Высокоэффективная жидкостная хроматография пептидолейкотриенов и фосфонопептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

HAU ЮНА ЛЬНА АКАДЕМ 1Я НАУК УКРА1НИ 1НСШГУТ Б100РГАШЧН01 XIM1I ТА НАФТ0Х1М11 HAH УКРА1НИ

Р Г Б ОД

•• Г vг. (.'

На правах рукопису

БСЛ1К МИХАИЛО ЮР1ИОВИЧ

ВИСОКОЕФЕКТИВНА Р1ДИННА ХРОМАТОГРАФIЯ ПЕПТИДОЛЕЙКОТРИеН1В

ТА ФОСФОНОПЕПТИД1В

02.00.10 - б1оорган1чна х1м1я, х!м1я природних та ф!з1олог1чно активних речовин

АВТОРЕФЕРАТ дисертацП на здобуття наукового ступеня кандидита х!м1чних наук

Ки1в - 1994

Дисертац1ею е рукопис.

РскЗота виконана в 1нститут1 <51оорган1чно1 х1м1Х та нафтох1м1Х HAH УкраХни

Пауков1 кер1вники:

академ1к HAH УкраХни, доктор х1м1чних наук В. П. Кухар

кандидат х1м1чних наук С. В. Галушко

0ф1ц1йн1 опоненти:

доктор х1м1чних наук, професор

С. Б. Серебряний

кандидат х1м1чких наук С. В. Сур

Пров1дна оргая1эац1я: ¡нститут колоХдно! xlMl1 та xlMll води 1м. А. В. Думанського HAH УкраХни

Захист в1дбудеться «Я- » Об 1994 р. на эас1данн1 спец1ал1зовано! вченоХ ради Л 01S.65.01 в Хнститут! <Иоорган1чно1 xlMll та нафтох1м1Х HAH УкраХни (253094 КиХв, вул. Мурманська, 1).

3 дисертац1ею можна ознайомитись у <31бл1отец1 1нституту б1сорган!чно1 xlMll та нафтох1м!Х HAH УкраХни (253094 КиХв, вул. Мурманська, 1).

Автореферат роэ1сланий « /?» -_1994 р,

Вчений секретар уь /ч

спец!ал1эованоХ вченоХ ради ' д. м. Федоряк

ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальн1сть. Пептидолейкотриени е основними продуктами 5-л!покси-геназного метабол!зму арахидоново! кислоти. Вони мають високу 6Ю-х!м1чну активн1сть, пов'зан! з розвиненням ряду патолоПй та зараз 1нтенсивно досл!джуються. В1дкриття, встансвлення будови цих сполук та 1х х!м!чний синтез стали можлив! т1льки тод!, коли до помирено! експериментально! практики ув1йшли методи високоефективно! р1динно! хроматограф!I (ВЕРХ). Реакц!йна сум!ш при синтез1 лейко-триен1в вм1щуе дек1лька десятк1в поб!чних продукт!в, ! метод ВЕРХ, в тепер1шн1й час, е единим препаративном методом вид1лення цих сполук. 0птимальн1 умови проведения синтезу суттево п1двиаують ви-х1д к1нцевих продукт!в, але зараз в!дсутн! методи що дозеоляють оперативно анал!зувати багатокомпонентн1 сум!ш1 при синтез! лейкотриен1в. В б!олог!чних системах лейкотриени знаходяться в ультрамалих концентрац!ях, у зв'язку з чим необх!дн1 над1йн1, селективн1 та високочутлив1 методики детектування цих сполук. В1домост1 про хроматограф!чн! властивост1 лейкотриен1в, вплив типу нерухомо! та склад рухомо! фаз обмежен!, а дан1, ко е в л1терату-р1 говорять про те, що проблема усп!шного хроматографування метабол1т!в арах!доново! кислоти е дуже складною.

Ам!нофосфонов1 кислоти та пептиди, ко 1х вм!цують - нова трупа ц!кавих сполук, як! мають антибактер1альн!, протипухлинн! та герб!цидн! властивост!. Особливо ц1каво отримання та досл1дження 1ндив!дуальних стерео!зомер!в оск1льки е1домо, цо б!ох1м!чн! властивост! стерео!зомер!в в!др!знявться. В!домост1 про викорис-тання хроматограф!чних метод!в в синтез1 ам!нофосфонових кислот (АФк) та фосфонопептид!в (ФП) дуже обмежен1, Високоефективна р!динна хроматограф!я дозволяе вир!шити проблеми анал!зу та розд!лення ам!нофосфонових кислот, дозволяе отримувати фосфонопеп-тиди та ам!нофосфонов1 кислоти високо! !зомерно! чистоти.

Обидва класи сполук досл!джуються протягом останнього часу у лаборатор!! тонкого орган1чного синтезу 1Б0НХ АН УкраХни. Анал!з продукт!в синтезу цих сполук, розд!лення, визначення чистоти 1 детектування у Й1олог1чних системах, так само як 1 реал1зац1я самих синтез1в, стали можлив1 т!льки завдяки застосуванню хроматограф!чних метод1в, та в першу чергу ВЕРХ. Це й виэначило виб1р мети ц!е! роботи.

Мета роботи. Метою ц!е! роботи було досл1дження впливу будови сполук, складу рухомо! фази на утримання та селективи!сть 1х

розд!лення за умов високоефективно! р1динно! хроматограф!I на полярних, Пдрофобних та 1 онообм!нних сорбентах,* роэробка метод 1 в розд!лення та анал1зу лейкотриен1в та пром!жних продукт1в Хх синтезу; розробка метод1в розд1лення та анал!зу стерео1зомер1в ам1нофосфонових кислот та фосфонопептид!в.

