Твердофазные фотосенсибилизаторы на основе фуллеренов для генерации синглетного кислорода в водных средах тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

На правах рукописи

I 0034617Э1

Крисько Татьяна Константиновна

ТВЕРДОФАЗНЫЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ ФУЛЛЕРЕНОВ ДЛЯ ГЕНЕРАЦИИ СИНГЛЕТНОГО КИСЛОРОДА В ВОДНЫХ СРЕДАХ

Специальности: 01.04.05- Оптика и 02.00.04 - Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Санюч 1етербург 2008

003461791

Работа выполнена в Федеральном Государственном унитарном предприятии «Научно-производственной корпорации «Государственном оптическом институте им. С.И. Вавилова»

Научные руководители: доктор физико-математических наук,

профессор Белоусова Инна Михайловна

кандидат химических наук Муравьева Татьяна Дмитриевна

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Холмогоров Владимир Евгеньевич

доктор технических наук, профессор Василевский Александр Михайлович

Ведущая организация - Санкт-Петербургский Государственный

университет

Ж ох 2009 г. в ¿л*

Защита диссертации состоится 4г^у>, _2009 г. в С_(часов на заседании

диссертационного совета Д407.001.01 во ФГУП «НПК «ГОИ им. С.И. Вавилова» по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Биржевая линия, 12

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «НПК «ГОИ им. С.И. Вавилова»

Автореферат разослан «' <9» ^у_2009 г

ЛЖ

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор физико-математических наук, ¡уМ

профессор Данилов В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Исследование различных фотосенсибилизаторов и условий протекания фотосенсибилизируемых химических реакций является актуальным научным направлением.

В настоящей работе рассматривается вопрос использования фотосенсибилизатора для возбуждения синглетного кислорода, который в настоящее время находит широкое применение, в первую очередь в биологии и медицине.

Актуальным применением реакции фотосенсибилизированного окисления органических соединений в биологии и медицине является метод фотодинамической инактивации болезнетворных организмов (вирусы, бактерии, простейшие и т.д.) в донорской крови и продуктах крови. Действительно, передача инфекций при переливании плазмы донорской крови и использовании лечебных препаратов, полученных из нее, является одним из путей заражения пациентов гепатитами, ВИЧ и другими особо опасными инфекциями. Тем более, что в последние годы в группу заболеваний, передающихся при гемотрансфузиях, попали еще более 30 "новых" инфекционных болезней человека и, видимо, эта группа будет постоянно увеличиваться.

Поэтому стратегической задачей службы крови всех стран мира является обеспечение минимального уровня риска передачи гемотрансмиссивных инфекций при введении реципиентам донорской плазмы и препаратов из нее. В связи с этим в службе крови по регламенту Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) был введен ряд новых инактивационных технологий, позволяющих снизить риск заражения инфекционными заболеваниями при трансфузии и терапии.

К наиболее перспективным инактивационным технологиям относится фотодинамическое воздействие, которое заключается в активации светом в присутствии кислорода вводимого в плазму фотосенсибилизатора, генерации активных форм кислорода (в том числе синглетного кислорода) и последующего разрушения ими инфекционных агентов.

В качестве фотосенсибилизаторов в настоящее время используются водорастворимые красители, в основном метиленовый синий. Следует отметить, что данная технология реализуется в установках импортного производства, в России технология инактивации практически не используются.

Однако, несмотря на высокую эффективность этого метода, он имеет существенные недостатки, которые заключаются в необходимости последующего удаления красителя из инактивированной плазмы, что реализуется с помощью специально разработанных селективных фильтров в небольших объемах плазмы. К тому же данный метод не может быть применен для инактивации пулированной плазмы, идущей на переработку на лечебные препараты, из-за невозможности полного удаления красителя из больших объемов вязкой биологической жидкости.

Создание нового класса высокоэффективных твердофазных фотосенсибилизаторов позволит осуществлять инактивацию плазмы в гетерогенных условиях, что обеспечит простоту полного извлечения реагента после процесса инактивации и тем самым гарантию отсутствия нежелательных примесей в целевой плазме. Такие фотосенсибилизаторы с успехом могут применяться как в процессах инактивации небольших объемов плазмы из дозы донорской крови, так в случае инактивации пулированной плазмы для получения из нее лечебных препаратов.

Изучение структурных особенностей твердофазных

фотосенсибилизаторов и связанной с ними эффективности генерации активных форм кислорода, позволит создать оптимальные фотосенсибилизаторы, на основе которых могут быть разработаны отечественные высоко эффективные методы инактивации гемотрансмиссивных инфекций в плазме донорской крови и препаратах на ее основе.

Дель работы н задачи исследования: Настоящая работа посвящена созданию новых твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов, обладающих способностью генерировать синглетный кислород в водных средах, селективно воздействовать на вирусы, быть фотостабильными и легко извлекаемыми из биологических жидкостей после фотовоздействия.

Первая задача настоящего исследования - создание фотостабильной, легко извлекаемой, простой в технологии изготовления, малотоксичной твердофазной композиции на основе фуллерена для целей фотодинамической инактивации вирусов в плазме и препаратах плазмы крови.

Вторая задача настоящего исследования - изучение способности твердофазных фотосенсибилизаторов на основе Сбо к генерации синглетного кислорода в водной среде.

Третья задача настоящего исследования - оценка потенциальных возможностей использования твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов для фотодинамической инактивации вирусов in vitro.

Методы исследования: рентгеноструктурный анализ; спектрофотометрия; элементный анализ; электронная микроскопия; динамическое светорассеяние; импульсная люминесценция; фотохимический метод определения синглетного кислорода; экспериментальное моделирование фотосенсибилизированного разрушения оболочечных вирусов в водных средах.

Научная новизна диссертационной работы заключается в следующих положениях:

1. Обнаружена и исследована генерация синглетного кислорода высоко агрегированным фуллереном Сбо в водных средах.

2. Разработан твердофазный фотосенсибилизатор синглетного кислорода на основе фуллерена С6о, обеспечивающий эффективную инактивацию

оболочечных вирусов в водных средах и легкое извлечение сенсибилизирующего агента после процедуры инактивации.

3. Разработан новый способ получения высоко аморфизованного (67%) твердофазного фуллерена.

4. Предложена модификация фотохимического метода обнаружения 'Ог в водных средах, обеспечивающая высокочувствительные измерения сингленого кислорода, образованного в результате взаимодействия невозбужденного молекулярного кислорода с фотовозбужденным твердофазным сенсибилизатором.

Практическая ценность работы состоит в создании нового типа твердофазного фотосенсибилизатора, использование которого в процессах инактивации гемотрасмиссивных инфекций в плазме донорской крови позволит разработать отечественную технологию получения патоген-безопасной плазмы донорской крови и препаратов из нее, что позволит снизить риск распространения особо опасных инфекций.

Защищаемые положения:

1. Способность агрегированных фуллеренов при их возбуждении видимым светом в водных средах генерировать синглетный кислород.

2. Твердофазный фотосенсибилизатор на основе фуллерена, при облучении видимым светом генерирующий синглетный кислород в водных средах.

3. Фотостабильность твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов в условиях облучения, характерных для процесса фотодинамической инактивации вирусов (длительность облучения < 2 ч., 100 мВт/см2, видимый диапазон спектра).

4. Фотодинамическая инактивация оболочечных вирусов в водных средах при использовании твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов.

Апробация работы. Результаты работы прошли апробацию на международных конференциях, на которых были представлены следующие доклады:

1. Belousova I.M., Belousov V.P., Danilov О.В., Ermakov A.V., Kiselev V.M., Kris'ko Т.К., Kris'co A.V., Mironova N.G., Murav'eva T.D. Photosensitizers, based fullerenes and fullerene-like nanostructures for biology medicine // 8th International Conference on Solar Energy and Applied Photochemistry "Solar -05 ", Book of abstracts, p. 66-67. February 20-25, 2005, Luxor, Egypt.

2. Belousova I.M., Belousov V.P., Danilov O.B., Ermakov A.V., Kiselev V.M., Kris'ko Т.К., Kris'ko A.V., Mironova N.G., Murav'eva T.D. Photosensitizers on the base of fiillerenes and fullerene-like nanostructures for biology medicine // 7lh Biennial International Workshop on Fullerenes and Atomic Clusters, Book of abstracts, p. 217. June 27-July 1, 2005, St-Petersburg, Russia.

3. Zarubaev V.V., Anfimov P.M., Rylkov V.V., Murav'eva T.D., Kris'ko Т.К., Sirotkin A.K., Starodubzev A.M., Belousova I.M. and Kiselev O.I. Photodynamic inactivation of influenza virus with fullerene suspensions in allantoic fluid // 7th Biennial International Workshop on Fullerenes and Atomic Clusters, Book of abstracts, p. 245. June 27-July 1,2005, St.-Petersburg, Russia.

4. Piotrovsky L.B., Sirotkin A.K., Zarubaev V.V., Poznyakova L.N., Murav'eva T.D., Kris'ko Т.К., Belousova I.M. and Kiselev O.I. Pristine fullerene C6o: different water soluble forms - different mechanisms of biological action // 7,h Biennial International Workshop on Fullerenes and Atomic Clusters, Book of abstracts, p. 240. June 27-July 1, 2005, St.-Petersburg, Russia.

5. Белоусова И.М., Белоусов В.П., Крисько A.B., Крисько Т.К., Муравьева Т.Д., Сироткин А.К. Фотосенсибилизаторы на основе фуллеренов и фуллереноподобных наноструктур для биологии и медицины // IX Межд. конферен1)ия ICHMS - 2005, Водородное материаловедение и химия углеродных наноматериалов. Сборник тезисов, с. 661, Сентябрь 5-11, 2005, Севастополь-Крым-Украина.

