Выделение, свойства и основные закономерности действия лигнолитических ферментов (лакказы, лигниназы, Mn-пероксидазы) тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи УДК 577.152

БЕККЕР Елена Григорьевна

ВЫДЕЛЕНИЕ, СВОЙСТВА И ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ДЕЙСТВИЯ ЛШЮЛОГИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ (ЛАККАЗЫ, ЛИГНИНАЗЫ, Мп-ПЕРОКСИДАЗЫ)

(Специальность 02.00.15 - химическая кинетика и катализ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-1993

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета МГУ

Научный руководитель: доктор химических наук Синицын А.П.

Официальные оппоненты: доктор химических наук Ярополов А.И

кандидат химических наук Медведева С.А.

Ведущее учреждение: Институт биохимии растений АН Республики Грузия

Защита состоится . в час на заседании

специализированного совета Д.053.05.76 по химическим наукам при Химическом факультете МГУ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук ¿'. -'

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Большое внимание в настоящее время уделяется разработке процессов биоконверсии растительного сырья, важной составной частью которого, наряду с целлюлозой и гемицел-люлозой, является лигнин. Если свойства и механизм действия цел-люлаз и гемицеллюлаз изучены достаточно подробно, то ферменты, окисляющие лигнин, исследованы существенно меньше. Особый интерес представляет проблема механизма регуляции лигнолитических ферментов в грибах и их действие на полимерный лигнин. Возможное ее решение, на наш взгляд, состоит в выделении ферментов, являющихся компонентами лигнолитического комплекса, и выяснении роли каждого из них в составе комплекса, исходя из результатов детального исследования свойств индивидуальных ферментов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование свойств и закономерностей действия основных компонентов лигнолитического комплекса - лакказы, лигниназы, Мп-перокси-дазы - на лигнин и его модельные субстраты. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

т получение очищенных ферментов - лакказы, лигниназы, Мп-пероксидазы;

- исследование физико-химических свойств выделенных ферментов, их специфичности по отношению к низкомолекулярным субстратам;

- исследование основных закономерностей действия лигнолитических ферментов на лигнин; установление роли ферментов при деструкции лигнина грибами.

Научная новизна работы. Впервые выделены лакказа из гриба Cerrería untcolor и Mn-пероксидаза из Pleurotus ostreatus, проведена очистка лигниназного препарата из штамма гриба Sporotríchm pulverulentvm. Определены биохимические и физико-химические свойства выделенных ферментов: молекулярные массы, изоэлектриче-ские точки, термостабильность, рН-оптимумы. Проведено сравнительное исследование субстратной специфичности ферментов на низкомолекулярных и модельных субстратах лигнина.

Проведен сравнительный анализ методов исследования действия ¡¡срмгнтов на лигнин. Установлена полимеризующая активность лак-

казн, лигниназы и Мп-пероксидазы по отношению к лигнину; показано, что присутствие низкомолекулярных индукторов и фракционирование лигнина не приводят к изменению характера процесса. Исследовано действие лигнолитических ферментов на озонированный лигнин; на основе результатов этого исследования изложены модельные представления процесса окисления лигнина грибами.

Практическая значимость работы обусловлена тем. что разработка биотехнологических способов получения полезных продуктов из растительного сырья требует изучения закономерностей биодеструкции лигнина. Кроме того, лигнин как крупнотоннажный отход переработки древесины является потенциальным источником разнообразных ароматических соединений. Так как химические способы извлечения таких соединений дороги или неэффективны, большой интерес вызывают биотехнологические методы.

Выделенные в работе ферменты могут быть использованы в биотехнологических препаратах для получения ароматических соединений из лигнина. С другой стороны, полимеризующая способность лигнолитических ферментов по отношению к лигнину может быть использована в очистке сточных вод целлюлозно-бумажной промышленности путем полимеризации, осаждения и удаления фенольных соединений и лигнина.

В работе также предложен эффективный метод предобработки лигнина - его озонирование - перед дальнейшей ферментативной деструкцией.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на конференции "Методы получения, анализа и применения .ферментов" (Рига, 1990),

Публикации. По материалам диссертации имеется 8 публикаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения^ обзора литературы (2 главы), экспериментальной части, включающей описание объектов исследования и методики эксперимента (I глава), изложения результатов исследований и их обсуждения (3 главы), выводов, списка цитируемой литературы, включающего 144 ссылки, из них 118 работ зарубежных авторов.

Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц, 34 рисунка.

ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ H МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА Объекты исследования. В качестве продуцентов лакказы и Mn-пероксидазы использовали грибы Cerrería unicolor и Pleurotus. ostreatus, соответственно, культивированные в Институте биохимии растений г. Тбилиси. Лигниназу выделяли из гриба Sporotrtchum pulverulentum, который был культивирован в Институте биотехнологии (г. Лейпциг, ФРГ). При исследовании реакций трансглюкозили-рования был использован препарат целлобиазы из Aspergillus Japo-ntcus высокой степени очистки производства НПО "Биотехника".

