Термодинамический анализ роли межмолекулярных взаимодействий в функциональности биополимеров в многокомпонентных растворах и коллоидных системах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

Семёнова Мария Германовна

ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РОЛИ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В ФУНКЦИОНАЛЬНОСТИ БИОПОЛИМЕРОВ В МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ РАСТВОРАХ И КОЛЛОИДНЫХ СИСТЕМАХ

02 00 04 -физическая химия 02 00 06 - высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва 2007

003065416

Работа выполнена в Институте биохимической физики им Н М Эмануэля Российской академии наук

Официальные оппоненты

Геннадий Ефремович Заиков доктор химических наук, профессор

Игорь Александрович Ямсков доктор химических наук, профессор

Александр Ильич Кокорин доктор химических наук, профессор

Ведущая организация Российский химико-технологический университет им Д И Менделеева

Защита диссертации состоится « » 0/(/7)@00$ 2007 г

в 7 часов на заседании Диссертационного Совета Д 002 039 01 в Институте биохимической физики им Н М Эмануэля РАН по адресу г Москва, ул Косыгина, д 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им Н Н Семенова РАН по адресу, г Москва, ул Косыгина, д 4

Автореферат разослан « 5~ » ёШ/ПЛбиЛ 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук /V, О М А Смотряева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы и основные направления исследования

Наиболее широко представленными в природе биополимерами являются белки и полисахариды, которые, благодаря большому разнообразию их молекулярных структур и свойств, выполняют множество важных и хорошо известных биологических функций, как в организме человека и животных, так и в растениях При этом одной из ключевых функций белков и полисахаридов, вытекающих из их полимерной природы, является их структурообразующая функция В ее основе лежат ярко выраженные способности биополимеров к самоассоциации, конформационным изменениям, адсорбции на границах раздела фаз, а также к фазовому расслоению или, напротив, к комплексообразованию с отличающимися по своей молекулярной природе биополимерами и низкомолекулярными соединениями Так, например, благодаря этой функции, биополимеры участвуют в построении клеточных мембран и структур различных тканей и жидких сред в живых организмах и растениях, а также способны гибко регулировать ионный, глюкозный или липидный обмен между клеткой и ее окружением

В настоящее время во всем мире отмечается растущий интерес к использованию структурообразующей функции биополимеров т vitro для создания продукции, обладающей усовершенствованной или уникальной структурой и свойствами, а также высокой физической стабильностью Этот интерес, с одной стороны, подготовлен накопленными глубокими знаниями о молекулярных свойствах индивидуальных биополимеров, способах их очистки и выделения из природного сырья, а также успехами в их широкомасштабном производстве и длительном хранении С другой стороны, он вызван возрастающей потребностью, в частности, пищевой, фармацевтической и косметической промышленности в разнообразных экологически чистых и высокофункциональных ингредиентах для разработки и выпуска, так называемой, «функциональной» продукции нового поколения, отличающейся ярко выраженным положительным воздействием на здоровье людей и, тем самым, на качество их жизни Положительными особенностями биополимеров, как потенциальных базовых ингредиентов для таких продуктов, наряду с их высокой полифункциональностью, являются также их биосовместимость и нетоксичность Кроме того, перспективность промышленного использования биополимеров, очевидно, определяется большим разнообразием их молекулярных структур и свойств, что открывает широкие возможности для молекулярного дизайна продукции нового поколения с уникальной структурой и свойствами

В дополнение к этому, можно сказать, что растущий интерес к функциональности биополимеров в настоящее время вызван также новыми экологическими требованиями сегодняшнего дня к химической индустрии в целом, а именно к разработке и выпуску биодеградируемых материалов

Однако, в то же время, как показала практика, для целенаправленного использования биополимеров в качестве функционально - активных ингредиентов, знание только их индивидуальных макромолекулярных свойств оказалось абсолютно недостаточным Как правило, если основываться только на этих знаниях, то результат введения биополимеров в реально важные многокомпонентные системы, содержащие смеси различных по природе биополимеров и низкомолекулярных веществ (солей, липидов, низкомолекулярных Сахаров, ароматообразующих соединений, и тд), может оказаться даже противоположным ожидаемому

Таким образом, к моменту начала нашей работы, было уже очевидно, что эффективное, целенаправленное и контролируемое использование биополимеров in vitro станет возможным только при ясном понимании роли межмолекулярных взаимодействий в их функциональности в многокомпонентных системах определенного состава

При этом среди наиболее распространенных и востребованных многокомпонентных систем, особое место занимают системы коллоидного типа на основе водных растворов биополимеров, т е такие, которые наряду с водной фазой (дисперсионной средой) содержат также тонко диспергированную масляную или воздушную фазу Особый интерес к таким коллоидным системам может объясняться тем, что, с одной стороны, они составляют основную массу разнообразной традиционной продукции пищевой, косметической и фармацевтической промышленности, а, с другой стороны, - являются наиболее перспективными с точки зрения инноваций, предоставляя большие возможности для разработки широкой гаммы продуктов нового поколения с легко варьируемым составом и структурой, что, в итоге, могло бы удовлетворить разнообразным и даже эксклюзивным запросам потребителей

Таким образом, основным направлением нашей работы было выяснение роли межмолекулярных взаимодействий в структурообразующих способностях биополимеров в многокомпонентных водных растворах и коллоидных системах При этом для достижения более глубокого понимания этой роли, мы проводили исследования в заданных экспериментальных условиях на модельных растворах и коллоидных системах, содержащих ограниченное число компонентов Кроме того, используя термодинамический подход, мы пытались подойти к пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе формирования, стабилизации и разрушения структуры в таких системах, выявляя основные взаимосвязи в следующем ряду молекулярная структура ключевых компонентов - термодинамика межмолекулярных взаимодействий -функциональность ключевых компонентов - структура и стабильность модельных растворов и коллоидных систем

Цель и основные задачи работы:

Цель работы состояла в термодинамическом анализе роли межмолекулярных взаимодействий в процессах формирования структуры и свойств, в объеме и на границе раздела фаз, в многокомпонентных растворах и коллоидных системах,

содержащих в качестве основных компонентов такие биополимеры, как белки и полисахариды

Для достижения поставленной цели мы поставили перед собой следующие конкретные задачи

1 Установить основные взаимосвязи между надмолекулярной организацией белков и формированием структуры в водных растворах и коллоидных системах на их основе

2 Установить ключевые факторы, определяющие характер (природу и силу) взаимодействий, различающихся по природе, биополимеров в водной среде

3 Установить основные взаимосвязи между характером взаимодействий, различающихся по природе, биополимеров и их способностью к формированию структуры и свойств в водных растворах и коллоидных системах на их основе

4 Изучить роль взаимодействий биополимеров с низкомолекулярными поверхностно активными веществами (ПАВ) в модификации молекулярных параметров и структурообразующих функций биополимеров в объеме и на границе раздела фаз в водных растворах и коллоидных системах на их основе

5 Изучить закономерности взаимодействий биополимеров с ароматобразующими соединениями

Научная новизна работы:

1 В данной работе получил свое дальнейшее развитие термодинамический подход к изучению природы и количественной характеристике межмолекулярных взаимодействий в многокомпонентных водных растворах и коллоидных системах на основе биополимеров

2 Используя термодинамический подход, нам, впервые, удалось установить прямые взаимосвязи между особенностями надмолекулярной организации белков в объеме водной среды, с одной стороны, и микроструктурой, реологическим поведением, и стабильностью водных растворов и прямых эмульсий, стабилизированных белками, с другой Кроме того, впервые, были обнаружены прямые корреляции между характером белок-белковых взаимодействий и силами, действующими между коллоидными частицами, покрытыми белковыми адсорбционными слоями

3 Впервые, с использованием лазерного светорассеяния, проведен количественный термодинамический анализ ключевых факторов, определяющих характер (природу и силу) взаимодействий между различными по природе биополимерами (белками и полисахаридами) в водной среде Кроме того, на основании сопоставления величин термодинамических параметров парных взаимодействий с особенностями фазовых диаграмм (положением критических точек и бинодалей), были также выявлены ключевые факторы, контролирующие особенности фазового поведения смешанных водных растворов биополимеров

4 В случае коллоидных систем, в частности, прямых эмульсий масла в воде, стабилизированных смесями биополимеров, впервые на количественном уровне, удалось установить, как определенный характер взаимодействий (физические взаимодействия, ковалентное связывание) между различающимися по природе биополимерами, а также фазовое состояние дисперсионной среды, определяют особенности структуры, реологического поведения и стабильности таких коллоидных систем

5 В результате проведенного систематического термодинамического исследования, нам впервые удалось раскрыть природу влияния низкомолекулярных Сахаров и, в частности, сахарозы на растворимость, поверхностную активность и гелеобразующую способность целого ряда различающихся по структуре белков, а также на особенности их фазового поведения в смешанных растворах с другими белками и полисахаридами

6 Также, впервые установлены молекулярные механизмы модификации молекулярных параметров и структурной функциональности биополимеров (белков и полисахаридов) посредством их взаимодействий с низкими концентрациями ПАВ в водной среде Выявлена роль структуры, как биополимеров, так и ПАВ в их взаимодействии и модификации свойств При этом, впервые изучена природа влияния полисахаридов на изменение поверхностных свойств комплексов белков с ПАВ

7 Впервые выявлена роль особенностей структуры ароматобразующих соединений, определяющая специфику их конкурентного связывания с глобулярным белком из эквимолярных смесей ароматобразующих соединений

8 Впервые показано влияние взаимодействий ароматобразующих соединений с белком на молекулярные и термодинамические параметры белка в водной среде

9 Также, впервые, охарактеризованы особенности влияния полисахаридов на способность белков связывать ароматобразующие соединения

Таким образом, в целом, вся совокупность полученной в работе термодинамической информации позволила достичь более глубокого понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе формирования структуры и свойств многокомпонентных водных растворов и коллоидных систем на основе биополимеров

Практическая значимость работы. В первую очередь, в данной работе получил свое дальнейшее развитие термодинамический подход к изучению многокомпонентных водных растворов и коллоидных систем на основе биополимеров, позволяющий глубже понять молекулярные механизмы формирования их структуры и свойств, что, очевидно, вносит свой вклад в дальнейшее развитие методологии современных физико-химических, биохимических и биотехнологических исследований

Кроме того, проведенное систематическое термодинамическое исследование показало возможность направленного регулирования

структурообразующих свойств биополимеров в многокомпонентных растворах и коллоидных системах посредством относительно слабых физических взаимодействий, как с высокомолекулярными, так и с низкомолекулярными компонентами таких систем Такая возможность может служить хорошей основой для разработки и создания широкой гаммы природных эмульгаторов и стабилизаторов нового поколения, а также систем доставки, с легко варьируемым составом и структурой, для пищевой, фармацевтической и косметической промышленности При этом, полученные знания могут также позволить оптимизировать композицию ингредиентов для таких систем, как по положительному влиянию на здоровье человека, так и по структурообразующим свойствам, что, без сомнения, может улучшить качество конечного продукта, как по его оздоровительному эффекту, так и по его общей привлекательности (текстуре, физической стабильности и аромату) для потребителя Таким образом, используя полученные знания, можно не только значительно расширить ассортимент, так называемой функциональной (имеющей положительное влияние на здоровье людей) продукции пищевой, косметической и фармацевтической промышленности, но и осуществить разработку ее принципиально новых видов

Апробация работы. Материалы работы были доложены и обсуждены на следующих конференциях "Biopolymer mixtures (Nottingham, UK, 1994), "Macromolecular Interactions in Food Technology" at International Chemical Congress of Pacific Basin Societies (Honolulu, Hawaii, USA, 1995), "Food Colloids Proteins, Lipids and Polysaccharides (Ystad, Sweden, 1996), "Food Emulsions and Foams Interfaces Interactions and Stability" (Seville, Spam, 1998), " III международная конференция Пища Экология Человек" (Москва, 1999), " Flavor Release, ACS Symposium"(New Orleans, USA ,1999), "Химия и биотехнология пищевых веществ" (Москва, 1999), "Food Colloids 2000 Fundamentals of Formulation " (Potsdam, Germany, 2000), «Биохимическая физика на рубеже столетий» (Москва, 2000), «Химия и биотехнология пищевых веществ Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов» (Москва, 2000), "От фундаментальной науки к новым технологиям Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок Экологически безопасные технологии" (Москва - Тверь, 2001), Food Colloids 2002, Biopolymers and Materials" (Waageningen, Netherlands, 2002), «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва 2002), XI Международная конференция по Крахмалу (Москва 2003), «Colloid Chemistry and Physicochemical Mechanics (Минск, Беларусь, 2003), " Функциональное питание, пищевая безопасность и здоровье людей в условиях мегаполиса" (Москва, 2003), "Food Colloids 2004 Interactions, Microstructure and Processing" (Harrogate, UK, 2004), "The 7th International Hydrocolloids Conference" " (Melbourne, Australia, 2004), "Delivery of Functionality in Complex Food Systems" (Lausanne, Switzerland, 2005), "Food Colloids 2006 Self-Assembly and Material Science" (Montreux, Switzerland, 2006)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 113 работ, из них 56 статей в рецензируемых научных журналах, а также в сборниках докладов международных научных конференций, 4 депонированных рукописи, 5 статей в сборниках научных трудов различных научно-исследовательских учреждений и университетов, тезисы 18 устных и 30 стендовых докладов на указанных выше научных конференциях и симпозиумах

Личный вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, заключался в выборе актуальных целей исследований, в постановке конкретных задач исследований, в разработке путей их экспериментального выполнения, а также в непосредственном участии на всех этапах исследований, интерпретации и теоретической обработки полученных результатов

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 419 страницах машинописного текста, содержит 121 рисунок, 38 таблиц и список литературы, включающий 383 ссылки Работа состоит из 2 частей и 5 глав

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Часть I. Взаимодействия между биополимерами

Глава 1. Роль самоассоциации биополимеров в формировании структуры многокомпонентных водных растворов и коллоидных систем.

Биополимеры, благодаря особенностям строения их макромолекул, содержащих большое число, как полярных, так и неполярных функциональных групп, обладают ярко выраженной способностью к взаимному притяжению в водной среде, что приводит к их самоассоциации, характер и степень которой определяется условиями окружающей среды (рН, давлением, температурой, ионной силой, присутствием специфических ионов или низкомолекулярных веществ)

К моменту начала нашей работы было хорошо известно, что самоассоциация биополимеров лежит в основе процессов фазового расслоения (осаждения) и образования структурных элементов сетки геля, которая может формироваться в объеме и на границе раздела фаз концентрированных растворов и коллоидных систем на основе биополимеров Кроме того, регулируемые процессы самоассоциации биополимеров использовались при создании микрокапсул на их основе Однако, при этом, практически отсутствовали данные, количественно характеризующие взаимосвязи между природой и интенсивностью самоассоциации биополимеров и особенностями процессов формирования и изменения во времени структуры биополимер -содержащих систем, а именно, растворов и коллоидных систем При этом в частности, было неясно, в какой мере склонность биополимеров к самоассоциации может влиять на интенсивность взаимодействий коллоидных частиц, покрытых адсорбционными слоями биополимеров Поэтому в нашей

работе мы ставили перед собой задачу попытаться на количественном уровне охарактеризовать эти взаимосвязи

Основными молекулярными параметрами, с помощью которых можно четко охарактеризовать самоассоциацию биополимеров, являются молярная масса (Мт средневесовая молярная масса) размер (Яа — радиус инерции и Я/, — гидродинамический радиус ) и термодинамическое сродство биополимеров к друг другу и к растворителю (Л2 — второй вириальный коэффициент в разложении химических потенциалов биополимера и растворителя по концентрации биополимера Знак Л2 характеризует природу парных взаимодействий а, его величина, - их интенсивность Л2>О, когда взаимодействия растворитель - биополимер - термодинамически наиболее выгодны, Ат= 0, когда нет термодинамических предпочтений в парных взаимодействиях между компонентами системы, Аг< 0, когда взаимодействия биополимер-биополимер -термодинамически наиболее предпочтительны) Все эти параметры могут быть прямо измерены с помощью, например, комбинации методов статического и динамического многоуглового лазерного светорассеяния в разбавленных растворах биополимеров

В нашей работе, с помощью многоуглового лазерного светорассеяния, как базового метода, нам удалось для ряда модельных коллоидных систем установить прямые взаимосвязи между особенностями самоассоциации белков в водных растворах и особенностями микроструктуры, реологического поведения, и стабильности эмульсий типа, масла в воде, стабилизированных белками А также, нам удалось показать прямые корреляции между природой и интенсивностью белок - белковых взаимодействий и силами, действующими между коллоидными частицами, покрытыми белковыми адсорбционными слоями Тем самым, нами был сделан шаг к более глубокому пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе, формирования структуры и свойств таких эмульсий Приведем далее несколько наиболее наглядных примеров найденных корреляций

Так, например, нами было показано, что именно особенностями самоассоциации казеината натрия в присутствии ионов кальция можно объяснить неожиданный факт высокой стабильности структуры эмульсии масла в воде, стабилизированной этим белком, которая была обнаружена в некотором среднем диапазоне концентраций ионов Са2+ в системе, а именно от 5 до 8 мМ (Рис 1), что, кардинально отличалось от сильной вытеснительной флоккуляции капель в этих эмульсиях, как в отсутствии ионов Са2+, так и при более низких (< 5 мМ) и более высоких (>10 мМ) их концентрациях (Рис 1) При этом на основании структурных (М„, Яв, форма, выраженная через параметр р=Яс/Яь) и термодинамических параметров (А2) наночастиц казеината натрия, определенных методом светорассеяния в водной среде, мы рассчитали изменение величины свободной энергии вытеснительной флоккуляции капель эмульсии, АСвытесн» с изменением концентрации ионов Са2+ в системе (Рис 1) по уравнению

ЛСг8ИК™ = 2 л/3 {- П) (Л - 'Л h f (3т + 2Д + Vi А) (1) ,

где а - радиус капель эмульсии, аппроксимированных, твердыми сферами; /: - расстояние между каплями эмульсии; Д - толщина вытеснителыюго слоя вокруг капель эмульсии, принятая равной гидродинамическому радиусу, /?/,, белковых частиц; П - осмотическое давление в растворе белка, заданное уравнением:

П = (ц1°-щ)/Г1 = RT(n +A-ZC1) (2),

где, /и" and — химические потенциалы чистого растворителя и растворителя в присутствии определённой концентрации белковых частиц; V[ - молярный объём растворителя; п= С/М число полимерных частиц, задаваемое их концентрацией, С, и степенью самоассоциации. т.е. эффективным молярным весом, (идеальная часть); Аг - второй вирид.тьиый коэффициент (неидеальная часть); R - газовая постоянная, и Г— абсолютная температура.

Проведённый расчёт показал наличие ярко-выраженного минимума в отрицательней величине AGBbllesH именно в концентрационном диапазоне or 5 до 8 мМ ионов Са" (Рис. 1), что объяснялось, как резким падением в этой области величины осмотического давления, Я, в дисперсионной среде эмульсии, так н значительным сжатием в этой области шшочастии белка за счёт формирования, по всей вероятности, множественных внутренних сшивок в белковых наночастицах с участием ионов кальция.

Рис, 1. Влияние ионов Са на значения осмотического давления. П, ;■) в растворе казеииата натрия и свободной энергии вытеснитель но и флоккуляции,

('•) между каплями эмульсии (и = 250 нм), стабилизированными казеинатом натрия (рН 7.0, ионная сила 0.05 М)

о

-го

-40

-60 -во -100 -120 -140

{¿нцеитрлцяя Са (мМ)

При этом было установлено, что падение П обусловлено, как уменьшением обшего числа наночастиц белка, и, вызванного нх ассоциацией, так и, главным образом, уменьшением вкладов электростатического отталкивания и эффектов исключенного объема в величину А2, что было обусловлено падением суммарного заряда на белке в результате присоединения ионов Са' и уменьшением размера наночастиц белка, соответственно. При этом, заряд па поверхности, как белковых наночастиц, так и капель эмульсии, стабилизированных белком, контролировался методами потснннометричсского титрования растворов бежа и определения электрокинетического ¡^потенциала

на дисперсных частицах, покрытых адсорбционными слоями белка Было также найдено, что повышение концентрации ионов Са2+ в системе > В мМ приводило к интенсивной ассоциации наночастиц белка, за счет, по-видимому, преимущественного формирования между ними межмолекулярных ионных мостиков - сшивок, что сопровождалось как увеличением размера и асимметрии ассоциатов, так и их общего суммарного заряда Эти изменения в свойствах белковых ассоциатов вносили положительный вклад в возрастание, как П, так и отрицательной величины АОвытесн, вызывая наблюдаемую интенсивную вытеснительную флоккуляцию в эмульсии (Рис 1)

Изучение особенностей самоассоциации белка также позволило нам подойти к более глубокому пониманию молекулярных основ возникновения в узком температурном диапазоне, близком к температуре человеческого тела (35-45°С), термообратимой и термонеобратимой вязкоэластичности эмульсионных гелей, стабилизированных казеинатом натрия в определенной области рН в присутствии определенных концентраций ионов кальция Так, было установлено (Рис 2), что в основе значительного развития термонеобратимой вязкоэластичности эмульсий (категория С), лежит также ярко-выраженная термонеобратимая ассоциация белка с ростом температуры

Рис. 2. Влияние изменения температуры на (а) состояние ассоциации наночастиц казеината натрия, (б) вязкость эмульсий (масло-вода), стабилизированных казеинатом натрия (нагревание - закрашенные обозначения, охлаждение - незакрашенные обозначения), (в) модуль эластичности С= 0*соэ5 (закрашенные обозначения) и модуль текучести 0"=0*5т5 (незакрашенные обозначения) (где, 0*= (С2 +0"2)1/2 - комплексный модуль сдвига и б фазовый угол) - в экспериментальных условиях, отвечающих различным категориям эмульсий А (■, □), рН 6 5, 15 мМ Са2+, В (▼, V), рН 5 5, 15 мМ Са2+, С (•, О), рН 5 1, 15 мМ Са2+

При этом для эмульсий, сохраняющих при нагревании свойства Ньютоновских жидкостей (категория А), была обнаружена наименьшая степень ассоциации белка в растворе Средняя степень ассоциации белка была отличительной чертой эмульсий, претерпевающих обратимый температурный

переход раствор-гель (категория В) Таким образом, было сделано предположение, что в основе, обнаруженного при нагревании, резкого возрастания вязкоэластичности эмульсий в узком температурном диапазоне (35-45 °С) (Рис 2) лежит значительное возрастание сил взаимного притяжения между наночастицами белка, как адсорбированных на каплях эмульсии, так и присутствующих в свободном состоянии в дисперсионной среде, что в итоге приводит к формированию большого числа новых структурно-важных белок-белковых связей в объеме эмульсии Действительно, в случае средней степени ассоциации белковых наночастиц (категория В), это предположение прямо подтверждалось изменением знака А2 от положительного к отрицательному, при нагревании Кроме того, дальнейшее падение величины А-2, найденное при последовательном обратном охлаждении раствора белка, свидетельствующее об усилении белок - белкового притяжения, объясняло невозможность спонтанного, т е только за счет Броуновского движения, разрушения сформированной сетки геля при понижении температуры в случае термообратимых эмульсий, относящихся к категории В

Следующий пример касается результатов модельного эксперимента, характеризующего взаимодействие масляных капель эмульсии, стабилизированных адсорбционными слоями а^-казеина и (3-казеина Так были установлены прямые взаимосвязи между интенсивностью сил притяжения в растворе белковых наночастиц друг к другу (знак и величина А2 ) и величиной вероятности (Ф) формирования пар между коллоидными частицами, покрытыми белковыми адсорбционными слоями (Таблица 1), в модельных коллоидных системах, где одни из коллоидных частиц были закреплены на твердой поверхности, а другие двигались около них в потоке растворителя под действием сил сдвига (Рис 3)

В этом эксперименте, была также установлена взаимосвязь между размерами наночастиц белка, задающих толщину белковых адсорбционных слоев на каплях эмульсии, и вероятностью необратимого объединения последних в пары Кроме того, была продемонстрирована хорошая корреляция между полученными данными и степенью вязкоэластичности, (характеризуемой величиной комплексного модуля сдвига в*), развивающейся в концентрированных эмульсиях типа масло-вода (45% вес/объем масляной фазы), стабилизированных этими белками (Таблица 1)

Рис. 3. Иллюстрация модельного эксперимента по взаимодействию коллоидных частиц в потоке А = исходное положение движущейся частицы, В = пример образования пары коллоидных частиц в «верхнем течении», С = более ожидаемое образование пары коллоидных частиц внизу «по течению» Закрашенный кружок представляет частицу, зафиксированную на твердой подложке

Твердая подлож]

поток

Таблица 1. Взаимосвязь между интенсивностью белок - белковых взаимодействий (Л2), вероятностью формирования пар между каплями эмульсии (Ф)и вязкоэластичностью концентрированных эмульсий (в*), стабилизированных основными фракциями казеина

Белок_а5Гказеин_[3-казеин

I (М) А2Ю" (м3 моль кг"2) Ф (%) 0* (Ра) А2104 (м3 моль кг"2) Ф (%) д* (Ра)

001 27 0 5 62 -0 4 0 04

0 05 28 0 - -0 1 0 -

0 1 -16 2 23 100 -0 1 0 0

0 15 -20 6 50 - 02 0 25

02 -54 5 80 1000 - 0 -

Еще одним интересным примером определяющей роли самоорганизации, в частности, ассоциации/диссоциации белков в их структурообразующей способности в водной среде является пример кардинального изменения микроструктуры и реологических характеристик геля казеината натрия в присутствии сахарозы

Так, было установлено, что введение в раствор казеината натрия сахарозы при рН > рI (4 8-5 0) (р/ - это область рН, отвечающая изоэлектрической точке белка) вызывает значительную диссоциацию исходных наночастиц белка (Рис 4а), вероятнее всего, за счет формирования между белком и сахарозой множественных водородных связей (Образование последних было подтверждено данными калориметрии смешения, свидетельствующими о ярко-выраженном экзотермическом характере взаимодействия казеината натрия и сахарозы в водной среде при температурах близких к комнатной (293-298 К)) В результате ярко-выраженной диссоциации белковых наночастиц в присутствии сахарозы микроструктура белковых гелей, формирующихся при приближении рН раствора казеината натрия к его изоэлектрической точке, становилась существенно более гомогенной (Рис 5) Кроме того, было обнаружено, что при повышении концентрации сахарозы в системе формирующиеся белковые гели обладали все более ярко выраженной вязкоэластичносьтью (Рис 46), что, очевидно, было следствием образования более плотной сетки геля, за счет увеличения числа белок - белковых контактов, вызванного значительной диссоциацией исходных наночастиц белка Кроме того, на основании данных светорассеяния можно было предположить об усилении притяжения между объединяющимися в сетку геля наночастицами белка в области рН < р/ в присутствии сахарозы, что подтверждалось, найденной в этих условиях, большей степенью ассоциации наночастиц белка (Рис 4а) По-видимому, в этой области рН сахароза уже не могла эффективно формировать водородные связи с более протонированным белком, но, в тоже время, могла эффективно выступать в роли дегидратирующего агента по отношению к белку, являясь конкурентом за образование водородных связей с молекулами воды

10009

1Q*\ (Да)

е, (Ра)

(6)

10ОО

У

в m ID № 80 Концентрация сахарозы (нес/объём %)

Put 4. (а) Влияние рН и содержания сахарозы на самоассоциацию казеината натрия в водной среде, выраженную через М„', (И) без сахарозы; (А) 35 % (вес/объём) : (•) 60 % (вес/объём); (б) Влияние сахарозы на модуль упругости гелей казеината натрия (3 % (вес/объём)) при рззличтж рН; (А) рН 5.5; (А) рН 5.1; (□) рН 3.9.

(а) (б) (в)

Рис 5. Микроструктура гелей казеината натрия (3 % (вес/объём)): (а) без сахарозы при рН 5.2; (б) в присутствии 30% (вес/объём) сахарозы при рН 4.9; (в) в присутствии 60% (вес/объём) сахарозы при рН 4.9.

Глава 2. Ключевые факторы, определиюпрк характер (природу и силу), взаимодействий между различающимися по природе биополимерами в

родной среде.

