Ферменткатализируемое окисление замещенных фенолов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

На правах рукописи

КУПРИЯНОВИЧ Юлия Николаевна

ФЕРМЕНТКАТАЛИЗИРУЕМОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЗАМЕЩЕННЫХ ФЕНОЛОВ

Специальность 02.00.03 - органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

и-

Иркутск-2009 °

003460509

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Иркутском институте химии им. А. Е. Фаворского Сибирского отделения РАН

Научный руководитель доктор химических наук, профессор

Медведева Светлана Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Васильцов Александр Михайлович

доктор химических наук Гоготов Алексей Федорович

Ведущая организация Институт химии и химической

технологии СО РАН (г. Красноярск)

Защита состоится 17 февраля 2009 года в 12 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 003.052.01 при Иркутском институте химии им. А. Е. Фаворского СО РАН по адресу: 664033, Иркутск, ул. Фаворского, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Иркутского института химии им. А. Е. Фаворского СО РАН (ИрИХ СО РАН).

Автореферат разослан 15 января 2009 г.

Ученый секретарь совета д.х.н.

Тимохина Л. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее время резко возрос интерес к in vitro ферментативно катализируемому органическому синтезу. Использование ферментов как катализаторов в органическом синтезе имеет ряд преимуществ: (I) реакция протекает в мягких, в отношении температуры, давления, рН, условиях и не является энергоемкой; (2) процесс имеет высокую энантио-, регио- и хемоселективность; (3) ферменты - это природные нетоксичные катализаторы, а ферментативный катализ представляет собой пример "зеленой" химии и является экологически обоснованным.

Особый интерес представляют оксидоредуктазные ферменты. Лакказа и пероксидаза являются наиболее доступными ферментами этого класса. Субстратная специфичность этих ферментов позволяет вовлекать в реакции окисления широкий ряд соединений, включая о-, п- дифенолы, аминофенолы, ароматические амины, полифенолы и полиамины. Одна из биологических функций оксидоредуктаз -окисление фенольных соединений и участие в процессах биосинтеза веществ лигниновой природы.

Известно, что начальная стадия дегидрополимеризации фенольных предшественников лигнина катализируется лакказной и/или пероксидазной системами окисления, а формирование макромолекулы контролируется скоростью поступления субстрата в зону реакции, что приводит к образованию структур различного топологического строения: end-wise и bulk типа. В связи с этим, актуальным представляется установление взаимосвязи между регионаправленностью реакции и условиями ферментативного окисления in vitro, тем более что сведения об этих процессах весьма ограничены. Решение данной задачи открывает возможность регулирования процесса ферментативного окисления и направленного синтеза веществ с заданными свойствами.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР Иркутского института химии им. А. Е. Фаворского СО РАН по теме "Развитие химии и глубокой переработки древесины: получение новых биологически активных и технически ценных продуктов для медицины, сельского хозяйства и критических технологий" (№ государственной регистрации 0120.046380) и при финансовой поддержке РФФИ (проект № 01-03-97204 "Исследование биокаталитических реакций окисления лигнинов и ароматических соединений - компонентов донных отложений озера Байкал" и проект № 05-04-97269 "Биохимическая эволюция вещества лигноцеллюлозных отходов Прибайкалья").

Цель работы заключалась в изучении закономерностей ферментативного окисления моно- и дизамещенных фенолов, азотсодержащих гетероциклических соединений в различных динамических условиях, исследовании строения и свойств продуктов дегидрополимеризации. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- изучение основных физико-химических характеристик и субстратной специфичности лакказы Trámeles versicolor и пероксидазы хрена для подбора оптимальных условий окисления субстратов;

- исследование динамики ферментативного окисления мономерных предшественников лигнина (гваякола, сирингола, феруловой кислоты, эвгенола, а-

гваяцилпропанола) и N-гетероциклических соединений (на примере пиррола) в условиях end-wise и bulk протекания процесса;

- изучение особенностей химического строения продуктов ферментативного окисления и влияния условий синтеза in vitro на свойства энзиматических дегидрополимеров.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено систематическое исследование процессов ферментативного окисления ряда фенольных соединений в разных динамических условиях синтеза и установлено, что режим подачи мономера в зону реакции влияет на параметры химической структуры продуктов дегидрополимеризации: соотношение образующихся арил-арильных и арил-эфирных связей, молекулярную массу, степень конденсированности и полидисперсности, термическую устойчивость.

Проведено исследование влияния природы фермента на направленность процессов окислительного сочетания фенольных предшественников лигнина, катализируемых лакказной и пероксидазной системами. Получены количественные характеристики внутримолекулярных арил-арильных и арил-эфирных связей в фенольных дегидрополимерах end-wise и bulk типов. Показано, что лакказа в условиях in vitro способствует протеканию таких процессов как деметоксилирование ароматических субстратов, окисление боковой пропановой цепи и, в ряде случаев, реакций разрыва ароматического кольца. Для соединений с гваяцилпропановым типом замещения кольца направление реакции зависит от степени окисленности атома Са алифатической цепи.

Впервые изучены особенности ферментативного окисления в присутствии пероксидазы хрена N-гетероциклических соединений на примере пиррола. Установлено, что скорость реакции и степень конверсии субстрата можно регулировать введением медиатора. В присутствии различных допантов получены электропроводящие композиты полипиррола.

Полученные данные о химической структуре энзиматических дегидрополимеров, закономерностях катализа в присутствии лакказы и пероксидазы, влиянии динамических условий синтеза позволяют планировать новые подходы к изучению процессов формирования соединений нерегулярной структуры. Выявление взаимосвязи "условия синтеза - строение - свойства" открывает возможности создания в условиях ферменткатализируемого органического синтеза веществ с заданными свойствами.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XX-XXII1 Международных конференциях по полифенолам (Freising-Weihenstephan, Germany, 2000; Marrakech-Morocco, 2002; Helsinki, Finland, 2004; Winnipeg, Manitoba, Canada, 2006), 5-м Международном симпозиуме по химии природных соединений (Ташкент,

2003), III Всероссийской конференции по химии и технологии растительных веществ (Саратов, 2004), VI Симпозиуме по фенольным соединениям (Москва,

2004), II Всероссийской конференции "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья" (Барнаул, 2005), Международной конференции по органической химии "Органическая химия от Бутлерова и Бейльштейна до современности" (С.-Петербург, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц, 19 рисунков, 1 приложение. Список литературы включает 183 наименования. Литературный обзор посвящен анализу данных по теории дегидрополимеризации фенольных предшественников лигнина, возможностям применения ферментативных систем окисления для получения практически значимых продуктов. Обсуждение результатов собственных исследований представлено в главе И. Необходимые экспериментальные подробности приведены в главе Ш.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Субстратная специфичность и кинетические характеристики оксидоредуктазных ферментов

Среди ферментативных систем, участвующих в процессе биосинтеза лигнина, важную роль играют ферменты, катализирующие превращения фенольных соединений в ходе реакций восстановления молекулярного кислорода (лакказа) и пероксида водорода (пероксидаза). Ферменты действуют посредством свободнорадикального механизма, на первой стадии реакции происходит образование феноксильных радикалов:

Лакказа Е-Си2+ + Аг-ОН -» Е-Си+ + Аг-О- + Н+ Е - фермент

2 Е-Си+ + Уг 02 + 2 Н+ -> 2 E-Cu2+ + Н20

Пероксидаза E-Fe3+ + Н202 — ЕI -[Fe4+(0)]+ Н20

Е I -[Fe4+(0)] ^ + Аг-ОН —> Е II -[Fe4+(OH)] + Аг-О* Е И -[Fe4+(OH)] + Аг-ОН Е-Fe + Аг-О* + Н20

Образующиеся феноксильные радикалы могут далее вступать в различные неферментативные реакции, наиболее характерными из них являются реакции окислительного сочетания.

Определение субстратной специфичности ферментов (лакказы Trametes versicolor и пероксидазы хрена) выполнили с использованием ароматических соединений, имеющих различный тип замещения кольца: о-д игидрокси-, гваяцильный, вератрильный, сирингильный. Было показано, что лакказа и пероксидаза катализируют окисление субстратов, содержащих хотя бы одну незамещенную фенольную ОН-группу. Оптимум действия лакказы лежит в области рН 4.5-5.0, и фермент стабилен в довольно широком диапазоне рН. Снижение активности при инкубировании в течение 6 суток при 22 °С не превышало 50% для кислой и нейтральной области рН (3.0, 6.0). Для пероксидазы, по сравнению с лакказой, рН оптимум сдвинут в нейтральную область 5.8-6.0, и фермент более чувствителен к изменению рН среды.

Определение кинетических параметров реакции окисления фенольных субстратов (максимальная скорость Утах, константа Михаэлиса Км) показало, что все соединения окисляются с достаточно высокими скоростями, а наиболее специфичным субстратом для ферментов является сирингол (табл. 1).

Таблица 1

Кинетические характеристики окисления фенольных субстратов лакказой

Т. versicolor и пероксидазой хрена

Субстрат сирингол гваякол феруловая а-гваяцил- эвгенол

к-та пропанол

Км, мкМ лакказа 7 100 165 220 127

пероксидаза 7 113 41 148 63

V ' max, лакказа 670* 173 175 234 75

мкМ/мин пероксидаза 389' 101 82 47 6

(*) скорость рассчитана на продукт - хинон

2. Дегидрополимеризация фенольных мономеров, катализируемая ферментами. Исследование химической структуры продуктов окисления

Характерной особенностью природного лигнина является отсутствие единообразия структурных элементов, из которых состоит макромолекула, что определяет широкий ряд мономерных соединений, используемых при моделировании процессов дегидрополимеризации. В настоящем разделе обсуждаются особенности ферментативного окисления фенольных соединений, моделирующих гваяцильный, сирингильный и фенилпропановый (с различной степенью окисления пропановой цепи) тип замещения ароматического кольца:

гваякол сирингол феруловая к-та а-гваяцилпропанол эвгенол

Проведено сравнение структурных особенностей продуктов окисления, полученных в различных динамических условиях: при изначально высокой концентрации мономерного субстрата - bulk-условия (В) и при постепенном введении мономерного субстрата в зону реакции - end-wise-условия (EW). На примере гваякола и сирингола, как наиболее простых моделей, выполнен теоретический анализ (метод AMI) возможных путей реакции окислительного сочетания в условиях радикального протекания процесса.

2.1. Ферментативное окисление 2-метокснфенола (гваякола) и 2,6-диметоксифенола (сирингола)

Феноксильные радикалы, образующиеся под действием ферментативной системы окисления, стабилизированы несколькими резонансными формами: Е-Си2*/0,

или E-Fe'VH.O,

ОСН,

ОСН,

■ Н,0

он о

R = Н гваякол; R = ОСН3 сирингол

Для гваякола сочетание радикалов возможно шестью способами с образованием соответствующих эфиров, пероксидов и дифенильных структур (табл. 2). Среди продуктов рекомбинации радикалов наиболее вероятным является 1,Г-диокси-2,2'-диметоксидифенил (сочетание С4-С6).