6. Kislyakov I.M., Belousova I.M., Videnichev D.A., Danilov O.B., Kiselev V.M., Kris'ko Т.К., Murav'eva T.D. Solid-phase fullerene-like nanostructures as singlet-oxygen sensitizers in liquid media // XII Conference on Laser Optics. Technical Program, p. 35, June 26-30,2006, St.-Petersburg, Russia.

7. Bagrov I.V., Belousova I.M., Kiselev V.M., Kislyakov I.M., Krisko Т.К., Murav'eva T.D. Visible light action on optical and photochemical properties of fullerene C6o coatings // XIII Conference on Laser Optics. Technical Program, p. 75, June 23-28, 2008, St.-Petersburg, Russia.

8. Belousova I.M., Belousov V.P., Kiselev V.M., Murav'eva T.D., Kislyakov I.M., Starodubtzev A.M., Krisko Т.К., Bagrov I. V. Structural and optical properties of solid-phase C60 nanoparticles in aqueous suspensions // XIII Conference on Laser Optics. Technical Program, p. 75, June 23-28, 2008, St.-Petersburg, Russia.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ в реферируемых журналах, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, заключения, списка литературы из 111 наименований и трех приложений; изложена на 172 страницах и содержит 48 рисунков и 3 таблицы.

Личное участие автора заключается в разработке и приготовлении исследуемых композиций для всех видов исследований и их спектральном анализе; разработке фотохимического метода определения синглетного кислорода, образованного твердофазными фотосенсибилизаторами; определении и анализе сенсибилизирующей способности и фотостабильности исследуемых композиций; анализе экспериментальных результатов, в том

числе биологических, с целью определения оптимального фотосенсибилизатора, отвечающего конкретному применению реакции фотоокисления.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Первая глава. Фуллсрен и фотодинамическая инактивация вирусов

В первой главе представлен обзор литературы, посвященный вопросам возможности и особенностей применения фуллерена в качестве сенсибилизирующего агента в фотодинамических процессах, в частности инактивации вирусов. На основании анализа литературных данных сформулированы основные задачи настоящей работы.

Прежде всего, обоснована необходимость инактивации вирусов в плазме и препаратах плазмы крови, проведен выбор метода инактивации. Показано, что, благодаря селективности воздействия, фотодинамическая инактивация вирусов может является одним из наиболее перспективных методов очистки плазмы донорской крови и препаратов плазмы крови. В основе фотодинамической инактивации вирусов лежат реакции фотосенсибилизированного окисления органических соединений активными формами кислорода: супероксидным анион-радикалом Ог"* и гидроксильным радикалом ОН* (механизм I типа) илисинглетным кислородом 'О^ (механизм II типа). В водных системах протекание фотореакции типа I определяется возбуждением сенсибилизатора как в триплетное (3Р ), так и в синглетное ('р") возбужденное состояние в присутствии электронодонорных соединений, в то время как генерация синглетного кислорода обуславливается только наличием состояния (3Р*). Оба типа фотодинамических реакций протекают одновременно, конкурируя между собой в зависимости от относительной концентрации кислорода, фотоокисяяемой молекулы и рН среды, концентрации окисляющих агентов.

Однако, применение в качестве фотосенсибилизатора активных форм кислорода традиционного водорастворимого красителя (например, метиленового синего) может ограничить использование метода при множественной трансфузии плазмы крови и обработке препаратов плазмы крови благодаря наличию в целевых продуктах нежелательных примесей. Устранению этого недостатка может способствовать разработка принципиально нового подхода к фотодинамической инактивации вирусов, основанного на использовании твердофазных фуллеренсодержащих фотосенсибилизаторов, которые могут быть легко удалены из реакционной смеси после процедуры инактивации. Кроме того, было показано, что молекулы фуллерена С6о могут составить конкуренцию традиционно используемым в фотодинамике красителям, т.к. обладают: широким спектром поглощения; высоким квантовым выходом синглетного кислорода в отсутствии агрегации (= 1);

превалированием процесса образования синглетного кислорода молекулярным фуллереном над обратным процессом тушения синглетного кислорода фуллереном; низкой токсичностью; высокой фотохимической стабильностью.

Анализ литературы показал, что для создания твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов целесообразнее использовать немодифицированный фуллерен. В свою очередь получение твердофазной композиции, содержащей мономеры немодифицированного фуллерена, представляется достаточно сложной задачей. Поэтому было важно выяснить вопрос, касающийся влияния агрегации молекул на время жизни возбужденных состояний фуллерена и, таким образом, на эффективность генерации активных форм кислорода, приводящих к инактивации вирусов. Приведенный в настоящей главе анализ исследований по данной проблеме показал, что: (1) агрегация молекул См способствует уменьшению времен жизни состояний (3Р*) и ('Р ) фуллерена; (2) для каждого конкретного вида агрегатов фуллерена необходимо отдельно решать вопрос об эффективности тушения возбужденных состояний в кластере, поскольку она зависит от степени агрегации и силы взаимодействия фуллеренов в агрегате.

В связи с этим было рассмотрено влияние уменьшения времен жизни состояний (3Р) и ('Р ) фуллерена на эффективность генерации синглетного кислорода. На основании немногочисленных, но непротиворечивых и очевидных, литературных данных показано, что самотушение возбужденных состояний фуллерена при агрегации приводит к снижению квантового выхода синглетного кислорода.

Кроме того, был изучен вопрос о генерации радикалов фуллерена при агрегации Ceo, приводящих к образованию радикалов кислорода (реакция типа I). Показано, что фуллерен, находясь в возбужденном состоянии в присутствии эффективных доноров электронов, является прекрасным акцептором электронов. Таким образом, фотовозбуждение неагрегированного Сбо способствует передаче электрона от донора к 3Сбо с образованием анион-радикала С60 (Ceo*-)- Что касается агрегированного фуллерена, то несмотря на снижение времен жизни возбужденных состояний, С6о, находясь в неполярном растворителе в присутствии достаточного количества доноров электронов, также способен к эффективной генерации Сбо*~-

Таким образом, показано, что наличие долгоживущего триплетного состояния фуллерена при облучении в водных средах способствует генерации синглетного кислорода (в условиях отсутствия элекгронодонорных соединений) и всех видов активных форм кислорода (в присутствии элекгронодонорных соединений).

В свою очередь для проведения эффективного технологического процесса селективной инактивации вирусов агрегированный фуллерен должен обладать не только высокой сенсибилизирующей способностью, но также избирательным воздействием на вирусы и достаточно высокой фотостабильностью. Кроме того, при работе с биологической жидкостью

следует учитывать большую вязкость среды и влияние ее биологических компонентов на ход процесса инактивации. Перспектива применения твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов для инактивации вирусов в биологических жидкостях (например, в плазме крови) приводит к необходимости изучения вышеупомянутых факторов.

Вторая глава. Разработка и получение твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов. Изучение их структурных свойств

В данной главе описано изготовление и исследование структурных свойств твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов. Для этого на основании литературного обзора были сформулированы основные требования, предъявляемые нами к твердофазным фуллеренсодержащим фотосенсибилизаторам, пригодным к использованию в процессе очистки плазмы и препаратов плазмы крови: простота получения и воспроизводимость физико-химических свойств; возможность сохранения высокой эффективности генерации активных форм кислорода фуллеренами в гетерогенных условиях; химическая и физическая устойчивость твердофазных фуллеренсодержащих фотосенсибилизаторов под действием излучения в водных средах; хорошая смачиваемость водными средами; полная извлекаемость фотосенсибилизаторов из биологической среды после процедуры фотодинамического воздействия; технологичность их практического использования в процессах инактивации вирусов; высокая способность к инактивации вирусов в биологических жидкостях, обладающих высокой вязкостью.

Для выполнения этих требований были предложены, изготовлены и исследованы: (1) раздробленный кристаллический фуллерен и его водная суспензия; (2) «аморфный» фуллерен и его водная суспензия; (3) пластины с нанесенным на них слоем фуллерена; (4) микрочастицы силикагеля с нанесенным на них слоем фуллерена и их водная суспензия.

Для исследования структуры твердофазных фотосенсибилизаторов были использованы: рентгеноструктурный анализ; спектрофотометрия; элементный анализ; электронная микроскопия; динамическое светорассеяние. Также было показано, что для качественного определения степени агрегации фуллерена с успехом может применяться спектральный анализ.

Приготовленная суспензия раздробленного кристаллического фуллерена, полученная в процессе обработки суспензии кристаллического фуллерена ультразвуком, характеризовалась большой неоднородностью частиц по размеру, а процесс ее получения - недостаточной воспроизводимостью.

В связи с этим, был предложен способ получения суспензии фуллерена в воде, характеризующийся узким распределением частиц по размеру. В качестве первой стадии процесса был взят способ получения водного мицеллярного

раствора фуллерена по методу Г.В. Андриевского'. Были оптимизированы условия получения устойчивого мицеллярного раствора фуллерена в воде, а

также разработаны и предложены современные и более информативные I условия изучения таких растворов методом электронной микроскопии.

Принимая во внимание тот факт, что процессы инактивации вирусов j происходят в среде, содержащей j определенное количество

неорганических солей, было изучено поведение и свойства мицеллярного I раствора фуллерена при добавлении в водный раствор физиологического количества хлористого натрия (0.9 %). В результате такой модификации гидратная оболочка мицелл

разрушается, и мицеллярный раствор превращается в суспензию однородных по размеру частиц фуллерена. Методом электронной микроскопии было показано, что средний размер таких частиц приблизительно составляет 20-30 нм.

