Усиление аналитического сигнала пьезокварцевого иммуносенсора с помощью наночастиц золота тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

00460544У

Шашканова Ольга Юрьевна

УСИЛЕНИЕ АНАЛИТИЧЕСКОГО СИГНАЛА ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО ИММУНОСЕНСОРА С ПОМОЩЬЮ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА

02.00.02 - аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 о ИЮН 2010

Воронеж 2010

004605449

Работа выполнена в Липецком государственном техническом университете

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Ермолаева Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Шеховцова Татьяна Николаевна доктор химических наук, доцент Шапошник Алексей Владимирович

Ведущая организация: Казанский государственный университет

им. В.И. Ульянова-Ленина, г. Казань.

Защита состоится «4» июня 2010 г. в 16 ч. 00 мин. в аудитории 439 на заседании диссертационного совета Д 212.038.19 по химическим наукам при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1, химический факультет, ауд. 439.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Воронежского государственного университета

Автореферат разослан 29 апреля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Крысин М.Ю.

ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ СТРУКТУРА РАБОТЫ

Актуальность. Пьезокварцевые иммуносенсоры положительно зарекомендовали себя в качестве удобного инструмента для проведения биохимических и клинических исследований, сертификации пищевых продуктов и фармацевтических препаратов, мониторинга объектов окружающей среды. Уникальной особенностью пьезокварцевых гравиметрических иммуносенсоров является сочетание высокой чувствительности, связанной с использованием в качестве физического преобразователя высокочастотного пьезокварцевого резонатора АТ-среза, и селективности, вследствие применения иммунореагентов. Аналитическим сигналом пьезокварцевого иммуносенсора служит уменьшение частоты колебаний при образовании иммунокомплекса на поверхности его электрода. Дальнейшее снижение предела обнаружения аналитов возможно за счет присоединения к поверхностному иммунокомплексу наночастиц полимеров или металлов. Наибольший интерес при определении высоко- и низкомолекулярных соединений представляет использование наночастиц золота, характеризующихся высокой биосовместимостью, инертностью и способностью образовывать достаточно прочные связи с биомолекулами.

Наночастицы золота положительно зарекомендовали себя в оптических и электрохимических сенсорах. Имеются немногочисленные работы, посвященные применению наночастиц золота для усиления аналитического сигнала пьезокварцевого иммуносенсора при определении высокомолекулярных соединений, например инсулина, трипсина и др. Еще в меньшей степени изучено усиление аналитического сигнала при определении низкомолекулярных соединений, например, пестицидов и лекарственных препаратов. Однако систематические исследования по изучению возможности применения наночастиц золота для усиления сигнала пьезокварцевого иммуносенсора ранее не проводились. Поэтому актуальным является расширение перечня определяемых с помощью пьезокварцевых иммуносенсора, усиленного наночастицами золота, соединений, в частности за счет биомаркеров аутоиммунных заболеваний и воспалительных процессов, что позволит повысить надежность ранней клинической диагностики, токсичных пестицидов и лекарственных препаратов, являющихся широко распространенными загрязнителями пищевых продуктов и объектов окружающей среды. Также необходимо дополнительное изучение условий синтеза устойчивых наночастиц золота фиксированного размера для усиления сигнала пьезокварцевого иммуносенсора.

Сокращения, используемые в тексте: AF - изменение частоты колебания сенсора; AuNP - золотые наночастицы, AuNPSH - тиолированные золотые наночастицы золота; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; анти-ДНК - а|гтитела к ДНК; у-амино-пропилтетраэтоксисилан; BSA - бычий сывороточный альбумин; Cmm - предел обнаружения; DCC -N.N-диииклогексилкарбодиимид; EDAC - 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид; GA - глутаровый альдегид: MIS - N-гидроксисукцинимид; Cys - 2-меркаптоэтиламин (цистамин); MPA ~ меркалтопроионовая кислота; I1-MUD-11 - меркаптоундеканол , AcMSA - ангидрид s-ацетилмеркаптоянтарной кислоты; PEG 3000 - полиэтиленгликоль; SDS -лодецилсульфат натрия; CRP - С - реактивный белок; monAt - моноклональное антитело; N - число циклов измерений; А,, - константа скорости образования; кр - константа скорости разрушения; Кл,р - константа аффинности, Г1КИС -иьезокварцевый иммунносенсор; ИФА - иммуноферментный анализ.

Цель исследования заключалась в изучении возможности применения наночастиц золота для повышения чувствительности определения и снижения предела обнаружения высоко- и низкомолекулярных соединений с помощью пьезокварцевого иммуносенсора. Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены следующие задачи:

- разработка методик получения наночастиц золота из золотохлористоводородной кислоты для последующего применения в пьезокварцевых иммуносенсорах;

- изучение закономерности тиолирования наночастиц золота и образование, конъюгатов с молекулами антител к ДНК и С - реактивным белком, антителами к сульфаметазину и алдрину;

- изучение способов иммобилизации ДНК, антител к CRP, поликлональных антител к алдрину и сульфаметазин-белкового конъюгата на поверхности электродов пьезокварцевого резонатора для формирования устойчивых и конформационно доступных покрытий сенсора;

- разработка методик определения следовых концентраций высокомолекулярных (антитела к ДНК, С - реактивный белок) и низкомолекулярных (сульфаметазин, алдрин) соединений с помощью пьезокварцевого иммуносенсора, усиленного наночастицами золота.

Научная новизна работы:

- установлено влияние концентрации восстановителя, стабилизатора и pH среды на средний диаметр синтезированных наночастиц золота из золотохлористоводородной кислоты с помощью хлорида олова (II);

- предложены новые способы формирования иммуноаффинных покрытий сенсоров для определения • антител к ДНК на основе тиолированных наночастиц золота и С - реактивного белка на основе каликс[6]арена;

- показано влияние размера наночастиц золота, природы и концентрации тиолирующего агента и соотношения концентраций тиосоединение/наночастицы золота на эффективность связывания с молекулами анти-ДНК и С - реактивным белком, антителами к сульфаметазину и алдрину;

- установлены закономерности применения золотых наночастиц для усиления аналитического сигнала пьезокварцевого иммуносенсора и снижения предела обнаружения высокомолекулярных соединений (антитела к ДНК, С - реактивный белок) в прямом формате и низкомолекулярных соединений (сульфаметазин и алдрин) в конкурентном и сэндвич форматах анализа.

Практическая значимость;

- разработаны методики получения наночастиц золота со средним диаметром 5, 30, 50 нм и их функционализации с помощью L-цистамина, 11-меркаптоундеканола, меркаптопропионовой кислоты и s-ацетилмеркаптоянтарной кислоты;

- показана возможность применения наночастиц золота для усиления аналитического сигнала сенсора и снижения предела обнаружения при определении высоко- и низкомолекулярных соединений;

- разработаны методики определения следовых концентраций антител к ДНК, С - реактивного белка, сульфаметазина и алдрина с помощью пьезокварцевого иммуносенсора, усиленного наночастицами золота.

На защиту выносятся:

методики получения наночастиц золота из золотохлористоводородной кислоты с помощью хлорида олова (II) со средним диаметром 5, 30, 50 нм для последующего применения в пьезокварцевых иммуносенсорах;

закономерности функционализации поверхности наночастиц золота меркаптопроизводными (ангидрид s-ацетилмеркаптоянтарной кислоты, 2-меркаптоэтиламин (L-цистамин), меркаптопропионовая кислота и 11-меркаптоундеканол) и взаимодействия с белковыми молекулами антител к ДНК и С - реактивным белком, антителами к сульфаметазину и алдрину;

способы формирования устойчивых и чувствительных биорецепторных покрытий для определения антител к ДНК на основе тиолированных наночастиц золота и С - реактивного белка на основе каликс[6]арена;

- ■ зависимость аналитического сигнала пьезокварцевого сенсора, предназначенного для определения высоко- и низкомолекулярных соединений ог размера наночастиц золота, природы и концентрации применяемого для их функционализации тиолирующего агента;

методики определения следовых концентраций антител к ДНК, С -реактивного белка, сульфаметазина и алдрина с помощью пьезокварцевого сенсора, усиленного наночастицами золота.

Апробация работы. Отдельные разделы диссертации доложены на II и III Всероссийской конференции по аналитической химии с международным участием «Аналитика России», (Краснодар, 2007, 2009 гг.), VII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием (Уфа - Абзаково, 2008), VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика -2009» (Йошкар-Ола, 2009), Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология - 2009» (Пущино, 2009).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 6 статьях, 5 из которых входят в список, рекомендованный ВАК, и 6 тезисах докладов.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 41 рисунок и 21 таблицу. Состоит из введения, 6 глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 232 источника и приложения.

Работа выполнялась при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 06-03-32226 «Создание новых высокочувствительных гравиметрических иммуносенсоров для ранней клинической диагностики инфекционных и аутоиммунных заболеваний» и №

06-03-96339 «Новые методы определения биологически активных соединений, основанные на иммунохимических реакциях на поверхности пьезокварцевых сенсоров»).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

Рассмотрены современные способы получения наночастиц золота, основное внимание уделено синтезу AuNP из золотохлористоводородной кислоты. Приведены основные приемы стабилизации и функционализации поверхности наночастиц золота с помощью органических и неорганических соединений. Показано применение золотых наночастиц в качестве маркеров и для усиления аналитического сигнала в различных методах анализа, в том числе и иммунохимических.

Изучение условий синтеза и модификации наночастиц золота

Синтез наночастиц золота осуществляли восстановлением золотохлористоводородной кислоты хлоридом олова (II), размер контролировали методом абсорбционной спектрофотометрии и подтверждали исследованиями, проведенными с помощью атомной силовой микроскопии, неоднородность синтезируемых наночастиц устанавливали с помощью построенных гистограмм распределения наночастиц по размерам. Восстановление золотохлористоводородной кислоты протекает через ряд основных стадий: получение высокопересыщенного раствора золота, нуклеации и формирования двойного электрического слоя на поверхности мицеллы. Регулировать образование наночастиц золота необходимого размера можно, управляя скоростями отдельных стадий процесса, изменяя концентрации восстановителя, стабилизатора и рН среды. При рН 4,24 образуются частицы со средним диаметром 5 нм, повышении рН до 5,25 или 5,47 приводит к укрупнению частиц до 10 и 35 нм. Увеличение рН свыше 6,18 способствует появлению крупных частиц, быстро выпадающих в осадок. С повышением концентрации восстановителя (рН 4,24) наблюдается формирование более мелких частиц, поскольку при высокой степени пересыщения скорость образования зародышей превалирует над скоростью их роста. При применении 5 мМ раствора хлорида олова отмечается максимальный выход наночастиц золота со средним диаметром 5 нм. Напротив, снижение концентрации до 1,25 мМ способствует укрупнению частиц до 30 нм, что может быть объяснено возникновением небольшого числа зародышей и более продолжительной стадией роста частиц по сравнению с нуклеацией. Снижение концентрации SnCl2 до 0,75 мМ и ниже вовсе не приводит к коллоидообразованию.

Для повышения устойчивости коллоидных систем золота на стадии синтеза применяли растворы PEG 3000 и SDS. Молекулы SDS способствуют получению частиц широкого фракционного состава, в то время как PEG (10 мг/мл), сворачиваясь определенным образом в растворе и на поверхности раздела фаз металл/раствор, ограничивает рост и способствует получению

коллоидных частиц диаметром 5 нм. Увеличение концентрации РЕО свыше 5 г/л затрудняет синтез АиЫР, формируя на золотой поверхности полислои, что приводит к потере способности связываться с биомолекулами. Показано, что используя хлорид олова, РЕО, изменяя их концентрацию и рН среды можно синтезировать наночастицы золота со средним диаметром 5, 30, 50 и 80 нм.

Для более эффективного связывания с биомолекулами и придания дополнительной устойчивости коллоидным частицам, поверхность АиЫР тиолировали меркаптопроизводными различного строения (Ь-цистамин, меркаптопропионовая кислота, 11- меркаптоундеканол, ангидрид з-ацетилмеркаптоянтарной кислоты), образующими сульфидные связи с поверхностью АиЫР и формирующими мостики различной длины и пространственного строения, отличающиеся природой концевых функциональных групп.