Наукова новизна. Досл1джен1 законом!рност! хроматограф!чно! пове-д!нки пептидолейкотриен1в в умовах обернено-фазовоКОФ) та ! онообм! нно К 10) ВЕРХ; досл1джен1 особливост1 роэд1лення д1астереоме-р1в фосфонопептид!в на полярних, Пдрофобних та 1онообм!нних сорбентах; при застосуванн1 реакцП ам!нофосфонових кислот з ортофта-левим альдег1дом та м-ацетил-1гцисте1ном отриман! д1астереомерн1 пох1дн1 1зо!ндолу та вивчена 1х взаемод!я з Пдрофобними 1 1онообм!нними сорбентами.

Практична Шнн1сть. Знайден1 оптимальн1 умови хроматограф!чного розд1лу пептидолейкотриен1в, д1астереомер!в фосфонопептид!в та 1зо!ндольних пох1дних ам!нофосфонових кислот; розроблен1 експресн1 методи контролю синтезу лейкотриен1в; розроблен1 методи препаративного вид1лення пептидолейкотриен!в та пром1жних продукт!в 1х синтезу, що дозволяють отримувати 1х з високим ступеней очиаення. Розроблен! високочутлив! методи анал1зу лейкотри-ену С4 у б!ох!м1чних об'ектах; розроблен! методи контролю д1а-стереомерного та енантЮмерного складу фосфонопептид!в та ам!нофосфонових кислот; розроблен1 методи контролю ферментативного розщеплення рацемат1в ам!нофосфонових кислот;

На захист виносяться:

- законом!рност1 впливу зм1сту рухомо! фази на утримання та селективн1сть розд1лу пептидолейкотриен1в, пром1жних продукт!в 1х синтезу, фссфонопептид!в та !зо!ндольних пох!дних ам!нофосфонових кислот;

- результата визначення термодинам1чних параметр!в утримання та селективност1 розд!лу пептидолейкотриен1в, пром!жних 1 поб!чних продукт!в 1х синтезу, д!астереомер!в 1эо!ндольних пох1дних ам1нофосфонових кислот та фосфонопептид!в на полярних, г!дрофобних та 1онообм1нних сорбентах;

- методи отримання 1зо!ндольних пох1дних ам1нофосфонових кислот та анал1д 1х енант!омерного складу при використанн1 високоефективно! р1динно! хроматограф!I;

- методи розд1лення д!астер1омер1в в1льних та захинених $осйонопептид1в за допомогою нормально-фазово! (НФ), обернено-

■1

фазовоX та 1онообм1нно! високоефективно! р1динно! хроматограф! ! ;

методи контролю ферментативного розщеплення рацемат!в ам1нофосфонових кислот за допомогою обернено-фазоьо! та !онообм1нно! високоефективно! р!динно! хроматограф!ï;

- методи контролю синтезу лейкотриен!в та пром!жних сполук, а такох методи 1х препаративного вид1лення за допомогою обернено-фазово! та 1онообм1нно! високоефективно! р1динно! хроматограф!I ;

- методи визначення лейкотриену С4 у б!олог1чних пробах за допомогою обернено-фазово! та 1онообм!нно! високоефективно! р!динно! хроматограф!I.

АпробаЩя робота. Результати проведених досл1джень допов1далися на конференцП з б!оорган!чно! xlMiï 1нституту б1оорган!чно! xlMlï АН УРСР (1989), IV Всесоюзн!й конференцП "Синтез и исследование простагландинов" (М1нськ 1989), Y Всесоюзному скмпоз1ум1 з молекулярно! р1динно! хроматограф!! (Рига 1990), 18 Шжнародному симпоз!ум1 з хроматограф!! (Амстердам 1990), 8 Шжнародному симпоз1ум! з хроматограф!ï Придунайських кра!н (Варшава 1991), Шжнародному симпоз1ум! з анал!зу пептид!в (Стокгольм 1993). Об*ем та структура роботи. Дисертац1я складаеться з вступу, огляду л!тератури, обгогорення результат!в, експериментально! частини, висновк1в, списка л1тератури, додатку. Робота викладена на 158 стор!нках машинописного тексту, мае 41 малюнок та 22 таблиц1.

Хроматограф!я лейкотриен!в. * Обернено-фазова високоефективна р!динна хроматограф!я лейко-трцен!в. В умовах ОФ ВЕРХ на октадецильних, октальному та бутильному сорбентах вивчалось утримання та селективШсть розд1лу

*ВЕРХ - високоефективна р1динна хроматограф!я5 ОФ, НФ, 10 -обернено-фаэовий, нормально-фазовий, !онообм!нний (стосовно до хроматограф!!)! ьтс4, ltd4, lte4- лейкотриени с4, d4, е4; lta4-«q, ьтс4-ме, НЕТЕ-Ме - метилов! еф1ри лейкотриен1в а4, о4, 5,0-диПдроксиекозатетраеново! кислоти; gsh - в!дноьленний глутат1он; gssq - окислений глутат!он; для позначення ам1ноалк1лфосфонових, ам1ноалк1лфосф1ново!, ам!ноалк1 лфосфонЮто! кислот застосовуються позначення ам1нокарбоново! кислоти з 1ндексами "Р", "PPh", MPH"j АФк - ам!нофосфонова кислота, ФП - фосфонопептид.

