Выделение и характеризация мезодермализующего фактора из амниотической жидкости коровы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Академия наук СССР Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина

На правах рукописи

УДК 377.17

КРАСНОСЕЛЬСКИЙ АЛЕКСЕЙ ЛЕОНИДОВИЧ

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАНТЕРИЗАЦИЯ1 МЕЗОДЕРМАЛЙЗУНЩЕГО ФАНТОРА ИЗ АМИМТИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ КОРОВЫ

Специальность 02.00.10 — биоорганическая химия, химия природных и биологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва — 1990

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР.

Научный руководитель — кандидат химических наук Чертов О. Ю.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Луканидин Е. М.; кандидат химических наук Храмцов Н. В.

Ведущая организация — Научный центр по разработке и внедрению современных методов молекулярной диагностики Минздрава СССР.

Защита состоится <.1 ^ 1990 г.

в _часов на заседании специализированного

совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР по адресу: 117871, ГСП-7, Москва,. В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР.

Автореферат разослан 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

)

Актуальность проблемы. Мэзодермалъная индукция является одним из фундаментальных механизмов дифференцировки клеток и тканой в эмбриогенезе и состоит в изменении программы развития одних клеток иод действием сигнала,исходящего от других (индуцирущих) клэток.Изучение молекулярных основ мезодермальной индукции представляет собой одно из важнейших направлений соврзмешюй молекулярной биологии развития. Хотя-это явление достаточно хорош описано еще в начале этого столетия с позиций классической биологии, биохимия и молекулярная биология процесса индукции изучена слабо. Одной из основных задач в изучении эмбриональной индукции является выделение и установление структуры аутентичного кпдуктора. Лучие всего эмбриональная индукция изучена на зародавах. Хепориз laevla, которые являются наиболее удобной экспериментальной модельной системой для изучения эмбриогенеза позвоночных (включая млекопитающих). Однако выделение и установление структура индуктора из зародышей Хепориз laevla практически невозможно на современном этапе развития биохимических методов. В связи с этим одним из достаточно плодотворных подходов к данной проблеме оказался поиск и выделение белка с подобной активностью из тканей, доступных в большем количестве,чем омбриони Хепориз laevla - таких как ткани взрослого организма и эмбрионов крупного рогатого скота -, его выделение и характеризация с целью изучения процесса индукции in vitro и In vivo.

Цель работы. Целью работы являлся поиск доступного источника мэзодеркализунцого фактора, разработка методики • его выделения и очистки, определение частичной аминокислотной последовательности этого белка и его характеристик,сравнение выделенного нвзодермализуицего фактора с известным^, болками-индукторами образования мезодермы. В связи с этим была поставлена задача

анализа экстрактов -сывороток крови, опухолевых и эмбризвалышх тканей с целью выявления наиболее богатого и доступного источника мезодермализунцего фактора. Следующий этап заключался в разработка метолики выделения мезодермализугацего фактора из амниошчоской жидкости коровы (оказавшейся более богатой но содержанию мззодереализующего фактора, чем другие проанализированные скани) и получении его в количествах достаточных для определения N-тонцевоЙ аминокислотной последовательности и характеризации этого бэлка.

Научная новизна и практическая ценность работы. D результате проделанной работы показано,чго экстракта некоторых он/холеных тканой (маланомк.рака тела матки человека), сывороток кропи новорожденных телят,северных оленей,а также амниотической кидкости коровы способны индуцировать образование мезодермы у зародышей Xenopua laevls. Для амниотической жидкости, как наиболее богатело и доступного источника, разработана методика выделения и очистки мззодермализунцего фактора. Получек частичноочищенный препарат мэзодермализующего фактора с 'высокой биологической активностью. Предложен метод определения молекулярной массы нативного болкл с одновременным тестированием биологической активности ii

показано,что молекулярная масса мезодермализумцего фактора равна 25 кДа. Определена последовательность двадцати Н-сонцевых аминокислотных остатков мезодермализ.ующего фактора. Наоведоно компьютерное сравнение полученной аминокгслотиой

последовательности с последовательностями оанкэ первичных зтруктур известных белков и. обнаружено, что она идентично соответствующей последовательности актитша А. Таким образом, а ¡показана новпв важная биологическая Функция активина А, б(обнаружен и выделен новый мезо,нормализующий фактор, действующий, возможно, in (Ivo.

Объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения , Обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части и списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАШЕ РАБО'ГЫ

I. Анализ некоторых тканей на содержание мезодзрмализующего фактора и выбор источника для его выделения.

Для выявления тканей, содержащих мезодермализущнй фактор и подходящих для его выделения, были получены экстракты гародышей . Xenopua Jaevia (на стадии оплодотворенной яйцеклетки),кекоторцх опухолевых тканей (мэлвнокы, рака тала натки человека), сывороток крови новорожденных телят,северных олзнвй и человека,а также околоплодных кидкостей коровы (Е?яш0тич9сксй и алантоисной). Эти ткани были выбраны нами на основании результатов экспериментов с эксплантатами тканей зпшотиых.проведвншх в лаборатории О.А.Хоперской (ИОГен АН СССР), которые показали, что некоторые из, тканей при инкубации с изолированными участками эктодорт.гц ранней гострулы Xenopus laevis (являющейся основной тест-системой в данной работе) способны индуцировать образование мезодергальных тканей из этих тотипотентных клеток. Экстракты зародышей Xenopus laevis (на стадии оплодотворенной яйцеклетки) и опухолевык тканей были получены с помощью методики кислотно-этаиольнсй экстракции, разработанной для трансформирущх факторов роста; сыворотки'крови экстрагировали с помощью модифицированной наш! методики кислотно-этанольной экстракции; околоплодные жидкости экстрагировали с помощью 0.5М уксусной кислоты с последующей сорбцией на катконооСмэншпс. Полученные экстракты существенно различались между собой по способности индуцировать мезодерму (табл.1), однако, следует отметить, что наблюдаемая активность экстрактов .по-видимому, не являатся отражением истинного содержания в них мезодерлализупцего фактора, поскольку экстракта получены различными способами и, следовательно, выходы биологически активного фактора могут различаться в каждом случае; некоторые экстракты, возможно, содержат вещества ингибируицие биологическую активность мезодермализущего фактора, что также приводит к различиям в наблюдаемой активности. Поэтому экотрактн, обладающие слабой мэзодермализупцвй активностью были дополнительно фракционированы с помощью ионообменной хроматографии (акниоткческоя и алантоисная жидкости) и гель-фичьтрации (экстракты сывороток) с целью отделения мозодермалнзукщего фактора

от присутствутш, возможно, ингибиторов.

Таблица I. Мезодермалкзуюцзя способность экстрактов некоторых тканей

ткань мезодермализупцая активность

мэлвнома человека 6-10 ед/г

опухоль тела матки человека 3-10 ед/г сыворотке крови новорожденных

толят 3-5 ед/мл

сыворотка крови человека 1-3 ед/мл

сыворотка крови саперных оленой 3-6 ед/мл

вмниотическая жидкость коровы 10-20 ед/мл

алантоисняя жидкость коровы _ 1-2 вд/л

зараДиши Xenopus leevln 10-15 ед/г

*препарату приписывается I ед.активности, если он вызывает минимальную наблюдаемую индукцию, будучи растворенным в I мл инкубационной срада.

Гель-фильтрация в 1М уксусной кислоте на Toyopearl HV» 55F приводила к значительному повышению активности экстрактов сыворотокГ, которая соответствовала Фракциям белков с Мг 20000-30000 и £>0000-70000( Рис.1). Ионообменная хроматографии амниотичэской и алантоисной жидкостей не приводила к сколько-нибудь значительному /говшонию активности этих препаратов. Однако даже грубое фракционирование препарата 'из амниотичасксй жидкости с помощью ВЗНОС на обращенной фазе приводила к резкому повышению мезодермалйзуодей активности. Но ни ионообменная хроматография, ни гель-фильтрация или ВЭЖХ на обращенной фазе не позволили выявить присутствие мезодермэлизугацего фактора в алвнтоисной жидкости в сколько-нибудь значительных количествах.