Тиолированные наночастицы золота применяли для получения иммуноаффинного слоя с высокой концентрацией активных сайтов связывания и увеличения массы присоединенных к биослою молекул определяемого соединения.

Исследование условий формирования рсцепторного слоя иьезокварцевого иммуносенсора

Важной стадией при разработке пьезокварцевого иммуносенсора является создание устойчивого, высокоактивного рецепторного слоя. Формирование иммуноаффинного слоя контролировали методами пьезокварцевого микровзвешивания и атомной силовой микроскопии, регистрируя увеличение массы при нанесении подложки и закреплении рецепторных молекул, а также устанавливая взаимосвязь шероховатости поверхности с величиной аналитического сигнала сенсора.

Изучение иммобилизации молекул ДНК. В работе использовались нативные и денатурированные молекулы ДНК цыпленка, крупного рогатого скота и человека. Молекулы ДНК закрепляли на предварительно сформированные подложки с применением бифункциональных реагентов.

Применение в качестве подложек серосодержащих соединений (11-М1Ю, МРА) и поли-Ь-лизина приводит к формированию сомоорганизующихся плотно упакованных молекул монослоя, связанных координационными связями с золотой поверхностью электрода. В результате происходит образование иммуноаффинных покрытий, характеризующиеся небольшой массой сорбируемой ДНК (тДНк) и высокими значениями концентрационной чувствительности (табл. 1). Исследование топографии поверхности показало наличие значительных перепадов высот, удобно расположенных возвышенностей с доступными активными центрами рецепторных молекул, что подтверждается высокими значениями аналитического сигнала сенсора при определении антител к ДНК. Недостатком таких покрытий является относительно невысокая устойчивость (8-15 циклов измерений).

Таблица 1.

Зависимость характеристик сенсора от способа иммобилизации молекул _ДНК (Сднк 0,5 мкг/мл;п = 3;Р = 0,95)

Метод тпод,мкг Шднк, мкг AF,Th Sc, Гц-см2-мкг" N Ra, нм

MPA+EDAC 10,3 2,3 112±8 18,2 12 25,9±4,4

Авидин - биотин 19,0 7,4 86±2 14,0 8 26,3±3,3

APTS+GA 34,9 26,4 144±2 23,3 20 20,6+3,1

Поли-Ь-лизин 9,5 5,7 95±6 15,4 12 29,6±5,3

11-MUD 8,6 3,5 85±2 13,8 9 39,9±4,6

AuNP+авидин 21,9 28,1 162±3 26,3 18 19,5±1,9

Предварительная модификация электрода сенсора y-APTS с активными аминогруппами способствует иммобилизации большого числа молекул ДНК по сравнению с подложками на основе серосодержащих соединений. Получаемая таким образом подложка обладает рядом достоинств: однородностью, равномерным распределением и пространственной доступностью функциональных групп для закрепления рецепторных молекул. Вследствие гидролитической стойкости и образования дополнительных кислородных мостиков между соседними молекулами APTS покрытие обеспечивает проведение более 20 циклов измерений.

Формирование биорецепторного слоя на основе авидин-биотинового комплекса осуществлялось при прикреплении биотинилированных молекул ДНК к поверхности электрода сенсора, модифицированной авидином. Реакция образования комплекса авидин-биотин характеризуется константой аффинности Ю15 М"1, указывающей на достаточно прочное связывание. Однако это может вызывать отрыв иммунокомплекса от поверхности сенсора вместе с подложкой и в результате сокращать срок его службы. Применение тиолированных золотых наночастиц для получения иммуноаффинного слоя способствует повышению интегральной концентрационной чувствительности, вследствие иммобилизации большего количества молекул ДНК и их удобному расположению в плоскости в виде плотных глобул для последующего взаимодействия с антителами.

Поэтому иммобилизация молекул ДНК на силанизированной подложке, а также на поверхности авидина с применением золотых наночастиц обеспечивает наиболее устойчивые, чувствительные и конформационно доступные покрытия.

Изучение иммобилизации антител к CRP. Определение CRP основано на реакции образования иммунокомплекса CRP, присутствующего в пробе, с антителами к нему, иммобилизованными на поверхности электрода резонатора. Для иммобилизации белковых молекул использован каликс[6]арен, закрепляемый как непосредственно на поверхность золотого электрода (способ 1), так и на подложке из силоксана (способ 2). Сравнение способов иммобилизации антител к CRP с помощью каликсарена с ковалентным закреплением на y-APTS через GA, показало, что сочетание

жесткой каликсареновой платформы, предоставляющей липофильную полость, и гибких фрагментов функциональных групп, создает благоприятные условия для внедрения и удержания «гостя» - молекул антител к CRP в полости супермолекулы без блокировки активных сайтов связывания, что подтверждается высокими значениями концентрационной чувствительности при невысокой массе покрытия. При этом относительно небольшая общая масса и толщина покрытия (способ 1) позволяют проводить определение CRP в более широком диапазоне концентраций без перегрузки сенсора. Такое покрытие характеризуется удовлетворительной устойчивостью и обеспечивает проведение до 15 циклов измерения. Удобное расположение антител к CRP для взаимодействия с С - реактивным белком, достигаемое в способе 1, подтверждено кинетическими исследованиями: константы скорости образования и разрушения комплекса примерно в 2 раза выше, чем при ковалентной иммобилизации на y-APTS, что позволяет регистрировать иммунохимическое взаимодействие между CRP и анти-CRP практически в режиме реального времени.

Иммобилизация сульфаметазии-белкового коиъюгата и поликлональных антител к алдрину. Закрепление конъюгатов и антител на поверхности электродов пьезокварцевого резонатора проводили с помощью y-APTS с последующей активацией GA. Отмечено, что использование такой технологии при иммобилизации конъюгата SA-C3-OVA (0,5 мг/мл) для определения сульфаметазина и поликлональных антител Anti-Aldrin Rabbit (20 мкг/мл) для определения алдрина обеспечивает формирование устойчивых и конформационно доступных иммунноаффинных покрытий.

Применение наночастиц золота для определения высоко- и низкомолекулярных соединений

Изучение условий определения антител к ДНК. Проточно-инжекционное определение антител к ДНК осуществляли в прямом формате за счет взаимодействия молекул рецепторного слоя сенсора с аналитом. Константы скорости прямой и обратной реакции между ДНК и анти-ДНК и Каф (2,7-108М ), рассчитанные по методике Скетчарда, указывают на возможность применения комплементарного взаимодействия в иммунохимическом анализе. График зависимости аналитического сигнала сенсора от концентрации антител к ДНК линеен в диапазоне 0,2 - 8 мкг/мл, предел обнаружения составляет 0,01 мкг/мл.

К образовавшемуся иммунокомплексу ДНК - анти-ДНК на второй стадии анализа присоединяли тиолированные наночастицы золота, пропуская их над поверхностью сенсора.

Исследовано влияние размера частиц, природы тиолирующих агентов и соотношения концентраций тиосоединение/золотые наночастицы - S/Au на эффективность связывания тиолированных наночастиц с антителами, оцененное по величине Af сенсора. Наиболее высокое значение Af зарегистрировано при применении наночастиц золота диаметром 5 нм, тиолированных L - цистамином или 11-меркаптоундеканолом, что

свидетельствует об оптимальном количестве конформационно доступных поверхностных функциональных групп. Для сенсоров с наночастицами, тиолированными МРА и АсМБА, АГ в 2-3 раза ниже, что объясняется не только низкой плотностью реакционных групп, но и частичной их дезактивацией (рис. 1а).

Рис. 1. Влияние природы тиолирующего реагента (d 30 нм) (а) и размера наночастиц золота (б) на аналитический сигнал сенсора, а): 1 - ангидрид s-ацетилмеркаптоянтарной кислоты, 2 - меркаптопроионовая кислота 3-11-меркаптоундеканол и 4 - цистамин; (соотношение S/Au =2)

Более высокая доля поверхностных активных центров для связывания с тиогруппами и биомолекулами отмечена для частиц диаметром 5 нм (рис. 16), полученных при двухкратном избытке тиосоединения по отношению к частицам коллоидного золота. При соотношении S/Au < 2 снижается плотность функциональных групп, и, следовательно, Af, а при увеличении соотношения более, чем в 2 раза формируются полимолекулярные слои тиолирующих агентов, утяжеляющих частицы, что вызывает срыв колебаний сенсора.

Эффективность связывания анти-ДНК с AuNPSH оценивали по значениям констант скоростей образования ко и разрушения кр конъюгата анти-ДНК с тиолированными наночастицами и КАф. Отмечено, что при использовании различных по природе тиолирующих агентов константа скорости образования конъюгата уменьшаются в следующем ряду: Cys (13597 MV) > 11-MUD (6953 MV) > МРА (5136 M'V1) > AcMSA (625 M"1 xc-'). Аналогичным образом изменяется kp.

Применение на второй стадии анализа тиолированных наночастиц золота позволило снизить предел обнаружения антител к ДНК до 0,003 мкг/мл. Градуировочная функция линейна в диапазоне концентраций анти-ДНК 0,005 - 0,1 мкг/мл.

Изучение условий определения С - реактивного белка. Определение С -реактивного белка с помощью пьезокварцевого иммуносенсора в прямом формате анализа проводили при пропускании CRP над поверхностью сенсора с иммобилизованными с помощью каликс[6]арена антителами к нему. Усиление аналитического сигнала сенсора достигается за счет присоединения к образовавшемуся иммунокомплексу тиолированных наночастиц золота.

Эффективность взаимодействия С-реактивного белка с тиолированными наночастидами золота оценивали методом пьезокварцевого микровзвешивания по значению Af, полученному при пропускании CRP над поверхностью сенсора с иммобилизованными тиолированными наночастицами золота. Максимальное значение Af наблюдается для частиц диаметром 5 нм, тиолированных L - цистамином. (рис. 2).

Рис. 2. Влияние природы тиолирующего агента и размера наночастиц на величину аналитического сигнала сенсора. Тиолирующий агент - цистамин (1, 3,4) и 11 - меркаптоундеканол (2). Диаметр частиц - 5 нм (1,2), 30 нм (3), 50 нм (4).

Применение AuNPSH позволило практически в 2 раза повысить чувствительность определения CRP, расширить диапазон определяемых содержаний 0,1 - 10 мкг/мл (без применения наночастиц 1-10 мкг/мл) и снизить предел обнаружения с 0,6 мкг/мл до 0,06 мкг/мл.

Для повышения чувствительности определения CRP и значительного сокращения расхода иммунореагентов изучены условия определения CRP в статическом режиме. Оптимизированы объемы пробы, раствора тиолированного коллоидного золота, продолжительность контакта раствора с сенсором для полного связывания CRP с антителами и AuNPSH. Выполнение анализа в статическом режиме позволило не только повысить чувствительность определения CRP, но и сместить диапазон определяемых содержаний по сравнению с проточно-инжекционным способом в область более низких концентраций CRP (0,01 - 1 мкг/мл). В тоже время продолжительность анализа увеличивается с 10 до 35 - 40 мин.

Выявлено мешающее влияние компонентов сыворотки крови на виличину аналитического сигнала сенсора, поэтому для определения рекомендован метод добавок, нивелирующий влияние матричных компонентов. Сенсоры апробированы при анализе модельных растворов и сыворотки крови.

Изучение условий определения сульфаметазина. Определение низкомолекулярного сульфаметазина с применением тиолированных наночастиц золота осуществляли в конкурентном формате анализа. Принципиальная схема проточно-инжекционного анализа (рис. 3) включала несколько этапов: введение в пробу, содержащую сульфаметазин, антител, предварительно конъюированных с наночастицами золота, для образования гомогенного иммунокомплекса; пропускание анализируемой пробы над поверхностью иммуносенсора для формирования гетерогенного комплекса между свободными антителами, конъюгированными с AuNP, и

иммобилизованным гаптен-белковым конъюгатом (I); удаление несвязавшихся иммунореагентов (II) и регистрация аналитического сигнала сенсора (III).

Рис. 3. Схема конкурентного определения сульфаметазина с применением

наночастиц золота.

Влияние наночастиц золота на аналитический сигнал ПКИС оценивали по величине коэффициента усиления сигнала п:

где Л/сАи и Af6e3/tu - аналитический сигнал при применении конъюгатов антител с наночастицами золота и немодифицированных антител, соответственно.