Для определения активности и субстратной специфичности ферментов были использованы следующие субстраты: сирингалдазин ("Signa", США); 2,2'-азино-бис(3-этил-6-бензотиазолин сульфонат) аммония - АБТС ("Serva",ФРГ); пирокатехин ("Реахим") марки х.ч., предварительно очищенный возгонкой в вакууме; ванилиновый спирт, предоставленный Институтом органической химии РАН (г.Москва) и предварительно очищенный колоночной хроматографией на силикаге-ле; конифериловый спирт ("Sigma", США); вератровый спирт ("Merck", ФРГ); краситель Remazol brilliant blue R ("Sigma", США); о-фенилендиамин ("Sigma", США); модельный димер лигнина -в-гваяциловый эфир вератрилпропанола-1, вератрилпропанол-1, предоставленные Институтом органической химии СО РАН г. Иркутск; 3,5-датретбутил-4-гидроксианизол - ДГБА ("Fluka", США), MnS04x Ж,0 ("Alctrlch", США), НАДН ("Reanal", Венгрия),

В качестве лигнинов использовали лигносульфонаты (ЛС) (слокский ЦБК, Латвия), коммерческий препарат щелочного лигнина fndulin AT ("Sima", США) и лигнин молотой древесины (ЛВД) бе->ззи ("Serva", ФРГ).

Определение активности ферментов. Активность ферментов выражали в международных единицах - единица активности соответст-товала такому количеству фермента, которое необходимо для окис-кзнкя I мкмоль субстрата mut образования I мкмоль продукта в ми-1уту на I мг" (мл) фермента. Лигниназную активность определяли шектрофотометрически по скорости окисления 3,4-диметоксибензи-ювого (вератрового) сшфта до вератрового альдегида (Tien et il, 1986). Активность лакказы определяли по скорости накопления фодуктов окисления сирингалдазина (Kawai et al, 1988). Другой гетод определения активности лакказы был основан на спектрофото-

метрическом измерении скорости окисления пирокатехина. Активность Мп-пероксвдазы также определяли двумя методами: по окислению двухвалентного марганца (Johansson et al, 1989) и по окислению НАДН (Asada et al, 1987).

Определение субстратной специфичности проводили с использованием гомогенного препарата лакказы,. лигниназы III и Мп-пе-роксадазы III. В случае лакказы реакционная смесь включала 0,1 М ацетатный буфер, pH 4,5; 0,1 мМ субстрат и фермент. Реакционная смесь для определения субстратной специфичности лигниназы состояла из 0,1 М ацетатного буфера, pH 4,5; 0,1 мМ субстрата; 0,05 мМ Н202 и фермента. При использовании в качестве субстратов MnS04 и НАДН вместо ацетатного буфера применялся лактатный буфер (pH 4,5). Для Мп-пероксвдазы реакционная смесь включала 0,1 М лактатный буфер, pH 4,5; 0,1 мМ субстрат; 0,1 мМ MnSO^; 0,05 мМ Н202 и фермент.

Активность ферментов по отношению ко всем субстратам определяли спектрофотометрически на разных длинах волн. За реакцией расщепления ß-гваяцилового эфира вератрилпропанола-I следили также с помощью обращенно-фазной хроматографии на колонке Ы-Chrosorb RP-18

Аналитические методы.

На каждой стадии очистки для всех ферментов белок на выходе с колонок определяли спектрофотометрически при 280 нм на приборе Pye Unicam SP1800 (Англия), с помощью бицинхониновой кислоты или по методу Лоури dowry et al, 1951).

При исследовании реакций трансглнжозилирования анализ Сахаров в реакционной смеси проводили методом ВЭЖХ на хроматографе "Bio-Rad" серии 700 (США) с использованием колонки Blo-Sil Amino 5S. В качестве подвижной фазы при анализе Сахаров использовали смесь ацетонитрилгвода (70:30). Детекцию Сахаров осуществляли с помощью дифференциального рефрактометра. Для анализа ароматических спиртов и их глюкозидов использовали злюент с содержанием ацетонитрила 90% и спектрофотометрически!! детектор (280 нм).

Разностные спектры поглощения продуктов были получены для реакции окисления ЛС лакказой, лигниназой и Mn-пероксидазой на спектрофотометре Pye Unicam SP 1800 (Англия). Растворы сравнения во всех случаях содержали те же компоненты, но фермент в них был

инактишрован кипячением в течение 10 минут.