Количественный термодинамический анализ ключевые факторов, определяющих характер (природу и силу) взаимодействий между различными по природе биополимерами, может бьиъ проведён с использованием величины перекрёстного второго вириального коэффициента А 23, значение которого прямо связано с величиной химического потенциала /у (молярной свободной энергией Гпббса щ =(507й/!/)т,т, при постоянных температуре и давлении) каждого компонента в смешанной системе в соответствии со следующими уравнениями:

р, = р" + ЯТ[1п(т/т") +Л'2гт, + £ 1}т.Д (3)

и о *

М3 = м3 + 1\Т[1п(т/т ) + А ПШ, + А 2}тл (4)

М, = р',' - (ИТ/т^т, + т3 + 1/2А' мт/ 4- ]/2А*;}т/ ^л",,тг»13) (5)

где растворитель —1 - компонент, биполимер] — 2 компонент, биполимерг — 3

о 0

компонент, ц и т стандартный химический потенциал и концентрация (моляльная шкала) г - го компонента (/ = 1-3), т - концентрация г -го компонента в системе, А 22 и А- вторые вириальные коэффициенты (моляльная шкала), характеризующие парные взаимодействия биополимера1 и биополимераг, соответственно, А 23 - перекрестный второй вириальный коэффициент (моляльная шкала), характеризующий парные взаимодействия биополимер! -биополимерг, R - универсальная газовая постоянная и Т- абсолютная температура

Из уравнений (3) и (4) ясно видно, что положительные значения Л*2з являются отражением термодинамически неблагоприятных взаимодействий между биополимерами, поскольку они ведут к возрастанию величин их химических потенциалов, тек возрастанию их термодинамической активности в смешанных системах Противоположное - верно для случая отрицательных значений А*2з

При этом хорошо известно, что в основе термодинамически неблагоприятных взаимодействий (А 2з > 0) между полимерами лежат эффекты исключенного объема (задаваемые физическим объемом, занимаемым одним полимером, который оказывается недоступным для другого полимера) И электростатическое отталкивание между одноименно - заряженными функциональными группами

Сравнение экспериментально измеренных величин А 2з с рассчитанными теоретически составляющими исключенного объема (А *23 искл), проведенное в нашей работе, позволило количественно выявить основные структурные факторы, ответственные за усиление термодинамически неблагоприятных взаимодействий между биополимерами в растворе (Таблица 2) Так, к таким структурным факторам могут быть отнесены следующие

(1) возрастание размера биополимерной молекулы, что наиболее четко прослеживается для пар глобулярного белка, легумина, с различными биополимерами и, в частности, с гибкоцепным нейтральным полисахаридом, декстраном, при возрастании молярной массы декстрана,

(2) уменьшение степени доступности пространства, занятого одним биополимером для другого Это проявляется в близких значениях А 23, найденных для смесей глобулярного белка с полисахаридами, имеющими практически одинаковую средневесовую молярную массу, но различную гибкость макромолекул и, следовательно, различную конформацию и размер легумин - декстран (Mw = 270 кДа) и легумин - пектинат (Mw = 250 кДа, степень этерификации Б = 58%), RG пясгината (71 нм) - в четыре раза больше Rg декстрана (17 нм) При этом хорошее совпадение экспериментальных и теоретических значений А 2з наблюдалось в случае аппроксимации декстрана гибким случайно-свернутым клубком, у которого, как правило, только 30% пространства может быть доступно для глобул белка, а пектината - либо полужесткоцепным клубком, у которого около 70 % пространства может быть доступно для глобул белка, либо изогнутым цилиндром,

(3) возрастание жесткости биополимерной молекулы, сопровождающееся значительным возрастанием ее размера, и, следовательно, величины исключенного объёма, как это наиболее ясно прослеживается из сравнения

параметров взаимодействия клубкоообразного гибкоцепного декстрана с глобулярным белком - легумином, стержнеобразным белком - фибриногеном или полужесткоцепным полисахаридом — альгинатом

В свою очередь, поскольку большинство биополимеров имеют полиэлектролитную природу, то, как и ожидалось, электростатическое отталкивание между одноименно заряженными биополимерами также является ключевым фактором, определяющим характер их взаимодействий Так, в случае наличия одноименного суммарного заряда на молекулах биополимеров, наблюдалось резкое возрастание вклада электростатической составляющей в интенсивность термодинамически неблагоприятных взаимодействий между биополимерами (в величину А*23), который по своей величине мог значительно превосходить вклад исключенного объема Такая закономерность наиболее четко прослеживалась при сравнении параметров взаимодействий в ряду таких пар биополимеров, как фибриноген-нейтральный полисахарид, декстран, фибриноген - анионный полисахарид, альгинат и два анионных полисахарида альгинат- карбоксиметилделлюлоза (Таблица 2)

При этом, степень, с которой суммарный электрический заряд на биополимере может быть вовлечен в кулоновские взаимодействия, зависит, как от того насколько сильно его изоэлектрическая точка, р1 , отличается от рН раствора, так и от того насколько эффективно ионная сила раствора может экранировать заряд биополимера Несколько примеров зависимости характера взаимодействий между биополимерами от условий окружающей среды (рН, ионная сила) представлено в таблице 3

Действительно, было показано, что, как приближение рН к р1 белков, так и рост ионной силы, способствующий эффективному экранированию кулоновских взаимодействий, может привести либо к ослаблению термодинамически неблагоприятных взаимодействий между биополимерами, как в случае смеси легумина и овальбумина, либо - к радикальному изменению характера взаимодействий между биополимерами, а именно, от термодинамически неблагоприятных (отталкивания) к термодинамически благоприятным (притяжению), как в случае смесей ссз1- и |3- казеинов с высокометоксилированным пектинатом (Е= 76%, Мш = 1800 кДа) (Табл 3)

Кроме того, для пары биополимеров, где только один биополимер заряжен, как и ожидалось, можно было предположить значительный вклад трансляционной энтропии противоинов в термодинамику взаимодействий между биополимерами

Так, действительно, повышение заряда на белке при удалении рН от р1 или понижение ионной силы раствора, способствующие возрастанию трансляционной энтропии противоинов, сопровождалось переходом от термодинамически неблагоприятных к термодинамически благоприятным взаимодействиям в смешанном растворе легумина и нейтрального полисахарида декстрана (Таблица 3) При этом интересно отметить значительное увеличение концентрационной области термодинамической совместимости биополимеров

Таблица 2. Влияние размера, конформации и заряда взаимодействующих биополимеров на величину перекрестного второго вириального коэффициента

Биополимеры /их 10 5 (см3/моль)

Теория

Биополимер Биополимер Эксперимент Сфера - Изогнутый Стержень -

1 2 сфера цилиндр - сфера

сфера

легумин овальбумин

(330 кДа) (44 кДа) 0 07 0 013

(Яо = 5 нм) (Яо = 3 нм)

(рН 7 8,1 = 0 1 М)

легумин пектинат Яз = Яо

(330 кДа) (250 кДа) 0 27 11 50 0,35

(Я0 = 5 нм) (Я0 = 72 нм) Яз =0,3 Яа

(рН 7 8,1 = 0 3 М) 0 47

легумин декстран Яз = Яв

(330 кДа) (44 кДа) 0 09 0 03

(Яо = 5 нм) (Яо = 6 нм)

(рН 7 8,1 = 0 1М)

легумин декстран Я3 = 0 7Яа

(330 кДа) (270 кДа) 031 0 29

(Яо = 5 нм) (Яо =17 нм)

(рН 7 8,1 = 0 1М)

Яз = Яв

легумин декстран 87

(330 кДа) (2500 кДа) 2 05 Яз = 0 1Яа

(Яо = 5 нм) (Яо = 65 нм) 33

(рН 7 8,1 = 0 1М) Я3 = 0 65Де 1 9

фибриноген декстран

(909 кДа) (270 кДа) 4 40 48

(Яо = 76 нм) (Я0 = 17 нм)

(рН 7 4,1 = 0 1М)

фибриноген альгинат

(909 кДа) (63 кДа) 1877 00 41 1

(Яо = 76 нм) (Яо = 65 нм)

(рН 7 4,1 = 0 1М)

К-2 = Яв

декстран альгинат Яз =

(270 кДа) (1540 кДа) 20 9

(Яо = 17 нм) (Я0 = 77 нм) 12 64 Яг = Яа

(рН 7 4,1 = 0 1М) Яз = 0 7 Яа

17 57

КМЦ*' альгинат Я2 = Яа

(1250 кДа) (1540 кДа) 2715 02 Яз - Яа

(Яо = 196 нм) (Яо = 77 нм) 513

(рН 7 4,1 = 0 1М)

*'КМЦ - карбоксиметилцеллюлоза

Таблица 3. Влияние рН и ионной силы на характер парных взаимодействий

между биополимерами

Биополимеры_ Л'^хЮ"5 Биополимеры_А'гзх 10"5

Биополимер 1 Биополимер 2 (см3/моль) Биополимер 1 Биополимер 2 (см3/моль)

легумин овальбумин Р-казеин пектинат

(рН 7 8,1 = 0 1 М) 0 07 (Е =76%) 0 12

(рН 7 0,1 = 0 01М)

легумин овальбумин 0 007 Р-казеин пектинат

(рН 7 0,1 = 0 1 М) (Е =76%) -6,2

(рН 7 0,1 = 0 1М)

а51-казеин пектинат легумин декстран

(Е =76%) 0 0008 (М„=270 Ша) 0 31

(рН 7 0,1 = 0 01М) (рН 7 8,1 = 0 1М)

легумин декстран

а8]-казеин пектинат -1,8 (Ч<*--68) (М„= 270 Ша) -0 17

(Б =76%) (рН 7 8,1 = = 0 01М)

(рН 7 0,1 = 0 1М) легумин декстран

(Ч =-30) (М„= 48 Ша) 0 20

(рН 7 0,1 = = 0 01М)

- суммарный заряд на белке

Глава 3. Роль характера парных взаимодействий между различающимися по природе биополимерами в формировании структуры многокомпонентных растворов и коллоидных систем.

3.1. Роль термодинамически неблагоприятных взаимодействий между

биополимерами

Термодинамически неблагоприятные взаимодействия между биополимерами, при возрастании их концентрации в растворе, как правило, приводят к расслоению смешанного раствора на фазы, каждая из которых обогащена одним из биополимеров (простая коацервация) Для ряда смешанных растворов биополимеров было проведено сопоставление величин вторых вириальных коэффициентов, характеризующих парные взаимодействия между всеми компонентами системы (Табл 4) с положением критических точек и бинодалей, очерчивающих концентрационную область фазового расслоения в системе (Рис 6)

Так, было обнаружено, что положение, как бинодали (линии, характеризующей составы сосуществующих фаз в двухфазной системе), разделяющей области ограниченной термодинамической совместимости и фазового расслоения в системе, так и положение критической точки на бинодали (то есть точки, в которой фазы, находящиеся в равновесии имеют одинаковый объем и состав) определяются, с одной стороны, силой термодинамически неблагоприятных взаимодействий между различающимися по природе биополимерами (величиной А*2з), а, с другой стороны, как характером взаимодействий между биополимерами одной природы (величинами А 22 и А*зз, характеризующими

термодинамическое сродство однотипных макромолекул биополимеров к друг другу и к растворителю и отражающими склонность биополимеров к самоассоциации), так и абсолютной величиной различия в термодинамическом сродстве биополимеров к растворителю (}А*22-А*зз\, те величиной эквивалентной по своей физической сути, более часто используемой, величине Ах эффекта) Оба последних фактора определяют направленность и степень перераспределения растворителя между сосуществующими фазами в области фазового расслоения системы

Таблица 4 Значения термодинамических параметров парных взаимодействий А 22, А зз: Л 2з и абсолютной величины различия в термодинамическом сродстве биополимеров к растворителю IА *22-А *33 I, измеренные в тройных системах (биополимер! - биополимерг - растворитель)

Биополимеры А'22Х Ю5 Л'ззх Ю"5 \А"22-А"33 \ х Ю5 А'23 х 10"5

Биополимер1 Биополимер 2 (см3/моль)

легумин овальбумин 0 17 0 02 0 15 0 07

(рН 7 8,1 = 0 1 М)

легумин овальбумин -0 04 0 007 0 05 0 007

(рН 7 0,1 = 0 1 М)

легумин пектинат 0 1 63 1 63 0 27

(Е =58%)

(рН 7 8,1 = 0 3 М)

легумин декстран 0 17 0 32 0 15 031

(рН 7 8,1 = 0 1М)

аБ1-казеин пектинат

(Е =76%) -0 02 5 18 52 0 0008

(рН 7 0,1 = 0 01М)

Р-казеин пектинат

(Е =76%) -0 02 5 18 52 0 11

(рН 7 0,1 = 0 01М)

Из сравнения термодинамических параметров, представленных в Табл 4, и положения критических точек и бинодалей (Рис 6) видно, что определяющая роль каждого из перечисленных выше факторов в увеличении концентрационной области термодинамической несовместимости биополимеров наиболее четко проявляется только при условии количественной и качественной близости всех остальных факторов

Так, например, определяющая роль большей положительной величины А 23 в увеличении концентрационной области фазового расслоения хорошо видна в случае равенства величин | А*22-А*зз I при сравнении таких пар, как [легумин + овальбумин (рН 7 В, I = 0 1 М) - легумин + декстран (рн 7 8,1 = О 1М)] и [а81-казеин+ пектинат (Е =76%) (рН 7 О, I = О 01М) - Р-казеин + пектинат (Е =76%) (рН 7 О, I = О 01М)]

В то время как определяющая роль большей величины I А*22-А*331 -проявляется при практических равных значениях А*23, обнаруженных для пар легумин + пектинат (Е =58%) (рН 7 8,1 = 0 3 М) и легумин + декстран (рН 7 8,1 =

01М) В свою очередь, ведущая роль склонности биополимеров к самоассоциации (А2 < 0) в водной среде, по-видимому, выражается в большей области термодинамической несовместимости, найденной для пары легумина с овальбумином при рН 7 0 (I = 0 1 М) по сравнению с рН 7 8 (I = 0 1 М), несмотря на меньшие величины, как А*2з, так и \л*22-А*зз I при рН 7 0

4 6 8 ю

л (вес/объем %)

Рис. 6. Бинодали и критические точки для следующих тройных систем

(1) легумин + овальбумин (рН 7 8,1 = 0 1 М),

(2) легумин + овальбумин (рН 7 0,1 = 0 1 М),

(3) легумин + декстран (рН 7 8,1 = 0 1М),

(4) легумин + пектинат (Б 58%) (рН 7 8,1 = 0 3 М),

(5) а51-казеин + пектинат (Е 76%) (рН 7 0,1 = 0 01М),

(6) Р-казеин +пектинат (Е 76%) (рН 7 0,1 = 0 01М)

В случае коллоидных систем (например, прямых эмульсий масла в воде), стабилизированных смесями биополимеров, было установлено, что термодинамически неблагоприятные взаимодействия (А2з>0) между биополимерами, повышающие их химические потенциалы (термодинамическую активность) в объеме водной фазы в соответствии с уравнениями 3 и 4, приводят к следующим важным изменениям в их структуре и стабильности Прежде всего, в соответствии с уравнением адсорбции Гиббса

~ - 2, Г,ф., , (6)

где у - поверхностное натяжение, Г - поверхностная концентрация и ц - химический потенциал адсорбирующегося биополимера на границе раздела фаз

было обнаружено значительное повышение поверхностной активности белка на плоской границе раздела фаз (неполярная фаза — вода) (что выражалось, как в увеличении скорости адсорбции белка на поверхности неполярной фазы, так и в возрастании равновесного значения межфазного давления к в адсорбционном слое белка (я"= уо -у, где уо и у - значения поверхностного натяжения для растворителя и раствора биополимера, соответственно)), а также возрастание величины адсорбции белка (Г) на каплях эмульсии (Табл 5)

При этом, при концентрациях биополимеров, приближающихся к области фазового расслоения, такого рода взаимодействия приводили к полислойной адсорбции белка на каплях эмульсии, как, например это наблюдалось для пары легумина с декстраном в условиях их термодинамической несовместимости (рН

8,1 =0 1М) Г = (7 1 + 0 1) мг/м2 - для белка в присутствии полисахарида и Г = (26 + 0 1) мг/м2 - для одного белка

Таблица 5. Влияние характера взаимодействия между различающими по природе биополимерами на величину адсорбции белка на каплях эмульсии масла (11об %) в воде (0 6 вес/об % белка и 0 28 вес/об % полисахарида) при рН 5 5,1 = 0 01М

Биополимеры А23х Ю"5 (см3/моль) Г (мг/м2) А23 х 10"5 (см3/моль) Г (мг/м2) А23х Ю"5 (см3/моль) Г (мг/м2)

а5]-казеин + Р-казеин + Иа-казеинат +

пектинат(Е = =76%) пектинат (Е =76%) пектинат (Е = 76%)

Белок 1 5 1 2 22

Белок +

Полисахарид -334,4 1 7 26 5 49 -155 4 23

Вследствие повышения поверхностной активности белка наблюдалось существенное понижение размера капель в эмульсии, т е значительное повышение общей площади поверхности в свежеприготовленных эмульсиях, стабилизированных белками под действием термодинамически неблагоприятных взаимодействий с полисахаридами (Рис 7) Однако, в то время как умеренное увеличение термодинамической активности белка в объеме раствора в присутствии полисахарида приводило к его лучшей эмульгирующей способности, противоположный результат наблюдался при ожидаемом более значительном возрастании термодинамической активности белка Что, четко прослеживается при сравнении размеров капель в эмульсиях, стабилизированных легумином в присутствии декстранов с молярной массой 48 и 500 кДа По-видимому, такой результат был обусловлен процессами фазового расслоения в водной среде эмульсии, содержащей смесь легумина с более высокомолекулярным декстраном При этом, вероятно, что такое фазовое расслоение затрудняло равномерную и быструю адсорбцию белка на вновь образующихся в гомогенизаторе каплях масляной фазы, препятствуя получению высоко дисперсной эмульсии Это могло быть вызвано тем, что белок адсорбировался на каплях эмульсии в виде концентрированной белковой фазы, что приводило к формированию толстых адсорбционных слоев на довольно больших каплях эмульсии, образующихся в первый момент гомогенизации, и что препятствовало их дальнейшему диспергированию в процессе гомогенизации (Рис 7)

Кроме того, было установлено, что такого рода взаимодействия могут также приводить к возрастанию вязкости сдвига в адсорбционном слое белка, г)""""^, в результате возрастания его поверхностной концентрации Так, например, было показано, что для р-казеина величина г[°трхн возрастала на 20-30 % (г/юверхн = 750 ± 75 и 590 ± 60 мНсм"1 в присутствии и в отсутствии пектината, соответственно, при рН 5 5,1 = 0 01М) в условиях термодинамически неблагоприятных взаимодействий с полисахаридом (А23 = 26х104 (см3 моль г"2)

Рис. 7. Влияние полисахарида на начальный размер капель в эмульсиях стабилизированных белком Величина приведённого среднего диаметра капель в эмульсии отложена от молярного отношения, Л, числа молей (п) полисахарида к числу молей белка в системе (■), (□) 11Б глобулин + декстран с М„ = 48 кДа и М„ = 500 кДа, соответственно (0 5 вес/объем % белка, 10 объем % масла, рН 8 0,1 = 0 1М), (О).(в) а51-казеин+ пекгинат и Р-казеин + пектинат при рН 7 0,1 = 0 01М, соответственно, (А) Р-казеин + пектинат при рН 5 5,1 = 0 01М (2 0 вес/объем % белка, 40 объем % масла)

Эмульсии по своей природе являются термодинамически метастабильными системами, структура и стабильность которых во времени задается, как прочностью адсорбционных слоев, сформировавшихся на частицах масляной фазы, так и характером взаимодействий между коллоидными частицами В нашем исследовании нам удалось также установить прямые корреляции между термодинамически неблагоприятными взаимодействиями между биополимерами и процессами флоккуляции (объединения коллоидных частиц) в эмульсиях, приготовленных на их основе Так было установлено, что, в то время как концентрированные эмульсии (40 об % масляной фазы), стабилизированные только белком, вели себя, как Ньютоновские жидкости, то те, которые содержали полисахарид, проявляли существенную вязкоэластичность (Рис 8а)

В тоже время, тогда, как разбавленные эмульсии (11об % масляной фазы), стабилизированные только белком, показывали высокую стабильность по отношению к кримингу (отделению сывороточного слоя), эмульсии, содержащие полисахарид, напротив, демонстрировали быстрый криминг (Рис 86)

Такое поведение эмульсий в сочетании с данными о том, что полисахарид не адсорбируется на границе раздела фаз в эмульсиях и не вносит своего вклада в их реологические свойства, являясь Ньютоновской жидкостью в условиях эксперимента, позволяет сделать предположение о том, что оно обусловлено процессами вытеснительной флоккуляции Эти процессы, по всей вероятности вызваны положительным вкладом термодинамически неблагоприятных взаимодействий между биополимерами (А 2з> 0) в величину осмотического давления в дисперсионной среде эмульсии в соответствии с уравнением (7) (см также ур-е (5) для выражения (р] -/л^) и, следовательно, в отрицательную величину вытеснительного потенциала АОвытеСн (см ур-е 1)

П= [КТ/( Ут)]х(т2 + тз + 1/2А*22т2 + 1/2А*33т/ +А*23т2т3), (7)

где К; - молярный объем воды

Кажущаяся вязкость сдвига, Ра сек Толщина сывороточного слоя (%)

Рис. 8. Влияние различных концентраций пектината (Е = 76%) на (а) кажущуюся вязкость сдвига концентрированных эмульсий (40 об %, 2 вес/об % белка) рН 7 О, I =

0 01М -(А) а31-казеин, (А) р-казеин, (□) а51-казеин + 05 вес/об % пектината, (■) р-казеин + 05 вес/об % пектината, (•)Р-казеин +10 вес/об % пектината, (О) а^-казеин +

1 0 вес/об % пектината, рН 5 5, 1 = 0 01М - (Х)а51-казеин , (О)оц1-казеин + 05 вес/об % пектината, (♦) а^-казеин +10 вес/об % пектината, (б) криминг в эмульсиях с низким содержанием масляной фазы (11 об %, 0 6 вес/об % белка, 0 28 вес/об % пектината) рН 7 0,1 = 0 01М - (А) а51-казеин + пектинат, (Ж) р-казеин + пектинат, рН 5 5, 1 = 0 01М -(•) а81-казеин + пектинат

3.2. Роль термодинамически благоприятных взаимодействий между биополимерами

В свою очередь, нам удалось установить, что термодинамически благоприятные взаимодействия между белками и полисахаридами вызывали значительное понижение поверхностной активности белков в присутствии полисахаридов на плоской границе раздела фаз (Табл 6), но, при этом практически не оказывали влияния на величину адсорбции белка на каплях реальных эмульсий (Табл 5) и на их размер

В то же время они приводили к более значительному, по сравнению с термодинамически неблагоприятными взаимодействиями, возрастанию вязкости сдвига в адсорбционном слое белка Так, например, в случае а5г казеина в присутствии пектината (Е = 76%) при рН 5 5 и I = 0 01М (А*2з = - 334 х105 (см3/моль)) величина ?/поверхм за сутки достигла значения, которое в пять раз превышало значение гР°верхн, найденное для чисто белкового адсорбционного слоя {г(,овеРхн = 820 ± 80 и 160 ± 20 мНм"1 в присутствии и в отсутствии пектината, соответственно)

Таблица 6. Влияние термодинамически благоприятных взаимодействий между биополимерами на поверхностную активность белка на плоской границе раздела фаз неполярная фаза - вода

Биополимеры

А23х 10° (см3/моль)

^бчасов

(мН/м)

А23х 10"-

Ябчасов А23Х 10"

Ябт

(см /моль) (мН/м) (см /моль) (мН/м)

Белок

легумин

(0 001 вес/об %)

+

декстран (Mw 270 kDa) рН 7 8, 0,01М а)

легумин

(0 001 вес/об %)

+

мальтодекстрин (MD 6)

(Mw 102 kDa)

легумин

(0 001 вес/об %) +

мальтодекстрин (MD 10) (Mw 45 kDa)

20

рН 7 2, 0,05М

б)

рН 7 2, 0,05М

б)

17

17

Белок +

Полисахарид

С,

С2

С3

-0,2

-0,02

-0 08

20 15 9

12 8 11

15 И 10

a)Ci = О 1 вес/об %, С2 = 1 3 вес/об %,С3 = 20 вес/об %, 0> Ci = 0 05 вес/об %, С2 = 0 1 вес/об %, С3 = 0 5 вес/об %

Все эти результаты, а также положительные данные по оценке величины адсорбции полисахарида на каплях эмульсии позволяют сделать предположение об ассоциативной адсорбции молекул полисахарида на поверхности капель эмульсии, стабилизированных белковыми адсорбционными слоями, которая может вносить дополнительный вклад в стерическую и/или электростатическую стабилизацию белковых адсорбционных слоев на каплях реальной эмульсии

Кроме того, в условиях термодинамически благоприятных взаимодействий между различающимися по природе биополимерами (as] -казеин + пектинат при рН 5 5, I = 0 01М, А*23 = - 334 хЮ5 (см3/моль)) так же, как и в случае термодинамически неблагоприятных взаимодействий, было найдено значительное возрастание вязкоэластичности концентрированных эмульсий (40 об % масляной фазы) и быстрый криминг в эмульсиях с низким содержанием масляной фазы (11 об % ) (Рис 8) В данном случае такое поведение стабилизированных белком эмульсий в присутствии полисахарида может объясняться флоккуляцией капель эмульсии по «мостичному» механизму, т е когда адсорбировавшиеся молекулы, как белка, так и полисахарида могут выполнять роль мостиков, связывающих смешанные белок - полисахаридные адсорбционные слои на каплях эмульсии

Часть II. Взаимодействия биополимеров с низкомолекулярными амфифильными соединениями

Глава 1. Модификация структурообразующей функции биополимеров посредством взаимодействия с низкомолекулярными поверхностно-активными соединениями (ПАВ)

К низкомолекулярным амфифильным соединениям, представляющим большой научный и практический интерес, относятся низкомолекулярные поверхностно активные вещества (ПАВ), которые широко используются для стабилизации коллоидных систем наряду с биополимерами В основе этой стабилизации лежит способность ПАВ формировать защитные адсорбционные слои на коллоидных частицах (масла, воздуха - в прямых эмульсиях и пенах), благодаря наличию у них, как и у биополимеров, полярных, и неполярных функциональных групп в молекулах При этом особый интерес вызывает изучение взаимовлияния ПАВ и биополимеров на их молекулярные и функциональные свойства В частности, целью нашей работы было проведение термодинамического анализа влияния ПАВ на молекулярные параметры и структурообразующие свойства белков в бинарных модельных системах типа ПАВ + белок, а также в выяснении роли третьего, неадсорбирующегося, биополимера, в частности полисахарида, на эти свойства

Взаимодействие белков с индивидуальными молекулами ПАВ.

Проведенные методом калориметрии смешения измерения величин энтальпии взаимодействия, ЛНвелок-плв, для нескольких пар промышленно важных белков (легумина в нативной и термоденатурированной форме, казеината натрия) и анионных ПАВ (имеющих одинаковую углеводородную часть, но сильно различающихся, как по заряду, так и по химическому строению их полярных частей А именно, CITREM (сложный эфир лимонной кислоты и моноглицерида) и SSL (натриевая форма сложного эфира жирной кислоты с молочной кислотой) По данным фирмы-производителя, «Damsco», эти ПАВ, содержали практически равные количества стеариновой (Cig) и пальмитиновой (Cií) жирных кислот KKMcitrem = 15 мг/л, KKMssl = 3,5 мг/л) позволили выделить ряд основных особенностей их структуры, определяющих характер их взаимодействия в водной среде Так, в первую очередь, к ним можно отнести - конформацию белков, обеспечивающую или нет доступность их интерьера для молекул ПАВ, а также их молярную массу, определяющую возможное число мест связывания для молекул ПАВ. Для иллюстрации этого положения обратимся к данным представленным на Рис 9 Так, из этих данных видно, что среди изученных белков минимальные абсолютные значения АНбедок.ПАв были обнаружены в случае нативного легумина, имеющего конформацию глобулы (М„ = 330 кДа, RG = 3-5 нм, с четвертичной структурой в виде тригональной призмы, объединяющей шесть субъединиц, каждая из которой состоит из объединённых кислых и основных полипептидных цепочек с Mw « 20 кДа), интерьер которой, по-видимому, оказывается практически

недоступным для молекул изученных ПАВ, с достаточно длинными углеводородными радикалами (С 16, С18)

АНтгп0бу™„-™В(кДж/моль)

о -20 -40 -60 -80 -100

АН.

1 ККМ», 10 Спдв <МГ/Л>

115гяобулинт/д-ПАВ

О

(кДж/моль)

АН

1 KKMSSL ю

спдв (мг/л)

3000 2000 1000 о

-1000 -2000

■4500 -«000

, (кДж/моль) (В)

KKNI Ю

Сплв(МГ/л)

Рис. 9. Энтальпия взаимодействий между одноименно заряженными белками (0 5 вес/объем %) (а) нативным легумином, (б) термоденатурированным легумином, (в) казеинатом натрия и анионными ПАВ (•) CITREM , (О) SSL при рН 7 2 , ионной силе 0 05М и 293К

В то же время, для термо-денатурированного (т/ц) легумина - 6300 кДа, Ян = 58 нм) и казеината натрия (Мк = 4000 кДа, = 117 нм) величина ДНбелок-плв имела практически на два порядка большие значения, что, очевидно, не могло быть обусловлено только на порядок большей молярной массой наночастиц этих белков и, в значительной степени, определялось их достаточно открытой структурой, задаваемой менее свернутыми, чем у глобулярного белка, полипептидными цепочками, составляющими наночастицы этих белков

Представленные данные также свидетельствуют, что к важным параметрам, определяющим характер взаимодействий одноименно заряженных белков и ПАВ можно отнести размер и заряд полярной «головы» молекул ПАВ, которые, при их малых значениях могут способствовать проникновению молекул ПАВ, как единого целого, в интерьер белка, что, в свою очередь, может повысить вероятность формирования различных типов взаимодействий, а именно, как экзотермических, так и эндотермических по своему характеру между полярными и неполярными участками белка и ПАВ При этом энергия взаимодействий между полярными функциональными группами белка и ПАВ (главным образом, электростатическая энергия взаимодействий внутри белкового интерьера - между разноименно заряженными крбоксильными группами молекул ПАВ и аминогруппами белка) 160 кДж/ моль, и образования водородных связей с участием крбоксильных, гидроксильных, эфирных и аминогрупп белка и ПАВ 10-40 кДж/ моль) в сумме может превышать энергию взаимодействий межу неполярными участками их молекул (гидрофобные взаимодействия 5-10 кДж /моль) В итоге, это может привести к превалированию энергии полярных взаимодействий над энергией - неполярных в измеряемом суммарном тепловом эффекте, что

должно проявиться в преимущественно экзотермическом характере взаимодействий между белками и ПАВ при комнатной температуре Действительно, наиболее ярко это выражается в значительно большем экзотермическом тепловом эффекте взаимодействия с белками, SSL, по сравнению с CITREM, что можно объяснить меньшим размером и зарядом полярной части молекул SSL (Рис 9)

Кроме того, полученные данные указывали на то, что достаточно большой одноимённый заряд на молекулах, как ПАВ, так и белков, вызывая сильное электростатическое отталкивание между ними, препятствует проникновению полярных «голов» ПАВ в интерьер белка, и, очевидно, уменьшает развитие полярных взаимодействий между ними В этих условиях формирование гидрофобных контактов между неполярными участками молекул белка и ПАВ может стать более предпочтительным Как, например, в случае обнаруженного ярко-выраженного, преимущественно эндотермического характера взаимодействия между CITREM и казеинатом натрия (Рис 9в) Кроме того, эндотермический характер переноса углеводородных цепочек CITREM из водной среды в гидрофобный интерьер наночастиц казеината натрия также, по-видимому, мог проявиться в данном случае

Такие эндотермические по характеру взаимодействия, как правило, являются энтропийно контролируемыми, и в данном случае могут быть обусловлены освобождением большого числа молекул воды при дегидратации, как молекул белка, так и ПАВ в процессе их взаимодействий

В результате описанных выше взаимодействий белков с индивидуальными молекулами ПАВ, наблюдалась, как правило, значительная ассоциация белковых наночастиц, при которой индивидуальные молекула ПАВ, по всей вероятности, играли роль эффективных сшивающих агентов При этом ассоциация белков проявлялась в существенном увеличении их молярной массы и размеров (RG), измеренных методом статического лазерного светорассеяния и приведенных в качестве иллюстрации в Табл 7

Здесь интересно отметить, что, по всей вероятности, благодаря меньшему электростатическому отталкиванию между одноименно заряженными молекулами SSL и белка, степень ассоциации белков в комплексе с этим ПАВ была либо близка, либо даже выше, чем для комплексов белков с CITREM, не смотря на практически пятикратно меньшую весовую концентрацию (и, приблизительно, четырехкратно меньшую молярную концентрацию) SSL в растворе по сравнению с CITREM (При этом следует отметить, что во всех опытах по светорассеянию, во-первых, полученные предварительно комплексы белок (0 5% вес/объем) + ПАВ (требуемой концентрации) разбавлялись буфером, т е сохраняя соотношение ПАВ-белок постоянным, а, во-вторых, в расчетах учитывалась только концентрация белка, поскольку вклад ПАВ в величину концентрации комплекса был на три порядка ниже, что входило в 10% ошибку метода)

С одной стороны, такая ассоциация белков при взаимодействии с ПАВ сопровождалась возрастанием их поверхностной гидрофильности, что находило свое отражение либо в увеличении положительных, либо в

уменьшении отрицательных значений вторых вириальных коэффициентов Наиболее ярко это видно на примере взаимодействия анионных ПАВ (CITREM и SSL) с наночастицами казеината натрия и т/д легумина (Табл 7)

Таблица 7. Молекулярные и термодинамические параметры комплексов белков с ПАВ, сформировавшихся в результате их взаимодействий в воде,®

среде при концентрациях ПАВ ниже ККМ (рН 7 2,1 = О 05М, 293 К) (Экспериментальна ошибка в определении Mw, А 2 and Rh составляла ± 10% от измеряемой величины Ошибка в определении ^составляла ± 5% от измеряемой величины)

Система Спав МЛ о6, А2 Ю5, Ra\ Р =

(мг/л) (Да) (м3 моль/кг2) (м3/ моль) (нм) k2> Rg/RI,

Казеинат натрия

Белок без 0 4 29 0 93 117 1 1

ПАВ

Белок + озккм 29 73 И 2 188 211 1 8 20

CITREM

Белок + ОЗККМ 25 63 63 78 207 1 8 22

SSL

Нативный легумин

Белок без 0 0 33 0 0 - -

ПАВ

Белок + 0 4ККМ 0 38 1 2 -24 5 -0 07 - -

CITREM

Белок + ОЗККМ 0 69 20 -07 -0 007 - -

SSL

Термоденатурированный легумин

Белок без 0 63 -21 - 17 40 07

ПАВ

Белок + 0 4ККМ 19 2 30 1 4 10 108 27 1 7

CITREM

Белок + ОЗККМ 55 87 32 8 1984 273 68 3 1

SSL

*) , 3 ,1/ комплекса / белка \

' К1 - степень ассоциации белка (Мш / М„ ), к2 - степень возрастания размеров

белков в комплексе с ПАВ /л0еаит)> **> Из-за отсутствия угловой асимметрии

светорассеяния, очевидно обусловленной малыми размерами нативного легумина и его комплексов с ПАВ, значения Ка для этого белка было невозможно определить методом светорассеяния