Было установлено, что коэффициент усиления сигнала сенсора не зависит от природы применяемой пары иммунореагентов, но изменяется в зависимости от размера наночастиц золота в следующем ряду: п5 нм > п30 „м >П5о нм > п7о ш > что связано с большей долей атомов золота в поверхностном слое для наночастиц с меньшим диаметром и их размером.

Проведенные кинетические исследования показали, что К.дф антител, конъюгированных с наночастицами золота и без использования AuNP являются величинами одного порядка ((9,0- 9,3)-108М''), что свидетельствует о доступности активных сайтов антител даже при конъюгации. Однако увеличение диаметра AuNP приводит к возрастанию констант скорости образования и разрушения иммунокомплекса, связанное с большей доступностью сайтов и устойчивостью комплекса, что вызывает его быстрое разрушение при регенерации биослоя.

Диапазон определяемых содержаний сульфаметазина составляет 5-120 мкг/мл, чувствительность определения - 2,43 Гц-мл/мкг, Cm¡„ - 0,6 мкг/мл.

Изучение условий определения алдрина. Применение AuNP в сэндвич формате анализа изучено на примере определения низкомолекулярного алдрина, предварительно конъюгированного с В SA. Снижение предела обнаружения алдрина происходит в результате проведения двух последовательных процессов: на первой стадии иммобилизованные на поверхности иммуносенсора поликлональные антитела Anti-Aldrin Rabbit связываются с алдрин-белковым конъюгатом с образованием специфического бинарного комплекса антиген-иммобилизованное антитело, а на второй происходит присоединение к образовавшемуся комплексу

конъюгат

Комплекс антител с AuNP^ Гетерогенный иммунокомплекс

моноклональных антител LIB-CCD2.4 MAb, специфичных к другому эпитопу анализируемого антигена (Рис.4).

WW—УЛУ —• WvV— v

I N III IV

Рис. 4. Схема сэндвич анализа алдрина с применением наночастиц золота. I -Пропускание раствора, содержащего алдрин-белковый конъюгат; II -Образование гетерогенного иммунокомплекса поликлональные антитела -алдрин-белковый конъюгат; III - Пропускание конъюгатов моноклональных антител с AuNP; IV - Образование сэндвич - комплекса:

А Алдрин-белковый Политональные ангатела Конъюгаты моноклональных А Моноклональные антитела ▼ конъюгат калдрину Д антител к аддрину с AuNP '»калдрину

Различия в рассчитанных по методике Скетчарда константах скорости образования, разрушения иммунокомплекса и константах аффинности алдрин-белкового конъюгата к поли- (5,0'109М"') и моноклональным (3,2'1010М"') антителам могут быть обусловлены неодинаковой способностью антител бивалентно или моновалентно взаимодействовать с антигеном. Более высокое значение ко и Кдф для моноклональных антител свидетельствуют об их большем иммунохимическом сродстве к определяемому соединению.

Для анализа были использованы тиолированные или нетиолированные наночастицы золота. Изучено влияние соотношения молярных концентраций наночастиц золота или AuNPSH и моноклональных антител на состав комплекса, а также размера AuNP на устойчивость и массу конъюгата, регистрируемую методом пьезокварцевого микровзвешивания. Вьивлено, что при соотношении CAuNpSh • CmonAt= 1 : 2 и применении наночастиц золота диаметром 5 нм наблюдается максимальное значение аналитического сигнала сенсора.

Применение наночастиц коллоидного золота позволило расширить диапазон определяемых содержаний 0,001 — 0,100 мкг/мл. Предел обнаружения снижается с 2 нг/мл до 0,8 нг/мл при использовании AuNP и до 0,6 нг/мл - при AuNPSH.

Практическое применение пьезокварцевых иммуносенсоров для определения высоко- и низкомолекулярных соединений

Методики определения высоко- (антитела к ДНК, С - реактивный белок) и низкомолекулярных (сульфаметазин, алдрин) соединений с помощью пьезокварцевого иммуносенсора, усиленного наночастицами золота, апробированы при анализе биологических жидкостей и пищевых продуктов.

Определение антител к ДНК. Присутствие повышенного содержания специфических антител к ДНК в сыворотке крови является важным биомаркером таких заболеваний, как ревматоидный артрит, системная красная волчанка, хронический гломерулонефрит. Наблюдение за изменением концентрации антител к ДНК в организме человека может

использоваться для достоверной и информативной ранней клинической диагностики, а также оценки активности процесса и эффективности терапии. Применение ДНК-сенсора, усиленного наночастицами золота, позволяет выявлять аутоиммунные заболевания на более ранних стадиях. Сенсоры апробированы при анализе сывороток крови больных аутоиммунными заболеваниями.

Таблица 2.

Определение антител к ДНК в сыворотке крови с помощью ДНК-сенсора и __иммуноферментного анализа (ИФА) (Р=0,95; п=5)_

Заболевание ПКИС ИФА

МЕ/мл мкг/мл Sr МЕ/мл* мкг/мл

Без применения наночастиц золота

Хронический гломерулонефрит 0,9±0,2 0,7±0,2 0,20 0,9 0,8

Системная красная волчанка 8,5±0,2 6,9±0,2 0,02 8,6 7,0

Системная красная волчанка 1,9±0,2 1,6±0,2 0,10 1,9 1,6

Ревматоидный артрит 1,2±0,1 1,0±0,1 0,08 1,1 0,9

С применением наночастиц золота

Ревматоидный артрит 0,049±0,008 ),039±0,007 0,14 - -

Ревматоидный артрит 0,069±0,013 ),056±0,010 0,15 - -

* - МЕ/мл - активность антител в условных единицах (1 МЕ/мл = 0,8147 мкг/мл)

Результаты определения анти-ДНК (табл. 2) сопоставлены с полученными методом иммуноферментного анализа данными иммунологической лаборатории областной клинической больницей г. Липецка). Статистическая обработка результатов не выявило систематической погрешности в результате анализа.

Определение сульфаметазина. Методика определения сульфаметазина в конкурентном формате анализа с применением гаптен-белкового конъюгата SA-C3-OVA, антител For 3-OVA Lot 2 и наночастиц золота размером 5 нм апробирована при анализе молока и куриных яиц методом добавок (табл. 3).

Таблица 3.

Результаты определения сульфаметазина в пищевых продуктах __(п = 4, Р = 0,95) _

Номер пробы Сдоб, мкг/мл Сх+доб, мкг/мл Сх, мкг/г sr

Молоко

1 10,0 10,0±1,3 0,08

2 100,0 100,0±6,4 0,04

Яйцо

1 10,0 10,6±1,7 0,6±0,1 0,10

2 100,0 100,6±12,8 0,6±0,1 0,08

*-сульфаметазин в пробе не обнаружен.

Присутствие сульфаметазииа в молоке не обнаружено, однако его содержание в яйце в 6 раз превышает предельно допустимые нормы, установленные для стран ЕС (ОД мкг/мл).

Определение алдрина. Разработанная методика определения алдрина апробирована при анализе вина и винограда. Анализ проводили с предварительной пробоподготовкой, осуществляя экстракцию алдрина из пробы и конъюгирование его с белковыми молекулами. Содержание алдрина в вине и винограде устанавливали методом добавок, результаты определения представлены в табл. 4.

Таблица 4.

Определение алдрина в образцах винограда и вина (п=3; Р=0,95)

Введено, нг/мл Найдено, нг/мл Sr

Виноград

5,0 5,1±1,0 0,1

100 102±20 | 0,1

«Мускат», Болгария

5,0 5,2±3,0 0,2

100 102±20 0,1

«Отто Гросс», Германия

5,0 4,9±2,0 0,2

100 101±20 0,1

Таким образом, все разработанные методики определения высокомолекулярных и низкомолекулярных соединений с помощью пьезокварцевого иммуносенсора, усиленного золотыми наночастицами, характеризуются высокой чувствительностью, селективностью и могут быть рекомендованы для определения субнаномолярных концентраций антител к ДНК и С - реактивного белка в биологических жидкостях и сульфаметазииа и алдрина в пищевых продуктах.

Выводы

1. Установлено, что для синтеза наночастиц золота диаметром 5 нм восстановлением золотохлористоводородной кислоты в присутствии хлорида олова (И) наиболее оптимальными условиями являются: значение рН 4,24; мольное соотношение золотохлористоводородной кислоты и хлорида олова 1:4,5 и концентрация PEG 10 мг/л. Увеличение рН и снижение концентрации хлорида олова приводит к укрупнению наночастиц и снижению их устойчивости.

2. В результате исследования процессов функционализации наночастиц золота различного размера тиореагентами установлено, что для применения в пьезокварцевых иммуносенсорах могут быть рекомендованы тиолированные цистамином или 11 - меркаптоундеканолом наночастицы золота диаметром 5 нм, обеспечивающие максимальное значение аналитического сигнала. Оптимальное соотношение при тиолировании молярных концентраций тиосоединения и наночастиц золота 2:1.

3. Показано, что при получении иммуноаффинных покрытий сенсоров на основе ДНК с применением самоорганизующихся слоев, конканавалина А, авидин-биотинового комплекса и тиолированных наночастиц золота, а также при иммобилизации антител к CRP на подложке из каликс[6]арена, закрепление молекул ДНК на силанизированной подложке и на поверхности авидина с применением тиолированных наночастиц золота, иммобилизация антител к CRP на каликс[6]арене, непосредственно закрепленном на золотой поверхности электрода, обеспечивают более высокую концентрацию рецепторных молекул и способствует формированию наиболее устойчивых, чувствительных и конформационно доступных покрытий.

4. Установлено, что применение тиолированных наночастиц золота для усиления аналитического сигнала сенсора приводит к образованию устойчивого тройного комплекса ДНК - анти-ДНК - AuNPSH или анти-CRP - CRP - AuNPSH, что позволяет снизить пределы обнаружения в 3 раза при определении антител к ДНК и в 10 раз при определении С - реактивного белка в прямом формате анализа. Проведение предварительной конъюгации тиолированных наночастиц золота с поликлональными антителами к сульфаметазину или моноклональными антителами к алдрину упрощает процедуру анализа и снижает предел обнаружения сульфаметазина в конкурентном формате анализа с 2,2 до 0,6 мкг/мл и алдрина в сэндвич -формате с 2 до 0,6 нг/мл.

5. Разработаны методики определения антител к ДНК в диапазоне концентраций 0,005 - 0,1 мкг/мл, С- реактивного белка - 0,1 - 10 мкг/мл, сульфаметазина - 5 -120 мкг/мл и алдрина - 1 - 100 нг/мл с помощью пьезокварцевого иммуносенсора, усиленного тиолированными наночастицами золота. Разработанные сенсоры апробированы для определения антител к ДНК и С — реактивного белка в сыворотке крови, сульфаметазина в яйце и молоке, алдрина в вине и винограде.

Работы, опубликованные по теме диссертации:

1. Шашканова О.Ю. Перспективы использования пьезокварцевого иммуносенсора для клинической диагностики аутоиммунных заболеваний. / О.Ю. Шашканова, Е.Н.Калмыкова, Т.Н.Ермолаева // Медицинские приборы и технологии. Сборник научных трудов. ТулГУ. 2007. С. 125-128.

2. Калмыкова Е.Н Проточные пьезокварцевые иммуносенсоры для диагностики инфекционных и соматических заболеваний / Е.Н.Калмыкова, О.Ю. Шашканова, Т.Н Ермолаева // II Всерос. конф. по аналитической химии с международным участием «Аналитика России 2007»: тез. докл. -Краснодар, 2007. -С. 429.

3. Ермолаева Т.Н. Пьезокварцевые биосенсоры для анализа объектов окружающей среды, пищевых продуктов и для клинической диагностики / Т.Н. Ермолаева, Е.Н.Калмыкова, О.Ю. Шашканова // Рос. хим. журн. 2008. Т. LII, N 2. С. 17-29.

4. Шашканова О.Ю. Пьезокварцевый иммуносенсор для диагностики аутоиммунных и инфекционных заболеваний / О.Ю. Шашканова, E.H. Калмыкова, Т.Н. Ермолаева // VII Всерос. конф. по электрохим. методам анализа с межд. участием «ЭМА - 2008»: тез. докл. - Уфа - Абзаково, 2008. -С.127.

