Структурное изучение сфинголипидов и сфинголипидоподобных соединений из некоторых морских беспозвоночных тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Гузий Алла Григорьевна

Структурное изучение сфинголипидов и сфинголипидоподобных соединений из некоторых морских беспозвоночных

02.00.10-биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток - 2006

Работа выполнена в Дальневосточном государственном университете и Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, старший научный сотрудник Макарьева Т.Н.

доктор химических наук, профессор Каминский В.А.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Уткина Н.К.

Ведущая организация: Институт органической химии УНЦ РАН

Защита состоится <»<р» апреля 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д. 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс. (4232) 314-050, e-mail: bcienee@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку. 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан < и > марта 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник Прокопенко Г.И.

ZOOGk

"7з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сфинголипиды - это один из наиболее разнообразных по химическому строению и функциональной активности классов липидных молекул. Их название происходит от слова "sphinx" (греч.), что означает «загадочный». К этому классу относятся сфингозиновые основания и их производные: церамиды, фосфосфинголипиды и гликосфинголипиды (цереброзиды и ганглиозиды). К настоящему времени из различных биологических источников химиками-биоорганиками выделено несколько сотен сфинголипидов, в основном производных сфингозиновых оснований, отличающихся друг от друга химическим строением. Наблюдающийся в последнее время повышенный интерес к структурным исследованиям сфинголипидов является следствием нескольких важных научных событий. К ним можно отнести открытие целого ряда новых структурных серий морских сфинголипидов и, в еще большей степени, установление важной роли отдельных сфинголипидов в регуляции процессов роста, дифференциации и апоптоза клеток. Кроме того, были найдены такие природные соединения, которые имеют определенное сходство в строении и, по-видимому, в биогенезе со сфинголипидами, но, в то же время, существенно отличаются от классических сфинголипидов и могут быть названы сфинголипидоподобными метаболитами.

Особый интерес из них представляют так называемые двухголовые сфинголипиды, которые были открыты в 1989 г. в Лаборатории химии морских природных соединений Тихоокеанского института биоорганической химии. В настоящее время не ясны биосинтетические пути образования таких липидов, приводящих к а,со-бифункционализации оснований сфингоидного типа. Эти соединения не имеют структурных аналоюв среди известных природных соединений и чрезвычайно редки. До сих пор они были найдены только в некоторых губках. Двухголовые сфинголипиды замечательны и своими биологическими свойствами. Так, недавно было обнаружено, что некоторые из них в низких концентрациях ингибируют рост Candida glabrata. Этот вид грибов, наряду с другими видами рода Candida, вызывает кандидозы, которые являются одними из самых частых оппортунистических микозов при низком иммунном статусе, в том числе на любой стадии развития ВИЧ-инфекций. В настоящее время известны лишь единичные примеры веществ, способных подавлять рост Candida glabrata

Поиск новых типов противогрибковых природных соединений - не только важный этап разработки новых лекарственных средств. Он имеет и фундаментальное значение в плане открытия новых молекулярных мишеней, взаимодействие с которыми может привести к противогрибковому эффекту. Кроме того, выделение новых вторичных метаболитов.

в РОСгсИ^ЦИЧ#йй1>нлМинголипидов cutnunTEKA >

библиотека j

сфинголипидоподобных соединений, и установление их химического строения обычно предшествует решению ряда других задач биоорганической химии, например, установлению их биологических функций, выявлению зависимости структура-активность, изучению биосинтеза, разработке схем полного химического синтеза, определению механизмов биологического действия и т.п.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось выделение и установление строения сфинголипидов и необычных сфинголипидоподобных вторичных метаболитов из губок Rhizochalma incrústala, Oceanapia sp. и офиуры Ophiarachna incrassata.

Для достижения этой цели были решены следующие задачи: 1) выбраны объекты исследования: 2) получены соответствующие экстракты; 3) разработаны схемы выделения целевых веществ; 4) осуществлено разделение соответствующих фракций, получены и очищены индивидуальные природные соединения или, в тех случаях, когда это было невозможно, суммы сфинголипидов; 5) выполнен анализ спектральных данных, получены производные, которые, в свою очередь, также исследованы с помощью ЯМР и масс-спектрометрии; 6) установлены структуры целевых соединений и 7) для некоторых из них изучена биологическая активность.

Положения, выносимые на защиту: 1) Губка Rhízochalina incrnstata содержит ризохалин А, который является первым представителем сфинголипидов и сфинголипидоподобных соединений, содержащим редкую /V-алкилкарбамоильную группу.

2) Уникальный алкалоидолипид оценалин А из губки Oceanapia sp. имеет аллильный метиловый эфир в углеводородной цепи, тетрагидроизохинолиновую и 2-амино-3-гидроксипропильную структурные единицы на концах этой цепи. Строение оценалина А предполагает существование принципиально нового пути биосинтеза в морских организмах.

3) Обычными сфинголипидами в губке Oceanapia sp. являются церамиды и цереброзиды, включая соединения, имеющие некоторые структурные различия по сравнению с ранее известными представителями этих групп сфинголипидов.

4) Офиура Ophiarachna incrassata содержит цереброзиды того же типа, что и ранее найденные в других иглокожих.

Научная новизна и практическая ценность работы. Из двух видов губок было выделено 2 новых сфинголипидоподобных метаболита и 39 новых сфинголипидов, установлены их структуры. Впервые в офиурах идентифицированы 12 цереброзидов. Изучены ЯМР и масс-спектры этих природных соединений, исследованы некоторые химические свойства. Получены новые данные о противогрибковой активности некоторых сфинголипидоподобных веществ морского происхождения, что открывает

возможности дальнейшего поиска в этом ряду высокоактивных соединений для создания на их основе новых лекарственных средств.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на 4th Europian Conference on Marine Natural Products, Paris. France, 2005; XI International Symposium on Marine Natural Products, Sorrento, Italy. 2004; на Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии», Владивосток, 2004.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 4 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, литературного обзора, посвященного особенностям химического строения сфинголипидов морских губок, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 106 цитируемых работ. Работа изложена на 107 страницах, содержит 13 таблиц, 1 схему и 15 рисунков.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.х.н. Макарьевой Т.Н., а также благодарит академика Стоника В.А. за консультации и помощь в работе. Автор благодарит к.\ н. Денисенко В.А. и к.х.н. Дмитренка A.C. за съемку спектров ЯМР, Дмитренка П.С. и Моисеенко О.П. - за получение масс-спектров, д.б.н. Светашева В.И. и к.х.н. Родькину С.А. - за идентификацию жирных кислот и их производных, Красохина В.Б. - за определение видовой принадлежности исследованных губок и к.б.н. Чернышева A.B. - за определение офиуры.

Используемые сокращения: МЭЖК - метиловые эфиры жирных кислот; ТСХ -тонкослойная хроматография; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления; ГЖХ - газо-жидкостная хроматография; ЯМР 'Н и ,3С - спектроскопия ядерного магнитного резонанса на протонах и ядрах углерода; КССВ - константа спин-спинового взаимодействия; COSY - корреляционная спектроскопия; НМВС - ЯМР-эксперимент гетероядерной корреляции через несколько связей; MALDI-TOF-MS - масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией/ионизацией; HRMALDf-TOF-MS - масс-спектрометрия высокого разрешения с матричной лазерной десорбцией/ионизацией; FABMS - масс-спектрометрия с ионизацией быстрыми атомами; EIMS - масс-спектрометрия с ионизацией электронным ударом; ESIMS - масс-спектрометрия с электроспрей ионизацией; ГЖХ-МС - хромато-масс-спектрометрия.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Ризохалнн А из губки Rhizochalina incrustata Ризохапин А (1), новый биполярный сфинголипид, был выделен из лиофилизированной губки R incrústala после экстракции этанолом.

Молекулярная формула C49H84N20|6 была рассчитана из масс-спектра высокого разрешения HRMALDI-TOF-MS перацетагного производного ризохалина А (1а). В этом спектре зарегистрирован пик иона [A/+Na+] при m/z 979.5759. Соответственно, в FABMS имелись пики при m/z 957 [А/+ Н]+ (регистрация положительно заряженных ионов) и при m/z 955 [А/*-Н]" (регистрация отрицательно заряженных ионов). В EIMS имелся небольшой пик молекулярного иона при m/z 956. В спектрах ЯМР 'Н и 13С соединения 1а присутсвовали сигналы, типичные для гликозидов псевдо-димерных аминоспиртов, аналогов ризохалина (3). Это сигналы двух вторичных метильных групп (5ц 1.11 д и 1.17 д; 5с 18.8 и 18.6). двух М-замещенных СН групп (5Н 3.92 м и 4.10 м; 5с 48.8 и 46.7); двух оксиметиновых групп (5Н 4.84 тд и 3.50 дт; 5С 76.4 и 82.5) и одной карбонильной группы (5С 211 6), окруженной с двух сторон ое-СН2 группами (5Н 2.37 т и 2.36 т; 5с 42.8 и 42.7). Кроме того, в ЯМР спектрах обнаруживались сигналы СН2 групп углеводородной цепи (5Н 1.25 уш. с; 5С 29.1-29.8).

Спектры ЯМР перацетата 1а, полученного из 1, имеют большое сходство со спектрами перацетата ризохалина за исключением амидного дублета, сдвинутого в сильное поле с 5Н 5.63 до 4.71. Следовательно, соединение 1 - это аналог ризохалина с модификацией при С-27, что было показано анализом спектров ЯМР ПС, COSY и НМВС. В спектре ЯМР ,3С соединения 1а имелись сигналы этоксигруппы (ОСН2СН3: 5Н 1.25 т, J=6.8 Гц, ЗН и 4.10 м, 2Н; 5С 14.6 и 60.8). Химический сдвиг (5С 156.2) согласовывался с резонансным сигналом карбонила карбамоильной группы. НМВС корреляция СН3-28 (5Н 1.11)/CH-N (5С 48.8) (рис. 1) подтвердила, что метановая группа, к которой относится сигнал при 5Н 4.71, находится рядом с одним из концов молекулы и тем самым - положение NH(CO)OCH2CH3 группы при С-27 в 1. Галактопиранозильная группа в 1 присоединена к агликону ß-гликозидной связью, как показала КССВ аномерного Н-1" (5Н 4.48 д, J=7.8 Гц). Кросс-пик Н-Г7С-3 (5С 82.5) в НМВС спектре показал место присоединения моносахарида при С-3.