Таким образом, анализ экстрактов описанных выше тканей гоказал, что экстракты зародышей Xenopus laevis (на стадии оплодотюрегшой яйцеклетки) и опухолевые ткани обладают хорошэй мезодерм^лизующей активностью, но они нэ могут служить источником для препаративного

07* 13Х

I > I

0. 1

В7Х 43Х 13Х

I ) I

ю аэ ад ]

10 20 ЗОИ

о. Б 1 Д

<2Ва

67Х «ЗК

I I I

0.11 А

67Х 43Х 13К

I I 1

Рис Л .Гель-фильтрация экстрактов некоторых, тканей на тойолбрл НИ 55 Г. а^экстракт опухоли тела матки'человека, б,)экстракт сыворотки новорожденных телят , б Экстракт мэланомы человека, г) шсстракт сыворотки северных оленей. Стрелками обозначено положение белков-мяркаров молекулярной массы: бычьего сывороточного альбумина (67 к.Ца), яичного альбумина (43 кДа),цигохрома О (13 кДа). Горизонтальной чертой обозначены активнш фракции.

Еыдвлешя мазодермализующвго фактора с целью его структурной хэрактеризации из-за невозможности получения больших количеств исходного материала. Сыворотки крови новорожденных телят,северных оленей и человека доступны в больших количествах и обладают хорошей мвзодермализупдей активностью, однако их удельная активность (на мг Салка) очень мала. Наиболее реальным источником могат служить лишь амниотическая жидкость коровы, доступная в препаративных количествах и одлвдатвя наиболее высокой удельной активностью.

О

2. Разработка методики и выделение мезодермализунцего фактора 1'з амниотичеекой жидкости коровы.

2.1 Предварительная обработка и ионообменная хроматография

Натмная омниотическая жидкость 'содержит мукополиеахяриды и другие вещества, придающие ей высокую вязкость, что делает невозможным еб фракционирование с гомощь» хроматографии без предварительной обработки. Поэтому амниотическую жидкость предварительно гомогенизировали в различных экстрагирующих растворах {50 мМ эц9тат аммония,рН 7 или 4.5, содержащий 2М мочевины ; О.Ште.5Ы или 1М уксусная кислота),из которых наилучшим оказался 0.5М раствор уксусной кислоты (он и был использован в дальнейшем). Затеи гомагенат разбавляли в 10 раз 50 мМ раствором ацетата аммония,рН 6.8 и полученную суспензию адсорбировали на СМ-целлылазу и элшровали иезодермэлизующий фактор 1М раствором ацетата аммония (градиентное элвиропание не позволяло излучить хороша го фракционирования и приводило лишь к "размззчванив" мезодерыаяизухщеЯ активности по фракциям). Нативная амниотяческая жидкость обладает достаточно слабой мезодермализущей активностью, однако ,еа обработка О.БЫ раствором уксусной кислоты с послэдутеей сорбцией на СИ-целлюлозу и элшровашем 1М раствором ацетата аммония позволяла несколько повысить ее тотальную мазодераализупцую способность. Препарат со значительно боя'зе высокой тотальной активностью удавалось получить лмпь поело фракционирования элюата с СМ52 -на птдроксилэпатите (см.гоше). Такую низкую исходную активность моено объяснить присутствием вешвств, ингибирующих мс-зодер/альнув индукцию. В пользу этого

объяснения свидетельствуют следующие дагеше: а) если объединить разделенные на гидрсксилапатите фракции,то тотальная мззодврмализупцая активность полученного препврата снизится до исходного низкого уровня. б)гель-фильтрация алюата с СМ-цэллюлозы в 0.2М растворе ацетата аммония,рН 7.2 не приводит к сколько-нибудь значительному повышению суммарной активности.

к а в а а Я • * а * а

Рис.2 Ионообменная хроматография грубого препарата

мезодермализующего фактора из амниотической жидкости на колонка

СМ-ТБК 25?) (7.5шт х 150тт).