5. Ermolaeva T.N. Piezoquartz biosensors for analysis of environmental objects foodstuff and for clinical diagnostic / T.N. Ermolaeva E.N. Kalmykova, O.Yu. Shashkanova //Rus. J. of General Chem. 2008. V. 78. № 12. P. 2430-2444.

6. Мелихова E.B. Определение следовых концентраций сульфаниламидных препаратов в объектах окружающей среды / Е.В. Мелихова, О.Ю. Шашканова, С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева // VII Всеросс. конф. по анализу объектов окружающей среды. «Экоаналитика -2009»: тез. докл. - Йошкар-Ола, 2009. - С. 148.

7. Шашканова О.Ю. Применение золотых наночастиц для усиления сигнала пьезокварцевого иммуносенсора / О.Ю. Шашканова, Т.Н. Ермолаева // III Всеросс. конф. «Аналитика России» с международ, участием: тез. докл. -Краснодар, 2009. -С. 157.

8. Шашканова О.Ю. Усиление сигнала пьезокварцевого ДНК-сенсора с помощью золотых наночастиц / О.Ю. Шашканова, Т.Н. Ермолаева // Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология - 2009» -Пущино: ИБФМ РАН, 2009. -С. 80-82.

9. Карасева H.A. Изучение условий формирования наноструктурированных покрытий пьезокварцевых иммуносенсоров / Е.А. Карасева, О.Ю. Шашканова, Т.Н. Ермолаева // Всеросс. конф. с элементами науч. школы для молодежи «Экотоксикология - 2009» - Пущино: ИБФМ РАН, 2009. -С. 40-42.

10. Шашканова О.Ю. Новый метод диагностики аутоиммунных заболеваний, основанный на аффинной реакции на поверхности пьезокварцевого сенсора. 1. Изучение условий синтеза золотых наночастиц различного размера в присутствии поверхностно-активных веществ / О.Ю. Шашканова, Т.Н. Ермолаева // Сорбционные и хроматографические процессы. 2009. Т. 9. № 5. - С. 677 - 684.

11. Шашканова О.Ю. Новый метод диагностики аутоиммунных заболеваний, основанный на аффинной реакции на поверхности пьезокварцевого сенсора. 2. Исследование сорбции тиосоединений на золотых наночастицах и образования конъюгатов с анти-ДНК / О.Ю. Шашканова, Т.Н. Ермолаева // Сорбционные и хроматографические процессы. 2009. Т. 9. № .5 - С.685 - 693.

12. Шашканова О.Ю. Применение золотых наночастиц для усиления сигнала пьезокварцевого иммуносенсора О.Ю. Шашканова, Т.Н. Ермолаева // Заводская лаборатория. 2010. №3. С. 37-40.

Подписано в печать 28.04.2010 . Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Ризография. Объем 1,1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 421

Полиграфическое подразделение Издательства Липецкого государственного технического университета. 398600 Липецк, ул.Московская, 30.

Введение. Общая структура работы.

Глава I. Обзор литературы.

1.1 .Методы получения наночастиц золота.

1. 2. Повышение агрегативпой устойчивости наночастиц золота.

I. 3 11римеиение наночастиц золота при определении биополимеров и биологически активных соединений.

Глава II. Экспериментальная часть.

П. 1 .Характеристика химических и нммунореагентов.

II.2. Способы формирования иммуноаффинных покрытий сенсоров

11.3. Измерение аналитического сигнала пьезокварцевого иммупосепсора.

11.4. Атомно-силовая микроскопия.

11.5. Пробоиодготовка продуктов и биологических жидкостей.

П.6. Оценка результатов измерений с помощью пьезокварцевого иммупосепсора.

II.7. Определение констант скорости прямой и обратной гетерогенной иммунохимической реакции и константы аффинности.

Глава III. Изучение условий синтеза и поверхностной модификации напочаешц золота.

III. 1. Влияние природы, концентрации восстановителя и стабилизатора, рН среды на размер и дисперсность наночастиц золота.

III.2. Изучение функционализации наночастиц золота.

Глава IV. Изучение влияния наночастиц золота на аналитический сигнал сенсора при определении высоко- и низкомолекулярпых.

IV. 1. Усиление аналитического сигнала сенсора при определении высокомолекулярных соединений.

TV. 1.1. Изучение иммунохимичсской реакции ДНК и анти-ДПК с помощью пьезокварцевого иммупосенсора и методом атомной силовой микроскопии.

IV. 1.2. Изучение иммунохимической реакции образования комплекса С - реактивный белок - антитела к CRP с помощью пьезокварцевого иммупосенсора.

TV. 1.2.1. Формирование иммуноаффинного покрытия для определения С - реактивного белка.

IV. 1.2.2. Применение наночастиц золота для определения С реактивного белка.

IV.2. Усиление аналитического сигнала сенсора при определении при определении низкомолекулярных соединений.

IV.2.1. Наночастицы золота для определения сульфаметазина в конкурентном формате анализа.

IV.2.1.1.Формирование иммуноаффинного нокрьпия для определения сульфаметазина.

IV.2.1.2. Оптимизация условий определения сульфаметазина в конкурентном формате анализа с помощью наночастиц золота.

V.2.2. Наночастицы золота для определения алдрина в сэндвич формате анализа.

IV.2.2.1. Формирование иммуноаффинных покрытий на основе поликлональных антител к алдрину.

IV.2.2.2. Изучение условий образования поверхностного сэндвич иммунокомплекса.

Глава V. Практическое применение пьезокварцевых иммупосенсоров, усиленных напочастицами золота.

VI. Выводы.

Список ли тературы.

Актуальность. Пьезокварцевые иммуносенсоры положительно зарекомендовали себя в качестве удобного инструмента для проведения биохимических и клинических исследований, сертификации пищевых продуктов и фармацевтических препаратов, мониторинга объектов окружающей среды. Уникальной особенностью пьезокварцевых гравиметрических иммуносенсоров является сочетание высокой чувствительности, связанной с использованием в качесше физического преобразователя высокочасто того пьезокварцевого резонатора АТ-среза, и селективности, вследствие применения иммупореагептов. Аналитическим сигналом пьезокварцевого иммуносепсора служит уменьшение частоты колебаний при образовании иммуиокомплекса на поверхности его электрода. Дальнейшее снижение предела обнаружения аналитов возможно за счет присоединения к поверхностному иммунокомгглексу наночастиц полимеров или металлов. Наибольший интерес при определении высоко- и низкомолекулярпых соединений представляет использование наночастиц золота, характеризующихся высокой биосовместимостыо, инертностью и способностью образовывать достаточно прочные связи с биомолекулами.

Паночастицы золота положительно зарекомендовали себя в оптических и электрохимических сенсорах. Имеются немногочисленные работы, посвященные применению наночастиц золота для усиления аналитического сигнала пьезокварцевого иммуносепсора при определении высокомолекулярных соединений, например инсулина, трипсина и др. Еще в меньшей свисни изучено усиление аналитического сигнала при определении пизкомолекулярных соединений, например, пестицидов и лекарственных препаратов. Однако систематические исследования по изучению возможности применения наночастиц золота для усиления сигнала пьезокварцевого иммуносепсора ранее не проводились. Поэтому актуальным является расширение перечня определяемых с помощью пьезокварцевых иммуносепсора, усиленного ианочастицами золота, соединений, в частности за счет биомаркеров аутоиммунных заболеваний и воспалительных процессов, что позволит повысить надежность ранней клинической диагностики, токсичных пестицидов и лекарственных препаратов, являющихся широко распространенными загрязнителями пищевых продуктов и объектов окружающей среды. Также необходимо дополнительное изучение условий синтеза устойчивых наночастиц золота фиксированного размера для усиления сигнала пьезокварцевого иммуносенсора.

Цель исследования заключалась в изучении возможности применения наночастиц золота для повышения чувствительности определения и снижения предела обнаружения высоко- и низкомолекулярных соединений с помощью пьезокварцевого иммуносенсора. Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены следующие задачи: разработка методик получения наночастиц золота из золотохлористоводородной кислоты для последующего применения в ньезоквар] \свых иммупосенсорах; изучение закономерности тиолирования наночастиц золота и образование конъюгатов с молекулами антител к ДНК и С - реактивным белком, антителами к сульфаметазину и алдрину; изучение способов иммобилизации ДНК, антител к CRP, поликлональных anIшел к алдрину и сульфаметазин-белкового коныогата на поверхности электродов пьезокварцевого резонатора для формирования устойчивых и конформационно доступных покрытий сенсора; разработка методик определения следовых концентраций высокомолекулярных (антитела к ДНК, С - реактивный белок) и инзкомолекулярных (сульфаметазин, алдрин) соединений с помощью пьезокварцевого иммуносенсора, усиленного ианочастицами золота.

Научная новизна работы: установлено влияние концентрации восстановителя, стабилизатора и рН среды на средний диаметр синтезированных паночастиц золота из золотохлористоводородной кислоты с помощью хлорида олова (II); предложены новые способы формирования иммуноаффинных покрытий сенсоров для определения антител к ДНК на основе тиолированньтх паночастиц золота и С - реактивного белка на основе калике [6 |арепа; г [оказало влияние размера паночастиц золота, природы и концентрации тиолиругощего агента и соотношения концентраций тиосоедииение/паночастицы золо та па эффективность связывания с молекулами анти-ДНК и С - реактивным белком, антителами к сульфаметазину и алдрину; установлены закономерности применения золотых паночастиц для усиления аналитического сигнала ньезокварцевого иммупосенсора и снижения предела обнаружения высокомолекулярных соединений (антитела к ДНК, С -реактивный белок) в прямом формате и пизкомолекулярных соединений (сульфаметазип и алдрип) в конкурентном и сэндвич форматах анализа. Практическая значимость; разработаны методики получения паночастиц золота со средним диаметром 5, 30, 50 нм и их функционализации с помощью L-цистамипа, 11-меркаптоундеканола, меркаптопропионовой кислоты и s-ацетилмеркаптоянтарпой кислоты; показана возможность применения паночастиц золота для усиления аналитического сигнала сенсора и снижения предела обнаружения при определении высоко- и низкомолекулярных соединений; разработаны методики определения следовых концентраций антител к ДНК, С - реактивного белка, сульфаметазина и алдрипа с помощью ньезокварцевого иммуносенсора, усиленного напочастицами золота.

На защиту выносятся; методики получения наночастиц золота из золотохлористоводородной кислоты с помощью хлорида олова (И) со средним диаметром 5, 30, 50 нм для последующего применения в пьезокварцевых иммуносенсорах; закономерности функционализации поверхности наночастиц золота меркаптопроизводными (ангидрид s-ацетилмеркаптоянтарной кислоты, 2-меркаптоэтиламшт (L-цистамин), меркаптопро1 тоновая кислота и 11-меркаптоундеканол) и взаимодействия с белковыми молекулами антител к Д1IK и С - реактивным белком, антителами к сульфаметазину и алдрину; способы формирования устойчивых и чувствительных биорецепторных покрытий для определения антител к ДНК на основе тиолированпых наночастиц золота и С - реактивного белка па основе каликс[6]арепа; зависимость аналитического сигнала пьезокварцевого сенсора, предназначенного для определения высоко- и низкомолекулярных соединений от размера наночастиц золота, природы и концентрации применяемого для их функционализации тиолирующего агента; методики определения следовых концентраций антител к ДНК, С -реактивного белка, сульфаметазина и алдрина с помощью пьезокварцевого сенсора, усиленного паночастицами золота.

Апробация работы. Отдельные разделы диссертации доложены на II и III Всероссийской конференции по аналитической химии с международным участием «Аналитика России», (Краснодар, 2007, 2009 гг.), VTI Всероссийской конференции но электрохимическим методам анализа с международным участием (Уфа - Абзаково, 2008), VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика -2009» (Йошкар-Ола, 2009), Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология - 2009» (Пущино, 2009).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 6 статьях, 5 из которых входят в список, рекомендованный ВАК, и 6 тезисах докладов.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 41 рисунок и 21 таблицу. Состоит из введения, 6 глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 232 источника и приложения.