Для получения спектров светорассеяния использовались реакционные системы индулин - лигниназа и ЛС - лигниназа. Измерения проводили на флуориметре Hitachi 512 (Япония), в качестве источника возбуждения использовалась ксеноновая лампа. Длина волны возбуждения - 340 нм.

Высокоэффективную гель-хроматографюэ лигнинов проводили на колонке со Сфероном PI000. В качестве элгента использовали ДМФА с добавлением 0,03 М ЫВг и 0,03 М Н3Р04. Колонку термостатиро-вали при 50 X, скорость потока - 0,5 мл/мин. .Для калибровки использовали полистиролы с массами от 3600 до 600000. Регистрацию продуктов проводили на длине волны 280 нм. Спектры элгарувдихся веществ регистрировали с помощью Bio-Dimension detector UV/VIS Monitor ("Bio-Rad", США).

Реакции окисления лигнинов для анализа методом гель-хроматографии проводили в гомогенной (ЛС и индулин) и гетерогенной (индулин и ЛМД) среде. Окисление нерастворимых субстратов осуществляли при перемешивании.-

Для исследования полимеризующего действия лакказы на мономзрные субстраты были выбраны ванилиновый спирт и АБТС. Состав реакционной смеси: 0,1 мМ ванилиновый спирт (0,4 мМ АБТС), 0,1 Ы ацетатный буфер, pH 5,5 и лакказа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I.Выделение и очистка ферментов, их биохимические свойства. С целью выявления продуцентов лигнолитических ферментов нами совместно с Институтом биохимии растений г. Тбилиси и Институтом биотехнологии г. Лейпцига (ФРГ) был проведен скрининг ряда грибов белой гнили с точки зрения их способности продуцировать лак-казу, лигниназу и Mn-пероксидазу. Среди рассмотренных грибов не оказалось культуры, продуцирующей одновременно все интересующие нас ферменты с достаточно большими активностями. Поэтому в качестве источников лакказы, лигниназы и Mn-зависимой пероксидазы были выбраны три разных гриба.

Схема очистки лакказы из Cer. unicolor представлена на рис. I. Общий выход фермента по активности после очистки составил 30 % (по сирингалдазину, табл. I). Гомогенность полученного

препарата фермента была подтверждена методами аналитического изоэлектрофокусирования (ИЭФ) и электрофореза.

Перед очисткой лигниназы культуральная жидкость Sp. palve-rulentum была нами сконцентрирована ультрафильтрацией и обессолена на акрилексе. Разделение проводили с помощью ионообменной хроматографии на MA7Q. При хроматографии культуральной жидкости Sp. pulverulentvm на препаративной колонке с MA7Q из лигниназно-го препарата удалось выделить пять изоферментов с общим выходом фермента по активности 61 % (табл. 2).

MA7Q оказался гораздо более эффективным носителем для очистки лигниназы Sp. pulverulentvm, чем обычно используемый для лигниназ Mono Q: в результате хроматографии на Mono Q удалось разделить только три изофермента, при этом выход по активности составил всего 26 %,

Каждый из выделенных изоферментов лигниназы из Sp. pulverulentvm проявлялся в виде одной полосы при электрофорезе в денатурирующих условиях. Однако результаты ИЭФ показали, что изоферменты ке являются гомогенными, все они содержат полосы примесных белков. Сканирование пластик геля после ИЭФ изоферментов позволило определить содержание лигниназы по белку во' всех изоферментах: оно составляло 90 - 95 %.

При дальнейших попытках более тонкого разделения изоферментов Sp. pulverulentum лигниназы быстро теряли активность, поэтому для исследования свойств лигниназы и ее дейстЕия на лигнин был выбран изофермент III, не являющийся гомогенным, но содержащий (по белку) больше 90 % лигниназы.

Третий компонент лигнолитического комплекса - Мп-пероксида-за (из PI. ostreatus) - перед очисткой был сконцентрирован осаждением сульфатом аммония (при его концентрации 60 % от насыщения). Из приведенных в табл. 3 данных по очистке Мп-пероксидазы видно, что на этой стадии удалось выделить 25 % белка, содержащего 95 % от исходной активности. Далее схема очистки была такой же, как и для лакказы. Общий выход фермента по активности (по НАДН) в результате очистки составил 57 % (табл. 3). При электрофорезе каждого изофермента наблюдалась одна полоса, но ИЭФ показало, что только Mn-пероксидаза III являлась гомогенной. По результатам ИЭФ двух других изоферментов был сделан вывод, что

Препарат лакказы из Cer. unicolor (Осажденная сульфатом аммония культуральная жидкость)

i

Обессоливание на Bio-Gel Р-6 i

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-сфероне CIOOO Элюция в градиенте 0-1 M КС2^

Обессоливание на Bio-Gel Р-6

I

Ионообменная хроматография на Mono Q

|элвция в градиенте 0-0,2 M NaCl

лакказа

Рис. I. Схема очистки лакказы из Cer. unicolor.