Буфер А: 50 мМ раствор ацетата аммония, рН 6.8

Буфер В: 0.6 М раствор ацетата аммония, рН 7.2

-поглощение при 280 ж

---- профиль градиента концентрации ацетат аммония

§ - мезодермализующая активность франции

-s-

Повторная ионообменная хроматография обессоленного препарата с СМ-целлюлозы на колонке СМ-ТБК 25Н позволяла улучшить фракционирование (Рис.2), но не позволяла повысить тотальную активность препарата и,к тому же, приводила к значительным потерял! - мезодермализующая активность получаемого препарата составляла лишь 50-60% тотальной активности наносимого препарата (что выявлено путем параллельного фракционирования исходного препарата и препарата после ионнообмзнной хроматографии с помощью ЮЖХ на обращенной фазг с последующим тестированием биологической активности). Поэтому ионообменная хроматография била исключена из схемы выделения как возможная первая стадия.

о.з2 00»

А И

О

о

4 о

5

ю _ _________

~' 20

М фракшли

Рис.3 Хроматография на биогелэ Ш'Р грубого препарата мезодермялизувдего фактора. -- поглощение на 280 им

-----концентрация фосфата натрия в элкгруитгм буфере

jg - мезодермализующая активность фракции

2.2 Хроматография на гидроксилапатите.

Хроматография на гидроксилапатите дает возможность наносить относительно большие количества белка и достигать сравнимого о ионообменной хроматографией фракционирования, позволяя получать при этом с хорошим выходом препарат с высокой тотальной активностью. При хроматографии на гидроксилапатите белки с мезодермализ'ующей активностью элюировались в диапазона О.)-0.15 М фосфата натрия (РЙС.З). Суммарная активность препарата значительно возрастала после этой стадии (см.таблицу 2).

2.3 ВЭЖХ на обращенной фазе в система вода/триметиламш/трифторунсусная кислота/ ацвтонитрил/н-пропвнол.

Активные фракции (N11-14) , полученные на прададущей стадии объединяли и подвергали ВЗЖХ на •обращенной фазе в системе вода/триметиламин/трифторуксусная кислота/ ацатонитрил/н-пропвнол (РЙС.4). В этой системе удавалось отделить мезодермализупций фактор от основных балластных белков. Фракции,содержащие мезодермализунций фактор, элюировались в диапазоне 51.8-52.1% буфера В. Их лиофилизовали и растворяли в 0.2М растворе ацетата аммония, содержащем 4М гуанидин-хлорида и очищали далее с помощью высокоэффективной гель-фильтрации.

2.4 Высокоэффективная гель-фильтрация.

Высокоэффективную . гель-фильтрацию проводили на колонках ТЗХгоооЭУУ и ТЭКЗОООБИ, объединенных в тандем. Как видно цз хроматограф,щ (РИС.5) мезодермализующую активность проявляли две фракции белков с Мг примерно 65 кБа (фракция I) и 20-30 к})э (фракция 2), причем тотальная активность фракции 2 всегда была выше активности фракции I. Появление на хроматогрзмме второго пика активности (соответствующего фракции I) объясняется .видима, агрегацией мезодермализуицего фактора с другим белком (или белками), поскольку при рехроматографии в тех же условиях фрзкции I наблюдаются опять два пика активности,соответствующие! фракциям 2 и I, при этом активность фракции 2 выше, чем фракции I. Францию 2 использовали для дальнейшей очистки мезодермализуицего фактора с

помсвдью ВЭЖХ на обращенной фазе.

%В

Рис.4 ВЭЖХ на обращенной фаза на колонке Ultrapore RPSC пкгквтх фракций с биогэля ИГР.

Буфер А: 0.1% трифторуксус.ная кислота,титрованная, до рН 3.5 тримэтиламшом

Еуфер Б: 10% буфера А/45% ацетонитрила/45$ к-нропанола

-поглощение на Z'¿8 км

---- концентрация буфера В

g- - мэзодормалкзуицяя активность фракции

2.5 ВЭЖХ на обращенной фазе в системе вода/трифтор.\ксуспая кислота/ацетоштрил.