Таблица 2

Тепловой эффект реакции рекомбинации 2-метоксифеноксильных радикалов по данным расчетов в приближении AMI

Регионаправленность Д АН/, кДж/моль Регионаправленность Д АН/, кДж/моль

(С4-С6) -271.9 (С1-0-С4) -183.8

(С6-С6) -262.1 (С1-0-С6) -169.5

(С4-С4) -261.0 (О-О) 134.4

Согласно данным квантово-химических расчетов при образовании соединений, содержащих три мономерных фрагмента (терфенилов), самым вероятным остается процесс рекомбинации радикалов посредством сочетания С-С. Наименее выгодны реакции, приводящие к образованию о-терфенила (здесь о-, м-, п- - относительное расположение двух крайних ароматических колец (АК) как заместителей при среднем кольце):

н3со он но осн3

и-терфенил .и-терфенил о-терфенил

сочетание (4-6)-(3-4) сочетание (4-4)-(6-4) сочетание (4-6)-(5-4)

В результате ферментативного окисления гваякола Е\У и В способами в присутствии лакказы и пероксидазы были получены продукты сочетания исходного метоксифенола нерегулярного строения. Использование методики количественного

расчета по спектрам ЯМР 'Н, |3С позволило оценить содержание функциональных групп и типов связей в полимерах (табл. 3). Основным типом связей являются арил-арильные (Сар-Сар), их число зависит от способа синтеза. Количество арил-эфирных (Сар-0-Сар) связей ниже и определяется не только динамическими условиями синтеза, но и природой ферментативной системы окисления.

Таблица 3

Количество основных функциональных групп и типов связей в полимерах _гваякола по данным ЯМР 'Н,1 С (в расчете на 1 АК)_

Структурный фрагмент лакказа пероксидаза

EW (рН 4.5) В (рН 4.5) EW (рН 7.0) В (рН 7.0)

НоНфен 0.137 0.078 0.326 0.542

с=о 0.053 0.076 0.498 0.028

caD-o 2.099 2.409 2.555 2.240

Сар"С 1.104 1.257 1.267 1.141

СНао (4, 5) 1.291 1.030 0.833 0.987

СНао(6) 0.646 0.552 0.551 0.710

СНа0 (3) 0.861 0.753 0.796 0.918

СН30 0.942 1.029 0.981 1.101

.fan 0.588 0.844 0.713 0.842

С -С 0.552 0.628 0.634 0.570

С -О-С ^ар 0.108 0.426 0.357 0.299

/ар - относительное содержание ароматических атомов углерода (степень ароматичности);Х/)= 1ар/1общ

Наиболее доступная и объективная характеристика среднестатистической структуры - частота замещения атома водорода в положениях 3-6 ароматического кольца (ун, число замещенных положений, приходящееся на одну мономерную единицу). Для полимеров гваякола она изменяется в ряду С4 > С6 > СЗ > С5 (табл. 4).

Таблица 4

Частота замещения ун атома водорода в положениях 3-6 ароматического кольца

полимеров гваякола, оцененная по спектрам ЯМР 13С

полимер

Положение лакказа пероксидаза

EW В EW В

(РН 4.5) (рН 4.5) (рН 7.0) (рН 7.0)

3 0.14 0.25 0.20 0.08

4 0.7 0.97 1.00 1.00

5 0 0 0.17 0.01

6 0.35 0.45 0.45 0.29

Анализ полученных данных показал, что наибольшее число замещающих групп приходится на атом углерода в положении 4 ароматического кольца. Примерно в два раза реже замещается атом водорода в положении 6. Минимальна частота

замещения в положении 3 (уИз), тем не менее, она все же достаточна высока. Эти данные согласуются с теоретически полученными значениями частоты замещения в ряду моделей, содержащих от 3 до 5 мономерных звеньев.

При пероксидазном окислении в реакцию вовлекается и положение С5 ароматического кольца. В целом пероксидазная система окисления способствовала образованию более разветвленных структур, мономерное звено которых имеет суммарную степень замещения по атому водорода от 1.4 до 1.8 для образцов В и Е\У, соответственно.

В спектрах ЯМР 13С продуктов окисления гваякола были зарегистрированы сигналы атомов углерода карбонильных групп, которые можно отнести к резонансу групп С=0 фенохиноидных структур. УФ-спектры свидетельствуют о принадлежности этих карбонильных групп фенохиноидным структурам, входящим в состав полимерной цепи. Форма полосы поглощения, наблюдаемая в УФ-спектрах, зависела от динамических условий синтеза (рис. 1).

1 - В (пероксидаза), 2 - Е\У (пероксидаза), 3 - В (лакказа), 4 - Е\У (лакказа)

Рис. 1. Электронные спектры полимеров гваякола

На молекулярно-массовые характеристики полимеров (табл. 5) влияние оказывает тип ферментативной системы окисления.

Таблица 5

Значения среднечисловой (М„), среднемассовой (М„) молекулярных масс и

степени полидисперсности (Мл/Мп) полимеров гваякола по данным __ гель-фильтрации__

Образец м„ М^УМП

лакказа Е\¥ (рН 4.5) 1510 1210 1.25

В (рН 4.5) 2060 1280 1.61

пероксидаза Е\У (рН 7.0) 6990 2030 3.44

В (рН 7.0) 2910 1850 1.57

Полимеры, полученные при окислении гваякола в присутствии лакказы, имеют узкое молекулярно-массовое распределение и примерно одинаковые значения степени полимеризации. В условиях пероксидазного окисления формировались

более длинные полимерные молекулы, при этом Е\У-полимер неоднороден по своему составу. Существенное различие в М„ при близких значениях М„ Е\У и В полимеров говорит о большей "сшитости" последнего.

Теоретический анализ путей формирования полимерной структуры 2,6-диметоксифенола при радикальном механизме процесса показал, что наиболее вероятным является образование на первой стадии димера со связью Сар-Сар по положению С4:

н3со осн3 осн3 осн3

IV + Я' ДД Н/= -254.56 кДж/моль ДА Н/= -163.11 кДж/моль

Радикал этого димера является инициирующей частицей дальнейшей полимеризации. Развитие цепи полимера при радикальном механизме может осуществляться исключительно путем образования эфирных связей с участием атомов С1 и С4 ароматического кольца, а ограничение цепи - за счет реакции передачи цепи.

Окисление сирингола в присутствии лакказы происходило с высокой скоростью, при практически отсутствующем ингибировании фермента. Однако продукты окисления обладали плохой растворимостью. Средние структурные формулы растворимой в ДМСО олигомерной фракции (М№ 1410 и 1280; М„ 660 и 900 для образцов Е\¥ и В, соответственно), рассчитанные по спектрам ЯМР 1Н, 13С, представлены ниже:

Е\У: СбН| 91(С=О)0 29(Сар-О-Сар)0 04(Сар-Сар)0 44(ОНфек)0 58(ОСНэ)1 52

В: СбН2 0б(С=0)оо5(Сар-0-Сар)о,2з(Сар-Сар)о42(ОНфе„)о 51(ОСНз)1 69

Доминирующим типом связей в олигомерах являются связи Сар-Сар. Число таких связей, приходящееся на одну мономерную единицу, не зависит от способа синтеза. Относительное содержание связей Сар-0-Сар мало и, напротив, определяется условиями получения.

В УФ-спектрах растворимой в ДМСО фракции наличие дифенохиноидных структур обусловливает появление отчетливой полосы при 470-475 нм. Ионизация олигомеров в щелочной среде приводит к возникновению двух интенсивных полос поглощения при 365 и 425 нм и одной слабой полосы при 605 нм, что указывает на вхождение дифенохиноидного фрагмента в полимерную цепь. Это обстоятельство является указанием на протекание побочной реакции деметоксилирования, в результате чего оказывается возможным С-С или С-О-С сочетание по положениям 2,6 ароматического кольца диметоксифенола.

Различия в химическом характере полимеров гваякола и сирингола, способе синтеза проявились в особенностях процесса термической деструкции. В отличие от полимеров сирингола, полимеры гваякола плавятся и разлагаются в достаточно

узком температурном интервале. Е\У-продукты являются термически более устойчивыми.

2.2. Ферментативное окисление фенолов с гваяцилпропановым типом замещения ароматического кольца

Анализ продуктов реакции ферментативного окисления феруловой кислоты Е\У и В способами показал, что в результате окисления образуются олигомерные (преимущественно димерные) и полимерные продукты (М„ варьирует в интервале 3000-8100). По данным ЯМР основные структурные фрагменты содержат арил-арильные и арил-пропановые связи.

Особенностью окисления в присутствии лакказы является образование дилактона феруловой кислоты (1). Содержание этого димера составляет 13.3% и 17.6% (в расчете на исходный мономер) в условиях EW и В, соответственно.

Для полимерной фракции, полученной в Е\У условиях, характерно значительное снижение степени ароматичности до 0.43 (/ар феруловой к-ты 0.6) и рост содержания карбоксильных групп, при этом количество двойных связей остается достаточно высоким. Эти двойные связи не являются структурной единицей пропановой цепи, а образовались в результате разрыва ароматического кольца и сопряжены с концевыми карбоксильными группами. При В-полимеризации таких изменений не происходит.

Ферментативное окисление феруловой кислоты

он

НО

+ полимер

При окислении феруловой кислоты в присутствии пероксидазы В-способом основными компонентами олигомерной фракции являются у-лактон-диферуловая кислота (2) и бензофуран-диферуловая кислота (3). Эти димеры образуются с выходом 34.8 и 19.2%, соответственно.

Полимерные продукты содержат структурные фрагменты с а-эфирными, р-арильными, Р-Р' связями (аналогично типам связей в димерах 1-3), а также с арил-арильными (4), арил-эфирными (5), р-эфирными (6) связями:

R R

Анализ количественного соотношения различных типов связей в полимерных продуктах свидетельствует о том, что наибольший вклад в формирование цепи вносят реакции между а,р-атомами и ароматическим кольцом (табл. 6). Преобладание а,р-эфирных и Р-углеродных связей по сравнению с арил-арильными и арил-эфирными связями является характерной особенностью макромолекулы лигнина.

