Выделение и свойства цитоплазматического рецептора гиббереллина из семяпочек хлопчатника тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Ч У и 3 «и

,11 ■ *

АКАДЕМИЯ НАУК УЗБЕКСКОЙ ССР ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОП ЛИЛ1ИИ имени АКАДЕМИКА Л. С. САДЫКОВА

На правах рукописи

АБИДОВА Мазлума Халиловна

УДК 577.112.083:543.54:577.171.6

ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕЦЕПТОРА ГИББЕРЕЛЛИНА ИЗ СЕМЯПОЧЕК ХЛОПЧАТНИКА

02.00.10—Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Ташкент —1991

Работа выполнена в Институте биоорганической химии имени академика А. С. Садыкова АН УзССР

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Абдукаримов А. А. кандидат химических наук Мавланов Г. Т. Официальные оппоненты: доктор химических наук

Садыков А. А. доктор биологических наук Юнусханов Ш. Ю.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. М. М. Шемякина АН СССР

о г- 5/

Защита состоится « ■У » О^ ^'у1г. д

часов на заседании специализированного совета Д 015.21.01 Института биоорганической химии им. акад. А. С. Садыкова АН УзССР, по адресу: 700143, проспект М. Горького, 83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. А. С. Садыкова АН УзССР.

Автореферат разослан «__> ёС^ уЦ)^^ Ш91 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

Л^,^/ С. И. МУХАМЕДХАНОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

О

' Актуальность проблеш. Быстрое развитие генетической инженерии растешь! диктует необходимость развития исследовашй! по разработке способов выявления и выделения генов, обуславливающих хозяйственно ценные признаки технических культур. Фитогормонам растений принадлежит ключевая роль в реализации генетической информации, ответственной за закономерную последовательность' морФо-физиолопиеских процессов в ходе онтогенеза. Они могут бить рассмотрен« как инструмент для специфической индукции генных последовательностей, находящиеся под контролем данного фитогормопа. Гибберзллнш, представляйте, собой наиболее обширную группу фито-гормснов, действуют на многие ¡кизнанно ванные процессы цветковых растений, такие как стимуляция роста, цветение, индукция нартепо-карпии, выраженность пола и др. Известно, что у хлопчатника основной хозяйственно ценный признак,каковым является синтез и технологические качества волокна, контролируется, главным образом, гибСереллином. Поогому, выяснение механизма действия гиОберол-линов представляет собой ценную информацию для генетики, селекции, генетической инженерии и биотехнологии хлопчатника.

Согласно современным представлениям, физиологическое действие гиббереллинов и других фитогормонов происходит посредством образования гормон-роцепторного комплекса, вызывающего начало тех изменений, которые в конечном итоге определяют гормональный :-ффект. Однако, выделение гомогеншшх рецепторов гибберэллина, удовлетворяющих все критерии оценки, неизвестны. Разработка способов выделения и счистки рецепторов гиббереллина современными методами хроматографии, учитывая лабильность строения этого фито-гормона (лиганда), представляет особый интерес.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выделение гомогенного рецептора гиббереллина из семяпочек хлопчатника, отвечающего критериям оценки рецептора фитогормона. В соответствии с этил были поставлены следующие задачи:

1. Разработать способ выделения и очистки рецептора гиббэ-реллинз с применением современных методов хроматографии.

2. Изучить физико-химические свойства выделенного рецептора и характеристики его взаимодействия с гормоном.

3. С помощью общэпр;:нятнх биологических тест-систем, изучить

соответствие выделенного бежа с критериями оценки рецепторов фи-тогормо,,п.и - ■

4. Изучить осоОешюсти физиологических действий и возможные биологические функции гиббереллин-рецепторного комплекса на хлопчатник.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведения настоящей работы, впервые наделен и очищен до гомогенного состояния гиббереллкневязывающий белок из семяпочек хлопчатника, отвечающий критериям оценки рецепторов фитогормонов. Разра-• боташшй метод позволяет эффективно отделять ферменти и другие Солки обмена гиООореллина от рецептора. Проведено детальное изучение основшх физико-химических свойств: молекулярная масса, изоэлектричоская точка, концевие остатки для двух полипептидных цепей, аминокислотный и углеводный состав. Изучены характеристики взаимодействия выделенного белка с гиСбереллином и с ДНК.

Получена антисыворотка к рецептору ГА3 и показано, что рецептор является цитоплазматическим белком, способшм в комплексе с гормоном связываться с ДНК.

Результаты углубляют представление о молекулярном механизме действия гиббереллина.

Полученные результаты представляют практический интерес, поскольку:

-принципы разработанного метода, позволяющие разделить гор-монсвязыванцие белки от рецептора, могут быть полезны для выделения рецепторов фитогормонов, обуславливающих их генетические эффекты.