ВЭЖХ на обращенной фазе проводили на ¡солонке U1 trapo re Pí'SC (которая была использована в первой хроматографии на обращенной

-а-

002гз

67К43К 13К

Л н и о

0.05

ч о

ш

100

50

О

10 20 м фрикции

Рис.5 Высокоэффективная эксклюзионная хроматография на колонках ТБК20С>08У?-ТЗКЗО(ЮЗИ,объединненых з тандем, частичноочкщенного препарата мезодерма.тазугацвго фактора. Элшруюь;ий буфер - 0.2М раствор ацетата аммония. рН 7.О. —— поглощение на 228 нм

о .

§ - мезодермализукхцая активность фракции. Стилками обозначеш положения белков-маркеров молекулярной массы:бычьего сывороточного альбумина (67К), яичного альбумина(43К), цитохрома С(13К)

фазе,см.вишь) в системе вода/трифторуксусная кислота/ацэтонитрил. Мезодермплизуигций фактор в этих условиях элшровэлся при 50.8-Ы% буфера В.(,ГИС.6). Интересно, что при хроматографии в ятих же условия? Фракции I с гель-фильтрации (см.вышо)наОлюдался один пик активности , время выхода которого совпадало с таковым Франции 2. Таким образом, можно заключить, что за мезодермализумцую

активдасть обеих фракций, полученных в результате гель-фгльтрацни ответственен,по-видимому,один и тот же белок. ' Полученный с помощью описанной выше методики частичноочшдешшй препарат мезодермализующего фактора с высокой биологической активностью использовали • для дальнейшей характеризации,

Рис.6 ВЭЖХ на йбращенной фазе на колонке иш-ароге НРБи активных

фракций с эксклюаионной хроматографии.

Буфер А: 0.05Й раствор трифторуксусной кислоты

Буфер Б: 0.05% раствор трифторуксусной кислоты/ацетонитрил

-- поглощение на 228 нм

----- концентрация буфера В

Щ - мезодермализующая активность фракции мезодермализущего фактора.

Описанная процедура выделения, кажется нам оптимальной по

-га-

следующим причинам: во-первых, содержание мезодормалнзуюпего фактора в амниотической жидкости очень мало, в связи с чем мы стремились получить максимальные выходы на какдой стадии и использовали хроматографические методы, для которых характерны высокие выходы биологически активного болка. По этой же причине для каждого последующего шага очистки мы брали фракции, соответствующие не только "середине" пика активности, но его "плечам". Во-вторых, мы старались добиться максимально возможного разрешения на каждой стадии, используя в основном ВЭЯОС. В-третьих, с целью избежания потерь белка и падения активности мы пытались избежать процедур дополнительной обработки препарата между последовательными стадиями (таких квк диализ, обессоливание, лиофилизацяя и т'.п.), выбрав указанную очередность этапов. В-четвертых, после каждой стадии фракционирования требовалось определять мезодормализугацуго активность во фракциях, в связи с чем мы стремились использовать растворы йа основе летучих соединений.

Таблица 2. Выделение мезодермализуювдго фактора из П л амниотической жидкости*

стадия содержание активность 'удельная степень %

очистки белка(мг) препарата(ед) активность (р,уПг) очистки выхода

хроматография на СМ52 108 41 0.026 - -

хроматогра|{жя на биогеле }ГГР 18 345 19.2 - ■ 100

оф ВЭЖХ-1 1.2 320 266.8 » ' 10261 93

высокоэффектив-

ная гель-филь- 0.24 292 1217 46795 84.6

трация

оф ВЭЖХ-2 0.003 277 92400 3553846 60.3

^Поскольку тотальная активность препарата увеличивалась почти в 10 раз после хроматографии на биогеле НТР, значения % выхода подсчитывали, начиная лишь со стадам офВЭЖХ-1.

- Щ '

З.Характеризация мезодармализущего футора.

