Влияние структуры полярных аналитов на факторы удерживания и селективность в условиях высокоэффективной жидкостной хроматографии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Григорьев Андрей Михайлович

ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ ПОЛЯРНЫХ АНАЛИТОВ НА ФАКТОРЫ УДЕРЖИВАНИЯ И СЕЛЕКТИВНОСТЬ В УСЛОВИЯХ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

02.00.02 — аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Воронеж - 2006

Работа выполнена в ОАО «НИИ технологий медицинской промышленности», г. Белгород

Научный руководитель доктор химических наук,

профессор Рудаков Олег Борисович

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Нифталиев Сабухи Ильич;

доктор химических наук Славинская Галина Владимировна

Ведущая организация: ЗАО «БиоХимМак СТ», г. Москва

Защита состоится 27 декабря 2006 г. в 16 час. 00 мин на заседании диссертационного совета Д.212.038.19 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1, ауд.439.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан 27 ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Крысин М.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) - один из наиболее востребованных инструментов современной аналитической и фармацевтической химии. Непрерывное появление новых сорбентов и модификация известных способов разделения, расширение и усложнение инструментальной базы, появление принципиально новых (для ВЭЖХ) типов детекторов свидетельствует о пристальном внимании, проявляемом к данному методу анализа. Развитие теории жидкостной хроматографии привело к созданию адекватных моделей удерживания соединений различного строения в условиях как обращенно-фазовой, так и нормально-фазовой ВЭЖХ, и следовательно, к возможности прогнозирования хроматографического поведения полифункциональных соединений. Следует отметить, что теоретическая трактовка тонких эффектов взаимодействий сорбата, сорбента и компонентов подвижной фазы в адсорбционном слое в большинстве случаев неоднозначна, и потому носит дискуссионный характер. Изучение этих эффектов и выявление закономерностей их проявления приводит не только к уточнению известных или к появлению новых толкований наблюдаемых процессов, но и позволяет непосредственно управлять селективностью разделения, упрощает поиск оптимальных условий анализа специфических многокомпонентных систем, например таких, как поливитаминные препараты, экстракты натуральных красителей, природных и искусственных смесей, содержащих физиологически активные соединения.

Актуальность таких исследований обостряется наличием проблем фальсификации фармацевтических препаратов и пищевой продукции, определения качества и безопасности промышленных продуктов и исходного сырья. Подавляющее количество биологически активных соединений характеризуются высокой полярностью или способностью ионизироваться, и поэтому можно заключить, что знание факторов, влияющих на их удерживание, не только способствует снижению времени, затрачиваемому на подбор условий разделения, но и предохраняет от возможных аналитических ошибок.

Целью работы явилось изучение влияния структуры геометрических изомеров природных и синтетических непредельных соединений на их хроматографическое поведение в зависимости от состава элюента и состояния адсорбционного слоя; выявление факторов, определяющих удерживание ионогенных органических и неорганических веществ в зависимости от рН, солевого фона и добавок модификаторов подвижной фазы.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• экспериментальное определение параметров удерживания 40 непредельных соединений в 36 нормально-фазовых хроматографических системах;

' • экспериментальное определение параметров удерживания 62 "" ионогенных и неионогенных соединений (антоцианы, флавилиевые соли, халконы, сульфонаты, амины, неорганические соли и пр.) в 15 обращенно-фазовых системах;

• синтез, препаративное ВЭЖХ-разделение ряда геометрйческих изомеров полиеновых соединений и подтверждение их структур спектроскопическими методами: ИК, ЯМР 'Н и 13С, УФ и видимой области;

• расчет геометрических и энергетических характеристик структур использованных соединений и образуемых ими модельных водородных связей методами квантовой химии и молекулярной механики;

• расчет факторов, влияющих на удерживание антоцианов и их равновесных форм в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ с кислыми подвижными фазами.

Научная новизна. На основе наблюдаемого поведения в условиях нормально-фазовой (НФ) и обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ дана новая трактовка механизмов удерживания без непосредственного применения инкрементных моделей.

Показано, что в присутствии полярных апротонных модификаторов подвижной фазы в условиях НФ на силикагеле (ацетон, сложные эфиры) основной вклад в механизме заместительной сорбции трех непредельных изопреноидных спиртов вносят карбонильные группы модификаторов.

С помощью квантовохимического и молекулярно-механического расчетов характеристик молекул сорбатов обоснован порядок их удерживания (НФ). В основу расчетов положено формирование водородных связей между гидроксильными группами спиртов и поверхностными функциональными группами сорбента при учете их стерической доступности и подвижности.

Найдено, что селективность разделения 2, £-изомеров полиеновых соединений и халконов (НФ) определяется в большей степени структурой поверхности неподвижной фазы и в меньшей - составом элюента. Установлена тесная корреляция между селективностью и конформационными возможностями молекул и степенью доступности их якорных групп.

Показано, что в присутствии кислот и солей в адсорбционном слое обращенно-фазового сорбента формируется дополнительный заряд, что позволило объяснить наблюдаемое поведение сорбатов - гидрофильных и гидрофобных ионов.

Обоснована возможность образования ионных пар в адсорбционном слое между неорганическими анионами и органическими катионами типа флавилия. Предложена математическая модель, адекватно описывающая характер удерживания антоцианов при варьировании кислотности и солевого состава подвижной фазы.

Практическая значимость работы. Разработан комплекс из 12 методик определения витаминов, полупродуктов их производства и кислот цикла Кребса методом ВЭЖХ, апробированных на Болоховском химкомбинате синтетических полупродуктов и витаминов, НПО "Витамины" (г. Москва), ПО "Биовитамины" (г. Белгород), ПО "Завод лимонной кислоты" (г. Белгород), ОАО "Ай Си Эн Лексредства" (г. Курск) и ООО "Технофарм" (г. Курск).

На защиту выносятся:

1. Обоснование закономерностей удерживания трех непредельных спиртов, обусловленных их геометрическими и конформационными характеристиками и , хроматографическими , свойствами полярных модификаторов подвижной фазы.

2. Предложение механизма разделения геометрических изомеров полиеновых соединений и халконов, определяемого различием их структурных и конформационных свойств.

3. Установление ряда факторов, влияющих на удерживание органических ионов в присутствии органических и неорганических противоионов. ,,

Апробация. Результаты диссертационной работы доложены: на II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005), II Школе-семинаре «Ионообменные процессы и выделение физиологически активных веществ» (Воронеж, 2006), 61 региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2006), III всероссийской конференции «Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах» («ФАГРАН-2006», Воронеж, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, в том числе 19 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК и 3 в виде тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов, списка литературы (153 наименования) и приложения. Работа изложена на 171 странице, содержит 45 рисунков и 12 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы. По теме исследования представлен критический обзор публикаций, посвященный вопросам факторов, влияющих на удерживание сорбатов в условиях ВЭЖХ. Отмечено, что большинство из них сконцентрированы на практических вопросах ВЭЖХ: подбор вариантов разделения конкретных смесей на сорбентах определенного (то есть имеющегося у исследователя) типа. Подчеркивая актуальность и необходимость подобных работ, указана их ограниченность в плане теоретического обоснования экспериментальных решений. Сравнительно редкие работы сосредоточены на вопросах механизмов удерживания и это неудивительно — ведь проблема жидкого состояния и характеристик адсорбционного слоя являются одной из самых сложных в химии растворов и поверхностей. Опубликовано значительное количество инкрементов (обобщаемых характеристик селективности разделения), однако для представления возможного поведения хроматографической системы требуются модели удерживания. Разумеется, существующие общие воззрения на механизмы удерживания как в НФ, так и в ОФ ВЭЖХ, (при всей условности подобного деления) достаточно непротиворечивы. Тем не менее, они требуют

6 ' •,• • непрерывной детализации; и (что еще более важно) количественного описания и теоретического обобщения.

Глава 2. Объекты и методы исследования. Здесь (в обшей форме) приведены характеристики аналитов, методики пробоподготовки и выполнения измерений, используемые хроматографические системы и аналитическое оборудование.

Основная часть исследований выполнена на хроматографах:

1. Waters Millipore (двухнасосный вариант WM 501 Solvent Delivery System, управляемый посредством WM 680 Automated Gradient Controller с детекторами WM Lambda-Max 481 LC Spectrophotometer, WM R401 Differential Refractometer и кондуктометром Цвет-3006) - для аналитических и полупрепаративных целей.

2. Gilson (однонасосный вариант с насосом 302 Piston Pump и детектором НМ Holochrome UV/Vis Detector) - для аналитических целей.

3. Gilson (однонасосный вариант с насосом 303 Piston Pump и детектором 131 Refractive Index Detector) - для препаративных целей.

4. Милихром 1 и Милихром 4 — для аналитических целей и разработок методик анализа, специализированных для микроколонок.

Для ввода проб в хроматографы, работающие с колонками стандартных размеров, применялись инжекторы U6K и Rheodyne 7125 с петлями вместимостью 20 мкл (для аналитических целей) и 2 мл (для перпаративных).

Первичная обработка хроматографической информации (сигналов от аналоговых выходов детекторов) осуществлялась интеграторами WM 740 Data Module или Shimadzu Chromatopac C-R3A, а также ПАК UniChrom.

В системах, характеризуемых заметным влиянием температуры на времена удерживания, использовали термостатирование колонки с точностью установки температур ±0.1°.

В работе использован широкий набор колонкок (сорбентов): это силикагели, октадецилсиликагели и привитые фазы, настроенные на нормально-фазовый режим (Диасорб 60 Диол и Диасорб 130 Нитрил).

Влажность растворителей, применяемых для НФ ВЭЖХ, контролировали.

Величины рН растворов проб и элюентов измеряли на рН-метре ОР-213.

Спектры поглощения аналитов регистрировали с помощью спектрофотометра Specord М40 в кюветах с длиной оптического пути 1-10 мм.

Идентификацию соединений проводили посредством измерения спектров ЯМР 'Н, ,3С и 19F на спектрометре Tesla BS567 (в хлороформе-d,, диметилсульфоксиде^б или тяжелой воде) с отсчетом химических сдвигов от сигналов ГМДСО и DSS (внутренние стандарты) или остаточных растворителей.

Большинство рассмотренных соединений принадлежат к классу биологически активных: либо синтезируемых, либо выделяемых из растительных форм. Остальная часть - это полупродукты их синтеза по определенной технологии, или поисковые варианты.

Z-изомеры соединений с кратными связями синтезированы из соответствующих £-изомеров фотохимическим методом. В зависимости от дальнейшей задачи их разделяли методом препаративной ВЭЖХ или же хроматографировали в виде фотохимической смеси.

Соединения растительного происхождения (антоцианы) получали в виде смесей экстракцией из соответствующих растительных форм.

Витамины, полупродукты их синтеза и их производные предоставлены фирмами-заказчиками исследований и вновь разрабатываемых аналитических методик или же синтезированы самостоятельно.

Квантовохимические расчеты строения и свойств рассматриваемых соединений проводили с помощью пакета HyperChem 7.1 и GAMESS (использованы неэмпирические методы и полуэмпирический AMI); для аппроксимации экспериментальных данных прочих расчетов использовали пакеты MatLab 6.5 и MathCad 11.