Структура лиофильно высушенных частиц полученных суспензий фуллерена была изучена рентгенографическим методом, полученные рентгенограммы представлены на рис.1. На рентгенограмме четко видны пики, характеризующие кристаллический фуллерен, вместе с гало, которые могут трактоваться как характеристика аморфной составляющей полученных порошков. Таким образом, методом модификации водного мицеллярного раствора Cûo получена дисперсная фуллереновая композиция, представляющая собой аморфный фуллерен (67%) с примесью кристаллического фуллерена (33%) и методом ультразвуковой обработки суспензии кристаллического фуллерена - кристаллический фуллерен (60%) с примесью аморфного фуллерена (40%).

Однако оказалось, что ни суспензия раздробленного кристаллического фуллерена, ни суспензия условно названного «аморфным» фуллерена не могут I обеспечить достаточную технологичность их практического использования в процессах инактивации вирусов. Они характеризовались недостаточно хорошей i извлекаемостью и постепенным снижением инактивационной активности I

' Andrievsky G.V., Kosevich M.V., Vovk О.М., Shelkovsky V.S. and Vashchenko L.A., On the Production of an Aqueous Colloidal Solution of Fullerenes // Journal ofthe Chemical Society, Chemical Communications. - 1995. -Vol. 12.-P. 1281-1282

Рис. 1 Рентгенограмма лиофильно высушенных частиц суспензии раздробленного кристаллического

фуллерена (1) и модифицированного водного мицеллярного раствора фуллерена(2)

вследствие укрупнения мелких частиц фотосенсибилизатора в вязких биологических средах.

В связи с этим было предложено создать фотосенсибилизаторы на основе фуллеренсодержащих покрытий. Такие структуры не подвержены агрегации в процессе фотодинамического воздействия в вязких биологических средах. Были разработаны фуллеренсодержащие покрытия на пластинах. Однако при использовании пластин с покрытием фуллерена в биологических экспериментах наблюдалась невысокая степень инактивации вируса. По всей видимости, это может объясняться незначительной площадью поверхности, содержащей фуллерен.

С целью увеличения рабочей площади поверхности твердофазных сенсибилизаторов был предложен и разработан способ нанесения покрытия из фуллерена на частицы силикагеля. В качестве матрицы был выбран микропористый силикагель марки КСК отечественного производства. Методом элементного анализа на содержание углерода было установлено, что покрытие из фуллерена на частицах силикагеля составляет в среднем 3-4 % вес. к весу всей композиции.

Полученные фуллеренсодержащие поверхности, в первую очередь микрочастицы силикагеля с нанесенным на них фуллереном, наилучшим образом соответствуют сформулированным нами характеристикам оптимального фотосенсибилизатора по совокупности параметров хорошей смачиваемости водными средами, простоты получения и воспроизводимости физико-химических свойств. Кроме того, по результатам спектрального анализа показано, что во всех разработанных композициях фуллерен находится в агрегированном виде.

Третья глава. Генерация синглетного кислорода твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллерена

В настоящей главе описаны результаты обнаружения синглетного кислорода, образованного в результате облучения твердофазных фуллеренсодержащих фотосенсибилизаторов в водной среде. Изучение эффективности генерации синглетного кислорода одновременно позволяет качественно судить об образовании триплетного возбужденного состояния фуллерена, а также сделать выводы о потенциальных возможностях исследуемых композиций в качестве фотосенсибилизаторов для инактивации вирусов в модельной водной среде, не содержащей элекронодонорных соединений.

Прежде всего, по наблюдению люминесценции синглетного кислорода на длине волны 1270 нм было установлено образование синглетного кислорода в суспензиях фуллеренсодержащих микрочастиц («аморфный» фуллерен, раздробленный кристалличсскии фуллерен и силикагель, покрытый фуллереном), и на поверхности покрытий фуллерена на стеклянной/кварцевой

подложке. Было определено время жизни синглетного кислорода в воде (2-3 мкс) и тяжелой воде (43 мкс). На примере облучения суспензии микрокристаллического фуллерена было показано, что интенсивность люминесценции прямо пропорциональна интенсивности возбуждающего импульса.

Однако оказалось, что определению количества образуемого кислорода люминесцентным методом мешают многочисленные систематические ошибки, поэтому было предложено обратиться к высоко чувствительному фотохимическому методу количественного определения '02 в водных средах, предложенному Kraljic and Mohsni1. В качестве «ловушки» синглетного кислорода в этом методе выступает аминокислота - гистидин, в качестве индикатора синглетного кислорода - п-нитрозодиметиланилин (RNO), характеризующийся интенсивной полосой поглощения с максимумом Агп = 440 нм и полушириной Aai/2(FWHM) = 75 нм. При реакциях, протекающих по такой схеме, падение оптической плотности раствора, регистрируемой на длине волны 440 нм, AD(440) < 0, должно быть прямо пропорционально увеличению концентрации синглетного кислорода, наработанного за время наблюдения.

Поскольку выбранный нами метод был первоначально разработан для растворов, то при применении его к твердофазным сенсибилизаторам были учтены некоторые дополнительные факторы: возможная сорбция молекул RNO на твердофазном образце, его нагрев в процессе облучения и связанная с ним термодесорбция RNO обратно в раствор, оседание образца в процессе облучения. Была создана установка непрерывного измерения изменения оптической плотности раствора (рис 2).

Запись сигналов велась на компьютере с использованием двухканальной осциллографической приставки в режиме самописца. Отношение амплитуд Imax/Iomax этих ДВУХ сигналов выражало собой зависимость пропускания системы от времени T(t). Начальный участок (первые 1-3 минуты) аппроксимации этой зависимости позволяет рассчитать скорость уменьшения оптической плотности раствора, связанного с наработкой синглетного кислорода:

AD/At = -lg[T(t+At)/T(t)]/At. (1)

Дополнительный контроль результатов осуществлялся сравнением спектров пропускания смесей до и после облучения, записываемых независимо на спектрофотометре в каждом опыте.

1 Kraljic I., Mohsni S.Et.. A New Method for the Detection of Singlet Oxygen in Aqueous Solutions // Photochemistry and Photcbiclogy. - 1978,- Vol. 28. - P. 577-581.

Количественное определение абсолютного значения концентрации синглетного кислорода для исследуемых фотосенсибилизаторов было предложено выполнить путем сравнения получаемых значений АБ/Д1 с величиной этого эффекта в растворе эталонного сенсибилизатора, для которого квантовый выход синглетного кислорода хорошо известен. В опытах в качестве эталонного сенсибилизатора был использован краситель метиленовый синий.

ро

____„

Си

Рис. 2, Экспериментальная установка по наблюдению наработки синглетного кислорода в водном растворе фотохимическим методом. Си - источник возбуждающего излучения (510 и 578 нм с соотношением интенсивностей 3:2; 15 кГц; 1 Вт/см"); LI, L2 - линзы; РР - плоско-параллельные пластины; М -зеркало; He-Cd -источник зондирующего излучения (441.5 нм; < lmW); MOD - частотный модулятор; SC - образец; D1 - детектор опорного излучения; D2 - детектор прошедшего излучения; PD - измеритель мощности

Расчет абсолютного значения стационарной концентрации синглетного кислорода п['02] был выполнен для раствора метиленового синего по формуле: п[102]=па[Ьу]-Ф(102)-т(102), (2)

где na[hv] - количество квантов возбуждающего излучения, поглощенных единицей объема вещества в единицу времени; ф(]02) - интегральный квантовый выход генерации синглетного кислорода исследуемым фотосенсибилизатором; т^'Ог) - время жизни синглетного кислорода в среде.

Концентрация поглощенных квантов с учетом поглощения в толстом слое вещества определялась по формуле:

n.[hv] = ^ jl(X)■ (1 -е™)-Xdkt (3),

где 1(А,) - распределение интенсивности в спектре возбуждающего светодиода; D(A.) - спектр оптической плотности сантиметрового слоя раствора; Н - высота столба обличаемой жидкости.

Для расчета было принято эффективное время жизни синглетного кислорода с учетом присутствия в растворе гистидина - т = 1.2 мкс; интегральный квантовый выход генерации синглетного кислорода метиленовым синим в воде в диапазоне длин волн 550-700 нм - 0.52.

Рассчитанное значение п['Ог] соответствует полученной из опыта величине скорости изменения оптической плотности АБ(440)/А1 раствора метиленового синего. Концентрации синглетного кислорода в других образцах определены по измеренным скоростям Л0(440)/Д1 пропорционально этому соответствию.

Опираясь на экспериментальные данные (таблица 1), была построена зависимость стационарной концентрации синглетного кислорода, приведенной к плотности мощности 100 мВт/см2 , от эффективной концентрации фуллерена (рисунок 3). Точки соответствуют изученным фуллеренсодержащим образцам. Кроме того, для облегчения сравнения сенсибилизирующих свойств исследуемых композиций была введена удельная величина ['02], которая представляет собой отношение стационарной концентрации синглетного кислорода к средней концентрации фотосенсибилизатора в растворе.

Таблица 1.

Результаты измерений стационарной концентрации синглетного кислорода ['СЬ], фотосенсибилизированного в водной среде исследуемыми системами, при I" мВт/см2.