3.1 Сравнение свойств мезодермализукщега фактора и фактора роста фибробластов

Из литературы было известно (Slack, и др., 1987), что фактор роста фибробластов - белок с молекулярной массой 16-19 кДа -способен вызывать мезодермальную индукцию In vitra в аналогичном используемому нами теста. Основываясь на характерных для фактора роста фибробластов свойстве связываться о гепарин-сефэрозой с высоким сродством мы провели хроматографию на атом носителе частично очищенного препарата мезодермализунцэго фактора. В условиях, в которых фактор роста фибробластов сорбируется нв гепарин-сефарозу (50мМ Na-фосфатшй буфер,содержащий 0.95U Had), выделяемый цами мезодермализущий фактор не связывался с носителем. Таким образом, мезодермальная индукция вызываемая полученным из амшотической жидкости препаратом не определялась, фактором роста фибробластов. В пользу втого свидетельствуют также другие характеристики препарата мазодермализущего фактора (см.ниже).

8.2 Определение относительной молекулярной массы мезодермализующего фактора

I

Для определения относительной молекулярной массы биологически активного мезодермализукщего фактора был использован электрофорез В'полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Одни пятая часть препатата , полученного из Б л амниотической лмдкости в результате описанной выше процедуры выделения/ была подвергнута электрофорезу в полиакриламидном геле ь присутствии F.D5 баз -восстановления дисульфидах связей (обработка дитиотреитолом или р-моркаитозтанолом приводила к исчезновению мезодермализущей активности). После, электрофореза белки переносили на мембрану Iranobllon FVDF (Millipore) с помощью электроблоттинга. Одну из дорожек окрашивали кумасси R-250 , другую разрезали на полоски шириной 2 мм, с которых элюировали белки для анализа биолохической активности.

Тавлица 3 Зависимость выхода элюируемых белков* от концентрации ацетонитрила и рН элшрущего раствора

элюирущий буфор концентрация рН выход{%)

ацетонитрила (%)

0.1% трифторуксусная

кислота:0.5 мг/мл бычьего 25 2.1 85

сывороточного альбумина:

ацетонитрил

50 мМ раствор ацетата

аммония:0.5 мг/мл бычьего 25 6.2 30

сывороточного альбумина:

ацетонитрил

0.1М раствор бикарбоната аммония:0.5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина: ацетонитрил

25

8.5

0.1М раствор бикарбоната аммония:0.5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина: ацетонитрил

10

8.5

20

0.1М раствор бикарбоната аммония:О.5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина: ацетонитрил

40

8.5

90

'использовали радиоактивномечэнные бычий сывороточный альбумин и цитохром С

3.2.1 Подбор системы растворителей для^элшрования белков с мембраны 1гажоЫ1оп РУМ?

Описанные в литература растворы для влвирования с мембраны ТштоЬПоп содержат детергенты или трифторуксусную кислоту в високсй концентрации, поотому требуется дополнительная обработка алюатдв перед биологическим тестированием, что приводит в некоторые случаях к потерям белка и понижении активности. Поэтому нами был подобран буферный раствор, позволяющий использовать злюаты с мембраны 1пюоЬ11оп для тестирования баз дополнительной ибработки. Р^о состав: 25% ацетонитрила в 0.1М растворе бикарбоната аммония (рН 8.0), 0.5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Мокно использовать также буферные растворы с кислым рН (например 0.1* раствор трифторуксусной кислоты, рН 2.1), ,ло на со значениями рН близкими к нейтральному, поскольку это приводит к значительному снижению выхода элюируетх белков(см.табл.З).

3.2.2 Определение относительной молекулярной массы и биологические свойства мезодермалкзуицаго фактора

Полученные с помощью данной влюирующей системы элюаты проанализировали на мэзодермадкзующую активность и обнаружили, что она соответствует белку с Нг 25000 (РИС 7). Выход по активности составил прибл. 40Х (квзодермализукщая активность препарата взятого для электрофореза - 100Х). Неразведанный элюат с полоски мембраны, соответствующей белкам с Мг 25000 вызывал образование хорда и мышц (являющихся характерными мазодермалышми производными, которые появляются в результате сильного индукционного воздействия), а при разведенки в 10 раз - мезотолий И мезенхиму (появляющуюся в ответ па слабое индукционное воздействие).