-рецептор может найти применение для обнаружения и выделения генов, чувствительных к индукции комплексом гиббереллин-рецептор.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на симпозиуме СССР-ФРГ "Структура и функции клетки", Ленинград, 16-19 мая, 1985 г.; на Всесоюзном . сЬщозиуме "Химия белков", Тбилиси, 21-26 мая, 1990 г.; на первой республиканской конференции молодых ученых "Теоретические и прикладные аспекты генетики и селекции животных, растений и ' микроорганизмов", Ташкент, 19-21 июня, 1990 г.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликованы пять работ.

Структура и объеи работы. Диссертация изложена на 119 страницах мапинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсукд&ння, экспериментальной части и выводов. Работа содержит 20 рисунков и 10 таблиц. Список использованной литературы состоит из 186 ¡шмэнований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ

Семяпочки, листья и другие органы хлопчатника для видел&нпн рецептора гиббереллина собраны на экспериментальных базах лаборатории частной генетики хлопчатника биологического факультета, ТашГУ им.В.И.Ленина и ЕКГЛССХ им.Г.С.Зайцева CAO ВАСХНИЛ. Сроки сбора биологического материала" указаны в конкретных случаях. Каллусные клетки и протопласты получены совместно с ГригиноЯ К.Н.

Все эксперименты по выделению'и характеристике рецепторного белка провэдеш (если иначе не указано) при температура 4-6°С.

Неорганические соли применяли с категорией чистоты х.ч. или о.с.ч., реактивы другой категории чистоты предварительно очищали обцепринятами способами. Дистиллированную воду для экспериментов по ионообменной хроматографа и электрофореза подвергал! деиониза-щш с помощью ионообмс-шсжов Elga (Англия).

Гибб&реллин-сефарозу, для аффинной хроматографа!, получали иммобилизацией гибб&реллсвой кислоты (ГА3) Serra (ФРГ) к эпокси-активированной сефарозе 4В Pharmacia (Швеция) по шструкциям фирмы, или к брокциан-сэфзрозе с предварительным получением диамино-пхсил производного с помощью карбодиимида. ДНК-целлюлозу получали иммобилизацией вцсокополимэрной ДНК тимуса теленка Реахим, марка А, по методу Lltrcan (1968).

Аналитический и препаративный электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) с ДЦС-На, проводили в диск буферной системе Laemmll (1970), Изоэлектрофокусировку белков проводили в готовых пластинках ПААГ с амфолинами - 1KB 1804 Ampholine PAG plate, диапазон рН 3,5 - 9,5.

Кд комплекса рецептора с ГА3 определяли колоночной афГзшной хроматографией (фронтальный анализ) и аффинным электрофорезом в тонки: слоях ГА3-с?фгрозы.

Антиоиворотку к рецептору ГА3 получал» иммунизацией кролика электрофоретически гомогенным белком по общепринятой схеме. Им-мунофэрментный анализ рецептора проводили с помощью антивидового пероксидазного коиъюгата против IgG кролика, производства UTO "Инициатива" (г.Щелково, Московской области).

Количественное опроделеште белка проводили rio методу Lowry и др. (1951 ) или Spector (1978).

Аминокислотный состав рецептора гиббереллина определяли ВЗНОС с предварительным получением фенилтиокарОамоильшх производных аминокислот в кислотном гидролизате (хроматограф Du Pont 8800 LKB, Швеция, колонка Nucleosll 50-18, интегратор - Hewlett рас-kard 8700). Аминокислотный анализ проведен совместно с к.х.н. Сагдиевыы Н.Ж. N-концевой остаток рецептора определяли дансильным методом Gray (1972). Состав углеводов рецептора определяли ТСХ, количественное содержание - фенол-сернскислотным методом.

Определение радиоактивных изотопов проводили на сцинцилля-ционном счетчике Бота I, в сцинщшшционной смеси Брея. В работе использованы радиоактивные аналоги гиббереллина, нуклеотидов, аминокислот, глюкозы, меченые по 3Н, 14С, 35S и ^Р, удельная радиоактивность и производитель указаны для конкретного эксперимента.

Ядра для экспериментов по синтезу РНК выделяли из проростков и каллусной ткани хлопчатника.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ '

Выделение и очистка гиббереллинсвязываодего белка с рецэптор-1шш свойствам! из сешшочек хлопчатника. Выделение гиббереллин-связывающих белков проводили традиционным способом - аффинной хроматографей на сорбенте, полученной путем иммобилизации фито-гормона на инертном.носителе. В качестве лиганда, для выделения гиббереллинсвязывавдих балков, выбрали гибберелловую кислоту (2,4а,7-тригидрокси-1-мотил-а-метилен-гибб-3 ен-1, Ю-да- карбоксильная кислота 1-»4а лактон)-ГАд. Выбор лиганда обусловлен тем, что в тканях хлопчатника наряду с другими (ГАр ГА4, ГА?, ГАд, ГАто), обнаружена также и гибберелловая кислота. С другой стороны