Таблицр 1.

Очистка лакказы из Cer. unicolor

Згап очистки Общая активность, * ед Белок, мг Удельная активность, ед/мг Выход, X Степень очистки

Культур, жидкость ,осажденная сульфатом аммония 724 16,1 45 roo 1,0

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-Сфероне 449 4,0 113 62 2,5

Ионообменная хроматография на Mono Q 217 1,1 189 30 4,2

*актизиэсть по сирингалдазину

Таблиир В.

Очистка лигниназы из Sp. pulverulentш

Этап очистки Общая ж активность, ед Белок, мг Удельная активность ед/мг Выход, % Степень очистки

культуралъная жидкость Бр. ри1иеги1епХит 2,580 1,120 2,30 100 1,0

Ионообменная хроматография на ВД70 (19x100 мм) 1,640 0,220 64

Лигниназа I 0,150 0,033 4,55 2,0

Лигниназа II 0,098 0,015 6,53 1,1

Лигниназа III 0,850 0,066 12,88 5,6

Лигниназа IV 0,440 0,045 9,78 4,3

Лигниназа V 0,032 0,008 5,33 2,3

*активность по вератровому спирту

Табмсир 3.

Очистка Mn-пероксидазы из PI. ostreatus

Этап очистки Общая , актив-ть , ед Белок, мг Удельная акт-ть, ед/мг Выход, X Степень очистки

Культуралъная жидкость Р1.озггеаХиз 63,4 53,7 1,18 100 о 1,0

Фракционирование сульфатом аммония 60,2 13,6 4,42 95 3,7

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-сфероне 48,2 7,5 6,40 76 5,4

Ионообменная

Х*на Мо^Т 36,2 2,3 57

Мп-перокс-за I 2,0 1,28 1,56 1,3

Мп-перокс-за II 15,2 0,49 31,30 26,5

Мп-перокс-за III 19,0 0,49 36,30 30,8

'активность по НДВД

Таблица 4.

Биохимические свойства ферментов

Фермент Молекулярная масса. Изоэлектрическая

кД точка

Лакказа 66 3,9

Лигниназы

I 32 4,8

II 32 4,4

III 32 4,3

IV 32 4,2

V 32 4,1

Mn-пероксидазы

I 45 4,3

II 45 3,8

III 45 3,5

Mn-пероксидаза II содержит примеси Mn-пероксидаз I и III, а Mn-пероксидаза I содержит изофермент II. При ИЭФ этих ферментов не были обнаружены полосы других, примесных белков.

Молекулярные массы и изоэлектрические точки всех выделенных ферментов представлены в табл. 4.

В результате очистки лигнолитических ферментов был получен гомогенный препарат лакказы Cer. unicolor, выделены пять изо-ферментов лигниназы Sp. pulverulentum, имеющие 90 - 95 % степень чистоты (по данным ИЭФ) и три изофермента Mn-пероксидазы PI. ostreatus, которые не содержали примесных белков, а изофермент III был гомогенным.

Для исследования свойств и действия на лигнин ферментов лигнолитического комплекса были использованы лигниназа III, поскольку среди выделенных нами изоферментов лигниназы она обладала наибольшей активностью, гомогенная Mn-пероксидаза III и очищенный препарат лакказы.

2.Субстратная специфичность ферментов. Субстратная специфичность лакказы, лигниназы и Mn-зависимоЯ пероксидазы была исследована на тринадцати низкомолекулярных и модельных субстратах лигнина. Значения удельных активностей ферментов по отношению к

этим субстратам представлены в табл. 5.

Таблица 5.

Субстратная специфичность лакказы Сег. unicolor, лигниназы Sp. pulverulentum и Mn-пероксидазы PI. ostreatus

. Субстрат Активность,ед/мг

Лакказа Лигниназа Мп-пероксидаза

сирингалдазин 139,0 3,8 145,0

АБТС 2740,0 2,3 49,6

Remazol brilliant blue R 4,2 н/о 7,4

см^енилендиамин 13,0 0,8 58,9

пирокатехин 46,0 34,5 170,0

конифериловый спирт 140,0 3,0 31,0

ванилиновый спирт 26,0 2,9 0

вератровый спирт 0 12,9 0

р-гваяциловый эфир вератрилпропанола-1 0 3,5 0

вератрилпропанол-1 Н/О 2,7 0

ДГБА 0 7,0 . я

НАДН 0 2,6 36,3

Мл2** 0 7,2x1О5 ЗхЮ6

*активность дана в условных единицах

н/о - активность не определялась

Лакказа Сег. unicolor окисляла сирингалдазин, АБТС, кони-фериловый спирт, о-фенилендаамин, ванилиновый спирт, пирокатехин и ремазол. Все реакции происходили при участии 02 (без Н202). Вератровый спирт, модельный димер лигнина - э-гваяцило-вый эфир вератрилпропанола-1, вератрилпропанол-1, Мп2*, НАДН не окислялись лакказой.

