Высокоэффективная жидкостная хроматография порфиринов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

ГРИШИНА ЛЮДМИЛА ЕВГЕНЬЕВНА

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ПОРФИРИНОВ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1996

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Шиигун O.A. кандидат химических наук, доцент Брыкина Г.Д.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Никитин Ю.С. доктор химических наук Томилова Л.Г.

Ведущая организация:

Институт химии неводных растворов РАН (Иваново)

Защита состоится ЧНЬ декабря в и час. мин. в ауд. 33 У^ на заседании диссертационного Совета Д.053.05.60 по химическим наукам при Московском государственном университете им М.ВЛомоносова по адресу:

119899, ГСП-3, Москва, В-234, Воробьевы горы, МГУ, Химический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан ноября 1996 г.

Ученый секретарь

ТИГГ(»Г>ТЯТГНГ|НПГ1ГГ> ( 'ППРТЯ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Порфирины представляют интерес как вещества с разнообразными биохимическими функциями. Они находят широкое практическое применение. Это обуславливает необходимость проведения качественного и количественного анализа смесей синтетических металлопорфиринов, порфиринов из биологических жидкостей человека, из экстрактов растений, из сырой нефти, мазута и других объектов. Практически единственный метод разделения и определения этих соединений - жидкостная хроматография (бумажная, тонкослойная, колоночная)- Наиболее перспективным' методом хроматографического анализа порфиринов является колоночная ВЭЖХ. В большинстве работ применяется обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ, значительно превосходящий : " нормально-фазовый по селективности разделения порфиринов.

Однако, несмотря на практические успехи ВЭЖХ порфиринов и достаточный эмпирический материал, до настоящего времени, практически не проводилось исследований, которые связывали бы структуру порфиринов с их хроматографическим поведением. Для прогнозирования селективности разделения порфиринов методом ВЭЖХ, понимания механизма адсорбции соединений в различных хроматографических системах, создания единой, рациональной системы поиска эффективных элюентов для качественного и количественного анализа смесей порфиринов или их линейных аналогов и развития все еще мало используемых для разделения этих соединений вариантов ВЭЖХ представляется актуальным систематическое изучение зависимости между строением порфиринов и их хроматографическими свойствами (параметрами удерживания). Особое место в анализе таких дорогостоящих и светочувствительных соединений как порфирины, может занять микроколоночная ВЭЖХ, о применении которой для этой цели практически нет литературных данных.

Цель работы: изучение хроматографического удерживания порфиринов, играющих ключевую роль в процессах биологического окисления и фотосинтеза - соединений различных структурных типов; некоторых желчных и фшсобилшовых пигментов (линейных аналогов порфиринов), в том числе склонных к фотохромным превращениям; исследование влияния структурных особенностей металлопорфиринов, лигандов и ряда пигментов на их хроматографические параметры удерживания в условиях

ВЭЖХ, а также на некоторые термодинамические параметры сорбции; установление корреляций хроматографических параметров со свойствами металла-комплексообразователя, функциональных и мезозаместителей; рассмотрение механизмов сорбции порфиринов в условиях нормально- и обращенно-фазового вариантов ВЭЖХ; использование метода ВЭЖХ для обнаружения и количественного определения порфиринов-лигандов и металлов в виде порфиринатов.

Научная новизна. Методом микроколоночной ВЭЖХ изучено поведение гемина и его пептидных производных -упрощенных моделей гемопротеидов. Найдены условия определения этих соединений в реакционных смесях в процессе их синтеза. В условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ исследовано поведение ряда порфириновых лигандов: протопорфирина IX, диметилового эфира протопорфирина IX, 1,4,5,8-тетраметилпорфирина, а,Р,у,о-тетрафенилпорфирина,