С другой стороны, взаимодействия ПАВ-белок могли приводить к явно-выраженному повышению гидрофобности поверхности белка (А2 < 0), как это, например, наблюдалось в случае взаимодействия нативного легумина с анионными ПАВ (Табл 7)

Найденные изменения в относительной гидрофильности/гидрофобности поверхности наночастиц белка в результате взаимодействий с ПАВ, по всей вероятности, были вызваны определенным преимущественным расположением гидрофильных и гидрофобных участков, как ПАВ, так и белка на поверхности их комплексов в ответ на преобладающий характер взаимодействий между

ними Кроме того, сопоставление данных светорассеяния и ДСК позволили сделать вывод, что найденное возрастание гидрофобности поверхности легумина (А, < 0) в результате взаимодействий с анионными ПАБ, может быть следствием, как снижения его конформационной стабильности (частичное разворачивание), так и присоединения углеводородных цепочек ПАВ к поверхности белковой глобулы

Интересный результат также показывает сравнение степени увеличения молярной массы белковых ассоциатов (к/) со степенью увеличения их радиуса инерции (к2), представленное в Табл 8 Поскольку, хорошо известно, что для полимерной агрегации соотношение между М„ и Rc может быть описано при помощи степенного уравнения М„ = KRGd\ в котором показатель степени d* имеет значение размерности, позволяющей описать пространственную структуру формирующихся агрегатов при помощи простых геометрических моделей При этом, для определенной пары белок - ПАВ, в первом приближении, можно предположить, что kj = k2d*, где значение l<2d* может быть рассчитано с использованием показателя степени d*, характерного для определенного типа агрегации полимерных частиц

Так, в случае наночастиц казеината натрия, имеющих довольно пористую структуру, задаваемую случайным образом свернутыми полипептидными цепочками индивидуальных казеинов, проведенное сравнение позволяет сделать предположение о возможном сжатии исходных наночастиц белка, объединяющихся в ассоциаты, за счет, по всей вероятности, формирования множественных внутренних сшивок в их интерьере при присоединении молекул ПАВ Что наиболее близко отвечает случаю преимущественно гидрофобного присоединения молекул CITREM к этому белку При этом интересно отметить, что возрастание структурно -чувствительного параметра р = Rc/Rh, (рассчитанного из данных статического и динамического светорассеяния и представленного в Табл 7), от 1 к 2 предполагает, что архитектура этих ассоциатов в целом видоизменяется от плотных сфер к более открытой архитектуре рыхлых, протекаемых клубков, несмотря на вероятное сжатие составляющих их белковых наночастиц

В случае т/д легумина проведенное сравнение (Табл 8) предполагает линейную ассоциацию исходных наночастиц белка, вызванную их взаимодействием с анионными ПАВ Этот результат хорошо согласуется с изменением параметра р, который указывает на изменение архитектуры белковых наночастиц от архитектуры твердых шариков 0 6 < р < 1 к их более открытому типу, которая приближается к линейной форме жестких полидисперсных стержней при р > 2, обнаруженной, например, при присоединении к белку молекул SSL

По-видимому, как в одном, так и во втором случае электростатическое отталкивание между расположенными на поверхности белков полярными группами анионных ПАВ способствуют формированию новых комплексных наночастиц с более открытой архитектурой по сравнению с архитектурой чистых белков

Таблица S. Теоретическая оценка типа ассоциации белков (0,5 вес/объём %),

вызванной их взаимодействием с ПАВ в водной среде при 293К __(рН 7.2, nomma сила 0.05М), _

Линейная Случайная Ассоциация Сжатие

ассоциация зс со ни ai m и каркасного полимерных

Система СПАВ (мг/л) k, 1 вдоль жесткого тина единиц, объединяющихся

стержня <]* = 1 d* =2.5 d* = 3.0 в ассопиат il* - 3.5

Казейнат и атрия

Велок + О.ЗККМ 7.3 1.8 4.3 5.8 7.8

сгашм

Бело* + SSL рдккм 6.3 }.Й 4.3 5,8 7.8

Термоденатурированньшй легумин

Белок 1 0.4ККМ 3.0 2.7 11.9 19.7 32.3

CITRHM

Белок + SSL 0,3 ККМ 8.7 6.8 120.5 314.4 819.9

lía Основании объединенных данных калориметрии смешения и лазерного светорассеяния, можно схематично представить молекулярный механизм взаимодействий белков с ПАВ, что, в качестве примера, продемонстрировано на Рис. 10 для взаимодействий наночаетнц казеината натрия е индивидуальными молекулами анионного 11ЛВ - CITREM (СцАВ < ККМ).

Изменение молекулярных и термодинамических свойств белков в объёме водной среды в результате их взаимодействия с ПАВ приводит к значительным изменениям их поверхностной активности на границе раздела фаз, что, в Частности, можно продемонстрировать на примере изменения поверхностной активное™ нативного и термо денатурированного легумина на плоской границе раздела фаз воздух-вода. Данные метода тензиометрии приведены на Рис. 1 i.

ДН>0 Д8 > О AG < О

Рис. 10. Схематичное представление молекулярного механизма в заи (и о действий казеината натрия (С = 0.5 вес/объём %) с индивидуальными молекулами CITREM (С = 5 мг/л (0,3 ККМ)) н водной среде при 293 К (рЙ 7.2, ионная сила 0.05 М). В левой части рисунка показаны только молекулы нидм, связанные с полярными группами белка и ПАВ, а также молекулы воды, структурированные «округ углеводородных «Хвостов» [IaB ito механизму гидрофобной гидратации. В правой части рисунка показано освобождение этих

s

1

молекул связанной и структурированной воды в результате преимущественно гидрофобных взаимодействий между белком и ПАВ Молекулы изначально несвязанной воды на рисунке не показаны

Из представленных данных, в первую очередь, видно, что поверхностная активность, как нативного, так и термоденатурированного легумина значительно возрастает в комплексе с изученными ПАВ

Рис. 11 Влияние ПАВ на поверхностную активность нативного и

термоденатурированного легумина (10 мг/л) на плоской границе раздела фаз воздух-вода (рН 7 2, ионная сила 0 05М, 298 К) Равновесное поверхностное натяжение, у, построено, как функция концентрации ПАВ (а) CITREM, (б) SSL, (Д) ПАВ без белка,

(•)нативный легумин, (О) т/д легумин Пунктиром указана концентрация ПАВ, изученная методом лазерного светорассеяния

Основываясь на данных лазерного светорассеяния (Табл 7), можно предположить, что такой результат является следствием, либо, более высокой степени ассоциации белков в присутствии ПАВ, что могло способствовать доставке большего числа поверхностно активных молекул из объема раствора на границу раздела фаз, либо, следствием понижения термодинамического сродства наночастиц комплексов к водной среде (более отрицательные значения вторых вириальных коэффициентов), как в случае нативного легумина

При этом такая модификация поверхностной активности белков приводила, как правило, к более продолжительному времени жизни пен стабилизированных комплексами белков с ПАВ, что наиболее вероятно было обусловлено, как лучшими стерическими характеристиками модифицированных белковых адсорбционных слоев на пузырьках воздуха (более высокая величина адсорбции, адсорбция ассоциатов белка), так и их более высокой водоудерживающей способностью (рост гидрофильное™) При этом важно отметить, что ПАВ при изученных концентрациях совсем не могли образовывать стабильных пен

Взаимодействие белков с мицеллами ПАВ

Было также установлено, что характер взаимодействий между ПАВ и белками зависит от состояния ПАВ в водной среде, т е находятся они в виде

Wo. (мН'м>

50

40

0 5 10 15 20 Сетка, <мг/л)

70

60

50

40

30

0 12 3 4 С^(мг/л)

индивидуальных молекул (Спав < ККМ) или в виде мицелл (СИАВ > ККМ) При этом, полученные данные позволили выделить некоторые свойства мицелл, оказывающие значительное влияние на характер их взаимодействия с белками

Так к ним можно отнести, во-первых, термодинамическую стабильность мицелл, выражаемую в терминах свободной энергии Гиббса мицеллообразования ДОмиц, которая, при низких абсолютных значениях, предположительно, может способствовать участию гидрофобного ядра мицеллы во взаимодействии с белком Во-вторых, - гидрофильно-липофильный баланс свойств поверхности мицелл, который отражает строение мицелл (прямые, обратные), а также их суммарный заряд И, в-третьих, их размер, который, очевидно, может определять вклад эффектов исключенного объема во взаимодействие между белками и мицеллами ПАВ

Так, было показано, что в условиях, когда ожидается, что и белки и мицеллы ПАВ несут достаточно высокий одноименный заряд, и между ними нет специфического сродства, то тогда мицеллы не принимают участия во взаимодействии с белками из-за сильного электростатического отталкивания между ними При этом только индивидуальные молекулы ПАВ, находящиеся в равновесии с мицеллами, могут взаимодействовать с белками, что отражается в практически неизменном характере взаимодействий между белками и ПАВ при прохождении области ККМ, о чем свидетельствуют данные калориметрии смешения

Напротив, в условиях, ослабления электростатического отталкивания между белками и мицеллами ПАВ (понижение рН в область р1 белков, переход от заряженных к нейтральным мицеллам) они могут взаимодействовать друг с другом При этом, с одной стороны, при низкой термодинамической стабильности мицелл ПАВ они, по-видимому, могут разрушаться при контактировании с белками, в результате чего может освобождаться большое число индивидуальных молекул ПАВ, способных принять участие во взаимодействии с белками, и в результате этого может наблюдаться резкое возрастание величины теплового эффекта при сохранении его характера при прохождении области ККМ С другой стороны, в случае достаточно высокой термодинамической стабильности мицелл, их участие во взаимодействии с белками как единого целого может проявляться в резком изменении характера взаимодействий белок - ПАВ при прохождении области ККМ При этом, с одной стороны, наибольшее сродство белков с мицеллами ПАВ наблюдается при наличии наибольшего количества противоположных зарядов на их поверхностях, а, с другой стороны, общее количество мицелл способных связаться с белками определяется молярной массой наночастиц белков, т е числом мест связывания на них

Данные светорассеяния свидетельствуют (Табл 9), что в зависимости от характера взаимодействий мицелл ПАВ с белком, может происходить различное изменение молекулярных параметров и термодинамических свойств белка в водной среде

Таблица 9 Влияние характера взаимодействия мицелл ПАВ с наночастицами казеината натрия на их молекулярные параметры и термодинамические свойства в водной среде при различных рН

MwlO-6 (Да) л2 Ю3, а2 (м3 моль/кг2) (м3 /моль) р= mw10"6 а2105, а2 р = Rc/Rh (Да) (м3 моль/кг2) (м3 /моль) ra/rh

рН Казеинат натрия Казеинат натрия + фосфолипид (105ККМ)

Ионная сила 0 01М

72 4 2 9 0 93 1 1 14 596 2335 1 7

60 16 4 7 24 1 9 6 58 42 1 3

5 1 1023 8 9 18 6х104 46 11 119 287 07

Ионная сила 0 05М

Казеинат натрия Казеинат натрия + CITREM (33 ККМ)

123 1 7 517 0 6

5 5 15 20 90 2 2 Казеинат натрия + SSL (33 ККМ) 18 5 9 38 1 4

Так, при участии большого числа молекул ПАВ из ядра мицелл во взаимодействии с белком (в результате их разрушения), они могут формировать множество внутримолекулярных и межмолекулярных сшивок с наночастицами белка, что проявляется, в первую очередь, в их ярко выраженной ассоциации и компактизации (уменьшение Rc и р) Как, например, это наблюдалось в случае взаимодействия мицелл CITREM с наночастицами казеината натрия При этом, кроме того, благодаря преимущественно гидрофобному характеру взаимодействий между неполярными участками молекул ПАВ и наночастиц белка, модифицированные наночастицы белка обладали высокой гидрофильностью поверхности за счет концентрирования на ней полярных групп CITREM

В то же время, если прямые мицеллы ПАВ участвуют во взаимодействии с белком, как единое целое, то их влияние на молекулярные параметры белка, по-видимому, определяется соотношением сил притяжения (электростатических между разноименными зарядами) И отталкивания (электростатических меяеду одноименными зарядами, эффекты исключенного объема) между белком и мицеллами, между мицеллами, присоединившимися к белку, а также между модифицированными наночастицами белка

Так, например, в случае присоединения мицелл SSL, молекулярные параметры исходных наночастиц белка изменялись незначительно (Табл 9), т е при возрастающей гидрофильности поверхности белковых наночастиц их ассоциация была слабо выражена По всей вероятности, в данном случае добавочный заряд, приобретенный наночастицами белка при присоединении

мицелл ПАВ, препятствовал развитию их значительной ассоциации, благодаря усиливающемуся электростатическому отталкиванию между ними

При присоединении к белку в целом нейтральных смешанных мицелл (липосом) фосфолипидов, ассоциация наночастиц белка наблюдалась только в условиях максимального сродства (как было установлено - электростатической природы) между мицеллами и белком, т е при рН 7 2 (Табл 9) При этом можно предположить, что мицеллы играли роль ионных мостиков между наночастицами белка Данные таблицы 9 также свидетельствуют, что в результате такого взаимодействия термодинамическое сродство модифицированных наночастиц белка к водной среде возрастало на несколько порядков, что можно объяснить добавлением гидрофильной поверхности мицелл к поверхности белка

В то же время, присоединение суммарно большего числа мицелл фосфолипидов к большим по молярной массе наночастицам белка, существующим при более кислых значениях рН (6 0 и 5 1), напротив, приводило к их диссоциации, что было наиболее ярко выражено для рН (5 1), наиболее близком к ИЭТ белка, те в условиях изначально-высокой степени гидрофобной агрегации практически незаряженного белка Такой результат, по-видимому, можно объяснить действием сил отталкивания между присоединившимися к белку мицеллами, (электростатических между одноименными зарядами, эффекты исключённого объема) которые эффективно нарушали первоначально существующие гидрофобные контакты в интерьере белковых ассоциатов

При рН 6 0, найденная диссоциация приводила к формированию более гидрофильных комплексных наночастиц белка (большие положительные значения «моляльных» и «весовых» А2 по сравнению с их значениями для чистого белка) за счет, по всей вероятности, присоединения достаточно гидрофильных мицелл фосфолипидов к белку

В то время как, диссоциация при рН 5 1 характеризовалась падением термодинамического сродства к водной среде модифицированных белковых наночастиц в целом (меньшее значение «моляльного» А2 по сравнению с его значением для чистого белка, что, как показал расчёт, главным образом, было связано с уменьшением вклада эффектов исключенного объема в их взаимодействие за счет уменьшения размеров), хотя их удельная гидрофильность, при этом, все же возрастала (рост положительной величины «весового» Аг), что может также быть объяснено добавлением гидрофильности от мицелл фосфолипидов к белку

В результате такой модификации пены, стабилизированные модифицированными наночастицами белка, как правило, отличались более высокой стабильностью во времени, по сравнению с пенами, стабилизированными только белком Исключением был случай стабилизации пен белком, свойства которого были модифицированы взаимодействием с мицеллами СГГКЕМ В этом случае пены практически не образовывались По-видимому, высокая степень ассоциации исходных наночастиц белка, сопровождающаяся значительным возрастанием их поверхностной

гидрофильности (резкий рост А2) (Табл 9), приводила к резкому падению числа частиц способных формировать достаточно прочные адсорбционные слои на пузырьках воздуха, что было причиной их быстрой коалесценции

В качестве примера синергетического взаимовлияния белка и мицелл ПАВ на их структурообразующую способность на границе раздела фаз на Рис 12 представлена зависимость времени полураспада пен, стабилизированных комплексами белка с мицеллами фосфолипида при их различной концентрации (Следует отметить, что мицеллы фосфолипидов в изученном диапазоне концентраций пен не образовывали)

(мин)

100

О 0 01 01

Рис. 12 Время полураспада пен, стабилизированных комплексами казеината натрия (1 вес/объем %) и мицелл фосфолипидов при их различной концентрации (О) рН 7 0, (□) рН6 0, (А) рН 5 0

в (мМ)

По-видимому, в случае модификации белка, сопровождающейся возрастанием гидрофильности поверхности белковых наночастиц, как при рН 7 2 или рН 6 0 найденный синергетический эффект обусловлен формированием стерически более прочных и лучше сольватированных адсорбционных слоев на пузырьках воздуха в пене, что замедляет их коалесценцию В то же время, при рН 5 0 этот эффект, по-видимому, главным образом, связан с упрочнением адсорбционных слоев на пузырьках воздуха за счет возрастания общего числа частиц, способных адсорбироваться на границе раздела фаз

Тройные системы: полисахарид - белок — ПАВ

Очевидно, что для того чтобы подойти ближе к пониманию процессов структурообразования в наиболее важных для практики многокомпонентных биополимерных системах, необходимо усложнение модельных систем Поэтому, следующим шагом в наших исследованиях был переход от бинарных систем к тройным системам, в частности, например, содержащих два биополимера и одно амфифильное соединение

Действительно, достоверно было установлено, что добавление амилозы и ферментативных производных крахмала (мальтодекстринов) к смесям глобулярных белков (овальбумин, легумин) с ПАВ (деканоат натрия, CITREM, SSL, PGE (эквимассовая смесь сложных эфиров стеариновой и пальмитиновой кислот с

ггалиглицсршюм)), как правило, приводило к понижению Поверхностной активности этих смешанных систем, практически «сводя к нулю» синсргстичсское взаимовлияние белков и ПАВ. Это выражалось в уменьшении, как значений равновесного межфазного давления в адсорбционном слое на границе раздела фаз воздух-вода, гак и времени жизни пен, стабилизированных смешанными (белок + ПАВ) системами, при добавлении полисахаридов, что н качестве примера показано на (Рис 13).

*<мН/м) (а) |.,(мин)

Рис. 13. Влияние мальтодекстринов (0,5 В5с/объ«м %) с различной молярной массой на поверхностней активность смесей легумшта с ПАВ на границе раздела фаз (кшух-пода (рН 7.2, донная сила 0.05М, 298 К), (а) Межфазное давление, к (через 3 часа от начат измерений), отложено от концентрации легумина в системе; Сспиш ~ 5 мг/л (0.3 ККМ); Счал1.м„с,риш = 0,5 нес/объём %: (О) Легумин + CITREM; (А) (ЛеГумнк + CITREM) + SA-2; (•) (Летумин + CITREM) + MD-6; (Ш)(Легумин + CITREM) ■ MEMO, (б) Время полураспада пен (tin), стабилизированных .чегумином (1 нес/объём %) в отсутствии и и Присутствии CITREM (5 мг/л — 0.3 К КМ) и мал ьтодек ст ри i ю в

Проведённый термодинамический анализ позволил выделить три основных причины, которые могут лежать в основе найденного влияния полисахаридов.

В первую очередь, данные калориметрии смешения указывали на интенсивное взаимодействие изученных полисахаридов с ПАВ, что предполагало возможную конкуренцию между полисахаридом и белком за молекулы ПАВ, которая могла приводить к уменьшению их синергстического взаимовлияния в проявлении поверхностной активности на границе раздела фаз,

При этом данные представленные на Рис. 14 показывают, как преимущественный характер взаимодействий между полисахаридами и ПАВ зависит от особенностей их молекулярной структуры.

Так, наличие достаточно длинных углеводородных цепочек в молекулах ПАВ определяет возможность их эффективных взаимодействий с гидрофобными участками полисахаридов в водной среде по гидрофобному

1Е-5 1Ё-4 1Е-3 0,01 0.1

CLTREH SA-2

механизму, в частности с гидрофобными участками глюкозных остатков в макромолекулах основных компонентов и ферментативных производных крахмала Это, выражается, например, в преимущественно эндотермическом характере взаимодействий мальтодекстринов и анионных ПАВ при комнатной температуре (Рис 14)

1500

1000

500

-500

ДН (мДж/г)

(а)

ДН (мДж/г)

1000

5 10 15 20' С (мМ)

|КЙй

30 20 ю о -ю -20 -30 -40

АН (мДж/г)

(мг/л) '

0 0024(мМ)

0 002

0 02 (мМ)

Рис. 14 Удельная энтальпия взаимодействий мальтодекстринов (0,5 вес/объем %) с различной молярной массой с ПАВ в водной среде (рН 7 2, ионная сила 0 05М, 298 К) (а) деканоат натрия, (б) SSL (в) CITREM (A)SA-2, (e)MD-6, (■)MD-10

При этом интересно отметить, что близкие эндотермические тепловые эффекты взаимодействий деканоата натрия (Сю) и SSL(50% - С16, 50% - С]8) с мальтодекстринами были найдены, несмотря на несколько порядков меньшую концентрацию последнего в изученной области концентраций ПАВ, те- ниже их ККМ Очевидно, что этот результат мог быть обусловлен формированием близкого числа гидрофобных контактов ПАВ-мальтодекстрин в сравниваемых системах в соответствии с большей длиной углеводородных цепочек в молекулах SSL

Данные калориметрии смешения также свидетельствуют, что при одинаковой длине углеводородного радикала молекул ПАВ, большое влияние на характер их взаимодействия с полисахаридами оказывает химическое строение полярной группы ПАВ Так, при сравнении молекул CITREM с менее полярными молекулами SSL (Рис 14) ясно видно, что преимущественный характер взаимодействий молекул CITREM с мальтодекстринами оказывается менее эндотермическим и даже переходит в экзотермический при снижении молярной массы мальтодекстринов (большее число частиц при одинаковой весовой концентрации) или при приближении концентрации CITREM к ККМ (рост концентрации молекул ПАВ, участие во взаимодействии мицелл) То есть, эти результаты позволяют сделать предположение о существенном вкладе формирования водородных связей между атомами кислорода (акцептор) и водорода (донор) полярных групп молекул CITREM (гидроксильные, карбоксильные,

эфирные) и мальтодекстринов (гидроксильные группы глюкозных колец) в общий тепловой эффект их взаимодействий

Кроме того, в основе преимущественно экзотермического характера взаимодействий полисахаридов с ПАВ может лежать образование между ними комплексов включения Но, это, по-видимому, возможно лишь при условии, что углеводородная цепочка ПАВ - не слишком длинная (как в случае деканоата натрия), и молярная масса полисахаридов - не слишком низкая (как в случае мальтодекстрина ЭА-2 или амилозы) Т е, при том условии, что, с одной стороны, полисахарид может претерпевать конформационный переход клубок-спираль, а, с другой стороны, ПАВ может быть легко включен в полисахаридную спираль При этом, обычно, спиральная конформация стабилизируется водородными связями, образование которых может быть облегчено одновременным формированием протяженных гидрофобных контактов между глюкозными кольцами полисахаридов и углеводородными цепочками ПАВ При этом, действительно, в случае амилозы ДСК зафиксировала появление теплового пика на термограмме, характеризующего конформационный переход (спираль-клубок) молекул амилозы в присутствии деканоата натрия при нагревании

Второй причиной, лежащей в основе обнаруженного влияния полисахаридов на поверхностные свойства смесей белков с ПАВ, можно считать изменение термодинамики взаимодействий модифицированных с помощью ПАВ белков и полисахаридов Что, очевидно, должно влиять на их термодинамическую активность в объеме водной среды

Так, например, действительно, данные статического лазерного светорассеяния (Табл 10) свидетельствовали о возрастании термодинамического сродства (возрастание отрицательных значений перекрестных вторых вириалъных коэффициентов (см Ур-я (3,4)) между легумином И мальтодекстринами в случае присоединения к ним молекул деканоата натрия Эти данные указывали на понижение термодинамической активности модифицированного белка в объеме водной среды (см Ур-я (3,4)), что, очевидно, препятствовало его адсорбции на границе раздела фаз

Более того, в случае С ПНЕМ, данные статического лазерного светорассеяния (Табл 10) указывали на формирование более гидрофильных наночастиц тройного комплекса (белок + ПАВ + полисахарид) по сравнению с наночастицами бинарных комплексов (белок+ ПАВ), что также могло привести к понижению поверхностной активности смесей белка с ПАВ в присутствии полисахаридов

При этом, в случае формирования тройного комплекса данные калориметрии смешения (Рис 15а) свидетельствовали о том, что взаимодействия между модифицированными с помощью СГПШМ белком и полисахаридами носят преимущественно экзотермический характер, те в их основе лежат преимущественно взаимодействия между их полярными группами Однако, менее выраженный экзотермический характер взаимодействий модифицированных белка и полисахаридов по сравнению с

характером взаимодействий белка и полисахаридов в отсутствии ПАВ, по — видимому, указывает также на существенный вклад образования эндотермических по характеру гидрофобных контактов между модифицированными белком и полисахаридами, вероятность формирования которых увеличивается при присоединении к белку и полисахариду относительно длинных углеводородных цепочек СГГКЕМ (Рис 15) Причем, этот вклад увеличивался, во-первых, при возрастании концентрации СГГКЕМ, т е в соответствии с ожидаемым возрастанием числа углеводородных цепочек этого ПАВ, присоединившихся к молекулам, как белка, так и мальто декстринов, и, во-вторых, в случае взаимодействий с белком мальтодекстринов с меньшей молярной массой, те в соответствии с их меньшей экранирующей способностью по отношению к углеводородным цепочкам, присоединившихся к ним, молекул СП'ЛЕМ

Таблица 10. Термодинамика парных взаимодействий между модифицированными с помощью ПАВ легумином и мальтодекстринами в водной среде, а также молекулярные и термодинамические параметры тройных комплексов белок + ПАВ + полисахарид, в водной среде (рН 7 2,1 = 0 05М, 293 К) (Параметры комплекса белок + ПАВ даны для сравнения) Экспериментальна ошибка в определении М„ ,Аб-бнАбпсоставляла + 10% от измеряемой величины

Взаимодействие белок-полисахарид Без ПАВ 1 мМ деканоат-Ыа

Аб-пс Ю4, Аб-пс Ю4,

(м3 моль/кг2) (м3 моль/кг2)

Легумин - SA-2 -03 -02

Легумин - MD-6 -02 -50

Легумин - MD-10 -24 -46

Двойной (белок+ПАВ) и тройной (беяок+ПАВ+полисахарид) комплексы

Система MwlO6 А2 Ю5, А'2,

(Да) (м3 моль/кг ) (м / моль)

Легумин + CITREM (6 мг/л) 0 38 -24 5 -0 07

Легумин + CITREM (6 мг/л) + SA-2 6 90 22 0 20 94

Легумин + CITREM (6 мг/л) + MD-6 7 40 22 0 24 09

Легумин + CITREM (6 мг/л) + MD-10 0 36 36 0 0 09

Общность изменения характера взаимодействий легумина и мальтодекстринов в результате их модификации при взаимодействии с анионными ПАВ показана на Рис 156 на примере взаимодействий биополимеров, модифицированных SSL Однако, в соответствии с меньшим зарядом и числом полярных групп в молекулах SSL по сравнению с молекулами CITREM, характер взаимодействий модифицированных биополимеров становился еще менее экзотермическим Наиболее ярко это проявляется при сравнении более высокомолекулярных мальтодекстринов (SA-2, MD-6), т е обладающих большей экранирующей способностью по отношению к углеводородным цепочкам, присоединенных к ним, молекул

ПАВ, а значит из-за этого более чувствительных к изменению полярности и заряда полярных «голов» ПАВ

Рис. 15 Удельная энтальпия взаимодействий*' легумина (0,5 вес/объем %) и мальтодекстринов (0,5 вес/объем %), модифицированных анионными ПАВ, в водной среде (рН 7 2, ионная сила 0 05М, 298 К) (a) CITREM, (б) SSL (A)SA-2, (•)MD-6, (И)МО-Ю

расчет энтальпии проводили в предположении, что и белок и полисахариды формировали стабильные комплексы с ПАВ до проведения измерений (достижение равновесия в связывании ПАВ биополимерами), так что свободных молекул ПАВ, способных дополнительно взаимодействовать с биополимерами не было в момент измерения в измерительной ячейке

Третьей причиной, лежащей в основе обнаруженного влияния полисахаридов на поверхностные свойства смесей глобулярных белков с ПАВ, можно считать изменение конформационной стабильности белков, модифицированных взаимодействиями с ПАВ, что, очевидно, должно влиять на способность глобулярных белков к формированию вязкоэластичных и прочных адсорбционных слоев на границе раздела фаз

Действительно, полученные для ряда систем ((овальбумин-деканоат натрия )+ амилоза, (легумин-деканоат натрия) + амилоза или амилопектин, или мальтодекстрины, (легумин-CITREM) + мальтодекстрины, (легумин-SSL) + мальтодекстрины)), данные ДСК достоверно свидетельствуют о том, что полисахариды могут не только эффективно нивелировать влияние ПАВ на конформационную стабильность глобулярных белков, за счет конкурентных взаимодействий с молекулами ПАВ, но и значительно модифицировать ее, по всей вероятности, за счет взаимодействий, как с ПАВ, так и с белками Так, например, как, в случае ожидаемого формирования тройного комплекса между модифицированными взаимодействием с CITREM легумином и мальтодекстринами (Табл 10) При этом наблюдалось возрастание величины кажущейся удельной энтальпии денатурации белка, AdH, по отношению к значению, характерному, как для комплекса белка с ПАВ, так и для нативного легумина (Рис 16а)

ДДИжг'К1)

(а)

Легумин Легумин Легумин + СИЯЕМ + + + +

СПТ!ЕМ ЭА-2 МР-6 МР-10

(б)

Легумин Легумин Легумин + С1ТЯЕМ

С|ТРЕМ вА2 КЮв МЮ-Ю

Рис 16 Влияние мальтодекстринов (0,5 вес/объем %) с различной молярной массой на термодинамические функции и параметры

термоденатурации комплекса легумина (0,5 вес/объем %) с СШШМ (В мг/л = 0,5ККМ) в водной среде (рН 7 2, ионная сила 0 05М, 298 К)

(а) (□) - кажущаяся удельная энтальпия термоденатурации белка, АН,!, и (•) - разность между кажущимися удельными теплоемкостями нативного и

термоденатурированного белка, ДСР,

(б) (□) - температура денатурации Та, и (•) -параметр кооперативности конформационного перехода, ЛТШ

При этом, в соответствии с ростом АД как правило, наблюдался и рост различия в кажущихся удельных теплоемкостях термоденатурированного и нативного легумина, ЛйСр, в тройных системах по отношению к величинам Д^Ср, найденным для комплекса белка с ПАВ и нативного легумина (Рис 16а) Это, очевидно, было связано с образованием в растворе до нагревания наночастиц тройного комплекса с более высокой удельной гидрофильностью поверхности Что хорошо согласуется с величинами вторых вириальных коэффициентов (Табл 10)

Наблюдаемые при этом только небольшие изменения температуры денатурации, Т^, при добавлении мальтодекстринов БА-2 и МИ-б, а также ее значительное падение в случае добавления наиболее низкомолекулярного из всех изученных мальтодекстринов (МД 10, ДЕ=10) (Рис 166), указывает на большое возрастание кажущейся удельной энтропии термоденатурации белка, Д^, в соответствии с уравнением Та = А На /А5Д что, в свою очередь, может быть отражением освобождения большого числа молекул из тройного комплекса легумин + ОТЕ-ЕМ + мальтодекстрин в результате разрушения при высокой температуре множественных водородных связей и гидрофобных контактов, сформировавшихся между всеми компонентами комплекса

В свою очередь, наблюдающийся рост величины ДТш может свидетельствовать о менее выраженной кажущейся кооперативное™ конформационного перехода для белка в тройном комплексе белок +ПАВ+ полисахарид (Рис 166), что, по-видимому, может быть связано с уменьшением протяженности зон контактов между компонентами в тройном комплексе

Глава 2. Взаимодействие биополимеров с ароматобразующими

соединениями.