В результате гидролиза la (6N HCl, 100°С, 2.5 ч) получили D-галактозу и два соединения, производные агликона. которые ацетилировали, разделили и очистили колоночной хроматографией на силикагеле. Продукт, элюированный первым, был идентифицирован как перацетат карбомаильного производного агликона ризохалина (2), вторым оказался перацетат агликона ризохалина (4), который по данным ЯМР, E1MS, и [а]и идентичен соединению, соответствующему полученному ранее из ризохалина (3) Следовательно, кето-гр\ппы в 3 и 1 локализованы в одинаковом

положении (С-18) и абсолютная конфигурация 1 - точно такая же. как в 3, т.е. (2Л,ЗЛ26Л27/?).

о

1 =Н, Р?2= р-О-гапактопиранозил

1а К,=Ас, К2=перацетил-|3-галактопиранозил

2 Я,= Н2=Ас

ОН^ОН

1н 13с нмвс

Рис. 1. НМВС-корреляции для фрагментов перацетата ризохалина А ОАс ЫНАс

Н3С

ЫНАс

ОАс

Ризохалин А - первый представитель двухголовых сфинголипидов, содержащий редкую А'- ал ки л к арб ам о ил ь н у ю группу. Ранее Л'-карбаматы были обнаружены в некоторых морских алкалоидах. Кроме того, такие поликетиды, как дискодермолид А и кабирамид С содержат Оалкил-карбамоильные группы. Все эти соединения были выделены из метанольных экстрактов морских организмов, а ризохалин А был получен после этанольной экстракции образца губки тсгизШШ Возможно, что 1 и другие природные карбаматы происходят из пока не идентифицированных

предшественников, взаимодействующих с метанолом или этанолом в процессе выделения.

2. Сфинголипиды из губки Осеапар'ш ер. 2.1. Оиеналин А из губки Осеапар'ш ер.

Из этанольного экстракта лиофилизированной губки Осеапар'ш эр. нами был выделен беспрецедентный вторичный метаболит, названный оценалином А (5).

5Ь

Сконцентрированный досуха этанольный экстракт распределили между водным этанолом и гексаном. Водно-этанольный слой экстрагировали бутанолом. Бутанольный экстракт разделили С-18 флеш-хроматографией и многократной ВЭЖХ на обращенной фазе. В результате в виде аморфного бесцветного порошка получили соединение 5, которое обнаруживалось нингидрином на ТСХ.

На основе данных HRFABMS и ЯМР для оценалина А (5) была предложена молекулярная формула C41H72N2O9. В самом деле, FABMS высокого разрешения дал пик иона с m/z 737.5286 [М+Н]4 (рассчитанное значение для C,,H73N209 737.5311). ESIMS дал интенсивный пик молекулярного иона при m/z 737 (100 %) [A/+Na]+. что отличало это соединение от ризохапина и его производных. УФ-Спектр (МеОН), указывал на наличие ароматического хромофора [^гаах 288 нм]. В ESI спектре 5 имелся пик дважды протонированного молекулярного иона (m/z 369, 30%, [М+2Н]3+). Подобные двухзарядные ионы характеристичны для соответствующих масс-спектров двухголовых сфинголипидов.

Из данных спектров ЯМР следовало, что в 5 присутствуют моносахаридный остаток (5н 4.32 д, J=7.2 Гц; 6С 104.8) и шесть ароматических атомов углерода, два из которых протонированы (5Н 6.60 с и 6.64 с; 8С 124.2, 116.8, 147.3, 146.5, 114.5 и 124.8). Кроме того, в ЯМР спектрах имелись сигналы метиленовой группы, связанной с

азотом (8Н 3.50 м и 3.54 м; 8с 41 6), двух метановых групп, связанных с азотом (5Н 4.32 дд и 3.17 м; 5С 57.3 и 52.7). двух гидроксиметиновых групп (8Н 3.68 ддд и 3.50 м; 8С 80.9 и 84.7). Также наблюдались сигналы дизамещенной двойной связи (8Н 5.20 дд и 5.63 дт; 8С 136.6 и 132.2), вторичного метила (8Н 1.27 д; 5С 16.0), одной ОМе группы (8Н 3.20; 8С 56.6) и сигнал длинноцепочечной полиметиленовой цепи (8Н 1 20-1.30). Спектры полученного в результате ацетилирования октаацетильного производного (5а) подтверждают присутствие шести ОН групп, первичной NH?. и вторичной NH группы.

Анализ двумерных спектров ЯМР указывает на наличие фрагментов а-с (рис. 2). Фрагмент а содержит гексапиранозильный остаток, присоединенный р-О гликозидной связью (8Н 4.32 д, J=7.2 Гц, НГ) к 2-амино-З-алканольному фрагменту. Значения КССВ и химических сдвигов сигналов аномерного Н-Г в спектре ЯМР 'Н и С-3 в спектре |3С (8с 80.9) вместе с JJ 'Н-ЬС корреляцией (I1MBC) между этими двумя сигналами подтверждают присоединение гексозы Р-0-гликозидной связью к С-3. Полное отнесение оставшихся сигналов в спектрах ЯМР 'Н и ПС было сделано на основании данных COSY и НМВС.

Фрагмент b содержит две спиновые системы. В COSY-спектре наблюдали корреляции сигналов метиленовых протонов при С-25 (8Н 2.00 ми 1.88 м) с сигналом Н-26, находящимся в слабом поле (8Н 4.32 дд, J=8.0 и 4.3 Гц, 1Н). Эта СН-группа соединена с атомом N, который связан со второй спиновой системой, включающей в себя Н2 при С-28 (5Н 3.50 м и 3.54 м) и Н2 при С-29 (8Н 2.89 дт, J=17.0 и 6.0 Гц; 2.97 ддд, J=17.0, 7.7 и 5.7 Гц), расположенные между атомом азота и ароматическим кольцом, что видно из величин химических сдвигов в спектрах ЯМР 'Н и |3С. Химические сдвиги в спектре ЯМР |3С для С-32 (бс 147.3) и С-33 (8С 146.5) согласуются с таковыми в спектре катехола.

nh2

с

я

ОН

.он

_ COSY

-fc. НМВС

b

Рис. 2. COSY и НМВС-корреляции для фрагментов а-с оценалина А

Обобщенный анализ УФ-спектров [Хтах 238 (е 7600), 288 нм (е 7850)], химических сдвигов арильных протонов Н-31 (5ц 6.60 с) и Н-34 (5Н 6.64 с) и кросс-пиков, присутствующих в НМВС спектре (Н-31/С-29. С-33, С-35 и Н-34/С-26, С-30, Г-32). показал, что вторым концом молекулы является 1,6,7-тризамещенный тетрагидроизохинолиновый (изохинолиновая нумерация) фрагмент (Ь). Дополнительные кросс-пики в НМВС-спектре (Н-28а/С29, С-26; Н29а/С28, С31, С35 и H-29b/C-31, С35) полностью согласуются с фрагментом Ь. Фрагмент с состоит из алли.пьного О-метилового эфира, ограниченного полиметиленовыми цепями. Кросс-пики в НМВС-спектре H-16/C-I4, Н-16/С-15, Н-16/С-18, Н-17/С-15 подтверждают положение ОМе группы в аллильном положении. В COSY-спектре наблюдали корреляции сигналов аллильных Н2при С-15 (5Н2.06 м, 2Н) с Н-16 (8Н 5.63 дд, J=7.2 Гц), Н-17 (SH 5.20 дд, J=8.3 и 15 Гц). О-замещенной СН (5Н 3.50 м, 1Н, Н-18) и, наконец, Н2 при С-19 (бн 1.55 м и 1.40 м). Вицинальная КССВ олефиновых протонов fj= 15.0 Гц) и химический сдвиг в спектре ЯМР |3С аллильной метиленовой группы С-15 (5С 33.9) согласуются с Е-конфигурацией двойной связи.

Попытки определить положение СН=СН-СН(ОМе) группы в 5 масс-спектрометрически не удались. В FAB- и MALDI-масс-спектрах отсутствовали фрагментарные ионы, соответствующие а или ß разрывам (по отношению к двойной связи). В EIMS-спектре перацетата 5а имелись только пики фрагментарных ионов, связанные с потерей одной или нескольких молекул кетена и СН3СООН.

Для решения этой проблемы перацетат 5а подвергли озонолизу, восстановлению (обработали 03, затем NaBH4) и ацетилированию (Ас20, пиридин). Два основных продукта (перацетаты 6 и 7) получили методом ВЭЖХ вместе с соответствующими изомерными соединениями (8 и 9).

Анализ спектров ЯМР показал, что соединение 6 сохраняет гликозилированный конец, в то время как производное 7 содержит углеводородную цепь, замещенную на одном конце тетрагидроизохинолином, а на другом - 0-ацетокси гликольной группой.

Псевдомолекулярные ионы, наблюдаемые при m/z 710 и 528 [/W+Na]+ в MALDI-TOF-масс-спектрах соединений 6 и 7. соответственно, позволили определить положение аллильного эфира в углеводородной цепи, как показано в 5.

Региоизомер 5Ь, по-видимому, присутствовал как неотделимая примесь в 5 (20%). Данные ЯМР показали, что соединение 8 содержит галактозу и СН(ОМе) фрагмент, в то время как производное 9 содержит тетрагидроизохинолиновую группу. Пики псевдомолекулярных ионов при т/г 754 и 484 [A/+Na]+ в MALDI-масс-спектрах 8 и 9 подтверждают их структуры.