ГЛ3~ один из немногих гиббереллинов, функция которой наиболее исследована в растениях, в том числе у хлопчатника. Ми применяли два вида сорбента, полученные на основе ГАд. В первом, лиганд присоединен к аминогексилсефарозе с помощь» карбодиимида емидной связью, COOK- группы при С-7 с Ш2-группой матрицу; во втором - к эпоксисефарозе посредством гфостой эфирной связи,ОН-групп при G-3 или G-I3 с оксирановой группой матрицы. При аффинной хроматографии и далее в качестве первичного критерия биологической активности гиббераллинсвязыващей фракции пршшмали ее стимулирующее влияние на синтез РНК в присутствии ГАд. Профиль элюцш бвжов семяпочек на двух типах аффинных сорбентов (рис.1) и выход различных фракций практически но отличались. ПААГ-электрофорез гиб-береллинсвязываьщих белков показал наличие множества белков в каждой из фракций. Состав белков в злюатах двух типов сорбентов был неразличимым. При изучении влияния полученных фракций на синтез РНК изолированными ядрами оказалось, что только элюат, получешшй 0,6 М tJaCl в комплексе с ГА3, оказывает стимулирующее воздействие (табл.1). Следовательно, гиабереллинсвязывающий белок с рецепторными свойствам! находится в данной фракции. Наличие большого набора гормснсвязывамдих белков, вероятно с равными сродствами к иммобилизованной ГАд,свидетельствует о невозможности использования лиганд-аффинной хроматографии на этом сорбенте, для выдоления гомогенного рецептора.

Рлс.1. Афишная хроматография растворимых белков семяпочек хлопчатника на ГАо-сефарозе (1x10 см).

о 20 40 60 80

Объем элюиди, мл

Таблица I

ВЛИЯНИЕ ГСБ, ПОЛУЧЕННЫХ ХРОМАТОГРАФИЕЙ !{А ГАд-СЕФАРОЗЕ, НА СИНТЕЗ РШ{ ИЗОЛИРОВАННЫМИ ЯДРАМИ ПРОРОСТКОВ ХЛОПЧАТНИКА

Фракция + Ю"6М ГА3 Количество белка добавлешюго гз реакцию, мг Включение [3Н]ЦТФ имп/мин 100 мкг ДНК Включение [^ЩГФ в % к контролю

ВБА (контр.) 0,05 4000 1 250 100 ± 6

исходная 0,05 4400 ± 280 ПО - 7

злюат 0,1 М 0,05 4000 ± 400 100 ± 10

МаС1

элват 0,6 М 0,05 5600 - 200 140 - 5

НаС1 .

элюат 0,8 М 0,05 3600 * 280 90 - 7

НаС1 с 50%

этиленгликоля

Гибберелдинсвязывающая фракция белков (ГСБ), элюированная из ГАд-софарозы 0,6М КаС1, может бить использована для дальнейшего выделения из нее гомогенного рецептора с помощью различных методов хроматографии белков. Однако, многостадийные и длительше процедуры могут привести к потере функциональных свойств бежа. Поэтому, мы вели поиск альтернативных способов выделения рецептора гиббереллина.

Известно, что физиологические функции фитогормонов, в том числе гиббереллина, связаны с избирательным регулированием активности определенных генов. В этом механизм действия фитогормонов обнаруживает сходство со стероидными гормонами животных. По аналогии со стероидными гормонами можно ожидать, что фитогормон-рецепторный комплекс имеет сродство к ДНК. Для исследования возможности применения аффинной хроматографии на иммобилизованной ДНК, из гомогената семяпочек хлопчатника получили сумму кислых растворимых белков.-Затем эта сумма белков была подвергнута тан-демной аффинной хроматографии на двух колонках с ДНК-целлюлозой. С первой ДНК-целлюлозной колонкой (с емкостью связывания ДНК-связывамдих белков несколько большей, чем содержание этих белков в разделяемой смеси) связывались ДНК-связывающие белки(ДСБ), имеющие сродство к иммобилизованной ДНК независимо от наличия гиббе-

рэллила по Срвкцпи. Косвязага-ше с первой колонкой Солки наносилась во вторую положу, поело предварительного добавления гпббэ-рЬллгша' до концентрация 1СГ°М. Ток как п-рвая колонка ' тандема связивапз практически воз ДСБ,' во пторуп колонку сорбировалась Сракцил п5бб9рэлп5п1рапис|&ю - свлзивакхцаяся сЩ. ("ГЛ3-ДСБ"). ffirce .привядала схема выделения ГАд-ДСБ.

СЕгЙШЧЮ! Щ)ПЧЛИККЛ (I 10 ДНЕВШЕ)

. ji.rcMorómí33iy;n, добавление до

. ! Ш КаС1 и П Трптсп X 100 ¡г.Гельн^лльтрзцня, биогель А6 J3.Диализ СУ!,!!!Л БЕЛКОП {ЮсК^СЮ кДа)

¡ТЛсЗнооСмзннап хромзтографпя (ШШ-'сефадзкс А-СО) г.Диэлиз.-

ДСБ I (вцбр. ) —---|З.Д!К-изллилоза I

|4.Добзвло1шэ ГА3 до.ЮчЛ • . }5.ДНК-цэллвлоза II

1 .