Глава 3. Нормально-фазовая ВЭЖХ соединений с кратными связями, расположенными возле полярной группы. Как в этой главе, так и далее основным инструментом анализа удерживания будет являться относительный подход. Наиболее проблемным вопросом любого варианта хроматографии является разделение близкородственных соединений. Нередким является случай, когда линеаризацию их удерживания при варьировании состава элюента выполнить не удается ни в логарифмических координатах (зависимость Снайдера-Сочевиньски), ни в обратнофункциональной зависимости (Скотта-Кучеры), вследствие заметной кривизны. Такое поведение хроматографических систем особенно характерно для наиболее интересных экспериментов — когда варьирование состава элюента достаточно велико. В таком случае разумно воспользоваться параметрами относительного удерживания вида:

\gk\=a,+b, *lg*\,,

где k"j — фактор удерживания соединения, принятого за образец в данной группе. Параметр bt является отношением наклонов Снайдера-Сочевиньски для соединений / и j и следовательно, является удобной характеристикой отличия их поведения - которое может быть очень небольшим. Как правило, относительное удерживание весьма линейно, а следовательно, его параметры наиболее удобны как характеристики поведения сорбатов.

В этой главе рассмотрено хроматографическое поведение изопреноидных спиртов (I-III, ряд изменения кратности связи вблизи полярной группы молекулы) и халконов (IV-VI, ряд изменения конфигурации двойных связей и заместителей вблизи полярной группы) в условиях НФ на силикагеле, см. рис.1. Применялись бинарные элюенты на основе гексана с апротонными добавками.

Поведение изопреноидных спиртов проиллюстрировано на примере спирта II (рис.2). Элюирующая способность полярных добавок находится в согласии с наблюдаемым удерживанием. Некоторая нелинейность (хорошо заметная на примере ацетона) систематична и потому не может (быть объяснена

ошибками измерения. Почти во всех рассмотренных системах величин удерживания образуют ряд 1>Ш>И.

С-шНзз

Рис. 1 Структуры соединений, рассмотренных в данной главе. Для соединений IV (Я, = К2=РЬ), V (1*1 = РЬ, К2 = РЬ-РЬ), VI (Я! = РЬ-РЬ, Я2 = РЬ), учтены также их 2-изомеры.

IV-VI

Зависимости удерживания соединений II, III относительно соединения I для разных полярных добавок высоко линейны (квадрат коэффициента корреляции R2 более 0.9994). Параметры а, и bt этих зависимостей, показывающие различие в поведении соединений I-III демонстрируют почти монотонный рост по абсолютной величине в ряду ацетон-этилацетат-этилпропионат-бутилацетат-диэтиловый эфир (ДЭЭ), что (кроме последнего члена ряда) находится в соответствии с количеством углеводородных звеньев в молекулах этих добавок. В этом порядке они указаны в табл.1.

Рис. 2 Зависимость логарифма фактора удерживания соединения II от логарифма мольной доли, % полярного модификатора. ■ - ДЭЭ, □ - этилпропионат, • - бутилацетат, о — этилацетат, 0 - ацетон.

Для сложных эфиров Я-С(0)0-Я" увеличение Я' на две метиленовых группы почти не меняет их элюирующих свойств; в то время как увеличение Я на одну группу дает хорошо заметный эффект. Вероятно, это связано с преимущественным способом взаимодействия между молекулами сложных эфиров и поверхностью силикагеля. Если это связывание обусловлено главным образом карбонильной группой, то удлинение Я (в нашем случае почти в 2 раза) приведет к увеличению стерических помех для якорной карбонильной группы, что и снизит элюирующую способность. Рассчитанные малликеновские заряды на соответствующих атомах кислорода для оптимизированных структур всех трех сложных эфиров почти одинаковы (0.357 на карбонильном кислороде и -0.283 на эфирном).

Основываясь на этом замечании, а также на данных табл.1, мы можем заключить, что основным фрагментом их структур, влияющих на поведение рассматриваемых спиртов I-III в данной хроматографической системе (как сорбции, так и взаимодействий в подвижной фазе), является карбонильная группа, а не мостиковый эфирный атом кислорода. Влияние карбонила падает при росте длины углеводородных цепей вокруг нее, поскольку растет вклад ван-дер-ваальсовых взаимодействий по сравнению с диполь-дипольными. При этом снижается вклад важнейшей геометрической характеристики карбонила, выгодной для реализации водородной связи - его перпендикулярна^ ориентация к молекулярной цепи.

Таблица 1

Параметры линейных зависимостей lgk* II и III от lgk'соединения I для разных полярных модификаторов

Соеди нение Полярный модификатор

Ацетон Этулацетат... Этилпропионат Бутилацетат ДЭЭ

а, Ь, а» bi а, Ь, а, bi а, Ь,

II > с •• . -0.108 0.938 -0.157 0.996 . -0.177 1.005 -0.179 1.019 -0.184 1.0<$ ( 0.090 0.835 -0.095 1.025 -0.152 1.050 ' :-0.163 1.091 -0.228 1.109

"Чнг

Расчетные оценки вероятности образования водородных связей между спиртами и поверхностью гидроксилированного сорбента,, включили конформационные характеристики якорных гидроксильных г групп и энергетические зависимости образования модельных водородных связей (между МП и молекулой воды) от расстояния между ними. Высота потенциальных барьеров вращения гидроксильной группы в оптимизированных структурах спиртов образует ряд Н>Ш>1; отсюда следует, что спирт I обладает наиболее йодвижной якорной группой, что дает дополнительную возможность в формировании оптимальных характеристик связи с сорбентом.

Один из вариантов моделирования водородной связи приведен на рис.3. Здесь соединения МП выступают акцепторами; причем эта модель почти не осложнена мешающими влияниями со стороны остальных фрагментов молекул МП, а потому демонстрирует именно способности этих соединений образовывать водородные связи именно в плане их электронных структур.

На расстоянии 2.3 А (минимум для всех кривых) энергетический выигрыш максимален для спирта I. Таким образом, расчет подтверждает наблюдаемый порядок элюирования.

Удерживание хапконов IV-VI исследовано только для элюентов с добавками ДЭЭ (учитывая невозможность специфических взаимодействий в элюенте) и имело целью рассмотреть поведение простейших соединений, имеющих кратную связь возле якорной (карбонильной) группы и способных к 2,£-изомеризации. Параметры относительных зависимостей сведены в табл.2.

Рис. 3 Зависимость энергии водородной связи от расстояния между протоном воды и кислородом соединений I (0), II (□), Ш(о).

Г.А2.8

-1.5

При образовании 2-структур падают как времена удерживания, так и наклоны зависимости Снайдера-Сочевиньски. Относительные наклоны при замене ^-конфигурации на 2 могут довольно сильно отличаться от единицы: для халкона V величина составляет 0.908, что сравнимо с добавлением фенильной группы для этого же соединения (¿>, = 1.118). Изменения близки по величине и противоположны по направлению.

Расчет энергии водородной связи дает одинаковые значения как для £, так и для Z-изoмepoв. Следовательно, объяснение надо искать в конформационных характеристиках молекул халконов.

Таблица 2

Параметры линейных зависимостей ^к' £-изомеров соединений V, VI от IV (добавление фенильной группы) и Z-изoмepoв от соответствующих Е-

изомеров.

Соединение а, Ь, F?

относительно 1М-Е

V-E 0.127 1.118 0.9978 0.091 1.101 0.9994

VI-Е

относительно ¿-изомера

IV-Z -0.0529 0.962 1 -0.0468 0.908 0.9999 -0.0372 0.977 0.9988

V-Z

VI-Z

Изменение торсионного угла 0=С-С=С (рис.4, то есть ограниченное вращение фрагмента молекулы) возможно и не требует значительных энергетических затрат: около 2 ккал/моль при изменении угла ±90°. Очевидно, что телесный угол, образованный вращающимся фрагментом будет разным: около 87° £ и 146° для Z. Отсюда следует, что стерические помехи,

выражающиеся в разной доступности карбонильного кислорода для силанольных групп, будут разными — и более значительными для 2-изомеров.

Рис. 4 Иллюстрация

появления стерических помех для Z-изомеров (соединение IV) возле поверхности сорбента (пунктир).

Е Ъ

Этой трактовке можно дать количественное обоснование. Для этого, во-первых, необходим учет длины вращающегося фрагмента (при его удлинении как параметр Ь> , так и наблюдаемое удерживание закономерно падают). Во-вторых, следует учесть вес (то есть возможный вклад в стерические затруднения) со стороны другого фрагмента, непосредственно соединенного с карбонильным кислородом. Его влияние проявляется как меньшая разница между поведением соответствующих Е и 2-структур (табл.2).

Глава 4. Разделение геометрических изомеров полиеновых соединений в нормально-фазовых условиях. Рассмотрено поведение геометрических изомеров, полиеновых соединений (рис.5) при варьировании состава бинарного элюента на основе гексана и вида сорбента.

Мы измерили значения селективности изомерного разделения (а = кл(£)/кХ2)) для разных полярных добавок на одном и том же сорбенте (колонка Силасорб 600).

X!

Рис. 5 Структуры

рассмотренных соединений (транс-изомеры).

Несмотря на разнообразие. строения якорного фрагмента этих соединений, их объединяет общая закономерность: падение удерживания при приближении г/мс-складки к этому фрагменту. Эта ситуация неизменна по крайней мере, при данном (достаточно широком) выборе полярных добавок.

Мы сделаем попытку объяснить эту закономерность и дать ей количественную трактовку.

Первое, на что можно обратить внимание - это резкое падение селективности в присутствии высокополярных добавок: ацетона, пропанола-2 и (с оговорками) диоксана; можно сделать заключение о том, что протолитические способности растворителя не играют значительной роли. При использовании бутанола и ДЭЭ в качестве модификаторов для исследуемых аналитов наблюдались сходные значения селективности; за исключением соединений XII (ретиноевая кислота) и XIV (спирт). Это легко объясняется возникновением сильных специфических взаимодействий в системе. Значит, можно принять допущение о том, что в присутствии малополярных добавок (и в первую очередь, ДЭЭ) Z.iT-селективность будет определяться структурными особенностями изомеров и поверхности сорбента.

Для исследования влияния поверхности сорбента на селективность разделения геометрических изомеров взяли ряд силикагелей с различными структурно-геометрическими характеристиками поверхности отечественного и импортного производства (табл.3). После соответствующей обработки ими были набиты колонки. Измерено удерживание изомеров соединений VII-IX (ряд, в котором происходит удлинение полиеновой цепи) при составе элюента 10 об.% ДЭЭ в гексане при фиксированной влажности (50% от насыщения), табл.3.

В данном ряду силикагелей (ШСМ - С-120) величины удерживания проходят через максимум (КСМ-5), падая в 3-6 раз на краях диапазона. Значительная часть поверхности микропористого ШСМ, недоступна либо по стерическим причинам, либо вследствие капиллярной конденсации воды в микропорах. Поверхность силохрома С-120 на микроуровне можно условно считать «ровной» по сравнению с размерами молекул VII-IX. Б-изомеры всех трех соединений ведут себя подобно. Поскольку наблюдаемые эффекты связаны именно с изменением кривизны поверхности сорбента и линейными размерами сорбатов, то можно предложить два вероятных объяснения.