фотосинтетических пигментов - феофитинов а ив и их комплексов с металлами (М§, Ъа., РЬ, Си, Рс1, Р^. Найдены условия для разделения порфиринов-лигандов и их металлокомплексов. Сопоставлены эффективность и селективность хроматографического разделения ряда порфиринов на обычной (150x3,9 мм) и микроколонке (64x2 мм). Методом ВЭЖХ изучена адсорбция порфиринов разных структурных групп, рассчитаны и проанализированы изотермы адсорбции. Изучены хроматографические характеристики некоторых желчных и фикобилиновых пигментов (линейных аналогов порфиринов). Показана перспективность метода ВЭЖХ для определения обратимости ряда фотопревращений фикобилиновых пигментов. Предложена теоретическая интерпретация полученных результатов, рассмотрены возможные механизмы взаимодействия изучаемых соединений с подвижной и неподвижной фазами.

Практическая значимость работы.Показана возможность разделения порфиринов различных структурных типов и их линейных аналогов в условиях жидкостной микроколоночной ВЭЖХ. Найдены условия для разделения и количественного определения методом обр'ащенно-фазовой микроколоночной ВЭЖХ упрощенных моделей гемопротеидов - геминпептидов в реакционных смесях в процессе их синтеза. Предложены подвижные фазы доя ВЭЖХ-анализа многокомпонентных смесей рада порфиринов - лигандов и их металлокомплексов на колонках, заполненных силикагелем С-18. Найдены условия хроматографического определения фотосинтетических пигментов - хлорофиллов а ив, феофитинов а иЪ в извлекаемых из растений экстрактах сложного состава.

Впервые метол микроколоночной ВЭЖХ использован для наблюдения фотопревращений фикобилинов. контроля за изменением пигментного состава разных групп водорослей во времени, обнаружения- минорных компонентов и разделения фикобилинов в пигментных системах.

Положения, выносимые да защиту;

1. Влияние ряда факторов (природа и состав подвижной фазы, природа неподвижной фазы, длина колонки) на хроматографические параметры удерживания порфирштов и их линейных аналогов.

2. Закономерности удерживания гемина, его пептидных производных в условиях нормально- и обращенно-фазового вариантов ВЭЖХ, условия идентификации и определения этих соединений в реакционных смесях в процессе их синтеза.

3. Выводы о закономерностях удерживания и селективности разделения иорфиринов-лигандов различных структурных групп (бесфитольных тетрапирролов и фотосинтетических пигментов) и их комплексов с металлами в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ.

4.Сопоставление эффективности разделения смесей металлопорфиринов на микронасадочных (64x2 мм) и обычных насадочных (150x3,9 мм) колонках.

5.Данные по изучению адсорбции ряда порфиринов методом ВЭЖХ, построению изотерм и расчету термодинамических параметров адсорбции.

6. Взаимосвязь хромагографических параметров удерживания и термодинамических параметров сорбции со структурными особенностями порфиринов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на XIV научной сессии Международного (страны СНГ) семинара по химии порфиринов и их аналогов (Иваново, март 1993), I Международной конференции по биокоординационной химии (Иваново, декабрь 1994) и Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ленинские горы-95" (Москва, апрель 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликованы: обзор "Высокоэффективная жидкостная хроматография порфиринов -лигандов и комплексов с металлами", четыре работы в виде статей и тезисов докладов и четыре статьи приняты к печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного закономерностям удерживания порфиринов, возможностям различных вариантов ВЭЖХ и перспективам их применения для определения этих соединений, пяти глав экспериментальной части с обсуждением

результатов по каждой главе, выводов, библиографии, включающей 81 работу отечественных и зарубежных авторов и приложения, содержащего электронные спектры поглощения соединений. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, включает 14 таблиц и 29 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Исходные вещества, аппаратура, методика эксперимента