Для лакказы Сег. unicolor были определены кинетические параметры по двум субстратам: сирингалдазину и АБТС. Судя по зна-

чениям Kjjj, "лучшим" субстратом для лакказы оказался сирингалда-зин (1^= Ю мкМ), для реакции окисления АБТС - 48 мкМ. Значения Vm для обеих реакций оказались одинаковыми и равны 118 мкМ/мин.

Исследование субстратной специфичности лигниназы Sp. pulverulentum показало, что, в отличие от лакказы Cer. untcolor, фермент окислял все субстраты (см. табл. 5). Ряд субстратов -вератровый, ванилиновый, конифериловый спирты, о-фенилендиамин, пирокатехин, ДГБА, ремазол, модельные димеры лигнина - окислялись лигниназой только в присутствии Н202. Это свойство фермента подтверждает его пероксидазную природу. Однако АБТС и сирингал-дазин окислялись лигниназой Sp. pulverulentum и без Н202 в присутствии 02, что говорит о наличии оксидазной функции у лигниназы. Добавление перекиси водорода в реакционную систему увеличивало скорость окисления этих субстратов.

В отношении ДГБА лигниназа проявляла деметоксилирующую активность, окисляя субстрат до 3,5-дитретбутил-л-бензохинона. При окислении модельных соединений лигнина - р-гваяцилового эфира вератрилпропанола-I и вератрилпропанола-I лигниназой происхо--дало расщепление Са-Ср-связи, и одним из продуктов реакции являлся вератровый альдегид, образование которого регистрировали с помощью обращенно-фазовой хроматографии.

Лигниназа обладала Mn-пероксидазной активностью, т.е. окисляла Мп2+ и НАДН. Однако добавление MnZt в реакционную смесь никак не влияло на активность лигниназы по отношению к другим субстратам.

Таким образом, полученные для лигниназы результаты исследования субстратной специфичности показывают, что фермент обладал как оксидазными свойствами, так и Mn-пероксидазной активностью по отношению к Мп2+ и НАДН, окисляя при этом специфический субстрат для лигниназ - вератровый спирт.

Исследование зависимости начальной скорости реакции окисления вератрового спирта лигниназой III Sp. pulverulentum от концентрации перекиси водорода показало, что при концентрациях й202, большее 0,4 мМ, реакция полностью ингибируется. Значение -сонстанты Михаэлиса ( ) по Нг0г, определенное методом Лайнуи-эера - Берка, составило 62 мкМ. Из зависимости начальной скорос-

ти реакции от концентрации вератрового спирта были получены значения Kjjj и Vm по вератровому спирту: 220 мкМ и 23,8 мкМ/мин соответственно.

Mn-пероксидаза PI. ostreatus окисляла (см. табл. 5) Мп2*, НАДН, сирингалдазин, конифериловый спирт, ремазол, АБТС, о-фени-лендиамин, пирокатехин. Пероксидазная природа фермента была подтверждена тем, что все эти субстраты, за исключением НАДН, окислялись только в присутствии перекиси водорода. Спосс.ность Ып-пероксидазы к 02-зависимому окислению НАДН с выделением R,02 используется для объяснения физиологической роли фермента в качестве генератора перекиси водорода в клетке.

Некоторые субстраты (сирингалдазин, АБТС, о-фенилендиамин) окислялись Мп-пероксидазой без Мп2*, однако присутствие ионов марганца ускоряло эти реакции в несколько раз. Остальные субстраты (ремазол, конифериловый спирт, пирокатехин) окислялись только с Мп2*. Это свидетельствует о том, что пероксидаза является Мп-зависиыой.

Бератровый спирт, модельные димеры лигнина, ванилиновый ; спирт, ДТБА не окислялись Мп-пероксидазой PI. ostreatus.

Для Mn-пероксидазы III нами была исследована зависимость начальной скорости реакции окисления Мпг* от концентраций Мпг+ и Нг0г. Ингибирование реакции ионами марганца наступает при их концентрации, выше 2 мМ, а перекисью водорода - при концентрациях, больших 0,1 мМ.

Из зависимости начальной скорости реакции от концентраций Ил2* и перекиси водорода были определены константы Михаэлиса для Mn-пероксидазы Fl. ostreatus: по Мп2+ - 0,075 мМ, по Н20г -0,03 ММ.