Во-первых, если радиус кривизны поверхности сорбента положителен и имеет размер порядка размера молекулы IX, то стерические препятствия (малая доступность карбонильного кислородного атома) снижаются. В большей степени это относится к 13Z и 1 lZ-изомерам.

Во-вторых, если принять во внимание, что при адсорбции в узких порах может произойти блокирование вращения вокруг одинарной связи, ближайшей к полярному концу молекулы (Ci4.I5 для IX и Сп-п Для VIII). Тогда молекула 13Z соединения IX (и молекула 11Z соединения VIII) оказываются неотличимыми от молекул их /я/юнс-изомеров, и селективность а падает. Далее, для IX вклад в удерживание начинает оказывать вращение вокруг следующей (С12.)з) одинарной связи. Но для 11Z вращение вокруг связи С12-13 стерически затруднено и в фазе раствора и, следовательно, не должно значительно снижать удерживание. Оставшиеся изомеры 9Z, 7Z, Е с рассмотренных сторон своих характеристик не меняют, и поэтому сохраняют порядок выхода.

'' Влажность элюента должна иметь большое влияние не только на удерживание, но и на селективность. Если в варианте силикагеля ШСМ почти

нет возможности удаления воды из его пор осушенным элюентом, то эта процедура может быть выполнима для более широкопористых силикагелей. И если это так, то при конденсации воды в более широких порах (КСМ-5 - КСК-2) величины а для изомеров IX должны быть близки к аналогичным значениям для силохрома.

Действительно, при хроматографировании на силикагеле КСС-3 с элюентом того же состава, но увлажненным до насыщения, порядок удерживания становится нормальным. Наклоны (1) при переходе от 50 до 100% -увлажненного элюента для 13г, 9г, 12 равны 2.18, 1.63, 0.72, 0.94 соответственно.

Наибольшее изменение, как и ожидалось, характерно для 132-изомера; его селективность приняла значение 1.65 и приблизилась к таковой для силохрома С-120. Повышение количества адсорбированной воды приводит, во-первых, к общему снижению удерживания и, во-вторых, к исчезновению мест, селективно вызывающих рост удерживания \ЪХ- и 11 ¿-изомеров.

Таблица 3

Селективности (а) для изомеров У11-1Х на силикагелях разных марок.

Элюенты, использованные для трех типовых силикагелей (правая часть таблицы), увлажнены максимально.

Марка и средний Оп>нм си лика геля LUCM КСМ-5 ксс- 4 КСС-3 КСК-2 С-120 Силасорб 300 Силасорб 600 Zorbax Sil

2.9 3.6 4.5 6.8 13.5 43 10 7 7.5

Изомер IX

132 2.03 1.09 1.16 1.18 1.08 1.98 2.02 1.88 1.84

11Z 1.77 1.13 1.19 1.24 1.14 1.68 1.73 1.69 1.61

9 Z 1.48 1.31 1.39 1.39 1.37 1.58 1.51 1.42 1.45

7 Z 1.20 1.06 1.12 1.12 1.06 1.20 1.19 1.17 1.18

VIII

11Z 2.64 2.29 2.43 2.45 2.56 2.48 2.53 2.34

9Z 1.43 1.32 1.36 1.37 1.40 1.33 1.42 1.39 1.33

7 Z 1.21 1.18 1.20 1.19 1.20 1.16 1.21 1.20 1.17

VII

9Z 1.80 1.70 1.73 1.78 1.81 1.71 1.79 1.65 1.64

7 Z 1.23 1.20 1.1S 1.19 1.22 1.13 1.24 1.21 1.16

Для количественной трактовки селективности на поверхности малой кривизны использована следующая модель. Для каждой оптимизированной структуры изомеров VII-1X были вычислены геометрические характеристики вращения углеводородного фрагмента вокруг связи 0=С-С=С (как на рис.4). Полученные значения использованы для определения корреляции с селективностью разделения. Лучшим критерием оказалась площадь максимальной окружности, описываемой вращающимся углеводородным фрагментом для изомера Z, отнесенная к площади соответствующего изомера Е (рис.6) — то есть величины, определяющей стерические помехи при сорбции.

Две точки, отклонившиеся, от линейной зависимости, только подтверждают ее истинность. UZ-изомер VIII (□) обладает очень высоким

(около 51 ккал/моль для Б-ггат) барьером такого вращения, что мешает ему принимать эту (наиболее выгодную для сорбции) конформацию — и селективность разделения резко растет. Структурная особенность 72-изомера VII заключена в близости циклогексенильного кольца к якорной группе, что формирует дополнительные помехи со стороны его метильной группы.

Данная трактовка дополнена измерениями в однокомпонентных элюентах (бензол и гексан), а также на привитых фазах — Нитрил и Диол. Подтверждена связь геометрического строения молекул рассмотренных соединений и СГХ силикагелей в отсутствие сильных диполь-дипольных взаимодействий в подвижной фазе.

а

2.5 -2

Рис. 6 Зависимость

относительной максимальной

площади вращения углеводородного фрагмента (Б) от селективности разделения (а) для всех изомеров соединений VII-IX.

1 ^

0.5 -I-,-,-1

13 5 7

S

Глава 5. Исследование факторов, влияющих на удерживание ионогенных соединений в обращенно-фазовом режиме. Здесь рассмотрен ряд вопросов, касающихся трактовке удерживания легкодиссоциируемых соединений в богатых водой элюентах в условиях ОФ ВЭЖХ. Вопрос о вкладах ион-парного и псевдоионообменного механизмов удерживания является открытым, поскольку включает в себя ряд непростых пунктов: формирование заряда поверхности, структура адсорбционного слоя, образование ионных пар и все, что может быть связано с поведением ионов в смешанных водно-органических растворителях.

Для определения ионнозависимых характеристик системы было предпринято расширенное исследование поведения неорганических и органических ионов при варьировании кислотности (хлорная кислота), ионного фона (перхлорат лития) и ацетонитрила. Термодинамический мертвый объем Vm (условная для данной работы величина) оценен методом Knox. Характерные для данной работы результаты приведены на рис.7.

Аналогичным образом ведут себя другие органические и неорганические катионы (К+, NH4+, Mg2+, триэтилбензиламмоний) и анионы (Br"; S042'; СН3СОО"; CF3COO"; бензол-, толуол-, нафтохинон-сульфонаты). В элюентах с малым содержанием хлорной кислоты обнаружен отчетливый избыток кислоты в неподвижной фазе. Зеркально-противоположное поведение ионов противоположного заряда (рис.7 а, б) позволяет предположить возможность

неспецифической сорбции крупных поляризуемых (и малогидратированных) перхлорат-анионов, придающих поверхности дополнительный отрицательный заряд. Большее удерживание катионов (и меньшее - анионов) при переходе от НС104 к 1лСЮ4 объяснено диссоциацией остаточных силанольных групп.

На рис.8 приведены аналогичные зависимости при варьировании ионного фона и кислотности элюента (при содержании ацетонитрила 30 об.%). Зависимости с вариацией содержания солей сделаны в кислых элюентах (рН1.96, обусловленной добавкой соответствующей кислоты) для нивелирования вклада остаточных силанолов.

2.5-,

Ъ

' 2.4 -МИН

2.3 —---

2.2--

2 —■— * ——в 1.9 -

1.8 -I-,-,-,-г

О 0.02 0.04 0.06 0.08 [У004]

а б

Рис. 7 Время удерживания ионов натрия (о) и нитрата (□) при изменении концентрации хлорной кислоты (а) и перхлората лития (б) в воде. Прямые соответствуют значению Ут(2.21 мл).

Удерживание нитрата отчетливо анионозависимо. Зависимость (х) измерена вообще без добавки кислоты (рН элюента близка к нейтральной). Тем не менее, при концентрации 1ЛС104 выше ~ 50 мМ различия в поведении нитрата исчезают — рН элюента уже не оказывает влияния на его удерживание. Это говорит о доминирующем влиянии вида аниона на условия, складывающиеся в неподвижной фазе.

0 0.02 0.04 0.06 0.08 [НСЮ1]

мин

2.7 2.6 2.5 2.4 2.3 -I 2.2 2.1

2 -I 1.9

1.8 1.7

0.001

Рис. 8 Удерживание нитрат-иона в зависимости от вида ионного фона и концентрации (логарифм ионной силы); 30 об. % ацетонитрила. Нз804 (■), СРзСООН (А), НСЮ4 (•), 1л2804 (□), СРзСООЫ (Д), ЫСЮ4(о), 1лС104 без добавки кислоты (х). Добавки солей сделаны в присутствии фиксированных количеств

соответствующих кислот (рН 1.96).

0.1

•Л

10

■»"■ Возможно, это объяснимо специфической сорбцией анионов вследствие Их большего размера, поляризуемости и меньшей гидратированности по сравнению с < катионами, в результате чего поверхность может приобретать дополнительный отрицательный заряд. Следует отметить также корреляцию между удерживанием нитрата и ионной активностью добавок: она минимальна для сульфатов и максимальна для перхлоратов.

Приведенные зависимости объясняют , разноплановость литературных данных по измерениям мертвых объемов колонок с. помощью неорганических ионов. Главным же для нас является вывод о за.метной концентрации анионов в адсорбционном слое.

Важными объектами наших исследований являются перхлораты флавилиевых (катионных) соединений, рис.9.

Рис. 9 Соединения, использованные в исследовании: XV (И.!, Я2 = ОН), XVI (Я,- = Н, Я2 = ОН), XVII (Я, = ОН, Я2 = Н), XVIII (Я,=Н, Я2 = ОСН3)

Их поведение исследовано в элюентах с добавками трех сильных кислот, различающихся по гидрофобности и заряду остатка: хлорной, трифторуксусной и серной и их литиевых солей.

2.5 2 1.5 1

0.5 -0

0.5

1.5

[СЮ4]

'" Рис. 10 Характерное удерживание соединений XV-XVIII. а - для соединения XVII го ионной силы, создаваемой литиевой солью при рН 1.96. Обозначения те же, что и на рис.8, б- V.? содержание ЫСЮ4 при той же рН; XV (о),XVI (А), XVII (□), XVIII (0).

Добавки всех трех солей вызывают рост удерживания флавилиевых соединений (рис.10). Этот рост (в основном) не обусловлен эффектом высаливания или изменения вязкости элюента, что подтверждено измерением удерживания неполярных халконов соединений XV-XVIII. При использовании

добавок сульфата лития зависимости (рис.10) могут носить более сложный характер. Также найдено, что удерживание анионов сульфокислот (бензол-, толуол-, нафтохинон-) в присутствии добавок 1лСЮ4 (более 2 мМ) лишь несколько падает, подобно неполярным халконам. Хотя эти зависимости несколько различны, можно сказать, что этот эффект объясним снижением поверхностного натяжения (согласно сольвофобной теории). Отметим, что удерживание гидрофильного нитрат-аниона также растет.