Таблица 6

Количество основных функциональных групп и типов связей в полимерах феруловой кислоты (пероксидаза) по данным ЯМР 'Н, 13С (в расчете на 1 АК)

Структурный фрагмент EW В Отнесение сигналов

СООН 0.935 0.642 карбоксильные, сложноэфирные группы

С -С 1.505 1.347 С6, С4 связанные с атомом углерода

СНар (6) (5) 1.595 1.741 С6, С5 незамещенные

СНар (3) 0.991 1.065 СЗ незамещенные

СНОалк 0.383 0.547 Со, р в а-О-Г, р-О-Г структурах

СНзО 0.838 0.996 метоксильные группы

СН№ ц-6 0.277 0.247 Ср в р-р', р-6' структурах

/ар 0.604 0.627 степень ароматичности/ар= 1ар/10бщ

С -С 0.178 0.144 арил-арильные связи

Сар-О-Сар 0.158 0.049 арил-эфирные связи

Полимеры, полученные в условиях пероксидазного окисления, имеют близкие значения молекулярных масс и полидисперсности (М„ 3500 и 3030; М„ 2290 и 2030 для образцов Е\У и В, соответственно), однако различия в качественном и количественном составе структурных фрагментов привели к изменению термической устойчивости: в условиях термической обработки разрыв внутримолекулярных связей в Е\У-полимере происходит в более низких температурных интервалах по сравнению с В-полимером (рис. 2).

70 -

50

30

10 -

-10

ч ..... л Е\У

Г

/\ \ В

/

/ А » \ \ \

/ \ V \ .. м..

200 400 6<

Рис. 2. Термический анализ полимеров феруловой кислоты (кривые

термогравиметрического (....)„

дифференциального

термического (-)

анализа)

Температура, "С Ферментативное окисление эвгенола

Исследование кинетики окисления эвгенола в присутствии ферментов показало, что это наиболее медленно окисляющийся субстрат, однако значения констант Михаэлиса имеют тот же порядок, что и для остальных фенолов. Преимущественным направлением на начальных стадиях реакции является образование 6-6' дегидродиэвгенола (7).

щсо.

осн

'3 +

В В-условиях количество образующегося дегидродиэвгенола не зависит от типа окислительного фермента и рН реакционной среды (табл. 7). Дальнейшая полимеризация эвгенола происходит с образованием структур с арил-эфирными связями (М№ полимерных продуктов составляет 2500-5500).

Полученные в присутствии лакказы полимеры содержат окисленные структуры. Положение сигналов в спектре свидетельствует о том, что образующиеся окисленные фрагменты принадлежат не хинонметиду эвгенола, а С=0 группе ванилина.

Таблица 7

Количество основных функциональных групп и типов связей в полимерах _ эвгенола по данным ЯМР 'Н,1 С (в расчете на 1 АК)_

Структурный фрагмент лакказа пероксизада Отнесение сигналов

В pH 4.5 В pH 5.9 В pH 7.0

С=0 0.166 - - С=0 хинонов, альдегидов

СООЯ 0.166 - - карбоксильные, сложноэфирные

группы

СНОалк 0.344 0.340 0.629 С0_р в а-О-1', (3-0-1', Ср-ОН

сн№ р.б 0.073 - - Ср в р-р', Р-6'

/ар 0.686 0.653 0.652 степень ароматичности/ар= 1ар / 1„(1щ

С -С 0.320 0.145 0.282 арил-арильные связи

С -О-С 0.233 0.295 0.103 арил-эфирные связи

димер 26% 26.8% 23.3% Iдимер ^ ^общ

Ферментативное окисление а-гваяцилпропанола

Ферментативное окисление а-гваяцилпропанола протекает с образованием слабо окрашенных нерастворимых в воде продуктов. В спектре ЯМР 13С Е\У-а-гваяцилпропанола, полученного в условиях лакказного окисления, полимерная компонента представлена трудноразрешимыми сигналами. На фоне полимерных сигналов легко идентифицируются сигналы низкомолекулярного продукта окисления, которые можно отнести к 6-6' димеру. Образование этого соединения происходит и в В-условиях окисления. Полимер (Мж 2900, М„ 1990), полученный в присутствии пероксидазы, имеет более сложный спектр, сигналы димера в котором однозначно выделить нельзя, т.к. происходит его дальнейшая полимеризация. Полимеры содержат в своем составе хиноидные группировки (табл. 8).

Таблица 8

Количество основных функциональных групп и типов связей в полимерах а-гваяцилпропанола по данным ЯМР 'Н, 13С (в расчете на 1 АК)

Структурный В В Отнесение сигналов

фрагмент (лакказа) (пероксидаза)

pH 4.5 pH 7.0

С=0 0.318 0.137 С=0 хинонов, кетонов

COOR 0.298 - карбоксильные, сложноэфирные

группы

снар(3,6) 1.316 1.372 СЗ, С6 незамещенные

с 0.807 1.935 Са,рл - атом пропановой цепи

С -С "--ар Wp 0.632 0.271 арил-арильные связи

С -О-С ар v ^-ар 0.138 0.113 арил-эфирные связи

/ар 0.660 0.655 степень ароматичности/ар= 1ар //ой(,

димер 28.5% - Iдимер / 1общ

Структуры, содержащие исходную пропенильную цепь, составляют 0.27 и 0.65 на 1 АК при В-окислении лакказной и пероксидазной системой, соответственно. Результатом деструкции боковой цепи является частичное высвобождение С4-углеродного атома, который может служить еще одним центром полимеризации.

Все ферментативно синтезированные фенольные дегидрополимеры обладали парамагнетизмом и давали в спектрах ЭПР сигналы различной интенсивности, концентрация парамагнитных центров составляла 1017-1018 сп/г. Наличие парамагнитных характеристик и достаточно высокой термостабильности позволяют рассмотреть ферментативную дегидрополимеризацию как способ синтеза электропроводящих полимерных материалов. Мы предприняли попытку расширить ряд субстратов и провели ферментативное окисление пиррола. Полипиррол (ПП) является представителем перспективного класса проводящих полимеров. Он приобретает проводимость в результате введения небольших концентраций допанта в матрицу исходного полисопряженного полимера.

3. Ферментативная окислительная полимеризация пиррола

Синтез полипиррола (ПП) изучен нами в классических ферменткаталитических условиях (диапазон рН 4-8) в присутствии пероксидазы хрена:

E-Fe /Н,0,

N Н

Пиррол окисляется ферментативной системой пероксидаза-Н202 с образованием полимера при оптимальном рН 4.5. Ключевая роль фермента в изучаемом процессе подтверждается тем, что без него полимеризация пиррола в сравнимых условиях не идет. При более высоких значениях рН происходит образование незначительного количества низкомолекулярных продуктов окисления, а при рН < 4.0 имеет место неферментативная катионная олигомеризация. Степень конверсии пиррола в полимер составляет 30-35% (рис. 3).

100

Рис. 3 Изменение концентрации пиррола при ферментативной полимеризации, рН 4.5 (I - фосфатный буфер, II -цитратный буфер, III - фосфатный буфер, АБТС, IV - фосфатный буфер, АБТС, СПС, V -фосфатный буфер, АБТС, трифлатЫ)

Время, ч

С целью оптимизации процесса получения ПП проанализирована возможность использования медиатора окислительной ферментативной полимеризации - 2,2'-

азино-бис(З-этил-бензотиазолин-б-сульфоната) (АБТС). Введение медиатора в реакционную систему приводит к значительному увеличению скорости полимеризации пиррола и к увеличению степени конверсии субстрата до 75% (рис. 3). Элементный анализ свидетельствует, что АБТС включается в структуру полученного полимерного композита (соотношение пиррол : АБТС составляет 13:1). С целью модификации свойств полимера, ферментативно с использованием медиатора АБТС, синтезированы полимерные композиты ПП в присутствии электролитов - трифторметансульфоната лития и полистирол-4-сульфоната натрия (СПС), которые также включаются в полимерную структуру.

Все полученные полимеры обладают парамагнетизмом и дают в спектрах ЭПР интенсивные узкие синглеты, соответствующие концентрациям неспаренных электронов 101 -Ю20 сп/г (табл. 9).

Таблица 9

Электропроводность полимеров пиррола, концентрация парамагнитных

центров (N) и xai эактеристики сигналов ЭПР

Образец a (См/см) N (сп/г) ДН мТл g-factor Параметр асимметрии

ПП (цитрат) 3.2-10"7 5.2-10'* 0.470 2.0022 0.91

ПП (АБТС) 1.2-10"6 з.з-ю" 0.400 2.0047 0.61

ПП (АБТС, трифлат Li) 6.0'10"5 2.4'10zu 0.220 2.0028 0.86

ПП (АБТС, СПС) 2.0-10"4 2.5-Ю20 0.047 2.0028 0.87

ПП (АБТС, СПС, 12) 5.1*10"3 2.8-102" 0.084 2.0038 0.83

Анализ характеристик спектров ЭПР указывает на наличие в полимерах развитой системы сопряженных связей. Парамагнетизм и электропроводность ПП обусловлены наличием в его структуре поляронов (катион-радикалов). В зависимости от способа получения полимера, в наших случаях анионными допантами выступают либо цитратные ионы из буферного раствора, либо сульфатные анионы из молекул АБТС и СПС, либо трифторметансульфонатные анионы. Обладающий наилучшими электропроводящими свойствами композит ПП-АБТС-СПС имеет электропроводность 2.0-10"4 См/см. Дополнительное допирование этого полимера в парах иода увеличивает его электропроводность еще на порядок.

Выводы

1. Впервые проведено сравнительное изучение количественного состава структурных фрагментов фенольных полимеров нерегулярного строения, полученных в различных динамических условиях, моделирующих природные процессы лигнификации. Показано, что процессы ферментативного окислительного сочетания фенолов с гваяцильным, сирингильным, гваяцилпропановым типом замещения кольца в условиях end-wise и bulk реакций идут с образованием димерных и полимерных соединений преимущественно за счет связей С-С и С-О-С, количество которых зависит не только от динамического режима процесса, но и природы ферментативной системы окисления.

2. Образование связей в полимерах в процессе ферментативной дегидрополимеризации Происходит региоселективно. Для гваякола наиболее

реакционноспособным является положение С4, менее реакционоспособны положения Сб и СЗ ароматического кольца. Для гваяцилпропановых структур предпочтительным направлением реакции при формировании полимерной молекулы является образование межмономерных связей по а- и ß- углеродным атомам алифатической цепи и Cl, С6 атомам ароматического кольца.

3. Доказано, что на регионаправленность в биокаталитических реакциях синтеза in vitro влияют динамические условия: в зависимости от режима подачи и расхода реагентов синтезированы соединения различного строения и термической устойчивости.

4. Установлено, что отличительной особенностью окислительной системы лакказа-кислород являются реакции деметоксилирования. По сравнению с пероксидазной системой, лакказная система способствует более глубокому протеканию процессов окисления гваяцилпропановых структур с образованием хиноидных и карбоксильных групп, а также деструкции ароматического кольца и пропановой цепи.

5. Показано, что система пероксидаза-пероксид водорода может служить катализатором окислительной полимеризации пиррола. Скорость реакции и степень конверсии субстрата в полимер можно регулировать введением медиатора окисления - 2,2'-азино-бис(3-этил-бензотиазолин-6-сульфоната)аммония. Энзиматически, в присутствии различных допантов, синтезированы композиты полипиррола, обладающие электропроводящими свойствами.