3.Эффект трансглюкозилирования в реакциях с участием модельных соединений лигнина. Разрушение лигнина и целлюлозы у высших базидиомицетов - биохимически сопряженные процессы. Одним из способов проявления этой взаимосвязи являются реакции трансглюкозилирования. Нами было отмечено, что при добавлении модельных соединений лигнина (ванилинового и вератрового спиртов) в реакционную, среду, содержащую целлобиозу и ß-глюкозидазу, ее гидролизусдув, наблюдалось образование глюкозидов этих модельных соединений в результате реакции трансглюкозилирования.

Гидролиз целлобиозы под действием р-глккозидазы проводили в присутствии различных концентраций акцептора (ванилинового и ве-ратрового спиртов) - 0,05; 0,1 и 0,2 М. На рис. 2 приведены кинетические кривые, характеризующие образование ванилил- и вера-трил-глюкозидов при трех концентрациях акцептора. Очевидно, что с увеличением концентрации акцептора скорость образования продукта трансглюкозилирования возрастает. Кинетические кривые проходили через максимум вследствие гидролиза глюкозидов на поздних стадиях реакции. Максимальный выход (при выбранных условиях) продукта трансглюкозилирования наблюдали через 3 ч, он составлял от 5 до 10 % для разных концентраций акцептора.

3,0

.4. I а * .* в г ^.«ч*» 9 7 меч

Рис.2.Кинетические кривые образования ванилил- (а) и вератрил- (б) глюкозидов в реакционной смеси, содержащей различные концентрации акцептора: I -0,05 М, 2 - 0,1 М, 3 - 0,2 М. Концентрация целло-биозы - 2x10"3 М, буфер - 0,1 М Иа-ацетатный, рН 4,5; 40 X.

Гидролиз целлобиозы под действием р-глюкозидазы, сопровождающийся трансглюкозилированием, можно представить с помощью следующей кинетической схемы:

*3(Н 20]

Е +" й

В + Ся

где а.

ИЗ*

-1

т в

Ев

Й4Ш

Е + А-в

- целлобиоза, С - глюкоза, А - ванилиновый или вератровый спиртГ А-С - продукт трансглюкозилирования.

Используя эту схему, можно найти соотношение констант скорости на стадиях трансглюкозилирования и гидролиза. Для ванили-

нового спирта значение оказалось равным 205, для вератро-

вого - 172.

Таким образом, константа скорости переноса глюкозного остатка на молекулу ароматического спирта во много раз превышает константу скорости переноса остатка на молекулу воды и зависит не от природы акцептора, а от его концентрации в реакционной системе. При увеличении концентрации спирта или изменении условий реакции можно ожидать более эффективного образования соответствующих глюкозидов.

4.Действие лигнолитических ферментов на полимерный лигнин.

Механизм действия лигнолитических ферментов на низкомолекулярные субстраты достаточно хорошо исследован, однако относительно их действия на высокомолекулярный лигнин имеются лишь отрывочные сведения. Одна из причин этого заключается в отсутствии чувствительного, избирательного и поддающегося калибровке метода контроля действия лигнолитических ферментов на лигнин.

Наш был проведен сравнительный анализ некоторых применяемых в настоящее время методов исследования изменений лигнина при его окислении. Анализ разностных спектров поглощения продуктов окисления растворимых в воде лигносульфонатов под действием выделенных нами лакказы, лигниназы и Mn-пероксидазы показывает, что, в целом, форда спектров одинакова и для всех ферментов наблюдаются общие закономерности (рис. За). Наибольшие изменения в оптической плотности при окислении ЛС происходят на длинах волн 330 и 510 нм.

Наш были получены также спектр! светорассеяния исходных веществ и продуктов реакций окисления ЛС и индулина под действием ферментов (рис. 36). Спектры светорассеяния содержат две полосы, соответствующие рзлеевскому рассеянию (узкая полоса) и флуоресценции (широкая полоса). Из данных рис. 26 видно, что в ходе реакции происходит перераспределение интенсивностей полос рассеяния - уменьшается интенсивность флуоресценции и возрастает пик, соответствующий рзлеевскому рассеянию.

Оба метода могут быть использованы для контроля скорости реакции окисления лигнина, однако не дают информацию о происходящих в системе изменениях молекулярно-массового распределения (ММР). Такую информацию можно получить, используя гель-хромато-

Рис.3, а) Разностные спектры поглощения продуктов окисления лиг-носульфзнатов лакказой (I), Мп-пероксидазой (2) и лигнмназой (3); О)спектры светорассеяния индулина (I) и продуктов его окисления лигниназой (2).

графический метод.

Одна из основных проблем, которая возникает при гель-хроматографии лигнинов, заключается в наличии полиэлектролитных эффектов. Этого обычно удается избежать, используя различные добавки к элюенту (как правило, это соли, кислоты, основания, ПАВ).