Наряду с текстурой, одним из ключевых свойств, определяющих качество и привлекательность продуктов пищевой, парфюмерно-косметической и фармацевтической промышленности, является их аромат, который задается определенной композицией летучих ароматобразующих соединений При этом хорошо известно, что многие нелетучие компоненты таких продуктов, в частности биополимеры (белки и полисахариды), могут существенно повлиять на их аромат и привести к нежелательным его изменениям, или, даже полному подавлению Поэтому, изучение взаимодействий биополимеров с ароматобразующими соединениями представляло и представляет большой научный и практический интерес

Бинарные системы: биополимер — ароматобразующее соединение Роль структуры белка в связывании ароматобразующих соединений

Взаимосвязь между структурой белка и его связывающей способностью была изучена на примере взаимодействия гексилацетата (НхАс) (основного компонента многих привлекательных фруктовых ароматов) с легумином, находящимся в различных молекулярных состояниях в водной среде С использованием комбинации методов ультрафильтрации и газо-жидкостной хроматографии были определены изотермы связывания НхАс белком (Рис 17), положение и вид которых кардинально различались для нативного (рН 7 2), термоденатурированного (30 мин, 90 °С, рН 7 2) и кислотно-денатурированного (рН 3 0) легумина Так, для термоденатурированного легумина степень связывания с ним НхАс, V, (число молей ароматобразующего соединения, связанного с одним молем белка) более резко возрастала с ростом концентрации НхАс по сравнению с нативным легумином В то же время, для кислотно-денатурированного белка связывания НхАс с белком практически не наблюдалось Дополнительный анализ изотерм связывания с помощью графиков Скетчарда ] = пК - уК , где V - степень связывания, п - общее число

центров связывания на макромолекуле белка, К -характеристическая константа связывания, Ь - концентрация свободного лиганда) (Рис 176) и Хилла

(ЩЬ) = -( /„ )Ь[(У)-1] + \пК, где ан - параметр кооперативности Хилла) (Рис 17в) / ан / у

свидетельствовал о том, что при термоденатурации белка, т е при разворачивании его белковой глобулы, сопровождающейся формированием

растворимых в водной среде агрегатов белка, механизм связывания НхАс изменяется от связывания на идентичных и независимых местах в интерьере белковой глобулы к кооперативному связыванию на взаимодействующих местах связывания на термоагрегатах белка

(V/! 1-

свов» X 10 ^ (моль1) (б)

Рис. 17 (а) Изотермы связывания НхАс с легумином в водной среде (рН 7 2,1 = 0 05 М), (б) график Скетчарда, (в) график Хилла (О) нативный легумин, (А) термоденатурированный легумин, показано также влияние прогрева (30 мин, 90 °С) (•->■) на установившееся равновесие связывания НхАс с нативным легумином, (□) кислотно-денатурированный легумин

При этом, поскольку величина кооперативного параметра Хилла попадала в следующий диапазон 1< а.ц = 2 < 100, то характер кооперативного связывания не отвечал принципу «все или ничего» Кроме того, число мест связывания на белке возрастало на порядок, но их специфичность падала, т е константа связывания уменьшалась в несколько раз (Табл 11)

При этом хорошее совпадение экспериментальных и литературных данных по числу мест связывания в белковой глобуле для молекул НхАс позволило сделать предположение, что, связывание НхАс нативным легумином обусловлено наличием высокоспецифичных мест связывания в интерьере нативной белковой глобулы, в частности, в гидрофобной полости, тригональной призмы, сформированной шестью субъединицами легумина Тогда как, в случае термоденатурированного легумина это связывание могло быть обусловлено наличием большого числа гидрофобных мест связывания в термоагрегатах белка, преимущественно сформированных из развернутых и более гидрофобных основных полипептидных цепочек легумина

Кроме того, было установлено, что, во-первых, степень связывания НхАс термоденатурированным легумином не зависела от способа термообработки раствора белка, те до или после установления равновесия по связыванию

НхАс, и, во-вторых, если для нативного легумина связывание было полностью обратимым, для термоденатурированного белка - оно было необратимым

Таблица. 11. Параметры связывания алкил ацетатов легумином

Система Общее число мест связывания на белке, п Характеристическая константа связывания, К (моль"1) Свободная энергия связывания Гиббса, ДО (ккал моль"1)

НхАс

Нативная глобула Агрегаты термоденатурированного белка*' 13 100 1406 259 -4 22 -3 02

ВиАс

Нативная глобула 102 137 -2 86

Алкилацетаты из эквимолярной смеси (ВиАс + АтАс + НхАс) Нативная глобула

ВиАс АтАс НхАс 32 19 8 281 541 5000 -3 28 -3 бб -4 96

Общее число мест связывания на белке, характеристическая константа связывания и свободная энергия связывания для термоденатурированного легумина представляют собой усредненные значения, величин полученных из графиков Клотца и Хилла (показан на рис 17(в»

Роль структуры ароматобразующих соединений в связывании с белком

С помощью построения изотерм связывания в ряду алкилацетатов (бутилацетат (ВиАс), гексилацетат (НхАс), гептилацетат (НрАс) и октилацетат (ОсАс))(Рис 18) нам удалось установить роль алкильного радикала ароматобразующих соединений в связывании с нативной глобулой легумина Так, например, вопреки ожиданиям, наибольшая степень связывания с глобулярным белком была обнаружена для самого короткоцепочечного ароматобразующего соединения в изучаемом ряду, а именно, для ВиАс, тогда, как наименьшая - для ОсАс (Рис 18) Этот экспериментальный факт свидетельствовал, о том, что существующие в интерьере белковой глобулы места связывания оказываются наиболее доступными для короткоцепочечного алкил ацетата Т е, в интерьере белковой глобулы существуют определенные структурные ограничения, которые препятствуют эффективному связыванию длинноцепочечных алкил ацетатов Кроме того, графики Скетчарда указывали на то, что существует определенная критическая длина углеводородной цепочки алкил ацетатов, превышение которой вызывает изменение механизма связывания ароматобразующих соединений белком Т е связывание на идентичных и независимых местах связывания в белковой глобуле, обнаруженное для ВиАс и НхАс (Рис 186), сменяется кооперативным

связыванием на взаимозависимых местах связывания - для НрАс и ОсАс (Рис 18в)

Рис 18 (а) Изотермы связывания алкилацетатов с легумином в водной среде (рН 7 2,1 = О 05 М) (■) ВиАс (О) НхАс, (Л) НрАс, (♦) ОсАс (б) графики Скетчарда для (■) ВиАс и (О) НхАс, (в) графики Скетчарда для (Ж) НрАс, (О) ОсАс

Кроме того, расчет параметров связывания, выполненный из графиков Скетчарда для ВиАс и НхАс свидетельствовал о том, что с увеличением длины углеводородного радикала ароматобразующих соединений число мест связывания для них на белке уменьшается, в то время как значение характеристической константы связывания увеличивается (Табл 11), что указывает на предпочтительно гидрофобную природу связывания алкил ацетатов белком (При этом хочется отметить, что в случае НрАс и ОсАс, из-за их ограниченной растворимости в водной среде, не было возможности достичь более высоких концентраций этих алкилацетатов в эксперименте, что не позволило построить более полные графики Скетчарда и Хилла, и, следовательно, не позволило определить с помощью этих графиков параметры связывания НрАс и ОсАс с белком)

В то же время, поскольку, аромат, как правило, создается определенной выбранной композицией ароматобразующих соединений, было также важно установить особенности конкурентного связывания ароматобразующих соединений с белком из их смесей

Так, сопоставление изотерм и рассчитанных параметров связывания алкил ацетатов с белком индивидуально и из их эквимолярных смесей позволило установить следующие основные закономерности

(1) связывание ароматобразующих соединений из их смесей с белком происходит более специфично, т.е. с большим соответствием мест связывания на белке их индивидуальной структуре. Тогда как связывание ароматобразующих соединений индивидуально происходит случайным образом, а именно, на всех доступных местах связывания в белке На это, например, прямо указывает возрастание характеристических констант связывания и уменьшение числа мест связывания в интерьере белковой

глобулы для индивидуальных коротко-цепочечных алкилацетатов при их связывании из эквимолярной смеси (Табл 11)

(2) кооперативное связывание длинноцепочечных алкилацетатов (НрАс и ОсАс) приводило к изменению механизма связывания более короткоцепочечного алкилацетата (НхАс) из их эквимолярной смеси, а именно, от связывания на идентичных и независимых местах связывания также к кооперативному связыванию Так, как будто бы, присоединение длинноцепочечных алкилацетатов значительно модифицировало интерьер белковой глобулы в сторону повышения его общей гидрофобности

(3) одновременное кооперативное связывание длинноцепочечных алкил ацетатов (НрАс и ОсАс) из их эквимолярной смеси значительно повышало степень связывания каждого из них с белком. Так, при индивидуальном связывании НрАс и ОсАс белком степень связывания^, (одинаковая концентрация свободного лиганда (Ь = О 55мМ)) для них равнялась Оби О 4, соответственно, тогда как при их связывании из эквимолярной смеси она достигала на порядок больших значений, а именно, 6 0 и 5 9, соответственно По-видимому, в данном случае, такому повышению степени связывания алкилацетатов также способствовала дополнительная гидрофобизация интерьера белка при их присоединении

Выводы

1 С помощью проведенного термодинамического анализа удалось объяснить особенности вытеснительной флоккуляции в эмульсии масла в воде, стабилизированной, казеинатом натрия в присутствии определенных концентраций ионов Са2+ При этом, впервые были установлены прямые взаимосвязи между характерными изменениями, под действием ионов Са2+, надмолекулярной структуры белка (М„, Ка, Ян) и характера парных белок-белковых взаимодействий (АБ.Б), с одной стороны, с изменением, как осмотического давления в дисперсионной среде, так и свободной энергии вытеснительной флоккуляции в эмульсии, с другой

2 Изучение особенностей самоассоциации казеината натрия в водной среде также впервые позволило подойти к более глубокому пониманию молекулярных основ возникновения в узком температурном диапазоне, близком к температуре человеческого тела (35-45°С), термообратимой и термонеобратимой вязкоэластичности эмульсионных гелей, стабилизированных казеинатом натрия в определенной области рН в присутствии определенных концентраций ионов кальция

3 Для капель эмульсии, стабилизированных адсорбционными слоями а, 1-казеина и Р-казеина, впервые были установлены прямые взаимосвязи между интенсивностью сил притяжения в растворе белковых наночастиц друг к другу (знак и величина Аб.б) и величиной вероятности (Ф) объединения капель эмульсии в поле сил сдвига

4 На примере казеината натрия в присутствии сахарозы (10-78 вес/объем %) впервые была установлена определяющая роль самоорганизации белка, в частности его диссоциации/ассоциации, в формировании микроструктуры и реологических характеристик геля на его основе Установлено, что в основе обнаруженной диссоциации наночастиц казеината натрия при рН > ИЭТ белка лежит образование множественных водородных связей с молекулами сахарозы В то время как, в основе усиления ассоциации белка при рН < ИЭТ белка лежит конкуренция между белком и молекулами сахарозы за молекулы воды

5 Термодинамический анализ, проведенный для целого ряда структурно различающихся белков и полисахаридов, впервые позволил на количественном уровне выделить ключевые факторы, ответственные за усиление термодинамически неблагоприятных взаимодействий между биополимерами в их смешанных растворах Так, к ним могут быть отнесены следующие возрастание размера биополимерной молекулы, уменьшение степени доступности пространства, занятого одним биополимером, для другого, возрастание жесткости биополимерной молекулы, степень, с которой суммарный одноименный электрический заряд на биополимерах может быть вовлечен во взаимное кулоновское отталкивание, несущественная роль трансляционной энтропии противоинов в термодинамике взаимодействий между биополимерами Кроме того, сопоставление термодинамических параметров парных взаимодействий между всеми компонентами смешанных растворов биополимеров с положением критических точек и бинодалей позволило выделить ключевые факторы, определяющие концентрационные области термодинамической несовместимости для каждой из изученных пар биополимеров

6 В случае коллоидных систем (например, прямых эмульсий масла в воде), стабилизированных смесями белков и полисахаридов, впервые было установлено, что термодинамически неблагоприятные взаимодействия (А2з > 0) между биополимерами, повышающие их химические потенциалы (термодинамическую активность) в объеме водной фазы эмульсий приводят к следующим важным изменениям в структуре и стабильности последних

(1) значительному повышению поверхностной активности белка на плоской границе раздела фаз (неполярная фаза - вода),

(2) возрастанию величины адсорбции белка на каплях эмульсии,

(3) возрастанию вязкости сдвига в адсорбционном слое белка, г|поверхн, в результате возрастания его поверхностной концентрации,

(4) понижению размера капель в эмульсии, тек увеличению общей площади поверхности раздела фаз в эмульсии при умеренном увеличении термодинамической активности белка в объеме раствора,

(5) формированию больших по размеру капель эмульсии и их интенсивной флоккуляции по механизму «вытеснительной флоккуляции» при значительном возрастании термодинамической активности белка в объеме раствора Такая флоккуляция приводит к возрастанию вязкоэластичности концентрированных

эмульсий (40 об % масляной фазы) и быстрому кримингу в эмульсиях с низким содержанием масляной фазы (11 об % )

В свою очередь, нам впервые удалось установить, что термодинамически благоприятные взаимодействия между белками и полисахаридами (А2з < 0), понижающие их химические потенциалы (термодинамическую активность) в объеме водной фазы вызывали

(1) значительное понижение поверхностной активности белков в присутствии полисахаридов на плоской границе раздела фаз (неполярная фаза - вода),

(2) более значительное, по сравнению с термодинамически неблагоприятными взаимодействиями, возрастание вязкости сдвига в адсорбционном слое белка, за счет сил взаимного притяжения, действующих между биополимерами,

(3) интенсивную флоккуляцию капель в эмульсии по механизму «мостичной флоккуляции», которая приводит к возрастанию вязкоэластичности концентрированных эмульсий (40 об % масляной фазы) и быстрому кримингу в эмульсиях с низким содержанием масляной фазы (11 об %),

(4) и не оказывали влияния на величину адсорбции белка на каплях реальных эмульсий и их размер

7 Впервые установлены молекулярные механизмы модификации молекулярных параметров и структурной функциональности биополимеров (белков и полисахаридов) посредством их взаимодействий с низкими концентрациями ПАВ в водной среде При этом

(1) установлено определяющее влияние заряда и размера полярной части молекул ПАВ на характер их взаимодействий с одноименно заряженными белками,

(2) выявлена роль заряда и конформации белков во взаимодействии с одноименно заряженными ПАВ,

(3) установлено влияние молекулярного состояния ПАВ на изменение молекулярных параметров и структурной функциональности белков При этом полученные данные позволили выделить некоторые свойства мицелл ПАВ, оказывающие значительное влияние на характер их взаимодействия с белками К ним можно отнести, во-первых, термодинамическую стабильность мицелл ПАВ, выражаемую в терминах свободной энергии Гиббса мицеллообразования АС}МИц, которая, при низких абсолютных значениях, может способствовать участию гидрофобного ядра мицеллы во взаимодействии с белком Во-вторых, - гидрофильно-липофильный баланс свойств поверхности мицелл ПАВ, который отражает строение мицелл (прямые, обратные), а также их суммарный заряд И, в-третьих, их размер, который, очевидно, может определять вклад эффектов исключенного объема во взаимодействие между белками и мицеллами ПАВ

(4) предложены термодинамически обоснованные схемы молекулярных механизмов образования комплексов между одноименно заряженными ПАВ и белками в водной среде

8 Впервые установлено, что добавление основных компонентов (амилоза и амилопектин) и ферментативных производных (мальтодекстрины) крахмала

к смесям глобулярных белков (овальбумин, легумин) с ПАВ может существенно понизить поверхностную активность этих смешанных систем, практически «сводя к нулю» синергетическое взаимовлияние белков и ПАВ Впервые было показано, что в основе такого влияния полисахаридов лежат следующие процессы

(1) интенсивное взаимодействие изученных полисахаридов с ПАВ,

(2) изменение термодинамики взаимодействий модифицированных с помощью ПАВ белка и полисахарида,

(3) изменение конформационной стабильности, модифицированных при помощи взаимодействий с ПАВ, белков

9 Анализ изотерм связывания алкил ацетатов с глобулярным белком, легумином, впервые показал, что

(1) С7 является критической длиной углеводородной цепочки, превышение которой приводит к смене механизма связывания алкил ацетатов глобулярным белком (легумином) от связывания на независимых и идентичных местах связывания к кооперативному связыванию на взаимозависимых местах связывания,

(2) конкурентное связывание алкил ацетатов с различной длиной углеводородной цепочки (Сб-С8) из их эквимолярной смеси с глобулярным белком контролируется структурными ограничениями в интерьере белка и величинами их характеристических констант связывания При этом связывание алкилацетатов из их смеси происходит более специфично и может в сумме превышать общее число молекул алкилацетатов способных связаться с белком индивидуально Взаимовлияние алкилацетатов при их совместном связывании проявляется, во-первых, в изменении механизма связывания более короткоцепочечного алкилацетата (НхАс) в присутствии более длинноцепочечных (НрАс и ОсАс) и, во-вторых, в значительном увеличении степени связывания длинноцепочечных алкилацетатов (НрАс и ОсАс), так как-будто бы предпочтительное связывание более длинноцепочечных алкилацетатов сопровождается дополнительной гидрофобизацией интерьера белковой глобулы, способствующей их связыванию

Автор выражает глубокую благодарность всем сотрудникам лаборатории функциональных свойств биополимеров ИБХФ РАН А С Антиповой, Л Е Беляковой, ЮН Поликарпову, М С Анохиной, ММ Ильину, Т А Истаровой, Е Н Цапкиной, и сотрудникам лаборатории флейвохимии ИБХФ РАН |Р В Головне, ТА Мишариной, М Б Терениной, а также сотрудникам группы

пищевых коллоидов университета г Лидз (Англия) Е Dickinson и В Murray за их большой вклад в представленную работу и постоянное доброе участие и дружескую поддержку

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1 Semenova М G , Shwenke К D , Plashchina I G, Braudo Е Е Symplex formation in the system rapeseed globulin- k-carrageenan//Nahrung -1984 -28-P 895-898

2 Plashchma I G, Semenova M G, Braudo E E, Tolstoguzov V B Structural studies of the solutions of anionic polysaccharides IV Study of pectin solutions by light scattering//Carbohydrate Polymers - 1985 -5 -P 159-179

3 Plashchma IG , Semenova M G, Slovokhotov Yu L, Struchkov Yu T, Braudo E E , Tolstoguzov V B Studies of the interaction of methanol with pectin m aqueous solution//Carbohydrate Polymeis - 1986 - 6 -P 1-13

4 Semenova M G , Plashchma I G , Braudo E E , Tolstoguzov V B Structure formation in sodium k-karrageenan solution//Carbohydrate Polymers - 1988 - 9-P 133-145

5 Semenova M G, Bolotina V S , Grmberg V Ya , Tolstoguzov V B Thermodynamic incompatibility of the 1 IS fraction of soybean globulin and pectinate in aqueous medium//Food Hydrocolloids -1990 - 3(6) - P 447-456

6 Semenova M G, Bolotina V S , Dmitrochenko A P , Leontiev A L , Polyakov V I, Braudo E E , Tolstoguzov V B The factors affecting the compatibility of serum albumin and pectinate in aqueous medium//Carbohydrate Polymers -1991- 15-P 367-385

7 Semenova M G , Pavlovskaya G E, Tolstoguzov V B Light scattering and thermodynamic phase behavior of the system 1 IS globulin- k-carrageenan-water//Food Hydrocolloids - 1991 - 4(6) -P 469-479

8 Dickinson E, Semenova M G Emulsifying behavior of protein m the presence of polysaccharide under conditions of thermodynamic mcompatibihty//J Chemical Society, Faraday Transactions - 1992 - 88(6) - P 849-854

9 Dickinson E , Semenova M G Emulsifying properties of covalent protein-dextran hybnds//Colloids and Surfaces -1992-64-P 299-310

10 Tsapkina E N , Semenova M G , Pavlovskaya G E , Leontiev A L , Tolstoguzov V B The influence of incompatibility on the formation of adsorbing layers and dispersion of n-decane emulsion droplets m aqueous solution containing a mixture of 1 IS globulin from Vicia faba and Dextran//Food Hydrocolloids -1992 -6(3)-P 237-251

11 Pavlovskaya G E , Semenova M G, Tsapkina E N, Tolstoguzov V B The influence of dextran on the interfacial pressure of adsorbing layers of 1 IS globulin vicia faba at the planar n-decane/aqueous solution mterface//FoodHydrocolloids -1993 - 7-P 1-10

12 Antipova A S , Semenova M G Effect of sucrose on the thermodynamnc incompatibility of different biopolymers//Carbohydrate Polymers -1995 - 28 - P 359-365

13 Semenova M G Factors determining the character of biopolymer-biopolymer interactions m multicomponent aqueous solutions modeling food systems In Macromolecular Interactions m Food Technology, Parris N , Kato A , Creamer L K, Pearce J (Eds ) - Washington DC American Chemical Society - 1996 -P 37-49

14 Antipova A S , Semenova M G Effect of neutral carbohydrate structure m the set glucose / sucrose / maltodextnn / dextran on protien surface activity at the air/water interface//Food Hydrocolloids - 1997 -11(1)-P 71-77

15 Wasserman L A , Semenova M G Effect of decane or sodium decanoate on the thermodynamics of globular protein so!utions//Food Hydrocolloids - 1997 -11(3) - P 319-326

16 Antipova A S , Semenova M G, Gauthier-Jacques A Effect of neutral carbohydrate structure on protein surface activity at air-water and oil-water interfaces In Food Colloids Proteins, Lipids and Polysaccharides, Dickinson E and Bergenstahl B -Cambridge The Royal Society of Chemistry - 1997 - P 245-258

17 Wasserman L A , Semenova M G Effect of lipophilic molecules on food protein surface activity at the air-water interface In Food Colloids Proteins, Lipids and Polysaccharides, Dickinson E and Bergenstahl B -Cambridge The Royal Society of Chemistry - 1997 - P 77-91

18 Antipova AS, Semenova MG Influence of sucrose on the thermodynamic properties of the 1 IS globulin of Vicia faba-dextran-aqueous solvent system//Food Hydrocolloids - 1997 - 11 - P 415-421

19 Wasserman LA, Semenova MG, Tsapkina EN Thermodynamic properties of the 1 IS globulin of Vicia faba-ovalbumin-aqueous solvent system phase behaviour and light scattermg//Food Hydrocolloids -1997 - 11 - P 327-337

20 Semenova M G, Gauthier-Jaques A P Effect of amylose on ovalbumin surface activity at the air-water interface in the ternary system amyIose+ ovalbumin+sodium caprate//Food Hydrocolloids - 1997 - 11 - P 79-86

21 Braudo E E, Plashchma I G, Semenova M G, Tolstoguzov V B Structure formation m liquid solutions and gels of polysaccharides A review of the authors work//Food Hydrocolloids - 1998 - 12 - P 253-261

22 Dickinson E, Semenova M G, Antipova A S , Pelan E Effect of high-methoxy pectin on properties of casem-stabilized emulsions//Food Hydrocolloids -1998 -12-P 425 - 432

23 Dickinson E, Semenova M G , Antipova A S Salt stability of casein emulsions//Food Hydrocolloids -1998 - 12-P 227-235

24 Semenova M G, Savilova L B The role of biopolymer structure m interactions between unlike biopolymers m aqueous medium//Food Hydrocolloids - 1998 - 12-P 65-75

25 Semenova M G Pioteins as functional components in colloidal foods//Current Opinion m Colloid and Interface Science - 1998 - 3(6) - P 627-632

26 Semenova M G, Belyakova L E, Antipova A S , Jubanova M A Influence of maltodextrins with different dextrose equivalent on the thermodynamic properties of legumm in a bulk and at the air-water mterface//Colloids and Surfaces B Biomterfaces- 1999- 12-P 287-297

27 Belyakova L E , Semenova M G , Antipova A S Effect of small molecule surfactants on molecular parameters and thermodynamic properties of legumm m a bulk and at the air-water interface depending on a protein structure in an aqueous medium//Colloids and Suifaces B Biomterfaces - 1999 - 12-P 271-285

28 Antipova A S , Semenova M G and Belyakova L E Effect of sucrose on the thermodynamic properties of ovalbumin and sodium casemate in a bulk and at the air-water interface//Colloids and Surfaces B Biomterfaces -1999-12 - P 261 -270

29 Semenova M G , Antipova A S , Belyakova L E , Dickinson E, Brown R, Pelan E , Norton I Effect of pectinate on properties of oil-in-water emulsions stabilized by asi-casein and (3-casem, In Food Emulsions and Foams Interfaces, Interactions and Stability, Dickinson E and Rodriguez Patino J M (Eds) -Cambridge The Royal Society of Chemistry - 1999 - P 163-175

30 Semenova M G, Antipova A S , Belyakova L E, Polikarpov Yu N , Misharina T A , Terenma M B , Golovnya R V Influence of Maltodextrins with a Different Dextrose Equivalent on the Interaction between Hexyl Acetate and Legumm m an Aqueous Medium In Flavor release linking experiments, theory and reality, Roberts D and A Taylor (Eds) - Washington DC American Chemical Society -2000 - P 260 - 273

31 Semenova M G , Antipova A S , Misharina T A , Terenina M B , Golovnya R V Factors Determining Binding of Aroma Esters with Legumin in an Aqueous Medium In Flavor release linking experiments, theory and leality, Roberts D and A Taylor (Eds) - Washington DC Amencan Chemical Society -2000 - P 293 - 308

32 Braudo E E, Plashchina IG, Semenova M G , Yuryev V P Associations m biopolymer solutions// Ernahrungs Forschung -2000 -45(3)~P 175-177

33 Semenova M G , Antipova A S , Belyakova L E Role of interactions between biopolymers in formation and stabilization of food colloids//Ernahrungs Forschung - 2000 - 45(3)- P 180 -182

34 Semenova M G , Chen J , Dickinson E , Murray B S , Whittle M Sticking of protem-coated particles m shear field// Colloids and Surfaces, B Biomterfaces - 2001 -22 - P 237-244

35 Dickinson E , Semenova M G , Belyakova L E , Antipova A S , IP in M M , Tsapkma E N, Ritzouhs Ch Analysis of light scattering data on the calcium ion sensitivity of casemate solution thermodynamics relationship to emulsion flocculation//J Colloid and Interface Science -2001 -239-P 87-97

36 Antipova A S , Semenova M G, Belyakova LE, Il'm MM On relationships between molecular structure, interaction and surface behaviour in mixture small - molecule surfactant + protein//CoIloids and Surfaces, B Biomterfaces - 2001 - 21 - P 217-230

37 Mysocdova M S , Semenova M G, Belyakova L E , Antipova A S Surface activity at the planar interface in relation to the thermodynamics of intermoleculai interactions in the ternary system maltodextnn - small - molecule surfactant - legumin//Colloids and Surfaces, B Biomterfaces - 2001 - 21- P 179-189

38 Semenova M G , Myasoedova M S , Antipova A S Effect of starch components and derivatives on the surface behaviour of a mixture of protein and small-molecule surfactants In Food Colloids 2000 Fundamentals of Formulation, Dickinson E and Miller R (Eds) - Cambridge The Royal Society of Chemistry -2001-P 233 - 241

39 Antipova A S , Dickinson E , Murray B S , Semenova M G On the effect of calcium ions on the sticking behaviour of casem-coated particles in shear flow//Colloids and Surfaces B Biomterfaces - 2002 - 27 - P 123-131

40 Semenova M G , Antipova A S , Belyakova L E, Polikarpov Yu N, Wasserman L A, Misharina T A , Teiemna MB, Golovnya RV Binding of aroma compounds with legumin 111 Thermodynamics of competitive binding of aroma compounds with 1 IS globulin depending on the aroma compound's structure//FoodHydiocolloids - 2002 - 16 - P 573-584

41 Semenova M G , Antipova A S, Wasserman L A , Misharina T A, Golovnya R V Binding of aroma compounds with legumm II Effect of hexyl acetate on the thermodynamic properties of 11S globulin in an aqueous medium//Food Hydrocolloids - 2002- 16-P 565-571

42 Semenova M G, Antipova A S , Misharina T A , Golovnya R V Binding of an aroma compounds with legumm I Binding of hexyl acetate with 11S globulin m an aqueous medium depending on the protein structure//Food Hydrocolloids - 2002 - 16 - P 557 -564

43 Semenova M G, Antipova A S , Belyakova L E Food protein interactions in sugar solutions//Current Opinion in Colloid & Interface Science - 2002 - vol 7/5-6 - P 438-444

44 Семенова M Г Сбалансированные по составу пищевые системы молекулярные механизмы структурообразования // Симпозиум «Функциональное питание, пищевая безопасность и здоровье людей в условиях мегаполиса», Сборник докладов Москва - 2003 - С 40-44

45 Semenova М G , Belyakova L Е , Antipova A S , Polikarpov Yu N, Klouda L, Maikovic A, Il'in M M Effect of maltodextrms on the surface activity of small-molecule surfactants//Colloids and Surfaces В Biointerfaces - 2003 - P 47-54

46 Belyakova L E, Antipova A S, Semenova M G, Dickinson E, Merino L M, Tsapkma E N Effect of sucrose on molecular and interaction parameters of sodium casemate m aqueous solution relationship to protein gelation//Colloids and Surfaces В Biointerfaces - 2003 - P 31-46

47 Semenova M G , Il'in M M , Belyakova L E , Antipova A S Protein + small-molecule surfactant mixtures Thermodynamics of interactions and functionality In Food Colloids, Biopolymers and Materials, Dickinson E and van Vliet Ton (Eds ) - Cambridge The Royal Society of Chemistry - 2003 - P 377-387

48 Anokhma M S, Il'in M M, Semenova M G, Belyakova L E, Polikarpov Yu N Effect of maltodextrms on the surface activity of small-molecule surfactants and then mixtuies with legumm In Starch from polysaccharides to granules, simple and mixture gels,Yuryev V P , Tomasic P and Ruck H (Eds ) - 2004- v 1, part 4, ch 15 -P 217-229

49 Il'in M M , Semenova M G , Belyakova L E , Antipova A S , Polikarpov Yu N Thermodynamic and functional properties of legumm m the presence of small-molecule surfactants effect of temperature and pH//J Colloid and Interface Science- 2004 -278 (1)- P 1-80

50 Anokhma M S , Il'm M M, Semenova M G, Belyakova L E, Polikarpov Yu N Calonmetric Investigation of the Thermodynamic Basics of the Effect of Maltodextrms on the Surface Activity of Legumm ш the Presence of Small- Molecule Surfactants// Food Hydrocolloids - 2005 -19- P 455-466

51 Il'in M M, Anokhma M S , Semenova M G, Belyakova L E , Polikarpov Yu N Calonmetric Study of the Interactions between Small- Molecule Surfactants and Sodium Casemate with Reference to the Surface Activity of Their Binary Mixtures//Food Hydrocolloids - 2005 -19- P 441-453

52 Istarova T A, Semenova M G , Sorokoumova G M, Selishcheva A A, BelyakovaL E, Polikarpov Yu N Effect of pH on Casemate Interactions with Soy Phospholipids in Relation to Surface Activity of Their Mixtures//Food Hydrocolloids -2005 -19- P 429-440

53 Semenova M G , Belyakova L E , Dickinson E, Eliot-Laize С , Polikarpov Yu N Casemate interactions m solution and m emulsions effect of temperature, pH and Calcium ions In Food Colloids Interactions, Microstructure and Processing, Dickinson E (Ed) - Cambridge The Royal Society, 2005 - P 209-217

54 3 В И Лозинский, И А Сименел, М Г Семенова, Л Е Белякова, М М Ильин, В Я Гринберг, А С Дубовик, А Р Хохлов Свойства "белковоподобных" сополимеров N-винилкапролактама и N-винилимидазола в водных растворах//ВМС, серия А - 2006 - 48 (4) - С 435-443

55 Semenova MG, Belyakova LE, Polikaipov YuN, Il'in M M, Istarova ТА, Anokhma MS, Tsapkma E N Thermodynamic analysis of the impact of the surfactant-protem interactions on the molecular parameters and surface behaviour of food protems//Biomacromolecules -2006 - 7(l)-P 101-113

56 Semenova M G Thermodynamic analysis of the impact of molecular interactions on the functionality of food biopolymers m solution and in colloidal systems A review//Food Hydrocolloids -2007 -21(1), P 23-

45

Заказ № 103/08/07 Подписано в печать 29 OS 2007 Тираж 150 экз Уел пл 3,25

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 www cfr ru , e-mail info@cfr ru

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Основные материалы, используемые в работе.