ГДд-ДСБ ¡' '

Изучение состава болкоэ Фракции ГАд-ДСЗ EUT электрофорезом в присутствий ДДС-iîa показало, что.сид состоит из одного белка с иг 160 1СДЗ, , В рэдуциру)£!дих . условиях (в присутствия р-кор::аптоэтанола) расщепляется на два.пэидэптйчнше полпгоптидшх фрагмента с Пг 71 ± 1 а 73 ± з-'гфа. Изучснсэ влияния порченной фракща на спнтаз ИЙ нзолпровашл! ядрзггт .показало, 'что .эта фракция таю» спекулирует TpwcKpsàa&omiya окяшйость ядер. Выход Cernía из I кг сырой масса семяпочек составлял 0,53 кг, степень очистки, относительно' водорастйоригйй бэдгов гокогената свитю-чек.щмшрио 4 тыс.раз (тзбл.2).

{Гзазлогстряческзя точка еэдолзшкзго <5зл::п, опрздзл-зшшя путем изозлзктрофокуспроварйя в ШАГ, оказалась рапной рН 4,6 (рка.2).

При гель-фальтраЕПП! на сефадоксэ G-ÍSO, п условиям близких к 'фпзкояопмэским, ГА^-ДСБ элтарозался едапсхпвЕШгм сшгятрлчшгм щ ком, соответсгругарм молекулярной масле примерно IGO (рис.3).

Следовательно, этот белок в физиологических условиях не образует олигомэрныо формы.

Выделенный гомогенный гиббореллинзависимо ДНК-связывакпцй. балок способен стимулировать синтез РНК изолированным* ядрами хлопчатника. Поэтому; в дальнеГлаем был исследован на соответствие критериям рецепторов фитогор.ганов.

Таблица Z.

ВЫДЕЛЕНИЕ ГИББЕРШЕНЗАВШШО Ш-СВЯЗЫВАЩЕГО БЕЛКА 113 •

СШПОЧЕК' ХЛОПЧАТНИКА 5ПТШ : 1 ' ЕЕЛОК, ыг

Гомогенат из I кг семяпочек (центрифугах 100 тыс.х g) 2000 II пик из оиогеля А 6 600

Суммарные кислые белки,.элюат DEAE-сефадекса 220

Суммарная ДНК-связывавдая 15

Гиббареллинзависимо ДНК-связывающал • 0,53

1-у^А'

!

•

iiic.2.

Изоэлектрофокуснровка ГАд-ДСБ из семяпочек в Бй-ном ПЛАТ с амфо_л!1Тш.ш.

10 ЬО 50 70 90 воиер фронда

Рис.3. Гель-фильтрация ГА^-ДСБ (сефадекс G-200, 2,2 х 120 см), 20 'ммоль Трис-Н01, pFI 7,0 c '0,I4M NaCl,скорость элюции 15 мл/час, фракции по 10 мл.

Кзучекхз гецептсрпой прнроды глбберэллинзависино Л-К-связнвэ-г~зго Сая:з пз ссаялочэк хлопчатника. Обратимое и Еысокоаффннноэ связывание с гормоне:,1 считается одним из важных критериев рецепторов. Количественную характеристику сродства рецептора с гиббэ-рэллшюм проводили определением константы диссоциаций (К^) гер-ион-белкового комплекса колоночной аффинной хроматографией (фронтальный анализ). По данным фронтального анаяпа (рис.4.) К^ комплекса ГАг,-ДСБ с ^мобилизованной ГА3 была равна 1,1 х Ю-*1!'. Метод полезен тем, что позволяет определять К^ комплекса белка со свободным гиббврзллином, который сказался равным 0,85 х Ю~7М. _ _____ . _

ГА3в ге- Vi.

ле.ксМ KI

0 8,67

4,3 1,68

0,43 3,5

0,17 4,1

' 0,072 5,5

Рис.4.

гэ а ч^й w-mio»

Хроматография гиббервллшзависимо , ДНК-связыбзкздго белка (ГАд-ДСВ) семяпочек.хлопчатника па ГАд-сефзрозв. Колонка 0,4. х 12 см содержала 277 wer (0,8 х Ю""6;,!) ГАд. ГА3-ДСБ наносили в концентрации 60 мкг/мл, непрерывно. Скорость нааесения I мл/час, Т = 10 °С. а) Профиль эдошн« цифра указывают кокцвнтрг.цит) свободного гормона (iocr/мл). с) Рябискмосгь V^ от V -свободного гг-бборяллгна.

У у/ 10 где

I -ксшситрош:

Для подтверждения данных. Фронтального' анализу пршэняла аф£ишщй электрофорез в тонких слоях'-ГАз^е^арозн. Пуавдгл штода основан на умебкшш влоэтрофорэтичзскба белка Щ'

связывании с шгмобразозгшншл рандом - ГА3- Как л.з'Гпс.Б, значения ¡Ыилтесов' Г%ёС8' с ^^обадшзовадчи'. и своЬодннм глбйбрэлл'.шсм (1,9 7. Ю"4Й и 3-Х 10-%; соответственно) бглзкц к значении,!, определенным Путем Дентального анализа.