В работе использовали билирубин IX (БР), биливердин IX (БВ), протопорфирин IX (ПП), аДу.ст-тетрафенилпорфирин (ТФП), протогемин IX (I) фирмы Fluka, Швейцария. Комплексы металлов (Zn, Си, Pd(II), Pt(II), Pb) с порфиринами-лигавдами получали по известной методике. Геминпептиды (II-VIII) были синтезированы в МИТХТ им. Ломоносова в лаборатории чл.-корр. РАН Р.П. Евстигнеевой. Хлорофиллы (XJI), феофитины (ФН), диметиловый эфир проюпорфирина IX (ДМЭПП), 1,4,5,8-тетраметилпорфирин (ТМП), экстракты фикобилинов из водорослей Nostok muscorum (N.m.) и Mastigocladus laminosus (МЛ.) и выделенные из них пигментные фракции были получены в лаборатории фотобиохимии Института биохимии им. А.Н. Баха.

Работа выполнена на отечественном жидкостном микроколоночном хроматографе Милихром-4 с модифицированным спектрофотометрическим детектором (?*=404 нм) и стальной колонкой 64x2 мм и жидкостном хроматографе фирмы Waters, США со спектрофотометрическим детектором (190-600 нм) и стальной колонкой 150x3,9 мм. В качестве неподвижных фаз применяли сорбенты Силасорб-600 (5 мкм), Нуклеосил С-18 (5 мкм) (фирмы Chemapol, ЧСФР), Новапак С-18 (5 мкм) (фирмы Waters, США). В качестве подвижных фаз (ПФ) использовали органические и водно-органические смеси следующих растворителей: ацетонитрила (АН), метанола, этанола, этилацетата (ЭА), диметилсульфоксида (ДМСО) и др.

Хроматографическое поведение геминпептидов

В работе исследовано поведение протогемина IX (I), его пептидных производных (II-VIII), в том числе гистидинсодержащих (ГУ-VII), лиганда протопорфирина IX, его линейного аналога - билирубина IX и продукта окисления БР-биливердина IX в условиях обращенно- и нормально-фазовой

С2Н5

=о

iOOCHî

-СН=(р-(СНг)з—СН

СН3

«

Н3С-НС-

H-jÇ

-(Н2С)з—Н2С-

(СН2)з

R'=CH3 ФНа СНО ФН в

Заместит Порфирин

в макрс ПП дмэпп ТФП ТМГ1 Feim (I)

шпсле

ri сн3 сн3 H CH3 CH3

Ri сн2=сн сн2=сн H H CH2=CH

r3 СН3 сн3 H H CH3

r4 сн2=сн сн2=сн H CH3 CH2=CH

r5 сн3 сн3 H CH3 CH3

r6 СН2)2СООН <СН2)2СООСН3 H H CH2)2COOH(R*)

r? СН2)2СООН (СН2)2СООСН3 H H CH2)2COOR»(H)

r8 сн3 сн3 H CH3 CH3

ra H H C6H5 H H

rp H H C6H5 H H

H H C6H5 H H

К H H C«H5 H H

♦Геминпегггиды: R=ValPhoCH3 (II)

LeuLeuValPhoCH3 (III) LeuHisOCH3 (IV) LeuHisAlaOCH3 (V) LeuHisNHC10H20COOCH3(VI) LeuHisNHC10H20COOCH3 (дипроизводное) (VII) GlyProLys(z)GlyGlyOCH3(VIII)

микроколоночной ВЭЖХ при различных составах подвижных фаз.

Нами показано, что возможности нормально-фазовой ВЭЖХ для анализа порфиринов ограничены, поскольку в этом варианте ВЭЖХ удается разделять только линейные и циклические тетрапирролы и моно- и дизамещенные геминпептиды.