Определение Н-ронцвьой аминокислотной посдедовотелыюсти мозодермалийущэго фактора

Для онродэлекия 11-конце вой аминокислотной последовательности брали частично' очщонный препарат мезодермализущего фактора, ода

67К: 43К-30К-

20.1 К-

14.4К-

41

Биологическая активнооть(вд.)

в

г 50 . 40

- 30

20 А

то

10 20 30 40 50

N полоски

Рис.7 Элзктрофирэз в полиакрнлзмидном голе с последующим переносом на мембрану ]гиоМ1оп и анализом мозодермализующей активности элюированних фракций (ем.текст).

Стрелками указаны положения балков маркеров-молекулярной мпссы: бычьего сывороточного альбумина (67К), яичного альбумина (4;<к), кэрбоангилрязк (ЗОК). ингибитора трипсина из соэбнх бобов (20.Ш),

о

а-лактальбумина (I1 Ж).Шкала соответствует положению виренашшх полосок.г? - мезодермэлизующая активность фракции.

пятая часть которого Сипа использована для оггрпдзлания молекулярной массы мезодормализукцого фактора путем элюирования с мембраны 1гятоМ1сп (см. выше). Препарат, содержащий 200 ед.активности (I единица активности соответствует оликяоте, вызывающей наименьшую наблюдаемую индукции) • подвергали электрофорезу в ¡1ААГ в невосстанавлиоаюишх условиях и пепоносили

на мембрану из стекловолокна GLasoybond(JUometra). В области мо л. масс 20-30 кДа присутствовала единственная полоса, соответствующая Салку с Мг 2Б000 (FHC.^t). О помощью газофазного саквенатора определена последовательность 20 N-концевых аминокислотных остатков этого балка. Сравнение ■ полученной аминокислотной последовательности с последовательностями банка первичных структур известных белков выявило eS идентичность соответствующей последовательности Рд-цепи ингибина и актившт, белкоа, которые во взрослом организма регулируют процесс высвобождения фэдлюсулостимулирующего гормона клетками гипофиза (ингибин тормозит этот процесс активин,напротив,стимулирует секрецию).

I 10 20

ываодврмализуиций фактор G-L-E-X-B-G-K-V-N-I-X-X-K-K-Q-F-F-V-S-F-Рд-цепь ингибина G-L-E-G-D-G-K-V-N-I-C-C-K-K-C)-r-F-V-S-F-

Молекулярная масса меаодэрмализуодого фактора равна 25СЮ0, что соответствует димару из двух р-субъэдшшц (димэр из двух р-цэпей имэ^т молекулярную массу 25 кДа и известен как активин ¿.Исходя из этого и учитывая определенную наш К-концэвую аминокислотную последовательность мы заключили, что мезодермализуидий фактор, вероятно, идентичен активину А.

OiipefleJieimo К-концобой аминокислотной последовательности было проведено на 10-20 пмолях белка (оценено по выходу ФГГ-производшх и интенсивности окраски полосы балка на мембрана Glass,ybond с помощью кумасси R-25Q),полученного в результате электрофореза в ПААГ высокоочмцвнного препарата мезодерма лизунце го фактора. Суммарная ■ мезодэрмализующая активность препарата использованного для анализа N-концзвой ашшокислотной последовательности составляла 200 вд*. Учитывая,что Б-8 од мэзодермализукцего фактора шдуцирувт образование' хорда, можно подсчитать, что фактор вызывает образование хорда в концентрации 0.3-1 пкмоль/нл. Эта согласуется с данными, полученными для других мазодермализуицих факторов. Так, •XTC-MIF ( препарат культуральной среды клеток Xenopua laevie линии ЕГО) индуцирует хорду в концентрации 0.4-1 пкмоль/мл (Smith et al 1988),а трансформирующий фактор роста типа р2 в концентрации 3-12 нг/мл (0.1-0.Б пкмоль/мл) индуцирует