VI. Выводы

1. Изучено влияние рН, природы и концентрации восстановителя, электролита и стабилизатора на размер наночастиц золота, получаемых восстановлением зологохлористоводородной кислоты. Установлено, что для синтеза частиц диаметром 5 нм в присутствии хлорида олова (И) необходимо поддерживать рН 4,24; мольное соотношение золотохлороводородной кисло гы и хлорида олова 1:4,5 и концентрацию PEG 10 мг/л. Увеличение рП и снижение концентрации хлорида олова приводит к укрупнению наночастиц и снижению их устойчивости.

2. В результате изучения процессов функциоиализации наночастиц золота различного размера тиореагентами установлено, что для применения в пьезокварцевых иммуносенсорах могут быть рекомендованы т иодированные цистамином или И — меркаптоундеканолом наночастицы золота диаметром 5 нм, обеспечивающие максимальное значение аналитического сигнала. Оптимальное соотношение при тиолировапии молярных концентраций тиосоединения и наночастиц золота 2:1.

3. Изучены условия получения иммуноаффинных покрытий сенсоров на основе ДНК с применением самоорганизующихся тио- (11-меркаптоупдеканол, меркаптопропионовая кислота, поли-L-лизин) и силоксаповых слоев, конкапавалина А, авидии-биотинового комплекса, а также 'тиолированных наночастиц золота и показано, что иммобилизация молекул ДНК па силанизированпой подложке и на поверхности авидина с применением тиолированных наночастиц золота способствует формированию наиболее устойчивых, чувствительных и конформационно доступных покрытий.

4. Изучены условия иммобилизации антител к CRP на подложке из каликс[6]арена и показано, что закрепление каликс[6 ]арена непосредственно на золотой поверхности электрода обеспечивает более высокую концентрацию рецепторных молекул, способствует снижению предела обнаружения CRP и расширению диапазона определяемых содержаний.

5. Установлено, чю применение тиолировапных наночастиц золота для усиления аналитического сигнала сенсора способствует образованию устойчивого тройного комплекса ДНК - апти-ДНК - AuNPSH или анги-CRP -CRP - AuNPSH, что позволяет снизить пределы обнаружения в 3 раза при определении антител к ДНК ив 10 раз при определении С — реактивного белка в прямом формате анализа. Проведение предварительной конъюгации тиолированиых наночастиц золота с поликлоиальными ан i ителами к сульфаметазину или моноклональпыми антителами к алдрину позволяет упрос гить процедуру анализа и снизить предел обнаружения с 2,2 до 0,6 мкг/мл при определении сульфаметазина в конкурентном формате анализа и с 2 до 0,6 нг/мл при определении алдрина в сэндвич формате.

6. Разработаны методики определения антител к Д11К в диапазоне концентраций 0,005 - 0,1 мкг/мл, С- реактивного белка - 0,1 - 10 мкг/мл, сульфаметазина - 5 -120 мкг/мл и алдрина - 1 - 100 нг/мл с помощью пьезокварцевого иммуносепсора, усиленного тиолированными наночастицами золота. Разработанные сенсоры апробированы для определения антител к ДНК и С - реактивного белка в сыворотке крови, сульфаметазина в яйце и молоке, алдрина в вине и винограде.

1. Cognet L., Tardin С., Boyer D., Choquet D., Tamarat P. Single metallic nanoparticle imaging for protein detection in cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2003.-V. 100.-№20.-P. 1 1350-11355.

2. Huang X., EI Sayed 1.11., Qian W. El-Sayed M.A. Cancer cell imaging and photothermal therapy in the near-infrared region by using gold nanorods. // J. Am. Chem. Soc.-2006.- V. 128. - № 6. - P. 2115-2120.

3. Li J., Wang C., Chen В., Dai Y., Zhang R., Song M. et al. The enhancement effect of gold nanoparticles in drug delivery and as biomarkers of drug-resistant cancer cells. // ChemMedChem. 2007. - V. 2. - № 3. - P. 374 - 378.

4. Young-Pil Kim, Eunkeu Oh, Hyun Kyong Shon, Dae Won Moon, Tae Geol Lee, Hale-Sung Kim. Gold nanoparticle-enhanced secondary ion mass spectrometry and its bio-applications. // Applied Surface Science. 2008. - V. 255,-№4.-P. 1064-1067.

5. Dong Xi, Xiaoping Luo, Qin Ning, Qianghua Lu, Kailun Yao, Zuli Liu. The detection of LIB V DNA with gold nanoparticle gene probes. // Journal of Nanjing Medical University. 2007. - V. 21.-№4.-P. 207-212.

6. Banerjee I. A., Regan M. R. Preparation of gold nanoparticle templated germania nanoshells. // Materials Letters. 2006. - V. 60, - № 7. - P. 915-918.

7. Mingzhou Yu, Jianzhong Lin, Tatleung Chan. Numerical simulation of nanoparticlc synthesis in diffusion llame reactor. // Powder Technology. 2008. -V. 181.- № I.-P. 9-20.

8. Huan Ma, Lcnore L. Dai. Synthesis of polystyrene-silica composite particles via one-step nanoparticle-stabilized emulsion polymerization. // J. Colloid and Interface Science. 2009. - V. 333. - №. 2. - P. 807-811.

9. Дыкман JI. А., Богатырев В. А., Щеголев С. Ю., Хлебцов Н. Г. Золотые наночастицы: Синтез,свойства, биомедицинское применение. М.: Наука. -2008. -319 с.

10. D. Jason Riley. Electrochemistry in nanoparticle science //Current Opinion in Colloid and Interface Science. 2002. - V. 7. -№ 3. - P. 186-192.

11. Yung-Chin Yang, Chang-IIai Wang, Yeu-Kuang Hwu, Jung-Ho Je. Synchrotron X-ray synthesis of colloidal gold particles for drug delivery // Materials Chemistry and Physics. 2006. - V. 100. - № 1. - P. 72-76.

12. Jorge Perez-Juste, Isabel Pastoriza-Santos, Luis M. Liz-Marzan, Paul Mulvaney. Gold nanorods: synthesis, characterization and applications // Coordination Chemistry Reviews. 2005. - V. 249. - №17. - P. 1870-1901.

13. Karsten Wegner, Sotiris E. Pratsinis. Scale-up of nanoparticle synthesis in diffusion flame reactors // Chemical Engineering Science. 2003. - V. 58. - № 20. -P. 4581-4589.

14. Помогайло А.Д., Розенберг А.С., Уфлянд И.Е. Наночастицы металлов в полимерах. М.: Химия. 2000. - 672 е.

15. Смирнов В.В., Тюрина Л.А. // Усп. хим. 1994. -№ 52. - С. 1350.

16. Turcevich J., Stevenson Р.С., Hiller J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold // Discuss. Faraday Soc. 1951. -V.l 1.-P.55-75.

17. Mirkin Ch. Programming the assembly of two- and three-dimensional architectures with DNA and nanoscale inorganic building blocks // Inorg. Chem. -2000. V. 39. - P. 2258-2272.

18. Nakamura K., Kawabata Т., Mori Ya. Size distribution analysis of colloidal gold by small angel X-ray scattering and light absorbance // Powder Technol. -2003.-V. 131.-P. 120-128.

19. Frens G. Controlled nucleation for the particle size in monodisperse gold suspensions // Nature Phys. Sci. 1973. - V. 241. - P. 20-22.

20. Creighton J. A., Eadon D. G. Ultraviolet-visible absorption spectra of the colloidal metallic elements // J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1991. - V. 87. - № 24.-P. 3881.

21. Roth J., Bulloc Ed. G.R, Persusz P. The colloidal gold marker system for light and electron microscopy cytochemistry // Techniques in immunocytochemistry // L/: Acad. Press. 1983. - V. 2. - P. 217-284.

22. T-Ienglein A. Radiolytic Preparation of Ultrafme Colloidal Gold Particles in Aqueous Solution: Optical Spectrum, Controlled Growth, and Some Chemical Reactions // Langmuir. 1999. - V. 15. - P. 6738-6744.

23. Stathis B.C. Fabricfiios A. Preparation of colloidal gold // Chem. Industr. (London). 1958. V. 27. P. 860 861.

24. Fabricanos A., Athanasions S., Licser K.N. Darstellung stabilec Hydrosole von Gold und Silber ourch Reduction mit Athylendimimtetraessigsaure // Ztchr. Naturforsch. 1963.-V. Bd. LS. - P.612-617.

25. Tarozaite R., Juskenas R., Kurtnaitiene ML, Jagminiene A., Vaskelis A. Gold colloids obtained by Au(IH) reduction with Sn(II): preparation and characterization // Chemiya. 2006. - V. 17. - № 2-3. - P. 1-6.

26. Tschopp J., Podack E.R., Muller -Eberchard LT.J. Ultrastructure of the membrane attack complex of complement: Detection of the tctramolecular C9-polymerizing complex C5b -8 // Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1982.- V. 79. - №23. - P. 7474-7478.

27. Xiong Liu, Mark Atwater, Jinhai Wang, Qun Huo. Extinction coefficient of gold nanoparticles with different sizes and different capping ligands //Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2007. - V. 58. - № 1. - P. 3-7.

28. Wagner J., Tshikhudo T.R., Kohler J.M. Microfluidic generation of metal nanoparticles by borohydride reduction //Chemical Engineering Journal. 2008. -V. 135.-P. 104-109

29. Ycc С. К., Jordan R., Ulmaii A., White II., King A., Rafailovich M., Sokolov J. Novel One-Phase Synthesis of Thiol-Functionalized Gold, Palladium, and Iridium Nanoparticles Using Superhydride // Langmuir. 1999. - V. 15. - № 10.-P. 3486-3491.

30. Corbierre M. K., Lennox R. B. Preparation of Thiol-Capped Gold Nanoparticles by Chemical Reduction of Soluble Au(I)-Thiolates // Chem. Mater. -2005.-V. 17.-№23.-P. 5691-5696.

31. Newman J. D. S., Blanchard G. J. Formation of Gold Nanoparticles Using Amine Reducing Agents // Langmuir. 2006. - V. 22. - № 13. - P. 5882-5887.

32. Zheng N., Fan J., Stucky G. D. One-Step One-Phase Synthesis of Monodisperse Noble-Metallic Nanoparticles and Their Colloidal Crystals // J. Am. Chem. Soc. 2006. - V. 128. - № 20. - P. 6550-6551.

33. Muhlprofdt FI. The preparation of colloidal gold particlies using tannic acid as an additional reducing agent //Experientia. -1982.-V.38.-P.1127-1128.

34. Slot J.W., Geuze FI.J. A new method of preparing gold probes for multiple -labeling cytochemistry // Europ. J. Cell Biol. 1985. - V. 38. - P.87-93.

35. Подлегаева .IT. Исследование условий получения ультрадисперсных частиц серебра и золота при химическом осаждении. / Л.Н. Подлегаева, JT.B. Колесников // Вестник КемГУ, Серия: Физика. Кемерово. - 2008. - № 3. -С. 96-98.

36. Bachong W., Lucocq J.M., Roth J. Thiocyanate gold: Small (2-3 nm) colloidal gold for affinity cytochemical labeling in electron microscopy // Histochemistry. 1985.-V. 83. - P.409-411.

37. Birrel G.B. Hedberg K.K. Immunogold labeling with small gold particlies : Silver enhancement provides increased detectsbiluty at low magnifications // J. Electron. Microsc. Technol. 1987. - V. 5. - P. 219-220.

38. Бусев А.И., Иванов B.M. Аналитическая химия золота. -М.: Наука. -1973.-263 с.

39. Hamamoto К., Kawakita H., Ohtoa K.and Inoue K. Polymerization of phenol derivatives by the reduction of gold ions to gold metal // Reactive and Functional Polymers. 2009. - V. 69. - №. 9. - P. 694-697.

40. Chang Cheng You, Apiwat Chompoosor, Vincent M. Rotello. The biomacromolecule - nanoparticle interface // Nanotoday. - 2007. - V.2. - №3. - P. 34-43.

41. Bethell D., Brust M., Schiffrin D.J., Kiely C. From monolayers to nanostructured materials: an organic chemist's view of self-assembly //Journal of Electroanalytical Chemistry. 1996. - V. 409. -№ 1-2. - P. 137-143.

42. Brust M., Kiely C. Some recent advances in nanostructure preparation from gold and silver particles: a short topical review // Colloids and Surfaces A: Physicochcmical and Engineering Aspects. 2002. - V. 202. - №. 2-3. - P. 175 -186.