В таком случае рост удерживания флавилиевых катионов трудно объяснить только изменением заряда поверхности и формированием заряженных слоев вблизи нее. В данном случае (учитывая отмеченное превышение концентрации анионов добавок вблизи поверхности) уместно предположить образование ионных пар с необходимой поправкой на активность. В самом деле, активности ЫС104 > СРзСООЫ > Ь|2804 во всем рассмотренном диапазоне концентраций; то же справедливо и для кислот. Количественные характеристики наблюдаемых явлений приведены в табл.4: это наклоны зависимостей к' от логарифма концентрации соли (абсолютные значения), наклоны зависимостей ^к' от к4 соединения XV (то есть относительные значения) и максимальные удерживания соединений.

Таблица 4

Параметры влияния содержания солей на удерживание соединений XI-XVIII. (рН 1.96)

Соединение 17% | 30%СНзС1Ч

исю4 | СРзСООи | и2зо4

XV XVI XVII XVIII Абсолютные наклоны к'-рХ -6.5 -0.82 -0.52 -0.34 -5.4 -0.88 -0.52 -0.40 -7.3 -1.16 -0.76 -0.63 -1.77 -0.96 -1.25

XVI XVII XVIII Относительные наклоны 1дкЧдк'(4*7-ОН) 1.11 1.00 0.98 1.06 1.03 0.95 0.95 1.01 0.89 0.81 1.11

XV XVI XVII XVIII Максимальное удерживание >19.3 2.50 1.62 0.53 >16.4 2.46 1.68 1.14 >23.2 3.36 2.48 1.77 5.00 3.43 >6.2

Очевидно различие в поведении соединений. Максимальное сродство характерно для перхлорат-аниона.

Подобным образом ведут себя азотистые основания (бензиламины и витамин В1). Зависимость удерживания от концентрации соли становится более выраженной при снижении содержания ацетонитрила, из чего можно заключить, что образование пар может носить гидрофобный характер.

Глава 6. Исследование поведения конверсируемых ионогенных соединений (антоцианов) в обращенно-фазовом режиме и кислых подвижных фазах. Эта глава посвящена рассмотрению вопросов удерживания антоцианов и факторов, влияющих на селективность их разделения. Поведение антоцианов как ионогенных соединений описано с помощью стехиометрического ион-парного формализма, а как конверсируемых соединений — с учетом известных равновесий. Измерено удерживание ряда антоцианов (Я3 — глюкоза, = Н): дельфинидин XIX (Яь = ОН), цианидин XX (Я, =Н, Яг = ОН), пегунидин XXI (Я, == ОСН3, Я2 = ОН), пеонидин XXII (Я, =Н, Я2 = ОСН3), пеларгонидин XXIII (Яь Я2 = Н), мальвидин XXIV (Яь = ОСН3) в водно-ацетонитрильных элюентах с добавками кислот - муравьиной, хлорной, трифторуксусной, перхлората лития (как нейтральный источник перхлорат-анионов) и гексансульфоната натрия (как обычный ион-парный реагент). Состояние этих соединений определяется кислотностью среды (рис.11); основное внимание было сосредоточено на заряженной флавилиевой (окрашенной) форме АН.

Рис. И Основные равновесия антоцианов в кислых водных растворах. Для наиболее распространенных структур: Яь Я2 = Н, ОН, ОСН3; -гликозидный остаток; = Н или гликозидный остаток.

Вопрос о механизме удерживания заряженных сорбатов - одна из наиболее сложных тем жидкостной хроматографии. Удерживание соединений Х1Х-ХХ^ будет определяться всеми факторами, которые влияют на удерживание ионогенных соединений, а также равновесиями (рис.11).

Важнейшим для нас является кислотно-основное равновесие (гидратация, связывающая ион флавилия АН и полуацеталь В, находящийся в быстром равновесии с г/мс-Зсалконом Сс), поскольку именно эти формы преобладают в кислой среде. Вкладом хиноидного основания (А) можно пренебречь по Причине незначительности его концентрации в равновесной смеси при рассмотренных значениях рН.

-ОН

Данная система любопытна тем, что на основании адекватности предложенной модели она позволяет делать предположения о наличии (отсутствии) ионных пар и их влиянии на равновесия. Мы сделали попытку описать удерживание в рамках стехиометрического ион-парного формализма без вклада поверхностного потенциала и возможной конкуренции за поверхность сорбента. В таком случае, в хроматографической системе будет присутствовать следующее равновесие (рис.12). Ас — отрицательно заряженный противоион (ион-парный реагент), АНАс - ионная пара между ним и катионом антоциана, величины ку — константы скоростей соответствующих процессов.

Если фактор удерживания элюата, который в данных конкретных условиях ВЭЖХ представляет собой равновесную смесь нескольких форм можно представить как А = * к\ , где к\ - фактор удерживания / - й формы;

а, - ее доля в равновесной смеси, то удерживание смеси равновесных форм для каждого соединения ХУ-ХХ:

к = к ш *ССлп + к М!Ас*аМ!Лс + к Ц(\ *ак\ ~ Т?-- »

<*н

где к*всс — фактор удерживания равновесной смеси полуацеталя В и цис-халкона Сс, находящихся при условиях измерения в быстром и неизменном равновесии.

АНАс

Рис. 12 Ионно-гидратные равновесия, протекающие в хроматографической системе.

АН -В + Сс + Н

к«

Само по себе образование ионньпс пар в подвижной фазе не приводит к росту удерживания ионогенного элюата. Тем не менее величина к*ЛИАс , представляющая собой (по определению) отношение количества ионных пар в неподвижной фазе к их количеству в подвижной, содержит константу распределения. Эта константа характеризует устойчивость ионных пар в адсорбционном слое — без конкретизации механизма их образования. Стехиометрическая модель лишь полагает постоянство этой константы, и следовательно, величины к^лнлс • Этот вопрос может быть причиной дискуссии; однако мы полагаем, что при условии постоянства содержания органического модификатора в элюенте (в наших условиях это ацетонитрил, 17 об.%) постоянство к*анас можно считать хорошим приближением. Кроме того, к32 — константа, характеризующая тримолекулярную реакцию, и ее величиной можно пренебречь.

Тогда константа ассоциации будет истинной:

[АНАс] _ kn _ .

[ЛН]*[Лс] k2i + k23 т

а константа гидратации — зависимой от концентрации противоиона и истинной при его отсутствии:

[ВСс]*ан кхъ кп *к12 *[Ас] 0 к23 ■ ЛгЛ _

—ТлТГл— 7 h7 ¡71 ~7Т~\ А +Т~ ^«и [Лс] = аа [ЛЯ] кп км*(к2]+к2 3J ¿л

Коэффициенты активности рассчитаны по полуэмпирическому уравнению Davis, причем их использование улучшило сходимость.

Эти зависимости позволили провести единую аппроксимацию для всех пяти экспериментально определенных зависимостей фактора удерживания: то есть от содержания кислоты, от pH (при двух значениях ионной силы) и от ионной силы (при двух значениях pH). Часть рассчитанных параметров (константы ассоциации) для трех противоионов приведены в табл.5. Константа ассоциации для гексансульфоната натрия рассчитана способом, подобным описанному ранее, при добавлении дополнительной формы - пары между антоцианом и гексансульфонат-анионом. Коэффициенты корреляции >0.996 для НСЮ4 и >0.9992 для CF3COOH и C6Hi3S03Na. Приведенные доверительные интервалы соответствуют доверительной вероятности 95%.

. , Таблица 5

Вычисленные константы ассоциации

Константы XIX XX XXI XXII | XXIV

нсю4

К asss 242±25 189±24 161±18 136±15 1 113±10

CF3COOH

К esSS 196±30 189±16 165±27 144±16 113±24

НСЮ4 + C6H13S03Na

Ks 300±9 240±16 229И6 183±20 185±20

Независимо от серьезных различий вида противоионов (от гидрофильного перхлората до гидрофобного гексансульфоната), значения констант близки. Учитывая это, можно заключить, что соседние значения констант близки или перекрываются. Тем не менее, падение значений констант при увеличении степени метилирования структур вполне очевидно. Этот эффект не связан с возможными стерическими препятствиями. Например, при переходе Х1Х-ХХ в фенильном кольце исчезает одна гидроксильная группа, а при переходе ХХ-ХХ1 появляется дополнительная группа ОСНз . Можно отметить, что подобный эффект наблюдается и для синтетических 2-фенилбензопирилиевых солей: для 4\7-дигидроксифенилбензопирилия значение Кач^ больше, чем для его 4,-гидрокси-, 7-гидрокси- и 4'-метокси-аналогов.

Различие хроматографического поведения форм антоцианов позволяет оценивать константы соответствующих равновесий с помощью очень небольшого количества вещества, без необходимости процедур по выделению

и очистке. Данная модель полностью описывает поведение антоцианов в кислых элюентах при небольшой ионной силе.

Выводы.

1. Ключевую роль в процессе заместительной сорбции в условиях нормально-фазовой ВЭЖХ третичных изопреноидных спиртов • при использовании сложных эфиров в качестве полярных модификаторов подвижной фазы играет карбонильная группа в структуре эфиров.

2. Порядок удерживания рассмотренных изопреноидных спиртов в значительной степени определяется конформационными характеристиками (подвижностью и доступностью якорной гидроксигруппы) а также энергетикой водородных связей, возникающей между этой группой и полярной поверхностью. Это подтверждено расчетом методами квантовой химии и молекулярной механики барьеров внутреннего вращения молекулярных фрагментов и характера образования модельных водородных связей между гидроксигруппами спиртов и молекулами воды как в донорном, так и в акцепторном вариантах.

3. Повышение селективности разделения £-изомеров полиеновых соединений и халконов в условиях нормально-фазовой ВЭЖХ является следствием снижения стерической доступности якорной группы 2-изомеров которая в свою очередь, определяется двумя факторами: уменьшением вероятности возникновения выгодных для сорбции Б-транс конформаций (определяемых энергией барьеров вращения молекулярных фрагментов) и площадью максимальной окружности, описываемой неполярными фрагментами молекул возле якорных групп. Расчет этих факторов для каждого класса соединений позволяет предсказать селективность разделения.

4. Установлено, что добавки кислот и солей (с анионами СЮ4", СРзСОО", БОд2") в водных элюентах при обращенно-фазовой ВЭЖХ приводят к увеличению отрицательной составляющей полного заряда поверхности сорбента, что влечет за собой изменение удерживания сорбатов: росту - для катионов и падению - для анионов. Размер этого заряда определяется природой и концентрацией анионов и при одинаковых концентрациях уменьшается в ряду от перхлората до сульфата.

5. Наблюдаемое сильное удерживание органических катионов (флавилия, бензиламинов, витамина В1) и слабое — сульфонатов (в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ) связано с формированием отрицательного заряда и электростатическими взаимодействиями в этом слое. Для катионов возможен также ион-парный механизм.

6. Удерживание конверсируемых органических катионов (антоцианов) существенно определяется природой и концентрацией анионов (СЮ4", СРзСОО ), присутствующих в подвижной фазе и может быть полностью описано в пределах ион-парной модели удерживания. Значительных различий между действием гидрофильного (СЮ4) и гидрофобного (гексансульфонат) анионов добавки не выявлено.