№ Фотосенсибилизатор Средняя концентрация, ío'W ['02], 10-см"3 Удельная Г'сухю8

1 Теоретическое значение для мономера Сбо 8.40 1200.0 142.86

2 Раздробленные кристаллы С6о 2.50 1.9 0.76

3 Частицы «аморфного» Сбо 12.00 12.0 1.00

4 Микрочастицы силикагеля с Сбо 8.40 9.5 1.13

5 Вакуумное напыление Ceo на кварцевой пластинке, L = 5 нм 0.09 0.0 -

6 Вакуумное напыление Сбо на кварцевой пластинке, L = 77.5 нм 1.70 1.5 0.88

7 Вакуумное напыление Сбо на кварцевой пластинке, L = 1350 нм 25.00 15.0 0.60

На этом же графике была отложена кривая (пунктир), полученная расчетом по формулам (2) и (3) в предположении, что фуллерен находится в воде в виде мономеров. Учитывая

нерастворимость С60 в воде, такая идеальная ситуация была нами названа псевдораствор фуллерена. Сенсибилизирующая способность молекул Сбо в псевдорастворе показывает максимальные возможности фуллерена как генератора синглетного кислорода в водной среде. Для расчета взято сечение поглощения фуллерена, полученное из спектров растворов в ССЦ, и время жизни синглетного

Сравнение экспериментальной и теоретической кривых показало, что:

• введение понятия средней концентрации сенсибилизатора и применение ее при анализе эффективности генерации синглетного кислорода приводит к теоретически описываемой форме концентрационной зависимости;

• обнаружение синглетного кислорода, сенсибилизированного твердофазными фуллеренсодержащими композициями, свидетельствует об образовании достаточно долгоживущего триплетного возбужденного состояния агрегированного фуллерена;

• чем больше фуллерена в системе, тем больше концентрация получаемого синглетного кислорода;

• количество синглетного кислорода, вырабатываемое твердофазными фуллерен-содержащими фотосенсибилизаторами в воде приблизительно на два порядка меньше, чем то количество, которое могли бы производить отдельные молекулы фуллерена (псевдораствор).

• перспектива увеличения эффективности генерации синглетного кислорода твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллеренов предполагает стремление к получению твердофазных композиций с

Рис. 3. Зависимость стационарной концентрации синглетного кислорода от средней концентрации фотосенсибилизатора в водной системе. □ -вакуумное напыление разной толщины; ♦ -суспензия раздробленного кристаллического фуллерена; • - суспензия «аморфного» фуллерена; о - суспензия микрочастиц силикагеля, покрытых фуллереном. Пунктирная линия соответствует псевдораствору фуллерена.

кислорода, характерное для водной среды.

поверхностным монослоем фуллерена, содержащим С&о в неагрегированном состоянии.

Анализ удельных значений ['СУ дополнительно показал, что:

1. использование вакуумно-напыленных покрытий Сб0 с толщинами 1350 нм и 5 нм и частиц нераздробленного кристаллического фуллерена в качестве фотосенсибилизаторов синглетного кислорода нецелесообразно;

2. оптимальная толщина слоя агрегированного фуллерена, обеспечивающая эффективное возбуждение молекул сенсибилизатора, составляет приблизительно от 30 до 300 нм;

3. агрегаты фуллерена, подобные с точки зрения их структурных особенностей, в различных твердофазных сенсибилизаторах обладают практически одинаковой эффективностью образования синглетного кислорода.

Сходство фотосенсибилизирующих свойств твердофазных фуллереновых композиций (2-4, 6 в таблице 1), на наш взгляд, не является случайным совпадением, а определяется сходством их структурных и физических особенностей. В самом деле, всс рассматриваемые здесь покрытия и частицы отличаются единством состава: они содержат только Сбо, находящийся в агрегированном виде. На рисунке 4 представлены спектры всех четырех композиций в сравнении со спектром фуллерена в растворе ССЦ. Анализ спектров показывает, что эти твердофазные композиции характеризуются схожей степенью агрегации фуллерена. То же самое справедливо и в отношении толщин покрытий и размеров частиц. На наш взгляд, это величины

одного порядка, причем отвечающие условиям

оптимального возбуждения фуллерена: толщина покрытия, полученного вакуумным

напылением фуллерена на кварце, в данном случае составляет 77.5 нм; диаметр агрегата «аморфного»

фуллерена равен 20-30 нм, с учетом возможной агломерации - около 100 нм; толщина агрегатов Сбо на поверхности силикагеля по нашим теоретическим расчетам (при равномерном распределении фуллерена по поверхности) может составлять до 50 нм; средний размер частиц раздробленного

D 32-

—I-1-1—

300 400

500 600 700 X, НМ

Рис. 4. Спектры поглощения фуллерена в твердофазных фуллерен-содержащих системах сравнительно со спектром раствора фуллерена. 1 -суспензия аморфного фуллерена; 2 - суспензия раздробленного кристаллического фуллерена; 3 -

гт tt(»fvmjri* *

4 - вакуумное напыление на кварце, L = 77.5 нм; 5- раствор Сбо в CCU

кристаллического фуллерена приблизительно равен 300 нм. Небольшие отличия в величине удельной стационарной концентрации синглетного кислорода для этих фотосенсибилизаторов, на наш взгляд, могут объяснятся несколько различной величиной удельной поверхности и степени ее дефектности, что отражается на концентрации поверхностных локализованных экситонов, по-видимому, обуславливающих процесс генерации синглетного кислорода.

Кроме того, нами было проведено сравнение количества полученного синглетного кислорода при замене среды с Н20 на 020 при прочих равных условиях, которое подтвердило факт образования синглетного кислорода в реакционной смеси. Действительно, время жизни синглетного кислорода в Н20 (2-3 мкс) с учетом тушения синглетного состояния 02 гистидином по нашим оценкам составляет Т) = 1.2 мкс, а в БгО (43 мкс) уменьшается за счет гистидина до т2 = 1.9 мкс, следовательно, использование 020 вместо Н20 должно привести к увеличению эффекта в т2/т! = 1.58 раза, что хорошо согласуется с полученными экспериментальными данными и не зависит от концентрации С6о (таблица 2).

Таблица 2.

Изменение стационарной концентрации синглетного кислорода, образованного

Эффективная концентрация Сбо, мг/мл [102](D20)/['02KH20)

3.27 1.58

1.63 1.68

Поскольку, как упоминалось ранее, в водной среде, не содержащей электронодонорных соединений, возбужденный С60 будет способствовать образованию только синглетного кислорода, то изучение эффективности генерации '02 поможет оценить потенциальные возможности исследуемой композиции в качестве фотосенсибилизатора для инактивации вирусов в такой модельной среде.

Проведенные нами расчеты учитывали экспериментальные условия, отвечающие реальному процессу эффективной фотодинамической инактивации вирусов: облучение видимым диапазоном спектра с плотностью мощности 100 мВт/см2, концентрация фуллерена - 2.7 мг/мл (соответствует условиям полученной нами полной инакцивации вирусов гриппа частицами силикагеля с нанесенным на них фуллереном), концентрация метиленового синего - 3.7-104 мг/мл (соответствует стандартной процедуре «Терафлекс» фирмы MacoPharma, Франция). Расчеты показали, что в данных условиях величина стационарной концентрации синглетного кислорода, нарабатываемой в водной среде твердофазным фотосенсибилизатором на основе фуллерена, (2.6-Ю10 см*3) не уступает и даже превышает упомянутую величину для метиленового синего (0.6-1010 см"3), используемого трансфузиологами в настоящее время. Таким

образом, мы можем предположить, что сенсибилизирующей способности фуллерена, нанесенного на микрочастицы силикагеля, достаточно для проведения эффективного технологического процесса инактивации вирусов в водной среде, не содержащей электронодонорных соединений.

Наилучшей среди исследованных композиций с точки зрения создания высокой стационарной концентрации синглетного кислорода в процессе фотодинамической инактивации вирусов была признана твердофазная композиция, представляющая собой частицы силикагеля с нанесенным на них фуллереном.

Четвертая глава. Изучение фотостабильности твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов

В настоящей главе была изучена фотостабильность покрытий фуллерена на стеклянных пластинах и микрочастицах силикагеля по сравнению с эталонным фотосенсибилизатором (метиленовым синим). Для выяснения возможных механизмов убыли фуллерена при облучении твердофазные покрытия были исследованы как в водной среде, так и на воздухе. Интенсивность, спектральный состав и максимальная длительность облучения были выбраны из условия соответствия параметрам облучения, применявшемся нами при экспериментальном моделировании реального технологического процесса инактивации вирусов твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллеренов.

Фотостабильность определялась двумя способами:

1. по изменению спектров поглощения суспензии или раствора фотосенсибилизатора в Н20 в результате облучения;

2. по изменению эффективности генерации синглетного кислорода ('Д 02) в результате предварительного облучения фотосенсибилизатора.

Анализ полученных результатов показал, что при длительном (2-3 часа) облучении интенсивным (100 мВт/см2) источником видимого диапазона фуллереновые покрытия в воде более фотостабильны, чем раствор метиленового синего. Об этом свидетельствуют как данные измерения спектров поглощения (рис. 5), так и результаты регистрации эффективности образования синглетного кислорода. Кроме того, наблюдается корреляция хода зависимости изменения спектра поглощения при облучении с ходом зависимости снижения сенсибилизирующей способности при тех же условиях для каждого из фотосенсибилизаторов.

Фотодеградация фуллеренового покрытия происходит только в приповерхностном слое, что является причиной несоответствия абсолютных значений изменений эффективности генерации синглетного кислорода фуллереном, нанесенным на микрочастицы силикагеля, (~ 30% за 2 часа) и убыли фуллерена, наблюдаемой но спектру (~ 5% за 2 часа).

Несмотря на то, что фотостабильность фуллереновых покрытий, как оказалось, не зависит от среды, механизмы убыли фуллерена в составе покрытий на воздухе и в воде различны: предположительный превалирующий механизм убыли фуллерена на воздухе - окисление, в воде -фотополимеризация.