наступних сполук - метил 8- $opMin-5S,6S- епокси-7Е-сктаеноата(1), метил 5з,вз-епокси-11-оксо-7,9-ундекад1еноата(ii), метил 5S, Bs-en0Kcii-13-0KC0-7,9,11-тридекатриеноата( iii), lta^-Me (iv), i/tc4-me(v), ltc4(vi), нете-ме (vii), gsh(viii), gssg(ix), iffd^x), lte^(xi). Логарифм коефШенту утримання сполук л1н!йно зменшу-еться при эб1льшенн1 концентрацП метанолу в елюент1. У рамхах сольвофобно! теорП утримання сполук на Пдрофобних поверхнях, був отриманий ряд параметр i в взаемодП сорбат1в з г!дрофобною поверхнею сорбент1в. Один з важлив1ших параметр! в - площина взаемодП сорбата з поверхнею сорбента. Площина г1дрофобного контакту пептидолейкотриен!в у значному ступен1 залегать в1д г1дрофобност1 поверхн! i у ряду ltc4, ltd4> lte4 зм!нюеться незначно (Таб.1). Де може бути св1доцтвом того, то з поверхнею взаемод1ють однакоЫ для ес1х лейкотриен!в д!лянки молекул.

Таблиця 1. Параметри взаемодП пептидолейкотриен!в з г1дро-фобними сорбентами.

MaTepi ал ДА HM 2

Ultropao 0DS-120T Lichrosorb RP-18 Lichrosorb RP-8 Nucleosil C4 LTC. LTD. LTE, 4 4 4 2.44 2.13 1 .99 1.23 1.26 1.36 1.62 1.55 1.36 0.76 0.89 1.0

При переход1 в!д ьтл4-ме(1У) до ьтс4~ме(У) зм!нення площини Пдрофобного контакту з поверхнею на 0.75 нм2е величина, що приблизно дор1внюе плоцию контакту з поверхнею глутат1ону (0.93 нм2). Можна припустити, що вуглеводневий 1 пептидний блоки не эазнають значних конформаЩйних зм1н при утворенн! ътс4-Ме 1 це приводить до адитивност1 площин контакт1в фрагмент1в з поверхнею. При .переход1 в!д ьтс4~Ме(V) до ьтс.(VI) д1ется зменшення площини Пдрофобного контакту на 0.21 нм , насл1дком чого е те, що селектиыасть розд!лу ц1е! пари сполук, а також ьтл4-Ме та ьтс4-Ме (V), п1двищуеться при п!двищенн1 концентрацП метанолу в елюент1, тобто при зменшенн1 утримання. НаявнЮть у ьтс4 1 ьтс4-Ме значно б1льшо! площини г1дрофобного контакту пор1вняно з ьтл4-ме та НЕТЕ-Ме (на 0.5 - 0.8 нм2) приводить нас це до одного висновку - спостер1гаеться явище коли приеднання г1дроф1льного пептидного фрагменту не приводить до зменшення взаемодП сорбату з г1дрофобною поверхнею, як цього сл1д було б оч!кувати, а навпаки зб!льшуе' його. Дом1нуючими факторами в цьому випадку е склад

■1

елюента I ор!ентаи1я молекули в1дносно поверхШ сорбенту.

Вельми важливою характеристикою хроматограф!чного процесу е селективн1сть роэд1лу компонент!в. Для вивчених сорбент!в, при використанн1 елюент1в з рН~7, порядок виходу лейкотриен1в - 1/го4,< ltd^, < l/ГЕд залишаеться пост1йним i не залежить в!д використаного сорбенту. При використанн1 елюент!в э рН <2.45 порядок елюювання лейкотриен!» залишаеться таким самим як при рН 7, але на сорбент! uitropao ods 120т посл1довн1сть елюювання зм1нюеться (ltd4< ltc4 < lte4).

Пор1внюючи залежност1 утримання ы?с4-ме та ltg4> ложна зробити висновок, що Шдвищення к' в 1нтервал1 рН 7.3 - 4.8 для 1Л*а4 пов'язане з наявн!стю карбоксильной групи вуглеводневого фрагменту, рК яко! буде у меж! 8-7. Для ьто4~ме е дв1 д1лянки, дэ рН не впливае на утримання: 5.6-7.5 та 3.8-5.4. Перегин на д1лянц! рН 5.4-5.0 дозволяе визначити рКа карбоксильно! групи гл!иинового фрагменту р1вним 5.5. Значне зб!льшення утримання при рН<4.5 св1дчить про перех1д а-карбоксильно! групи глутам1нового фрагменту у не!он1зований стан. На мал. 1 приведен! залежност1 k'=í(pH) для сорбента Separon sgx 018 при BMícTi метанолу в елюент! 65 та 70%, Як видно, вони значно в!др!зняються, а д!лянка рН оптимального розд1лу лейкотриен!в значно зрушуеться нав1ть при невелик1й зм1н! вм!сту орган!чного компоненту в елюент!.

При зм1н! конаентрацН !он1в водню в елюент! можна визначити термодинам! чне зм1нення енерг11 сорбцИ молекул сорбату, що знаходяться у р1зних ступенях !он!зац!1: A(üc¡ee Ь-ютто^/к^ ), де к0 та к. - коеф!ц!енти утримання р!зних 1он!эованих форм сорбату. Значения к0 та к визначали при рН 1.8 та 7, в!дпов!дно. Результати розрахунк!в приведен! у таблиц! г. '

Таблиця 2.

Зм!на енерг!! сорб-ц11 пептидолейкотрие-н1в при зм1н1 ступеня 1он1эац11.

Як ми бачимо, зменшення концентрат! метанолу на 10% веде до зм1ни р!зниц1 енерг!! сорбц!! в середньому на 1.1 кДж/моль.