Основные методы исследования, используемые в работе

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Часть I. Взаимодействия между биополимерами.

Глава 1. Роль самоассоциации биополимеров в формировании структуры многокомпонентных водных растворов и коллоидных систем.

1.1. Параметры, характеризующие самоассоциацию биополимеров в растворе

1.2. Определение параметров, характеризующих самоассоциацию биополимеров в растворе, методом лазерного светорассеяния

1.3. Взаимосвязь между самоассоциацией биополимеров и их структурообразующей способностью в растворах и коллоидных системах

1.3.1. Термодинамический анализ данных светорассеяния по влиянию ионов кальция на молекулярные и термодинамические параметры казеината натрия в водном растворе: взаимосвязь с флоккуляцией прямых эмульсий, типа масла в воде, стабилизированных белком.

1.3.2. Самоассоциация наночастиц казеината натрия в растворе и в прямых эмульсиях: влияние температуры, рН и содержания ионов кальция.

1.3.3. Термодинамический анализ факторов, контролирующих притяжение между каплями прямой эмульсии, покрытых белковыми адсорбционными слоями, в поле сил сдвига

1.3.4. Термодинамический анализ факторов, контролирующих самоассоциацию и функциональные свойства белков в присутствии низкомолекулярных Сахаров

Глава 2. Ключевые факторы, определяющие характер (природу и силу) взаимодействий между различающимися по природе биополимерами в водной среде

2.1. Количественная термодинамическая оценка характера (природы и силы) взаимодействий между различающимися по природе биополимерами по величине перекрёстного второго вириального коэффициента.

2.2. Влияние молекулярной структуры биополимеров на характер их взаимодействия в водной среде.

Глава 3. Роль характера парных взаимодействий между различающимися по природе биополимерами в формировании структуры многокомпонентных растворов и коллоидных систем.

3.1. Вклад слабых и обратимых физических взаимодействий между биополимерами в структурообразование растворов и коллоидных систем

3.1.1. Смешанные водные растворы.

3.1.2. Смешанные коллоидные системы.

3.1.2.1. Влияние нейтрального полисахарида декстрана на эмульгирующую способность глобулярных белков: легумина и бычьего сывороточного альбумина

3.1.2.2. Влияние характера взаимодействий между декстраном и легумином на поверхностную активность легумина на плоской границе раздела фаз масло-вода

3.1.2.3. Влияние фазового состояния и состава смешанного раствора термодинамически несовместимых декстрана и легумина на изотерму адсорбг{ии легумина на каплях эмульсии типа масла в воде

3.1.2.4. Влияние высокометоксилированного пектината на свойства эмульсий типа масла вводе, стабилизированных asi - казеином и fi-казеином.

3.2. Вклад формирования ковалентных коньюгатов между биополимерами в структурообразование коллоидных систем

Часть II. Взаимодействия биополимеров с низкомолекулярными амфифильными соединениями.

Глава 1. Модификация структурообразующей функции биополимеров посредством взаимодействия с низкомолекулярными поверхностно-активными соединениями (ПАВ)

1.1. Бинарные системы: биополимер - ПАВ.

1.1.1. Бинарные системы: белок - ПАВ.

1.1.1.1. Термодинамический анализ взаимосвязи между структурными особенностями белков и низкомолекулярных ПАВ и преимущественным характером их взаимодействия в водной среде (ниже ККМ).

1.1.1.2. Модификация молекулярных и термодинамических параметров белков в результате их взаимодействия с индивидуальными молекулами ПАВ в водной среде (ниже ККМ).

1.1.1.3. Модификация поверхностной активности белков на границе раздела фаз воздух-вода в результате их взаимодействия с индивидуальными молекулами ПАВ в водной среде (ниже ККМ).

1.1.1.4. Особенности, как взаимодействий белок-ПАВ, так и модификации молекулярных и термодинамических параметров белков в комплексе с ПАВ в области концентрации ПАВ выше их ККМ.

1.1.1.5. Модификация пенообразующей способности казеината натрия в результате его взаимодействия с мицеллами ПАВ в водной среде (выше ККМ).

1.1.2. Бинарные системы: полисахарид - ПАВ.

1.1.2.1. Термодинамический анализ взаимосвязи между структурными особенностями нейтральных полисахаридов и низкомолекулярных ПАВ и преимущественным характером их взаимодействия в водной среде (ниже ККМ).

1.1.2.2. Модификация молекулярных и термодинамических параметров полисахаридов в результате га взаимодействия с индивидуальными молекулами ПАВ в водной среде (ниже ККМ).

1.1.2.3. Модификация поверхностной активности полисахаридов и ПАВ на границе раздела фаз воздух-вода в результате их взаимодействия в водной среде (ниже ККМ).

1.2. Тройные системы: белок - полисахарид - ПАВ.

Глава 2. Взаимодействие биополимеров с ароматобразующими соединениями, как один из ключевых факторов в регулировании аромата биополимер - содержащих систем

2.1. Бинарные системы: биополимер - ароматобразующее соединение.

2.1.1. Роль структуры белка в связывании ароматобразующих соединений.

2.1.2. Влияние связывания гексил ацетата с легумином на молекулярные и термодинамические свойства белка в водной среде.

2.1.2.1. Влияние связывания НхАс с легумином на конформационную стабильность белка.

2.1.2.2. Влияние связывания НхАс с легумином на молекулярные и термодинамические параметры белка в водной среде.

2.1.3. Роль структуры ароматобразующих соединений в связывании с белком.

2.1.3.1. Роль длины углеводородного радикала в связывании алкилацетатов с глобулярным белком - легумином.

2.1.3.2. Особенности связывания с легумином метамерных сложных ароматобразующих эфиров, различающихся положением эфирной группы в углеводородной цепочке (С$) их молекул.

2.1.3.3. Роль структуры ароматобразующих сложных эфиров в их конкурентном связывании с легумином из их смесей

2.2. Тройные системы: биополимер] - биополимерг - ароматобразующее соединение

2.2.1. Связывание НхАс с мальтодекстринами. Сравнение со связыванием НхАс с легумином.

2.2.2. Влияние мальтодекстринов на связывание НхАс с легумином в их эквимассовом растворе: мальтодекстрин + легумин + вода.

2.2.2.1. Связывание НхАс с легумином в его эквимассовом смешанном растворе с мальтодекстрином SA-2.

2.2.2.2. Связывание НхАс с легумином в его эквимассовом смешанном растворе с мальтодекстрином SA-6.

2.2.3. Влияние образования ковалентных конъюгатов между легумином и мальтодекстринами на связывающую способность легумина по отношению к

2.2.3.1. Связывание НхАс с ковалентным коньюгатом легумина с мальтодекстрином SA

2.2.3.2. Связывание НхАс с ковалентным коньюгатом легумина с мальтодекстрином SA

ВЫВОДЫ.

Наиболее широко представленными в природе биополимерами являются белки и полисахариды, которые, благодаря большому разнообразию их молекулярных структур и свойств, выполняют множество важных и хорошо известных биологических функций, как в организме человека и животных, так и в растениях. При этом одной из ключевых функций белков и полисахаридов, вытекающих из их полимерной природы, является их структурообразующая функция. В её основе лежат ярко выраженные способности биополимеров к самоассоциации, конформационным изменениям, адсорбции на границах раздела фаз, а также к фазовому расслоению или, напротив, к комплексообразованию с отличающимися по своей молекулярной природе биополимерами и низкомолекулярными соединениями. Так, например, благодаря этой функции, биополимеры участвуют в построении клеточных мембран и структуры различных тканей и жидких сред в живых организмах и растениях, а также, способны гибко регулировать ионный, глюкозный или липидный обмен между клеткой и её окружением.

В настоящее время во всём мире отмечается растущий интерес к использованию структурообразующей функции биополимеров in vitro для создания продукции, обладающей усовершенствованной или уникальной структурой и свойствами, а также высокой физической стабильностью. Этот интерес, с одной стороны, подготовлен накопленными глубокими знаниями о молекулярных свойствах индивидуальных биополимеров, способах их очистки и выделения из природного сырья, а также успехами в их широкомасштабном производстве и длительном хранении. С другой стороны, он вызван возрастающей потребностью, в частности, пищевой, фармацевтической и косметической промышленности в разнообразных экологически чистых и высоко функциональных ингредиентах для разработки и выпуска, так называемой, «функциональной» продукции нового поколения, отличающейся ярко выраженным положительным воздействием на здоровье людей и, тем самым, на качество их жизни. Положительными особенностями биополимеров, как потенциальных базовых ингредиентов для таких продуктов, наряду с их высокой полифункциональностью, являются также их биосовместимость и нетоксичность. Кроме того, перспективность промышленного использования биополимеров, очевидно, определяется большим разнообразием их молекулярных структур и свойств, что открывает широкие возможности для молекулярного дизайна продукции нового поколения с уникальной структурой и свойствами.

Более того, растущий интерес к функциональности биополимеров вызван также новыми экологическими требованиями сегодняшнего дня к химической индустрии в целом, а именно к разработке и выпуску биодеградируемых материалов.

Однако, в то же время, как показала практика, для целенаправленного использования биополимеров в качестве функционально - активных ингредиентов, знание только их индивидуальных макромолекулярных свойств оказалось абсолютно недостаточным. Как правило, если основываться только на этих знаниях, то результат введения биополимеров в реально важные многокомпонентные системы, содержащие смеси различных по природе биополимеров и низкомолекулярных веществ (солей, липидов, низкомолекулярных Сахаров, ароматобразующих соединений, и т.д.), может оказаться даже противоположным ожидаемому.

Таким образом, к моменту начала нашей работы, было уже очевидно, что эффективное, целенаправленное и контролируемое использование биополимеров in vitro станет возможным только при ясном понимании роли межмолекулярных взаимодействий в их функциональности в многокомпонентных системах определённого состава.

При этом среди наиболее распространённых и востребованных многокомпонентных систем, особое место занимают системы коллоидного типа на основе водных растворов биополимеров, т.е. такие, которые наряду с водной фазой (дисперсионной средой) содержат также тонко диспергированную масляную или воздушную фазу. Особый интерес к таким коллоидным системам может объясняться тем, что, с одной стороны, они составляют основную массу разнообразной традиционной продукции пищевой, косметической и фармацевтической промышленности, а, с другой стороны, - являются наиболее перспективными с точки зрения инноваций, предоставляя большие возможности для разработки широкой гаммы продуктов нового поколения с легко варьируемым составом и структурой, что, в итоге, могло бы удовлетворить разнообразным и даже эксклюзивным запросам потребителей.

Таким образом, основным направлением нашей работы было выяснение роли межмолекулярных взаимодействий в структурообразующих способностях биополимеров в многокомпонентных водных растворах и коллоидных системах. При этом для достижения более глубокого понимания этой роли, мы проводили исследования в заданных экспериментальных условиях на модельных растворах и коллоидных системах, содержащих ограниченное число компонентов. Кроме того, используя термодинамический подход, мы пытались подойти к пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе формирования, стабилизации и разрушения структуры в таких системах, выявляя основные взаимосвязи в ряду: молекулярная структура ключевых компонентов - термодинамика межмолекулярных взаимодействий -функциональность ключевых компонентов - структура и стабильность модельных растворов и коллоидных систем.

ЦЕЛЬ И ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Цель работы состояла в термодинамическом анализе роли межмолекулярных взаимодействий в процессах формирования структуры и свойств, в объёме и на границе раздела фаз, в многокомпонентных растворах и коллоидных системах, содержащих в качестве основных компонентов такие биополимеры, как белки и полисахариды.

Для достижения поставленной цели были определены следующие конкретные задачи:

1. Установить основные взаимосвязи между надмолекулярной организацией белков и формированием структуры водных растворов и коллоидных систем на их основе.

2. Установить ключевые факторы, определяющие характер (природу и силу) взаимодействий различающихся по природе биополимеров в водной среде.

3. Установить основные взаимосвязи между характером взаимодействий различающихся по природе биополимеров и их способностью к формированию структуры и свойств в водных растворах и коллоидных системах на их основе.

4. Изучить роль взаимодействий биополимеров с низкомолекулярными поверхностно активными веществами (ПАВ) в модификации молекулярных параметров и структурообразующих функций биополимеров в объёме и на границе раздела фаз в водных растворах и коллоидных системах на их основе.

5. Изучить закономерности взаимодействий биополимеров с ароматобразующими соединениями.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Основные материалы, используемые в работе

Легумин (11S глобулин) - основной запасной белок бобовых, был выделен из семян кормовых бобов по методу, который был описан в работе [1]. Гомогенность выделенного легумина была оценена методом седиментации в фосфатном буфере при рН 8.0 и ионной силе 0.05 М. На седиментограмме был найден один пик легумина с коэффициентом седиментации 12S. asr казеин и J3- казеин - основные белковые фракции основного белка молока - казеина, были выделены в Hannah Research Institute (Ayr, Scotland) из свежего молока путём последовательного кислотного осаждения, промывки, переосаждения, растворения в мочевине с последующей ионообменной хроматографией и диализом. По данным высокоскоростной жидкостной хроматографии чистота выделенных белков составляла > 98 % по весу образца.

Лиофильно-высушенный образец казеината натрия (натриевая форма основного белка молока - казеина), (90.4 вес % сухого белка, 4.2 вес % золы, 5.1 вес % влажности, 0.09 вес % ионов кальция, 1.4 вес % ионов натрия, 0.01 вес % ионов калия) был поставлен DMV International (Veghel, Netherlands).

Бычий сывороточный альбумин (БСА) - основной белок крови, был поставлен Sigma Chemicals.

Овальбумин (ОВА) - основной белок яиц, был поставлен Sigma Chemicals

Фибриноген, белок крови, (высокой чистоты, Литва) был использован без дополнительной очистки.

Цитрусовый пектин со средней степенью этерификации (58%) был поставлен фирмой "Koch-Light, UK". Высокометоксилированный цитрусовый пектин (степень этерификации 75%; тип 104) был поставлен фирмой «Citrus Colloids Limited, UK». Перед исследованиями образцы пектина были переосаждены в подкисленном изопропаноле по методике, описанной в работе [2]. Водные растворы переосаждённых пектинов были отдиализованы против бидистиллированной воды и затем лиофильно высушены.

Декстраны (Т 40 и 500) были поставлены Sigma Chemicals, а декстраны (Т 250 и 2000) - Pharmacia Chemicals и были использованы без дополнительной очистки.

Альгинаты натрия, выделенные из бурых водорослей (высокой чистоты, Россия), перед исследованиями, были переосаждены в подкисленном изопропаноле по методике, описанной в работе [2]. Водные растворы переосаждённых альгинатов были отдиализованы против бидистиллированной воды и затем лиофильно высушены

Карбоксиметилцеллюлоза (высокой чистоты, Россия) была использована без дополнительной очистки.

Амилоза и амилопектин, выделенные из картофельного крахмала были поставлены Sigma Chemicals и использованы без дополнительной очистки.

Мальтодекстрины (Paselli SA-2, MD-6, MD-10, фирмы Avebe) были использованы без дополнительной очистки.

Низкомолекулярные поверхностно активные вещества (ПАВ) (использовались так, как были поставлены фирмами изготовителями без дополнительной очистки): деканоат натрия был поставлен фирмой Sigma Chemicals; CITREM, SSL, PGE(80) были поставлены фирмой Danisco Cultor, Denmark. Соевый фосфолипид "Lipoid S-21" был поставлен фирмой Lipoid GmbH Company, Germany.

Сахароза (> 99.5%) была поставлена компанией Реахим, Россия (для экспериментов по светорассеянию) и British Sugar pic (для реологических измерений и микроскопии).

Глюконо-8 -лактон (> 99% чистоты) был поставлен фирмой Sigma Chemicals.

Ароматобразующие эфиры: алкилацетаты: бутилацетат (ВиАс), амилацетат (AmАс), гексилацетат (НхАс), гептилацетат (НрАс), октилацетат (ОсАс), бутилбутират (BuBu), этилгексоат (EtGex) и гептилформиат (HpForm) и метиловые эфиры карбоновых кислот: пентановой кислоты (МЕРА), гексановой кислоты (МЕНА), октановой кислоты, (МЕОА), нонановой кислоты (MENA) были поставлены компанией Реахим, Россия (95% чистоты) и были очищены перегонкой до 99% чистоты.

Органические растворители, используемые в экспериментах, а именно, ацетон, этанол, диэтиловый эфир, бензол, толуол, н-тетрадекан, декан были поставлены компанией Реахим, Россия (> 99% чистоты) и были использованы без дополнительной очистки.

Цетил бромид (99% 1-бромгексадекан) был поставлен фирмой Sigma Chemicals.

Соли, шёлочи и кислоты высокой степени чистоты (> 99% чистоты), были использованы для приготовления буферов.

Все водные растворы были приготовлены с использованием бидистиллированной воды.

Подсолнечное масло для приготовления эмульсий типа масло в воде было очищено от свободных жирных кислот и холестерина, пропусканием через колонку, заполненную флорисилом (Sigma Chemicals) по методике, описанной в работе [3] (для очистки 50г масла необходимо 4 г флорисила).

Основные методы исследования, используемые в работе Приготовление растворов биополимеров.

Растворы биополимеров с необходимой концентрацией готовили, используя определённые буферы (фосфатные, ацетатные, Tris-HCL), при комнатной температуре (20 - 22 °С). Для удаления небольшой доли нерастворимого остатка (как правило, около 3 вес%) в растворяемых образцах биополимеров - проводили центрифугирование их растворов (4000 об/мин, 30 мин, 20 °С). Концентрацию биополимеров в растворе, как правило, определяли, рефрактометрическим методом, используя рефрактометр Shimadzu (Япония), и заранее определённые инкременты преломления биополимеров в соответствующем буфере. Кроме этого, концентрацию белков в растворе определяли методом Биурета [4], а концентрацию полисахаридов - фенол -сернокислотным методом [5], используя для этого спектрофотометр Beckman DU-70 (USA) и построенные калибровочные кривые.

Приготовление растворимых агрегатов термоденатурированного легумина.

Раствор нативного легумина (1 вес%) готовили в фосфатном буфере (рН 7.2, ионная сила 0.05М), как описано выше. Определённые аликвоты (25 мл) раствора белка помещали в стеклянные ампулы, которые запаивали. Затем эти ампулы прогревали при 90°С в течение 30 мин. на водяной бане, после этого их охлаждали до комнатной температуры (22 ± 2 °С) и выдерживали в течение 20 часов для установления равновесия. Уровень термоденатурации белка в растворе был охарактеризован дифференциальной сканирующей калориметрией (ДСК) при помощи микрокалориметра ДАСМ-4М (Пущино, Россия). При этом на термограмме не было зафиксировано никаких изменений теплоёмкости белка при сканировании по температуре, что свидетельствовало о значительной степени денатурации белковой глобулы.

Приготовление растворов амилозы и амилопектина.

Лиофильно - высушенные образцы амилозы и амилопектина растворяли сначала в 2 объёмах растворителя (рН 7.0, 0.04М NaCl + 0.01М фосфатного буфера), затем через 1 мин к полученным растворам добавляли 1 объём 2N NaOH и перемешивали полученные растворы в течение 5 мин. Затем рН растворов доводили до нейтрального значения, добавляя 2 объёма HCI. После этого растворы прогревали при 85 °С в течение 1 часа для того, чтобы добиться полного растворения амилозы и амилопектина. Затем растворы полисахаридов охлаждали до 30 °С и центрифугировали при этой температуре, при 4000 g в течение 20 мин., с целью отделения нерастворившейся части полисахаридов. Приготовленные таким образом, растворы полисахаридов хранились не дольше четырёх дней при температуре 40 °С, что предотвращало протекание в них процессов ретроградации [6]. По данным лазерного светорассеяния, изменения молекулярных параметров полисахаридов за время хранения их растворов с концентрацией от 0.5 до 1.0 вес/объём %, в таких условиях, не наблюдалось.

Приготовление растворов мальтодекстринов.

Мальтодекстрины растворяли в фосфатном буфере (рН 7.2, ионная сила о

0.05 М) при механическом перемешивании при 85 С в течение 1 часа. После этого растворы охлаждали до комнатной температуры (22 ± 2 °С) хранили не дольше трёх дней. На основании данных лазерного светорассеяния никаких изменений молекулярных параметров мальтодекстринов в растворах с концентрацией от 0.5 до 1.0 вес/объём % за время хранения, в таких условиях, не наблюдалось.

Добавление ионов кальция в раствор казеината натрия.

Ионы кальция в раствор белка вводили методом равновесного диализа, чтобы избежать случайного осаждения казеината натрия. При этом использовали диализные трубки, проницаемые только для низкомолекулярных веществ: Visking dialysis membrane 36/32, Chemie Brunschwig. Объёмы во внутреннем и внешнем сосудах соотносились между собой, как 1: 10. Диализ проводили в течение 48 часов при 6 °С со сменой растворителя через 24 часа.

Приготовление растворов низкомолекулярных поверхностно активных веществ (ПАВ) и их смешанных растворов с белками и полисахаридами.

Базовые растворы низкомолекулярных ПАВ (CITREM, SSL, PGE(80)) с концентрацией от 100 до 1000 мг/л и фосфолипидов с концентрацией 100 мг/л были приготовлены в определённых буферах, при помощи их обработки ультразвуком при частоте 4.5 кГц с одновременным их нагреванием (65 °С) и встряхиванием на водяной бане в течение 1 часа (CPLAN водный шейкер, тип 357, Poland). В результате такой обработки получали тонике дисперсии ПАВ в водной среде, которые хранили при комнатной температуре. Такие базовые растворы ПАВ были использованы для приготовления, как серий растворов ПАВ с более низкой концентрацией, так и смешанных растворов ПАВ+ биополимер. При этом смешанные растворы (ПАВ + биополимер) дополнительно встряхивали при 40 °С в течение 1 часа (CPLAN водный шейкер, тип 357, Poland), затем охлаждали их до комнатной температуры и использовали в различных измерениях. В результате такой обработки все изученные биополимеры сохраняли свою растворимость в водной среде. Смешанные растворы биополимеров с ПАВ, которые использовались для приготовления серий растворов с различными концентрациями биополимеров и ПАВ, всегда были свежеприготовленными. Серии приготовленных растворов хранились не больше двух дней. По данным светорассеяния за это время не происходило никаких изменений в молекулярных параметрах комплексов, образующихся между биополимерами и ПАВ.

Построение фазовой диаграммы для смешанных растворов биополимеров.

При построении фазовой диаграммы, в первую очередь, для ускорения фазового расслоения в смешанных растворах термодинамически несовместимых биополимеров, использовали центрифугирование этих растворов при 25000g в течение 1,5 часов. Неизменность объёмов сосуществующих в смешанных растворах фаз, в результате их повторного центрифугирования, свидетельствовало о достижении фазового равновесия в изучаемой системе. В случае белок - полисахаридных смешанных растворов содержание полисахарида в сосуществующих фазах определяли фенол - сернокислотным методом [5], тогда, как содержание белка - методом Биурета [4]. В случае белок - белковых смешанных растворов бинодали строили методом измерения объёмов сосуществующих фаз [7]. Дополнительно проводили оценку концентрации белков в сосуществующих фазах, используя метод седиментации в ультрацентрифуге и измерения площади под белковыми пиками на седиментограммах.

Определённые концентрации биополимеров в сосуществующих фазах позволяли построить бинодаль. Координаты критической точки на бинодали определяли экстраполяцией прямолинейного диаметра, т.е. линии, проходящей через середины соединительных линий бинодали, до пересечения с бинодалью.

Калориметрия смешения.

Калориметрические измерения были проведены на калориметре смешения LKB 2277 (Sweden). Подача растворов реагирующих веществ в калориметр осуществлялась по двум каналам с помощью перистальтического насоса со скоростью, равной 4 х 10"6 (л/сек), по каждому из каналов. Это означает, что растворы в измерительной ячейке во всех случаях были разбавлены в два раза. Таким образом, все концентрации смешиваемых компонентов указанные, как в тексте, так и представленные на рисунках, отвечают их концентрациям в измерительной ячейке. Перед подачей растворов реагентов в калориметр они были термостатированы во внешнем термостате при температуре измерения. Каждый раз перед измерением проводилась электрическая калибровка калориметра при температуре измерения. Чувствительность калориметрических измерений составляла 3 х 10"6 Дж/сек.

Как правило, измеряли тепловые эффекты следующих процессов: (1) разбавления растворов каждого из реагентов чистым буфером Qpeai-ент - буфеР; (2) смешения растворов реагентов Qj> Все эти тепловые эффекты Q измерялись в единицах тепловой мощности (Дж/сек).

Удельную энтальпию взаимодействия между парой реагентов определяли по следующему уравнению:

АН реагент1 - реагент2 " (Q 2 " 0реагснт1-буфер " Q реагент2- буфер)/ АП (1) где An - количество граммов одного из выбранных реагентов в секунду (г/сек).

Абсолютная ошибка измерений составляла не более ± 10 %.

Дифференциальная сканирующая калориметрия.

Калориметрические измерения проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (Пущино, Россия) в диапазоне температур от 20 до 110 °С, при скорости сканирования 2 °С мин"1 и избыточном давлении 2.5 атм. Концентрация белка в измерительной ячейке составляла 0.005 г/мл. Точность измерений составляла 10% от значений теплоёмкости. Чувствительность калориметрических измерений составляла 5 х 10"6 Дж/сек. Термодинамические параметры термоденатурации белка рассчитывали из полученных термограмм, как это было предложено в работе [8]. Значения термодинамических параметров термоденату рации белка, приведённые в тексте представляют собой усреднённые данные, как минимум двух повторений каждого измерения.

Оценка молекулярных и термодинамических параметров биополимеров в объёме водной среды методом многоуглового лазерного светорассеяния.

Средневесовую молярную массу, Mw, радиус инерции, Rq, и второй вириальный коэффициент, Л2, биополимеров и их комплексов определяли методом многоуглового статического светорассеяния в разбавленных растворах. Серию растворов (как правило, 7-8 концентраций) с различной концентрацией готовили, разбавляя растворы биополимеров чистым буфером.

Необходимо отметить, что в случае комплексов биополимеров с ПАВ или ароматобразующими соединениями такое разбавление поддерживает постоянным молярное отношение между составляющими компонентами комплексов, что, как известно, является одним из важнейших факторов, оказывающих влияние на равновесие реакции комплексообразования.

Отношение Рэлея Rq было измерено, используя вертикальнополяризованный свет (633 нм) в диапазоне углов 40° < 6 < 140° (13 углов), на приборе VA Instruments Co Ltd LS-01 аппарате с He-Ne лазером (633 нм, мощность лазера составляла 15 мватт) (Россия) откалиброванного по обеспыленному бензолу (R90 = 11.84 х 1(Н> см~1). Растворы обеспыливали фильтрованием через мембранные фильтры (Millipore), с подобранным для каждого изучаемого полимерного образца размером пор (от 0.22 до 0.8 мкм), прямо в измерительную кювету. Подбор размера пор фильтра проводили, определяя концентрацию изучаемого полимерного образца до и после фильтрования.

Экспериментально измеренные значения ARQ были использованы для расчёта и построения угловых и концентрационных зависимостей ЯС/Ме, как правило, по методу Зимма [9] или методу Берри [10]. Здесь, С - концентрация полимера (г/мл), ДЯ0 - избыточное светорассеяние раствора полимера по отношению к светорассеянию растворителем под углом 0, Я - оптическая константа

2 2 2 4 системы, равная 4л п v /NA\ , где NA - число Авогадро, Я - длина волны падающего света в вакууме , п - показатель преломления растворителя, и v = dn/dc инкремент показателя преломления полимера. Значение средневесовой молярной массы, Мт оценивалось из средней величины интерсептов концентрационной ЯС/М0 при 0 0 (экстраполяция проводилась по 13 углам) и угловой ЯС/М0 при С 0 (экстраполяция проводилась по 7-8 концентрациям) зависимостей. Значения второго вириального коэффициента, Аг, рассчитывали из тангенса угла наклона концентрационной зависимости ЯС/М0 при 0 0. Значение радиуса инерции, RG, находили из тангенса угла наклона угловой зависимости ЯС/М0 при С 0.

Уровень полидисперсности исследуемых полимерных образцов оценивали по графику Холтцера, проводя построение величины ^(М©/ЯС)с=о от величины q<RG> г'1 (где, Rq - радиус инерции и q = (4лА) sin (0/2) - волновой вектор)

11]. При этом полученные данные свидетельствовали, что полидисперсность всех изученных биополимеров не превышала 2.

Значения Mw, А2 и RG , представленные в данной работе представляют собой усреднённые данные, как минимум двух повторений каждого измерения. Экспериментальная ошибка в определении Mw и А2, как правило, не превышала 10%. Ошибка в определении RG составляла 5%.

Значения инкрементов показателей преломления, v, оценивали при 436 или 635 нм, при необходимой температуре, используя дифференциальный рефрактометр Shimadzu (Japan). Экспериментальная ошибка в определении v не превышала 10%. Конкретные значения v биополимеров в различных экспериментальных условиях представлены в соответствующих статьях, описывающих данные статического светорассеяния, ссылки на которые приведены в тексте данной диссертационной работы.

Значения гидродинамического радиуса, Rh, биополимеров и их комплексов определяли методом динамического светорассеяния [10, 12]. Временная корреляционная функция интенсивности светорассеяния была измерена при 90°, при помощи прибора лазерного светорассеяния VA Instruments Со Ltd LS-01 (Санкт Петербург, Россия) (вертикально-поляризованный свет с длиной волны Х= 633 нм). Значения гидродинамического радиуса, Rh, представленные в этой работе являются результатом усреднения, как минимум, десяти повторных измерений временной корреляционной функции интенсивности светорассеяния для каждого эксперимента. Ошибка в определении Rh не превышала 10 %. Для определения Rh из временной корреляционной функции интенсивности светорассеяния использовали специальную компьютерную программу (DYNALS Release 1.5, все права принадлежат А. Голдингу и Н. Сидоренко, VA Instruments Со Ltd (Санкт Петербург, Россия)).

Измерения характеристической вязкости.