ОАс-ОАс

Lto4

АсО~Х-—-ггЛ—-О _ОАс =

NHAc

АсО'

°А^ОАс

ОАс

ОАс

ОАс

Соединение 5Ь, вероятно, образуется в результате аллильной перегруппировки, катализируемой кислотой в процессе выделения двухголовых сфинголипидов методом ВЭЖХ (при этом используется система растворителей 0.1% TFA МеОН/Н20). Так как СН=СН-СН(ОМе) фрагмент отделен от концевых функциональных групп длинными полиметиленовыми цепями, то изомеры 5 и 5Ь не имеют различий в спектрах ЯМР 'Н.

Гидролиз 5 (6N НС1, 100° С, 2.5 ч) дал D-галактозу. Продукт озонолиза 6, полученный из 5а был идентичен соединению За [ЯМР спектры, [a]D], полученному ранее в результате окислительной деградации ризохалина (3), как показано ниже.

ОАс^ОАс

LLo

АсО~\-—-О ОАс =

[1] Ас20, пиридин

[2] моноперфталевая кислота

[3] КОН водн

[4] Ас20, пиридин

ОАс

NHAc

За

Абсолютная конфигурация 3 была установлена ранее интерпретацией КД спектров тетра-/У,0-бензоилпроизводных, полученных из ризохалина (3). Оценалин А (5) имеет такую же (2/?,3#) конфигурацию, как у ризохалина. Соединения 5, 5а, 7 и 9 показали только слабое оптическое вращение и отсутствие бензоидного эффекта Коттона в КД спектрах при длине волны, характерной для спектров 1-замещенных 6,7-дигидрокси-тетрагидрохинолинов (/.,пах 270 нм). Известно, что подобные соединения имеют склонность к эпимеризации при С-1 (изохинолиновая нумерация) в присутствии кислот. Поэтому мы сделали вывод, что 9 - рацемат, а 5 и 5а существуют как смесь (1:1) С-26 эпимеров (конфигурация С-18 не определена).

В спектрах ЯМР 'Н наблюдалось раздвоение сигналов для 32,33-0, Л'-ацетатных групп и соседних сигналов в перацетатах 5а, 7 и 9, содержащих тетрагидроизохинолиновый фрагмент, по причине затрудненного вращения вокруг третичного ацетамида (Ы-27-Ас). Это явление было ранее известно, и такое раздвоение сигналов наблюдалось при регистрации спектров ЯМР М-ацетилтетрагидроизохинолинов.

При повышении температуры (до Т = 80° С и выше) раздвоенные ацетатные сигналы в ЯМР 'Н спектре 7 (С505Ы) сливались в синглеты из-за ускорения вращения вокруг связи М-СО и отсутствия устойчивых ротамеров в этих условиях.

Следует отметить, что существование устойчивых ротамеров - довольно редкое явление. В нашем случае его удалось изучить с помощью ЯМР спектроскопии высокого разрешения. Соединения, такие как оценалину, прекрасная модель для изучения подобных явлений, и вопрос о существовании устойчивых конформаций такого рода веществ еще предстоит исследовать, чтобы установить насколько зависит их биологическая активность от того, какая из конформаций взаимодействует с молекулярной мишенью при ингибировании роста патогенных грибов.

Изохинолины редки среди морских природных соединений. Большинство природных 6,7-дигидрокси-1-замещенных тетрагидрохинолинов образуются в результате конденсации тирамина, фенилэтиламина или дофамина с альдегидами или а-кетокарбоксильными кислотами с последующим отщеплением карбоксильной группы в виде С02.

Беспрецедентное строение оценалнна А делает интересным вопрос о его биогенезе. Известные биполярные сфинголипиды имеют одинаковое число углеродных атомов (С24) в углеводородной цепи между функциональными группами на концах молекулы, что позволяет предположить их образование из сходных липидных предшественников.

Вероятно, исходным субстратом для биосинтеза таких липидных предшественников, как и других липидных производных, выступает уксусная кислота. Чтобы вступить в биосинтетические реакции, ацетат активируется в результате

реакции с коэнзимом А с образованием ацетилкоэнзима А. Далее, по нашему предположению, в результате конденсации семи молекул ацетилкоэнзима А образуется интермедиат с чередующимися металеновыми и кетонными звеньями. Такие вещества называются поликетидами. Затем следует восстановление кетонных групп до гидроксильных, дегидратация и восстановление двойных связей. В результате образуется длинноцепной ацил-СоА.

Биосинтез сфинголипидного а-конца в 5 и 3, вероятнее всего, происходит путем передоксальфосфат-зависимой конденсации аланина с ацил-СоА, как ранее было показано на примере микотоксина фумонизина В,_ продуцируемого Fusarium moniliforme. Аналогичным образом проходит, верояшо, и биосинтез некоторых С12-С]8 аминоспиртов морского происхождения. Образовавшийся аминоспирт. возможно, подвергается со-окислению до карбоксильной группы. Хотя аналогичные биосинтетические реакции для аминоспиртов, насколько нам известно, ранее обнаружены не были, ш-окисление жирных кислот является известным биохимическим процессом. Далее, по-видимому, идет наращивание углеводородной цепи присоединением пяти молекул ацетилкоэнзима А с последующим восстановлением, взаимодействием с молекулой дофамина и гликозилированием.

Наличие двойной связи при С-16, гидроксильной группы при С-18 или кето-группы при С-18 и семи метиленовых групп с ш-конца в известных биполярных сфинголипидах, по-видимому, является результатом последовательного присоединения пяти молекул ацетилкоэнзима А к карбоксильной группе на конце углеводородной цепи аминоспирта по ацетатному пути через образование поликетида. Наличие функциональных групп в центральной части углеводородной цепи, на наш взгляд, подтверждает эти предположения.

Оценалин А (5) проявляет противогрибковую активность против устойчивого к действию флуканазола штамма Candida glabrata (минимальная ишибирующая концентрация 30 мкг/мл), что сравнимо с активностью D-сфингозина. Соединение 5 блокирует биосинтез сфинголипидов в С glabrala, ингибируя церамидсинтазу (установлено совместно с группой проф. Молинского. Калифорнийский ун-т в Дэвисе. США). Ранее подобные механизмы противогрибкого действия известны не были.

О / О

А + | А -НБСоА

СоАБ СН3 (СоАЭ СНз

СоАБ

Н3С ,СООН о

+

ЙН2 СоАЭ

аланин

О О О О О О О

ААА^кХАА

Рис. 3. Гипотетическая схема биосинтеза оценалина А

3. Церамиды из губки Осеапар'ш эр.

Нам представлялось интересным выяснить, реализуется ли в губках этого рода биосинтез обычных сфинголипидов. С этой целью мы выделили из экстрактов Осеапар1а ер. фракцию церамидов. Следует отметить, что губки обычно представляют собой симбиотические комплексы, включающие значительные количества симбиотических микроводорослей и бактерий. Поэтом) решить вопрос о том, в каких именно компонентах комплекса (клетках самой губки или в микросимбионтах) биосинтезируется та или иная группа природных соединений очень трудно.

Церамиды были выделены нами из этанольного экстракта губки Осеапарю эр. Концентрированный этанольный экстракт распределяли между бутанолом и водой, затем полученный бутанольный экстракт хроматографировали на колонке с силикагелем. Фракцию, элюированную этилацетатом, далее очищали колоночной хроматографией на сефадексе ЬН-20 и силикагеле, в результате получили сумму церамидов (10).

ОН

10 п = 8,9

т = 8-10, 14-20

Структурная идентификация компонентов полученной фракции проводилась методами ЯМР-спектроскопии. Широкий дублет ЫН при 5Н 6.35, два дублета дублетов при 5Н 3.75 и 3.93 (СН7ОН). мультиплетные сигналы при 5н 4.14 (СН-Ы), 3.57 (СН-О) и 3.62 (СН-О) подтвердили, что выделенные нами церамиды являются производными фитосфингозинов. Интенсивный сигнал при 5ц 1.20-1.39 [(СН2)„] и два сигнала метальных групп (5Н 0.88 т. .1=7.0, ЗН и 0.85 д, .1=6.6. 6Н) в спектре ЯМР 'Н указывали на присутствие длинных алкильных цепей с н- и изо-концами.

Для определения длины цепей жирных кислот и сфингозиновых оснований провели метанолиз смеси церамидов. ГЖХ-МС-анализ полученных метиловых эфиров жирных кислот показал, что главной кислотой в церамидах (10) является пальмитиновая кислота. Эта кислота вместе с Сп-С^-насыщенными нормальными кислотами составляет более 79% от общей фракции жирных кислот. Только около 14 и 6% жирных кислот имеют изо- и антеизо-структуры, соответственно.

Полученные в результате метанолизасфннгозиновые основания анализировали в виде перацетатов методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии. Псевдомолекулярные [/1/+Na]+ ионные пики при m/z 508 и 522 соответствовали C,s- и С,9-фитосфингозинам. В спектре ЯМР 'Н этой смеси наблюдались сигналы трех метиновых групп, связанных с гетероатомами, дублет при 5Н 5.91 (NH) и два дублета дублетов протонов CHiOAc-группы. Более того, триплет при 8Н 0.88 и дублет при 5Н 0.86 указывали на присутствие как нормальных, так и ызо-концов в сфингозиновых основаниях. Присутствие н- и изо-концов было подтверждено ГЖХ-МС-анализом А'-ацетил-1,3,4-[ри-О-триметилсилильных производных, полученных из сфингозиновых оснований обработкой 20% уксусным ангидридом в метаноле с последующим силированием Л7,0-бис-(триметилсилил)-трифторацетамидом. На хроматограмме два пика веществ, дающих в масс-спектрах пики молекулярных ионов с m/z 575, соответствовали производным изо- и н-С|8 o-фитосфинганинов и два пика, имеющих молекулярные ионы с m/z 589. соответствовали изо- и н-С,90-фитосфинганинам (приблизительное соотношение площадей пиков в обоих случаях составляло 2 : 3). Стереохимия оснований определена как 25,35,4/? сравнением спектров ЯМР 'Н их перацетатов со спектрами перацетатов стандартных сфингозиновых оснований и их диастереомеров и на основании значения угла вращения церамидов.