Нами был использован метод, позволяющий проводить хроматографию лигнина без полиэлектролитных эффектов (Русаков и др., 1982) и получены спектры ММР лигносульфонатов, индулина, лигнина молотой древесины березы и продуктов их ферментативного окисления. . . - •

Поскольку ЛС растворимы в воде, а индулин хорошо растворяется в органических растворителях, в частности в ДМСО, реакции ферментативного окисления этих субстратов были проведены в гомогенной системе. Реакции окисления нерастворимого в воде ЛВД были проведены в гетерогенной системе. Сравнение гель-хроматограмм реакционной смеси до начала и после завершения реакции показывает, что все три фермента полнмеризувт субстраты. При этом наибольшей полимеразной активностью характеризуется лакказа (рис. 4). В табл. 6 приведены величины сдвига положения максимума пика субстрата на гель-хроматограмме в результате реакции (в процентах) для девяти реакционных систем, составленных из сочетаний

Результаты окисления лигносульфонатов, индулина и лигнина молотой древесины лакказой, лигниназой и Мп-пероксидазой

Субстрат Сдвиг максимума на хроматограмме при окислении субстрата, %

Лакказа Лигниназа Мп-пероксидаза

Лигносульфо-наты 26 8 8

Индулин 58 36 7

Лигнин МОЛОт той древесины 15 9 7

трех ферментов и трех субстратов.

В литературе имеются сообщения о том, что присутствие какого-либо низкомолекулярного индуктора в реакционной системе может ускорять процесс ферментативного окисления лигнина. Нами в качестве индукторов были использованы вератровый спирт (для лигни-назы) и АБТС (для лаккаэы и Кп-пероксвдазы). Однако добавление этих соединений в реакционную среду не привело к заметным изменениям характера и скорости процесса окисления полимерных субстратов. Отметим, что в случае окисления ЛС и индулина под действием лакказы в присутствии АБТС происходило исчезновение пика, соответствующего АБТС, что было связано с полимеризацией АБТС,

вызванной лакказой. Аналогичные изменения ММР происходили при окислении лакказой ванилинового спирта (без лигнина).

Анализ спектров поглощения веществ, полученных при хроматографии реакционной смеси до начала и после завершения реакции для нескольких реакционных систем: лигнин - фермент, показал, что длина волны регистрации спектра ММР субстрата или продуктов реакции не влияет на характер получаемых данных. Кроме того, можно сделать вывод, что в реакциях окисления различных лигнинов лакказой, лигниназой и Мп-пероксидазой не образуется каких-либо продуктов деструкции, поглощающих на других длинах волн по сравнению с 280 нм, и основным результатом реакции является полимеризация субстратов.

Отсутствие деструктирующей способности лигнолитических ферментов по отношению к лигнину можно, видимо, объяснить тем, что лигнин представляет собой сложный по структуре субстрат (разветвленный и неупорядоченный), который недоступен для молекул ферментов. Возможно также, что в грибах перед ферментативной деструкцией он подвергается определенной предобработке нефермента-тавной природы, делащей его более доступным для действия ферментов. Мы предположили, что в грибах начальные этапы деструкции лигнина не связаны непосредственно с лигнолитической ферментной системой, а осуществляются различными активированными формами кислорода. Чтобы проверить это предположение, мы использовали модельный субстрат, представляющий лигнин, обработанный озоном. После обработки ЛС озоном в течение 30 минут происходила деструкция ЛС и образовывались две Фракции продуктов деструкции (рис. 5а). Действие лигнолитических ферментов на озонированные ЛС приводило к дальнейшей деструкции основной фракции, содержащей разрушенные ароматические кольца. При этом наибольшей депо-лимеризующей активностью обладала Мп-пероксидаза (рис. 56).

На основании полученных результатов мы предположили возможный механизм расщепления лигнина в грибах. Поскольку ни один из исследованных наш ферментов не вызывал деструкцию необработанного лигнина, вероятно, что на первых этапах разрушения лигнина в грибах основную роль играют различные активированные формы кислорода, которые могут неспецифически действовать на полимерный субстрат (в нашем случае моделью активированной формы кислорода

служил озон). На этой стадии окисления лигнина ферменты в грибах принимают участие в качестве продуцентов кислородных радикалов.

Можно предположить, что активирогандае формы кислорода не ■разрушают лигнин до конца, производя только его частичное расщепление (в основном, ароматических колец). Далее частично дестру-ктированный лигнин подвергается непосредственному воздействию лигнолитических ферментов: при этом может происходить дальнейшая деструкция ароматических колец (судя по изменениям ММР озонированного субстрата под действием ферментов), а также возможно расщепление боковых С-С связей.

В заключение следует отметить, что озонирование лигнина можно рассматривать как эффективный метод его предобработки для дальнейшего ферментативного окисления.