Измерение характеристической вязкости, [г|], изучаемых биополимеров и их комплексов проводили в их разбавленных водных растворах при 20 ±0.1 °С, используя капиллярный вискозиметр Убеллоде (как правило, с диаметром капилляра « 0.4 мм). Серию растворов с различной концентрацией (5-6 концентраций) готовили, разбавляя растворы биополимеров чистым буфером. Значения характеристической вязкости, [г|], были рассчитаны из интерсепта концентрационной зависимости приведённой вязкости г)уд/с при с —> 0, по уравнению Хагтинса [13-15]: = [фяЫс (2) с где г)уд- удельная вязкость, которая определяется, как г|уд= (r|r -1), где, г|г -относительная вязкость биополимеров в растворе, г|г = —, rj - вязкость раствора полимера и r|s- вязкость чистого буферного раствора, Л] - константа Хаггинса.

Потенциометрическое титрование и измерение электрофоретической подвижности.

Суммарный заряд биополимеров оценивали, как потенциометрическим титрованием их растворов, так и определением (^-потенциала при измерении их электрофоретической подвижности.

В методе потенциометрического титрования [13] использовали изоионный раствор биополимера, который готовили, применяя метод равновесного диализа. При этом раствор биополимера диализовали против чистого буфера, в который было добавлено необходимое количество NaCl, для создания требуемой в эксперименте величины ионной силы. Для проведения равновесного диализа использовали диализные трубки, проницаемые только для низкомолекулярных веществ: Visking dialysis membrane 36/32, Chemie Brunschwig. Объёмы во внутреннем и внешнем сосудах соотносились между собой, как 1: 10. Диализ проводили в течение 48 часов при 6 °С со сменой растворителя через 24 часа. По завершении равновесного диализа рН раствора биополимера соответствовал рН изоионного раствора биополимера.

Измерения рН повторяли после добавления определённого объёма НС1 (0.1 М) к изоионному раствору биополимера. В параллельном эксперименте к изоионному раствору биополимера добавляли определённый объём 0.1 М NaOH. Кроме этого, проводили параллельное титрование растворами 0.1 М НС1 и 0.1М NaOH раствора сравнения, представляющего собой раствор NaCl в бидистиллированной воде, с требующейся, в эксперименте, концентрацией.

Общее число протонов, присоединённых к биополимеру или отданных биополимером в процессе титрования кислотой или щёлочью, определяли из сравнения значений рН раствора биополимера и раствора сравнения при добавлении к ним одинакового количества кислоты или щёлочи.

В случае белков, общее число протонов, присоединённых или отданных белком относительно его изоэлектрической точки, принимали за кажущийся суммарный отрицательный заряд белка.

Температуру в курсе титрования поддерживали всегда равной 20 °С.

Электрофоретическую подвижность биополимеров в водной среде, а также капель эмульсий, покрытых адсорбционными слоями биополимеров, измеряли с помощью Malvern Zetasizer 4 (Malvern, United Kingdom). Перед измерениями, эмульсии, стабилизированные биополимерами, разбавляли чистым буфером в соотношении 1:10. Измерения проводили в капиллярных кварцевых кюветах в стационарном слое, т.е. в слое, где электроосмотические эффекты были равны нулю. Перед каждой серией измерений проводили калибровку прибора по стандартной дисперсии латексных частиц. Экспериментальная ошибка в определении С, - потенциала не превышала 5 мВ.

Определение поверхностного натяжения, у, на плоской границе раздела фаз воздух-вода или масло-вода.

Значения поверхностного натяжения, y биополимеров, низкомолекулярных поверхностно активных веществ (ПАВ) и их комплексов на плоской границе раздела фаз (неполярная фаза-вода) определяли, используя метод Вильгельми [16] при помощи тензиометра Kruss (Hamburg, Germany). Для измерений у использовали платиновую пластинку. При этом величина поверхностного натяжения, у, измерялась с точностью ± 1 мН/м. Все измерения проводились в термостатируемой ячейке при 25 ± 0.5 °С.

Реологические измерения в межфазных адсорбционных слоях биополимеров.

Вязкость сдвига в межфазных адсорбционных слоях биополимеров определяли при помощи реометра, описанного в работе [17]. Кажущаяся вязкость сдвига в адсорбционном слое биополимера периодично измерялась в течение 24 часов, при 25°С. Скорость вращения пластинки в момент измерения была равна 1.309 х 10"3 рад/сек.

Приготовление и характеристика эмульсий типа масла в воде.

Эмульсии типа масла в воде (с различным процентным содержанием масла), стабилизированные биополимерами, готовились при комнатной температуре, используя лабораторный гомогенизатор высокого давления (при давлении 300 бар). Распределение капель эмульсии по размерам оценивали при помощи прибора: Mastersizer S2.01. (Malvern, United Kingdom) и характеризовали

3 2 величиной средних диаметров капель эмульсии: d32 = Zifthdk /%кп\Ак и ^43 ~ 5 где щ - это число капель с диаметром d^

Определение величины адсорбции биополимеров на каплях эмульсии типа масла в воде.

Определение величины адсорбции биополимеров на каплях эмульсии проводили следующим образом:

1. В одной части исследуемой эмульсии определяли распределение капель эмульсии по размеру, используя прибор: Mastersizer S2.01 (Malvern, United Kingdom). Затем, по известным средним размерам капель в эмульсии и общему количеству масляной фазы в эмульсии, рассчитывали общую площадь поверхности раздела фаз масла - вода в эмульсии;

2. Во второй части эмульсии - проводили разделение дисперсионной, водной, среды эмульсии и дисперсной, масляной, фазы. Для этого, эта часть эмульсии была отцентрифугирована в центрифужных пробирках со специальными вкладышами (для лёгкого удаления сконденсировавшейся в результате центрифугирования масляной фазы) при 15000 об/мин и 4°С в течение 1 часа;

3. В дисперсионной среде, отделённой центрифугированием, - определяли концентрацию неадсорбировавшегося биополимера. Затем по известной общей концентрации биополимера в системе - рассчитывали его адсорбировавшееся количество.

4. По определённым таким образом значениям общей поверхности раздела фаз в эмульсии, а также общему количеству биополимера, адсорбировавшегося на границе раздела фаз масло-вода - рассчитывали величину адсорбции биополимера, Г, т.е. количества биополимера, приходящегося на единицу площади раздела фаз: где, Г(мг/м2) - величина адсорбции; Р(мг) - общая масса биополимера в 100 мл эмульсии масла в воде; I - доля биополимера, адсорбировавшаяся на границе раздела фаз; SSA (м /мл) - удельная площадь поверхности раздела фаз в эмульсии, определённая при помощи прибора: Mastersizer S2.01. (Malvern, United Kingdom); F (мл) - объём масляной фазы в 100 мл эмульсии.

Определение скорости криминга в эмульсии типа масла в воде.

За процессом криминга в прямой эмульсии, типа масла в воде, следили, определяя высоту, либо сливкообразного верхнего слоя, либо сывороточного нижнего слоя, отделяющегося в эмульсии при её хранении в течение определённого времени.

При этом образцы эмульсий, как правило, хранились при 20 ± 2°С в стеклянных пробирках, диаметром 10 мм, и высотой образцов эмульсий - 40 мм.

Изучение взаимодействия между коллоидными частицами в поле сил сдвига.

Для изучения взаимодействия между каплями эмульсии в поле сил сдвига использовали специально сконструированный аппарат, подробное описание которого дано в работах [18-20]. При этом, в качестве «масляной» фазы в эмульсиях использовали цетил бромид, так как его плотность практически совпадала с плотностью водной фазы, что исключало дополнительное движение коллоидных частиц, вызванное действием гравитационных сил. В случае латексных частиц для этих же целей использовали дейтерированную воду.

Прибор состоял из стационарной (верхней) и, движущейся с определённой скоростью, (нижней) стеклянных пластин [18-20]. Сначала, коллоидные частицы фиксировали на стационарной верхней пластине, помещая на неё небольшое количество (-0.5 мл) эмульсии и оставляя её на 12- 15 часов. Затем осторожно ополаскивали пластину бидистиллированной водой, при этом, на ней оставалось достаточное для измерения количество коллоидных частиц, необратимо прикреплённых к пластине. Ламинарное движение капель эмульсии создавали параллельным движением нижней пластины, расположенной на близком расстоянии (~ 200 мкм) по отношению к фиксированной верхней пластине. Перед началом движения мобильные коллоидные частицы приближали к фиксированным частицам на расстояние, не превышающее диаметру коллоидных частиц (~ 5 мкм) по линии, параллельной пластинам и соединяющей центры коллоидных частиц. Движение мобильных частиц в потоке вызывалось перемещением нижней пластины с определённой скоростью, что приводило к их вынужденному столкновению. Определённое количество таких столкновений приводило к видимому слипанию движущейся и фиксированной коллоидных частиц, что позволяло рассчитать величину вероятности формирования дуплета коллоидных частиц в поле сил сдвига, Ф. Считалось, что дуплеты частиц были сформированы, если они не разрушались в поле действия сил сдвига в течение 30 - 40 секунд с момента их столкновения. Кроме того, в процессе эксперимента проводили качественную характеристику сил сцепления коллоидных частиц в дуплете, варьируя, как скорость сдвига движущейся пластины от минимальной до максимально возможной, так и направление движения. При прочном соединении коллоидных частиц в дуплете не наблюдалось их движения друг относительно друга, даже в случае приложения к ним наибольшей скорости сдвига или изменения её направления. При слабом соединении коллоидных частиц в дуплете, при увеличении скорости сдвига в системе, ранее свободная мобильная частица начинала двигаться вокруг фиксированной коллоидной частицы. При наиболее слабом притяжении между коллоидными частицами они также двигались по траектории вокруг фиксированной коллоидной частицы даже при нулевой скорости сдвига, т.е. только в результате Броуновского движения. За исключением случаев формирования очень прочных дуплетов коллоидных частиц, т.е., когда величина вероятности формирования дуплета коллоидных частиц в поле сил сдвига, Ф, превышала 80%, столкновение фиксированной и движущейся коллоидных частиц повторяли не менее 60 раз. В этом случае, повторные серии экспериментов позволили оценить экспериментальную ошибку в определении Ф, которая составляла 4%.

Реологические измерения в объёме эмульсий.

Реологические измерения, а именно измерения в стационарном режиме, т. е. при установившемся течении, а также в динамическом режиме, т. е. когда напряжение и деформация в образце изменялись по волновому закону, проводили при помощи Bohlin CS - 50 реометра (United Kingdom). При этом исследуемый образец помещался в зазор между двумя коаксиальными цилиндрами (диаметр внутреннего цилиндра - 14 мм, диаметр внешнего цилиндра - 15.4 мм, объём образца - 2мл). На поверхность образца наливали тонкий слой силиконового масла, для того, чтобы предотвратить высыхание исследуемого образца за время измерения. Реологические измерения в стационарном режиме проводили в диапазоне изменяющегося напряжения сдвига от 0.02 до 10 Па. Динамический режим реологических измерений использовали для определения модуля эластичности (модуля сохранения) G', модуля текучести (модуля потерь) G" и комплексного модуля G* =( G' + G"2)1/2 при варьировании частоты от 10'3 Гц до 10 Гц. Все измерения проводили в диапазоне линейной вязкоэластичности.

Характеристика микроструктуры гелей биополимеров.

Leica TCS (Germany) конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, оснащённый 100 х 1.3 масляно-иммерсионным объективом, был использован в режиме флюоресценции. В качестве источника света, возбуждающего флюофор (длина волны возбуждения = 488 нм), был использован Аг/Кг лазер. Детектор был настроен на улавливание флюоресценции при длине волны выше 550 нм. Микрографическое разрешение составляло 512 х 512 пикселей, и результирующее изображение представляло собой среднее из 16 сканирований.

Родамин Б (0.01 %) был использован в качестве красителя для контрастирования белка на полученном изображении.

Оценка пенообразующей способности биополимеров.

Пены, объёмом 25 мл, обычно готовили - пропусканием воздуха через стеклянную мембрану с диаметром пор (1 мкм). Скорость подаваемого воздуха всегда поддерживалась постоянной. Пены всегда готовили, используя одинаковый объём (5 мл) и концентрацию (1 вес/объём %) растворов биополимеров. Изменение дисперсности и стабильности пен во времени фиксировали, используя цифровой фотоаппарат.

Определение концентрации ароматобразующих эфиров в водных растворах биополимеров.

Концентрацию ароматобразующих соединений в водной среде определяли при помощи газо-жидкостной хроматографии (Hewlett Packard (USA) 571 OA, интегратор 3380A).

Разделение экстрагированных соединений было проведено при помощи капиллярной колонки SE-30 (JIW) (50 м х 32 мм, df = 0.2 мкм и/или 60 м х 32 мм, df = 0.25 мкм) при 110 °С. Условия хроматографии были следующими:

разделяющее отношение газа носителя (гелия) составляло 1 : 30 или 1: 100; скорость потока была равна 1 и/или 1.5 мл/мин, температура инжектора и детектора (FID) были равны 150 °С и/или 200 °С, количество введённых образцов было равно 0.5 - 2 мкл. Содержание ароматобразующих соединений было определено по соотношению площадей пиков, относящихся к ароматобразующим соединениям и внутреннему стандарту (н-ундекану).

Определение количества ароматобразующих соединений, связывающихся с биополимерами.

При определении количества ароматобразующих соединений, связывающихся с биополимерами, мы использовали метод ультрафильтрации, с помощью которого мы разделяли связанные и несвязанные с биополимерами ароматобразующие соединения. При этом эксперименты проводились следующим образом: рассчитанное количество ароматобразующего соединения, растворённого в диэтиловом эфире, добавлялось к 25 мл растворов биополимеров с концентрацией 1 вес/объём %, а также к такому же объёму растворителя, являющегося в данном случае раствором сравнения. Полученные таким образом смешанные растворы встряхивали в течение 1-2 минут и оставляли выстаиваться в течение 30 минут при комнатной температуре в открытой посуде для удаления следов эфира. Затем эти растворы, но уже в закрытой посуде - встряхивали на водяном встряхивателе (CPLAN встряхиватель, тип 357, Poland) в течение 1 часа, при комнатной температуре, для установления равновесия. После этого смешанные растворы были отфильтрованы через ядерные мембранные фильтры с размером пор 0.027 мкм (мембраны были сделаны из лавсана и были обработаны 20% NaOH).

Количество пор на 1 см было равно 2x10^. При этом, на каждые 200 А^ приходилась 1 карбоксильная группа. Биополимеры не проходили через эти мембраны, тогда как несвязанные с биополимерами ароматобразующие соединения - проходили. Аликвоты отфильтрованных растворов (5 мл), содержащие несвязанные с биополимерами ароматобразующие соединения, собирали в пробирки, в которые было налито по 3 мл диэтилового эфира. Полученные таким образом смеси энергично встряхивали и оставляли выстаиваться в течение 24 часов в холодильнике для достижения более полного экстрагирования ароматобразующих соединений слоем диэтилового эфира. Затем органический слой отделялся от водного раствора, и в нём проводили количественное определение концентрации несвязанных с биополимерами ароматобразующих соединений, т.е. свободных лигандов [Lfree], при помощи газожидкостной хроматографии, как это было описано выше. Величины [Lfree], представленные в этой работе являются усреднёнными величинами от 3-8 повторений хроматографического анализа. Используя эти данные, были рассчитаны концентрации связанных с биополимерами лигандов. При этом также учитывалась количество ароматобразующих соединений, сорбировавшихся на ядерных мембранах. Ошибка в определении количества ароматобразующих соединений, связанных с биополимерами не превышала 5%.

Оценка обратимости связывания ароматобразующих соединений с биополимерами.

Раствор биополимера (1 вес/объём % (25 мл) с добавленным, как описано выше, ароматобразующим соединением встряхивали в течение 1 часа в водяном встряхивателе (CPLAN встряхиватель, тип 357, Польша) при комнатной температуре. Затем проводили ультрафильтрацию полученного смешанного раствора, как описано выше, и отбирали 5 мл отфильтрованного раствора для определения в нём концентрации ароматобразующего соединения, несвязанного с белком, как описано выше. Оставшуюся часть смешанного раствора разбавляли буфером до начального объёма, т.е. до 25 мл. В результате этого, концентрация биополимера поддерживалась на постоянном уровне, в то время как, концентрация ароматобразующего соединения уменьшалась. Полученный раствор с новым соотношением между концентрациями биополимера и ароматобразующего соединения опять встряхивали в течение 1 часа, при комнатной температуре, в вышеупомяноутом встряхивателе. Для оценки количества свободного лиганда повторяли всю процедуру, описанную выше.

Оценка влияния тепловой обработки на связывание ароматобразующего соединения белком.

Раствор белка (1 вес/объём % (50 мл) с добавленным, как описано выше, ароматобразующим соединением встряхивали в течение 1 часа в водяном встряхивателе (CPLAN встряхиватель, тип 357, Польша) при комнатной температуре. Для определения количества свободного и связанного с белком ароматобразующего соединения проводили ультрафильтрацию, как описано выше, для 25 мл смешанного (белок + ароматобразующее соединение) раствора. Оставшуюся часть смешанного раствора (25 мл) помещали в стеклянную ампулу и запаивали. Затем ампулу прогревали в термостате при 90

С в течение 30 мин и после этого охлаждали до комнатной температуры. Прогретый таким образом смешанный раствор выдерживали в течение 24 часов перед проведением ультрафильтрации и количественным определением содержания свободного лиганда в фильтрате, а затем и связанного лиганда с термоденатурированным белком.

Процедура последовательного добавления ароматобразующих соединений к раствору биополимеров.

Была отработана следующая процедура последовательного добавления ароматобразующих соединений в раствор биополимеров. Рассчитанное количество первого ароматобразующего соединения в диэтиловом эфире добавляли к 50 мл раствора биополимера (1 вес/объём %). Полученные таким образом смешанные растворы встряхивали в течение 1-2 минут и оставляли выстаиваться в течение 30 минут при комнатной температуре в открытой посуде для удаления следов эфира. Затем эти растворы, но уже в закрытой посуде - встряхивали на водяном встряхивателе (CPLAN встряхиватель, тип 357, Польша) в течение 1 часа, при комнатной температуре для установления равновесия. После этого, половину раствора использовали для ультрафильтрации с последующей оценкой количества первого ароматобразующего соединения, связанного с белком, как описано выше. К оставшейся половине раствора добавляли расчётное количество второго ароматобразующего соединения. Новый смешанный раствор, содержащий уже два ароматобразующих соединения, опять энергично встряхивали в течение 12 минут и оставляли выстаиваться в течение 30 минут при комнатной температуре в открытой посуде для удаления следов эфира, и затем опять встряхивали в закрытой посуде в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого, смешанные растворы фильтровали, как описано выше, для определения свободных и связанных с белком двух ароматобразующих лигандов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Часть I. Взаимодействия между биополимерами

Изучение взаимодействий между биополимерами занимает всё большее место в современных фундаментальных и прикладных исследованиях, связанных с инновационными разработками продукции пищевого, фармацевтического и косметического назначения, поскольку эти взаимодействия лежат в основе процессов фазового расслоения и гелеобразования, т.е. двух базовых процессов в формировании микроструктуры биополимер-содержащих систем, в итоге определяющих их макротекстуру и механическую стабильность [21-33].

В представленной работе мы изучали, главным образом, вклад относительно слабых, преимущественно физических взаимодействий, в структурообразующие свойства биополимеров. Такие взаимодействия не могли привести к образованию высоко стабильных биополимер-биополимерных гибридов, как это могло бы происходить при формировании ковалентных связей между биополимерами, но, в то же время, они могли оказывать существенное влияние на структурообразующие функции биополимеров в объёме и на границе раздела фаз в водных растворах и коллоидных системах. В частности, среди таких взаимодействий можно выделить, различного рода электростатические взаимодействия (ионные, диполь-дипольные, донорно-акцепторные), стерические взаимодействия (эффекты исключённого объёма), а также гидрофобные взаимодействия.

Кроме того, для сравнения мы продемонстрируем, как формирование ковалентных связей (коньюгатов) между белками и полисахаридами по реакции Майара, может влиять на их структурообразующие способности.

При этом вклад взаимодействий между биополимерами в структурообразование многокомпонентных растворов и коллоидных систем может быть разделён на вклады от самоассоциации биополимеров и от взаимодействий между различающимися по природе биополимерами. В анализе роли каждого из этих вкладов в структурообразующую способность биополимеров, термодинамический подход занимал центральное место в нашем исследовании. В основе этого похода лежал анализ экспериментальных данных ряда таких термодинамических методов, как лазерного светорассеяния, калориметрии смешения, дифференциальной сканирующей калориметрии и тензиометрии.

Выводы

1. С помощью проведённого термодинамического анализа удалось объяснить особенности вытеснительной флоккуляции в эмульсии масла в воде, стабилизированной, казеинатом натрия в присутствии определённых концентраций ионов Са2+. При этом, впервые были установлены прямые взаимосвязи между характерными изменениями, под действием ионов Са2+, надмолекулярной структуры белка (Mw, RG, Rh) и характера парных белок-белковых взаимодействий (.Аб-б), с одной стороны, с изменением, как осмотического давления в дисперсионной среде, так и свободной энергии вытеснительной флоккуляции в эмульсии, с другой.

2. Изучение особенностей самоассоциации казеината натрия в водной среде также впервые позволило подойти к более глубокому пониманию молекулярных основ возникновения в узком температурном диапазоне, близком к температуре человеческого тела (35-45°С), термообратимой и термонеобратимой вязкоэластичности эмульсионных гелей, стабилизированных казеинатом натрия в определённой области рН в присутствии определённых концентраций ионов кальция.

3. Для капель эмульсии, стабилизированных адсорбционными слоями а81-казеина и Р-казеина, впервые были установлены прямые взаимосвязи между интенсивностью сил притяжения в растворе белковых наночастиц друг к другу (знак и величина АБ.Б) и величиной вероятности (Ф) объединения капель эмульсии в поле сил сдвига.

4. На примере казеината натрия в присутствии сахарозы (10-78 вес/объём %) впервые была установлена определяющая роль самоорганизации белка, в частности его диссоциации/ассоциации, в формировании микроструктуры и реологических характеристик геля на его основе. Установлено, что в основе обнаруженной диссоциации наночастиц казеината натрия при рН > ИЭТ белка лежит образование множественных водородных связей с молекулами сахарозы.

В то время как, в основе усиления ассоциации белка при рН < ИЭТ белка лежит конкуренция между белком и молекулами сахарозы за молекулы воды.

5. Термодинамический анализ, проведённый для целого ряда структурно различающихся белков и полисахаридов, впервые позволил на количественном уровне выделить ключевые факторы, ответственные за усиление термодинамически неблагоприятных взаимодействий между биополимерами в их смешанных растворах. Так, к ним могут быть отнесены следующие: возрастание размера биополимерной молекулы; уменьшение степени доступности пространства, занятого одним биополимером, для другого; возрастание жёсткости биополимерной молекулы; степень, с которой суммарный одноимённый электрический заряд на биополимерах может быть вовлечён во взаимное кулоновское отталкивание; несущественная роль трансляционной энтропии противоинов в термодинамике взаимодействий между биополимерами. Кроме того, сопоставление термодинамических параметров парных взаимодействий между всеми компонентами смешанных растворов биополимеров с положением критических точек и бинодалей позволило выделить ключевые факторы, определяющие концентрационные области термодинамической несовместимости для каждой из изученных пар биополимеров.

6. В случае коллоидных систем (например, прямых эмульсий масла в воде), стабилизированных смесями белков и полисахаридов, впервые было установлено, что термодинамически неблагоприятные взаимодействия (А2з > 0) между биополимерами, повышающие их химические потенциалы (термодинамическую активность) в объёме водной фазы эмульсий приводят к следующим важным изменениям в структуре и стабильности последних:

1) значительному повышению поверхностной активности белка на плоской границе раздела фаз (неполярная фаза - вода);

2) возрастанию величины адсорбции белка на каплях эмульсии;

3) возрастанию вязкости сдвига в адсорбционном слое белка, г|поверхн, в результате возрастания его поверхностной концентрации;

4) понижению размера капель в эмульсии, т.е. к увеличению общей площади поверхности раздела фаз в эмульсии при умеренном увеличении термодинамической активности белка в объёме раствора;

5) формированию больших по размеру капель эмульсии и их интенсивной флоккуляции по механизму «вытеснительной флоккуляции» при значительном возрастании термодинамической активности белка в объёме раствора. Такая флоккуляция приводит к возрастанию вязкоэластичности концентрированных эмульсий (40 об.% масляной фазы) и быстрому кримингу в эмульсиях с низким содержанием масляной фазы (11 об. %).

В свою очередь, нам впервые удалось установить, что термодинамически благоприятные взаимодействия между белками и полисахаридами (А2з < 0), понижающие их химические потенциалы (термодинамическую активность) в объёме водной фазы вызывали:

1) значительное понижение поверхностной активности белков в присутствии полисахаридов на плоской границе раздела фаз (неполярная фаза - вода);

2) более значительное, по сравнению с термодинамически неблагоприятными взаимодействиями, возрастание вязкости сдвига в адсорбционном слое белка, за счёт сил взаимного притяжения, действующих между биополимерами;

3) интенсивную флоккуляцию капель в эмульсии по механизму «мостичной флоккуляции», которая приводит к возрастанию вязкоэластичности концентрированных эмульсий (40 об. % масляной фазы) и быстрому кримингу в эмульсиях с низким содержанием масляной фазы (11 об. %);

4) и не оказывали влияния на величину адсорбции белка на каплях реальных эмульсий и их размер.

7. Впервые установлены молекулярные механизмы модификации молекулярных параметров и структурной функциональности биополимеров белков и полисахаридов) посредством их взаимодействий с низкими концентрациями ПАВ в водной среде. При этом:

1) установлено определяющее влияние заряда и размера полярной части молекул ПАВ на характер их взаимодействий с одноимённо заряженными белками;

2) выявлена роль заряда и конформации белков во взаимодействии с одноимённо заряженными ПАВ;

3) установлено влияние молекулярного состояния ПАВ на изменение молекулярных параметров и структурной функциональности белков. При этом полученные данные позволили выделить некоторые свойства мицелл ПАВ, оказывающие значительное влияние на характер их взаимодействия с белками. К ним можно отнести, во-первых, термодинамическую стабильность мицелл ПАВ, выражаемую в терминах свободной энергии Гиббса мицеллообразования AGMmi, которая, при низких абсолютных значениях, может способствовать участию гидрофобного ядра мицеллы во взаимодействии с белком. Во-вторых, - гидрофильно-липофильный баланс свойств поверхности мицелл ПАВ, который отражает строение мицелл (прямые, обратные), а также их суммарный заряд. И, в-третьих, их размер, который, очевидно, может определять вклад эффектов исключённого объёма во взаимодействие между белками и мицеллами ПАВ.

4) предложены термодинамически обоснованные схемы молекулярных механизмов образования комплексов между одноимённо заряженными ПАВ и белками в водной среде.

8. Впервые установлено, что добавление основных компонентов (амилоза и амилопектин) и ферментативных производных (мальтодекстрины) крахмала к смесям глобулярных белков (овальбумин, легумин) с ПАВ может существенно понизить поверхностную активность этих смешанных систем, практически «сводя к нулю» синергетическое взаимовлияние белков и ПАВ.

Впервые было показано, что в основе такого влияния полисахаридов лежат следующие процессы:

1) интенсивное взаимодействие изученных полисахаридов с ПАВ;

2) изменение термодинамики взаимодействий модифицированных с помощью ПАВ белка и полисахарида;

3) изменение конформационной стабильности, модифицированных при помощи взаимодействий с ПАВ, белков.

9. Анализ изотерм связывания алкил ацетатов с глобулярным белком, легумином, впервые показал, что:

1) С7 является критической длиной углеводородной цепочки, превышение которой приводит к смене механизма связывания алкил ацетатов глобулярным белком (легумином) от связывания на независимых и идентичных местах связывания к кооперативному связыванию на взаимозависимых местах связывания;

2) конкурентное связывание алкил ацетатов с различной длиной углеводородной цепочки (Сб-Св) из их эквимолярной смеси с глобулярным белком контролируется структурными ограничениями в интерьере белка и величинами их характеристических констант связывания. При этом связывание алкилацетатов из их смеси происходит более специфично и может в сумме превышать общее число молекул алкилацетатов способных связаться с белком индивидуально. Взаимовлияние алкилацетатов при их совместном связывании проявляется, во-первых, в изменении механизма связывания более короткоцепочечного алкилацетата (НхАс) в присутствии более длинноцепочечных (НрАс и ОсАс) и, во-вторых, в значительном увеличении степени связывания длинноцепочечных алкилацетатов (НрАс и ОсАс), так как-будто бы предпочтительное связывание более длинноцепочечных алкилацетатов сопровождается дополнительной гидрофобизацией интерьера белковой глобулы, способствующей их связыванию.

Заключение

Таким образом, хорошее совпадение экспериментальных и литературных данных по числу мест связывания для молекул НхАс в белковой глобуле позволило сделать предположение, что, связывание НхАс нативным легумином обусловлено наличием высокоспецифичных центров связывания в интерьере нативной белковой глобулы, в частности, в гидрофобной полости, тригональной призмы, сформированной шестью субъединицами легумина. Тогда как, в случае термоденатурированного легумина это связывание обусловлено наличием большого числа гидрофобных мест связывания в термоагрегатах белка, преимущественно сформированных из развёрнутых и более гидрофобных основных полипептидных цепочек легумина.

Кроме того, было установлено, что, во-первых, степень связывания НхАс термоденатурированным легумином не зависела от способа термообработки раствора белка, т.е. до или после установления равновесия по связыванию с НхАс, и, во-вторых, если для нативного легумина связывание было полностью обратимым, то для термоденатурированного белка - оно было необратимым.

2.1.2. Влияние связывания гексил ацетата с легумином на молекулярные и термодинамические свойства белка в водной среде.

2.1.2.1. Влияние связывания НхАс с легумином на конформационную стабильность белка.

Данное исследование проводили методом ДСК. Термодинамические параметры, характеризующие процесс термоденатурации нативного и кислотно- денатурированного белка представлены в таблице 28.

Прежде всего, необходимо отметить, что при рН 7.2 отношение удельной энтальпии денатурации AHd к эффективной энтальпии денатурации Вант-Гоффа, ЛНэффект {рассчитанной на единичную полипептидную цепочку, входящую в состав глобулы легумина, с Mw=27500 Да [357,358]) ДНУДНэффект « 1. Таким образом, как и ожидалось, нативную глобулу легумина составляют 12 термодинамически эквивалентных домена, каждый из которых идентичен

ЛН(Дж/г)

20

10 0

0 12 3 log [R ] a) d ^ ^"^эффект

6)

2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

-4 -3 -2 -1 log [ L ]

ДСЕ(Джг' К ') log [ L ]

Рисунок 98. Влияние НхАс на термодинамические параметры, характеризующие процесс тепловой денатурации легумина в водной среде (ионная сила 0.05М) при (•), рН 7.2 и (А), рН 3.0: (a) AHd отложена, как функция от десятичного логарифма молярного отношения НхАс к белку, RM; (б) AHd / АНэффеш ; и (в) AJ2P отложена, как функция от десятичного логарифма концентрации НхАс в системе. отдельной полипептидной цепочке, входящей в состав белковой глобулы [357360].

1. Tolstoguzov V. Functional properties of food proteins and role of protein polysaccharide interaction//Food Hydrocolloids -1991. 4 - P. 429468.

2. Plashchina I.G., Semenova M.G., Braudo E.E. & Tolstoguzov V.B. Structural studies of the solutions of anionic polysaccharides. 4. Study of pectin solutions by light scattering//Carbohydrate Polymers 1985. - 5 - P. 159-179.

3. Dickinson E. & Tanai S. Protein displacement from the emulsion droplet surface by oil-soluble and water-soluble surfactants// Journal of Agricultural and Food Chemistry 1992. - 40 - P. 179-183.

4. Gernall A.B., Bardavil C.I. & David M.M. Determination of serum proteins by means of the biuret reaction// Journal of Biological Chemistry -1949.- 177- P. 751-766.