Дополнительная информация о составе церамидов была получена ГЖХ-МС-анализом 1,3,4-три-0-триметилсилильны\ эфиров церамидов. На хроматограмме имелись пики, соответствующие церамидам состава /'-Си (/С,6о, гс-С18 ¡/С^ сь по/С 16 0> "/'-Clso/C|7 0. /-С]9 о/Спо, f-Ci9o/Ci7o* И/''Ctg о/С|8 (h '"С 19 о/С, 8 Оэ п-Сi9o/C|8o- Масс-спектры подтверждали эти структуры.

СН3(СН2)„-СН2-С-

0 I

Si(CH3)3

H

-с—

I

о

Si(CH3h

H

-C-CH2OSi(CH3)j

: NH

bi с-сн2;сн2(сн2)т-сн3

! О e! T

Схема 1. Фрагментация 1,3,4-три-О-триметилсилильных эфиров церамидов в МС-спектрах электронного удара

Ионные пики в этих соединениях можно разделить на несколько групп (схема 1): 1) относящиеся к фрагментам, характеризующим молекулярную массу; 2) относящиеся к фрагментам, характеризующим длину сфингозиновых оснований; 3) относящиеся к фрагментам, характеризующим длину жирнокислотных цепей. Например, расщепление связи между С-3 и С-4 (с) дает пик т/: 299 (основание С]8о)

или m/z 313 (основание С|90). Другой характерный для сфингозиновых оснований фрагмент (М-d) имеет величину m/z 401 для оснований С]80и 415 для оснований С190. Жирнокислотные фрагментарные ионы с m/z 256, 270 и 284 были образованы переносом двух протонов на фрагмент b и демонстрировали, что церамиды содержат соответствующие 16:0, 17-0 и 18:0 жирнокислотные остатки. Основные пики с m/z 328, 342 и 356 соответствуют иону, который содержит одну триметилсилильную группу и жирнокислотный остаток (b+H+триметилсилильный радикал). Эти пики подтверждают, что основная жирная кислота в церамидах (10) - это 16:0. Полученные масс-спектры указывают на то, что основные компоненты церамидной фракции (10) являются производными н- и изо С|80- и С19о-фитосфингозинов и насыщенных жирных кислот.

Масс-спектры высокомолекулярных компонентов церамидной смеси не были получены из-за недостаточной летучести в условиях ГЖХ соответствующих производных. Для их идентификации использовали MALDl-TOF-масс-спектры смеси церамидов (10), полученные в присутствии LiCl. Наличие в спектре [М+и]+-пиков ионов с m/z 562, 576, 590,604, 646, 660, 674, 702, 716, 730, 744, отличающихся друг от друга на величину, кратную 14, указывает на строение дополнительных компонентов этой фракции, содержащих длинноцепочечные (т.н. демоспонгиевые) жирные кислоты.

и-С|8-Фитосфингозин - обычное тригидроксилированное длинноцепочечное основание церамидов из растений и дрожжей. Из морских беспозвоночных производные нзо-С18-фитосфингозина впервые были обнаружены в асцидии Cystodytes cf. dellechiajei. Однако, в отличие от выделенных нами церамидов, эти вещества были ацилированы а-гидроксикислотами. Хотя я-С^-фитосфингозин был ранее обнаружен в церамидах из многих видов дрожжей, есть только одно сообщение об этом типе церамидов в морских беспозвоночных: н-С^-фитосфингозин, ацилированный негидроксилированными кислотами, идентифицирован в губке Iotrochota baculifera. О церамидах. содержащих гшз-С^-фитосфингозин, ранее не сообщалось. Таким образом, мы идентифицировали серию новых структурных вариантов церамидов, содержащих изо-С\%- и С^-фитосфингозины и ацилированных по аминогруппе негидроксилированными жирными кислотами.

2.3 Цереброзиды из губки Oceanapia sp.

Цереброзиды, имеющие общие формулы 11 и 12, мы получили из этанольного экстракта Oceanapia sp. после распределения между бутанолом и водой, многократной колоночной хроматографии веществ растворимых в бутаноле на силикагеле, сефадексе LH-20 и амберлите XAD-2. Перекристаллизация полученной фракции из метанола и ее разделение с помощью ВЭЖХ на прямой фазе завершили выделение.

В спектре ЯМР 'Н (С505Н) цереброзидов 11 имеются сигналы протонов трех типов метильных групп: концевой в нормальной цепи, в изопропильном фрагменте и в Л'-ацетильном фрагменте (5ц 0.87 т, ЗН; 0 86 д, 6Н и 2.18 с). Сигналы двух амидных протонов проявляются при 5Н 8.47 (д, .1=8.4 Гц) и 8.97 (д, .1=8.4 Гц). В спектре обнаруживаются также сигналы двенадцати протонов метиновых/метиленовых групп, связанных с кислородом или азотом, включая аномерный протон моносахаридного остатка (5Н 5.18 д, 7=8.4 Гц). Интенсивный сигнал при 5Н 1.20-1.39 [(СН2)„] и сигнал метиленовой группы рядом с карбонилом (5Н 2.50 т, 1=7.5 Гц) указывают на наличие

углеводородных радикалов, в том числе остатка жирной кислоты.

О

т= 12, 13, 14

Анализ спектров ЯМР 'Н и ЬС и сравнение со спектрами известных ранее цереброзидов позволили предположить, что 11 является производным фитосфингозина, ацилированным по аминогруппе негидроксилированной насыщенной жирной кислотой и замещенным по гидроксилу в первом положении Р-/V-ацети л гл ю козами ном. В самом деле, спектры, в том числе их части, содержащие сигналы моносахарида, практически совпадали со спектрами ранее известных p-D-/V-ацетилглюкозаминилцерамидов, имеющих фитосфингозин в качестве основания.

Для определения длины цепей жирных кислот и сфингозиновых оснований провели метанолиз 11. ГЖХ-МС-Анализ полученных метиловых эфиров жирных кислот показал, что главной кислотой в И является пальмитиновая кислота (более 70% от общей фракции жирных кислот). Две другие жирные кислоты 17:0 и 18:0 составляют около 12 и 16%, соответственно. Спектры ЯМР суммы метиловых эфиров жирных кислот показали, что все жирные кислоты являются нормальными [метальные протоны и углерод метальной группы давали только сигналы бн 0.88 (т, J=7.1, ЗН) и 5С 14.1, соответственно].

Полученные в результате метанолиза сфингозиновые основания анализировали в виде перацетатов методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии. Псевдомолекулярные ионные пики при т : 508 и 522 [A/+Na]+ соответствовали С13- и С|9-фитосфингозинам. В спектре ЯМР 'Н es ммы ацетилированных оснований наблюдались сигналы трех метановых групп, связанных с гетероатомами. дублет NH при 8Н 5.95 и два дублета

лублетов протонов СН2ОАс-группы. Триплет при 5Н 0.88 и дублет при 5Н 0.86

указывали на присутствие как нормальных, так и мзо-концов в сфингозиновых основаниях.

Взаимное расположение функций в сфингозиновых основаниях было подтверждено НМВС экспериментами. Так, в спектре 11 имелись кросс-пики 2Н-1 (5Н 4.64 и 4.59)/С-2 (8С 51.9). С-3 (8С 76.1) и Н-3 (5Н 4.32)/С-1 (5С 68.8). С-2 (5С 51.9), С-4 (8С 72.6). Как известно, химические сдвиги протонов при С-1 - С-4 и соответствующих атомов углерода чувствительны к стереохимии асимметрических центров С-2, С-3 и С-4. Совпадение ЯМР спектров 11 и цереброзидов из халицилиндрозидов А1-А4 из НаНсЪопйгга суНпйгМа позволяет предположить, что они имеют одинаковую относительную стереохимию.

Таким образом, цереброзиды (11) являются производными нормальных и изо-С,8- и С^-фитосфингозинов, ацилированных по аминогруппе негидроксилированными неразветвленными 16:0, 17-0 и 18:0 жирными кислотами и замещенных по гидроксилу в первом положении Р-А'-ацетилглюкозамином. Цереброзиды типа 11 являются новыми вариантами природных гликозилцерамидов и отличаются от халицилиндрозидов А,-А4 выделенных ранее, только длиной жирнокислотных остатков. В самом деле, цереброзиды из Н суИпс/га1а, в отличие от 11, ацилированы по аминогруппе я-21:0, я-22:0, «-23:0 и и-24:0 кислотами.

Сигналы в спектрах ЯМР 'Н и С цереброзидов (12) были близки к соответствующим сигналам в спектрах халицилиндрозидов ВрВб (изо-С16. Сп, С,8 и С19-фитосфингозинов. ацилированных по аминогруппе а-гидроксикислотами и замещенных по первичному гидроксилу Р-А'-ацетилглюкозамином). Спектры ЯМР 12 отличались только наличием сигналов двойной связи (8Н 5.49 м и 8С 130.3). а также сигналами антеизо- разветвления на конце углеводородного радикала (8с 11.6 и 19.4).

Н1

X = 2, 4

т = 20, 21,22

Н<

п = 6, 7, 8

ЫНАс

12

Метанолиз цереброзидов (12) привел к метиловым эфирам а-гидроксикислот. сфингоэиновым основаниям и смеси а- и Р-1-0-метил-Л,-ацетилглюкозаминов. Жирнокислотный анализ был выполнен с помощью ГЖХ-МС. Удельное вращение

этой фракции метиловых эфиров ([<аг]™ -5.4°) позволило предположить, что кислоты имеют Ä-конфигурацию при С-2'. По данным спектра ЯМР 13С все кислоты имеют нормальное строение.