, Основное,содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Высокоэффективная жидкостная хроматография синтетического витамина В1 / А.М. Григорьев и [др.] // Журн. аналит. химии.- 1992.- Т. 47.-Вып. 10.-С. 1904-1909.

2. Григорьев A.M. Определениеантоцианов методом высокоэффективной жидкостнрй хроматографии. Некоторые закономерности удерживания / В. И. Дейнека, А. М. Григорьев // Журн. аналит. химии.- 2004.- Т. 59.- Вып. 3.- С. 305-309. •

3. Григорьев A.M. Относительный анализ удерживания гликозидов цианидина / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев // Журн. физ. химии.- 2004.- Т. 78.-№5.- С. 923-926.

4. Григорьев А.М. Удерживание антоцианов в обращенно-фазовой системе со смешанным элюентом ацетонитрил-муравьиная кислота-вода / В.И. Дейнека,

, A.M. Григорьев //Журн. физ. химии.- 2005.- Т. 79.- № 5.- С. 900-903.

5. , Хроматографический анализ изофитола / A.M. Григорьев и [др.] // Хим.-фарм. журн.- 1990.-Т. 24.-№ 11.-С. 81-83.

6. Быстрое определение пантенола методом ВЭЖХ / A.M. Григорьев и [др.] // Хим.-фарм. журн.- 1991.- Т. 25.- № 2.- С. 84-86.

7. О механизме образования Z,£ - изомеров ретиналя / А.М. Григорьев и [др.] // Хим.-фарм. журн.- 1992.- Т. 26.- № 11.- С. 90-93.

8. Григорьев A.M. ВЭЖХ в исследовании флавоноидов. Определение рутина / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев, В.М. Староверов // Хим.-фарм. журн.-2004.-Т. 38.- № 9.- С. 23-25.

9. ВЭЖХ в анализе антоцианов: исследование цианидиновых гликозидов плодов растений рода Prunus / А.М. Григорьев и [др.] // Хим.-фарм. журн.-2004.- Т. 38.- № 8.- С. 29-31.

10. ВЭЖХ анализ водорастворимых витаминов в составе поливитаминного сиропа «Олиговит» / A.M. Григорьев и [др.] // Хим.-фарм. журн.- 2004.- Т. 38.-№ З.-С. 33-35., .

11. Инкрементный подход в анализе антоцианов методом ВЭЖХ / A.M. Григорьев и [др.] // Химия природн. соедин.- 2003.-№ 2.- С. 137-139.

12. Григорьев A.M. Антоцианы некоторых растений Белгородской флоры /

B.И. Дейнека, A.M. Григорьев, A.M. Ермаков // Химия природн. соедин.- 2003.-№5.-С. 412-413.

13. Основные антоцианы некоторых растений семейства Grossulariaceae / A.M. Григорьев и [др.] // Химия природн. соедин.- 2003.- № 4.- С. 324-325.

14. Основные антоцианы лепестков семи сортов Tulpa / A.M. Григорьев и [др.] // Химия природн. соедин.- 2003.- № 5.- С. 414.

15. Григорьев A.M. Хроматографическое поведение антоцианов в кислых водно-ацетонитрильных подвижных фазах / A.M. Григорьев, В.И. Дейнека, О.Б. Рудаков // Сорбционные и хроматографические процессы.- 2005.- Т. 5.- Вып. 4.-

C. 508-534.

16. Григорьев A.M. Новые экспресс-методики определения жирорастворимых витаминов в сиропе «Олиговит» и таблетках «Алфавит» методом ВЭЖХ / А.М. Григорьев, В.М. Староверов // Сорбционные и хроматографические процессы.- 2006.- Т. 6.- Вып. 5.- С. 62-69.

17. Влияние площади поверхности силикагеля на селективность разделения Z,£-H30Mep0B полиеновых карбонилсодержащих соединений / A.M. Григорьев и [др.] // Сорбционные и хроматографические процессы. -2006.-Т. 6. Вып. 2.- С. 179-190.

18. Анализ компонентного состава антоцианов плодов и жирных кислот масел семян некоторых видов семейства Rosaceae методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / A.M. Григорьев и [др.] // Раст. ресурсы.- 2005.- Т. 41.-№ 1.- С. 91-98.

19. Исследование антоцианов черники в плодах и препаратах на ее основе /

A.M. Григорьев и [др.] // Зав. лаб.- 2006.- № 3.- С. 16-20.

20. Григорьев A.M. Закономерности удерживания 3-глюкозидов антоцианидинов и флавилиевых солей в условиях ОФ ВЭЖХ / A.M. Григорьев,

B.И. Дейнека, О.Б. Рудаков. // Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии: материалы II Международ, симп.- Краснодар, 2005.- С. 23-24.

21. Григорьев A.M. Нормально-фазовая ВЭЖХ гликозидов: ланатозиды и рутин / A.M. Григорьев, О.Б. Рудаков, В.М. Староверов // 61 per. конф. по фармации и фармакологии: сб. науч. тр. «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».- Пятигорск, 2006.- Вып. 61.- С. 185-188.

22. Григорьев A.M. Ионнозависимые распределения в условиях обращено-фазной ЖХ / A.M. Григорьев, О.Б. Рудаков // Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах («ФАГРАН-2006»): материалы III Всерос. конф., Воронеж, 2006.- Т. И.- С. 746-750.

Работы №№ 1-19 опубликованы в изданиях, соответствующих списку ВАК

Основные принятые обозначения.

Введение.

1. ГЛАВА 1 Обзор литературы

1.1 Основные модели удерживания в нормально-фазовом режиме на силикагеле.

1.2 Вопросы разделения изомеров полиеновых соединений.

1.3 Факторы, влияющие на удерживание ионогенных соединений в условиях обращенно-фазовой хроматографии.

1.4 Антоцианы: равновесия в водных растворах и поведение в условиях ВЭЖХ.

2. ГЛАВА 2 Объекты и методы исследования

2.1 Хроматографическое оборудование.

2.2 Нормально-фазовый режим.

2.3 Обращенно-фазовый режим.

2.4 Дополнительное оборудование.

3. ГЛАВА 3 Нормально-фазовая ВЭЖХ соединений с кратными связями, расположенными возле полярной группы

3.1 Хроматографическое поведение непредельных третичных спиртов.

3.2 Расчетные оценки различий хроматографического поведения спиртов.

3.3 Хроматографическое поведение халконов.

Актуальность проблемы. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) - один из наиболее востребованных инструментов современной аналитической и фармацевтической химии. Непрерывное появление новых сорбентов и модификация известных способов разделения, расширение и усложнение инструментальной базы, появление принципиально новых (для ВЭЖХ) типов детекторов свидетельствует о пристальном внимании, проявляемом к данному методу анализа. Развитие теории жидкостной хроматографии привело к созданию адекватных моделей удерживания соединений различного строения в условиях как обращенно-фазовой, так и нормально-фазовой ВЭЖХ, и следовательно, к возможности прогнозирования хроматографического поведения полифункциональных соединений. Следует отметить, что теоретическая трактовка тонких эффектов взаимодействий сорбата, сорбента и компонентов подвижной фазы в адсорбционном слое в большинстве случаев неоднозначна, и потому носит дискуссионный характер. Изучение этих эффектов, выявление закономерностей их проявления приводит не только к уточнению известных или к появлению ^ новых толкований наблюдаемых процессов, но и позволяет непосредственно управлять селективностью разделения, упрощает поиск оптимальных условий анализа специфических многокомпонентных систем: таких, например, как поливитаминные препараты, экстракты натуральных красителей, природных и искусственных смесей, содержащих физиологически активные соединения.

Актуальность таких исследований обостряется наличием проблем фальсификации фармацевтических препаратов и пищевой продукции, определения качества и безопасности промышленных продуктов и исходного сырья. Подавляющее количество биологически активных соединений характеризуются высокой полярностью или способностью ионизироваться, и поэтому можно заключить, что знание факторов, влияющих на их удерживание не только способствует снижению времени, затрачиваемому на подбор условий разделения, но и предохраняет от возможных аналитических ошибок.

Целью работы явилось изучение влияния структуры геометрических изомеров природных и синтетических непредельных соединений на их хроматографическое поведение в зависимости от состава элюента и состояния адсорбционного слоя; выявление факторов, определяющих удерживание ионогенных органических и неорганических веществ в зависимости от рН, солевого фона и добавок модификаторов подвижной фазы.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• экспериментальное определение параметров удерживания 40 непредельных соединений в 36 нормально-фазовых хроматографических системах;

• экспериментальное определение параметров удерживания 62 ионогенных и неионогенных соединений (антоцианы, флавилиевые соли, халконы, сульфонаты, амины, неорганические соли и пр.) в 15 обращенно-фазовых системах;

• синтез, препаративное ВЭЖХ-разделение ряда геометрических изомеров полиеновых соединений и подтверждение их структур спектроскопическими методами: ИК, ЯМР 'Н и 13С, УФ и видимой области;

• расчет геометрических и энергетических характеристик структур использованных соединений и образуемых ими модельных водородных связей методами квантовой химии и молекулярной механики;

• расчет факторов, влияющих на удерживание антоцианов и их равновесных форм в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ с кислыми подвижными фазами.

Научная новизна работы. На основе наблюдаемого поведения в условиях нормально-фазовой (НФ) и обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ дана новая трактовка механизмов удерживания без непосредственного применения инкрементных моделей и (для НФ) - без использования общих физико-химических свойств сорбатов.

Показано, что в присутствии полярных апротонных модификаторов подвижной фазы в условиях НФ на силикагеле (ацетон, сложные эфиры) основной вклад в механизме заместительной сорбции трех непредельных изопреноидных спиртов вносят карбонильные группы модификаторов.

С помощью квантовохимического (и молекулярно-механического) расчета характеристик молекул сорбатов обоснован порядок их удерживания (НФ). В основу расчетов положено формирование водородных связей между гидроксильными группами спиртов и поверхностными функциональными группами сорбента при учете их стерической доступности и подвижности.

Найдено, что селективность разделения 2, ¿'-изомеров полиеновых соединений и халконов (НФ) определяется в большей степени структурой поверхности неподвижной фазы и в меньшей - составом элюента. Установлена тесная корреляция между селективностью и конформационными возможностями молекул и степенью доступности их якорных групп.

Показано, что в присутствии кислот и солей в адсорбционном слое обращенно-фазового сорбента может формироваться дополнительный заряд, » что позволило объяснить наблюдаемое поведение сорбатов - гидрофильных и гидрофобных ионов.

Обоснована возможность образования ионных пар в адсорбционном слое между неорганическими анионами и органическими катионами типа флавилия. Предложена математическая модель, адекватно описывающая характер удерживания антоцианов при варьировании кислотности и солевого состава подвижной фазы.