Сорбент -Д(ДО), кДж/моль

Lichrosorb ЕР-8 70% МеОН Nuoleosil 0. 4 60% МеОН LTO4 LTD. 4 LTE4

4,71 3.42 3.97 2.87 2.41 1 .54

К'

j i 1 1 1 1 1 1 i 1 1 1 i 1 1

l\ 1 ! | \ I 1 1 \ i Q 1 i 1 \ 1 \ 1 i 1 \ I \ 1 1

■ \ 1 \ 1 \\Д

■

б

рн

-4- 2 о

-в- 4 б 0

Малюнок 1. Вплив рН рухомо! фази на утримання пептидолейкотриен1в. •

Колонка 3.3x150 мм, Separon sox С18, 5 мкм; рухома фаза: водний розчин 0.01 М н3ро4, 0.01 м (nh4)2so4 нейтрал1зований ам1аком, метанол у концентрат 1 655« об. та 7058 об.

Сполуки: 1 -ИГС4 (70$ об. МеОН), 2 - ИИ>4 (70$ Об. МвОН), 3 - LTE4 (70$ об. МеОН), 4 -1/ГС^ (65$ об. МеОН), 5 - ЬТР4 (65$ об. МеОН), 6 - ИГЕ. (65$ об. МеОН).

Эменшення i(AQee) у ряду LT04, ltd^, хде4 мохе бути пояснено зменшенням дипольних момент 1 в пептидолейкотриен!в. Шдвищення концентрацП 1он1в водно в рухом!й фаз! значно зменшуе селективн1сть розд1лення пептидолейкотриен1в, до в деякшс випадках мае позитчьну роль. Найб1лыи повно перевага зниження селективност1 роэд1лу лейкотриен1в виявляеться при використанн1 високоефективних колонок, наприклад uitropao 0DS-120T, та елюент1в з рН < 3. В цьому випадку пептидолейкотриени елюються компактною групою, так що в1дпадае необх!дн1сть в застосуванн1 град!ентного елюювання.

Луже актуальною проблемою в ОФ ВЕРХ лейкотриен!в е ефектив-н1сть хроматограф!чного процесу. В пор1внянн! з нейтральними елюентами, ефективн1сть хроматографування пептидолейкотриенi в у кислих елюентах значно Шдвищуеться для ycix сорбент!в, окр1м Ыо-hroeorb КР-18. Так Neff зб1льшуеться у 1.15, 1.1, 1.46 рази для i/ro4, ltd4, ые4 на сорбент! uitropao 0DS-120T, у 1.72, 1.72, 9.0 рази на октильному та у 5.5, 1.в4, 2.9 рази на бутильному сорбентах. При переход1 в1д нейтральних до кислих елюент!в Ыдбуваеться значно б!льше зб1льшення ефективност1 на октильному та бутильному сорбентах н1ж на октадецильному uitropao ODS-120T. Таким чином, понижения рН елюент!в, в ряд1 випадк!в, може бути засобом п1двищення ефективност1 елюювання пептидолейкотриен!в в умовах ОФ ВЕРХ.

1онообм!нна ВЕРХ лейкотриен!в. При хроматографуванн! сполук на ам1нопропильних сорбентах та застосуванн! елюент1в, що забезпе-чують протонування ам1ногруп сорбенту, реал1зуеться 1онообм1нний вар1ант р!динно! хроматограф!1. Залежн1сть коеф1ц!енту утримання лейкотриен1в в1д концентрацП метанолу в елюент! мае парабол!чну форму. Як видно, при низькому bmIct! метанолу в елюент1 значний вклад в утримання Ш34-Ме та ьтс4 вносить г1дрофобн1 взаемодП. При п1двниенн1 концентрацП метанолу в елюент! зменшуеться доля г!дрофобних вэаемод!й, та у зв'язку з понижениям д!електрично! проникност1, зроотае доля !онних, що в свою чергу приводить до эростання утримання. При концентрацП метанолу б!льш 50$ спосте-р!гаоться значне п1двищення ефективност1 елюювання. У вивчених умовах, неге практично не утримуеться, залеяност! в!добрахують вплив концентрацП метанолу в рухом1й фаз1 на селективн1сть в1д-д1лення цих сполук. На приклад1 1/го4-Ые, х/со4, та hete нами вив-чався вплив рН елюенту на утримання в умовах 10 ВЕРХ. 3 понижениям рН в!д 7 до 2, эагальне зм!нення утримання 1/го4-Ые та LT0,

незначне, що е великою перевагою 10 ВЕРХ по в1дношенню до ОФ ВЕРХ.

Для вивчення 1онообм1иного процесу та вибору умов вид1лення ЬТСд-Ме та ътс4 ми вивчали вплив концентрацП 1 типу проти1он1в на утримання цих сполук. Вивчався вплив зм1ни концентрацП н1трат-(50% МеОН, рН 3.4) та сульфат-1он1в (©595 МеОН, рН 3.7) на утримання. Знайдено, до логарифм коеф1ц1ента утримання е лШйною функц!ею логарифма активност! проти!она у рухомП! фаз1, залежност! добре описуються р!внянням - 1пк'=о • 1па + в. Таким чином, утримання лейкотриен!в добре описуеться в цих умовах як 1онообм1нний процес. Абсолютне значения Б е в1дношенням заряд1в елюовакого та елюючого !он1в. Усереднена по двох значениях для 1/гс^-ме та ьтс4 величина дор1внюе 0.93 та 1.1, в1дпов1дно, тобто в 1онн1 взаемодП э сорбентом вступае одна карбоксильна група -глутам1нового залишка глутат!ону. При хроматографуванн1 пептидо-лейкотриен1в в розчинах (Ш4)2бо4, були одержан1 значения Б р1вн1 одиниц1, тобто при рН=7 пептидолейкотриени е двохзарядн1 анюни.

Значною перевагою 1онообм1нного вар1анту, пор1вняно з ОФ ВЕРХ, е слабка залемпсть в1д рН елюенту, а також значно б1льша селективн!сть розд1лу пептидолейкотриен1в та р1зноман1тних Пдрофобних продукт1в.