к «Ч • 0 0.1 0,5 1,0 3,0 в • -

о *

¥ .9. 1

О « 9 о 0 е •-■ -

. А ь. 8-' .Г ■ д ■ »

'• ■ л '

у*

' /

■4 - ' гал>Гр"7м

2,

. /

-I - • I К а Г^.хКГЧ!

в?-40 го о .

ГАдСаоаогл. 110"6 ц (1.КЦ '

' 0,0 2» '"

<4 ' 40

0,5 '46 ;

. .1,0 -.56

. 3,0 66

Рис.5.' 'Афрпапй электрофорез..ГАд-ДОВ в слоях' ГА3-сбфарозн. а-контроль -. (электрофорез,Ь слоях сефорозы 4В), б - е' па4о01Ш13ованная 'ГА3 ' 4хШ~4Н, содержите свободного гормона - кок.указано. Внизу - зашкЦюсть Дй от кон-' цектращш свободной гибборэлловоП кислоты в гелэ.

Виааприводэщша-.данные доказывай'!, -Что изменения лигаэда-ГАд, происходяйиэ при ^мобилизации - приводят ■ к сшшршш способности связываться, с. рецептором, - ыфаааадомус'я в увеличении Кй примерно_ в 1СС0 раз. Одаа из бозко'ЛШх причин резкого утплоиая сродства ГСБ к ш2.;об'ллпзозаш-юму гиббегроллда. в том,- что отрозт-.о ГЛ3 -с®&цпш сорс'оатов близко со страшен коньигатоп гяббзролхша,

образукгдася п растаяли как oípsnp'O гячяотэтроеппшо ¡Хори. СнЬчзтпо r;e пягаппая ГЛ3 - 1%-£СЗ' (0,Й5-3,0 i 10~7Щ глпя з

продолах гармйзхких да. гороя-роцэпгорпгх П5р.

1 Йек гдтексо? пз способа Еадэнетяга, Г.^-Д® а прпсутстггтя пл-бзроллтщэ образует cr -доупптевоЗ ДО йЪ^зтЪ кс»жопс.

оттродалоки lí, ко:.згз:«а 'Ш^-ЯСВ я Г>-33 х ЯЯЗ яйучапя т;п;у сйпгквашя ('шЛП8 {тго^пепт^л г^-тфйа^ягяэЗ, шлсйул-фкп касса ICO кДа> в коорд^пют Сгм-гчарда (р-с.б). Оказалось, что bg-ДСЗ связаваэтся с язь а ррдаутсювга ГДд-» Kd ксмялокса 0,4. к 10"%,

Рлс.6. связнбшпш ГАд-ДСЗ с С^ЗЛНИ а присутствии п:бйорблл:гла. . Концеитрецнл ГЛд 10-5М, . Лбсцзссй- связанная ДНК, . саль; ордината- свззан-иая/сбободиая х IQ_Z,

' Критерием биологической ахтпшости рецептора. гпОСорэлдана, крет«''приЕэдощшх O'BÉ'jo-zcanecKiix- . комплекса с гормоном, сродс»'30 горг.сн-редзптораого'лс.ялд^са к'ДНК), является вггянеше физиологических СукхцтЛ- ааогст под всздзПетвпСМ пйСоролл-ш- бел-козого кадалоксз.' Эти иэгеюззя, которые да-гаш бить характерны для гиббореллияа и ткапа-ик?юия, явл^тся следствием' спэци^ячес-кого отьота клетки (сргалоидо). Согласно лт?вретурякц даняшл, иисгао &|фэгсго гяселрэллша обусловлэнп его вгазгла шетяв-ИОСТЬ груши геиез. Сй1г.ру:::еш'9 рецептора гибборэлггяа по стшу-лчру:г,о:;у до5ста ГЛз^кювого жлгсовоа упсгталосъ cazo.

Бок-о no.t'pottio з.-;т.'Ьо Г/,Э-ДС13 яа траяокр'.етдопг/п актязпость шоларог&птге пдор, сиецзСтшосгь »того с.'^окта по отиошеш»» и

источнику ядер и к фатогормонем изучает на ядрах из проростков хлопчатника и фасоли. Дляпзучония спэцг^лчпостл рецептора к ГА3 в активном гормон-беляовои комплексе, .габОзрзлллн зстадпли ауксинами, которые) текже являются стшуляторг.'Д! транскрипционной активности ядер.Результаты приведена б таОл.З.

Таблица 3.

