996, Vol. 383, p. 172-175.

129. Rahmanian M., Jarett L. Activation of rat adipocyte plasma membrane adenylate cyclase by sodium azide. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1974, Vol. 61, p. 1051-1056.

130. Kiang J.G., Wu Y.Y., Lin M.C. Heat treatment induces an increase in intracellular cyclic AMP content in human epidermoid A-431 cells. Biochem. J., 1991, Vol. 276, p. 683-689.

131. Jarvis W.D., Fornari F.A., Browning J.L., Gewirtz D.A., Kolesnick R.N., Grant S. Attenuation of ceramide-induced apoptosis by diglyceride in human myeloid leukemia cells. J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, p. 31685-31692.

132. Ghoumari A.M., Wehrle R., De Zeeuw C.I., Sotelo C., Dusart I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration J. Neurosci., 2002, Vol. 22, p. 3531-3542.

133. Musashi M, Ota S, Shiroshita N. The role of protein kinase C isoforms in cell proliferation and apoptosis. Int. J. Hematol., 2000, Vol. 72, p. 12-19.

134. Yakushiji K., Sawai H., Kawai S., Kambara M., Domae N. Characterization of C2-ceramide-resistant HL-60 subline (HL-CR): involvement of PKC delta in C2-ceramide resistance. Exp Cell Res., 2003, Vol. 286, p. 396-402.

135. Visnjic D., Batinic D., Banfic H. Different roles of protein kinase C alpha and delta isoforms in the regulation of neutral sphingomyelinase activity in HL-60 cells. Biochem. J., 1999, Vol. 344, p. 921-928.

136. Barmack N.H., Qian Z.Y., Kim H.J., Yoshimura J. Activity-dependent distribution of protein kinase C-delta within rat cerebellar Purkinje cells following unilateral labyrinthectomy. Exp. Brain Res., 2001, Vol. 141, p. 6-20.

137. Skinner R., Abrahams J., Whisstock J., Lesk A., Carrell R., Wardell M. The 2.6 A structure of antithrombin indicates a conformational change at the heparin binding site. J. Mol. Biol., 1997, Vol. 266, p. 601-609.

138. Baumann U., Huber R., Bode W., Grosse D., Lesjak M., Laurell C. Crystal structure of cleaved human alpha-1-antichymotrypsin at 2.7 angstroms resolution and is comparison with other serpins. J. Mol. Biol., 1991, Vol. 218, p. 595-606.

139. Baumann U., Bode W., Huber R., Travis J., Potempa J. Crystal structure of cleaved equine leucocyte elastase inhibitor determined at 1.95 angstroms resolution. J. Mol. Biol., 1992, Vol. 226, p. 1207-1218.

140. Sippy B.D., Hofman F.M., Wright A.D., He S., Ryan S.J., Hinton D.R. Soluble tumor necrosis factor receptors are present in human vitreous and shed by retinal pigment epithelial cells. Exp. Eye Res., 1996, Vol. 63, p. 311-317.

141. Abu el Asrar A.M., Maimone D., Morse P.H., Gregory S., Reder A.T. Cytokines in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy. Am. J. Ophthalmol., 1992, Vol. 114, p. 731-736.

142. Hardwick C., Feist R., Morris R., White M., Witherspoon D., Angus R., Guidry C. Tractional force generation by porcine Muller cells: stimulation by growth factors in human vitreous. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1997, Vol. 38, p. 2053-2063.

143. T ombran-Tink J., Barnstable C .J. Therapeutic prospects forPEDF: more than a promising angiogenesis inhibitor. Trends Mol. Med., 2003, Vol. 6, p. 244-250.

144. Drake C.J., Hungerford J.E., Little C.D. Morphogenesis of the first blood vessels. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1998, Vol. 857, p. 155-179.

145. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, Vol. 72, p. 248-254.

146. Rodionov I., Baru M., Ivanov V. A swellographic approach to monitoring continuous-flow solid-phase peptide synthesis. Pept. Res., 1992, Vol. 5, p. 119-125.

147. Nieuwkoop P.D., Faber L. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). North Holland publication company Amsterdam-Oxford, 1975.

148. Хоперская О.А. Техника экспериментов с зародышами. В кн. «Методы биологии развития». Под ред. Б.Л. Астаурова. М., Наука, 1974, 620 е., стр. 161183.

149. Niu М.С., Twitty V.C. The differentiation of gastrula ectoderm in medium conditioned by axial mesoderm. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1953, Vol. 39, p. 985-989.

150. Pletnicov M.V., Storozheva Z.I., Sherstnev V.V. Developmental analysis of habituation оf the acoustic startle response in the preweanling and adult rats. Behav. Process., 1995, Vol. 34, p. 269-277.

151. Лилли P. Патологическая техника и практическая гистохимия. Изд-во "Мир", М., 1969, 645 е., стр. 166-167.

152. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, Vol. 227, p. 680-685.

153. Needleman S., Wunsch C. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J. Mol. Biol., 1970, Vol. 48, p. 443-453.