Список публикаций по теме диссертации

1. Куприянович Ю.Н., Волчатова И.В., Медведева С.А., Каницкая J1.B. Ферментативный синтез полимеров на основе 1-окси-2-метоксибензола // Химия в интересах устойчивого развития. - 2000. -№ 8. - С. 393-398.

2. Каницкая J1.B., Селезнев С.Н., Медведева С.А., Куприянович Ю.Н., Турчанинов В.К. Дегидрогенизационная полимеризация 2,6-диметоксифенола // ВМС, сер. А. - 2003. - Т. 45, № 2. - С. 196-204.

3. Куприянович Ю.Н., Медведева С.А., Рохин A.B., Каницкая J1.B. Региоселективность реакций полимеризации феруловой кислоты под действием оксидазных ферментов // Биоорг. химия. - 2007. - Т. 33, № 5. - С. 555-562.

4. Kupriyanovich J.N., Sukhov B.G., Medvedeva S.A., Mikhaleva A.I., Vakul'skaya T.I., Myachina G.F., Trofimov B.A. Peroxidase-catalyzed synthesis of electroconductive polypyrrole // Mendeleev commun. - 2008. - V. 18, no. 1. - P. 56-58.

5. Куприянович Ю.Н., Волчатова И.В., Медведева С.А. Ферментативный синтез полифенолов // Тез. докл. Международной конф. "Экология и рациональное природопользование на рубеже веков. Итоги и перспективы". Томск. - 2000. - С. 61.

6. Куприянович Ю.Н., Медведева С.А., Волчатова И.В. Влияние динамических условий синтеза на региоселективность поликонденсации фенольных соединений // Тез. докл. Всеросс. конф. "Химия и технология растительных веществ". Сыктывкар. -2000.-С. 219.

7. Куприянович Ю.Н. Влияние динамических условий синтеза на строение и свойства фенольных дегидрополимеров // Тез. докл. V Всеросс. студ. научно-практич. конф. "Безопасность-2000". Иркутск. - 2000. - С. 239-240.

8. Medvedeva S.A., Kupriyanovich J.N., Volchatova I.V., Kanitskaya L.V., Seleznev S.N. Enzymatic polymerisation of phenolic compounds (syringol and guaiacol) catalysed by laccase. // XX International conference on polyphenols. Germany, Freising-Weihenstephan. - 2000. - P. 97-98.

9. Medvedeva S.A., Kanitskaya L.V., Seleznev S.N., Kupriyanovich J.N., Enzymatic dehydropolymerisation of 2,6-dimethoxyphenol // XXI International conference on polyphenols. Marrakech-Morocco. - 2002. - P. 543-544.

10. Kupriyanovich J.N., Medvedeva S.A., Kanitskaya L.V., Rokhin A.V. Enzymatic dehydropolymers on the base of ferulic acid // 5th International symposium on the chemistry of natural compounds. Tashkent. - 2003. - P. 252.

11. Kupriyanovich J.N., Medvedeva S.A., Kanitskaya L.V., Rokhin A.V. Peroxidase-and laccase-catalysed synthesis of DHPs with different structures // XXII International conference on polyphenols. Finland, Helsinki. - 2004. - P. 615.

12. Куприянович Ю.Н., Медведева С.А., Рохин A.B. Сравнительное исследование фенольных дегидрополимеров, полученных в условиях пероксидазного и лакказного окисления // Тез. докл. VI Симпозиума по фенольным соединениям. Москва. - 2004. - С. 99.

13. Куприянович Ю.Н., Медведева С.А., Рохин А.В. Исследование биокаталитических реакций окисления фенольных соединений // Тез. докл. Школы-семинара молодых ученых России. Улан-Удэ. - 2004. - С. 227.

14. Куприянович Ю.Н., Медведева С.А., Рохин А.В. Структурные особенности дегидрополимеров на основе моно- и ди- замещенных фенолов // Тез. докл. Ill Всеросс. конф. по химии и технологии растительных веществ. Саратов. - 2004. - С. 98-99.

15. Куприянович Ю.Н., Медведева С.А., Рохин А.В. Реакции окислительного сочетания в процессах синтеза полимеров на основе эвгенола // Тез. докл. II Всеросс. конф. "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья". Барнаул. - 2005. - С. 268-269.

16. Куприянович Ю.Н., Медведева С.А., Иванов А.В., Сухов Б.Г., Трофимов Б.А. Новый способ синтеза полипиррола при ферментативном катализе радикальной полимеризации // Тез. докл. Международной конф. по орг. химии "Органическая химия от Бутлерова и Бейльштейна до современности". С.-Петербург. - 2006. - С. 754-755.

17. Куприянович Ю.Н., Медведева С.А., Рохин А.В. Синтез и строение полимерных моделей лигнина на основе фенилпропановых структур // Тез. докл. IV Всеросс. конф. по химии и технологии растительных веществ. Сыктывкар. - 2006. -С. 104.

18. Kupriyanovich J.N., Medvedeva S.A., Rokhin A.V. Investigation of molecular-mass characteristics of phenolic polymers obtained under conditions of enzymatic oxidation // XXIII International conference of polyphenols. Canada, Winnipeg. - 2006. - P. 285.

Подписано к печати 09.01.2009 г. Формат 60*84/16. Объем 1,0 п.л. Тираж 120 экз. Заказ № 430. Издательство Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ОКИСЛЕНИЕ АРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ IN VIVO И IN VITRO (литературный обзор)

1.1. Оксидоредуктазные ферменты. Лакказа. Пероксидаза

1.2. Основные типы связей и структур в макромолекулах лигнина

1.3. Дегидрогенизационная полимеризация фенольных предшественников лигнина. Bulk- и end-wise- дегидрополимеры

1.4. Органический синтез в условиях in vitro ферменткатализируемых реакций

1.4.1. Окисление фенольных соединений в присутствии оксидоредуктазных ферментов

1.4.2. Ферменткатализируемая полимеризация виниловых соединений

1.4.3. Использование ферментативного катализа для получения электропроводящих полимеров

ГЛАВА 2. ФЕРМЕНТКАТАЛИЗИРУЕМОЕ ОКИСЛЕНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Обсуждение результатов)

2.1. Субстратная специфичность и кинетические характеристики оксидоредуктазных ферментов

2.2. Дегидрополимеризация фенольных соединений, катализируемая ферментами. Исследование химической структуры полимеров

2.2.1 .Ферментативное окисление 2-метоксифенола (гваякола)

2.2.2. Ферментативное окисление 2,6-диметоксифенола сирингола)

2.2.3. Ферментативное окисление фенолов с гваяцилпропановым типом замещения кольца. Окисление феруловой кислоты

2.2.4. Ферментативное окисление эвгенола

2.2.5. Ферментативное окисление а-гваяцилпропанола

2.2.6. Роль динамических условий и природы фермента в процессах дегидрополимеризации фенольных соединений 97 2.3. Окислительная полимеризация пиррола в присутствии пероксидазы хрена

ГЛАВА 3. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

3.1. Исходные вещества

3.2. Методы определения активности ферментов

3.3. Определение биохимических и кинетических характеристик ферментов

3.4. Ферментативное окисление фенольных субстратов

3.4.1. Окисление гваякола

3.4.2. Окисление сирингола

3.4.3. Окисление феруловой кислоты

3.4.4. Окисление эвгенола

3.4.5. Окисление а-гваяцилпропанола

3.5. Окисление пиррола

3.6. Молекулярно-массовый анализ полимеров

3.7. Спектроскопия ЯМР

3.8. ЭПР

3.9. Определение электронной проводимости полипирролов

3.10. Хроматографические методы 119 ВЫВОДЫ 120 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 122 Приложение

В последнее время резко возрос интерес к in vitro ферментативно катализируемому органическому синтезу [1]. Несмотря на то, что эффективность и рациональность биотехнологических методов проверена столетиями, возможность использования индивидуальных ферментных препаратов появилась не так давно. Связано это как с совершенствованием методик скрининга продуцентов ферментов, методов выделения и очистки, так и с появлением рекомбинантных ферментов [2]. В настоящее время промышленное получение технических ферментов является экономически выгодным, о чем свидетельствует возрастающий объем продаж на мировом рынке. Ужесточение требований к экологической безопасности химических процессов также является одной из причин все возрастающего интереса к ферментативному катализу [3].

Использование ферментов в органическом синтезе имеет ряд преимуществ:

- катализируемая ферментами реакция протекает в мягких в отношении температуры, давления, рН условиях и не является энергоемкой;

- ферменты как катализаторы имеют высокую энантио-, регио- и хемоселективиость, что обеспечивает возможность получения новых функционализированных соединений, в том числе и лекарственных препаратов;

- ферменты являются природными нетоксичными катализаторами, а ферментативный катализ представляет собой пример "зеленой" химии и является экологически обоснованным [4, 5].

В промышленных биокаталитических процессах широко используются различные ферменты [1, 6-8]. Особый интерес представляют собой оксидоредуктазные ферменты, основными субстратами которых являются фенолы и ароматические амины. Каталитические свойства этих ферментов дают возможность их использования в целлюлозно-бумажной промышленности для биоделигнификации, детоксикации и обесцвечивания сточных вод, разрушения ксенобиотиков, получения древесно-волокнистых плит без токсичных связующих [4, 9-13]. Широкое применение находят эти ферменты в медицине при создании различного рода диагностикумов и биосенсоров [2]. Оксидоредуктазные ферменты обнаружены в биологических объектах различного уровня организации, от прокариот до высших организмов. Естественной биологической функцией оксидоредуктаз является окисление фенольных соединений и участие в процессах биосинтеза и биодеструкции веществ лигниновой природы [14-16]. Лигнин - один из самых распространенных природных полимеров. Но, несмотря на многолетние исследования, остаются открытыми вопросы о строении этого биополимера, его структурной организации и особенностях биосинтеза [17-20].

Исследование процесса ферментативной дегидрополимеризации фенольных соединений, моделирующих структурные элементы лигнина, представляет интерес с точки зрения установления закономерностей формирования сложной макромолекулы этого полимера [21-23]. Актуальной задачей в этом плане является исследование взаимосвязи между условиями ферментативного окисления in vitro и регионаправленностью, а также макромолекулярными характеристиками дегидрополимеров. В первую очередь, это вариации скорости поступления субстрата в зону реакции и соотношения фермент - субстрат, которые позволяют получить структуры различного топологического строения: end-wise- и bulk-типа. Решение данной задачи может служить более широким целям, а, именно, создать основу для возможности регулирования процесса ферментативного окисления и направленного синтеза полимеров с заданными свойствами.