Положение двойных связей в углеродной цепи метиловых эфиров 2-ОН-26:! и 2-ОН-28.1 кислот было установлено методом ГЖХ-МС соответствующих диметилдисульфидных аддуктов (ДМДС) метиловых эфиров жирных кислот. В масс-спектре ДМДС-аддукта метилового эфира 2-ОН-26:1 кислоты (рис. 4) присутствуют пики молекулярного иона при m/z 518, а также характеристических ионов с m/z 401 (C2iH.15S05+. 7%) и m/z 117 (C6HnS+, 6%), указывающие на положение двойной связи между 21 и 22 атомами углерода. В масс-спектре ДМДС-аддукта метилового эфира 28:1 кислоты (рис. 4) присутствуют пики молекулярного иона m/z 546, а также характеристических ионов с m/z 401 (С2зН45$Оз+, 6%) и m/z 145 (C8H|7S+, 7%). Они также свидетельствуют о наличии 21(22)-двойной связи. Положение химических сдвигов соседних с двойной связью углеродов (5С 27.1) в спектре ЯМР |3С метиловых эфиров жирных кислот указывает на ¡шс-конфигурацию двойной связи. Известно, что атомы углерода, соседние с транс- двойной связью, имеют химические сдвиги при 5С 29.5-38.0, а атомы углерода, соседние с цис-двойной связью, при 8С 26.0-28.5.

m/z 518

н3со

m/z 401

m/z 117

Рис. 4. Фрагментация диметилдисульфидных аддуктов метиловых эфиров кислот 2-ОН-26:1Д21 и 2-ОН-28:1Д21 в MC-спектрах электронного удара.

В MALDI-TOF-масс-спектрах перацетатов сфингозиновых оснований наблюдаются пики псевдомолекулярных ионов с m/z 494. 508 и 522 [M+Na]\ что соответствует С^-, С)8- и С^-фитосфингозинам. Сигналы 8С 19.2 и 11.5 в спектре ЯМР 13С указывали на присутствие антеизо-концов, а сигналы 5с 39.0, 23.3 и 22.7 - на

присутствие изо-концов в сфингозиновых основаниях. Сравнение спектра ЯМР Н перацетатов оснований и угла вращения ([сг]^0+8.0°) с соответствующими значениями для сфингозиновых оснований, полученных из цереброзидов из губки И суПпс!гша, позволили предположить 25,35,4/? стереохимию в сфингозиновых основаниях.

Цереброзиды типа 12 также являются новыми вариантами природных гликозилцерамидов. От халицилиндрозидов ВГВ6 они отличаются жирнокислотным составом (единственной их общей жирной кислотой является 2-ОН-24:0) и наличием антеизо-концов в сфингозиновых основаниях.

3. Цереброзиды из офиуры ОрИ'шгасИпа тспжМа. Богатым источником цереброзидов из морских беспозвоночных, отличающихся по структуре и биологическим свойствам от цереброзидов наземных организмов, являются иглокожие (тип ЕсЬтос1егта1а). Необычные цереброзиды были выделены из морских звезд, голотурий, морских ежей. Однако ни один из представителей обширного класса ОрЫигоМеа, одного из пяти классов типа ЕсЫпоскптша. до сих пор не был исследован в направлении изучения структур цереброзидов. Нами впервые были выделены цереброзиды из офиуры ОрМагаИпа /псгшват

Офиуру ОрЫагаЫа 'тсгаьваш дважды экстрагировали этанолом. Экстракт (Зл) концентрировали в вакууме и хроматографировали на колонке с силикагелем в градиентной системе: СНС13—»СНС13:ЕЮН (1 '1)—>ЕЮН. Фракцию, элюируемую в системе СНС13:ЕЮН (1:1), повторно разделяли на колонке с силикагелем в системе СНС13:ЕЮН:Н20 (65:25:2). Фракцию, содержащую цереброзиды. очищали колоночной хроматографией на сефадексе ЬН-20 в системе СНС!3:ЕЮН (1:1). Получили сумму цереброзидов (13).

т = 18,19, 20

П = 6, 7, 8, 9

Структурную идентификацию цереброзидов проводили спектральными методами (ЯМР, МАЬШ-ТОР, ГЖХ-МС) и с помощью химических трансформаций.

Анализ полученных данных показал, что эти цереброзиды являются изо- и н- С^-, С\т, С 18~ и С^-фитосфингозинами, ацилированными по аминогруппе 2-гидрокси С22-С24-насыщенными нормальными жирными кислотами и замещенными по гидроксилу в первом положении Р-глюкопиранозой.

Такие цереброзиды широко распространены в морских беспозвоночных. Они обладают ранозаживляющей активностью, являются ингибиторами ряда ферментов. Ранее такие соединения уже находили в морских звездах, голотуриях и оболочниках. В офиурах цереброзиды обнаружены впервые.

4. ВЫВОДЫ

1 Из экстрактов губки Rhizochalina incrústala выделен ризохалин А, новое биполярное сфинголипидоподобное соединение Его структура установлена как N-этилкарбамоилыюго производного ранее известного ризохалина. Ризохалин А - первый представитель сфинголипидов и сфинголипидоподобных соединений, содержащий редкую карбаматную группу.

2. Из губки Oceanapia sp. выделен новый уникальный алкалоидолипид оценалин А. строение которого установлено спектроскопическими методами и химической деградацией. Оценалин А имеет аллильный метиловый эфир в углеводородной цепи и тетрагидроизохинолиновую и 2-амино-З-гидроксипропильную структурные единицы на концах этой цепи. Показано, что оценалин А проявляет противогрибковую активность против штамма Candida glabrata, вызывающего микозы у ВИЧ-инфицированных больных.

3. Из этой же губки выделена и структурно изучена серия из восемнадцати новых церамидов. содержащих U30-C]s- и С]9-фитосфингозины и ацилированных по аминогруппе негидроксилированными жирными кислотами.

4. Два типа цереброзидов, содержащих Д'-ацетилглюкозамин, выделены из губки Oceanapia sp. Шесть новых цереброзидов первого типа содержат н- и изо- С|8- и С,д-фитосфингозины. ацилированные по аминогруппе н-16:0, н-17:0 и «-18:0 жирными кислотами. Пятнадцать цереброзидов второго типа (из них двенадцать - новых) являются производными изо- и антеизо-Cfj-, С ir- и Сщ-фитосфингозинов, ацилированных по аминогруппе длинноцепными (C24-C2g) а-гидроксикислотами.

5. Из экстрактов офиуры Ophiarachna incrassata выделены цереброзиды, которые структурно идентифицированы как производные изо- и н- C|6-, C17-, C]g- и С]9-фитосфингозинов. ацилированных по аминогруппе а-гидрокси С22-С24-насыщенными нормальными жирными кислотами и гликозилированых Р-глюкопиранозой. В офиурах цереброзиды обнаружены впервые.

Основные публикации по теме диссертации

1. Makarieva T.N, Denisenko V.A. Dmitrenok P.S, Guzii A.G., Santalova E.A.. Stonik V.A., MacMillan J.В., Molinski T.F. Oceanalin A, a hybrid alpha.omega-bifunctionalized sphingoid tetrahydroisoquinoline beta-glycoside from the marine sponge Oceanapia sp. // Org. Lett. 2005. V. 7, No 14. P. 2897-2900.

2. Makarieva, T.N., Guzii, A.G.. Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Santalova E.A, Pokanevich E.V., Molinski T.F., Stonik V.A. Rhizochalin A, a novel two-headed sphingolipid from the sponge Rhizochalina incrustata // J. Nat. Prod. 2005. V. 68, No 2. P. 255-257.

3. Гузий А.Г., Макарьева Т.Н.. Светашев В.И., Денисенко В.А.. Дмитренок П.С., Поканевич Е.В., Сантапова Е.А., Красохин В.Б., Стоник В.А. Новые церамиды из морской губки Oceanapia sp. // Биоорган, химия. 2006. Т. 32, № 3. С. 320-327.

4. Makarieva T.N, Denisenko V A. Dmitrenok P.S, Guzii A.G., Santalova E.A., Stonik V.A., MacMillan J.B., Molinski T.F. Oceanalin A, a hybrid alpha,omega-bifuncticmalized sphingoid tetrahydroisoquinoline beta-glycoside from the marine sponge Oceanapia sp. // 4th Furopian Conference on Marine Natural Products: book of abstr. - Paris, France. 2005. P. 50.

5. Makarieva T.N., Guzii A.G., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Santalova E.A, Pokanevich E.V., Molinski T.F.. Stonik V.A. Novel sphingolipids and unusual sphingolipids-like compounds from the sponges Rhizochalina incrustata and Oceanapia sp. // XI International Symposium on Marine Natural Products: book of abstr. - Sorrento, Italy. 2004. P. 68.

6. Гузий А.Г., Макарьева Т.Н.. Светашев В.И., Денисенко В.А., Дмитренок П.С., Поканевич Е.В., Сантапова Е.А., Красохин В.Б., Стоник В.А. Новые церамиды из тропической губки Oceanapia sp. // Региональная научная конференция «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии»: сб. тез. докл. - Владивосток. 2004. С. 27.

7. Макарьева Т.Н.. Денисенко В.А., Дмитренок П.С., Гузий А.Г., Сантапова Е.А., Стоник В.А., МакМилан Д., Молинский Т.Ф. Оценалин А, беспрецедентный а,со-бифункцинальный сфингоидный р-гликозид из морской губки Oceanapia sp. // Региональная научная конференция «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии»: сб. тез. докл. - Владивосток. 2004. С. 26.

Соискатель

Гузий А. Г.