Хроматограф1 я а-ам1нофосфонових кислот та фосфонопептщЦв. Попередколоночна модиФ1кац!я а-ам!нофосфонових кислот та енант1о-мерний анал!з за допомогою ОФ ВЕРХ. Для анал1зу енантЮмерно! чис-тоти ам1нофосфонових кислот ми використовували реакШю ам1нокислоти з орто-фгалевим альдег1дом та ы-ацетил-1г-цисте!ном. В лужному середовииа утворюються д1астереомерн1 пох1дн1 1зо1ндолу, як1 можливо розд!лити в умовах ОФ та 10 ВЕРХ:

р pij pph Р Р

Вивчалися сл1дуюч1 ам1НОКИСЛОТИ: Ala; Ala, Ala" , pMepAla , Val ,

Leup, phep, PhGiy^. 0собливост1 будови цих сполук вивчались нами

за допомогою комп-ютерного моделювання. Знайдено, що структура э

мШмальною енерг1ею в сво!й будов1 мае плоский 1зо1ндольний

ú

фрагмент, 1он1зован1 карбоксильна та фосфонатна трупа максимально в1докремлен1. Можливо, ао в конденсован1й фаз! ц1 особливост1 будови молекули будуть збер1гатися. Имоь1рно, що 1зо1ндольний фрагмент та алк1льн1 групи ам1нонислот повинн! вносити основний вклад в Пдрофобн1 взаемодИ з неполярними фазами.

Нами вивчався вплив концентрацП метанолу в елвент1 на утримання та селективн1сть розд1лу д1астереомер1в 1зо1ндольних пох!дних АФк на р1зних октадецильних сорбентах. Селективн1сть розд1лу д1астереомер1в пох!дних значно залежить в1д будови АФк. Максимальна селективн! сть досягаеться для роэд1лу пох1дних Phoij^, що ймов1рно пов'язано э наявнЮтю фенИльного зам1сника безпосередньо 61 ля оптичного центру ам1нокислоти. Зам1на одного

Р РН

гидроксилу на водень (пох!дн! Ala та Ala ) приводить до зниження

селективност1 розд1лу та зм1ну характеру концентрац1йно!

залежност1 - в останньому випадку селективн1сть дещо зменшуеться з

рн

п1двищенням утримання. Сл1д зауважити, що у випадку Ala похине 1Ызомеру елсеться першим, в той час як для останн1х АФк порядок утримання пох1дних протилежний. Уведення, эам1сть г1дроксилу,

PPh

фен1льного зам1сника (Ala') приводить до значного зростання селективност! розд1лу, пор1вняно до пох1дних А1ар. При пор1внянн1 селектавност! роэд1лу пар пох1дних Leup/Vaip та Phep/Phoiyp знайдено, що значно б1льша селективн1сть отримуеться для першо! пари сполук, хоча обидв! в1др1эняються на метиленову трупу. Таким чином, адитивнЮть вклад1в в цьому випадку не спостер1гаеться. Порядок зростання селективност! розд!лу пох!дних у ряду ам1н0ф0Сф0И0Вих кислот - PheP<Ala?<Valp<Leup<PhGlyP однаковий для колонок, заповнених сорбентами Separon SIX C18 та Eurospher 80-С18, однак для сорбенту ootadecyi poiyol si 100 е значна в1дм!на.

При пор1внянн1 хроматограф1чних властивостей 1зо1ндольних пох1дних АФк та Ix карбонових аналоПв було знайдено, що утримання пох1дних ам1нокарбонових кислот пропорШйне Ix г1дрофобност! та значно б!льше за фосфонових. Селективн1сть розд1лу 1зо1ндольних пох1дних Val, Leu, та Ala також значно перевищуе ц1 значения пох!дних фосфонових аналоПв.'

При синтез 1 АФк важливим е контроль оптично! чистоти ix еф1р1в. Нами досл1джувався розд1л пох1дних д1етилоьих та дИзопропилових еф1р1в А1ар та Leup. Знайдено, що селективн1сть розд!лу 1зо!ндольних noxiдних А1ар значно перевищуе селек-тивн!сть розд1лу еф!р1в. Для Leup селективност! розд!лу пох1дних

кислоти 1 пропилового еф1ру однаков1, а етилового значно менша. Таким чином, для вивчених сполук, спостер1гаеться эниження селективност! •розд1лу 1зо1ндольних пох1дних еф1р1в, особливо д1етилових, пор1вняно до в1льних АФк.