ВЫВОДЫ

I. Выделена и очищена до гомогенного состояния (по данным изо-электрофокусирования и электрофореза в денатурирующих условиях) лакказа из Cerrería unicolor, выделено пять изоферментов лигни-назы из Sporotrlchum pulverulentum и три изофермента Мп-перок-сидазы из Pleurotus ostreatus. Разработанные схемы очистки ос-

нованы на ионообменной хроматографии (низкого давления и FPLC) и являются наиболее эффективными для выделения ферментов из указанных источников.

2. Определены биохимические характеристики (молекулярные массы и изоэлектрические точки) лакказы, всех изоферментов лигниназы и Мп-пероксвдазы. Исследованы физико-химические свойства лакказы, лигниназы III и Мп-пероксидазы III: субстратная специфичность по отношению к низкомолекулярным и модельным субстратам, термостабильность, pH-зависимости, кинетические параметры окисления модельных субстратов.

3. Обнаружено образование глхжозидов модельных соединений лигнина - ванилинового и вератрового спиртов в результате реакции трансглюкозилирования при действии э-глюкозидазы на целлобиозу. Показано, что реакцию можно представить в виде трехстадийной кинетической схемы, на основании которой определено соотношение констант на стадиях трансглюкозилирования и.гидролиза.

4. Проведен сравнительный анализ методов исследования действия лигнолитических ферментов на лигнин. Показано, что спектрофото-метрический и флуоресцентный методы позволяют фиксировать окисление функциональных (гидроксильных, карбонильных и др.) групп лигнина, в то время как гель-хроматографический метод дает информацию об изменении молекулярно-массового распределения лигнина.

5. Установлено наличие полимеризующей активности лигнолитических фэрыентов - лакказы, лигниназы, Mn-зависимой пероксидазы по отношению к лигнину: лигносульфонатам, индулину и лигнину молотой древесины. Показано, что присутствие низкомолекулярных индукторов и фракционирование лигнина не приводят к изменению характера процесса.

G. Исследовано действие лигнолитических ферментов на озонированный лигнин. Показано, что обработку озоном можно рассматривать в качестве модели действия активированных форм кислорода при окислении лигнина микроскопическими лигнолитическими грибами. Установлена деполимеризукщая активность ферментов по отно-кению к озонированному лигнину. На основе полученных экспериментальных результатов и литературных данных изложены модельные представления процесса окисления лигнина грибами.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1.Беккер Е.Г., Петрова С.Д.. Ермолова О.В., Элисашвили

B.И., Синицын А.П. Выделение, свойства и некоторые свойства лак-казы из Сеттепа unicolor. // Биохимия. - 1990. - Т.55. - вып.П.

- С.20Г9-2024.

2.Ермолова О.В., Беккер Е.Г., Синицын А.П. Лакказа из гриба Cerrena untcolor. Конференция "Метода получения, анализа и применения ферментов", тезисы докладов, Рига, 1990, С,45.

3.Беккер Е.Г., Гусаков А.В., Синицын А.П. Трансгликозилиру-пцая активность э-глхжозидазы из Aspergillus Japontcus в присутствии ванилинового и вератрового спиртов как модельных соединений лигнина. Конференция "Методы получения, анализа и применения ферментов", тезисы докладов, Рига, 1990, С.180.

• 4.Беккер Е.Г., Гусаков А.В., Синицын А.П. Реакции трансгли-козилирования, катализируемые э-глюкозидазой из Aspergillus Japonicus в присутствии модельных соединений лигнина. // Прикл. биохим. микробиол. - 1991, - Т.27. - вып.4. - С.482-485.

5.Беккер Е.Г., Хартиг К., Лорбеер X., Синицын А.П. Выделение изоферментов лигниназы из Sporotrlchm pulverulentum и их некоторые- свойства. // Биохимия. - 1991. - Т.56. - вып.8. -

C.I4I3-I4I9.

6.Беккер Е.Г., Пирцхалаишвили Д.О., Элисашвили В.И., Синицын А.П. Mn-пероксидаза из Pleurotus ostreatus: выделение,, очистка и некоторые свойства. // Биохимия. - 1992. - Т.57. - вып.8.

- C.I248-I253.

7.Беккер Е.Г., Синицын А.П. Выбор схем очистки ферментов лигнолитического комплекса. // Биохимия. - 1992. - Т.57. - вып. 10. - C.I5I9-I526.

8.Беккер Е.Г., Синицын .А.П. Сравнительный анализ методов исследования действия лигнолитических ферментов на лигнин. // Прикл. биохим. микробиол. 1993. - Т.28. - вып. 3.

Отпечатано на тютапринте

Тиран 100 экз. I уч.-изд. лист Зак. 936-92