Практическая значимость работы. Разработан комплекс из 12 методик определения витаминов, полупродуктов их производства и кислот цикла Кребса методом ВЭЖХ, апробированных на Болоховском химкомбинате синтетических полупродуктов и витаминов, НПО "Витамины" (г. Москва), ПО "Биовитамины" (г. Белгород), ПО "Завод лимонной кислоты" (г. Белгород),

ОАО "Ай Си Эн Лексредства" (г. Курск), ООО "Технофарм" (г. Курск). Кроме того, выполнен ряд работ и разработан комплекс методик (17) для определения продуктов поисковых синтезов биологически-активных соединений. Перечень работ приведен в Приложении.

Положения, выносимые на защиту:

1. Обоснование закономерностей удерживания трех непредельных спиртов, обусловленных их геометрическими и конформационными характеристиками и хроматографическими свойствами полярных модификаторов подвижной фазы.

2. Обоснование механизма разделения геометрических изомеров полиеновых соединений и халконов, определяемого различием их структурных и конформационных свойств.

3. Обоснование удерживания органических ионов в присутствии органических и неорганических противоионов.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005); II Школе-семинаре ( «Ионообменные процессы и выделение физиологически активных веществ»

Воронеж, 2006); 61 региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2006); III всероссийской конференции «Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах» («ФАГРАН-2006», Воронеж, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, в том числе 19 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК и 3 в виде тезисов докладов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Определено, что ключевую роль в процессе заместительной сорбции в условиях нормально-фазовой ВЭЖХ третичных изопреноидных спиртов при использовании сложных эфиров в качестве полярных модификаторов подвижной фазы играет карбонильная группа в структуре эфиров.

2. Порядок удерживания рассмотренных изопреноидных спиртов в значительной степени определяется конформационными характеристиками (подвижностью и доступностью якорной гидроксигруппы) а также энергетикой водородных связей, возникающей между этой группой и полярной поверхностью. Это подтверждено расчетом методами квантовой химии и молекулярной механики барьеров внутреннего вращения молекулярных фрагментов и характером образования модельных водородных связей между гидроксигруппами спиртов и молекулами воды как в донорном, так и в акцепторном вариантах.

3. Повышение селективности разделения 2, ^-изомеров полиеновых соединений и халконов в условиях нормально-фазовой ВЭЖХ является следствием снижения стерической доступности якорной группы 2-изомеров которая в свою очередь, определяется двумя факторами: уменьшением вероятности возникновения выгодных для сорбции 5-транс конформаций (определяемых энергией барьеров вращения молекулярных фрагментов) и площадью максимальной окружности, описываемой неполярными фрагментами молекул. Расчет этих факторов для каждого класса соединений позволяет предсказать селективность разделения без использования общих физико-химических свойств сорбатов.

4. Установлено, что добавки кислот и солей (с анионами СЮ4", СБзСОО", Б04 ) в водных элюентах при обращенно-фазовой ВЭЖХ могут приводить к увеличению отрицательной составляющей полного заряда поверхности сорбента, что объясняет изменение удерживания сорбатов: рост -для катионов и падение - для анионов. Размер этого заряда определяется природой и концентрацией анионов и при одинаковых концентрациях уменьшается в ряду от перхлората до сульфата.

5. Наблюдаемое сильное удерживание органических катионов (флавилия, бензиламинов, витамина В]) и слабое - сульфонатов (в условиях обращено-фазовой ВЭЖХ) связано с формированием отрицательного заряда и электростатическими взаимодействиями в этом слое. Для катионов возможен также ион-парный механизм.

6. Удерживание конверсируемых органических катионов (антоцианов) существенно определяется природой и концентрацией анионов (СЮ4", СР3СОО")„ присутствующих в подвижной фазе и может быть полностью описано в пределах ион-парной модели удерживания. Значительных различий между действием гидрофильного (СЮ4") и гидрофобного (гексансульфонат) анионов добавки не выявлено.

7. Разработано 27 методик определения витаминов, полупродуктов их производства, части кислот цикла Кребса и соединений, участвующих в цепях синтеза перспективных биологически-активных соединений.

1. Snyder L.R., Kirkland J.J. I I Introduction to Modern Liquid Chromatography. Toronto: John Willey & Sons Inc. 1979. P. 409.

2. Snyder L.R. Principles of adsorption chromatography.- New York: Dekker, 1968.- 413 p.

3. Soczewinski E. Solvent compozition effect in thin-layer chromatography systems of the type silica gel electron donor solvent//Anal.Chem.- 1969.-Vol. 41.-№ 1.- P. 179-182

4. Scott R.P.W., Kucera P. Solute-solvent interaction on the surface of silica gel // J. Chromatogr.- 1978,- Vol. 149.- № 1.- P. 93-110

5. Scott R.P.W., Kucera P. Solute-solvent interaction on the surface of silica gel, II // J. Chromatogr.- 1979,- Vol. 171.- № 1.- P. 37-48

6. Шатц В.Д., Сахартова O.B. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Рига: Зинатне. 1988. 391 с.

7. Березовский, В.М. Химия витаминов. М: Пищевая промышленность.- 1973. 632 с

8. Григорьев, A.M. Хроматографический анализ изофитола / A.M. Григорьев, JI.A. Высочина, З.В. Половинко, В.П. Романенко, В.И. Дейнека, В.М. Староверов // Хим.-фарм. журн.- 1990.- Т. 24.- № П.- С. 81-83

9. O.Becker, R.S. The visual process: photophysics ant photoisomerization of model visual pigments and primary reaction / R.S. Becker // Photochem. Photobiol.- 1988.- V. 48,- P. 369-399

10. Liu R.S.H., New geometric isomers of vitamin A and carotenoids / R.S.H. Liu, A.E. Asato // J. Am. Chem. Soc.- 1977.- V. 99. -№ 24,- P. 8095-8097.

11. Zonta, F. HPLC of retinals, retinols (vitamin A) and their dehydro homologues (vitamin A) / F. Zonta, B. Strancher // J. Chromatogr.1984.- V.301.-P. 65-75

12. Bruening, R.C. Rapid HPLC analysis of retinal mixtures / R.C. Bruening, P. Derguini, K. Nakanishi // J. Chromatogr.- 1986.- V.361.-P. 437-461

13. Bruening, R.C. Preparative scale isolation of 11-cis retinal from isomeric retinal mixture by centrifugal partition chromatography / R.C. Bruening, P. Derguini, K. Nakanishi // J. Chromatogr.- 1986.-V.357.- P. 340-343

14. Landers, G.M. Absence of isomerization of retinyl palmitate, retinol and retinal in chlorinated and nonchlorinated solvents under gold light / G.M. Landers, J.A. Olson // J. Assoc. Off. Anal. Chem.- 1986.-V.69. -№ 1. P.-50-55

15. Tsukida, K. HPLC analysis of cis-trans stereoisomeric 3-dehydroretinals in the presence of retinal isomers / K. Tsukida, R. Masahara, M. Ito // J. Chromatogr.- 1980.- V. 192.- P. 395-401

16. Дейнека, В.И. О механизме образования Z,E изомеров ретиналя / В.И. Дейнека, А.П. Высочин, В.М. Староверов, A.M. Григорьев // Хим.-фарм. журн.- 1992.- Т. 26.- № 11.- С. 90-93.

17. Григорьев, A.M. Новые экспресс-методики определения жирорастворимых витаминов в сиропе «Олиговит» и таблетках «Алфавит» методом ВЭЖХ / A.M. Григорьев, В.М. Староверов // Сорбционные и хроматографические процессы.- 2006.- Т. 6.-Вып. 5,- С. 62-69

18. Модифицированные кремнеземы в сорбции, катализе и хроматографии. Под ред. Г.В. Лисичкина. // М: Химия.- 1986.248 с

19. Фадеев, А.Ю. Распределение по поверхности и динамическое поведение органических молекул, закрепленных на кремнеземе.: дисс. на соискание степени канд. хим. наук: 02.00.04 / Фадеев Александр Юрьевич.- М., 1999.- 226 с

20. Водородная связь / Под ред. Н.Д.Соколова. // М., Наука.- 1981.288 с

21. Рудаков, О.Б. Экспертная система для жидкостной хроматографии: принципы построения и применение вхимическом анализе.: дисс. на соискание степени доктора химических наук: 02.00.02 / Рудаков Олег Борисович.- Воронеж, 2004,- 400 с

22. Snyder, L.R. Solvent-strength selectivity in reversed-phase HPLC / L.R. Snyder, M.A. Quarry, J.L. Glajch // Chromatographia- 1987.- V. 24.- P. 33-44

23. Sentell, K.B. Retention mechanisms in reversed-phase chromatography. Stationary phase bonding density and solute selectivity / K.B. Sentell, J.G. Dorsey // J. Chromatogr.- 1989.- V. 461.-P. 193-207

24. Welsch, T. Silanol effects in reversed-phase liquid chromatography / T. Welsch, H. Frank // J. Chromatogr.- 1990.- V. 506,- P. 97108

25. Horvath, C. Surface Silanols in Silica-Bonded Hydrocarbonaceous Stationary Phases. I. Dual Retention Mechanism in Reversed-Phase / A. Nahum, C. Horvath // J. Chromatogr.- 1981.- V. 203.- P. 53-63

26. Nikitas, P. Effect of the organic modifier concentration on the retention in reversed-phase liquid chromatography II. Tests usingvarious simplified models / P. Nikitas, A. Pappa-Louisi, P. Agrafiotou // J. Chromatogr. A- 2002.- V. 946.- P. 33-45

27. Ко, J. Comparison of selected retention models in reversed-phase liquid chromatography / J. Ко, J.C. Ford // J. Chromatogr. A- 2001.-V.913.-P. 3-13

28. Рудаков, О.Б. Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии. / О.Б. Рудаков, И.А. Востров, С.В. Федоров, А.А. Филиппов, В.Ф. Селеменев, А.А. Приданцев.-Воронеж: «Водолей», 2003.- 527 с

29. Григорьев, A.M. Быстрое определение пантенола методом ВЭЖХ / A.M. Григорьев, В.М. Староверов, А.П. Высочин, В.И. Дейнека // Хим.-фарм. журн.-1991.- Т. 25.- № 2.- С. 84-86.

30. Knox, J.N. Theory of Solvent Disturbance Peaks and Experimental Determination of Thermodynamic Dead-Volume in Column Liquid Chromatography / J. H. Knox, R. Kaliszan // J. Chromatogr.- 1985.-V. 349.-P. 211-234

31. Karraker, K.A. Disjoining pressures, zeta potentials and surface tensions of aqueous non-ionic surfactant/electrolyte solutions: theory and comparison to experiment / K.A. Karraker, C.J. Radke // Adv. in Coll. and Int. Sci.- 2002,- V. 96,- P. 231-264

32. Netz, R.R. Debye-Hückel theory for interfacial geometries / R.R. Netz //Phys. Rev.- 1999.- V. 60,- P. 3174-3182

33. Levin, Y. Surface tension of strong electrolytes / Y. Levin, J.E. Flores-Mena // Europhysics Lett.- 2001.- V. 56.- P. 187-192

34. Stillinger, F.H. Interfacial Solutions of the Poisson-Boltzmann Equation / F.H. Stillinger // J. Chem. Phys.- 1961.- V. 35.-№ 5,- P. 1584-1589

35. Ландау, JI. Д. Теоретическая физика. В 10 ч. Ч. 8. Электродинамика сплошных сред / Л.Д. Ландау, Е.М. Лифшиц.-М.: Наука, 1982.- 620 с

36. Оно, С. Молекулярная теория поверхностного натяжения в жидкостях / С. Оно, С. Кондо.- М.: Изд. иностр. лит., 1963.- 290 с. (пер.)