Лакказа и пероксидаза являются наиболее доступными ферментами класса оксидоредуктаз. Субстратная специфичность этих ферментов позволяет вовлекать в реакции окисления широкий круг субстратов, включая о-, п-дифенолы, аминофенолы, ароматические амины, полифенолы и полиамины, некоторые неорганические ионы [24]. Существенно расширить область практического применения этих ферментов возможно при использовании эффективных фермент-медиаторных систем, способных катализировать окисление субстратов, которые в обычных условиях не окисляются или подвергаются окислению с невысокой скоростью [15, 25-28]. Обширные исследования, ведущиеся в направлении поиска новых активных форм оксидоредуктазных ферментов, их модификации, повышающей стабильность и диапазон действия, а также работы, связанные с ферментативным синтезом полимеров, подтверждают значимость развития биокатализа в этой области.

Исследование процессов ферментативного окисления фенольных соединений под действием оксидоредуктазных ферментов дает возможность расширить представления о процессах лигнификации. Знание закономерностей процессов дегидрополимеризации позволяет развить подходы к ферменткатализируемому синтезу полимеров на основе не только фенолов, но и других практически значимых мономеров, таких как анилин, пиррол, тиофен.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении закономерностей ферментативного окисления моно- и дизамещенных фенолов, азотсодержащих гетероциклических соединений в различных динамических условиях, исследовании строения и свойств продуктов дегидрополимеризации. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- изучение основных физико-химических характеристик и субстратной специфичности лакказы Trametes versicolor и пероксидазы хрена для подбора оптимальных условий окисления субстратов;

- исследование динамики ферментативного окисления мономерных предшественников лигнина (гваякола, сирингола, феруловой кислоты, а-гваяцилпропанола, эвгенола) и N-гетероциклических соединений (на примере пиррола) в условиях end-wise и bulk протекания процесса; изучение особенностей химического строения продуктов ферментативного окисления гваякола, сирингола, феруловой кислоты, а-гваяцилпропанола, эвгенола, пиррола и влияния условий синтеза in vitro на свойства энзиматических дегидрополимеров.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено систематическое исследование процессов ферментативного окисления ряда фенольных соединений в разных динамических условиях синтеза и установлено, что режим подачи мономера в зону реакции влияет на параметры химической структуры продуктов дегидрополимеризации: соотношение образующихся арил-арильных и арил-эфирных связей в полимерах, молекулярную массу, степень конденсированности и полидисперсности, термическую устойчивость.

Проведено исследование влияния природы фермента на направленность протекания процессов окислительного сочетания фенольных предшественников лигнина, катализируемых лакказной и пероксидазной системами. Получены количественные характеристики внутримолекулярных арил-арильных и арил-эфирных связей в фенольных дегидрополимерах endwise- и bulk-типов. Показано, что лакказа в условиях in vitro способствует протеканию таких процессов как деметоксилирование ароматических субстратов, окисление боковой пропановой цепи и, в ряде случаев, реакций разрыва ароматического кольца. Для соединений с гваяцилпропановым типом замещения кольца направление реакции зависит от степени окисленности атома Са алифатической цепи.

Впервые изучены особенности ферментативного окисления в присутствии пероксидазы хрена N-гетероциклических соединений на примере пиррола. Установлено, что скорость реакции и степень конверсии субстрата можно регулировать введением медиатора. В присутствии различных допантов получены электропроводящие композиты полипиррола.

Полученные данные о химической структуре энзиматических дегидрополимеров, закономерностях катализа в присутствии лакказы и пероксидазы, влиянии динамических условий синтеза позволяют планировать новые подходы к изучению процессов формирования соединений нерегулярной структуры. Выявление взаимосвязи "условия синтеза — строение - свойства" открывает возможности создания в условиях ферменткатализируемого органического синтеза веществ с заданными свойствами.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XX-XXIII Международных конференциях по полифенолам (Freising-Weihenstephan, Germany, 2000; Marrakech-Morocco, 2002; Helsinki, Finland, 2004; Winnipeg, Manitoba, Canada, 2006), 5-м Международном симпозиуме по химии природных соединений (Ташкент, 2003), III Всероссийской конференции по химии и технологии растительных веществ (Саратов, 2004), VI Симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2004), II Всероссийской конференции "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья" (Барнаул, 2005), Международной конференции по органической химии "Органическая химия от Бутлерова и Бейлылтейна до современности" (С.Петербург, 2006).

Работа выполнена в соответствии с планом НИР Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского СО РАН по теме: "Развитие химии и глубокой переработки древесины: получение новых биологически активных и технически ценных продуктов для медицины, сельского хозяйства и критических технологий" (№ государственной регистрации 0120.0 46380) и при финансовой поддержке РФФИ: грант № 01-03-97-204 "Исследование биокаталитических реакций окисления лигнинов и ароматических соединений -компонентов донных отложений озера Байкал", 2001-2003 гг.; грант № 05-0497-269 "Биохимическая эволюция вещества лигпоцеллюлозных отходов Прибайкалья", 2005-2007 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста,

ВЫВОДЫ

1. Впервые проведено сравнительное изучение количественного состава структурных фрагментов фенольных полимеров нерегулярного строения, полученных в различных динамических условиях, моделирующих природные процессы лигнификации. Показано, что процессы ферментативного окислительного сочетания фенолов с гваяцильным, сирингильным, гваяцилпропановым типом замещения кольца в условиях end-wise и bulk реакций идут с образованием димерпых и полимерных соединений преимущественно за счет связей С-С и С-О-С, количество которых зависит не только от динамического режима процесса, но и природы ферментативной системы окисления.

2. Образование связей в полимерах в процессе ферментативной дегидрополимеризации происходит региоселективно. Для гваякола наиболее реакционноспособным является положение С4, менее реакционоспособны положения С6 и СЗ ароматического кольца. Для гваяцилпропановых структур предпочтительным направлением реакции при формировании полимерной молекулы является образование межмономерных связей по а- и (3- углеродным атомам алифатической цепи и CI, С6 атомам ароматического кольца.

3. Доказано, что на регионаправленность в биокаталитических реакциях синтеза in vitro влияют динамические условия: в зависимости от режима подачи и расхода реагентов синтезированы соединения различного строения и термической устойчивости.

4. Установлено, что отличительной особенностью окислительной системы лакказа-кислород являются реакции деметоксилирования. По сравнению с пероксидазной системой, лакказная система способствует более глубокому протеканию процессов окисления гваяцилпропановых структур с образованием хиноидных и карбоксильных групп, а также деструкции ароматического кольца и пропановой цепи.

5. Показано, что система пероксидаза - пероксид водорода может служить катализатором окислительной полимеризации пиррола. Скорость реакции и степень конверсии субстрата в полимер можно регулировать введением медиатора окисления — 2,2'-азино-бис(3-этил-бензотиазолин-6-сульфоната)аммония. Энзиматически, в присутствии различных допантов, синтезированы композиты полипиррола, обладающие электропроводящими свойствами.

1. Koeller К.М., Wong С.-Н. Enzymes for chemical synthesis 11 Nature. 2001.- Vol. 409, no. 6817. P. 232-240.

2. Газарян И.Г., Хушпульян Д.М., Тишков В.И. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений // Усп. Биол. Хим. 2006. - Т. 46. - С. 303-322.

3. Schmid A., Dordick J.S., Kiener A., Witholt В. Industrial biocatalysis today and tomorrow // Nature. 2001. - Vol. 409, no. 6817. - P. 258-268.

4. Call H.P., Mucke I. History, overview and applications of mediated lignolytic systems, especially laccase-mediator-systems (Lignozym®-process) // J. Biotechnol.- 1997. Vol. 53, no. 2-3. - P. 163-202.

5. Riva S. Laccases: blue enzymes for green chemistry // Trends Biotechnol. — 2006. Vol. 24, no. 5. - P. 219-226.

6. Егоров H.C., Олескин A.B., Самуилов В.Д. Биотехнология проблемы и перспективы. М.: Высшая школа, 1987. - 159 с.

7. Березин И.В., Клесов А.А., Швядас В.К. Инженерная энзимология. М.: Высшая школа, 1987. 144 с.

8. Хиггинс И., Бест Д., Джонс Д. Биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 1988.-480 с.

9. Burton S.G. Oxidizing enzymes as biocatalysts // Trends Biotechnol. 2003. — Vol. 21, no. 12.-P. 543-549.

10. Burton S.G. Laccases and phenol oxidases in organic synthesis a review // Curr. Org. Chem.-2003.-Vol. 7, no. 13. - P. 1317-1331.

11. Рабинович М.Л., Болобова A.B., Кондращенко В.И. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Книга 1. Древесина и разрушающие ее грибы. М.: Наука, 2001. 264 с.

12. Mester Т., Tien М. Oxidation mechanism of lignolytic enzymes involved in the degradation of environmental pollutants // Int. Biodeter. Biodegr. 2000. - Vol. 46, no. l.-P. 51-59.

13. Ruttimann-Johnson С., Lamar R.T. Polymerization of pentachlorphenol and ferulic acid by fungal extracellular lignin-degrading enzymes // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - Vol. 62, no. 10. - P. 3890-3893.

14. Волчатова И.В. Физиолого-биохимические механизмы микробиологической деструкции лигнина. Дисс. канд. биол. наук. Иркутск,1994.-227 с.

15. Морозова О.В. Лакказы базидиальных грибов, лакказа-медиаторные системы и возможности их использования. Автореф. дисс. канд. хим. наук. Москва, 2006. 25 с.

16. Медведева С.А. Превращения ароматической компоненты древесины в биохимических процессах делигнификации. Дисс. докт. хим. наук. Иркутск,1995.-470 с.

17. Biosynthesis and biodégradation of wood components / Ed. by Higuchi T. Orlando, Florida: Academic Press, INC, 1985. 679 p.

18. Левит M.H., Шкроб A.M. Лигнин и лигниназа // Биоорг. Хим. 1992. - Т.18. №3,-С. 309-344.

19. Карманов А.П. Структура и полимерные свойства природного лигнина и его биосинтетических аналогов дегидрополимеров. Автореф. дисс. докт. хим. наук. Уфа, 1995.-48 с.

20. Матвеев Д.В. Полимеризация монолигнолов и исследование структуры природного лигнина. Автореф. дисс. канд. хим. наук. Уфа, 2000. 22с.

21. Кочева Л.С. Структурная организация и свойства лигнина и целлюлозы травянистых растений семейства злаковых. Автореф. дисс. докт. хим. наук. Архангельск, 2008. 42 с.

22. Карманов А.П., Кузнецов С.П., Монаков Ю.Б. Моделирование биосинтеза лигнина in vitro. Странный аттрактор // ДАН. 1995. - Т. 342, № 2. - С. 193-196.

23. Карманов А.П., Монаков Ю.Б. Явление самоорганизации при ферментативной полимеризации 2-окси-З-метоксибензальдегида // ВМС, сер. Б. 1994. - Т. 36, № 12. - С. 2098-2099.

24. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. Т. 1. М.: Мир, 1982. 389 с.