Высокая

фотостабильность покрытий фуллерена С60 как в водной, так и в газовой среде обуславливает перспективность их

применения в

фотодинамической терапии.

1, мин

Рис. 5. Относительное уменьшение концентрации фотосенсибилизаторов в зависимости от времени облучения: • - суспензия микрочастиц силикагеля с фуллереновым покрытием, о - раствор метиленового синего.

Пятая глава. Изучение принципиальных возможностей твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов для фотодинамической инактивации вирусов in vitro

В настоящей главе приводятся экспериментальные доказательства тропности агрегированного фуллерена к оболочечным вирусам и эффективной инактивации оболочечных вирусов in vitro (в физиологическом растворе и реальной биологической жидкости - аллантоисной жидкости куриного эмбриона) твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллеренов. Кроме того, выполнен окончательный выбор оптимального твердофазного фотосенсибилизатора на основе фуллерена в соответствии с основным требованиям, предъявляемым нами к твердофазным фотосенсибилизаторам, пригодным к использованию в установках по очистке плазмы и препаратов плазмы крови.

Работа по инактивации оболочечных вирусов in vitro была проведена в НИИ Гриппа РАМН совместно коллективом ФГУП «НПК «ГОИ им. С.И. Вавилова», НИИ Гриппа РАМН и Институтом экспериментальной медицины РАМН с участием автора в части изготовления твердофазных фотосенсибилизаторов и анализа результатов.

Проведенные эксперименты показали зависимость наблюдаемых процессов инактивации оболочечных вирусов (например, см. рис. 6) от концентраций фуллерена и кислорода, а также дозы освещения. Таким образом,

деструктивное действие твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов было связано с образованием активных форм кислорода, прежде всего синглетного кислорода.

Полученные твердофазные композиции, представляющие собой

частицы силикагеля с нанесенным на них слоем фуллерена, представляются оптимальной композицией, т.к. отличаются высокой прочностью нанесенного слоя, воспроизводимостью свойств независимо от партии получения, хорошей смачиваемостью в воде, кроме того, характеризуются высокой эффективностью генерации синглетного кислорода и инактивации оболочечных вирусов, а также удобством при работе с ними и при извлечении их из вязких биологических жидкостей.

о-1--1-,-1-,-,-,-,-,-,-г

0 1 2 3 4 :

Время облучения, час

Рис.6. Инактивация вируса гриппа (А/Р11/8/34 (Н0>11)) в физиологическом растворе. Фотосепсибилизатор - фуллерен, нанесенный на частицы силикагеля. Содержание фуллерена -1.8 мг/мл, удельная интенсивность облучения - 82 мВт/см3. Облучение -100 мВт/см2 в диапазоне длин волн 400-850 нм. Погрешность определения инфекционного титра вируса - 0.5

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Разработаны твердофазные фотосенсибилизаторы на основе фуллерена для генерации синглетного кислорода в водных, в том числе биологических, средах. Показано, что твердофазные фотосенсибилизаторы, представляющие собой микрочастицы силикагеля с нанесенным на них фуллереном Сбо, обладают рядом положительных свойств: простотой получения, воспроизводимостью физико-химических свойств, хорошей смачиваемостью водными средами, большой активной поверхностью, фотостабилыюстью, технологичностью практического использования в процессах инактивации вирусов. Главное преимущество таких твердофазных систем — возможность извлечения фотосенсибилизатора из биологической среды после фотодинамического воздействия.

2. Разработана фотохимическая методика обнаружения синглетного кислорода, с помощью которой впервые удалось измерить концентрацию 'От, генерируемого твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллеренов в водных системах и выявить существенное влияние агрегации молекул фуллеренов на генерацию синглетного кислорода для всех фуллеренсодержащих структур.

3. На основании результатов изучения генерации синглетного кислорода проведено сопоставление стационарных концентраций 'Оя, создаваемых суспензией микрочастиц силикагеля с нанесенным на них фуллереном и раствором метиленового синего. Показано, что сенсибилизирующей способности фуллерена, нанесенного на микрочастицы силикагеля, достаточно для проведения эффективного технологического процесса инактивации вирусов в модельной водной среде, не содержащей электронодонорных соединений.

4. В ходе биологических экспериментов показано, что твердофазные фотосенсибилизаторы на основе фуллеренов за счет образования 'Ог, эффективно инактивировуют оболочечные вирусы в водной среде, не содержащей электронодонорных соединений. Такие сенсибилизаторы проявляют высокую способность к инактивации вирусов гриппа в биологических жидкостях, обладающих высокой вязкостью.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белоусов В.П., Белоусова И.М., Крисько А.В., Крисько Т.К., Муравьева Т.Д., Сироткин А.К.. Водный мицеллярный раствор Cgo' получение, некоторые свойства и способность к генерации синглетного кислорода // Журнал общей химии. - 2006. - Т. 76, № 2. - С. 265-272.

2. Belousova I.M., Danilov О.В., Kiselev V.M., Kislyakov I.M., Kris'ko Т.К., Murav'eva T.D., Videnichev D.A. Solid-phase Fullerene-like Nanostructures as Singlet Oxygen Photosensitizers in Liquid Media // SPIE. Proceedings. - 2007, Vol. 6613, P. 66130C-1 - 66130C-12.

3. Zarubaev V.V., Belousova I.M., Kiselev O.I., Piotrovsky L.B., Anfimov P.M., Krisko T.C., Muraviova T.D., Rylkov V.V., Starodubcev A.M., Sirotkin A.C. Photodynamic Inactivation of Influenza Virus with Fullerene C6o Suspension in Allantoic Fluid // Photodiagnosis and Photodynamic therapy. - 2007. - Vol. 4. -P. 31-35.

4. Sirotkin A.K., Zarubaev V.V., Poznyakova L.N., Dumpis M.A., Muravieva T.D., Krisko Т.К., Belousova I.M., Kiselev O.I., Piotrovsky L.B. Pristine Fullerene C60: Different Water Soluble Forms - Different Mechanisms of Biological Action // Fullerene, Nanotubes and Carbon Nanostructures. - 2006. -Vol. 14,No 2-3.-P. 327-333

5. Багров И.В., Белоусова И.М., Ермаков A.B., Киселев В.М., Кисляков И.М., Крисько Т.К., Муравьева Т.Д. Фотостабильность покрытия фуллерена Сбо как твердофазного фотосенсибилизатора синглетного кислорода // Оптика и спектроскопия. - 2008. - Т. 105, № 5. - С. 787-793.

6. Белоусова И. М., Белоусов В.П., Киселев В.М., Муравьева Т.Д., Кисляков И.М., Сироткин А.К., Стародубцев A.M., Крисько Т.К., Багров И.В., Ермаков А.В. Структурные и оптические свойства твердофазных фотосенсибилизаторов синглетного кислорода на основе водных суспензий фуллерена // Оптика и спектроскопия. - 2008. - Т. 105, № 5. -777-786.

Подписано в печать 15.12.2008г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ № 1017.

Отпечатано в ООО «Издательство "ЛЕМА"»

199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д.24, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.lemaprint.ru

Введение

Глава 1. Фуллерен и фото динамическая инактивация вирусов

1.1. Фотосенсибилизируемые реакции

1.2. Фотодинамическая терапия, активные формы кислорода

1.3. Инактивация вирусов в плазме и препаратах плазмы крови

1.4. Фотосенсибилизаторы: фуллерен или красители

1.5. Функционализированные фуллерены

1.6. Особенности применения твердофазных фотосенсибилизаторов

1.7. Влияние степени агрегации молекул фуллерена на времена жизни уровней Т1 и

1.8. Влияние агрегации молекул фуллерена на генерацию активных форм кислорода

1.8.1. Снижение квантового выхода синглетного кислорода при агрегации молекул фуллерена

1.8.2. Образование радикалов фуллерена

1.9. Выводы

Глава 2. Разработка и получение твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов. Изучение их структурных свойств

2.1. Введение

2.2. Методическая часть

2.3. Электронные спектры поглощения фуллеренов и агрегация

2.4. Получение и структурные свойства суспензии раздробленного кристаллического фуллерена в воде

2.5. Получение и структурные свойства водной суспензии «аморфного» фуллерена

2.6. Покрытия на основе фуллеренов на плоских поверхностях

2.7. Фуллерены, нанесенные на микрочастицы силикагеля

2.8. Выводы

Глава 3. Генерация синглетного кислорода твердофазными фотосенсибшшзаторами на основе фуллерена

3.1. Введение

3.2. Методы обнаружения синглетного кислорода

3.3. Импульсная люминесценция

3.4. Выбор химического метода обнаружения 'Ог

3.5. Модификация фотохимического метода определения синглетного кислорода. Экспериментальная установка

3.6. Метод расчета стационарной концентрации синглетного кислорода с помощью эталонного фото сенсибилизатор а

3.7. Генерация синглетного кислорода твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллеренов

3.8. Анализ удельных величин стационарной концентрации синглетного кислорода

3.9. Потенциальные возможности фуллерена, нанесенного на микрочастицы силикагеля, в качестве фотосенсибилизатора синглетного кислорода в модельной водной среде, не содержащей электронодонорных соединений

3.10. Выводы

Глава 4. Изучение фотостабильности фуллереновых покрытий в составе твердофазных фотосенсибилизаторов синглетного кислорода

4.1. Введение

4.2. Методическая часть

4.3. Результаты и обсуждение

4.4. Выводы

Глава 5. Изучение принципиальных возможностей твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов для фото динамической инактивации вирусов in vitro

5.1. Введение

5.2. Сродство фуллерена к вирусу

5.3. Фотодинамическая инактивация вирусов немодифицированными фуллеренами в модельных водных системах

5.4. Особенности инактивации вирусов в реальных биологических жидкостях

5.5. Выводы 135 Выбор твердофазного фотосенсибилизатора на основе фуллеренов для фотодинамической инактивации вирусов биологических жидкостях 136 Выводы 140 Заключение 142 Литература 143 Приложение 1. Методическая часть к биологическим экспериментам по инактивации вирусов твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллеренов

A. Приготовление вирус содержащей жидкости и определение степени ее инфекционности 155 Б. Морфологические исследования (просвечивающая электронная микроскопия)

B. Изучение принципиальной возможности инактивации обол очечных вирусов фуллеренами в модельных системах

Г. Изучение динамики инактивации вирусов гриппа твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллеренов 160 Приложение 2. Экспериментальное определение условий полной инактивации вирусов гриппа фуллереном, нанесенным на микрочастицы силикагеля, в аллантоисной жидкости куриного эмбриона

Исследование различных фотосенсибилизаторов и условий протекания фото сенсибилизируемых химических реакций является традиционным научным направлением, разрабатываемым в ГОИ им. С.И. Вавилова в течение нескольких десятилетий. Научная школа ГОИ в этой области знаний связана, в первую очередь, с именами таких академиков, как И. С. Вавилов и А.Н. Теренин.