37. Крестов, Г.А. Ионная сольватация / Г.А. Крестов, Н.П.

38. Новоселов, И.С. Перелыгин и др.- М.: Наука, 1987.- 320 с 46.Эрдеи-Груз, Т. Явления переноса в водных растворах / Т. Эрдеи-Груз,- М.: Мир, 1976.- 595 с. (пер.)

39. Гордон, Дж. Органическая химия растворов электролитов / Дж. Гордон.- М.: Мир, 1979.- 712 с. (пер.)

40. Измайлов, Н.А. Электрохимия растворов / Н.А. Измайлов.- М.: «Химия», 1976.- 488 с

41. Добош, Д. Электрохимические константы / Д. Добош.- М.: Мир, 1980.- 365 с. (пер.)

42. Knox, Н. Theory of Solvent Disturbance Peaks and Experimental Determination of Thermodynamic Dead-Volume in Column Liquid Chromatography / H. Knox, R. Kaliszan // J. Chromatogr.- 1985.- V. 349.-P. 211-234

43. Rimmer, C.A. The measurement and meaning of void volumes in reversed-phase liquid chromatography / C.A. Rimmer, Carolyn R. Simmons, J.G. Dorsey // J. Chromatogr.- 2002.- V. 965.- P. 219-232

44. Scott, R.P.W. Chromatography theory / R.P.W. Scott.- Marcel Dekker.: New York, Basel, 2002,- 475 p

45. Horvath, C. Liquid Chromatography of Ionogenic Substances with Nonpolar Stationary Phases / C. Horvath, W. Melander, I. Molnar // Anal.Chem.- 1977,- V. 49.- P. 142-153

46. Melander, W. Reversed-Phase Chromatography. In vol. 2. Vol. 2. High-Performance Liquid Chromatography: Advances and Perspectives / W. Melander, C. Horvath.- New York: Academic Press, 1980,-319 p

47. Chen, G. Electrical Double-Layer Models of Ion-Modified (ion-pair)reversed-phase liquid chromatography / G. Chen, S. G. Weber, L.L. Glavina, F. F. Cantwell // J. Chromatogr.- 1993.- V. 656.- P. 549576

48. Stahlberg, J. Quantitative Evaluation of the Electrostatic Theory for Ion Pair Chromatography / J. Stahlberg // Chromatographia.- 1987.-V. 24,- P. 820-826 57. Stahlberg, J. Retention models for ions in chromatography / J.

49. Stahlberg // J. Chromatogr. A- 1999,- V. 855,- P. 3-55 58.Stahlberg, J. Electrostatic Retention Model for Ion-Exchange Chromatography / J. Stahlberg // Anal. Chem.- 1994.- V. 66.- P. 440449

50. Cecchi, T. Extended Thermodynamic Approach to Ion Interaction Chromatography / T. Cecchi, F. Pucciarelli, P. Passamonti // Anal. Chem.-1991.- V. 73,- P. 2632-2639

51. Cecchi, T. Extended thermodynamic approach to ion interaction chromatography: a thorough comparison with the electrostatic approach, and further quantitative validation / T. Cecchi // J. Chromatogr. A- 2002.- V. 958.- P. 51-58

52. Janosa, P. Reversed-phase high-performance liquid chromatography of ionogenic compounds: comparison of retention models / P. Janosa, J. Skoda//J. Chromatogr. A- 1999.- V. 859.- P. 1-12

53. Roses, M. Influence of mobile phase acid-base equilibria on the chromatographic behaviour of protolytic compounds / M. Roses, E. Bosch // J. Chromatogr. A- 2002.- V. 982.- P. 1-30

54. Espinosa, S. Retention of ionizable compounds on high-performanceliquid chromatography XI. Global linear solvation energy relationships for neutral and ionizable compounds / S Espinosa, E. Bosch, M. Roses // J. Chromatogr. A- 2002.- V. 945,- P. 83-96

55. Dong, M.W. Factors affecting the ion-pair chromatography of water-soluble vitamins / M.W. Dong // J. Chromatogr.- 1988.- V. 442,- P. 81-95

56. Григорьев, A.M. Высокоэффективная жидкостная хроматография синтетического витамина В1 / A.M. Григорьев, JI.A. Высочина, В.М. Староверов, В.И. Дейнека, А.П. Высочин, В.М. Белова // Журн. аналит. химии.- 1992.- Т. 47.- Вып. 10.- С. 1904-1909

57. Староверов, В.М ВЭЖХ анализ водорастворимых витаминов в составе поливитаминного сиропа «Олиговит» / В.М. Староверов, В.И. Дейнека, A.M. Григорьев, Е.Ф. Прохода, М.В. Покровский, В.В. Иванов. // Хим.-фарм. журн.- 2004,- Т. 38.- № 3,- С. 33-35

58. Roshal, A.D. Luminescent properties of 2-phenylbenzopyrillium salts / A.D. Roshal, D.Y Minaev, V.L. Koval, A.I. Novikov // Optics and Spectroscopy.- 1998.- V. 85.- № 5.- P. 705-710

59. Bonch-Bruevich, A.M. Adsorption and fluorescent properties of pyrillium compounds / A.M. Bonch-Bruevich, R. Gadonas, E.N. Kalitteevskaya etc. // Optics and Spectroscopy.- 2000.- V. 89.- № 5.-P. 712-720

60. Рошаль, А.Д. Нуклеофильная сольватация как причина образования TICT-конформации фенилбензопириллиевых катионов в возбужденном состоянии. // Вестник Харьковского университета.- 1999.- № 454,- С. 125-129

61. Pina, F. Structural transformations of the synthetic salt 4',7-dihydroxyflavylium chloride in acid and basic aqueous solutions. Part 1 Ground state / F. Pina; M. Benedito, M. Lina, P. A. Joao, etc // An.Quim. - 1997,- V. 93,- P. 111-118

62. Pina, F. Photochromism of 4'-Methoxyflavylium Perchlorate. A

63. Write-Lock-Read-Unlock-Erase" Molecular Switching System / F. Pina, M. J. Melo, M. Maestri, R. Ballardini, V. Balzani // J. Am. Chem. Soc. 1997.- V. 119.- P. 5556

64. Figueiredo, P. Photochromism of the Synthetic 4',7-Dihydroxyflavylium Chloride / P. Figueiredo, J. C. Lima, H. Santos, M.-C. Wigand, R. Brouillard, F. Pina, A. Macanita // J. Am. Chem. Soc. 1994.-V. 116.-P. 1249-1254

65. Pina, F. Photochemistry of 3,4 -dimethoxy-7-hydroxyflavylium chloride. Photochromism and excited-state proton transfer / F. Pina, L. Benedito, M. J. Melo, A. J. Parola, M. A. Bernardo // J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1996.- V. 92.- № 10.- P. 1693-1699

66. Схунмакерс, П. Оптимизация селективности в хроматографии / П. Схунмакерс. -М.: Мир, 1989.- 399 с

67. Maestria, М. Light and рН switching between the various forms of the 4'-methylflavylium cation / M. Maestria, F. Pina, A. Roque, P. Passaniti // J. Photochem. Photobiol. 2000.- V. 137.- № 1.- P. 21-28

68. Pina, F. Photochromic flavylium compounds as multistate/multifunction molecular-level systems / F. Pina, M. Maestri, V. Balzani // Chem. Commun. 1999.- P. 107-114

69. Илиел, JT. Конформационный анализ / Э. Илиел, Н. Аллинджер, С. Энжиал, Г. Моррисон.- М.: Мир, 1969.- 592 с. (пер.)

70. Молекулярные взаимодействия Под ред. Г. Ратайчак, У. Орвилл-Томас //М.: Мир, 1984.- 600 с. (пер.)

71. Thermodynamic Study of Proton Transfer, Hydration, and Tautomeric Reactions of Malvidin 3-Glucoside / R. Brouillard, B. Delaporte. // J. Am. Chem. Soc.- 1977.- V. 99.- P. 8461-8468

72. Brouillard, R. Origin of the exceptional colour stability of the Zebrina anthocyanin / R. Brouillard, B. Delaporte. // Phytochemistry.- 1981.-V. 20.-P. 143-155

73. Cheminât, A. PMR Investigation of 3-0-(b-D-glucosyl)malvidin. Structural Transformation in Aqueous Solutions / A. Cheminât, R. Brouillard. // Tetrahedron Lett.- 1986.- V. 27.- P. 4457-4460

74. Brouillard, R. The hemiacetal-cis-chalcone equilibrium of malvin, a natural anthocyanin / R. Brouillard, L. Jacques. // Canadian Journal of Chemistry.- 1990,- V. 68,- № 5,- P. 5755-5761

75. Figueiredo, P. Photochromism of the Synthetic 4',7-Dihydroxyflavylium Chloride / P. Figueiredo, J. C. Lima, H. Santos, M.-C. Wigand, R. Brouillard, F. Pina, A. Macanita. // J. Amer. Chem. Soc.- 1994.- V. 116,- № 4.- P. 1249-1254

76. Merlin, J. C. Resonance Raman Spectroscopic studies of anthocyanins and anthocyanidins in aqueous solutions / J. C. Merlin, A. Statoua, J. P. Cornard, M. Saidi-Idrissi, R. Brouillard. // Phytochemistry.- 1994.-V. 35,- № l.-P. 227-232

77. Dangles, O. Kinetic and thermodynamic investigation of the aluminium-anthocyanin complexation in aqueous solution / O. Dangles, M. Elhabiri, R. Brouillard. // Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 2.- 1994.- № 12.- P. 2587-2596

78. Goiffon, J.-P. High-performance liquid chromatography of red fruit anthocyanins / J.-P. Goiffon, M. Brun, M.-J. Bourrier // J. Chromatogr. A. -1991.- V. 537.- P. 101-121

79. Goiffon, J.-P. Anthocyanic pigment determination in red fruit juices, concentrated juices and syrups using liquid chromatography / J.-P. Goiffon, P.P. Moulyb, E.M. Gaydouc // Anal. Chim. Acta. 1999.- V. 382.-P. 39-50

80. Дейнека, В.И. Основные антоцианы некоторых растений семейства Grossulariaceae / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев, В.М.