25. D'Acunzo F., Galli C., Masci B. Oxidation of phenols by laccase and laccase-mediator systems // Eur. J. Biochem. 2002. - Vol. 269, no. 21. - P. 5330-5335.

26. Goodwin D.C., Grover Т.A., Aust S.D. Roles of efficient substrates in enhancement of peroxidase-catalysed oxidation // Biochemistry. — 1997. Vol. 36, no. l.-P. 139-147.

27. Won K., Kim Y.H., An E.S., Lee Y.S., Song B.K. Horseradish peroxidase-catalyzed polymerisation of cardanol in presence of redox mediators // Biomacromolecules. 2004. - Vol. 5, no. l.-P. 1-4.

28. Gross R.A., Kumar A., Kalra B. Polymer synthesis by in vitro enzyme catalysis // Chem. Rev. 2001. - Vol. 101, no. 7. - P. 2097-2124.

29. Wang P. Nanoscale biocatalyst system // Curr. Opin. Biotechnol. 2006. -Vol. 17, no. 6.-P. 574-579.

30. Dordick J.S., Freeman A. Biocatalysis as a discovery tool: from nanoscale to high-throughput and beyond // Curr. Opin. Biotechnol. 2006. - Vol. 17, no. 6. — P. 559-561.

31. Freudenberg K., Neish A. Constitution and biosynthesis of lignin. Berlin-Heidelberg-New York: Springer, 1968. 129 p.

32. Лигнины (структура, свойства и реакции) / Под ред. Сарканен К.В., Людвиг К.Х. М.: Лесная промышленность, 1975. 629 с.

33. Gavnholt В., Larsen К. Molecular biology of plant laccases in relation to lignin formation // Physiol. Plantarum. 2002. - Vol. 116, no. 3. - P. 273-280.

34. O'Malley D.M., Whetten R., Bao W., Chen C.-L., Sederoff R.R. The role of laccase in lignification // Plant J. 1993. - Vol. 4, no. 5. - P. 751-757.

35. Рабинович М.Л., Болобова A.B. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Книга 2. Ферменты, модели процессы. М.: Наука, 2002. 343 с.

36. Xu F. Oxidation of phenols, anilines and benzenethiols by fungal laccases: correlation between activity and redox potentials as well as halide inhibition // Biochemistry. 1996.-Vol. 35, no. 23.-P. 7608-7614.

37. Неорганическая биохимия. Т. 2 / Под ред. Эйхгорн Г. М.: Мир, 1978. -736 с.

38. Пегасова Т.В. Структура лакказы из Coriolus hirsutus и строение ее активного центра. Автореф. дисс. канд. хим. наук. Москва, 2004. 24 с.

39. Беккер Е.Г. Выделение, свойства и основные закономерности действия лигнолитических ферментов (лакказы, лигниназы, Mn-пероксидазы). Дисс. канд. хим. наук. Москва, 1993. 158 с.

40. Xia Z., Yoshida Т., Funaoka М. Enzymatic degradation of highly phenolic lignin-based polymers (lignophenols) // Eur. Polym. J. 2003. - Vol. 39, no. 5. - P. 909-914.

41. Королева O.B., Явметдинов И.С., Шлеев C.B., Степанова Е.В., Гаврилова В.П. Выделение и изучение некоторых свойств лакказы из базидиального гриба Cerrena maxima // Биохимия. 2001. - Т. 66, № 6. - С. 762-76.

42. Горбатова О.Н., Степанова Е.В., Королева О.В. Изучение некоторых биохимических и физико-химических свойств индуцибельной формы внеклеточной лакказы базидиомицета Coriolus hirsutus II Приклад. Биохим. Микробиол. 2000. - Т. 36, № 3. - С. 272-277.

43. Леонтьевский А.А., Мясоедова Н.М., Баскунов Б.П., Позднякова Н.Н., Варес Т., Калккинен Н., Хатакка А.И., Головлева Л.А. Реакции голубых и желтых лакказ с модельными соединениями лигнина // Биохимия. 1999. - Т. 64, № 10.-С. 1362-1369.

44. Позднякова Н.Н., Леонтьевский А.А., Головлева Л.А. Внеклеточные оксидазы твердофазной культуры лигнинолитического гриба Panus tigrinus 8/18 II Биохимия. 1999. - Т. 64, № 4. - С. 526-532.

45. Wallace G., Fry S.C. Action of diverse peroxidases and laccases on six cell wall-related phenolic compounds // Phytochemistry. 1999. - Vol. 52, no. 5. - P. 769-773.

46. Явметдинов И.С. Лакказа и Мп-пероксидаза базидиомицета Сегепа Maxima: характеристика и роль в биосинтезе гуминоподобных веществ. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Москва, 2003. — 25 с.

47. Bourbonnais R., Paice M.G. Oxidation of non-phenolic substrates. An expanded role for laccase in lignin biodégradation // FEBS J. 1990. - Vol. 267, no. 1.-P. 99-102.

48. Головлева Л.А., Леонтьевский А.А. Лигнинолитическая активность дереворазрушающих грибов // Микробиология. 1998. - Т. 67, № 5. - С. 581587.

49. Srebotnik Е., Jensen К.А., Hammel J., Hammel K.E. Cleavage of nonphenolic lignin structures by laccase in the presence of 1-hydroxybenzotriazole // 7th Intern. Conf. on Biotechn. in the pulp and paper industry. Vancouver, Canada, 1998. P. 195.

50. Карасева Е.И., Гапоник П.Н., Метелица Д.И. Влияние тетразола и его аминопроизводных на кинетику пероксидазного окисления хромогенных субстратов // Биоорг. Хим. 2004. - Т. 30, № 3. - С. 316-323.

51. Chen C.-L., Potthast A., Rosenau T., Gratzl J.S., Kirkman A.G., Nagai D., Miyakoshi T. Laccase-catalyzed oxidation of l-(3,4-dimethoxyphenyl)-l-propene using ABTS as mediator // J. Mol. Catal., В: Enzym. 2000. - Vol. 8, no. 4-6. - P. 213-219.

52. Childs R.E., Bardsley W.G. The steady-state kinetics of peroxidase with 2,2'-azino-di-(3-ethyl-benzthiazoline-6-sulphonic acid) as chromogen // Biochem. J. — 1975.-Vol. 145, no. l.-P. 93-103.

53. Kobayashi S., Uyama H., Kimura S. Enzymatic polymerization // Chem. Rev. -2001.-Vol. 101, no. 12.-P. 3793-3818.

54. Dunford H.B. Horseradish peroxidase structure and kinetic properties // in Peroxidases in chemistry and biology. Vol. 2 / Ed. by Everse J., Everse K.E., Grisham M.B. Boca Raton: CRC Press, 1991. P. 25.

55. Gajhede M. Plant peroxidases: substrate complexes with mechanistic implications // Biochem. Soc. Trans. 2001. - Vol. 29, part 2. - P. 91-99.

56. Sawahata Т., Neal R.A. Horseradish peroxidase-mediated oxidation of phenol // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. - Vol. 109, no. 3. - P. 988-994.

57. Головлева Л.А., Леонтьевский А.А. Биодеградация лигнина // Усп. Микробиол. 1990. - Т. 24. - С. 128-155.

58. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и их роль в жизни растений. М.: Наука, 1996.-47 с.

59. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М.: Высшая школа, 1974. — 216 с.

60. Sederoff R.R., MacKay J.J., Ralf J., Haffield R.D. Unexpected variation in lignin // Curr. Opin. Plant Biol. 1999. - Vol. 2, no. 2. - P. 145-152.

61. Fergus B.J., Goring D.A.I. The location of guaiacyl and syringyl lignins in birch xylem tissue // Holzforschung. 1970. - Vol. 24, no. 4. - P. 113-117.

62. Hardel H.-L., Leary G., Stoll M., Westermark U. Variations in lignin structure in defined morphological parts of birch // Svensk Papperstidn. — 1980. Vol. 83, no. 2.-P. 71-74.

63. Peng F., Westermark U. Distribution of coniferyl alcohol and coniferaldehyde groups in the cell wall of spruce fibers // Holzforschung. 1997. - Vol. 51, no. 6. - P. 531-536.

64. Никитин B.H., Оболенская A.B., Щеголев В.П. Химия древесины и целлюлозы. М.: Лесная промышленность, 1978. — 368 с.

65. Богомолов Б.Д. Химия древесины и основы химии высокомолекулярных соединений. М.: Лесная промышленность, 1973. — 400 с.

66. Леонович А.А., Оболенская А.В. Химия древесины и целлюлозы. М.: Лесная промышленность, 1988. 152 с.

67. Adler Е. Lignin chemistry past, present and future // Wood Sci. Technol. — 1977.-Vol. 11, no. 3.-P. 169-218.

68. Sarkanen S. Template polymerization in lignin biosynthesis // in Lignin and lignan biosynthesis / Ed. by Lewis N.G., Sarkanen S. ACS symp. ser. 697, Washington: ACS, 1998.-P. 194-208.

69. Карманов А.П., Давыдов В.Д., Богомолов Б.Д. Современное состояние проблемы неоднородности природного лигнина // Хим. Древесины. 1982. - № 2.-С. 3-25.

70. Карманов А.П., Монаков Ю.Б. Фрактальная структура bulk и end-wise дегидрополимеров // ВМС, сер. Б. 1995. - Т. 37, № 2. - С. 328-331.

71. Карманов А.П., Беляев В.Ю., Марченко Т.А., Кочева Л.С., Монаков Ю.Б. Топологическая структура макромолекул природного лигнина березы // ВМС, сер. А. 2002. - Т. 44, № 2. - С. 233-238.

72. Кокоревич А.Г., Гравитис Я. А., Озоль-Калнин В.Г. Развитие скейлингового подхода при исследовании надмолекулярной структуры лигнина. Лигнин как фрактальный объект // Хим. Древесины. 1989. - № 1. — С.3-24.

73. Озоль-Калнин В.Г., Кокоревич А.Г., Гравитис Я.А. Оценка фрактальной и химической размерности bulk и end-wise полимеров // Хим. Древесины. 1986. - № 5. - С. 108-109.

74. Карманов А.П. Лигнин. Структурная организация и самоорганизация // Хим. Раст. Сырья. 1999. - № 1. - С. 65-75.

75. Radotic К., Jermic М. Two pathways of lignin synthesis: a comparative study // Iugoslav. Physiol. Pharm. Acta. 1998. - Vol. 34, no. 2. - P. 491-501.

76. Nimz H.H., Ludemann H.D. Carbon 13 nuclear magnetic resonance spectra of lignins: 6. Lignin and DHP acetates // Holzforschung. 1976. - Vol. 30, no. 2. - P. 33-40.

77. Landucci L.L., Ralf S. Biomemetic initiation of lignol dehydropolymerization with metal salts // in Lignin and lignan biosynthesis / Ed. by Lewis N.G., Sarkanen S. ACS symp. ser. 697, Washington: ACS, 1996. P. 149-162.