Известно, что фотосенсибилизиация применяется в различных типах фотохимических реакций (фотоприсоединение, фотополимеризация и др.), причем решение общей задачи нахождения оптимального фотосенсибилизатора невозможно. Наоборот, в каждом случае необходимо решать конкретную задачу, учитывающую тип фотохимической реакции, среду, в которой проходит соответствующая реакция, и предполагаемую область приложения реакции. В настоящей работе рассматривается вопрос использования фотосенсибилизатора для возбуждения синглетного кислорода, который в настоящее время находит широкое применение, например, в лазерной технике - для возбуждения йода в газовых лазерах, а также в биологии и медицине - для окисления органических соединений.

Одним из актуальных применений реакции фотосенсибилизированного окисления органических соединений является метод фотодинамической инактивации болезнетворных организмов (вирусы, бактерии, простейшие и т.д.) в донорской крови и продуктах крови. В числе инфекционных агентов, контаминирующих кровь и препараты крови, достаточно упомянуть особо опасные вирусы иммунодефицита человека, гепатитов В и С, цитомегаловирус человека и др. [1, 2]. Роль этих агентов в структуре инфекционной патологии человека в последнее десятилетие возрастает в связи с изменением образа жизни, экологической обстановки и, кроме того, естественного процесса вирусной эволюции в человеческой популяции.

В настоящее время доноры, как и препараты крови, проходят многоступенчатый и дорогостоящий контроль на отсутствие вирусной контаминации. В связи с этим разработка доступных методик инактивации плазмы донорской крови и препаратов крови могла бы стать важным шагом к обеспечению безопасности процедуры гемотрансфузии. Обработка типа ультрафиолетового облучения вызывает повреждение терапевтических компонентов крови, поэтому для инактивации патогенов необходимы иные, более специфические, подходы.

Ранее было показано, что оболочечные вирусы могут быть эффективно инактивированы соединениями, производящими активные формы кислорода, среди которых красители являются наиболее заметным и широко используемым типом веществ. Способность к инактивации вирусов была описана для красителей различной химической природы, в частности, фталоцианинов, мероцианинов, производных порфирина, тиазинов, оксазинов, и некоторых других [3].

Благодаря преимущественному воздействию на вирусы, а не на компоненты биологической жидкости, метод фотодинамической инактивации вирусов, на наш взгляд, является оптимальным для целей очистки плазмы и препаратов плазмы крови. Однако, несмотря на все преимущества этого метода, использование фотосенсибилизаторов на основе красителей имеет ряд существенных недостатков, ограничивающих применение этого метода инактивации.

Недостаток, присущий большинству красителей - их растворимость в водных средах, которая приводит к загрязнению целевых продуктов инактивации следами используемого красителя. По нашему мнению, эта ситуация не отвечает современным требованиям, предъявляемым к лечебным препаратам, поскольку большинство красителей обладает свойствами цито- и генотоксичности [4]. Дополнительным недостатком является низкая стабильность красителей при освещении, что может приводить к появлению продуктов фото деструкции [5].

В связи с вышесказанным, при использовании таких водорастворимых красителей, остро стоит проблема удаления нежелательных и вредных примесей из биологических жидкостей после процесса фотодинамического воздействия. Это требует разработки методов селективной фильтрации таких веществ из вязких растворов, например плазмы, а, следовательно, разработки специальных фильтров, обеспечивающих полное удаление примесей [6]. Однако, учитывая масштабность потребности современной медицины в плазме донорской крови и белковых препаратах плазмы, создание и использование таких селективных фильтров неминуемо приведет к снижению объемов обрабатываемых целевых продуктов.

Проблематичность использования процесса инактивации плазмы и препаратов плазмы донорской крови с помощью красителей становится тем более очевидной при множественной трансфузии (в связи с неминуемым накоплением токсичных веществ у реципиента) и при очистке белковых препаратов из плазмы крови (в связи с проведением процесса в больших объемах, делающих нецелесообразным применение селективных фильтров).

Облегчить задачу применения метода фотодинамической инактивации вирусов в препаратах плазмы крови и плазме крови для множественной трансфузии позволит создание нового класса фотостабильных фотосенсибилизаторов твердофазного типа, обеспечивающих получение целевых продуктов, гарантированно свободных от вредных и нежелательных примесей.

Новые возможности для современных методов фотодинамической инактивации вирусов в плазме и препаратах плазмы крови открывает применение фуллеренов в качестве эффективных фотосенсибилизаторов для образования синглетного кислорода. В настоящее время фуллерены стали объектом активных исследований в различных областях науки и техники. Необычайные свойства этого класса соединений вызвали значительный интерес к их применению в качестве биологически и фармакологически активных веществ. Кроме того, твердофазные фотосенсибилизаторы на основе фуллерена нерастворимы в воде и при необходимости могут быть легко удалены из водной среды.

Однако, получение твердофазной композиции, содержащей мономеры немодифицированного фуллерена, представляется достаточно сложной задачей. В свою очередь агрегация фуллерена в композиции может повлиять на эффективность генерации активных форм кислорода, в том числе синглетного кислорода. Дополнительная трудность проведения процесса сенсибилизированного окисления в водных средах состоит в коротком времени жизни синглетного кислорода в воде по сравнению с органическими растворителями и тем более с вакуумом. Благодаря этому обстоятельству исследователям ранее не удавалось зафиксировать образование синглетного кислорода в воде при участии высоко агрегированного фуллерена.

Высокая сенсибилизирующая способность твердофазного фотосенсибилизатора на основе фуллерена является только необходимым, но недостаточным условием проведения эффективного технологического процесса селективной инактивации вирусов. Помимо вопросов обеспечения сродства твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов к вирусу и их фотостабильности может возникнуть проблема, связанная с обеспечением высокой вероятности контакта фуллерена с кислородом и вирусом в водной среде, особенно в вязкой биологической жидкости, каковой является плазма крови.

Таким образом, настоящая работа посвящена созданию новых твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов, обладающих способностью генерировать синглетный кислород в водных средах, селективно воздействовать на вирусы и быть фотостабильными и легко извлекаемыми из биологических жидкостей после процедуры фотовоздействия.

Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, заключения, списка литературы и трех приложений.

Выводы

• Разработаны фотостабильные твердофазные фотосенсибилизаторы на основе фуллерена для генерации синглетного кислорода в водных, в том числе биологических, средах. Главное преимущество таких твердофазных систем - возможность проведения фотодинамического процесса в гетерофазных условиях, что облегчает извлечение фотосенсибилизатора из биологической среды после фотодинамического воздействия.

• Разработана фотохимическая методика обнаружения синглетного кислорода, с помощью которой впервые удалось измерить концентрацию 'Ог, генерируемого твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллеренов в водных системах, и выявить существенное влияние агрегации молекул фуллеренов на генерацию синглетного кислорода для всех фуллеренсодержащих структур.

• Обнаружено, что агрегаты фуллерена, подобные с точки зрения их линейных размеров, в различных твердофазных сенсибилизаторах обладают практически одинаковой эффективностью образования синглетного кислорода.

• На основании результатов изучения генерации синглетного кислорода и теоретического расчета показано, что сенсибилизирующей способности фуллерена, нанесенного на микрочастицы силикагеля, может быть достаточно для проведения эффективного технологического процесса инактивации вирусов в водной среде, не содержащей электронодонорных соединений.

• В ходе биологических экспериментов показано, что твердофазные фотосенсибилизаторы на основе фуллеренов, помещенные в водный раствор неорганических солей, эффективно инактивируют оболочечные вирусы за счет образования 102,. Такие фотосенсибилизаторы также проявляют высокую способность к инактивации вирусов гриппа в биологических жидкостях, обладающих высокой вязкостью.

• По результатам исследований твердофазный фотосенсибилизатор, представляющий собой микрочастицы силикагеля с нанесенным на них фуллереном Сбо, может быть рекомендован в качестве фотосенсибилизатора активных форм кислорода (и в частности, синглетного кислорода) для разработки отечественного способа фотодинамической инактивации вирусов в плазме и препаратах плазмы крови

Заключение

Проведенные исследования показывают возможность создания твердофазного фотосенсибилизатора синглетного кислорода на основе фуллерена. Полученные результаты могут послужить основой для использования твердофазных фотосенсибилизаторов в процессах фотодинамической инактивации гемотрасмиссивных инфекций в плазме донорской крови и препаратах на ее основе.