43. Taylor M. D. R., Moriarty P., Brust M. Polydisperse Au nanoclusters on silicon: fractal aggregates via spinodal decomposition? // Chemical Physics Letters.-2001.-V. 348.-№. 1-2. P. 27-33.

44. Faraday M. The Bakerian Lecture: Experimental Relations of Gold (and Other Metals) to Light. // Phil. Trans. R. Soc. 1857. - V. 147. -P. 145-181.

45. Brust M., Walker D., Betheil D. et al. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1994,-№7.-P. 802-807.

46. Schulz-Dobrick M., Sarathy К. V., Jansen M. Surfactant-Free Synthesis and Functionalization of Gold Nanoparticles // J. Am. Chem. Soc. 2005. - V. 127. -№37.-P. 12816-12817.

47. Iwamoto M., Kuroda К., Kanzow J., Ilayashi S., Faupel F. Size evolution effect of the reduction rate on the synthesis of gold nanoparticles // Adv. Powder Tech. 2005. - V. 16. - P. 137-144.

48. Jorgcnsen J. M., Erlacher K., Pedersen J. S., Gothelf К. V. Preparation Temperature Dependence of Size and Polydispersity of Alkylthiol Monolayer Protected Gold Clusters // Langmuir. 2005. - V. 21. - P. 10320-10323.

49. Leff D. V., Ohara P. C., Heath J. R., Gelbart W. M., Thermodynamic Control of Gold Nanocrystal Size: Experiment and Theory. // J. Phys. Chem. -1995. — V.99. — P. 7036-7041.

50. Badia A., Cuccia L., Demers L., Morin F., Lennox R. В., Structure and Dynamics in Alkanethiolate Monolayers Self-Assembled on Gold Nanoparticles: A DSC, FT-1R, and Deuterium NMR Study // J. Am. Chem. Soc. 1997. - V 119. -№ 11.-P. 2682-2692.

51. Waters C. A., Mills A. J., Johnson K. A., Schiffrin D. J., Purification of dodecanethiol derivatised gold nanoparticles. // Chem. Commun. 2003. - V.4. -P. 540-541.

52. Sweeney S. F., Woehrle G. FL, Hutchison J. E. Rapid Purification and Size Separation of Gold Nanoparticles via Diafiltration. // J. Am. Chem. Soc. 2006. -V. 128.-№ 10.-P. 3190-3197.

53. Kanehara M., Sakurai J.I., Sugimura FL, Teranishi T. Room-Temperature Size Evolution of Thiol-Protected Gold Nanoparticles Assisted by Proton Acids and Flalogen Anions // J. Am. Chem. Soc. 2009. - V. 131. - № 5. - P. 16301631.

54. Chen S., Kimura K. Synthesis and Characterization of Carboxylate-Modified Gold Nanoparticle Powders Dispersible in Water. // Langmuir. 1999. - V. 15. -№4.-P. 1075-1082.

55. Weare W. W., Reed S. M., Warner M. G., FTutchison J. E., Improved Synthesis of Small 1.5 nm Phosphine-Stabilized Gold Nanoparticles. // J. Am. Chem. Soc.-2000.-V.122.-№51.-P. 12890-12891.

56. Schmid G., Pfcil R., Boese R., Bandermann 1\, Meyer S., Calis G. H. M., J. W. A. van der Velden, Au55P(C6II5)3.12C16 ein Goldcluster ungewohnlicher Grofie.//Chem. Ber. - 1981. - V. 114.-№ ll.-P. 3634-3642.

57. Schmid G., Pugin R., JMalm.-O., Bovin J.-O., Silsesquioxanes as Ligands for Gold Clusters, liur. // J. Inorg. Chem. 1998. - V.6. - P. 813-817.

58. Li D., He Q., Li J. Smart core/shell nanocomposites: Intelligent polymers modified gold nanoparticles // Advances in Colloid and Interface Science. 2009. -V. 149. -№. 1-2.-P. 28-38.

59. Sun X., Luo Y. Size-controlled synthesis of dendrimer-protected gold nanoparticles by microwave radiation // Materials Letters. 2005. — V. 59. - №. 29-30. - P. 4048-4050.

60. Garcia M. E., Baker L. A., Crooks R. M. Preparation and Characterization of Dendrimer-Gold Colloid Nanocomposites // Anal. Chem. 1999. - V. 71. - № 1. -P. 256-258.

61. Garcia-M. J. C., Crooks R. M. Extraction of Au Nanoparticles Having Narrow Size Distributions from within Dendrimer Templates // J. Am. Chem. Soc. 2004. - V. 126.-№49.-P. 16170-16178.

62. Krasteva N., Besnard I., Guse В., Bauer R. E., Mullen K., Yasuda A., Vossmeyer T. Self-Assembled Gold Nanoparticle/Dendrimer Composite Films for Vapor Sensing Applications // Nano Lett. 2002. - V. 2. - № 5. - P. 551-555.

63. Vossmeyer Т., Guse В., Besnard I., Bauer R. E., Mullen K., Yasuda A. Gold Nanoparticle/Polyphenylene Dendrimer Composite Films: Preparation and Vapor-Sensing Properties // Adv. Mater. 2002. - V. 14. - № 3. - P. 238-242.

64. Labande A., Ruiz J., Astruc D. Supramolecular Gold Nanoparticles for the Redox Recognition of Oxoanions: Syntheses, Titrations, Stereoelectronic Effccts, and Selectivity // J. Am. Chem. Soc. 2002. - V. 124. - № 8. - P. 1782-1789.

65. Grohn F.,. Bauer B. J, Akpalu Y. A., Jackson C. L., Amis E. J. Dendrimer Templates lor the Formation of Gold Nanoclusters // Macromolecules. 2000. -V. 33. - JV° 16. - P. 6042-6050.

66. Crooks R. M., Zhao M., Sun L., Chechik V., Ycung L. K. Dendrimcr-Encapsulated Metal Nanoparticles: Synthesis, Characterization, and Applications to Catalysis//Лес. Chem. Res. 2001.-V. 34.-№3. --P. 181-190.

67. Niu Y., Crooks R. M. Dendrimer-encapsulated metal nanoparticles and their applications to catalysis. II C. R. Chimie. -2003. V. 6 (8-10).-P. 1049-1059.

68. Hsumi K., Satoh K., Torigoe K. Interactions between Alkanethiols and Gold-Dcndrimer Nanocomposites // Langmuir. 2001. - V. 17. - № 22. - P. 6860-6864.

69. Manna A., Imae Т., Aoi K., Okada M., Yogo T. Synthesis of Dendrimer-Passivated Noble Metal Nanoparticles in a Polar Medium: Comparison of Size between Silver and Gold Particles // Chem. Mater. 2001. - V. 13. - № 5. - P. 1674-1681.

70. Chechik V., Crooks R. M. Monolayers of Thiol-Terminated Dendrimers on the Surface of Planar and Colloidal Gold // Langmuir. 1999. - V. 15. - № 19. P. 6364-6369.

71. Wilson О. M., Scott R. W. J., Garcia-Martinez J. C., Crooks R. M. Separation of Dendrimer-Encapsulated Au and Ag Nanoparticles by Selective Extraction // Chem. Mater. 2004. - V 16. - № 22. - P. 4202-4204.

72. Taubert A., Wiesler U.-M., Mullen K. Dendrimer-controllcd one-pot synthesis of gold nanoparticles with a bimodal size distribution and their self-assembly in the solid state // J. Mater. Chem. 2003. - V. 13. - № 5.- P. 10901093.

73. Love С. S., Cheehik V., Smith D. K., Brennan C., Dendron stabilised gold nanoparticles: generation dependence of core size and thermal stability // J. Mater. Chem. - 2004. - V. 14. - № 5. - P. 919-923.

74. Li D., Li J. Frechet-type dendrons-capped gold clusters // Colloids Surf. Л2005. Y. 257. - P. 255-259.

75. Knecht M. R., Garcia-Martinez J. C., Crooks R. M. Hydrophobic Dendrimers as Templates for Ли Nanoparticles // Langmuir. 2005. - V. 21. - № 25.-P. 11981-11986.

76. Eastoe J., Hollamby M. J., Hudson L. Recent advances in nanoparticle synthesis with reversed micelles //Advances in Colloid and Interface Science.2006.-V. 128-130. P. 5-15.

77. Manna A., Imae Т., Yogo Т., Aoi K.,i Okazalci M. Synthesis of Gold Nanoparticles in a Winsor II Type Microemulsion and Their Characterization //Journal of Colloid and Interface Science. 2002. - V. 256. - № 2. - P. 297-303.

78. Chen F.; Xu G.-Q.; Iior T. S. A. Preparation and Assembly of Colloidal Gold Nanoparticles in СТАВ Stabilized Reverse Microemulsion // Mater. Lett. -2003. V. 57. - P. 3282-3286.

79. Manna Д.; Imae Т.; Yogo Т.; Aoi К.; Okazaki, M. Synthesis of Gold Nanoparticles in a Winsor II Type Microemulsion and Their Characterization // J. Colloid Interface Sci. 2002. - V. 256. - P. 297-303.

80. Arcoleo V.; Liveri V. T. AFM Investigation of Gold Nanoparticles Synthesized in Water/AOT/n-heptanes // Chem. Phys. Lett. 1996. - V. 258. - P. 223-227.

81. Porta F.; Prati L.; Rossi M.; Scan G. Synthesis of Au (0) Nanoparticles from W/O Microcmulsions. Colloids Surf. 2002. - V.211. - P. 43-48.

82. Liu, S.; Weaver J. V. M.; Save M.; Armes S. P. Synthesis of pFI-Responsive Shell Cross-Linked Micelles and Their Use as Nanoreactors for the Preparation of Gold Nanoparticles // Langmuir. 2002. - V. 18. - P. 8350-8357.

83. Johnson S. R.; Evans S. D.; Brydson R. Influence of a Terminal Functionality on the Physical Properties of Surfactant-Stabilized Gold Nanoparticles // Langmuir. 1998. - V. 14. - P. 6639-6647.

84. ITassenkam Г.; Norgaard K.; lversen L.; Kiely C. J.; Bjornholm T. Fabrication of 2D Gold Nanowires by Self-Assembly of Gold Nanoparticles on Water Surfaces in the Presence of Surfactants // Adv. Mater. 2002. - V. 14. - P. 1126-1130.

85. Kawai Т.; Neivandt D. J.; Davies P. B. Sum Frequency Generation on Surfactant-Coated Gold Nanoparticles // J. Am. Chem. Soc. 2000. - V. 122. - P. 12031-12032.

86. Svergun D. I.; Shtylcova E. V.; Dembo А. Т.; Bronstein L. M.;Platonova O. A.; Yakunin A. N.; Valetsky P. M.; Khokhlov A.R. Size Distributions of Metal Nanoparticles in Polyelectrolyte Gels // J. Chem. Phys. 1998. - V. 109. - P. 111109-11116.

87. Mayer Л. В. R.; Mark J. E. Colloidal Gold Nanoparticles Protected by Cationic Polyelectrolytes // Pure Appl. Chem. 1997. - V. 11. - № 34. - P. 21512164.

88. Mayya K. S.; Schoeler В.; Caruso F. Preparation and Organization of Nanoscale Polyelectrolyte-Coated Gold Nanoparticlcs // Adv. Funct. Mater. -2003.-V. 13.-P. 183 -188.

89. Булавченко А.И., Арымбаева А. Т., Булавченко О. А., Татарчук В.В. Получение наночастиц золота в обратных мицеллах TRITON N-42 после сульфатио-хлоридных растворов // Журн. физической химии. 2006. - Т.80. - №12. — С.2220-2225.

90. Eastoe J., Hollamby M.J., Hudson L. Recent advances in nanoparticle synthesis with reversed micelles //Advances in Colloid and Interface Science. —2006.-V. 128- 130.-P. 5-15.

91. Ершов Б.Г. Наночастицы металлов в водных растворов: электронные оптические и каталитические // Рос. хим. журн. 2001. - Т. XLV. - № 3. - С. 20-30.

92. Petit С., Pileni М.Р. Physical Properties of Sell-Assembled Nano-Sized Cobalt Particles // Appl. Surf. Sci. 2000. - V. 162 - 163. - P. 519.