"7043

р-7043

Гузий Алла Григорьевна

Стр) ктурное изучение сфинголипидов и сфинголипидоподобных соединений из некоторых морских беспозвоночных АВТОРЕФЕРАТ

ЗАО «Фартоп» г. Владивосток, ул. Адм. Фокина. 31

Тираж 100 экз. Изготовлено с машинописных листов Отпечатано 21 марта 2006 г.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Сфинголипиды губок, особенности строения, свойства и таксономическое распределение.

2.1. Простые сфингозиновые производные.

2.2. Церамиды.

2.3. Гликосфинголипиды.

2.4. Биполярные сфинголипидоподобные соединения.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Ризохалин А из губки Rhizochalina incrustata.

3.2. Сфинголипиды из губки Oceanapia sp.

3.2.1. Оценалин А из губки Oceanapia sp.

3.2.2. Церамиды из губки Oceanapia sp.

3.2.3. Цереброзиды из губки Oceanapia sp.

3.3. Цереброзиды из офиуры Ophiarachna incrassata.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. ф 4.1. Приборы и материалы.

4.2. Биологический материал.

4.3. Выделение ризохалина А из губки Rhizochalina incrustata.

4.4. Выделение оценалина А из губки Oceanapia sp.

4.5. Выделение церамидов из губки Oceanapia sp.

4.6. Выделение цереброзидов из губки Oceanapia sp.

4.7. Выделение цереброзидов из офиуры Ophiarachna incrassata.

5. ВЫВОДЫ.

Актуальность проблемы. Сфинголипиды - это один из наиболее разнообразных по химическому строению и функциональной активности классов липидных молекул. Их название происходит от слова "sphinx" (греч.), что означает «загадочный». К этому классу относятся сфингозиновые основания и их производные: церамиды, фосфосфинголипиды и гликосфинголипиды (цереброзиды и ганглиозиды). К настоящему времени из различных биологических источников выделено несколько сотен сфинголипидов, в основном" производных сфингозиновых оснований, отличающихся друг от друга химическим строением. Наблюдающийся в последнее время повышенный интерес к структурным исследованиям сфинголипидов является следствием нескольких важных научных событий, К ним можно отнести открытие целого ряда новых структурных серий морских сфинголипидов и, в еще большей степени, установление важной роли отдельных сфинголипидов в регуляции процессов роста, дифференциации и апоптоза клеток. Кроме того, были найдены такие природные соединения, которые имеют определенное сходство в строении и, по-видимому, в биогенезе со сфинголипидами, но в то же время существенно отличаются от классических сфинголипидов и могут быть названы сфинголипидоподобными метаболитами.

Особый интерес из них представляют так называемые двухголовые сфинголипиды, которые были открыты в 1989 г. в Лаборатории химии морских природных соединений Тихоокеанского института биоорганической химии. В настоящее время не ясны биосинтетические пути образования таких липидов, приводящих к а,со-бифункционализации оснований сфингоидного типа. Эти соединения не имеют структурных аналогов среди известных природных соединений и чрезвычайно редки. До сих пор они были найдены только в некоторых губках. Двухголовые сфинголипиды замечательны и своими биологическими свойствами. Так, недавно было обнаружено, что некоторые из них в низких концентрациях ингибируют рост Candida glabrata. Этот вид грибов, наряду с другими видами рода Candida, вызывает кандидозы, которые являются одними из самых частых оппортунистических микозов при низком иммунном статусе, в том числе на любой стадии развития ВИЧ-инфекции. В настоящее время известны лишь единичные примеры веществ, способных подавлять рост Candida glabrata.

Поиск новых типов противогрибковых природных соединений - не только важный-этап разработки новых лекарственных средств. Он имеет и фундаментальное значение в плане открытия новых молекулярных мишеней, взаимодействие с которыми может привести к противогрибковому эффекту. Кроме того,, выделение новых вторичных метаболитов, в том числе сфинголипидов и сфинголипидоподобных соединений, и установление их химического строения обычно предшествует решению ряда других задач биоорганической химии, например, установлению их биологических функций, выявлению зависимости структура-активность, изучению биосинтеза, разработке схем полного химического синтеза, определению механизмов биологического действия и т.п.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось выделение и установление строения сфинголипидов и необычных сфинголипидоподобных вторичных метаболитов из губок Rhizochalina incrustata, Oceanapia sp. и офиуры Ophiarachna incrassata.

Для достижения этой цели были решены следующие задачи: 1) выбраны объекты исследования; 2) получены соответствующие экстракты; 3) разработаны схемы выделения целевых веществ; 4) осуществлено разделение соответствующих фракций, получены и очищены индивидуальные природные соединения или, в тех случаях, когда это было невозможно, суммы сфинголипидов; 5) выполнен анализ спектральных данных, получены производные, которые, в свою очередь, также исследованы с помощью ЯМР и масс-спектрометрии; 6) установлены структуры целевых соединений и 7) для некоторых из них изучена биологическая активность.

Научная новизна и практическая ценность работы. Из двух видов губок было выделено 2 новых сфинголипидоподобных метаболита и 39 новых сфинголипидов, установлены их структуры. Впервые в офиурах идентифицированы 12 цереброзидов. Изучены ЯМР и масс-спектры этих природных соединений, исследованы некоторые химические свойства. Получены новые данные о противогрибковой активности некоторых сфинголипидоподобных веществ морского происхождения, что открывает возможности дальнейшего поиска в этом ряду высокоактивных соединений для создания на их основе новых лекарственных средств.

Публикация результатов исследования. Основные результаты данной работы опубликованы в таких научных журналах как: «Organic Letters», «Journal of Natural Products», «Биоорганическая химия». Материалы работы были представлены на четвертой Европейской Конференции по Морским природным соединениям в 2005 году в Париже; на одиннадцатом международном симпозиуме по Морским природным соединениям в 2004 году в Сорренто (Италия); на Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии», Владивосток, 2004. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, посвященного особенностям химического строения сфинголипидов морских губок, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 106 цитируемых работ. Работа изложена на 106 страницах, содержит 13 таблиц, 1 схему и 15 рисунков.

5. ВЫВОДЫ

1. Из экстрактов губки Rhizochalina incrustata выделен ризохалин А, новое биполярное сфинголипидоподобное соединение. Его структура установлена как А^-этилкарбамоильного производного ранее известного ризохалина. Ризохалин А - первый представитель сфинголипидов и сфинголипидоподобных соединений, содержащий редкую карбаматную группу.

2. Из губки Oceanapia sp. выделен новый уникальный алкалоидолипид оценалин А, строение которого установлено спектроскопическими методами и химической деградацией. Оценалин А имеет аллильный метиловый эфир в углеводородной' цепи и тетрагидроизохинолиновую и 2-амино-З-гидроксипропильную структурные единицы на концах этой цепи. Показано, что оценалин А проявляет противогрибковую активность против штамма Candida glabrata, вызывающего микозы у ВИЧ-инфицированных больных.

3. Из этой же губки выделена и структурно изучена серия из восемнадцати новых церамидов, содержащих изо-Cjg- и С^-фитосфингозины и ацилированных по аминогруппе негидроксилированными жирными кислотами.

4. Из губки Oceanapia sp. выделены два типа цереброзидов, содержащих А^-ацетилглюкозамин, Шесть новых цереброзидов первого типа содержат н- и изо- С is- и С^-фитосфингозины, ацилированные по аминогруппе н-16:0, н-17:0 и н-18:0 жирными кислотами. Пятнадцать цереброзидов второго типа (из них двенадцать - новых) являются производными изо- и антеизо-С\1-, Cig- и С(9-фитосфингозинов, ацилированных по аминогруппе длинноцепными (С24-Сгв) а-гидроксикислотами.

5. Из экстрактов офиуры Ophiarachna incrassata выделены цереброзиды, которые структурно идентифицированы как производные изо-и н- С 1б~) Си-, С|8- и С^-фитосфингозинов, ацилированных по аминогруппе а-гидрокси С22-С24-насыщенными нормальными жирными кислотами и гликозилированых (З-глюкопиранозой. В офиурах цереброзиды обнаружены впервые.

1. Gulavita N.K., Scheuer P J. Two Epimeric aliphatic amino alcohols from a sponge Xestospongia sp // J. Org. Chem. 1989. Vol. 54. P. 366-369.

2. Alvi K.A., Jaspars M., Crews P. Penazetidine A, an alkaloid inhibitor of protein kinase С // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994. Vol. 4. P. 2447-2450.

3. Kuroda I., Musman M., Ohtano I.I., Ichiba Т., Tanaka J., Gravalos D.G., (j^ Higa T. Pachastrissamine, a cytotoxic anhydrophytosphingosine from themarine sponge, Pachastrissa sp // J. Nat. Prod. 2002. Vol. 65. P. 1505-1506.

4. Ledroit V., Debitus C., Lavaud C., Massiot G. Jaspines A and B: two new cytotoxic sphingosine derivatives from the marine sponge Jaspis sp. // Tetrahedron Lett. 2003. Vol. 44. P. 225-228.

5. Grode S., Cardellina J.H. Ceramides from the sponge Dysidea etherria II « Lipids. 1983. Vol. 18. P. 889-893.

6. Hirsch S., Kashman Y. New Glycosphingolipids from marine organisms // Ш Tetrahedron. 1989. Vol. 45. P. 3897-3906.

7. Garg H.S., Agrawal S. A novel sphingosine derivative from the sponge Spirastrella inconstans II J. Nat. Prod. 1995. Vol. 58. P. 442-445.

8. Hattori Т., Adachi K., Shizuri Y. New ceramide from marine sponge Haliclona koremella and related compounds as antifouling substances against macroalgae // J. Nat. Prod. 1998. Vol. 61. P. 823-826.

9. Moon D.H., Hwang K.H., Choi K.R., Kim C., Kim J., Lee Y., Zee O. Some peroxysterols and ceramides from Phellinus ribis, a Korean wild mushroom // Ann. Sci. Technol. 1995. Vol. 8. P. 901-906.

10. Yaoita Y., Ishizuka Т., Kukuda R., Machida K., Kikuchi M. Structures of new ceramides from the fruit bodies of Grifola frondosa I I Chem. Pharm. Bull. 2000. Vol.48. P. 1356-1358.