спщиданость сгймштщго .s&skía йШБЕРтпг-РЕЦЕЛТйиюго

КШПЛЕКОА НА ТРАНСКРИЩЮШУЮ АКТИВНОСТЬ ЯДЕР Ш РАЗНЫХ РАСТЕНИЯ

Источник ядер

Проростки хлопчатника

Еатглапт опыта

контроль ГАд-ДСВ ГА3-ДСБ ГА3-ДСВ

+ +

ГА0-ДСВ +

ГАд*

МУК

НУН

Проростки фасоли

ГАд ИУК НУН

AHÍTD 0,0{ МКГ/МЛ ГАд-ДСВ + ГАд + AktD контроль ГАд-ДСВ ГАд-ДСВ + ГАд ГА~

Включение t3HlIÍI®,B РНК

Шп/мйнДОО ÍW ДНН|в % к контр.

4000+- 200 100 5

4200 ± ZOO 105 ¿ 5 .

5800 - 400 ■ 140 ± 10

4200 ± 250. 105 ± В

4300 í 300 107 i 7

4300 i 300 107 - 7

4300 ¿ 300 107 i 7-

4300 i 250 107 i 6

2400 ¿ 300. 60 ± 5-

2500 * 300 63 - 7,5

2200 - 200' ■ íOO - 9

2300 í 250 IÓ4 -+H

2300 i' 250 104 ±. 21

. 2400 * 200 ' 109 -+9

* ГА.-ДСБ в реакционной смеси - i шг; все гормоны ш ! мкмоль.

Как видно из табл.3, ГА3-ДСБ в комплексе с гиббереллином стимулирует транскрипционную, активность только ядер из проростков хлопчатника (140%). Указанный аффект не проявлялся при замена-ГА3 на ауксины, к снимался ингибитором транскрйпции- ахтиномицином В.

Из опытов по синтезу РНК изолированными ядрами, без идентификации транскрилтов, невозможно определить .какая группа генов находится под контролем гиббереллкн-рэцепторшго комплекса. В литературе описаны наиболее ранние эффекты гиббароляшт, такие как индукция фэруенгов. Например в клэтаах алейронового слоя некоторые ферменты индуцируются ужо через 1 час после воздействия гор-

нона. Для определения подобных aîjeKToa.isi кзучаст спятаз белков прртоштсКагя цз проростков жлоЩапта под воздвЗстгле« габбэ-рэлягга-рзцэпторного комплекса (р;тс.7). "

. Электрофораз енопь с?штози-роэЕШпа сэлков протопластов алспчатшяз a I03-îio!ï ШАГ с , ДДО-Пз. ( Охенп $дюрогро!£3 по .{^Hist балков). А- КОНТРОЛЬ. В. npIWJfTCTEIffi хо гссмяь гао, п- li присутст-

стп ГАд-гзцэпторного комплекса'.'' ttiTpu указывав? г.олэкуд-яр:щэ t,tarai : шдуцпруемых белков.

Как шда» из ' верхнрго" рисунка изучаема!} горюв-рецояторщЗ комплекс ripii одвочаейвой индукции стимулировал синтез белков с Ur>l8Q, tes, 157, .152 кДа. В условиях ошпа CEîîa ГАЭ'приводила к пйгибпрованиа синтеза одного белка с îfr 133 кДа, осталышэ белко-еыо полосы били идентичны контрольного оэдту. Из-за отсутствия в литература детального описания генов и гш продуктов, котоpuо находятся под контролем гиббероллина у ' хлопчатника, идентгфшвция вшгеописшшх белковых полос"вэвоагахаа. Тем не менее этот'экспэ-ршепт показывает, что ГАд-ДСВ в комплекса с пкМэредлшюм способен стимулировать синтез группы белков.

Приникая во внимание литературный данные о домшируядей роли гиббереллина в синтезе хлопковой целлюлозы и, что FAg-ДСВ выделен из семяпочек^ которые являются местом синтеза хлопкового волокна, •кц изучал;! влияние выдалегоого бежа и его комплекса с ЕАд на процессы синтеза целлюлозы (по включению С14С]глкжозц в целлюлозу протопластов). Как -следует из табл.4 ферементированныз клетки каллуса хлопчатника, при регенорацни своих вторичных оболочек проявляют чувствительность к [гиббероллин - ГАд-ДСВ! комплексу. В условиях опыта гиббероллш-белковый комплекс стимулировал включение моченой глюкозы в агартонерастворимый материал примерна в два раза. С целью выяснения природа спиртонерастворимог^

;—•$ r^V

'Д.-'

в

Риз. 7

радиоактивного продала ого 'уксусна-озохЕохиакии

реактивом (с;.;зсь уксусной и азотной кислоти; 3:1), лохорай гйдро-лгзует uaariosy.' Посла' йэдгаяаза' рсдаоагдаязэсть сшхртоизраотворц- • кого материала углэпьаалаоь.в 2-3 раза, одцсио соои&опапнэ счотэ мэйду разпша саркаатап сайта. сохргтооь ,'Оэз -кзадиэилй. Оходо-ватольно, кр;:розт ¿клшо.£23й (,г01Г4агкззи v иэраствор^Г: коверкая обусловлен саатвзои црдшкш с шраз№шштдай структурой. Замена ГДд в опито на оукскай из нркподапз; к. сг.муляцкп синтеза цалкшози. ¿¡п12шш&ш D, аоОзЬйзнйзй в 'кккубацйоннуо .ср'эду в концентрации, нодавляг^зй на СО,; синтез цолпюяози, полностью снимал еф£э8т FÁg-CwKOBoro когллзкеа. Это позволяет, прэддоложать, что действие гермон-рёцзпторного коушювса зйкллчаэтея в 'активации группы гиСбброллгипувств;1тольн^х генов, ¿шэкйкх отнойошю к системе синтеза цэллэлози. Сккудйруюце'а шйяниэ ш.2тлзкса ГЛ3-ДСБ

Таблица 4.