Обрашенно-фазовая ВЭЖХ. Установлено, что при изменении состава подвижной фазы АН-вола объемы удерживания соединений закономерно уменьшаются с повышением содержания ацетонитрила в подвижной фазе. При более высоких содержаниях АН удерживание геминпептидов несколько возрастает. Менее отчетливо эта закономерность выражена для билирубина и протогемина. Подобная экстремальная зависимость может быть следствием смены обращенно-фазового механизма удерживания на полярно-фазовый, обусловленный взаимодействием молекул сорбата с остаточными силанольными группами поверхности, и хорошо согласуется с поведением пептидов в аналогичных условиях. Разделить геминпептиды в водно-ацетонитрильных смесях не удалось.

Нами показано, что объемы удерживания (V^, мкл) исследуемых соединений существенно зависят от природы подвижной фазы и ее состава:

Соединение Подвижная фаза

АН-ацетон (50:50) ДМСО-вода-АН (47:3:50) Мегганол-вода-ЭА

(64:16:20) 440:10:50)

I 300 655 260 295

ПП 180 364 186 175

БР 176 177 175 145

Объемы удерживания наиболее различаются в системе ДМСО-вода-аиетоиитрил (47:3:50). В этой системе можно разделить моно- и дизамещенные производные протогемина IX, идентифицировать и определить количественно все рассматриваемые соединения, в том числе в реакционных смесях в процессе их синтеза (рис.1). ПО, например, геминпептида VIII составляет 2,5x10'' моль/л. По увеличению объемов удерживания соединения можно расположить в ряд:

БРиБВ с ПП < VIII < VII < I < V < IV < VI < III < II. Следует отметить следующие закономерности удерживания в системе ДМСО-вода-ацетонитрил (47:3:50):

минимальным удерживанием обладают билирубин и биливердин, для молекул которых возможны различные некомпланарные конформации, за счет чего гогошадь контакта с

а

О 200

2

Л,

600 1000

1000 V.MKJI

Рис.1. Хроматограммы реакционной смеси соединений VII (1), VI (2) (а); и смеси соединений ПП (1), VIII (2), I (3), III (4) (б). Колонка 64x2 мм, Нуклеосил С-18, элюент ДМСО-вода-АН (47:3:50), расход эшоента (F) 100 мкл/мин

неподвижной фазой меньше, чем у циклических тетрапирролов:

- протогемин IX и гсминпептиды удерживаются сильнее, чем лиганд, поскольку при переходе от ПО к 1-VIII изменяется гидрофобность соединений и преобразуется реакционный центр молекулы N4H74-N4M;

- соединениям VIII и VII, имеющим большую гидрофобность, чем протогемин, соответствуют меньшие объемы удерживания по сравнению с I. К ослаблению взаимодействия реакционного

центра VII с неподвижной фазой может приводить его пространственное экранирование за счет дополнительной координации лигандов стабильной плоской частицей комплекса. Учитывая данные Р.П. Евстигнеевой с сотр. ой устойчивости комплексов протогемина с защищенными гистидинсодсржащими пептидами, следует ожидать, что в качестве таких лигандов выступают гиствдинсодержащие заместители R (соединения IV-VII), координируемые центральным атомом через атом азота имидазольного кольца гистидина и занимающие пятое (IV-VI) или пятое и шестое (VII) места во внутренней координационной сфере металла. Дополнительные лиганды могут располагаться над или под (одностороннее экранирование реакционного центра 1V-VI) или и над, и под порфириновон плоскостью (двухстороннее экранирование VII). В последнем случае способность к взаимодействию с неподвижной фазой и объем удерживания резко уменьшаются;

тетракоординационные комплексы, функциональные заместители которых не координируются центральным атомом, удерживаются сильнее остальных соединений. Исключение составляет геминпептид VIII, имеющий в молекуле в качесгве заместителя самую длинную пептидную цепь, конформация которой приводит к полному пространственному экранированию реакционного центра.

Хроматографическое поведение ряда порфиринов - лигандов и их комплексов с металлами

В условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ при различных составах подвижных фаз исследовано поведение ряда бесфитольных порфириновых лигандов - ГШ, ДМЭПП, ТМП, ТФП, фотосинтетических пигментов, молекулы которых содержат фитильную группу - ФН а и в и их комплексов с металлами (Мд, Ъп, Си, РЬ, Р<1, Р1).