5. Dubois M., Gilles K.M., Hamilton J.K., Rebers P.A. & Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances// Analytical Chemistry 1956. - 28 - P. 350-356.

6. Belitz H.D. & Grosch W. Carbohydrates. In Food Chemistry Berlin: Springer-Verlag, 1987. - ch. 4, P. 245-249.

7. Polyakov V.I., Grinberg V.Ya., & Tolstoguzov V.B. Application of phase diagram of water-casein-soybean globulin system// Polymer Bulletin -1980.- 2-P. 757-760.

8. Privalov P.L. & Khechinashvili N.N. A Thermodynamic Approach to the Problem of Stabilization of Globular Protein Structure: A Calorimetric Study// Journal of Molecular Biology 1974,- 86 - P. 665 -684.

9. Evans J.M. Manipulation of light scattering data. In Light scattering from polymer solutions; Huglin M. B. (Ed.) London: Academic Press, 1972. - ch. 5, P. 89-164.

10. Burchard, W. Light scattering. In Physical Techniques for the Study of Food Biopolymers; S. B. Ross-Murphy (Ed.) Glasgow: Blackie, 1994. -P. 151-214.

11. Coviello Т., Kajiwara K., Burchard W., Dentini M., & Crescenzi V. Solution properties of xanthan. 1. Dynamic and static light scattering from native and modified xanthans in dilute solutions/ZMacromoJecules 1986. -19(11)-P. 2826-2831.

12. Home D.S. Light scattering studies of colloidal stability and gelation. In New Physico-Chemical Techniques for the Characterization of Complex Food Systems; Dickinson E. (Ed). Glasgow: Blackie, 1995. - P. 240-267.

13. Тенфорд, Ч. Химия полимеров Москва: «Химия», 1965 - 772 с.

14. Rha С. & Pradipasena P. Viscosity of proteins. In Functional properties of food macromolecules; Mitchell J. R. and Ledward D. A. (Eds.) London-New-York: Elsevier applied science publishers, 1985. - Ch. 2.- P. 79-120.

15. Gaines G. L. Insoluble Monolayers at Liquid Gas Interfaces. - New York: Intersince, 1996.

16. Murray B. S., Dickinson E., McCarney J. M., Nelson P. V., & Whittle M. Observation of the dynamic colloidal interaction forces between casein-coated latex particles// Langmuir 1998 - 14 (13) - P. 3466- 3469.

17. Casanova H., Chen J., Dickinson E., Murray B. S., Nelson P.V., & Whittle M. Dynamic colloidal interactions between protein-stabilised particles Experiment and simulation// Physical Chemistry Chemical Physics. - 2000. - 2(17) - P. 3861- 3869.

18. Whittle M., Murray B. S., Chen J., & Dickinson E. Simulation and experiments on colloidal particle capture in a shear field//Langmuir. 2000.-16(25)-P. 9784- 9771.

19. Appelqvist I. & Debet M. Starch-biopolymer interactions a review//Food Review International. - 1997. - 13 - P. 163-224.

20. Casanova H., & Dickinson E. Influence of Protein Interfacial Composition on Salt Stability of Mixed Casein Emulsions//Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1998. - 46(1) - P. 72-76.

21. Dickinson, E. Flocculation and competitive adsorption in a mixed polymer system. Relevance to casein-stabilized emulsions//Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 1997. - 93 - P. 2297-2301.

22. Dickinson, E. Proteins at interfaces and in emulsions. Stability, rheology and interactions//Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 1998. - 94 - P. 1657-1669.

23. Dickinson, E. Hydrocolloids at interfaces and the influence on the properties of dispersed systems// Food Hydrocolloids. 2003. - 17 - P. 2539.

24. Dickinson E. & McClements, D.J. Advances in Food Colloids. -Glasgow: Blackie, 1995.- P. 81-101.

25. Dickinson E., Semenova M.G., & Antipova A.S. Salt stability of casein emulsions// Food Hydrocolloids 1998. - 12 - P. 227-235.

26. Goff H. Colloidal aspects of ice cream -a review//International Daiiy Journal. 1997- 7-P. 363-373.

27. Grinberg V.Ya., & Tolstoguzov V.B. Thermodynamic incompatibility of proteins and polysaccharides in solutions//Food Hydrocolloids. 1997. -11-P. 145-158.

28. Marinova К., Gurkov Т., Velev О., Ivanov I., Campbell В., & Borwankar R. The role of additives for the behaviour of thin emulsion films stabilized by proteins//Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects.-1997- 123-124-P. 155-167.

29. Semenova M. G. Proteins as functional components in colloidal foods// Current Opinion in Colloid and Interface Science. 1998 - 3 (6) - P. 627-632.

30. Wasserman L., Semenova M., & Tsapkina, E. Thermodynamic properties of the 1 IS globulin of Vicia faba-ovalbumin-aqueous solvent system: phase behaviour and light scattering//Food Hydrocolloids. 1997.11 - P. 327-337.

31. Zasypkin D., Braudo E., & Tolstoguzov V. Multicomponent biopolymer gels//Food Hydrocolloids. 1997 - 11 - P. 159-170.

32. Foegeding E.A. Rheology, structure and texture perception in food protein gels. In Food Colloids. Interactions, Microstructure and Processing; Dickinson E. (Ed.). Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 2005. -P.3-15.

33. Semenova M. G., Belyakova L. E., Dickinson E., Eliot-Laize C., & Polikarpov Yu. N. Caseinate Interactions in Solution and in Emulsions:

34. Effect of Temperature, pH and Calcium Ions. In Food Colloids: Interactions, Microstructure and Processing; Dickinson E. (Ed). Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 2005. - P. 209 - 217.

35. Semenova M. G., Chen J., Dickinson E., Murray B. S., & Whittle M. Sticking of protein-coated particles in shear field//Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 2001. - 22 - P. 237- 244.

36. Sagis L.M.C., Veerman C., Ganzevles R., Ramaekers M., Bolder S.G., & van der Linden E. Mesoscopic structure and viscoelastic properties of 0-lactoglobulin gels at low pH and low ionic strength// Food Hydrocolloids. -2002- 16-P. 207-213.

37. Пригожин, И., Дефей, P. Химическая термодинамика. -Новосибирск: Из-во «Наука» Сибирское отделение, 1966. 509 с.

38. Edmond Е. & Ogston A. An approach to the study of phase separation in ternary aqueous systems/ZBiochemistry Journal.- 1968.- 109 P. 569-576.

39. Nagasawa, M., & Takahashi, A. Light scattering from polyelectrolyte solutions. In Light scattering from polymer solutions; Huglin M. B. (Ed.) -London: Academic press, 1972. P. 671-723.

40. Dickinson E. Structure, stability and rheology of flocculated emulsions//Current Opinion in Colloid Interface Science. 1998 - 3 - P. 633 - 638.

41. Dalgleish D. G. Adsorption of protein and the stability of emulsions// Trends in Food Science and Technology. 1997 - 8 - P. 1-6.

42. Leong, Y. K., Scales, P. J., Healy T. W., and Boger, D. V. Interparticle forces arising from adsorbed polyelectrolytes in colloidal suspensions//Colloids and Surfaces: A. 1995 - 95 - P. 43 -52.

43. Dickinson E., & Eriksson L. Particle flocculation by adsorbing polymers//Advances in Colloid and Interface Science. 1991- 34 - P. 1 - 29.

44. Dickinson E., & Euston S. R., Short-range structure of simulated floes of particles with bridging polymer//Colloids and Surfaces. 1992 - 62 (3) -P. 231 -242.

45. Gregory J. Flocculation by polymers and polyelectrolytes. In Solid/liquid Dispersions; Tadros Th. F. (Ed.). London: Academic Press, 1987, P. 163 -181.

46. Xiang Yu, & Somasundaran P., Role of polymer conformation in interparticle-bridging dominated flocculation// Journal of Colloid and Interface Science. 1996. - 177, P. 283-287.

47. Dickinson E. & Pawlowsky K. Effect of i-carrageenan on flocculation, creaming, and rheology of a protein-stabilized emulsion// Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1997. - 45- P. 3799-3806.

48. Vincent, В. The stability of solid/liquid dispesrsions in the presence of polymers. In Solid/Liquid Dispersions; Tadros Th. F., (Ed.). London: Academic Press, 1987.-P. 149-162.

49. Lekkerkerker H. N. W., & Stroobants A. On the spinodal instability of highly asymmetric hard sphere suspensions//Physica A: Statistical Mechanics and its Applications. 1993 - 195 - P. 387-397.

50. Vincent В., Edwards J., Emmett S., & Croot R. Phase separation in dispersions of weakly-interacting particles in solutions of non-adsorbing polymer// Colloids and Surfaces. 1987 - 31- P. 267-298.

51. Heeney, L., M.Sc. thesis, Leeds University, 1995.

52. Dickinson E., Goller M. I., & Wedlock D. J. Creaming and rheology of emulsions containing polysaccharide and non-ionic or anionic surfactants// Colloids and Surfaces: A. 1993 - 75 - P. 195 - 201.

53. Vincent B. Dispersion Stabilization and Destabilization by polymers. In Food Emulsions and Foams: Interfaces, Interactions and Stability; Dickinson E. and Rodriguez Patino J. M., (Eds.). Cambridge: Royal Society of Chemistry, 1999. - P. 19 - 28.

54. Dickinson E., & Golding M. Depletion flocculation of emulsions containing unadsorbed sodium caseinate// Food Hydrocolloids. 1997 - 11 -P. 13-18.

55. Dickinson E., Golding M., & Povey M. J. W. Creaming and flocculation of oil-in-water emulsions containing sodium caseinate//Journal of Colloid and Interface Science. 1997- 185 - P. 515 - 529.

56. Israelachvili J. Intermolecular and Surface Forces, 2nd edn. London: Academic Press. - 1992. - 450 p.

57. Leong Y.K., Scales P.J., Healy T.W., & Boger D.V. Interparticle forces arising from adsorbed polyelectrolytes in colloidal suspensions//Colloids and Surfaces A: PhysicoChemical and Engeneering Aspects. 1995. - 95- P. 43-52.

58. Williams P. A., & Smith N. J. Depletion flocculation. In Biopolymer Mixtures; Harding S. E., Hill S. E., and Mitchell J. R., (Eds.). Nottingham: Nottingham University Press, 1995. - P. 161-172.

59. Vrij, A. Polymers at interfaces and the interactions in colloidal dispersions// Pure and Applied Chemistry. 1976 - 48, P. 471-483.

60. Dickinson E., & Golding M. Influence of calcium ions on creaming and rheology of emulsions containing sodium caseinate//Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 1998. - 144 (1-3) -P. 167-177.

61. Dickinson E., & Davies E. In fluence of ionic calcium on stability of sodium caseinate emulsions//Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 1999 -12 (3-6)-P. 203-212.

62. Lucey J. A., Srinivasan M., Singh H., & Munro P. A. Characterization of commercial and experimental sodium caseinates by multiangle laser light scattering and size-exclusion chromatography//!. Agricultural and Food Chemistry. 2000-48-P. 1610-1616.

63. Farrell Jr. H.M., & Thompson, M.P. Caseins as calcium binding proteins In Calcium Binding Proteins II. 1988 — P. 117-137.

64. Melchionna S., & Hansen J.-P. Triplet depletion forces from density functional optimization// Physical Chemistry Chemical Physics. 2000. - 2 -P. 3465-3471.

65. Dickinson E., & Stainsby G. Colloids in Food. London: Applied Science, 1982.

66. Snowden M. J., Williams P. A., Garvey M. J., & Robb I. D. Phase Separation of Concentrated Aqueous Silica Dispersions in the Presence of

67. Nonadsorbed Polyelectrolytes//Journal of Colloid and Interface Science. -1994-166-P. 160- 167.

68. Gregory, J. Polymer adsorption and flocculation in sheared suspensions//Colloids and Surfaces. 1988. - 31 - P. 231-253.

69. Dickinson E. An Introduction to Food Colloids. Oxford: Oxford University Press, 1992. - P. 94.

70. Walstra, P. Introduction to aggregation phenomena in food colloids. In Food Colloids and Polymers: Stability and Mechanical Properties; Dickinson E. and Walstra P., (Eds.). Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 1993.- P. 3-15.

71. Dickinson E., Pinfield V. J., Home D. S., & Leermakers F. A. M. Self-consistent-field modeling of adsorbed casein. Interaction between two protein-coated surface// Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 1997. - 93 - P. 1785-1790.

72. Eliot C. & Dickinson E. Thermoreversible gelation of caseinate-stabilized emulsions at around body temperature//International Dairy Journal. 2003 - 13 - P. 679 - 684.

73. Burchard W. New aspects of polymer characterization by dynamic light scattering//Chimia. 1985. - 39 - P. 10-18.

74. Dickinson E. & Casanova H. A thermoreversible emulsion gel based on sodium caseinate//Food Hydrocolloids. 1999 - 13(4) - P. 285-289.

75. Semenova M., & Savilova L. The role of biopolymer structure in interactions between unlike biopolymers in aqueous medium//Food Hydrocolloids. 1998.- 12 - P. 65-75.

76. Dickinson E., Hunt J. A. & Home D.S. Calcium induced flocculation of emulsions containing adsorbed P-casein or phosvitin//Food Hydrocolloids. 1992. - 6 - P. 359-370.

77. Home D. S. & Leaver J. Milk proteins on surfaces//Food Hydrocolloids. 1995.- 9- P. 91-95.

78. Ye A. & Singh H. Interfacial composition and stability of sodium caseinate emulsions as influenced by calcium ions// Food Hydrocolloids. -2001- 15(2)-P. 195 -207.

79. Antipova A. S., Dickinson E., Murray B. S. & Semenova M. G. On the effect of calcium ions on the sticking behaviour of casein-coated particles in shear flow//Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2002. - 27, P. 123-131.

80. Дженкс. В.П. Катализ в химии и энзимологии. Москва: Мир, 1972.

81. Walstra Р. & Jenness R. Dairy Chemistry and Physics. New York: Wiley, 1984.

82. Leman J. & Kinsella J. E. Surface activity, film formation and emulsifying properties of milk proteins//Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 1989-28(2)-P. 115-138.

83. Belitz H.D. & Grosch W. Milk and dairy products. In Food Chemitry.- Berlin: Springer-Verlag, 1987. Ch.10. - P. 377- 402.

84. Fox P. F. & Mulvihill D. M. Physico-chemical Aspects of Dehydrated Protein-rich Milk Products. Denmark: Proc. Int. Dairy Fed. Symp., 1983, P. 188.

85. Rollema H.S. & Brinkhuis J.A. A H-NMR study of bovine casein micelles; influence of pH, temperature and calcium ions on micellar structure// Journal of Dairy Research. 1989 - 56 - P. 417-425.

86. Holt C. Casein micelle substructure and calcium phosphate interaction studied by Sephacryl column chromatography// Journal of Dairy Science.1998.-81 P. 1994-3003.

87. Mallee L. F. Mineral fortification using bioactive peptides from milk// Industrial Proteins. 1999 -7(2) - P. 5-7.

88. Vetier N., Desobry-Banon S., Ould Eleya M.M. & Hardy J., Effect of Temperature and Acidification Rate on the Fractal Dimension of Acidified Casein Aggregates// Journal of Dairy Science. 1997- 80 - P. 3161-3166.

89. Chen J. & Dickinson E. On the temperature reversibility of the viscoelasticity of acid-induced sodium caseinate emulsion gels/Anternational Dairy Journal 2000 - 10(8) - P. 541- 549.

90. Dickinson E. Adsorbed protein layers at fluid interfaces: Interactions, structure and surface rheology//Colloids and Surfaces B: Biointerfaces.1999.- 15 (2)-P. 161-176.

91. P. F. Fox, Developments in Dairy Chemistry 4. - London: Elsevier Applied Science, 1989.

92. Cosgrove Т., Fleer G. J., Cohen Stuart M.A., Scheutjens J.M., & Vincent B. Polymers at Interfaces. London: Chapman and Hall, 1993.

93. Whittle M., Murray В. S., Chen J., Dickinson E. Simulation and experiments on colloidal particle capture in a shear field// Langmuir. 2000 - 16 (25)-P. 9784-9791.

94. Wu X., Dabros Т., & Czarnecki J. Determining the Colloidal Forces between Bitumen Droplets in Water Using the Hydrodynamic Force Balance Technique// Langmuir. 1999 - 15(25) - P. 8706 - 8713.

95. Kulmyrzaev A, Bryant C, & McClements D J Influence of Sucrose on the Thermal Denaturation, Gelation, and Emulsion Stabilization of Whey Proteins// Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2000. - 48 - P. 1593-1597.

96. Baier S, & McClements D. J. Impact of Preferential Interactions on Thermal Stability and Gelation of Bovine Serum Albumin in Aqueous Sucrose Solutions// Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2001 -49-P. 2600-2608.

97. Rich L. M., & Foegeding E. A. Effects of Sugars on Whey Protein Isolate Gelation // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2000 - 48 -P.5046-5052.

98. Khan R. H., & Shabnum M. S. Effect of Sugars on Rabbit Serum Albumin Stability and Induction of Secondary Structure// Biochemistiy-Moscow. 2001- 66 - P. 1042-1046.

99. Carvajal P.A., MacDonald G.A., & Lanier T.C. Ciyostabilization Mechanism of Fish Muscle Proteins by Maltodextrins// Ciyobiology. 1999 -38-P. 16-26.

100. Rodrirguez Nino M. R., & Rodrirguez Patino J. M. Effect of the Aqueous Phase Composition on the Adsorption of Bovine Serum Albumin to the Air-Water Interface// Industrial and Engineering Chemistry Research -2002 -41 -P. 1489-1495.

101. Antipova A. S., Semenova M. G., & Belyakova L. E. Effect of sucrose on the thermodynamic properties of ovalbumin and sodium caseinate in abulk and at the air-water interface// Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. -1999- 12-P. 261-270.

102. Hogan S. A., McNamee B. F., O'Riordan E. D., &0'Sullivan M. Emulsification and microencapsulation properties of sodium caseinate/carbohydrate blends// International Dairy Journal 2001 - 11 - P. 137-144.

103. Murray В S, Liang H-J Enhancement of the Foaming Properties of Protein Dried in the Presence of Trehalose// Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1999 - 47 - P. 4984-4991.

104. Murray B. S., & Liang H-J. Evidence for Conformational Stabilization of P-Lactoglobulin When Dried with Trehalose// Langmuir. 2000 - 16 - P. 6061-6063.

105. Clarkson J. R., Cui Z. F., & Darton R. C. Effect of solution conditions on protein damage in foam// Biochemical Engineering Journal 2000 - 4 -P. 107-114.

106. Abbasi S., & Dickinson E. Influence of sugars on high-pressure induced gelation of skim milk dispersions//Food Hydrocolloids. 2001 - 15 -P. 315-319.

107. Keenan R. D., Young D. J., Tier С. M., Jones A. D., & Underdown J. Mechanism of Pressure-Induced Gelation of Milk// Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2001 - 49 - P. 3394-3402.

108. Dickinson E., & Merino L. M. Effect of sugars on the rheological properties of acid caseinate-stabilized emulsion gels// Food Hydrocolloids. -2002-16-P. 321-331.

109. Mercier J. D., Grosclaude F., Ribadeau-Dumas B. Primary structure of bovine caseins. A review//Milchwissenschaft. 1972 - 27- P. 402 - 408.

110. Walstra P. & Jenness R. Dairy Chemistry and Physics. New York: Wiley, 1984.

111. Chu В., Zhou Z., Wu G., & Farrell H. M. Laser Light Scattering of Model Casein Solutions: Effects of High Temperature// Journal of Colloid and Inteface Science. 1995- 170 - P. 102 -112.

112. Schorsch C., Jones M.G. & Norton I.T. Thermodynamic incompatibility and microstructure of milk protein/locust bean gum/sucrose systems//FoodHydrocolloids. 1999. - 13 -P. 89-99. . „ •

113. Schorsch C., Clark A. H., Jones M.G. & Norton I.T. Behaviour of milk protein/polysaccharide systems in high sucrose//Colloids and Surfaces: В.-1999- 12, P. 317-329.

114. Mozersky S.M., Farrel H.M. & Barford R.A. The Effects of Sucrose and Lactose on the Sizes of Casein Micelles Reconstituted from Bovine Caseins// Journal of Dairy Science. 1991 - 74 - P. 2382 -2393.

115. Dewan R. K., Bloomfield V.A., Chudgar A., & Morr C.V. Viscosity and voluminosity of bovine milk casein micelles. J. Dairy Science. 1973 -56(6)-P. 699-705.

116. Vaccari G., Mantovani G. In Sucrose: Properties and Applications; Mathlouthi M., Reiser-Cedus P. (Eds). New York: Chapman & Hall, 1995. -P. 33.

117. Mathlouthi M. In Sucrose: Properties and Applications; M. Mathlouthi, P. Reiser-Cedus (Eds). New York: Chapman & Hall, 1995. - P. 75.

118. Flink, J. M. In: Physical Properties of Foods; Peleg M., Bagley E. B. (Eds). New York: AVI Publishing Co., 1984. - P. 473.

119. Dawson R. M. C., Elliott D. C., Elliott W. H., Jones К. M. Data for Biochemical Research, 3rd edn.- Oxford: Clarendon Press, 1986.

120. Antipova A.S., & Semenova M.G. Effect of sucrose on the thermodynamic incompatibility of different biopolymers//Carbohydrate Polymers. 1995.- 28 - P. 359-365.

121. Lee J. C., & Timasheff S. N. The stabilization of proteins by sucrose// Journal of Biological Chemistry.- 1981 -256 7193-7201.

122. Antipova A.S., & Semenova M.G. Effect of neutral carbohydrate structure in the set glucose/sucrose/maltodextrin/dextran on protein surface activity at the air/water interface// Food Hydrocolloids. 1997 - 11 - P. 7177.

123. Minson E. I., Fennema O., Amundson С. H. Efficacy, of. various carbohydrates, as cryoprotectants. for casein in skim milk.// Journal of Food Science. 1981 - 46 (5) - 1597-1602.

124. Garrett I.M., Stairs R.A. & Annet R.G. Thermal denaturation and coagulation of whey proteins: effect of sugars// Journal of Dairy Science. -1988-71 -P. 10-16.

125. Allison S. D., Chang В., Randolph T. W, & Carpenter J. F. Hydrogen bonding between sugar and protein is responsible for inhibition of dehydration-induced protein unfolding// Archives of Biochemistry and Biophysics 1999. - 365 - P. 289 - 298.

126. Tzannis S. Т., & Prestrelski S. J. Moisture effects on protein-exciopient interactions in spray-dried powders. Nature of destabilizing effects of sucrose// Journal of of Pharmaceutical Sciences 1999.- 88 -P.360 - 370.

127. Lropez-Driez E. C. & Bone S. An investigation of the water-binding properties of protein+sugar systems// Physics in Medicine and Biology.-2000- 45-P. 3577-3588.

128. Imamura K., Iwai M., Ogawa Т., Sakiyama Т., & Nakanishi K. Evaluation of hydration statyes of protein in freeze-dried amorphous sugar matrix//Journal of Pharmaceutical Sciences. 2001. - 90 - P. 1955-1963.

129. McClements D. J. Estimation of steric exclusion and differential interaction contributions to protein transfer free energies in aqueous cosolvent solutions// Food Hydrocolloids. 2001 - 15 - P. 355-363.

130. Timasheff S N. Control of protein stability and reactions by weakly interacting cosolvents: the simplicity of the complicated//Advances in Protein Chemistry. 1998. - 51 - P. 355-432.

131. Saunders A. J., Davis-Searles P. R., Allen D. L., Pielak G. J., & Erie D. Osmolyte-induced changes in protein conformational equilibria//Biopolymers. 2000 - 53 - P. 293-307.

132. Ebel C., Eisenberg H., & Ghirlando R. Probing Protein-Sugar Interactions//Biophysical Journal. 2000-78-P. 385-393.

133. Brands С. M. J., & Van Boekel M. A. J. S. Reactions of monosaccharides during heating of sugar-casein systems: building of a reaction network model// Journal of Agricultural and Food Chemistry. -2001-49-P. 4667-4675.

134. Brands С. M. J., Wedzicha B. L., & Van Boekel M. A. J. S. Quantification of melanoidin concentration in sugar-casein systems// Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2002 - 50 - P. 1178- 1183.

135. Arakawa T. & Timasheff S.N. Stabilization of protein structure by sugars//Biochemistry. 1982 - 21- P. 6536-6544.

136. Antipova A.S., & Semenova M.G. Influence of sucrose on the thermodynamic properties of the 1 IS globulin of Vicia faba-dextran-aqueous solvent system// Food Hydrocolloids. 1997.- 11 - P. 415 - 421.

137. Dickinson, E. Protein-polysaccharide interactions. In Food Colloids and Polymers: stability and mechanical properties; Dickinson E., & Walstra P., (Eds.). Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 1993. - P. 77-93.

138. Dickinson E. Stability and rheological implications of electrostatic milk-protein-polysaccharide interactions// Trends in Food Science and Technology. 1998. - 9-P. 347-354.

139. Dickinson E. & Semenova M.G. Emulsifying behaviour of protein in the presence of polysaccharide under conditions of thermodynamic incompatibility// Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. -1992.-88-P. 849-854.

140. Dickinson E., Semenova M.G., Antipova A.S., & Pelan E. Effect of high-methoxy pectin on properties of casein-stabilized emulsions//Food Hydrocolloids. 1998. - 12 - P. 425 - 432.

141. Norton I.T., & Frith W.J. Phase separation in mixed biopolymer systems. In Food Colloids, Biopolymers and Materials; Dickinson E. and van Vliet, Ton, (Eds.).- Cambridge: The Royal Society of Chemistry. -2003.-P. 282-297.

142. Pavlovskaya G., Semenova M., Tsapkina E., & Tolstoguzov V. The influence of dextran on the interfacial pressure of adsorbing layers of 1 IS globulin vicia faba at the planar n-decane/aqueous solution interface// Food Hydrocolloids.- 1993. 7- P. 1-10.

143. Tolstoguzov V. Structure property relationships in Foods. In Macromolecular Interactions in Food Technology; Parris N., Kato A., Creamer L. K. and Pearce J.,(Eds.). - Washington DC : American Chemical Society, 1996.-P. 2-14.

144. Ledward D.A. Protein-Polysaccharide Interactions. In Protein Functionality in Food Systems; Hettiarachchy N.S. and Ziegler G.R., (Eds.). New York: Marcel Dekker, 1994. - P. 225-259.

145. Semenova M.G., Bolotina V.S., Grinberg V.Ya., & Tolstoguzov V.B. Thermodynamic incompatibility of the 1 IS fraction of soybean globulin and pectinate in aqueous medium//Food Hydrocolloids. 1990. - 3(6) - P. 447456.

146. Kratochvil P., & Sudelof L.O. Interactions in polymer solutions// Acta Pharmaceutica Suecica. 1986. - 23 - P. 31-46.

147. Ogston A.G. On the interaction of solute molecules with porous networks// Journal of Physical Chemistry 1970. -74 - P. 668-669.

148. Цветков B.H. Жёсткоцепные полимерные молекулы. -Ленинград: Наука, 1986 379 с.

149. Stockmayer W.H. Light Scattering in Multi-Component Systems // Journal of Chemical Physics. 1950. - 18 - P. 58-61.

150. Smidsrod G. Some physical properties of alginates in solution and in the gel state. Trondheim: NTNF's Institure for Marine Biochemistry, 1973.

151. Green G.H.S. Chemistry and Industry 1961.- P. 1036-1037.

152. Derbyshire E., Wrigh D. J., & Boulter D. Legumin and vicilin, storage proteins of legume seeds. A review// Phitochemistry. 1976.- 15- P. 3-24.

153. Neurath H. & Bailey The Proteins, Chemistry, Biological activity and methods. New York: Academic Press Inc., Publishers, 1953 - v.III. - part 1. - ch.5.

154. Casassa E.F. Effect of heterogeneity in molecular weight on the second virial coefficient of polymers in good solvents// Polymer. 1962. - 3 -P. 625-638.

155. Khoklov A.R., & Nyrkova I.A. Compatibility Enhancement and Microdomain Structuring in Weakly Charged Polyelectrolyte Mixtures// Macromolecules. 1992.-25 - P. 1493-1502.

156. Piculell L., & Lindman B. Association and segregation in aqueous polymer/polymer, polymer/surfactant, and surfactant/surfactant mixtures: similarities and differences// Advances in Colloid and Interface Science. -1992.-41-P. 149-178.

157. Bungenberg de Jong H. G. Crystalization, Coacervation and Flocculation. In Colloid Science; Kruyt, H.R. (Ed.). Amsterdam: Elsevier, 1949. - vol. 2. - P. 232 -258.

158. Пер-Оке Альбертсон Разделение клеточных частиц и макромолекул. Москва: Мир, 1974.- 381 с.

159. Polyakov V., Grinberg V., & Tolstoguzov V. Thermodynamic incompatibility of proteins// Food Hydrocolloids. 1997. - 11- P. 171-180.

160. Semenova M., Pavlovskaya G., & Tolstoguzov V. Light scattering and thermodynamic phase behaviour of the system 1 IS globulin- k-carrageenan-water// Food Hydrocolloids. 1991. - 4 - P. 469-479.

161. Hsu C.C., & Prausnitz J.M. Thermodynamics of polymer compatibility in ternary systems// Macromolecules. 1974. - 7(3) - P. 320324.

162. Zeman L., & Patterson D. Effect of solvent on polymer incompatibility in soIution/ZMacromoIecules. 1972. - 5(4) - P. 513-516.

163. Семёнова М.Г. Термодинамическая совместимость глобулярных белков и полисахаридов в водной среде по данным светорассеяния. Диссертация, канд. Хим. Наук. Москва, 1989 г. - 253 с.

164. Cai R. & Arntfield S. Thermal gelation in relation to binding of bovine serum albumin-polysaccharides systems//Journal of Food Science. -1997.-62-P. 1129-1134.

165. Edwards R. & Rutter P.R. The adsorption of bovine serum albumin and dextran D250 at the solid-liquid interface// Journal of Colloid and Interface Science. 1980. - 78 - P. 304-311.

166. Dickinson E.& Euston S.R. Stability of food emulsions containing both protein and polysaccharide. In Food Polymers, Gels and Colloids; Dickinson E., (Ed.). Cambridge: The Royal Society of Chemistry at Norwich, 1991.-P. 132-146.

167. Cao Y., Dickinson E. & Wedlock D J. Creaming and flocculation in emulsions containing polysaccharide// Food Hydrocolloids. 1990. - 4 - P. 185-195.

168. Dickinson E. The role of hydrocolloids in stabilizing particulate dispersions and emulsions. In Gums and Stabilizers for the Food Industry; Phillips G.O., Wedlock D.J. and Williams P.A., (Eds.). Oxford: IRL Press, 1988 .-vol. 4-P. 249 -264.

169. Radford S.J., & Dickinson E. Depletion flocculation of caseinate-stabilised emulsions: What is the optimum size of the non-adsorbed protein nano-particles?//Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2004. - 238(1-3) - P. 71-81.

170. Napper D.H. Polymer Stabilization of Colloidal Dispersions.- London: Academic Press, 1983.

171. Lips A., Campbell I.J. & Pelan E.G. Aggregation mechanism in food colloids and the role of biopolymers. In Food Polymers, Gels and Colloids; Dickinson E., (Ed.). Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 1991. -P.l-21.

172. Walstra P. Dairy Chemistry and Physics. Wiley, 1983.

173. Swaisgood H.E. Chemistry of milk protein. In Developments in Dairy Chemistry; Fox., P.F., (Ed.). London: Applied science, 1982. - 1 - P. 1-59.

174. Dickinson E., Ma J., & Povey M.J.W. Creaming of concentrated oil-in-water emulsions containing xanthanI I Food Hydrocolloids. -1994. 8 -P. 481-497.