ВКЛЮЧЕНИЕ 114С)Г;юиОЗЬ] в ЦЕШЛОЗУ ПР0Т.01ЩАСТ0В &701МДТНКы\ ПОД ВВЗШВ1 РЕЦЕПТОРА ШБ0?ШВИА ti СйтГШйЮЗ

Вариант опита

Включение twCJW2¿eo3íi ШН7ШГ- " |~в % к контролю'

' ' _i_ • ' i

Контроль . 9100 - '200 • 100 - 2,2

ГАд-ДОВ 9650 t ISO IOS ~ í,3

ГА3 . - , ' . 9450 t 550 ' lOÍ4 6•

ГАд-ДСВ + r¿3* 16500 ¿ 1500 IÊ2 ± IS

ГАд-ДСВ + IOTÍ '9200 i- 200 . IOÍ ¿. 2,2

ГАд-ДСВ + КУК 9400 i 400 Í03 - 4,5

Акт D 0,01 МКГ/Ш1 5150 - 65Q 55 - 7,2

ГАд-ДСБ+(ГАд)+AKTD 5250 í 750 57 ± 3,3

*ГА3 взята в концентрации 0,1 мшоль, ПУК и КУК - I шлоль ■

с гиббэрвллщюм на синтоз целлюлозы вторичной сгонки- протопластов свидетельствует,'Что изучаемый белок является рецептором гиббе-реллшш, способный участвовать в процессо регуляции формирования вторичной клеточной стенки. Хлопковод волокна тзкгэ является клеткой, мохэешзш формирования которой во многом идентичны синтезу целлюлозы вторичной клеточной оболочки растительных клзток.

Для изучения возможных механизмов действия ГЛд-ДСБ, мы определяли его количество в клетках каллусной ткани, которые инкубировались в среде с различным содержанием ГАд (табл.9). При опре-делешш этого белка после I часовой инкубации, его количество в цитоплазма уменьшалось, а в ядрах - увеличивалось. Эти данные показывают, что рецептор, связанный с гормоном интеркалирует в ядра, где и проявляются физиологические эффекты, описанные выше. Подобными свойствами обладают цитоплазматические рецепторы, обусловливающие ген-регулирующие функции.

Таблица 5.

ИЗМЕНЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ГАд-ДСВ В ОРГАНОВДАХ КЛЕТКИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ ЭКЗОГЕННОГО ГИВВЕРЕЛЛИНА (ГОШУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ)

Концентрация ГАЧ Количество ГАд-ДСВ в мкг/г ткани Соотношение ГАо-ДСБ в цитозоле/ в ядрах

мембраны* цитозоль** ____ ядра

Без гормона 0,005 0,51 0,11 4,63

Ю-0 М 0,005 0,34 0,18 1,88

Ю-5 М 0,010 0,28 0,30 0,93

*хлоронласты и митохондрии объединены во фракцию мембран **супернатант 100 тнс.х в

***ядра допольнителыю очищены в градиенте сахарозы

Изучение химических свойств рецептора гиббередлина. Для изучения химических свойств использовали гомогенный образец ГАд-ДСБ, выделенный как описано " ранее и дополнительно очищенный препаративным ПААГ-электрофорезом в присутствии ДЦС-Иа.

Известно, что многие ДНК-связывающие белки как растительного, так и животного происхождения гликозилироваш и содержание Сахаров играет важную роль в проявлении ДНК-связывающего свойства молекулы. Поэтому, мы изучали качественное и количественное содержание углеводов в выделенном рецепторе гиббереллина. Качественный состав углеводов в кислотном гидролизате рецептора изучали тонкослойной хроматографией. В составе гидролизата определяются два пятна углеводов примерно с одинаковой интенсивностью и соответствующие по значению Н^ маннозо и галактозамину (2-амино-2-дезокси Б-галактоза). Количественное содержание галактозамина и машюзы "в рецепторе определяли фенол - сернокислотным методом.

Для построения калиоровочной кривой использовали смесь галактоз-амина и маннози в молярном соотношении 1:1. Количественное содержание углеводов оказалось равным 27 - 2 % . Принимая во внимание содержание Сахаров, для расчетов по аминокислотному составу этого белка, определяли молекулярную массу полипептидной части молекулы 116,84 кДа (1016 остатков).