Эастосований метод дериватизацЦ i анал1эу мохе бути використаний не т1льки до ам1нокислот, а такох до д1пептид1в. Нами досл1дхено роэд1л пох1дних д1астереоыерних пептид1в L-Aia-L.D-Aiap на колонках, заповнених сорбентами Separon sxx cía та Ootade-oyi poiyoi ßi 100. Знайдено, ао на останн1й колонц1, при використанн1 2556 метанолу та 75% 0.01 М фосфатного буфера, анал1з д1астереомерного складу мохе бути проведений за 15 хвилик. Попередколоночна модиф!кац!я ам!нойюсФорових кислот та енантЮ-мерний анал!з за допомогою ан1оно-обм1нно!1 ВЕРХ. Д1астереомерн1 пох1дн1 1зо1ндолу е багатоосновними кислотами 1 мохуть взаемод1яти з поверхнею ан1онообм1иного сорбенту. На ам!нопропильному сорбент1 (Separon sxx nh2) доел!джувались хроматограф1чн! властивост! 1зо1ндольних пох1дних наотупних ам1нофосфонових кислот: А1ар, pMeßAiap, Vaip, Leup, Phep, PhGly*1, Для найб1льшого энихення Пдрофобних взаемод1й використовувавоя елюент, то мостив 50$ метанолу. 3 метою оптим1зац11 умов розд1лу д1астереомер1в вивчався вплив концентрацП фосфату амон1ю в елюент1 на утримання та селективн!сть розд\лу. Логарифм коефШенту утримання с л1н1йною функШею логарифма концентрат 1 сол1 в елюент!. Утримання пох1дних Зростае В ряду: ßMeßAlaP < YalP < LeuP < PheP < AlaP < PhOlj^, Таким чином, в цьому випадку, на в i дм! ну в1д ОФ ВЕРХ, немае зв-язку м1х утриманням 1 г1дрофобн1стю або розм1ром сполук. Математична обробка результата експеримент1ь дозволяс апроксимувати эалежност1 ринянням типу: in k* = ь - р ■ in о, де С - кониентрац1я сол1 в елюент1 (мШ, Анал1з параметру р дозволяс зробити висновок, що сербдне значения заряду хроматографованих сполук знаходиться в мехах 2.3 - 2.7. 0ск1льки карбоксильна група мае рК "2.5, а такох рК, фосфонатно! групи 1.5-2, мохна зробити висновок, що фосфонатна група 1он1зована часткоьо в уыовах екперименту 160% МеОН, pH 7). Таким чином, наявн!сть великих концентрац1й метанолу знижуе I диференц1юе силу АФк.

При зростанн1 утримання д1астереомерннх пох1дних вивчених кислот, за винятком ßMeßAiap та Vaip, досягаеться селективн!оть, достатня для повного розд1лу, Порядок влюювання пох1дних такий самий як i в ОФ ВЕРХ - ь-ь-1замери елюрться першими. Знайдено, «о

ю

для ароматичних кислот Fhep та PhGiy^, при зменшенн1 концентрацП елюючого 1она селективн1сть розд1лу д1астереомерних пох1дних 1зо1ндолу незначно п1двищуеться. Селективн1сть розд1лу пох1дних leup п!двищуеться при зменшенн! концентрацП в1д 100 до 50 мМ, до-сягаючи максимума в межах 25 мМ. Для пох1дних А1ар характерно р1зке эб1лыиення селективност1 розд1лу при пониженн1 концентрацП в!д 50 до 25 мМ. Оптимальна концентрац1я фосфату амон1ю для розд1лу пох1яних - 25^5 мМ, в цьому випадку розд1л найб1льш селективний 1 коефЩ1енти утримання знаходяться в межах 1.0-3,0.

Знайден! умови дають змогу проводити за допомогою ОФ та 10

ВЕРХ експресний анал1з енант1омерного складу АФк при

ферментативному розщепленн1 рацемат!в п1д д1ею пен1цил1нацилази.

Обернено-фазова хроматограф!я фосфонод!пептид!в. Вивчались хрома-

Т0Граф!ЧН1 ВЛаСТИВ0СТ1 НаСТуПНИХ д1пеПТИД1в: L-Ala-L,D-Ala (i),

Ir-Yal-L, D-AlaP (II), L-Leu-L,I>-PheP (III), L-Phe-B,D-LeuP(IV), L-

Leu-L,D-Phe (V), Z-L-Phe-L,D-LeuP(0Et)2 (VI), Z-L-Val-L,D-

AlaF(0iPr)2 (VII), Boo-L-Leu-L,D-PheP(0iPr)2(YIII), Z-L-Ala-L,D-Alap(OlPr)2 (IX)>

Найб1лыи г1дроф1льна з вивчених сполук, ФП L-Ala-L,D-Aiap, вельми слабко утримуеться в умовах ОФ ВЕРХ, нав1ть за в!дтсутн1с-т» орган!чного розчинника в елюент1. Нами знайдено, що на колонц1 Separon six cíe, при зб1льшенн! концентрацП (nh4)2so4 в рухом1й фаз1 з 1.5 до 3 М, п1двииуеться як утримання ь-ь-!зомеру (в1д к'= 1.47 до 3.37), так 1 селективн1сть розд1лу д1астереомер1в (в1д а=2.17 до 5.70). У випадку L-Vai-L,D-Aiap г!дрофобн!сть сорбату п1двииуеться 1 для вивчення утримання ми застосовували водно-мета-нольн! розчини. При зменшенн! концентрацП МеОН в1д 10 до 0%, селективн1сть розд1лу д1астереомер!в L-Vai-L,D-Aiap зб!льшуеться в1д 1.55 до 2.10 (Ootadeoyl poiyol Si 100). При, подалыюму п1дви-щен1 г1дрофобност1 сорбат1в (сполуки L-Leu-L,i>-Phep та L-Phe-L,D-Leup), селективн1сть розд1лу зб1льшуеться таким чином, що досяга-еться повне розд1лення д1астереомер1в (Ootadeoyl poiyol si 100, 40% МеОН, a=1.85 та 2.95, в!дпов1дно). Зм1на ам1нокислотно1 П0СЛ1Д0ВН0Т1 130мерних ФП (сполуки L-Leu-I D-PheP Та L-Fhe-L.D-Leup) майже нэ впливае на утримання ь-ь-1зомер1в, але пептид L-Phe-D-beup (k'= 2.48) утримуеться значно сильн1ше н1ж 1зомерний L-Leu-D-PheP (k'= 1.8),

Пор1внюючи хроматограф1чн1 властивост1 карбонових пептид1в та IX фосфонових аналоПв (сполуки L-Leu-L,D-Phe та L-Leu-L,D-PheP),

энайдено, що на сорбент1•Separon SIX 018, при bmIctí 40$ МеОН в елюент1, L-Leu-L-Phep та L-Leu-L-Phe мають коефШ1енти утримання 2. 8В та 3.29, a Ix ь-ЕИзомери в1дпов1дно - 4.72 та 7.07. Таким чином, зам1на карбоксильно! групи на фосфонатну приводить до значного зменшення утримання I селективност1 розд1лу д1астереомер1в.