78. Landucci L.L., Ralf S.A., Hammel K.E. ,3C NMR characterization of guaiacyl, guaiacyl/syringyl and syringyl dehydrogenation polymers // Holzforshung. 1998. -Vol. 52, no. 2.-P. 160-170.

79. Lai Y.-Z., Sarkanen K.V. Structural variation in dehydrogenation polymers of coniferyl alcohol // Cellul. Chem. Technol. 1975. - Vol. 9, no. 3. - P. 239-245.

80. Davin L.B., Wang H.B., Crowell A.L., Bedgar D.L., Martin D.M., Sarkanen S., Lewis N.G. Stereoselective bimolecular phenoxy radical coupling by an auxiliary (dirigent) protein without an active center // Science. 1997. - Vol. 275, no. 5298. -P. 363-366.

81. Davin L.B., Lewis N.G. Dirigent proteins and dirigent sites explain the mystery of specificity of radical precursor coupling in lignan and ligninbiosynthesis // Plant Physiol. 2000. - Vol. 123, no. 2. - P. 453-461.

82. Davin L.B., Lewis N.G. Dirigent phenoxy radical coupling: advances and challenges // Curr. Opin. Biotechnol. 2005. - Vol. 16, no. 4. - P. 398-406.

83. Kim M.K., Jeon J.H., Fujita M, Davin L.B., Lewis N.G. The western red cedar {Thuja plicata) 8-8' dirigent family displays diverse expression patterns andconserved monolignol coupling specificity // Plant. Mol. Biol. 2002. - Vol. 49, no. 2.-C. 199-214.

84. Halls S.C., Lewis N.G. Secondary and quaternary structures of the (+)-pinoresinol-forming dirigent protein // Biochemistry. 2002. - Vol. 41, no. 30. - P. 9455-9461.

85. Halls S.C., Davin L.B., Kramer D.M., Lewis N.G. Kinetic study of coniferyl alcohol radical binding to the (+)-pinoresinol forming dirigent protein // Biochemistry. 2004. - Vol. 43, no. 9. - P. 2587-2595.

86. Hatfield R., Vermerris W. Lignin formation in plants. The dilemma of linkage specificity//Plant Physiol. -2001. -Vol. 126, no. 4.-P. 1351-1357.

87. Uyama H., Kobayashi S. Enzyme-catalyzed polymerisation to functional polymers //J. Mol. Catal., B: Enzym. 2002. - Vol. 19-20. - P. 117-127.

88. Iwahara K., Honda Y., Watanabe T., Kuwahara M. Polymerization of guaiacol by lignin-degrading manganese peroxidase from Bjerkandera adusta in aqueous organic solvents // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. - Vol. 54, no. 1. - P. 104111.

89. Dubey S., Singh D., Misra R.A. Enzymatic synthesis and various properties of poly(catechol) // Enzyme Microb. Technol. 1998. - Vol. 23, no. 7. - P. 432-437.

90. Fukuoka T., Uyama H., Kobayashi S. Effect of phenolic monomer structure of precursor polymers in oxidative coupling of enzymatically synthesized polyphenols // Macromolecules. 2004. - Vol. 37, no. 16. - P. 5911-5915.

91. Sahoo S.K., Liu W., Samuelson A., Kumar J., Cholli A.L. Biocatalytic polymerization of p-cresol: an in situ NMR approach to understand the coupling mechanism // Macromolecules. 2002. - Vol. 35, no. 27. - P. 9990-9998.

92. Uyama H., Kurioka H., Kobayashi S. Preparation of polyphenol particles by peroxidase-catalyzed dispersion polymerization // Colloids Surf. — 1999. — Vol. 153, no. l.-P. 189-194.

93. Ikeda R., Uyama H., Kobayashi S. Novel synthetic pathway to a poly(phenylene oxide). Laccase-catalyzed oxidative polymerization of syringic acid // Macromolecules. 1996. - Vol. 29, no. 8. - P. 3053-3054.

94. Saito K., Tago T., Masuyama T., Nishide H. Oxidative polymerization of 2,6-dimethylphenol to form poly(2,6-dimethyl-l,4-phenylenoxide) in water // Angew. Chem. Int. Edit. 2004. - Vol. 43, no. 6. - P. 730-733.

95. Ikeda R., Sugihara J., Uyama H., Kobayashi S. Enzymatic oxidative polymerization of 2,6-dimethylphenol // Macromolecules. — 1996. — Vol. 29, no. 27. -P. 8702-8705.

96. Kobayashi S., Higashimura H. Oxidative polymerization of phenols revisited // Prog. Polym. Sci. 2003. - Vol. 28, no. 6. - P. 1015-1048.

97. Uyama H., Maruichi N., Tonami H., Kobayashi S. Peroxidase-catalyzed oxidative polymerization of bisphenols // Biomacromolecules. 2002. - Vol. 3, no. l.-P. 187-193.

98. Uyama H., Kobayashi S. Enzymatic synthesis of polyphenols // Curr. Org. Chem.-2003.-Vol. 7, no. 13.-P. 1387-1397.

99. Mejias L., Reihmann M.H., Sepulveda-Boza S., Ritter H. New polymers from natural phenols using horseradish or soybean peroxidases // Macromol. Biosci. -2002.-Vol. 2, no. l.-P. 24.

100. Kurisawa M., Chung J.E., Uyama H., Kobayashi S. Enzymatic synthesis and antioxidant properties of poly(rutin) // Biomacromolecules. 2003. - Vol. 4, no. 5. — P. 1394-1399.

101. Tonami H., Uyama H., Kobayashi S., Reihmann M. Enzymatic polymerization of m-substituted phenols in the presence of 2,6-di-o-melhyl-/?-cyclodextrin in water // e-Polymers. 2002. - No. 3. - P. 1-7.

102. Ayyagari M.S.R., Kaplan D.L., Chatterjee S. Solvent effects in horseradish peroxidase-catalyzed polyphenol synthesis // Enzyme Microb. Technol. — 2002. — Vol. 30, no. l.-P. 3-9.

103. Klibanov A.M. Improving enzymes by using them in organic solvents // Nature. 2001. - Vol. 409, no. 6817. - P. 241 -246.

104. Sarma R., Alva K.S., Marx K.A., Tripathy S.K., Akkara J.A., Kaplan D.L. Enzymatic polymerisation of amphiphilic alkyl tyrosine derivatives from emulsions // Mater. Sci. Eng. 1996. - Vol. 4, no. 3. - P. 189-192.

105. Tonami H., Uyama H., Kobayashi S. Chemoselective oxidative polymerization of m-ethynylphenol by peroxidase catalyst to a new reactive polythenol // Biomacromolecules. 2000. - Vol. 1, no. 2. - P. 149-151.

106. Liu W., Cholli A.L., Kumar J., Tripathy S. Mechanistic study of the peroxidase-catalyzed polymerization of sulfonated phenol // Macromolecules. — 2001. Vol. 34, no. 11. - P. 3522-3526.

107. Singh A., Kaplan D.L. Enzyme-based vinyl polymerization // J. Polym. Environ. 2002. - Vol. 10, no. 3.-P. 85-91.

108. Singh A., Kaplan D.L. In vitro enzyme-induced vinyl polymerization // Adv. Polym. Sci. 2006. - Vol. 194. - P. 211-224.

109. Iwahara K., Hirata M., Honda Y., Watanabe T., Kuwahara M. Free-radical polymerization of acrylamide by manganese peroxidase produced by the white-rot basidiomycete Bjerkandera adusta // Biotechnol. Lett. — 2000. Vol. 22, no. 17. — P. 1355-1361.

110. Durand A., Lalot T., Brigodiot M., Marechal E. Enzyme-mediated initiation of acrylamide polymerization: reaction mechanism // Polymer. 2000. - Vol. 41, no. 23.-P. 8183-8192.

111. Durand A., Lalot T., Brigodiot M., Marechal E. Enzyme-mediated initiation of acrylamide polymerization: main characteristics of molecular weight control // Polymer.-2001.-Vol. 42, no. 13.-P. 5515-5521.

112. Kalra B., Gross R.A. HRP-mediated polymerization of acrylamide and sodium acrylate // Green Chem. 2002. - Vol. 4, no. 2. - P. 174-178.

113. Ikeda R., Tanaka H., Uyama H., Kobayashi S. Laccase-catalyzed polymerization of acrylamide // Macromol. Rapid Commun. — 1998. — Vol. 19, no. 8. -P. 423-425.

114. Milstein O., Huttermann A., Frund R., Ludemann H.-D. Enzymatic co-polymerization of lignin with low-molecular mass compounds // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. - Vol. 40, no. 5. - P. 760-767.

115. Wang X., Schreuder-Gibson H., Downey M., Tripathy S., Samuelson L. Conductive fibers from enzymatically synthesized polyaniline // Synth. Met. 1999. -Vol. 107, no. 2.-P. 117-121.

116. Liu W., Anagnostopoulos A., Bruno F.F., Senecal K., Kumar J., Tripathy S., Samuelson L. Biologically derived water soluble conducting polyaniline // Synth. Met. 1999.-Vol. 101, no. 1-3.-P. 738-741.

117. Jin Z., Su Y., Duan Y. A novel method for polyaniline synthesis with the immobilized horseradish peroxidase enzyme // Synth. Met. 2001. - Vol. 122, no. 2. -P. 237-242.

118. Karamyshev A.V., Shleev S.V., Koroleva O.V., Yaropolov A.I., Sakharov I.Yu. Laccase-catalyzed synthesis of conducting polyaniline // Enzyme Microb. Technol. 2003. - Vol. 33, no. 5. - P. 556-564.

119. Sakharov I.Y., Vorobiev A.C., Leon J.J.C. Synthesis of polyelectrolyte complexes of polyaniline and sulfonated polystyrene by palm tree peroxidase // Enzyme Microb. Technol. 2003. - Vol. 33, no. 5. - P. 661-667.

120. Nabid M.R., Entezami A.A. Enzymatic synthesis and characterization of a water-soluble, conducting poly(o-toluidine) // Eur. Polym. J. 2003. - Vol. 39, no. 6. -P. 1169-1175.

121. Samuelson L., Liu W., Nagarajan R., Kumar J., Bruno F.F., Cholli A., Tripathy S. Nanoreactors for the enzymatic synthesis of conducting polyaniline // Synth. Met. -2001.-Vol. 119. no. 1-3.-P. 271-272.

122. Nabid M.R, EntezamiA.A. A novel method for synthesis of water-soluble polypyiTole with horseradish peroxidase enzyme // J. Appl. Polym. Sci. 2004. -Vol. 94, no. l.-P. 254-258.

123. Song H.-K., Palmore G.T.R. Conductive polypyrrole via enzyme catalysis // J. Phys. Chem.- 2005. -Vol. 109, no. 41.-P. 19278-19287.