Аминокислотный состав рецептора, определенный ВЭЖХ ФГК-производных аминокислот, представлен" в таблице 6. Для аминокислотного состава рецептора характерно большое содержание моно-аминодикарбоновых кислот (соотношение Aap + Glu / Lys + Arg, без учета содержания Asn и Gin равно 2,2) и Phe. Как уже было определено, рецептор гиббереллина состоит из двух полипептидных цепей. Для определения N-концевых аминокислотных остатков отдельные цепи разделяли микропрепаратив!шм ПААГ-электрофорозом в присутствии ß-меркаптоэтанола и ДЦС-Na. N-концевыо остатки огфеделяли дансильным методом. Идентификацию DîiS-производных проводили ТСХ. Н-ксщэц легкой цепи (Ыр 71 кДа) представлен Asp, Н-концевой остаток тяжелой цепи идентифицировали как Glu.

Таблица 6. .

АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ РЕЦЕПТОРА ГИББЕРЕЛЛИНА ИЗ СЕМЯПОЧЕК ХЛОПЧАТНИКА

Аминокислота количество остатков

Аминокислота количество остатков

ASX*

Thr

Ser

130,3 49,7 51 ,2 118,3

38.0

61.1 67,2 17,1 41 ,4

Met Ile Leu Туг Phe His Lys Arg

10,2 50,8

69.0

23.1 136,0

26,6 70,1 41 ,2 14,1

Glx*

Pro Gly Ala 1/2 Cys** Val

*Азх =Asp+Asn; Glx =Glu+Gln. **по минимальному времени гидролиза

***Тгр определяли по гидролизу с толуолсульфокислотой.

ВЫВОДИ

1. Из семяпочек и проростков хлопчатника впервые выделен гиб-береллшгеависимо ДНК-связывающий белок, который связываясь с ГА3 приобретает сродство к ДНК (гиббереллинзависимо ДНК-связываюций белок I'Ag-ДСБ). Разработан метод выдоления гомогенного ГАд-ДСБ и показано, что белок тлеет Мг 160 кДа, состоит из двух полипептид-ifflx цепей - 71 - I и 78 - 3 кДа, N-концевыо остатки Asp и Glu, соответстветю, pi 4,6, гликозилирован (27-2% сахара, манноза и галактозамин), определен аминокислотный состав.

2. Показано, что сродство выделенного белка к ш,мобилизованному гиббереллину примерно в 1000 раз слабее, чем к свободному (Kd 0,4 - 1,5 х 10-4М и 0,85 - 3 х Ю~7М соответственно). Белок в присутствии ГАд образует с двунитевой ДНК тройной аффинный комплекс с Кд 10_8М, который без гормона не образуется.

3. Получена антисыворотка к ГАд-ДСБ и кммуноферментным методом показано, что белок локализован в основном в цитоплазме и частично в ядрах. При повышении концентрации экзогенной ГАд соотношение количества белка в цитоплазме и в ядрах изменяется в сторону увеличения связанного с ядрами бежа.

4. ГАд-ДСБ в комплексе с гиббереллином вызывает стимуляцию синтеза РНК изолированными ядрами клеток хлопчатника, в протопластах приводит к индукции группы невдентифицированшх белков и к стимуляции синтеза целлюлозы клеточной оболочки.

5. Выделенный гиббереллинзависимо ДНК-связывахтаЛ белок является цитоплазматическим рецептором гиббереллина у хлопчатника.

. Основное содержание диссертацш! изложено в следующих работах:

1. A.A. Абдукаримов, М.Х. Абидова, С.А. Джатаев и другие. Состояние и перспективы развития генно- и клеточно-иняенерной биотехнологии хлопчатника.//В сб.: Проблемы и перспективы развития хишш природных и физиологически активных веществ./род. A.A. Абдувахабов, Ташкент: "Фан", 1988, С. 393 - 412.

2. М.Х. Абидова, A.A. Абдукаримов, Г.Т. Мавланов. Гибберел-линзависимый ДНК-связывающий белок из семяпочек хлопчатника. // ДАН УзССР, 1989, JS I, С. 52 - 53.

3. A.A. Абдукаримов, М.Х. Абидова, Г.Т. Мавланов. Аффинная хроматография рецептора гиббереллина.//Тезисы докл. Всесоюз.

симп. "Химия белков", Тбилиси, 21-26 мая 1990 г., С. 43.

4. М.Х. Абидова. Изучение роли рецептора гиббераллша в регуляции активных гормон чувствительных генов хлопчатника. // Тезисы докл. I респ. конф. молод, ученых "Теор. и прикл. аспекты генет. и салак, животных, раст. и микроорганизмов", Ташкент, 19-21 июнь 1990, С. 60-61. (

5. М.Х. Абидова, Г.Т. Мавланов, И.Н. Грипша и другие'. Изучение функциональных особенностей рецептора гиббереллина, выделенного из семяпочек хлопчатника. // ДАН УзССР, 1990, » II, С. 52-53.