11. Muralidhar P., Krishna N., Kumar M.M., Rao C.B., Rao D.V, New sphingolipids from marine sponge Iotrochota baculifera И Chem. Pharm. Bull. 2003. Vol. 51. P. 1193-1195.

12. Meyer M., Guyot M. New sphingolipids from the marine sponge Grayella cyatophora II J. Nat. Prod. 2002. Vol. 65. P. 1722-1723.

13. Tilvi S., Majik M., Naik C.G. A tandem mass spectrometric approach for determining the structure of molecular species of ceramide in the marine sponge Haliclona cribricutis И Eur. J. Mass Spectrom. 2005. Vol. 11. P. 345351.

14. Zhang G.W., Ma X.Q., Zhang C.X., Su J.Y., Ye W.C., Zhang X.Q., Yao X.S., Zeng L.M. Two novel ceramides from the marine sponge Ircinia fasciculata И Helv. Chim. Acta. 2005. Vol. 88. P. 885-890.

15. Ramesh P., Pavikanth V., Reddy V.L.N., Venkateswarlu Y. A novel ceramide from the Indian marine sponge Fasciospongia cavernosa II J. Chem. Res. S. 2001. P. 232-234.

16. Nakao Y., Takada K., Matsunaga S., Fusetani N. Calyceramides A-C: neuraminidase inhibitory sulfated ceramides from the marine sponge Discodermia calyx И Tetrahedron. 2001. Vol. 57. P. 3013-3017.

17. Agrawal S., Garg H.S. Sphingolipid and sterols of the sponge Callyspongia spinosissima II Indian J. of Chem. 1997. Vol. 36B. P. 343-346.

18. Mancini I., Guella G., Debitus C., Pietra F. Oceanapins A-F, unique branched ceramides isolated from the haplosclerid sponge Oceanapia cf. tenuis of the Coral Sea// Helv. Chim. Acta. 1994. Vol. 77. P. 51-58.

19. Tan R.X., Chen J.H. The cerebrosides // Nat. Prod. Rep. 2003. Vol. 20. P. 509-534.

20. Shier W.T., Shier A.C. Sphingosine- and ceramide-analog toxins an update // J. Toxicol. - Toxin Rewiews. 2000. Vol. 19. P. 189-246.

21. Natori Т., Koezuka Y., Higa T. Agelasphins, novel a-galactosylceramides from the marine sponge Agelas mauritianus II Tetrahedron Lett. 1993. Vol. 34. P. 5591-5592.

22. Natori Т., Morita M., Akimoto K., Koezuka Y. Agelasphins, novel antitumor and immunostimulatory cerebrosides from the marine sponge Agelas mauritianus I I Tetrahedron. 1994. Vol. 50. P. 2771-2784.

23. Costantino V., Fattorusso E., Mangoni A. Glycolipids from sponge. IV. Immunomodulating glycosyl ceramides from the marine sponge Agelas distar II Tetrahedron. 1996. Vol. 52. P. 1573-1578.

24. Cafieri F., Fattorusso E., Mahajnah Y., Mangoni A. Longiside, a novel digalactosylceramide from the Caribbean sponge Agelas longissima II Liebigs Ann. Chem. 1994. P. 1187-1189.

25. Costantino V., Fattorusso E., Mangoni A. Glycolipids from sponges. 3. Glycosyl ceramides from the marine sponge Agelas conifera // Liebigs Ann. 1995. P. 2133-2136.

26. Costantino V., Fattorusso E., Mangoni A. Glycolipids from sponges. 1. Glycosyl ceramide composition of the marine sponge Agelas clathrodes II LiebigsAnn. 1995. P. 1471-1475.

27. Costantino V., Fattorusso E., Imperatore C., Mangoni A. Vesparioside from the marine sponge Spheciospongia vesparia, the first diglycosylceramide with a pentose sugar residue // Eur. J. Org. Chem. 2005. P. 368-373.

28. Costantino V., Fattorusso E., Mangoni A., Aknin M., Gaydou E.M, Axiceramide A and B, two novel tri-a-glycosylceramides from the marine sponge Axinella sp // Liebigs Ann. Chem. 1994. P. 1181-1185.

29. Hayashi A., Nishimura Y., Matsubara T. Occurrence of ceramide digalactoside as the main glycosphingolipid in the marine sponge Halichondria japonica И Biochim. Biophys. Acta. 1991. Vol. 1083. P. 179-186.

30. Li H.Y., Matsunaga S., Fusetani N. Halicylindrosides, antifungal and cytotoxic cerebrosides from the marine sponge Halichondria cylindrata II Tetrahedron. 1995. Vol. 51. P. 2273-2280.

31. Deng S.Z., Tian C.L., Xiao D.J., Wu H.M. Iotroridoside-A, a novel cytotoxic glycosphingolipid from the marine sponge Iotrochota ridley II Chinese. J. Chem. 2001. Vol. 19. 362-364.

32. Schmitz F.J., McDonald F.J. Isolation and identification of cerebrosides from the marine sponge Chondrilla nucula II J. Lipid Res. 1974. Vol. 15. P. 158-164.

33. Endo M., Nakagawa M., Hamamoto Y., Ishihama M. Pharmacologically active substances from southern Pacific marine invertebrates // Pure Appl. Chem. 1986. Vol. 58. P. 387-394.

34. Emura C., Higuchi R., Myamoto T. Amphimelibiosides A-F, six new dihexosides isolated from a Japanese marine sponge Amphimedon sp // J. Org. Chem. 2005. Vol. 70. 3031-3038.

35. Costantino V., Fattorusso E., Imperatore C., Mangoni A. Glycolipids from sponge. Part 12. Ectyoceramide, the first natural hexofuranosylceramide from the marine sponge Ectyoplasia ferox II Eur. J. Org. Chem. 2003. P. 1433-1437.

36. Costantino V., Fattorusso E., Mangoni A. Glycolipids from sponges. Part 9: Plakoside C and D, two further prenylated glycosphingolipids from the marine sponge Ectyoplasia ferox II Tetrahedron. 2000. Vol. 56. P. 5953-5957.

37. Nagle D.G., McClatchey W.C., Gerwick W.H. New glycosphingolipids from the marine sponge Halichondriapanacea И J. Nat. Prod. 1992. Vol. 55. P. 1013-1017.

38. Макарьева Т.Н., Денисенко B.A., Светашев В.И., Высоцкий М.В., Стоник В.А. Цереброзиды дальневосточной губки Hymenyacidon assimilis // Химия природ, соединений. 1989. № 5. С. 634-639.

39. Sakai Т., Koezuka Y. Glycolipid derivatives as therapeutic agents // Exp. Opin. Ther. Patents. 1999. Vol. 9. P. 917-930.

40. Nicholas G.M., Hong T.W., Molinski T.F., Lerch M.L., Cancilla M.T., Lebrilla C.B. Oceanapiside, an antifungal bis-a,ct)-amino alcohol glycoside from the marine sponge Oceanapiaphillipensis II J. Nat. Prod. 1999. Vol. 62. P. 1678-1681.

41. Makarieva T.N., Denisenko V.A., Stonik V.A., Milgrom Yu.N., Rashkes Ya.W. Rhizochalin, a novel secondary metabolite of mixed biosynthesis from the sponge Rhizochalina incrustata II Tetrahedron Lett. 1989. Vol. 30. P. 6581-6584.

42. Zhou B.N., Mattern M.P., Johnson R.K., Kingston D.G. Structure and stereochemistry of a novel bioactive sphingolipid from a Calyx sp // Tetrahedron. 2001. Vol. 57. P. 9549-9554.

43. Kong F.H., Faulkner D.J. Leucettamol-A and leucettamol-B, 2 antimicrobial lipids from the calcareous sponge //J. Org. Chem. 1993. Vol. 58. P. 970-971.

44. Willis R.H., De Vries D.J. BRS1, a C30 bis-amino, bis-hydroxy polyunsaturated lipid from an Australian calcareous sponge that inhibits pronein kinase С // Toxicon. 1997. Vol. 35. P. 1125-1129.

45. Casapullo A., Fontana A., Cimino G. Coriacenins: A new class of long alkyl chain amino alcohols from the Mediterranean sponge Clathrina coriacea II J. Org. Chem. 1996. Vol. 61. P. 7415-7419.

46. Jayatilake G.S.,-Baker B.J., McClintock J.B. Rhapsamine, a cytotoxin from the Antarctic sponge Leucetta leptorhapsis II Tetrahedron Lett. 1997. Vol. 38. P. 7507-7510.

47. Molinski T.F., Makarieva T.N., Stonik V.A. (-)-Rhizochalin is a dimeric enantiomorphic (2J/?)-sphingolipid: absolute configuration of pseudo-C2V-symmetric bis-2-amino-3-alkanols by CD // Angew. Chem. Int. Ed. 2000. Vol. 39. P. 4076-4079.

48. Uy M.M., Ohta S., Yanai M., Ohta E., Hirata Т., Ikegami S. New spirocyclic sesquterpenes from the marine sponge Geodia exigua И Tetrahedron. 2003. Vol. 59. P. 731-736.

49. Ovender S.P.B., Capon R.J. Echinosulfonic acids A-C and echinosulfone A: Novel bromoindole sulfonic acids and a sulfone from a southern Australian marine sponge, Echinodictyum II J. Nat. Prod. 1999. Vol. 62. P. 1246-1249.

50. Gunasekera S.P., Gunasekera M., Longley R.E., Schulte G.K. Discodermolide: A new bioactive polyhydroxylated lactone from the marine sponge Discodermia dissoluta //J. Org. Chem. 1990. Vol. 55. P. 4912-4915.

51. Matsunaga S., Fusetani N., Hashimoto K., Koseki K., Noma M. Kabiramide C, a Novel antifungal macrolide from Nudibranch Eggmasses // J. Am. Chem. Soc. 1986. Vol. 108. P. 847-849.