93. Spalla O. Nanoparticle interactions with polymers and polyelectrolytes // Current Opinion in Colloid & Interface Science. 2002. - V. 7. - № 3 - 4. - P. 179 185.

94. Левченко Л.А., Карцев В.Г., Садков А.П., Шестаков А.Ф., Шилова А.К., Шилов А.Е. Биомиметические модели Р1ЛД1Т зависимого окисления метана золотом в комплекс с биофлаваноидами // Доклады Академии наук.2007. Т. 412. - № 4. - С. 500-502.

95. Sperling R.A. Surface Modification and Functionalization of colloidal nanoparticles. // Marburg/Lahn. — 2008. P. 7-9.

96. Haba Y., Kojima С., Harada A., Ura Т., Horinaka II. and Kono K. Preparation of poly (ethylene glycol)-modified poly (amido amine) dendrimers encapsulating gold nanoparticles and their heat-generating ability // Langmuir. -2007.-V. 23.-P. 5243.

97. Tripathy P., Mishra A.and Ram S. Immobilizing Au-nanocolloids in cobranched polymer molecules in presence of gluconic acid in poly (vinyl alcohol) in hot water // Mater. Chem. Phys. 2007. - V. 106. - P. 379.

98. Salvati R., Longo A., Carotenuto G., Nicola S. D., Pepe G.P., Nicolais L. and Barone A. UV—vis spectroscopy for on-line monitoring of Au nanoparticles size during growth // Applied Surface Sci. 2005. - V. 248. - P. 28 - 31.

99. Wagner J., Kohler J.M., Continuous synthesis of gold nanoparticles in a micro reactor // Nano Lett. 2005. - V. 5. - № 4. - P. 685-691.

100. Xu C., Teja A.S. Continuous hydrothermal synthesis of iron oxide and PVA-protected iron oxide nanoparticles // J. Supercritical Fluids. 2008. - V. 44. - № 1. -P. 85-91.

101. Mafune F., Kohno J., Takeda Y., Kondow T. Formation of gold nanoparticles by laser ablation in aqueous solution of surfactant // J. Phys. Chem. B. -2001. V. 105.-№22.-P. 5114-5120.

102. Kuo C.FL, Chiang T.F., Chen L.J. I-Iuang and M.FI. Synthesis of highly faceted pentagonal- and hexagonal-shaped gold nanoparticles with controlled si/es by sodium dodecyl sulfate // Langmuir. 2004. - V. 20. - №18. - P.7820 -7824.

103. Deng J.P., Wu C., Yang G.FI. and Мои C.Y. Pyrene-assisted synthesis of size-controlled gold nanoparticles in sodium dodecyl sulfate micelles // Langmuir. -2005.-V. 21.-P. 8947- 8951

104. Lu C., Zu Y. and Yam V.W.W. Nonionic surfactant-capped gold nanoparticles as postcolumn reagents for high-performance liquid chromatography assay of low-molecular-mass biothiols // J. Chromatograp. A. — 2007. V. 1163. -№ 1-2.-P. 328-332.

105. Huang II., Yang X. Synthesis of chitosan-stabilized gold nanoparticles in the absence/presence of tripolyphosphate. Biomacromoleculcs. 2004. - V. 5. - № 6. - P. 2340-2346.

106. Daniel M.C., Astruc D. Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology // Chem. Rev.- 2004. V. 104. - № 1. - P.293-346.

107. Zhang S.B, Wu Z.S., Guo M.M., Shen G.L., Yu R.Q. A novel immunoassay strategy based on combination of chitosan and a gold nanoparticle label // Talanta. -2007.-V. 71.-№4.-P. 1530-1535.

108. Remant B.K.C., Santosh A., Narayan В., Kim C.H., Kim II.Y. Stabilization of gold nanoparticles by hydrophobically-modified polycations // J. biomaterials science. 2006. - V. 17. - № 5. - P. 579-589.

109. Паддефет P.Химия золота. M.: «Мир». — 1982. 326c.

110. Wang K.L., Balandin A.A., Markel V.A., George T.l7., Wiley J., Quantum Dots: Physics and Applications in Optics of Nanostructured Materials. New York. -2001.-P.515.

111. Ulman A./ A.Ulman // Chem. Rev.-1996. №96. - P. 1533-1535.

112. Peng Z., Wang E., Dong S.Incorporation of surface-derivatized gold nanoparticles into electrochemically generated polymer films // Electrochemistry Communications. 2002. - V. 4. - № 3. - P. 210-213.

113. Aryal S., Bahadur R., Bhattarai N., Lee B.M., Kim Ii.Y. Stabilization of gold nanoparticles by thiol functionalized poly(e-Caprolactone) for the labeling of PCL biocarrier // Materials Chemistry and Physics. 2006. - V. 98. - №. 2 - 3. -P. 463-469.

114. Tang, J. Kolliopoulou S., Tsoukalas D. Fabrication of gold nanoparticlc lines based on fracture induced patterning // Microelectronic Engineering. 2009. - V. 86. - №. 4 - 6. - P. 861-864.

115. Plartmann N., Dahlhaus D., Franzka S. Self-assembled organic templates for the selective adsorption of gold nanoparticles into confined domains // Surface Science. 2007. - V. 601.-№ 18.-P. 3916-3920.

116. Klajn R., Bishop K.J.M., Grzybowski B.A. Light-controlled self-assembly of reversible and irreversible nanoparticles suprastructures. // J Proc Natl Acad Sci USA. 2007. - V. 104.-№ .25. - P. 10305-10309.

117. Walker, C.H., John J.V.St, and Neilson P.W. Synthesis and size control of gold nanoparticles stabilized by poly (methylphenylphosphazene) // J. Am. Chem. Soc. -2001. — V. 123.-№ 16.-P. 123: 3846-3847.

118. Srisombat L.-O., Park J.-S., Zhang S., Lee T. R. Preparation, Characterization, and Chemical Stability of Gold Nanoparticles Coated with Mono-, Bis-, and Tris-Chelating Alkancthiols // Langmuir. 2008. - V. 24. - № 15.-P. 7750-7754.

119. Left D.V., Ohara P.C., Heath J.C., Gelbart W.M. Thermodynamic Control of Gold Nanocrystal Size: Experiment and Theory // J. Phys. Chem. 1995. - V. 99. -P. 7036-7041.

120. Sarathy К. V., Raina G., Yadav R. Т., ICulkami G.U., Rao, C. N. R. Thiol-Derivatized Nanocrystalline Arrays of Gold, Silver, and Platinum // J. Phys. Chem. В,- 1997.-V. 101. -№ 48. P. 9876-9880.

121. Porter L. A., Ji D., Westcott S. L., Graupe M, Czernuszewicz R. S, Halas N. J., Lee T. R. Gold and Silver Nanoparticles Functionalized by the Adsorption of Dialkyl Disulfides // Langmuir. 1998. - V. 14. - P. 7378-7386.

122. Brust ML, Fink J., Bethel, D., Schiffrin D.J., Kiely C. Synthesis and reactions of lunctionalised gold nanoparticles // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1995. - № 4-5.-P. 1655-1656.

123. Johnson S. R., Evans S. D., Mahon S. W., Ulman, A. Alkanethiol molecules containing an aromatic moiety self-assembled onto gold clusters // Langmuir. -1997,-V. 13.-№ l.-P. 51-57.

124. Mayya K. S., Patil V. and Sastry M. On the Stability of Carboxylic Acid Derivatized Gold Colloidal Particles: The Role of Colloidal Solution pH Studied by Optical Absorption Spectroscopy. Langmuir. 1997. - V. 13. - № 15. - P. 3944-3947.

125. Sastry M, Mayya K. S., Bandyopadhyay K.,.pH — dependent changes in the optical properties of carboxylic acid derivatized silver colloidal particles. // Coll. Surf. A. 1997. - V. 127. - №. 1 - 3. - P. 221-228.

126. Chen S., Murray R. W. Arenethiolate Monolayer-Protected Gold Clusters // Langmuir. 1999. - V. 15. - № 3. - P. 682 - 689.

127. Leff D. V., Brandt L., Heath J. R. Synthesis and Characterization of Hydrophobic, Organically-Soluble Gold Nanocrystals Functionalized with Primary Amines // Langmuir. 1996. - V. 12. - № 20. - P. 4723 - 4730.

128. Gittins D. L; Caruso F. Tailoring the Poly electrolyte Coating of Metal Nanoparticles // J. Phys. Chem. B. 2001. - V. 105. - P. 6846-6852.

129. Weisbccker С. S., Merrill M. V., Whitesides G. M. Using Two-Stage Chemical Amplification To Determine the Density of Defects in Self-Assembled Monolayers of Alkanethiolates on Gold // Langmuir. 1996. - V. 12. - № 13. - P. 3257-3264.

130. Evans S. D., Johnson S. R., Ringsdorf II., Williams L. M. and Wolf, IT. Photoswitching of Azobenzene Derivatives Formed on Planar and Colloidal Gold Surfaces // Langmuir. 1998. - V. 14. № - 22. - P. 6436-6440.

131. Ingram R. S., ITostetler M. J. and Murray R. W. Poly-hetero-co-functionalized Alkanethiolate-Stabilized Gold Cluster Compounds // J. Am. Chem. Soc.- 1997.- V. 119. -№39. -P. 9175 -9178.

132. Templcton A. C, Plostetler M. J., Kraft,С. Т., Murray R. W. Reactivity of Monolayer-Protected Gold Cluster Molecules: Steric Effects // J. Am. Chem. Soc. 1998,- V. 120.-№ 8.-P. 1906-1911.

133. Chen J., Wiley В., Li Z. -Y., Campbell D., Saeki F., Cang IT., Au L., Lee J., Li X., Xia Y. Gold nanocages: engineering their structure for biomedical applications. // Adv. Mater. 2005. - V. 17. - P. 2255 - 2261.

134. Chen L., Wei IT., Guo Y., Cui Z., Zhang Z., Zhang X.-E. Gold nanoparlicle enhanced immuno-PCR for ultrasensitive detection of Hantaan virus nucleocapsid protein // J. Immunol. Meth. 2009. - V. 346. - № 1 - 2. - P. 64-70.

135. Dubois F., Mahler В., Dubertret В., Doris E., Mioskowski C. A Versatile Strategy for Quantum Dot Ligand Exchange // J. Am. Chem. Soc. 2007. - V. 129.-№3.-P. 482-483.

136. Warner M. G., Reed S. M., Hutchison J. E., Small, Water-Soluble, Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles Synthesized by Interfacial Ligand Exchange Reactions // Chem. Mater. 2000. - V. 12. - № 11. - P. 3316-3320.

137. Thiele II., Hoppe К., Moll G. Uber das kolloide Gold // Kolloid-Z. Polym. -1962.-V. 185. — № 45. P. 112-119.

138. Баран А.А. Полимерсодержащие дисперсные системы / А.А.Барап / 11аукова думка, Киев. 1986. - 359 с.

139. Raschke G., Kowarik S, Franzl Т., Sonnichsen C.,.Klar T.A, Feldmann J., Nichtl A., Kurzinger K. Biomolecular recognition based on single gold nanoparticle light scattering // Nano Lett. 2003. - V. 3. - № 7. - P. 935-938.

140. Bao P., Frutos A.G., Greef Ch., Lahiri J., Muller U., Peterson T.C., Warden L., Xie X.Y. High-Sensitivity Detection of DNA Hybridization on Microarrays Using Resonance Light Scattering // Anal. Chem. 2002.- V. 74. - № 8. - P. 17921801.

141. Mey J.D., Moeremans M. In Advansed Techniques in Biological Electron Microscopy. (lid. J.K.Koehlcr) / Springer-Verlag, Berlin. 1986. - 229pp.

142. Iiartmann N., Dahlhaus D., Franzka S. Self-assembled organic templates for the selective adsorption of gold nanoparticles into confined domains //Surface Science.-2007.-V. 601.-№ 18.-P. 3916-3920.

143. Brust M., Kiely C.J. Monolayer protected clusters of gold and silver // Colloids and Colloid Assemblies. 2004.-V. 11- P. 96-119.

144. Roth J. In Techniques in Immunocytochemistry, (Eds G.R.Bullock,P.Petrusz) / J.Roth./Academic Press, London. 1983.-217 pp.