0ск1льки ФП с 1оногенними сполуками, вони можуть зм1нювати адсорсЗц1йн1 властивост! в залежност1 в1д кислотност1 елюенту (Мал, 2). 1х утримання та селективн1сть розд1лу д1астереомер!в значно зб1льшуються при зменшенн! рН в межах 5-7, то в1дпов1дае значению рК2 дисоц!ац!I фосфонатно! групи <рК2~ 5-7). Завдяки цьому, використання елюент1в з рН<5 може п1двищити навантаження на колонку при препаративному розд1ленн1.

Эахищен! пептиди значно сильн1ше утримуються в умовах ОФ ВЕРХ. Однак зб1льшення г1дрофобност1 супроводжуеться зменшеням селективност1 розд1лу д1астереомер1в. Розд1лити д1астереомери було можливо т1льки у випадку z-L-Phe-L,D-Leup^0Et)2. 0ск1льки захищен1 ФП мають велике синтетична значения, для 1х розд!лу ми застосували НФ вар1ант хроматограф!I на н1трильному та ам1нопропильному сорбентах. Ус1 вивчен1 спояуки (yi-ix) можуть бути розд1лен1 на обох типах сорбент1в при застосуванн1 рухомо! фази гексан-1зопропанол. В умовах НФ ВЕРХ ь-ь-1зомери утримуються сильн1ше н1ж ЬЧЫзомери.

Ан1онообм1нна хроматограф!я Фосфонопептид1в. При хроматографуван-н1 на ам!нопропильному сорбент1 при використанн1 елюенту, що м1с-тив Н3Р04, реал1зуеться режим Юнного обм!ну ФП. При п1двищенн1 концентрат! кислоти в рухом1й фаз1 утримання пептид1в зменшуеть-ся, але селективнЮть розд1лу д1астереомер1в практично не зм!ню-еться. Утримання пептид1в на ам1нопропильному сорбент1

р Р р

Зб1льшуеться В ряду: L-Ala-D-Ala < L-Val-D-Ala < L-Leu-D-Phe <

Р

L-Phe-D-Leu , а селективнЮть роэд1лу д1астереомер1в энаходиться в межах 1.2 - 1.4. Знайдеко, що L-L-lsowepu елюються першими в умовах АО ВЕРХ. Оптимальним складом елюенту е 0.1-10 мМ Н3Р04 та 5$ метанолу.

На в1дм1ну в1д ФП, селективн1сть роэд1лу карбонових аналоПв (L-Leu-L,D-Phe) значно эб1льшуеться при зростанн1 концентрац1Х кислоти, що може бути пояснено р1эницею значень рК карбоксильних груп L-L та L-D-nenTHfliB.

Малюнок 2. Вплив рН елюенту на коеф1ц1енти утримання (к1) ь-ь-1зомер1в та селективнЮть розд1лення (а) д!астереомер1в. Колонка 3.3x150 мм, Separon six С18, 5 мкм; рухома фаза: водний розчин 0.01 М н3ро4, нейтрал1зований ам1аком,- метанол (00:40 об). Сполуки: 1,4 - Val-AlaP, 2,5 - Leu-PheP. 3,3 - L-Leu-D-Phe.

Кат1онообм1нна хроматограф!я ФосФонопептид1в. На фен1лсульфонат-HOMy CopdeHT 1 фОСфОНОПеПТИДИ L-Leu-L,I>-PheP та L-Phe-L.D-LeuP утримуються значно сильнШе н1ж на ам1нопропильному, i для Ix елюювання необх!дно застосування рухомих фаз з б1льшою 1онною силою. Знайдено, то д1астереомери розд1ляються при використанн1 елюент1в, то Miстили 0,1 М розчин K2so4 та н3ро4. При п1двищенн1 концентрацН н3ро4 в1д 0.1 до 50 мМ селективнЮть розд1лу д1астереомер1в L-Leu-L,D-Phep та L-Phe-L,D-LeuI> складае 1.8 1 2.2, в1дпов1дно. При застосуванн1 елюент1в, то м1стили т1льки н3ро4 в концентрацН в1д 5 до 100 мМ, на цьому сорбент 1 були розд1лен! д1астереомери б1льш ■г1дроф!льних пептид1в L-Aia-L,D-Alap, L-Val-L,D-Alap. Ix селективн1сть розд1лу 1 утримання зб1льшувались при эменшенн! концентрацН кислоти.

Висновки.

1. Селективн1сть розд1лення пептидолейкотриен1в залежить в1д типу сорбента, концентрацН метанолу та 1он1в водню в елюент1. При пор1внянн1 сорбент1в С1В, Се та С4 знайдено, що кращ1 властивост1 мае октадецильний сорбент tsk ods 120т. Найб1льша селективн1сть роэд1лення лейкотриен!в досягаеться при застосуьанн1 цього сорбенту та елюента. ао мЮтить 05 - 70% метанолу(рН = 7.1).

2. Понижения pH елюенту до 2 е методом Шдвищення ефективност1 елюювання пептидолейкотриен1в. Ступень пивищення ефективност! елюювання, в пор1ьнянн1 з нейтральними елюентами, тим ьище, чим ыенш Пдрофобний сорбент використовувався для хроматографування. Максимальна ефективн1сть елюювання лейкотриен1в досягаеться на сорбент1 так ods 120т при використанн1 елюент1в, що Mi стили 70-75% метанолу (рН=2). За цих умов пептидолейкотриени елюються компактною групою та в1дпадае необх1дн1сть в град1ентному елююванн1.