81. Староверов, A.A. Сиротин 11 Химия природн. соедин.- 2003.- № 4.- С. 324-325

82. Дейнека, В.И. Основные антоцианы лепестков семи сортов Tulpa / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев, В.М. Староверов, В.В. Фесенко // Химия природн. соедин.- 2003.- № 5.- С. 414

83. Дейнека, В.И. Антоцианы некоторых растений Белгородской флоры / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев, A.M. Ермаков // Химия природн. соедин.- 2003.- № 5.- С. 412-413

84. Дейнека, В.И. ВЭЖХ в исследовании флавоноидов. Определение рутина / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев, В.М. Староверов // Хим.-фарм. журн.- 2004,- Т. 38.- № 9.- С. 23-25

85. Дейнека, В.И. Относительный анализ удерживания гликозидов цианидина / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев // Журн. физ. химии.- 2004.- Т. 78.- № 5,- С. 923-926

86. Дейнека, В.И. Исследование антоцианов черники в плодах и препаратах на ее основе / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев, JI.A. Дейнека, Е.И. Шапошник, В.М. Староверов // Зав. лаб.- 2006.- № З.-С. 16-20

87. Дейнека, В.И. Инкрементный подход в анализе антоцианов методом ВЭЖХ / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев, В.М. Староверов, О.Н. Борзенко // Химия природн. соедин.- 2003.- № 2,-С. 137-139

88. Дейнека, В.И. ВЭЖХ в анализе антоцианов: исследование цианидиновых гликозидов плодов растений рода Prunus / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев, О.Н. Борзенко, В.М. Староверов, М.А. Трубицын // Хим.-фарм. журн,- 2004.- Т. 38.- № 8,- С. 29-31

89. Дейнека, В.И. Определение антоцианов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Некоторые закономерности удерживания / В. И. Дейнека, А. М. Григорьев // Журн. аналит. химии.- 2004,- Т. 59.- Вып. 3,- С. 305-309

90. Дейнека, В.И. Относительный анализ удерживания гликозидов цианидина / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев // Журн. физ. химии.- 2004.- Т. 78.- № 5.- С. 923-926

91. Дейнека, В.И. Удерживание антоцианов в обращенно-фазовой системе со смешанным элюентом ацетонитрил-муравьиная кислота-вода / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев // Журн. физ. химии.- 2005,- Т. 79.- № 5.- С. 900-903

92. Григорьев, A.M. Хроматографическое поведение антоцианов в кислых водно-ацетонитрильных подвижных фазах / A.M. Григорьев, В.И. Дейнека, О.Б. Рудаков // Сорбционные и хроматографические процессы.- 2005.- Т. 5,- Вып. 4.- С. 508-534

93. Hanai, Т. Quantitative structure-retention relationships of phenolic compounds without Hammett's equations / T. Hanai // J. Chromatogr. A. 2003,- V. 985.- № 1,- P. 343-349

94. Hanai, T. Simulation of chromatography of phenolic compounds with a computational chemical method / T. Hanai // J. Chromatogr. A. 2004.- V. 1027.- № i. p. 279-287

95. Amic, D. Application of topological indices to chromatographic data: Calculation of the retention indices of anthocyanins / D. Amic, D. Davidovic-Amic, N. Trinajstic. // J. Chromatogr. A. 1993.- У. 653.-№1.-P. 115-121

96. Tsao, R. Optimization of a new mobile phase to know the complex and real polyphenolic composition: towards a total phenolic index using high-performance liquid chromatography / R Tsao, R. Yang. // J. Chromatogr. A. 2003.- V. 1018,- № 1.- P. 29-40

97. Liu, X. Quantification and Purification of Mulberry Anthocyanins with Macroporous Resins / X. Liu, G. Xiao, W. Chen, Y. Xu, J. Wu // Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2004.-V. 5.- P. 326-331

98. Vendramini, A. Phenolic Compounds in Acerola Fruit (Malpighia punicifolia, L.) / A. Vendramini, L. Trugo // J. Braz. Chem. Soc. 2004.- V. 15.- № 5.- P. 326-331

99. Vendramini, A. Phenolic Compounds in Acerola Fruit (Malpighia punicifolia, L.) / A. Vendramini, L. Trugo // J. Braz. Chem. Soc. 2004.- V. 15.- № 5.- P. 326-331

100. Mondello, L. Determination of anthocyanins in blood orange juices by HPLC analysis / L. Mondello, A. Cotroneo, G. Errante, G. Dugo, P. Dugo // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. -2000.-V. 235.-P. 191-195

101. Su Noh Ryu. High Performance Liquid Chromatographic Determination of Anthocyanin Pigments in Some Varieties of Black Rice / Su Noh Ryu, Sun Zik Park, Chi-Tang Ho // J. Food Drug Anal. 1998,-V. 6.-№4,-P. 729-736

102. Revilla, E. Value of high-performance liquid chromatographic analysis of anthocyanins in the differentiation of red grape cultivars and red wines made from them / E. Revilla, E. Garcia-Beneytez, F.

103. Cabello, G. Martin-Ortega, J.-M. Ryan. // Journal of Chromatography A. 2001.- V. 915.- № 1.- P. 53-60

104. Revilla, E. Comparison of Several Procedures Used for the Extraction of Anthocyanins from Red Grapes / E. Revilla, J.M. Ryan, G. Martin-Ortega. // J. Agric. Food Chem. 1998,- V. 46.- № 11.- P. 4592-4597

105. Kiss, G. A. C. Solid-phase extraction and high-performance liquid chromatographic separation of pigments of red wines / G. A. C. Kiss, E. Forgacs, T. Cserhati, etc. // J. Chromatogr. A. 2000.- V. 889,-№ l.-P. 51-57

106. Johnston, T.V. Separation of anthocyanin pigments in wine by Low Pressure Column Chromatography / T.V. Johnston, J. R. Morris. //J. FoodSci.- 1996,-V. 61.-№ i.p. 109-111

107. Mozeti, B. Determination and Quantitation of Anthocyanins and Hydroxycinnamic Acids in Different Cultivars of Sweet Cherries

108. Prunus avium L.) from Nova Gorica Region (Slovenia) / B. Mozeti, P. Trebse, J. Hribar. // Food Technol. Biotechnol. 2002.- V. 40,- № 3.- P. 207-212

109. Brandt, K. Structure and biosynthesis of anthocyanins in flowers of Campanula / K. Brandt, T. Kondo, H. Aoki; T. Goto. // Phytochemistry. 1993,- V. 33.- № 1.- P. 209-212

110. Drdak, M. Analysis of anthocyanins in red wines by high-perfortance liquid chromatography using butylamines in the mobile phase / M. Drdak, P. Daucik, J. Kubasky. // J. Chromatogr. 1990.- V. 504.- P. 207-209

111. Merken, H.M. Liquid chromatographic method for the separation and quantification of prominent flavonoid aglycones / H. M. Merken, G. R. Beecher. // J. Chromatogr. A. 2000.- V. 897,- P. 177-184

112. Morais, H. Column Liquid Chromatography Stability of Anthocyanins Extracted from Grape Skins / H. Morais // Chromatographia. - 2002.- V. 56.- P. 173

113. Atanasova, V. Effect of oxygenation on polyphenol changes occurring in the course of wine-making / V. Atanasova, H. Fulcrand, V. Cheynier, M. Moutounet // Anal. Chim. Acta. 2002,- V. 458.- P. 15-27

114. Atanasova, V. Structure of a new dimeric acetaldehyde malvidin 3-glucoside condensation product / V. Atanasova, H. Fulcrand, V. Cheynier, M. Moutounet // Tetrahedron Letters. 2002.-V. 43.- P. 6151-6153

115. Froytlog, C. Combination of chromatographic techniques for the preparative isolation of anthocyanins applied on blackcurrant (Ribes nigrum) fruits / C. Froytlog, R. Slimestad, O.M. Andersen. // J. Chromatogr. A. - 1998.- V. 825.- № 1.- P. 89-95

116. Fossen, T. Characteristic anthocyanin pattern from onions and other Allium / T. Fossen, O.M. Andersen, D.O. Ovstedal, A.T. Petersen, A. Raknes. // J. Food Sci. 1996,- V. 61,- № 4.- P. 703-706

117. Francis, G. W. Droplet counter-current chromatography of anthocyanins / G. W. Francis, O.M. Andersen. // J. Chromatogr.1984.- V. 283.- P. 445-448

118. Andersen, O. M. Simultaneous analysis of anthocyanins and anthocyanidins on cellulose thin layers / O.M. Andersen, G. W. Francis. // J. Chromatogr. 1985.- V. 318.- P. 450

119. Andersen, O. M. Anthocyanins in fruits of Vaccinium-uliginosum L (Bog Whortleberry) / O.M. Andersen // J. Food Sci.1985.- V. 52.-№3.-P. 665

120. Andersen, O. M. NMR of anthocyanins assignments and effects of exchanging aromatic protons / A.T. Pedersen, O.M. Andersen, D.W. Aksnes, W. Nerdal // Magnetic Resonance in Chemistry.- 1993.- V. 31,- № 11- P. 972-976

121. Andersen, O. M. Acylated anthocyanins from petunia flowers / R. Slimestad, A. Aaberg, O.M. Andersen. // Phytochemistry.- 1999.-V. 50.- № 6- P. 1081-1086

122. Andersen, O. M. Chromatographic separation of anthocyanins in cowberry (Lingonberry) Vaccinium vites-idaea L / O.M. Andersen. // J. Food Sci.- 1985.- V. 50.- P. 1230

123. Cabrita, L. Colour and stability of the six common anthocyanidin 3-glucosides in aqueous solutions / L. Cabrita, T. Fossen, O.M. Andersen. // Food Chem.- 2000,- V. 68,- P. 101-107

124. Fossen, T. Delphinidin 3'-galloylgalactosides from blue flowers of Nymphaea caerulea / T. Fossen, O.M. Andersen. // Phytochemistry.- 1999.- V. 50.-№ 7-P. 1185-1188

125. Andersen, O. M. Anthocyanins from Maize (Zea mays) and Reed Canarygrass (Phalaris arundinacea) / T. Fossen, R. Slimestad, O.M. Andersen. // J. Agric. Food Chem.- 2001.- V. 49.- № 5- P. 23182321

126. Vivar-Quintana, A. M. Anthocyanin-derived pigments and colour of red wines / A.M. Vivar-Quintana, C. Santos-Buelga, J.C. Rivas-Gonzalo. // Anal. Chim. Acta.- 2002.- V. 458.- P. 147-155

127. Kennedy, J. A. Analysis of pigmented high-molecular-mass grape phenolics using ion-pair, normal-phase high-performance liquid chromatography / J.A. Kennedy, A.L. Waterhouse. // J. Chromatogr. A.- 2000.- V. 866.- № 1- P. 25-34

128. Kennedy, J. A. Composition of grape skin proanthocyanidins at different stages of berry development / J.A. Kennedy, Y. Hayasaka, S. Vidal, E.J. Waters, G.P. Jones. // J. Agric. Food Chem.- 2001.- V. 49.-№ 11-P. 5348-5355

129. Kennedy, J. A. Changes in grape seed polyphenols during fruit ripening / J.A. Kennedy, M.A. Matthews, A.L. Waterhouse. // Phytochemistry.- 2000.- V. 55.- № 1- P. 77-85

130. Kennedy, J. A. Analysis of proanthocyanidins by highperformance gel permeation chromatography / J.A. Kennedy, A.W. Taylor. // Journal of Chromatography A.- 2003.- V. 995.- № 1- P. 99107

131. УТВЕРЖДАЮ» Генеральный директор ОАО «НИИ ТМП»• \Ч/ . •■ ■ '.У/- • ¡\к.х.н;. В.М. Староверов ' L1 2006 г.