145. Bera M.K., Sanyal M.K., Banerjee R., Kalyanikutty K.P., Rao C.N.R. Effect of vibrations on the formation of gold nanoparticle aggregates at the toluene-water interface //Chemical Physics Letters. 2008. - V. 461. - № 1 - 3. - P. 97-101.

146. Gu Y.-J., Cheng J., Lin C.-C., Lam Y. W., Cheng S. LI., Wong W.-T. Nuclear penetration of surface functionalized gold nanoparticles // Toxicology and Applied Pharmacology. 2009. - V. 237. - № 2. - P. 196-204.

147. Laguna A. Modern supramolecular gold chemistry: gold-metal interactions and applications. /Wiley-vch Verlag Gmbh. 2008. - 525pp.

148. Drake P.,. Lin Y.J The attachment, modification and release of gold nanoparticles from a photolabile solid phase synthesis resin, a new methodology for nanopaiticle surface modification // Thin Solid Films 2006. V. 515. — № 1. -P. 245-253.

149. Wang Z., Ma L.Gold nanoparticle probes // Coordination Chemistry Reviews. -2009. -V.253.-№ 11 12.-P. 1607-1618.

150. You C.C., De M., Rotello V.M. Monolayer-protected nanoparticle-protein interactions // Current Opinion in Chemical Biology. 2005. - V. 9. - № 6. - P. 639-646.

151. Stein E. W.; McShane M. J. Multilayer Lactate Oxidase Shells on Colloidal Carriers as Engines for Nanosensors. // Nanobioscience. 2003. - №2. - P. 133137.

152. Gregori L, Hainfeld JF, Simon M.N, Goldgaber D Binding of amyloid beta protein to the 20 S proteasome // J Biol Chem. 1997. - V. 272. - P. 58-62.

153. Wilson R. The use of gold nanoparticles in diagnostics and detection // Chem. Rev. 2008. - V. 37. - P. 2028-2045

154. Malmsten M. Biopolymers at Interfaces, 2nd ed // Marcel Dekker: New York.-2003.-P. 110

155. Шашканова О.Ю., Калмыкова E.H., Ермолаева T.FI. Пьезокварцевый иммуносенсор для диагностики аутоиммунных заболеваний. // XVII Росс, молодеж. науч. конф. "Проблемы теоретической и экспериментальной химии" (17 20 апреля 2007, Екатеринбург). — С. 16.

156. Zhang Jin Z., Noguez Cecilia. Plasmonic optical properties and applications of metal nanostructuresb// Plasmonics. 2009. - V. 3:4. - P. 127-150.

157. Mikhlin Yu., Likhatski M., Yaroslavtseva I. and Borisova Z. A study of the immobilized products of tetrachloraurate reduction by sulphide ions // Journal of Siberian Federal University. Chemistry 2. 2008. - V. 1. - P. 142-150.

158. Love J. C., Estroff L. A., Kriebel J. K., Nuzzo R. G., Whitesides G. M. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology // Chemical Reviews.- 2005. V. 105.-№4.-P. 1103-1169.

159. Калмыкова E.FI., Дергунова E.C., Ермолаева Т.Н. Кинетические исследования аффинного взаимодействия и их применение при разработке ньезокварцевых иммуиосенсоров // Сорбц. и хроматограф, процессы. -2004. Т.4. - Вып. 5. - С. 597-605.

160. Riboh J.C., Haes A.J., McFarland A.D., Yonzon C.R., Van Duyne R.P. A Nanoscale Optical Biosensor: Real-Time Immunoassay in Physiological Buffer Enabled by Improved Nanoparticle Adhesion // J. Phys. Chem. 2003. -№107.-P. 1772- 1780.

161. Daniel M.C., Astruc D. Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular

162. Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology,

163. Catalysis, and Nanotechnology //Chem Rev. 2004. - V. 104. - № 1. - P. 293346.

164. Rosi N.L. Mirlcin C.A. Nanostructures in Biodiagnostics // Chem. Rev.2005.-V. 105. № 4. — P. 1547-1562.

165. Li H., Rothberg, L.J. Label-free colorimetric detection of specific sequences in genomic DNA amplified by polymerase chain reaction // J.Am. Chem. Soc. -2004.-V. 126.-P. 10958-10961.

166. Li H., Rothberg L.J. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004. - V. 101. -№39. -P. 14036-14039.

167. Huang C.C., Huang Y.F., Cao Z., Tan W., Chang ILT. Aptamer-modified gold nanoparticles for colorimetric determination of platelet-derived growth factors and their receptors //Anal. Chem. 2005. - V. 77. - P. 5735-5741.

168. Cai II., Wang Y., Lie P., Fang Y Electrochemical detection of DNA hybridization based on silver-enhanced gold nanoparticle label // Analytica Chimica Acta. 2002. - V. 469. - №. 2, 3. - P. 165-172.

169. Lin Y.W., Liu C.W., Chang IT.T. DNA functionalized gold nanoparticles for bioanalysis. // Anal Methods. 2009. - V.l. - P. 14-24.

170. Wilson R. The use of gold nanoparticles in diagnostics and detection // Chem. Rev. 2008. - V. 37. - P. 2028-2045.

171. Liu J., Lu Y. Fast Colorimetric Sensing of Adenosine and Cocaine Based on a General Sensor Design Involving Aptamers and Nanoparticles // Angcw. Chem. 2006. - V.45. - № l.-P. 90-94.

172. Zhao W., Chiuman W., Brook M.A., Li Y. Simple and Rapid Colorimetric Biosensors Based on DNA Aptamer and Noncrosslinking Gold Nanoparticle Aggregation // ChemBioChem. 2007. - V. 8. - P. 727-731.

173. Chen S.J., Huang Y.F., Huang C.C., Lee K.H., Li Z.H., Chang II. Г. Colorimetric Determination of Urinary Adenosine Using Aptamer-Modilied Gold Nanoparticles // Biosens. Bioelectron. 2008. - V. 23. - P. 1749-1753.

174. Wang J., Wang L., Liu X., Liang Z., Song S., Li W., Li G., Fan C. A gold nanoparticle-based aptamer target binding readout for ATP assay. // Adv. Mater.2007.-V. 19.-P. 3943-3946.

175. Saul Т.К., Pal A., Jana N.R., Wang Z.L., Pal T. Size controlled synthesis of gold nanoparticles using photochemically prepared seed particles // Journal of Nanoparticle Research. 2001. - V. 3. - P.257-261.

176. Liu X., Huo Q. A washing-free and amplification-free one-step homogeneous assay for protein detection using gold nanoparticle probes and dynamic light scattering //Journal of Immunological Methods. 2009. - V. 349. -№ 1 - 2. - P. 38-44.

177. Oaew S., Karoonuthaisiri N., Surareungchai W. Sensitivity enhancement in DNA hybridization assay using gold nanoparticle-labeled two reporting probes // Biosensors and Bioelectronics. 2009. - V. 25. - №. 2. - P. 435-441.

178. Llomola J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors // Anal Bioanal Chem. 2003. - V. 377. - P.528-539.

179. Asian K., Lakowicz J.R., Geddesa C.D. Nanogold-plasmon-resonance-based glucose sensing // Analytical Biochemistry. 2004. - V. 330. - P. 145-155.

180. Kim, li., Stanton J., Vega, R. Kunstman K. et all. A real-time PCR-based method for determining the surface coverage of thiol-capped oligonucleotides bound onto gold nanoparticles // Nucleic Acids Research. 2006. - V. 34. — № 7.-P. e54-e54.

181. Wen X., ITe IT., Lee L.J. Specific antibody immobilization with biotin-poly(l-lysine)-g-poly(ethylene glycol) and protein A on microiluidic chips //Journal of Immunological Methods. 2009. - V. 350. - № 1 - 2. - P. 97-105.

182. Pingarron J.M., Yanez-Sedeno P., Gonzalez-Cortes A. Gold nanoparticle-based electrochemical biosensors // Electrochimica Acta. — 2008. — V. 53. — № 19. -P. 5848-5866.

183. Базовая химия и нефтехимия. Каталитическая активность наночастиц золота Электронный ресурс./ Режим доступа: http://www.newchemistry.ru/printletter.php?nid::::::709, свободный. Заглавие с экрана.

184. Xiao Y., Patolsky F., Kat/, E. ITainfeld J.E., Willner I. Plugging into enzymes: Nanowiring of redox-enzymes by a gold nanoparticle // Science. 2003. - V. 299. - P.1877-1881.

185. Yang W., Bail Y., Li Y., Sun C. Amperometric nitrite sensor based on hemoglobin/colloidal gold nanoparticles immobilized on a glassy carbon electrode by a titania sol-gel film // Analytic, and Bioanalytic. Chem. 2005. - V 382. - № 1. - P. 1618-2642.

186. Lin J., ITe C., Zhang L., Zhang, S. Sensitive amperometric immunosensor for alpha-fetoprotein based on carbon nanotube/gold nanoparticle doped chitosan film//Anal Biochem. 2009. -V. 384.- № l.-P. 130- 135.

187. Qu L., Bian C., Sun J., Ren Z., Han J., Xia S. Electrochemical synthesis of gold nanoparticles in polypyrrole for antibody immobilization // 4th IEEE International Conference on Nano/Micro Engineered and Molecular Systems. -2009.-P. 597-600.

188. Yuan H.A.R., Tang D., Chai Y., Li N. Dual-Amplification of Antigen-Antibody Interactions via Backfilling Gold Nanoparticles on (3-Mercaptopropyl) Trimethoxysilane Sol-Gel Functionalized Interface // Electroanalysis. — 2007. — V. 19. №. 4,-P. 479-486.

189. Wen X., He IT., Lee L.J. Specific antibody immobilization with biotin-poly(l-lysine)-g-poly(ethylene glycol) and protein A on microfluidic chips //Journal of Immunological Methods. 2009. - V. 350. - № 1 - 2. - P. 97-105.

190. Liu X., FIuo Q. A washing-free and amplification-free one-step homogeneous assay for protein detection using gold nanoparticle probes and dynamic light scattering // J. Immunol. Methods. 2009. - V. 349, - Is. 1 - 2. - P. 38-44

191. Мао, X. Yang L., Su X.-L., Li Y.A nanoparticle amplification based quartz crystal microbalance DNA sensor for detection of Escherichia coli 0157:117 // Biosens. Bioelectronics. -2006. V. 21, -№. 7. - P. 1 178-1185.

192. Nishida N., Rao C.N.R. Fluorescent gold nanoparticle superlattices // Adv. Mater. 2008. - V. 20. - P. 4719 - 4723.

193. Мелихова E.B. Применение ньезокварцевых иммуносенсоров для нроточно-инжекциопного определения биологически-акшвных соединений / Дис. канд. хим. наук. Липецк: ВГУ. 2006. - 125 с.

194. Нартова, Ю.В., Еремин С.А., Ермолаева Т.Н. 11ьезокварцевый иммуносенсор для определения ацетохлора в водных средах // Сорбциоипые и хроматографические процессы. — 2006. — т. 6. Вып. 5. - С. 764-772.

195. Crooks S. Detection of levamisole residues in bovine liver and milk by immunobiosensor / S. Crooks, B. McCarney, I. Traynor, C. Thompson, S. Floyd, Т. C. Elliott//Anal. Chimica Acta. 2003. - V. 483.-P. 181-186.

196. Mecea V.M. Is quartz crystal microbalance really a mass sensor // Sens. Actuators. 2006. - V.128. - P. 270-277.

197. Philp D., Stoddart J.F. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 1996. V. 35. P. 1154.

198. Decher G., Sauvage J.P., Layered nanoarchitectures via directed assembly of anionic and cationic molecule // Flosseini M.W. In comprehensive supramolecular chemistry. Elsevier science: Oxford. 1996. - V. 9. - P. 507-528.

199. Fredericks J.R., Hamilton M.W. Elsevier science: Oxford. 1996. - V.9. -P. 565-594.

200. Gao, Z.X., Fang Y. ., Ren J., Ning B.A., Zhu I-1.Z. Studies on biotin-avidin indirect conjugated technology for a piezoelectric DNA sensor. International Journal of Environmental // Analytical Chemistry. 2004. - V 84 (8). - P. 599606.

201. Р1артова Ю.В. Определение ряда хлорорганических пестицидов иммупохимическими методами / Автореф. канд. хим. наук. Воронеж. 2008. -23с.