52. Carroll A.R., Ngo A., Quinn R.J., Redburn J., Hooper J.N.A. Petrosamine B, an inhibitor of the Helicobacter pylori enzyme aspartyl semialdehyde dehydrogenase from the Australian sponge Oceanapia sp. // J. Nat. Prod. 2005. Vol. 68. P. 804-806.

53. Eder C., Schupp P., Proksch P., Wray V., Steube K., Muller C.E., Frobenius M., Herderich M., VanSoest. R.W.M.- Bioactive pyridoacridine alkaloids from the Micronesian sponge Oceanapia sp. // J. Nat. Prod. 1998. Vol. 61. P. 301-305.

54. Salomon C.E., Faulkner D.J. Sagitol, a pyridoacridine alkaloid from the sponge Oceanapia sagittara // Tetrahedron Lett. 1996. Vol. 37. P. 9147-9148.

55. Boyd K.G., Harper M.K., Faulkner D.J. Oceanapamine, a sesquiterpene alkaloid from the philippine sponge Oceanapia sp. // J. Nat. Prod. 1995. Vol. 58. P. 302-305.

56. Capon R.J., Skene C., Liu E.H.T., Lacey E., Heiland K., Friedal T. The isolation and synthesis of novel nematocidal dithiocyanates from an australian marine sponge Oceanapia sp. //J. Org. Chem. 2001. Vol. 66. P. 7765-7769.

57. Ichiba Т., Scheuer P.J., Kellyborges M. Sponge-derived polyunsaturated C-16 dibromocarboxylic and tribromocarboxylic acids // Helv. Chim. Acta. 1993. Vol. 76. P. 2814-2816.

58. Matsunaga S., Okada Y., Fusetani N., VanSoest R.W.M. An antimicrobial С и acetylenic acid from a marine sponge Oceanapia species II J. Nat. Prod. 2000. Vol. 63. P. 690-691.

59. Nicholas G.M., Newton G.L., Bewley C.A. Novel bromotyrosine alkaloids: Inhibitors of mycothiol S-conjugate amidase // Org. Lett. 2001. Vol. 3. P. 15431545.

60. Kohmoto S., McConnell O.J., Wright A. l,l-Dimethyl-5,6-dihydroxyindolinium chloride from a deep-water marine sponge, Dercitus sp. // Experientia. 1988. Vol. 44. P. 85-86.

61. Choudhury S.R., Traquair J.P., Jarvis W.R. New extracellular fatty-acids in culture filtrates of Sporothrix flocculosa and S. rugulosa И Can. J. Chem. 1995. Vol. 73. P. 84-87.

62. Snatzke G. Circular-dichroism and absolute conformation application of qualitative MO theory to chiroptical phenomena // Angew. Chem. Int. Ed. 1979. Vol. 18. P. 363-377.

63. Chrisey L.A., Brossi A. i?-(+)-tetrahydroharmine and S-(-)~ tetrahydroharmine preparation of optically pure alkaloids and acid-catalyzed racemization //Heterocycles. 1990. Vol. 30. P. 267-270.

64. De Konining C.B., Van Otterlo W.A.L., Michael J.P. Amide rotamers of N-acetyl-l,3-dimethyltetrahydroisoquinolines: synthesis, variable temperature NMR spectroscopy and molecular modeling // Tetrahedron. 2003. Vol. 59. P. 8337-8345.

65. Kitamura M., Tsukamoto M., Takaya H., Noyori R. Conformational study on 2-acyl-l-alkylidene-l,2,3,4-tetrahydroisoquinolines // Bull. Chem. Soc. Japan. 1996. Vol. 69. P. 1695-1700.

66. Fraenkel G., Cava M.P., Dalton D.R. Hindered Rotation in l-Benzyl-1,2,3,4-tetrahydro-6,7-dimethoxyisoquinolines // J. Am. Chem. Soc. 1967. Vol. 89. P. 329-332.

67. Takada K., Uehara Т., Nakao Y., Matsunaga S., Van Soest R.W.M., Fusetani N. Schulzeines A-C, new alpha-glucosidase inhibitors from the marine sponge Penares schulzei //J. Am. Chem. Soc. 2004. Vol. 126. P. 187-193.

68. Battersby A.R., Binks R., Huxtable R. Biosynthesis of pellotine // Tetrahedron Lett. 1968. Vol. 9. P. 6111-6115.

69. Lundstrom J. Isoquinoline alkaloid biosynthesis // Alkaloids / Brossi, A. (Ed.). New York, 1983. Vol. 21. P. 312.

70. Merrill A.H., Sandhoff K. Sphingplipids: metabolism and cell signaling // Biochem. Lipids Lipopro. 2002. P. 373-407.

71. Merrill A.H. De novo sphingolipid biosynthesis: a necessary, but dangerous, phathway // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 25843-25846.

72. Liao J., Tao J., Lin G., Liu D. Chemistry and biology of sphingolipids // Tetrahedron. 2005. Vol. 61. P. 4715-4733.

73. Brodesser S., Sawatzki P., Kolter T. Bioorganic chemistry of ceramide // Eur. J. Org. Chem. 2003. P. 2021-2034.

74. ApSimon J.W. Structure, synthesis, and biosynthesis of fumonisin B) and related compounds // Envirin. Health Persp. 2001. Vol. 109. P. 245-249.

75. Boyle C.D., Harmange J.-C., Kishi Y. Novel structure elucidation of AAL toxin T-A backbone // J. Am. Chem. Soc. 1994. Vol. 116. P. 4995-4996.

76. Branham B.E., Plattner R.D. Alanine is a precursor in the biosynthesis of fumonisin B-l by Fusarium-moniliforme II Mycopathologia. 1993. Vol. 124. P. 99-104.

77. Kossuga M.H., MacMillan J.B., Rogers E.W., Molinski T.F., Nascimento G.S. F., Rocha R.M., Berlinck R.G.S. (26',3^)-2-aminododecan-3-ol, a new antifungal agent from the ascidian Clavelina oblonga // J. Nat. Prod. 2004. Vol. 67. P. 1879-1881.

78. Clark R.J., Garson M.J., Hooper J.N.A. Antifungal alkyl amino alcohols from the Tropical marine sponge Haliclona n. sp // J. Nat. Prod. 2001. Vol. 64. P. 1568-1571.

79. Мецлер Д. Биохимия: в 2 т. M.: Мир. Т. 2: Химические реакции в живой клетке. - 1980. - 312 с.

80. Richter R.K., Mickus D.E., Rychnovsky S.D., Molinski T.F. Differential modulation of the antifungal activity of amphotericin В by natural and ent-cholesterol // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004. Vol. 14. P. 115-118.

81. Asai N., Fusetani N., Matsunaga S., Sasaki J. Sex pheromones of the hair crab Erimacrus isenbeckii. Part 1: Isolation and structures of Novel ceramides // Tetrahedron. 2000. Vol. 56. P. 9895-9899.

82. Sugita M. Studies on glycosphingolipids of starfish, Asterina-pectinifera. 1. Isolation and characterization of ceramide mono-hexosides and dihexosides // J. Biochem. 1977. Vol. 82. P. 1307-1312.

83. Sugiyama S., Honda M., Komori T. Biologically-active glycosides from Asteroidea. 15. Asymmetric-synthesis of phytosphingosine and phytosphingosine anhydro base-assignment of absolute stereochemistry // Liebigs Ann. Chem. 1988. P. 619-625.

84. Hammarstrom S. Gas-liqiuid chromatography-mass spectrometry of synthetic ceramides containing phytosphingosine // J. Lipid Res. 1970. Vol. 11. P. 175-182.

85. Nichols F.C. Novel ceramides recovered from Porphyromonas gingivalis: relationship to adult periodontitis // J. Lipid Res. 1998. Vol. 39. P. 2360-2372.

86. Raith K., Darius J., Neubert R.H. Ceramide analysis utilizing gas chromatography-mass spectrometry//J. Crom. A. 2000. Vol. 876. P. 229-233.

87. Lynch D.V., Dunn T.M. An introduction to plant sphingolipids and a review of recent advances in understanding their metabolism and function // New Phytologist. 2004. Vol. 161. P. 677-702.

88. Sperling P., Heinz E. Plant sphingolipids: structural diversity, biosynthesis, first genes and functions // Biochim. Biophys. Acta. 2003. Vol. 1632. P. 1-15.

89. Dickson R.C., Lester R.L. Yeast sphingolipids // Biochimica et Biophysica Acta. 1999. Vol. 1426. P. 347-357.

90. Loukasi A., Bultel-Ponce V., Longeon A., Guyot M. New lipids from the tunicate Cystodytes cf. dellechiajei, as PLA2 inhibitors // J. Nat. Prod. 2000. Vol. 63. P. 799-802.

91. Rupcic J., Mesaric M., Marie V. The influence of carbon on the level and composition of ceramides of the Candida lipolytica yeast // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. Vol. 50. P. 583-588.

92. Yamada K., Sasaki K., Harada Y., Isobe R., Higuchi R. Constituents of holothuroidea, 12. Isolation and structure of glucocerebrosides from the sea cucumber Holoturia pervicax II Chem. Pharm. Bull. 2002. Vol. 50. P. 14671470.

93. Higuchi R., Kagoshima M., Komori T. Structures of three new cerebrosides, Astrocerebroside А, В and С and related nearly homogeneous cerebrosides // Liebigs Ann. Chem. 1990. Vol. 3. P. 659-663.

94. Kawano Y., Higuchi R., Isobe R., Komori T. Isolation and structure of six new cerebrosides // Liebigs Ann. Chem. 1988. Vol. 5. P. 19-24.

95. Venkannababu U., Bhandari S.P.S., Garg H.S. Regulosides A-C: Glycosphingolipids from the starfish Pentaceraster regulus II Liebigs Ann. Reel. 1997. Vol. 6. P. 1245-1247.