124. Гиндилис A.JI. Физико-химические закономерности катализа лакказой из различных источников. Автореф. дисс. канд. хим. наук. М., 1988. 28 с.

125. Devar V.J.S., Zoebisch E.G., Healy E.F., Stewart J.J.P. AMI: a new general purpose quantum mechanical molecular model // J. Am. Chem. Soc. — 1985. — Vol. 107, no. 13.-P. 3902-3909.

126. Booth H., Saunders B.C. Studies in peroxidase action. Part X. The oxidation of phenols // J. Chem. Soc. 1956. - No 4. - P. 940-948.

127. Lindgren B.O. Dehydrogenation of phenols. II Dehydrogenation polymers from guaiacol // Acta Chem. Scand. 1960. - Vol. 14, no. 10. - P. 2089-2096.

128. Наканиси К. Инфракрасные спектры и строение органических соединений. М.: Мир, 1965. 216 с.

129. Spanget-Larsen J., Chen E., Shim I. Why is l,6,6aA,4-trithiapentalene colored? // J. Am. Chem. Soc. 1994. - Vol. 116, no. 25. - P. 11433-11435.

130. Gonzales-Lafont A., Lluch J.M., Bertan J., Marquet J. Exited states and electronic spectra of monosubstituted benzenes. An AMI study // Spectrochim. Acta., A. 1988. - Vol. 44, no. 12. - P. 1427-1434.

131. Стрельский В.А. Пероксидазное окисление лигнина и его модельных соединений. Автореф. дисс. канд. хим. наук. Ленинград, 1986. 18 с.

132. Рогинский В.А. Фенольные антиоксид анты. М.: Наука, 1988. 247 с.

133. Armstrong D.R., Cameron С., Nonhebel D.C., Perkins P.G. Oxidative coupling of phenols //J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2. 1983. - No. 5. - P. 563-591.

134. Худяков В.И., Левин П.П., Кузьмин В.А. Обратимая рекомбинация радикалов // Усп. Хим. 1980. - Т. 49, № 10. - С. 1990-2031.

135. Zahradnik R., Carsky P. Physical properties and reactivity of radicals // Prog. Phys. Org. Chem. 1978. - No. 10. - P. 374-380.

136. Калабин Г.А., Каницкая JT.В., Кушнарев Д.Ф. Количественная спектроскопия ЯМР природного органического сырья и продуктов его переработки. М.: Химия, 2000. -408 с.

137. Ward G., Hadar Y., Bilkis I., Konstantinovsky L., Dosoretz C. Initial steps of ferulic acid polymerisation by lignin peroxidase // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276, no. 22.-P. 18734-18741.

138. Ralph J., Quideau S., Graber J.H., Hatfield R.D. Identification and synthesis of new ferulic acid dehydrodimers present in grass cell walls // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1,- 1994.-Vol. l,no. 23.-P. 3485-3498.

139. Wallace G., Fry S.C. In vitro peroxidase-catalysed oxidation of ferulic acid esters // Phytochemistry. 1995. - Vol. 39, no. 6. - P. 1293-1299.

140. Tatsumi K., Freyer A., Minard R., Bollag J.-M. Enzyme-mediated coupling of 3,4-dichloroaniline and ferulic acid: a model for pollutant binding to humic materials // Environ. Sci. Technol. 1994. - Vol. 28, no. 2. - P. 210-215.

141. Larsen E., Andreasen M.F., Christensen L.P. Regioselective dimerization of ferulic acid in a micellar solution // J. Agric. Food Chem. — 2001. Vol. 49, no. 7. — P. 3471-3475.

142. Белами Л. Инфракрасные спектры сложных молекул. М.: Изд. иностранной литературы, 1963.- 590 с.

143. Андерсонс Б.А., Гравитис Я.А., Эриньш П.П. Исследование макромолекулярных моделей лигнина, полученных из феруловой кислоты // ХПС. 1980. - № 2. - С. 239-245.

144. Домбург Г.Э., Шарапова Т.Е. Процесс образования промежуточных структур при термических превращениях лигнинов // Хим. Древесины. 1978. — № 3. - С. 31-52.

145. Zhang R., Kulkarni К.A., Kulkarni А.Р. Oxidation of eugenol by human term placental peroxidase // Placenta. 2000. - Vol. 21, no. 2. - P. 234-240.

146. Краткая химическая энциклопедия. Т. 5. М.: Советская энциклопедия, 1967.-С. 913.

147. Fujisawa S., Kadoma Y. Action of eugenol as a retarder against polymerization of methyl methacrylate by benzoyl peroxide // Biomaterials. 1997. - Vol. 18, no. 9. -P. 701-703.

148. Ciszewski A., Milczarek G. Preparation and general properties of chemically modified electrodes based on electrosynthesized thin polymeric films derived from eugenol // Electroanalysis. 2001. - Vol. 13, no. 10. - P. 860-867.

149. Thompson D., Norbeck K., Olsson L.-I., Constantin-Teodosiu D., Van der Zee J., Moldeus P. Peroxidase-catalyzed oxidation of eugenol: formation of a cytotoxic matabolite(s) // J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264, no. 2. - P. 1016-1021.

150. Satoh K., Sakagami H., Yokoe I., Kochi M., Fujisawa S. Interaction between eugenol-related compounds and radicals // Anticancer Res. 1998. - Vol. 18, no. 1. — P. 425-428.

151. Atsumi Т., Fujisawa S., Satoh K., Sakagami H., Iwakura I., Uehai Т., Sugita Y., Yokoe I. Cytotoxicity and radical intensity of eugenol, isoeugenol or related dimer // Anticancer Res. 2000. - Vol. 20, no. 4. - P. 2519-2524.

152. Bland D.E. Eugenol lignin: its chemical properties and significance // Biochem. J. 1961. - Vol. 81, no. 1. - P. 23-28.

153. Stafford H.A. Differences between lignin-like polymers formed by peroxidation of eugenol and ferulic acid in leaf sections of Phleum // Plant Physiol. — 1960.-Vol. 35, no. l.-P. 108-114.

154. Have R., Thouars R.G., Swarts H.J., Field J.A. Veratryl alcohol-mediated oxidation of isoeugenyl acetate by lignin peroxidase // Eur. J. Biochem. 1999. -Vol. 265, no. 3.-P. 1008-1014.

155. Furukawa H., Wieser M., Morita H., Sugio Т., Nagasawa T. Purification and characterization of eugenol dehydrogenase from Pseudomonas fluorescens El 18 II Arch. Microbiol.- 1998.-Vol. 171, no. l.-P. 37-43.

156. Тарабанько В.Е., Петухов Д.В. Исследование механизма и усовершенствование процесса окислительного расщепления лигнинов в ароматические альдегиды // Хим. интерес, уст. разв. 2003. — № 4. - С. 645-657.

157. Тарабанько В.Е. Механизм окислительного расщепления лигнинов в ароматические альдегиды // II Всеросс. конф. Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья. Барнаул, 2005. С. 91-95.

158. Николаева Н.А., Чупка Э.И., Никитин В.М. Окислительные превращения лигнина и его модельных соединений при щелочных обработках // Хим. Древесины. 1974.-№2.-С. 76-81.

159. Крошилова Т.М., Чупка Э.И., Никитин В.М. Исследование группового состава щелоков натронной и натронно-кислородной варок гваяцилпропанола-1 и изоэвгенола // Хим. Древесины. 1976. - № 2. - С. 58-65.

160. Добеле Г.В., Скрипченко Т.Н., Домбург Г.Э., Лиепиныи М.Г., Осадшая Т.Н. Основной продукт термообработки гваяцилпропанола-1 в присутствии фосфорной и борной кислот // Хим. Древесины. 1988. - № 1. - С. 83-86.

161. Ralph J., Brunow G., Boerjan W. Lignins // in Encyclopedia of life science / Ed. by Rose F., Osborne K. Chichester, UK: John Wiley and Sons, Ltd., 2007. P. 110.

162. Yarolopolov A.I., Skorobogatko O.V., Vartanov S.S., Varfolomeyev S.D. Laccase. Properties, catalytic mechanism, and applicability // Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. - Vol. 49, no. 2. - P. 257-284.

163. Тимонов A.M., Васильева C.B. Электронная проводимость полимерных соединений // Soros Educational J. 2000. - № 3. - С. 33-40.

164. Gossauer A. Die Chemie der Purrole. Berlin: Springer Verlag, 1974. 433 s.

165. Jones R.A., Bean G.P. The chemistry of pyrroles. London: Acad. Press, 1977. -525 p.

166. Handbook of Conducting Polymers / Ed. by Skotheim T.A., Elsenbaumer R.L., Reynolds J.R. New York: Marcel Dekker Ink., 1998. 1097 p.

167. Верницкая Т.В., Ефимов О.Н. Полипиррол как представитель класса проводящих полимеров (синтез, свойства, приложения) // Усп. Хим. 1997. - Т. 66, №5.-С. 489-505.

168. Jesus М.С., Fu Y., Weiss R.A. Conductive polymer blends prepared by in situ polymerization of pyrrole: a review // Polym. Eng. Sci. — 1997. — Vol. 37, no. 12. — P. 1936-1943.

169. Wang L.-X., Li X.-G., Yang Y.-L. Preparation, properties and applications of polypyrroles // React. Funct. Polym. 2001. - Vol. 47, no. 2. - P. 125-139.

170. Genoud F., Guglielmi M., Nechtschein M. ESR study of electrochemical doping in the conducting polymer polypyrrole // Phys. Rev. Lett. 1985. - Vol. 55, no. l.-P. 118-121.

171. Shen Y., Wan M. In situ doping polymerization of pyrrole with sulfonic acid as a dopant // Synth. Metals. 1998. - Vol. 96, no. 2. - P. 127-132.

172. Omastova M., Trchova M., Pionteck J., Prokes J., Stejskal J. Effect of polymerization conditions on the properties of polypyrrole prepared in the presence of sodium bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate // Synth. Met. 2004. - Vol. 143, no. 2. -P. 153-161.

173. Cruz A.G.B., Wardell J.L., Rocco A.M. A novel material obtained by electropolymerization of polypyrrole doped with Sn(dmit)3. , [tris(l,3-dithiole-2-thione-4,5-dithiolato)-stannate]2- // Synth. Met. 2006. - Vol. 156, no. 5. - P. 396404.

174. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randal R.J. Protein measurements with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193, no. 1. - P. 265275.

175. Wu T.-M., Lin S.-H. Characterization and electrical properties of polypyrrole/multi-walled carbone nanotube composites synthesized by in situ chemical oxidative polymerization // J. Polym. Sci., B: Polym. Phys. 2006. - Vol. 44, no. 10.-P. 1413-1418.

176. Ralph, S.A., Ralph J., Landucci L. NMR database of lignin and cell wall model compounds. 2004. Available at http://ars.usda.gov/services/.