Автор выражает благодарность проф., д.ф.-м.н. Белоусовой И.М. и к.х.н. Муравьевой Т.Д. за руководство работой, проф. Данилову О.Б. за содействие в проведении исследований, сотрудникам «Института лазерной физики» ФГУП «НПК «ГОИ им. С.И. Вавилова», НИИ Гриппа РАМН, Института экспериментальной медицины РАМН, НПО «Буревестник» и Института высокомолекулярных соединений РАН, принимавших участие в совместных экспериментальных исследованиях, за плодотворное сотрудничество.

1. Mohr Н. 1.activation of Viruses in Human Plasma // Methods in Enzymology. -2000.-Vol. 319. - P. 207-216.

2. Ender A., Schmitt U.M., Endres W., Luz В., Sugg U. Screening of Blood Donations for HIV-1 and HCV RNA by Transcription-Mediated Amplification Assay: One Year Experience // Transfusion Medicine and Hemotherapy. 2004. -Vol. 31.-P. 10-17.

3. Wainwright M. The Emerging Chemistry of Blood Product Disinfection // Chemical Society Reviews. 2002. - Vol. 31. - P. 128-136.

4. Kasermann F., Kempf C. Photodynamic Inactivation of Enveloped Viruses by Buckminsterfullerene // Antiviral Research. 1997. - Vol. 34. - P. 65-70.

5. Пиотровский Л.Б., Белоусова И.М., Данилов О.Б., Киселев О.И. Фуллерены: фотодинамические процессы и новые подходы в медицине. -СПб: Роза мира, 2005 139 с.

6. Mop X.; Ламбрехт Б. Способ инактивации вирусов в крови и ее компонентах: Патент RU2036235 от 1992.03.1.

7. Введение в фотохимию органических соединений / Под ред. Г. О. Беккера. -Л: Химия, 1976.-384 с.

8. Экспериментальные методы химической кинетики. Фотохимия: Учебное пособие / М.Я. Мельникова, В.Л. Иванов. М.: Изд-во Московского Университета, 2004. - 125 с.

9. Теренин А.Н. Фотоника молекул красителей и родственных органических соединений. Л.: Наука, 1967. - 616 с.

10. Levy J.G., Obochi М. New Applications in Photodynamic Therapy. Introduction // Photochemistry and Photobiology. 1996. - Vol. 64. - P. 737-739.

11. Trauner K.B., Hasan T. Photodynamic Treatment of Rheumatoid and Inflammatory Arthritis // Photochemistry and Photobiology. 1996. - Vol. 64. -P. 740-750.

12. Taylor P.W., Stapleton P.D., Paul Luzio J. New Ways to Treat Bacterial Infections // Drug Discovery Today. 2002. - Vol. 7. - P. 1086-1091.

13. Foote C.S. Photosensitized Oxidation and Singlet Oxygen: Consequences in Biological Systems // Free Radicals in Biology / edited by W.A. Pryor. New York: Academic Press, 1976. - Vol. 2. - P. 85-133.

14. Davila J., Harriman A. Photosensitized Oxidation of Biomaterials and Related Model Compounds // Photochemistry and Photobiology. 1989. - Vol. 50. - P. 29-35.

15. Красновский А.А., мл. Синглетный молекулярный кислород и первичные механизмы фото динамического действия оптического излучения // Итоги науки и техники. Современные проблемы лазерной физики. М: ВИНИТИ, 1990-Т. З.-С. 63-135.

16. Schell J., Felder D., Nierengarten J.-F., Rehspringer J.-L., Levy R., Hônerlage B. Induced Absorption of Сбо and a Water-soluble Сбо-derivative in Si02 Sol-gel Matrices // Journal of Sol-Gel Science and Technology. 2001. - Vol. 22. - P. 225-236.

17. Leach S., Vervloet M., Despres A., Breheret E., Hare J.P., Dennis T.J., Kroto H.W., Taylor R. and Walton R.M. Electronic Spectra and Transitions of the Fullerene C60 // Chemical Physics. 1992. - Vol. 160. - P. 451-466.

18. Arbogast J.W., Darmanyan A.P., Foote C.S., Diederich F.N., Rubin Y., Diederich F., Alvarez M.M., Anz S.J. Photophysical Properties of Sixty Atom

19. Arbon Molecule (C60) // Journal of Physical Chemistry. 1991. - Vol. 95. - P. 11-12.

20. Ebbesen T.W., Tanigaki K., Karoshima S. Excited-state Properties of C6o // Chemical Physics Letters. 1991. - Vol. 181. - P. 501-504.

21. Белоусов В.П., Белоусова И.М., Будтов В.П., Данилов В.В., Данилов О.Б., Калинцев А.Г., Мак А.А. Фуллерены: структурные, физико-химические и нелинейно-оптические свойства// Оптический журнал. 1997 - Т. 64, № 12.- С. 3-37.

22. Barbara J. Why "Safer than Ever" May not be Quite Safe Enough // Transfusion Medicine and Hemotherapy. 2004. - Vol. 31. - P. 2-10.

23. Селиванов E.A., Данилова Т.Н., Дегтерева И.Н., Воробей Л.Г., Григорья М.Ш. Служба крови России в 2005 году // Трансфузиология. 2006. том 7.- № 3. С. 4-43.

24. Жибурт Е.Б. Пути повышения качества препаратов крови // Ремедиум. -2005. № 4. - С. 42-44.

25. Шевченко Ю.Л., Жибурт Е.Б. Безопасное переливание крови М: Современная медицина, 2000. - 320 с.

26. Mosley J.W. Should Measures be Taken to Reduce the Risk of Human Parvovirus (B19) Infection by Transfusion of Blood Components and Clotting Factor Concentrates? // Transfusion. 1994. - Vol. 34. - P. 774-746.

27. Roberts P. Vims Safety of Plasma Products // Reviews in Medical Virology. -1996.-Vol. 6.-P. 25-38.

28. Русанов В., Левин И. Лечебные препараты крови М.: Медпрактика-М, 2004 г. 284 с.

29. Швинн X., Вольтер Д. Способ получения неинфицированной плазмы крови. Пат. RU 2040260 от 1991.12.27.

30. Kempf С., Jentsch P., Poirier B, Barre-Sinoussi F., Morgenthaler J.J., Morel A., Germann D. Virus Inactivation during Production of Intravenous Immunoglobulin // Transfusion. 1991. - Vol. 31. - P. 423-427.

31. Omar A., Kempf C., Immelmann A., Rentsch M., Morgenthaler J.J. Virus Inactivation by Pepsin Treatment at pH 4 of lgG Solutions: Factors Affecting the Rate of Virus Inactivation // Transfusion. 1996. - Vol. 36. - P. 866-872.

32. Burnouf-Radosevich M., Burnouf Т., Huart J.J. A Pasteurized Therapeutic Plasma// Infusion Therapy and Transfusion Medicine.- 1992,- Vol.19.- P.91-94.

33. Burnouf Т., Radosevich M., El-Ekiaby M., Satoh S., Sato Т., Amin S.N., Savidge G.F., Goubran H.A. Nanofiltration of Single Plasma Donations: Feasibility Study // Vox Sanguinis.- 2003,- Vol.84.- P. 111-119.

34. Kasermann F., Kempf C. Buckminsterfullerene and Photodynamic Inactivation of Viruses // Reviews in Medical Virology. 1998. - Vol. 8. - P. 143-151.

35. Arbogast Y.W., Foote Ch.S. Photopysical Properties of Сбо // Journal of the American Chemical Society. 1991. - Vol. 113. - P. 8886-8889.

36. Koshevar I.E., Redmond R.W. Photosensitized Production of Singlet Oxygen // Methods in Enzymology. 2000. - Vol. 319. - P. 20 - 28.

37. Krasnovsky A. A., Jr. Singlet molecular oxygen in photobiochemical systems: IR phosphorescence studies // Membrane Cellular Biology. 1998. - Vol. 12, No 5 -P. 665-690.

38. Sills M. R., Zinkham W. H. Methylene blue-induced Heinz body hemolytic anemia // Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine. 1994. - Vol. 148, No. 3.-P. 306-310.

39. Majithia A., Steams M.P. Methylene blue toxicity following infusion to localize parathyroid adenoma // The Journal of Laryngology and Otology. 2006 - Vol. 120, No 2.-P. 138-140.

40. Фотодинамическая очистка воды в системах городского и локального водоснабжения, бассейнах и замкнутых водоемах. Рекламно-техническое описание научно-исследовательской работы ФГУП «Государственный научный центр «НИОПИК», декабрь 2004.

41. Bagno A., Claeson S., Maggini M., Martini M.L., Prato M., Scorrano G. 60.Fullerene as a Substituent // Chemical European Journal. 2002. - Vol. 8. -P. 1016-1023.

42. Guldi D.M, Prato M. Excited-state Properties of Сбо Fullerene Derivatives // Accounts of Chemical Research. 2000. - Vol. 33. - P. 695 - 703.

43. Foley S., Bosi S., Larroque C., Prato M., Janot J.M., Seta P. Photophysical Properties of Novel Water Soluble Fullerene Derivatives // Chemical Physics Letters. 2001. - Vol. 350. - P. 198-205.

44. Murthy C. N., Geckeler К. E. The Water-Soluble P-cyclodextrin-60.fullerene Complex // Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. -2001.-Vol. 13.-P. 1194-1195.