175. Mercier J.D., Grrosclaude F., & Ribadeau-Dumas B. Primary structure of ovine caseins. A review// Milchwissenschaft. 1972 - 27- P. 402-408.

176. Nylander T. & Wahlgren M. Competitive and sequential adsorption of P-casein and p-lactoglobulin on hydrophobic surfaces and the interfacial structure of P-casein// Journal of Colloid and Interface Science. 1994 -162-P. 151-162.

177. Creamer L.K., Berry G.P. A study of the properties of dissociated bovine casein micelles// Journal of Dairy Research. 1975 - 42 - P. 169183.

178. Chu В., Zhou Z., Wu G., & Farrell H.M. Laser light-scatterring of model casein solutions: effects of high temperature// Journal of Colloid and Interface Science. 1995 - 170 - P. 102-112.

179. Schmidt D.G. Association of caseins and casein micelle structure. In Developments in dairy chemistry; Fox P.F., (Ed.). Essex England: Appl. Sci. Publ. Ltd., 1982 - vol.l - P. 61.

180. Tadros Th. F. & Vincent B. In Encyclopedia of Emulsion Technology; Becher P. (Ed.). New York: Marcel Dekker, 1983 - Vol.l - P. 129.

181. McClements, D.J. Food emulsions: Principles, practices and techniques. 2nd Edition. 2004.

182. Galazka V.B., Smith D., Ledward D.A., & Dickinson E. Complexes of bovine serum albumin with sulfated polysaccharides: Effect of pH, ionic strength and high-pressure treatment//Food Chemistry. 1999 - 64 - P. 303-310.

183. Neirynck N., Van der Meeren P., Bayarri Gorbe S., Dierckx S. & Dewettinck K. Improved emulsion stabilizing properties of whey protein isolate by conjugation with pectins// Food Hydrocolloids. 2004. - 18(6) -P. 949-957.

184. Diffis N. & Kiosseoglou V. Improvement of mulsifying properties of soybean protein isolate by conjugation with carboxymethyl cellulose// Food Chemistry.- 2003.- 81(1) P. 1- 6.

185. Dickinson E. & Galazka V.B. Emulsion stabilization by ionic and covalent complexes of p-lactoglobulin with polysaccharides//Food Hydrocolloids.-1991.- 5- P. 281 -296.

186. Dickinson E. & Galazka V.B. Emulsion stabilization by protein-polysaccharide complexes. In Gums and Stabilisers for the Food Industry; Phillips G.O., Wedlock D.J., and Williams P.A. (Eds.) Oxford: University Press, 1992.- Vol.6. - P. 351-362.

187. Dickinson E. Colloid science of mixed ingredients// Soft Matter. -2006. 2 (8) - P. 642-652.

188. Dalgleish, D.G. Food emulsions. In Encyclopedic handbook of emulsion technology. 2001 - P. 207-232.

189. Dickinson E. Protein-polysaccharide interactions. In Food Colloids and Polymers: stability and mechanical properties; Dickinson E. & Walstra P. (Eds.) -Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 1993. P. 77-93.

190. Utsumi Sh., Nacamura T. & Mori T. Role of constituent subunits in the formation and properties of heat-induced gels of 1 IS globulins from legume seeds// Journal of Agricultural Food Chemistry.- 1983.- 31- P. 503506.

191. Kavanagh G.M, Clark A.H., & Ross-Murphy S.B. Heat-induced gelation of globular proteins: part 3. Molecular studies on low pH beta-Iactoglobulin gels// International Journal of Biological macromolecules. -2000.- 28(1)-P. 41-50.

192. Galazka V. B. PhD Thesis. University of Leeds. -1991.

193. Grinberg V.Ya., Danilenko A.N., Burova T.V. & Tolstoguzov V.B. Conformational stability of 11 s globulins from seeds//Journal of the Science of Food and Agriculture. 1989. - 49(2) - P. 235- 248.

194. Gumpen S., Hegg P.O. & Martens H. Thermal stability of fatty acid-serum albumin complexes studied by differential scanning calorimetry// Biochimica et Biophysica Acta. 1979.- 574 -P. 189- 196.

195. Sperry P. R., Hopfenberg H.B. & Thomas N.L. Flocculation of latex by water-soluble polymers: Experimental confirmation of a nonbridging, nonadsorptive, volume-restriction mechanism// Journal of Colloid and Interface Science. 1981. - 82 - P. 62-76.

196. McClements D.J. Comments on viscosity and depletion flocculation by polysaccharides//Food Hydrocolloids.- 2000. 14(2) - P. 173-177.

197. Moschakis Т., Murray B. S. & Dickinson E. Microstructural evolution of viscoelastic emulsions stabilised by sodium caseinate and xanthan gum// Journal of colloid and interface science. 2005. - 284( 2) -P. 714-728

198. Castle J., Dickinson E., Murray B.S. & Stainsby G. ACS Symp. Ser., 343. Washington DC: American Chemical Society. 1987.- P.l 18.

199. Krog N. Food emulsifiers and their chemical and physical properties. In Food Emulsions; Friberg S.E. and Larsson K. (Eds.). New York: Marcel Dekker. - 1997. - ch. 4 - P. 141-187.

200. Antipova A.S., Semenova M.G., Belyakova L.E. & II'in M.M. On relationships between molecular structure, interaction and surface behaviour in mixture: small molecule surfactant + protein// Colloids and Surfaces B: Biointerfaces.- 2001- 21- P. 217-230.

201. Kelley D. & McClements D.J. Interactions of bovine serum albumin with ionic surfacatants in aqueous solutions// Food Hydrocolloids 2003. -17- P. 73-85.

202. Doxastakis G. & Sherman P. The interaction of sodium caseinate with monoglyceride and diglyceride at the oil-water interface and its effect on interfacial rheological properties// Colloid Polymer Science. 1986. - 264 -P. 254-259.

203. Wustneck R., Kragel J. & Miller R. The adsorption of surfaceactive complexes between ^-casein, }- lactoglobulin and ionic surfactants and their shear rheological behaviour//Colloids and Surfaces, A 1996 - 114 - P. 255-265.

204. Kerstens S., Mugnier C., Murray B.S. & Dickinson E. Influence of ionic surfactants on the microstructure of heat-set -lactoglobulin-stabilized emulsion gels//Food Biophysics. 2006. - 1 (3) - P. 133-143.

205. Dickinson E. & Hong S-T. Influence of an anionic surfactant on the rheology of heat-set p-lactoglobulin-stabilized emulsion gels// Colloids Surfaces A: Physicochemical and Engeneering Aspects. 1997. - 127 - P. 1-10.

206. Patino J., Nino R. & Gomez J. Interfacial and foaming characteristics of protein-lipid systems// Food Hydrocolloids . 1997. - 11 - P. 49-58.

207. Chen J.S. & Dickinson E. Viscoelastic Properties of Protein-Stabilized Emulsions: Effect of Protein-Surfactant Interactions//Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1998. - 46 - P. 91-97.

208. Chen J.S. & Dickinson E. Effect of monoglycerides and diglycerol-esters on viscoelasticity of heat-set whey protein emulsion gels// International Journal of Food Science and Technology. 1999. - 34 - P. 493-501.

209. Gennis R.B. Biomembranes. Molecular structure and function. New York: Springer-Verlag. 1989.

210. Lawrence A. A., Mohammednur Т., Desta S. & Shiferaw M. Effect of ionic strength and/or pH on Extractability and physico-functional characterization of broad bean (Vicia faba L.) Protein concentrate// Food Hydrocolloids. 2006. - 20(8) - P. 1124-1134.

211. Вайнтрауб JI.A. Овощные белки и их биосинтез. Под ред. Кретовича В. Л. Москва: Наука. - 1975. - С. 142-152.

212. Holt C. Structure and stability of the bovine casein micelle. In Advances in Protein Chemistry; Anfinsen C.B., Edsall J.D., Richards F.R. and Eisenberg D.S. (Eds.). San Diego: Academic Press. - 1992. - vol. 43 -P. 63-151.

213. Home D.S. Casein interactions: casting light on the black boxes, the structure in dairy products// International Dairy Journal. -1998. 8 - P. 171177.

214. Home D.S. Casein structure, self-assembly and gelation//Current Opinion in Colloid and Interface Science. -2002. 7 (5-6) - P. 456 - 461.

215. Home D.S. Casein micelle structure: Models and muddles//Current Opinion in Colloid and Interface Science. 2006. - 11(2-3) - P. 148 - 153.

216. Euston S.R. & Home D. S. Simulating the self-association of caseins// Food Hydrocolloids. 2005. -19 - P. 379 - 386.

217. Dauphas S., Mouhous-Riou N., Metro В., Mackie A.R., Wilde P.J., Anton M. & Riaublanc A. The supramolecular organization of p-casein: effect on interfacial properties// Food Hydrocolloids. 2005. - 19 - P. 387393.

218. Farrell Jr. H.M., Brown E.M., Hoagland P.D. & Malin E.L. Higher order structures in casein: a paradox//Advanced Dairy Chemistry-1: Proteins, Part A. 2003. - P. 203-231.

219. Farrell Jr. H.M., Malin E.L., Brown E.M. & Qi, P.X. Casein micelle structure: What can be learned from milk synthesis and structural biology? //Current Opinion in Colloid and Interface Science. 2006 - 11(2-3) - P. 135- 147.

220. Rollema H. S. In "Advanced Dairy Chemistry — 1 Proteins"; Fox P. F. (Ed.). London: Elsevier Applied Science. - 1992 - P. 111.

221. Mallee L. F. Mineral fortification using bioactive peptides from milk// Industrial Proteins. 1999.- 7(2) - P. 5 - 7.

222. G. Fauconneau. In Plant Proteins for Human Food; Bodwell C.E. and Petit L. (Eds). Hague: Martinus Mijhoff. - 1983 - P. 1.

223. Belitz H.D. & Grosch W. Legumes. In Food Chemistry. Berlin: Springer Ver-lag. -1987 - ch. 16, P. 536-548.

224. Garcia M., Torre M., Marina M., & Laborda F. Composition and characterization of soybean and related products//Critical Reviews in Food Science and Nutrition. -1997. 37- P. 361-391.

225. Muschiolok G. & Schmandke H. Functional Properties of Faba Bean Products (Vicia faba). Aachen: Nutrition, Biochemistry, Processing, Shaker-Verlag. 2000 (in German).

226. Creighton, Т.Е. Proteins, 2nd edition. New York: Freeman W. H. and Co. - 1993.

227. Paula S., Stis W., Tuchtenhagen J. & Blume, A. Thermodynamics of Micelle formation as a function of temperature: a high sensitivity titration calorimetry study// Journal of Physical Chemistry. -1995 99 - P. 11742 -11751.

228. Эдсолл Дж., Гатфренд X. Биотермодинамика. Изучение равновесных биохимических процессов. Под ред. Ю.А. Чизмаджева. -Москва: Мир. -1986.- 296 с.

229. Finkelstein A.V., Ptitsyn О.В. Protein Physics. A Course Lectures (Soft Condenced Matter, Complex Fluids and Biomaterials). California: Academic Press. An Imprint of Elsevier Science, - 2002.

230. Nakai S., Ho L., & Tung M.A. Solubilization of rapeseed, soy and sunflower protein isolates by surfactants and proteinase treatments//Canadian Institute of Food Science and Technology Journal. -1980.- 13-P. 14-22.

231. Utsumi Sh., Nacamura Т., & Mori T. Role of constituent subunits in the formation and properties of heat-induced gels of 1 IS globulins from legume seeds// Journal of Agriculture and Food Chemistry. 1983. - 31 -P. 503-506.

232. Dickinson E., Pinfield V.J., Home D.S. & Leermakers F.A.M. Self-consistent-field modelling of adsorbed casein. Interaction between twoprotein-coated surfaces// Journal of Chemical Society Faraday Transactions-1997.-93-P. 1785-1790.

233. Malhotra A. & Coupland J. N. The effect of surfactants on the solubility, zeta potential, and viscosity of soy protein isolates// Food Hydrocolloids. 2004. - 18 - P. 101-108.

234. Privalov, P.L. & Khechinashvili, N.N. A Thermodynamic Approach to the Problem of Stabilization of Globular Protein Structure: A Calorimetric Study// Journal of Molecular Biology. 1974. - 86 - P. 665 -684.

235. Magdassi S., Vinetsky Ye. & Relkin P. Formation and structural heat-stability of p- lactoglobulin/surfactant complexes// Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 1996. - 6 - P. 353 -362.

236. Privalov P.L. Stability of Proteins: Small Globular Proteins//Advances in Protein Chemistry. 1979. - 33 - P. 167-241.

237. Ahmad F. & Salahuddin A. Reversible unfolding of the major fraction of ovalbumin by guanidine hydrochloride//Biochemistry. 1976. - 15 - P. 5168-5175.

238. Pfeil W. & Privalov P.L. In Biochemical Thermodynamics; Jones M.N. (Ed.). Elsevier Scientific Publishing Co - 1979. - Ch.3 - P. 75-115.

239. Privalov P.L., Khechinashvili N.N. & Atanasov B.P. Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. calorimetric study of chymotrypsinogen, ribonuclease and myoglobin//Biopolymers. 1971. -10 (11)-P. 1865-1890.

240. Abed M. Ah. & Bohidar H. B. Gelatin-alpha olefin sulfonate interactions studied by dynamic light scattering//International Journal of Biological Macromolecules. 2004. - 34 - P. 49-54.

241. Sanchez C.C. & Patino J. M. R. Interfacial, foaming and emulsifying characteristics of sodium caseinate as influenced by protein concentration in solution// Food Hydrocolloids. 2005. - 19 - P. 407-416.

242. Rouimi S., Schorsch C., Valentini C. & Vaslin S. Foam stability and interfacial properties of milk protein-surfactant systems//Food Hydrocolloids. -2005. -19 P. 467-478.

243. Prins A., & KAI van Kalsbeek H. Foaming behaviour and dynamic surface properties of liquids//Current Opinion in Colloid and Interface Science. 1998. - 3(6) - P. 639-642.

244. Dickinson, E. & Izgi, E. Foam stabilization by protein-polysaccharide complexes// Colloids and Surfaces: A. 1996. - 113 - P. 191-201.

245. Patino J.M.R. & Nino M. R.R. Interfacial characteristics of food emulsifiers (proteins and lipids) at the air-water interface//Colloids and Surfaces: B. 1999. - 15 - P. 235-252.

246. Husband F.A., Wilde P J., Mackie A.R. & Garrood MJ. A Comparison of the Functional and Interfacial Properties of p-Casein and Dephosphoiylated p-Casein// Journal of Colloid and Interface Science. -1997.- 195-P. 77-85.

247. Dickinson E. & McClements D.J. Advances in Food Colloids. Glasgow: Blackie. 1995 - ch.8 - P. 247- 279.

248. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия: в 3-х томах. Москва: Мир. 1985. - Т. 3, гл. 15 - С. 6 - 40.

249. Scatchard G. The attraction of proteins for small molecules and ions// Annals of the New York Academy of Sciences. 1949. - 51 - P. 660-672.

250. Caessens P.W.J.R., Gruppen H., Visser S., Van Aken G.A. & Voragen AJ.G. Plasmin Hydrolysis of P-Casein: Foaming and Emulsifying Properties of the Fractionated Hydrolysate// Journal of Agricultural Food Chemistry. 1997- 45 - P. 2935-2941.

251. Harkema Ir. J., Paselli SA-2 and Paselli Excel. In Ingredients Handbook. Fat Substitutes; Dalzell J. M. (Ed.) Surrey: Leatherhead Food RA.- 1998.-P. 103-115.

252. Conde-Petit B. & Escher F. Complexation Induced Changes of Rheological Properties of Starch Systems at Different Moisture Levels// Journal of Rheology. 1995. - 39 - P. 1497 - 1518.

253. Nuessli J., Sigg В., Conde-Petit B. & Escher F. Characterization of amylose-flavour complexes by DSC and X-ray diffraction// Food Hydrocolloids. -1997. 11 - P. 27-34.

254. Singh N., Kaur K., Singh H. & Singh H. Effect of starch-lipids inclusion complex formation on functional properties of flour in tandoori roti// Food Chemistry. 2000. - 69(2) - P. 129-133.

255. Allen M. Т., Miola L., Suddaby B. R. & Whitten D. G. Fluorescent stilbene, diene and triene surfactants as probes of reactivity in amylose inclusion complexes//Tetrahedron. 1987. - 43(7) - P. 1477-1484.

256. Rutschmann M. A. & Solms J. The formation of ternary inclusion complexes of starch with menthone and monostearate: a possible food model system// Lebensmittel Wissenschaft und Technologie-Food Science and Technology. 1990. - 23 - P. 451 -456.

257. Rutschmann M. A. & Solms J. Study of starch inclusion complex formation in an integrated food model system. In "Flavors and off-flavors'-89"; Charalambous G. (Ed.). Elsevier. - 1990.

258. Nuessli J., Conde-Petit В., Trommsdorff U. R. & Escher F. Influence of starch flavour interactions on rheological properties of low concentration starch systems// Carohydrate Polymers. 1995. - 28 - P. 167-170.

259. Ohashi K., Goshima G„ Kusuda H. & Tsuge H. Effect of Embraced Lipid on the Gelatinization of Rice Starch// Starch/ Starke. 1980. - 32 - P. 54-58.

260. Akuzawa S., Sawayama S., & Kawabata A. Selectivity and Thermal Properties of Various Starches Incorporating Free Fatty Acids//Bioscience, Biotechnology and Biochememistry. 1995. - 59 - P. 1605-1608.

261. Svensson E., Autio K.,& Eliasson A-Ch. The Effect of sodium dodecylsulfate on gelatinization and gelation properties of wheat and potato starches//Food Hydrocolloids. 1998. - 12 - P. 151-158.

262. Raphaelides S. N. Rheological Studies of Starch-Fatty Acid Gels// Food Hydrocolloids. 1993. - 7 - P. 479-495.

263. Mary Chiming Tang and Les Copeland. Analysis of complexes between lipids and wheat starch//Carbohydrate Polymers. 2007. - 67 (1-2) -P. 80-85.

264. Chiotelli E. & Le Meste M. Effect of triglycerides on gelatinisation and rheological properties of concentrated potato starch preparations// Food Hydrocolloids. 2003. - 17(5) - P. 629-639.

265. Lundqvist H., Eliasson A.-C. & Olofsson G. Binding of hexadecyltrimethylammonium bromide to starch polysaccharides. Part I. Surface tension measurements// Carbohydrate Polymers. 2002. - 49(1) -P. 43-55.

266. Dickinson E., Goller M. I. & Wedlock D. J. Osmotic Pressure, Creaming, and Rheology of Emulsions Containing Nonionic Polysaccharide//Journal of Colloid and Interface Science. 1995. - 172 - P. 192-202.

267. Babak V. G. Stabilization of emulsion films and emulsions by surfactant-polyelectrolyte complexes. In Food Colloids 2000: Fundamentalsof Formulation; Dickinson E. and Miller R. (Eds.). Cambridge: The Royal Society of Chemistry. - 2001. - P. 91-102.

268. Paula S., StisW., Tuchtenhagen J. & Blume A. Thermodynamics of Micelle formation as a function of temperature: a high sensitivity titration calorimetry study// Journal of Physical Chemistry. 1995. - 99 - P. 1174211751.

269. Cooper A. Thermodynamic analysis of biomolecular interactions. A review//Current Opinion in Chemical Biology. 1999. - 3(5) - P. 557-563.

270. Mira, Isabel. Interactions between surfactants and starch: from starch granules to amylose solutions. Doctoral thesis. - 2006

271. Godet M. C., Buleon A., Tran A. & Colonna P. Structural Features of Fatty Acid Amylose Complexes// Carbohydrate Polymers. - 1993. - 21 -P. 91-95.

272. Semenova M. G. & Gauthier-Jaques A. Effect of amylose on ovalbumin surface activity at the air/water interface in the ternary system: amylase + ovalbumin + sodium caprate// Food Hydrocolloids. 1997. - 11 -P. 79-86.

273. Эскин В.Е. Рассеяние света растворами полимеров и свойства макромолекул. Ленинград: Наука 1986. - 288с.

274. Sun S. F. Physical Chemistry of Macromolecules. Basic Principles and Issues. (2nd Eddition) Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. 2004.

275. Dobrynin A. V. & Rubinstein M. Theory of polyelectrolytes in solutions and at surfaces. A review article// Progress in Polymer Science. -2005-P. 1049-1118.

276. Belitz H. D. & Grosch W. Vegetables and their products. In Food Chemistry. Berlin: Springer-Verlag. 1987 - ch.17- P. 549-577.

277. Goddard E.D. Polymer-surfactant interaction: Part I. Uncharged water-soluble polymers and charged surfactants. In Interactions of Surfactants with Polymers and Proteins. CRC Press. 1993. - P. 123-169.

278. Kiraly, Z. & Dekany, I. A thermometric titration study on the micelle formation of sodium decyl sulfate in water//Journal of Colloid and Interface Science. 2001. - 242 - P. 214-219.

279. Wang Y., Han В., Yan H. & Kwak, J.C.T. Microcalorimetry study of interaction between ionic surfactants and hydrophobically modified polymers in aqueous solutions// Langmuir. 1997. - 13 - P. 3119-3123.

280. Streicher W.W. & Makhatadze G.I. Advances in the analysis of conformational transitions in peptides using differential scanning calorimetry// Methods Molecular Biology. 2007. - 350 - P. 105-13.

281. Fares K., Landy P., Guilard R. & Voilley A. Physicochemical interactions between aroma compounds and milk proteins effect of water and protein modification// Journal of Dairy Science. - 1998. - 81 (1) - P. 82-91.

282. Franzen K.L. & Kinsella J.E. Parameters affecting the binding of volatile flavor compounds in model food systems. Part I. Proteins//Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1974. - 22(4) - P. 675-678.

283. Gremli, H.A. Interaction of flavor compounds with soy protein// Journal of American Oil Chemical Society. 1974. - 51(1) - P. 95A- 97A.

284. Landy P., Daraux C. & Voilley A. Retention of aroma compounds by proteins in aqueous solution// Food Chemistry. 1995. - 54(4) - P. 387392.

285. Conde-Petit В., Escher F. & J. Nuessli Structural features of starch-flavor complexation in food model systems. A review article. //Trends in Food Science & Technology. 2006. -17(5) - P. 227-235.

286. Sostmann K. & Guichard E. Immobilized beta-lactoglobulin on a HPLC-column a rapid way to determine protein-flavour interactions // Food Chemistry. -1998. - 62 (4) - P. 509-513.

287. Voilley A.J. Flavour encapsulation-influence of encapsulation media on aroma retention during drying//ACS Symposium series. 1995. - 590 -P. 169-179.

288. Wassef W. & Nawar Some variables affecting composition of headspace aroma//Journal of Agricultural and Food Chemistry. -1971.-19 (16)-P. 1057-1059.

289. Graf E. & Deeroos K.B. Performance of vanilla flavour in low-fat icecream//ACS Symposium series. 1996. - 633 - P. 24-35.

290. Hansen A.P. & Booker D.C. Flavour interaction with casein and whey-protein// ACS Symposium series. 1996. - 633 - P. 75-89.

291. Mottram D.S., Szaumanszumski C. & Dodson A. Interaction of thiol and disulfide flavour compounds with food components//Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1996. - 44 - P. 2349-2351.

292. Miller K.S., Upadhyaya S.K. & Krochta J.M. Permeability of D-limonene in whey-protein films// Journal of Food Science. 1998. - 63 - P. 244-247.

293. Makri E., Papalamprou E. & Doxastakis G. Study of functional properties of seed storage proteins from indigenous European legume crops (lupin, pea, broad bean) in admixture with polysaccharides//Food Hydrocolloids. -2005. 19(3) - 583-594.

294. Fauconneau G. In Plant Proteins for Human Food; Bodwell C.E. and Petit L. (Eds). The Hague: Martinus Mijhoff. -1983 - P. 1.

295. Garcia M.C., Torre M., Marina M.L. & Laborda F. Composition and characterization of soybean and related products//Critical Reviews in Fodd Science and Nutrition. 1997. - 37 (4) - P. 361-391.

296. Kinsella J.E. Functional properties of soy proteins//Journal of American Oil Chemical Society. 1979. - 56 (3) - P. 242- 258.

297. McDaniel M.R. & Chan N. Masking of soy protein flavor by tomato sauce// Journal of Food Science. 1988. - 53 (1) - P. 93-96.

298. Dumont J.P. & Land D.G. Binding of diacetil by pea proteins// Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1986. - 34. - P. 1041-1045.

299. Pattee H.E., Salunkhe D.K., Sathe S.K. & Reddy N.R. Legume lipids// Critical Review of Food Science and Nutrition. 1982. - 17(2). - P. 97-139.

300. Damodaran S. & Kinsella J.E. Interaction of carbonyls with soy protein: thermodynamic effects// Journal of Agricultural and Food Chemistry.- 1981.-29-P. 1249-1253.

301. Damodaran S. & Kinsella J.E. Interaction of carbonyls with soy protein: conformational effects// Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1981. - 29-P. 1253-1257.

302. Aspelund T.G. & Wilson L.A. Adsorption of off-flavor compounds onto soy protein: a thermodynamic study//Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1983. 31. - P. 539 -545.

303. O'Neill Т.Е. & Kinsella J.E. Flavor protein interactions: characteristics of 2-nonanone binding to isolated soy protein fractions//Journal of Food Science. -1987. 52 (1) - P. 98-101.

304. Damodaran S. and Kinsella J.E. Flavor protein interactions. Binding of carbonyls to bovine serum albumin: thermodynamic and conformational effects// Journal of Agricultural and Food Chemistry. -1980. 28 (3) - P. 567-571.

305. Fischer N. & Vaneijk T. Gas-chromatography olfactometry as a tool for measuring flavor-food ingredient interactions in model systems//ACS Symposium series 1996. - 633 - P. 164 - 178.

306. Belitz H.D. & Grosch W. Aroma substances. In Food Chemistry.-Berlin: Springer Verlag. 1987. - ch.5 - P. 257-304.

307. Jennings W.G. Influence of temperature and salt addends on vapor equilibration of headspace//Journal of Food Science. 1965. - 30 - P. 445 -449.

308. Borgna J.L. Requirements for reliable determination of binding affinity constants by saturation analysis approach//Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 2004. - 92(5) - P. 419-433.

309. Klotz I.M. & Urguhardt I,M. Binding of organic ions by proteins. Comparison of native and modified proteins// Journal of American Chemical Society. 1949. - 71 - P. 1597 - 1603.

310. Kozhevnikov G.O., Danilenko A.N., Braudo E.E. & Schwenke K.D. Comparative studies on thermodynamic characteristics of pea legumin and legumin-T thermal denaturation// International Journal of Biologicalmacromolecules. 2001- 29(4-5) - P. 225-236.

311. Schwenke K.D. Reflections about the functional potential of legume proteins. A review. A review // Nahrung. 2001. - 45(6) - P. 377-381.

312. Schwenke K. D., Grinberg V.Ya., Danilenko A.N., Burova T.V. & Tolstoguzov V.B. On the acceptability of the two-state model of protein unfolding to the 11 S globulins from plant seeds// Nahrung. 1987 - 31(2) -P. 183-184.

313. Utsumi Sh., Nacamura T. & Mori T. Role of constituent subunits in the formation and properties of heat-induced gels of 1 IS globulins from legume seeds// Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1983. - 31 -P. 503-506.

314. German В., Damodaran S. & Kinsella J.E. Thermal dissociation and association behaviour of soy proteins// Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1982. - 30 - P. 807-811.

315. Celej M.S., Dassie S.A., Freire E., Bianconi M.L. & Fidelio G.D. Ligand-induced thermostability in proteins: thermodynamic analysis of

316. ANS-albumin interaction// Biochimica et Biophysica Acta. 2005. -1750(2)-P. 122-133.

317. Kratochvil P. Particle scattering functions. In Light scattering from polymer solution; Huglin M.B. (Ed.). London and New York: Academic Press.-1972.-P. 333-384.

318. Suurkuusk J. Specific heat measurements of lysozyme, chymotrypsinogen, and ovalbumin in aqueous solution and in solid state// Acta Chemica Scandinavica. 1974. - B28 - P. 409 - 417.

319. Pfeil W. In Biochemical Thermodynamics; Tones T.N. (Ed.). -Amsterdam: Elsevier. 1988. - ch. 2.

320. Gelano E.L., Silva C.H.T.P., Imasato H. & Tabak M. Interaction of bovine (BSA) and human (HSA) serum albumins with ionic surfactants: spectroscopy and modelling//Biochimica et Biophysica Acta. 2002 - 1594 -P. 84-99.

321. Tolstoguzov V.B. Protein-polysaccharide interactions. In Food Proteins and Their Application. CRC Press 1997. - P. 171-198.

322. Tolstoguzov V.B. Thermodynamic aspects of biopolymer functionality in biological systems, foods, and beverages//Critical Reviews in Biotechnology. 2002. - 22 - P. 89-174.

323. Audette G.F., Delbaere L.T.J. & Xiang J. Mapping Protein: Carbohydrate Interactions// Current Protein and Peptide Science. 2003. - 4 (1)-P. 11-20.

324. Ding P., Wolf В., Frith W.J., Clark A.H., Norton I.T. & Pacek, A.W.Interfacial tension in phase-separated gelatin/dextran aqueous mixtures// Journal of Colloid and Interface Science. 2002. - 253 (2) - P. 367-376.

325. Langourieux S. & Crouzet,T. Study of Aroma Compounds-Polysaccharides Interactions by Dynamic Exponential Dilution// Food Science and Technology- Lebensmittel -Wissenschaft und Technologie. -1994.-27-P. 544-549.

326. Golovnya R. V., Terenina M. В., Krikunova N. I., Yuryev V. P. & Misharina T. A. Formation of Supramolecular Structures of Aroma Compounds with Polysaccharides of Corn Starch Cryotextures// Starch -Starke. 2001- 53 (6) - P. 269 - 277.

327. Seuvre A. M., Espinosa Diaz M. A. & Voilley A. Retention of aroma compounds by P-lactoglobulin in different conditions// Food Chemistry. -2002.- 77(4)-P.421-429.

328. Guichard E. Flavour retention and release from protein solutions. A review paper// Biotechnology Advances. 2006. - 24(2) - P. 226-229.

329. Guichard. E. & Etievant P. Measurement of interactions between polysaccharides and flavour compounds by exclusion size chromatography: Advantages and limits// Nahrung Food. 1998. - 42 - P. 376 - 379.

330. Landy P., Druaux C. & Voilley A. Retention of aroma compounds by proteins in aqueous solution// Food Chemistry. 1995. - 54(4) - P. 387392.

331. Le Thanh M., Thibeaudeau P., Thibaut M.A. & Voilley A. Interactions between volatile and non-volatile compounds in the presence of water//Food Chemistry. 1992. - 43,129-135.

332. Arvisenet G., Le Bail P., Voilley A., Cayot N. Influence of physicochemical interactions between amylose and aroma compounds on the retention of aroma in food-like matrices// Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2002. - 50(24) - P. 7088-7093.

333. Quiocho F.A., Spurlino J.C. & Robseth L.E. Extensive features of tight oligosaccharide binding revealed in high-resolution structures of the maltodextrin transport/chemosensory receptor // Structure. 1997. - 5 - P. 997- 1015.

334. Arvisenet G., Voilley A. & Cayot N. Retention of aroma compounds in starch matrices: competitions between aroma compounds toward amylose and amylopectin// Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2002. -50(25)-P. 7345-7349.

335. Jouquand C., Ducruet V. & Le Bail P. Formation of amylose complexes with C6-aroma compounds in starch dispersions and its impact on retention// Food Chemistry. 2006. - 95(3) - P. 461-470.