3. Розроблен1 методи препаративного вид1лення лейкотриен1в з реакц1Яник сум1шей дозволяють отримувати ц1 сполуки э1 ступеней 1зомерно1 чистоти не менш 99%.

4. Розроблен1 високоселектиьн1 та чутлив1 методи виэначення ультрамалих концентрац1й лейкотриену С4 у бЮлоПчних об'ектах за допомогою обернено-фаэово! та IohooömIhhoI ВЕРХ. Методи дозволяють виэначати ьтс4 на р!вн1 2-3x10"" моля у эразку.

5. Знайден1 оптимальн1 умови роэд1лу та аиал1зу д1астереомер1в Ыльних та захищених фосфонод!пептид!в методами нормально-фазово!,

обернено-фазово! та 1онообм1нно1 хроматографП. Для розд1лення в1льних фосфонод1пептид1в необх1дне застосування обернено-фазово! або loHoodMiHHOl хроматографП, тод1 як захиаен1 пептиди можна розд1лити переважно за допомогою нормально-фазово! ВЕРХ.

6. Селективн1сть розд1лу д1астереомер1в фосфонод!пептид1 в та 1зо1ндольних пох!дних ам1нофосфоиових кислот в умовах обернено-фазово! ВЕРХ л!двищуетъся при зростаня1 об'ему замЮника б1ля асиметричного атому ам1нофосфоново! кислоти. Найб1льша селективн1сть роэд1леиня фосфонод1пептид1в досягаеться при застосуванн1 елюент!в з рН <5.

7. Розроблен1 методи анал1зу ,енант1смерно1 чистоти ам1нофосфонових кислот. iao заснован1 на реакцП цих сполук з орто-фгалевим альдег1дом та и-ацетил-1г-цисте1ном, та наступним роэд1лом 1эо1ндольних пох1дних в умовах обернено-фазово! та 1онообм1нно1 хроматографП. При оптимальних умовах розд1лення один з 1зомер1в ам1нофосфоново! кислоти може бути визначений в к1лькост1 не менш

0. 5 % в присутност1 перевиауючо! концентрацП 1ншого.

Список публ1кац!й за темо» дисертацП,

1. Галушко C.B., Велик М.Ю., Сорочинский А.Е., Корнилов A.M., Кухарь В.П. ОСращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография в синтезе лейкотриенов А4 и С4.// Биоорган, химия, 1989, Т 15, N V, с. 952-959.

2. Кухарь В.П., Галушко C.B., Велик М.Ю., Сорочинский А.Е., Корнилов A.M. Высокоэффективная жидкостная хроматография лейкотриенов. // Тез. докл. IV Всес. конф. "Синтез и исследование простагландинов". Минск 1989. с. 120-122.

3. Галушко C.B., Велик М.Ю., Сорочинский А.Е., Корнилов A.M., Кухарь В.П. Высокоэффективная жидкостная хроматография в синтезе лейкотриенов. Разделение изомеров мвтил-55,бЗ-оксвдо-И-оксоундека-диеноата.// Ж. аналит. хим., 1989, Т 44, Выл. 5, с. 938-941.

4. Галушко C.B., Велик М.Ю., Сорочинский А.Е., Корнилов A.M. Высокоэффективная жидкостная хроматография лейкотриена С4 на аминопропильном сорбенте.// Биоорган, химш.. 1990, Т 16, N 1, с. 113-117.

5. Галушко C.B., Велик М.Ю., Сорочинский А.Е., Корнилов A.M., Кухарь В.П. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография лейкотриенов.// Тез. докл. V Всес. симпоз. по мол. жидкостной хроматогр. Рига 1990. с. 163.

6. Галушко C.B., Велик М.Ю., Солоденко В.А., Кашева Т.Н., Кухарь В.П. Высокоэффективная жидкостная хроматография фосфонодипептидов. //Биоорган, химия, 1990, Т 16, N 12, с. 1643-1646.

7. Galushko S.V.,Belik М. Yu., Solodenko V.A., Kasheva T.N., Kukhar V.P. Normal- and reversed-phase high-periormanoe liquid chromatography of eome phosphonodipeptides.// J. Chromatography. 1991, 553, 143-147.

8. Galushko S.Y., Belik M. Yu., Solodenko V.A., Kasheva T.N., Kukhar V.P. Ion-exohange HPLC or diastereoisomere of some phosphon-odipeptides.// 8th Danube Symposium on Chromatography 1991, Abstraot Mo- P-16 . '

9. Galushko S.V., Belik M. Yu., Solodenko V.A., Kasheva T.N., Kukhar V.P. Ion-exohange high-periormanoe liquid chromatography of diastereoisomers of some phosphonodipeptides.// J. Chromatography. 1992, 600, 79-81.

10. Solodenko V.A., Belik M.Y., Galushko S.V., Kukhar V.P., Kozlova E.V., Mironenko D.A., Svedas V.K. Enzymatio preparation of both Land D-enantiomere of phosphonio and phosphonous analogues of alanine using penioillin aoylase.// Tetrahedron: Asymmetry. 1993. V. 4, N 9, p. 1965-1968.

11. Galushko S.V.,Belik M. Yu., Shishkina I. P., Solodenko V.A., Pojarkova L. N. Diastereoisomerio analysis of phosphonodi- and tripeptides by reversed phase HPLO.// Internatinal Symposium on analysis of peptides 1993, Abstraots, poster 4.

Пип. до лруку. Формат if tv^ ПаЫр^/w

Друк. офс. Умори, друк. арк. fi 9i Обл.-вид. арк. e,tC тир.//</ За

Юмвська кннжкова друьарня иауково! книги. KhIb, Penlna, 4.