45. Konstantaki M., Koudoumas E., Couris S., Janot J.M., Eddaoudi H., Deratani A., Seta P., Leach S. Optical Limiting Behavior of the Water-Soluble C60/ycyclodextrin Complex I I Chemical Physics Letters. 2000. - Vol. 318. - P. 488495.

46. Beeby A., Eastoe J., Heenan R. K. Solubilisation of C60 in Aqueous Micellar Solution // Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 1994. -Vol. 10.-P. 173-175.

47. Tabata Y., Murakami Y., Ikeda Y. Photodynamic Effect of Polyethylene Glycol-modified Fullerene on Tumor // Japanese Journal of Cancer Research. 1997. -Vol. 88. - No. 11. - P. 1108-1116.

48. Yamakoshi Y.N., Yagami T., Fukuhara K., Sueyoshi S., Miyata N. Solubilization of Fullerenes into Water with Polyvinylpyrrolidone Applicable to Biological Tests // Journal of the Chemical Society, Chemical Communications.1994.-Vol. 4. P. 517-518.

49. Scrivens W.A., Tour J.M. Synthesis of 14C-Labeled C60, Its Suspension in Water, and Its Uptake by Human Keratinocytes // Journal of the American Chemical Society. 1994. - Vol. 116. - P. 4517-4518.

50. Deguchi S., Alargova R.G. and Tsujii K., Stable Dispersions of Fullerenes, C6o and C70, in Water. Preparation and Characterization // Langmuir. 2001. - Vol. 17. - P. 6013-6017.

51. Andrievsky G.V., Kosevich M.V., Vovk O.M., Shelkovsky V.S. and Vashchenko L.A., On the Production of an Aqueous Colloidal Solution of Fullerenes // Journal of the Chemical Society, Chemical Communications.1995.-Vol. 12.-P. 1281-1282.

52. Theraflex MB Plasma. The Integrated Pathogen Reduction System. Рекламный проспект фирмы MacoPharma (Франция), апрель 2005.

53. Макарова Т.Л. Электрические и оптические свойства мономерных и полимеризованных фуллеренов / Физика и техника полупроводников. 2001. Т. 35, № 3. С. 257-293.

54. Nath S., Pal H., Sapre A.V. Effect of Solvent Polarity on the Aggregation of C6o // Chemical Physics Letters. 2000. - Vol. 327. - P. 143-148.

55. Guldi D.M. Capped Fullerenes: Stabilization of Water-soluble Fullerene Monomers as Studied by Flash Photolysis and Pulse Radiolysis // Journal of Physical Chemistry A. 1997. - Vol. 101. - P. 3895-3900.

56. Palit D.K., Sapre A.V., Mittal J.P., Rao C. N. R. Photophysical properties of the fullerenes, C60 and C70 // Chemical Physics Letters. 1992. - Vol. 195. - P. 1-6.

57. Foote C.S. Photophysical and Photochemical Properties of Fullerene // Electron transfer I. Topics in Current Chemistry. Berlin: Springer, 1994. - Vol. 169. - P. 347-363.

58. Guldi D.M., Asmus K.-D. Photophysical Properties of Mono- and Multiply-Functionalized Fullerene Derivatives // Journal of Physical Chemistry A. 1997. -Vol. 101.-P. 1472-1481.

59. Hayat M.A. Principles and Techniques of Electron Microscopy. Biological applications. 4-th ed. Cambridge, UK; New York: Cambridge University Press, 2000. - 563p.

60. Arbogast J.W., Foote C.S., Kao M. Electron transfer to triplet fullerene C60 // Journal of the American Chemical Society. 1992. - Vol. 114. - P. 2277-2279.

61. Shen L., Li H.-F., Zhang H.-Y. A Theoretical Elucidation on the Solvent Dependent Photosensitive Behaviors of C6o // Photochemistry and Photobiology. 2006. - Vol. 82, Issue 3. - P. 798-800.

62. Tokuyama H., Yamago S., Nakamura E., Shiraki T., Sugiura Y. Photoinduced Biochemical Activity of Fullerene Carboxylic Acid // Journal of the American Chemical Society. 1993. - Vol. 115. - P. 7918-7919.

63. Boutorine A.S., Tokuyama H., Takasugi M., Isobe H., Nakamura E., Helene C. Fullerene-oligonucleotide Cnjugates: Poto-induced Squence-specific DNA Cleavage // Angewandte Chemie International Edition. 1994 - Vol. 33. - P. 2462-2465.

64. Климова B.A. Основные микрометоды органических соединений. М: Химия, 1975. - 222 с.

65. Сироткин А.К., Сухинин В.П., Назарова О.В., Гаврилова И.И., Панарин Е.Ф. Синтетические полимеры в изучении адсорбции вирусных частиц // Доклады Академии Наук. 2003. - Т. 388, № 6 - С. 821-825.

66. Дункан А., Горди В., Джонс Н., Матсен Ф., Сандорфи К., Вест В. Применение спектроскопии в химии / Пер. с англ. М.: Изд-во иностранной литературы, 1959.-659 с.

67. Catalan J. Towards the Gas-phase UV-VIS Absorption Spectrum of Сбо // Chemical Physics Letters. 1994. - Vol. 223. - P. 159-161.

68. Koudoumas E., Ruth A.A., Couris S., Leach S. Solvent Effects on the Optical Limiting Action of C6o Solutions // Molecular Physics. 1996. - Vol. 88, No. 1. -P. 125-133.

69. Bayliss N. S. The Effect of the Electrostatic Polarization of the Solvent on Electronic Absorption Spectra in Solution // Journal of Chemical Physics. -1950. Vol. 18, Issue 3. - P. 292-296.

70. Елецкий А.В., Смирнов Б.М. Фуллерены и структуры углерода // Успехи физических наук. 1995. - Т. 165, № 9. - С. 977-1007.

71. Agafonov S.S., Glazkov V.P., Kokin I.F., Lushnikov S.A., Somenkov V.A., Syrykh G.F., Filippov A.A. Interaction of Crystalline and Amorphous

72. Fullerenes with Hydrogen, Parafin Hydrocarbons and Their Derivatives:Te3HCbi докладов. ICHMS'2005, Sevastopol-Crimea-Ukraine, 2005. P. 674.

73. Andrievsky G.Y., Klochkov V.K., Karyakina E.L., Mchedlov-Petrossyan N.O. Studies of Aqueous Colloidal Solutions of Fullerene C6oby Electron Microscopy // Chemical Physics Letters. 1999. - Vol. 300. - P. 392-396.

74. Talyzin A.V., Jacob A. Hydrogen adsorption by ball milled Сбо // Journal of Alloys and Compounds. 2005. - Vol. 395. - P. 154-158.

75. Хохлова Т.Д. Влияние химии поверхности и размера пор модифицированных сипикагелей на адсорбцию овальбумина // Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. 2002. - Т. 43, № 3. - С. 144146.

76. Nardello V., Aubry J.-M. Measurement of Photogenerated Singlet Oxygen in Aqueous Media // Methods of Enzymology. 2000. - Vol. 319. - P. 50-58.

77. Pak V.N., Hanson C.D., Coon S.R. Oxidation off and S2" Anions by Oxygen in Aqueous Suspensions of Silica Gel // Russian Journal of Applied Chemistry. -2001.-Vol. 74.-P. 58-62.

78. Guldi D.M., Huie R.E., Neta P., Hungerbuhler H., Asmus K.-D. Excitation of Ceo, Solubilized in Water by Triton X-100 and y-Cyclodextrin, and Subsequent Charge Separation via Reductive Quenching // Chemical Physics Letters. -1994.-Vol. 233.-P. 511-516.

79. Kraljic I., Mohsni S.Et., Arvis M. A General Method for the Identification of Primary Reactions in Sensitized Photooxidations // Photochemistry and Photobiology. 1978. - Vol. 27. - P. 531-537.

80. Kraljic I., Mohsni S.Et. A New Method for the Detection of Singlet Oxygen in Aqueous Solutions // Photochemistry and Photobiology. 1978. - Vol. 28. - P. 577-581.

81. Kraljic I., Trumbore C.N. p-Nitrosodimethylaniline as an OH Radical Scavenger in Radiation Chemistry // Journal of the American Chemical Society. 1965. -Vol. 87. - P. 2547-2550.

82. Belousova I.M., Mironova N.G., Yur'ev M.S. Fullerene-Oxygen Action on Biological Tissues: Numerical Modeling // SPIE. Proceedings 2006. - Vol. 6257 P. 62570T.

83. Бирюлин Ю.Ф., Виноградова Л.В., Згонник B.H. О повышении квантовой эффективности излучательной рекомбинации фуллерена С70 в растворе толуола // Письма в ЖТФ. 1998. - Т. 24, № 22. - С. 70-75.

84. Reed C.A., Bolskar R.D. Discrete Fulleride Anions and Fullerenium Cations // Chemical Reviews. 2000. - Vol. 100. - P. 1075-1120.

85. Конарев Д.В., Любовская Р.Н. Донорно-акцепторные комплексы и ион-радикальные соли на основе фуллеренов // Успехи химии. 1999. - Т. 68, №1. - С. 23-44.

86. Сидоров Л.Н., Юровская М.А., Борщевский А.Я., Трушков И.В., Иоффе И.Н. Фуллерены: учебное пособие. М: Экзамен, 2005. - 688 с.

87. Mahy B.W.J Virology a Practical Approach. - Washington DC: IRL Oxford Press, 1985. - p. 264.

88. Вирусология: В 3-х т.: Т. 1: Пер. с англ. / Под ред. Б. Филдса, Д. Найпа. М.: Мир, 1989. - 492 с.

89. Кольман Я., Рём К.-Г. Наглядная биохимия. М: Мир, 2000. - 469 с.