Установлено, что объемы удерживания лигандов практически во всех изученных ПФ закономерно возрастают с увеличением их гидрофобности: ПП < ДМЭПП < ТМП < ТФП < ФН<? < ФНд. Наибольшее удерживание феофитинов связано с особым механизмом адсорбции этих пигментов, который заключается помимо обычных гидрофобных взаимодействий сорбат - сорбент во встраивании, растворении фитила в поверхностном углеводородном слое С-18. Обнаружено, что в ПФ АН-этанол-укс. к-та (40:40:16) порядок элюирования лигандов меняется: объем удерживания ФНв становится наименьшим. Значительное взаимодействие этого лигавда с элюентом вызвано специфической сольватацией атома азота реакционного центра укс. к-той ОЫ...НАс). Специфическая сольватация реакционного центра феофитина 8 обусловлена повышенной электронной плотностью на И-атомах (+С-эффект формильной группы).

Введение ЦА металла значительно изменяет хроматографическое поведение соединений, при этом порадок выхода из колонки лигандов и их комплексов одинаков (рис.2). Прослеживается влияние природы ЦА металла на удерживание. Однако, порядок элюирования порфиринатов не во всех случаях коррелирует с элеюроэтрицательностью ЦА металла [П (И), Р<1 (II) > Си (И) > РЬ(Н)> Ъа. (II) > М§ (II)] и уменьшением

т 200 зоо ¿00 200 300 у,:

Рис.2. Хроматограммы смесей соединений гпПП (1), гпДМЭПП (2), гпТМП (З), гпТФП (4), элюент АН-этанол-укс. к-та (40:40:16) (а) ; ПП (1),ДМЭПП (2), ТМП (3), ТФП (4), элюент этанол (б). Колонка 64x2 мм, Нуклеосил С-18, Р=100 мкл/мин

кинетической устойчивости комплексов [ 14 (II) > Рс1 (II) > Си (II) > 7,п (II) > (II) > РЬ (II)], кроме того ряды хроматографической подвижности могут изменяться в различных подвижных фазах. Как правило, координационно-ненасыщенные комплексы РЬ, ¿п). присоединяющие в качестве дополнительных лигандов молекулы подвижной фазы, удерживаются слабее лиганда (рис.3,4). С увеличением полярности элюента разница в удерживании лигандов и таких металлокомплексов увеличивается, поскольку возрастает способность молекул элюента выступать в роли дополнительных лигандов. С другой стороны, введение многих металлов заметно ухудшает растворимость порфиринов в органических растворителях, что приводит в ряде случаев к возрастанию удерживания координационно-насыщенных комплексов (Си, Рф. Таким образом, последовательность выхода соединений определяется рядом факторов, действующих в различных направлениях: координационной насыщенностью комплексов, их растворимостью, электроотрицательностью ТДА металла, кинетической устойчивостью комплексов.

На примере протопорфиринатов и тетрафенилпорфиринатов сопоставлены возможности разделения металлов в виде комплексов с разными лига идами. Установлено, что пики ПП и его комплексов в изученных условиях размыты. Это, по нашему мнению, связано с тем, что молекула ПП содержит различные заместители в тетрапиррольном макроцикле, не имеет центра симметрии. Гвдрофобность разных участков такой молекулы различается, а следовательно различно и удерживание молекул ПП, взаимодействующих теми или иными участками макрокольца с углеводородным слоем неподвижной фазы. При лом зона адсорбции расширяется, происходит размывание. Тетрафенилпорфирину и его комплексам, имеющим симметричное строение, соответствуют узкие пики. Показано, что параметры удерживания прото- и тетрафенилпорфиринатов существенно зависят от природы и состава элюента. Так уменьшение полярности ПФ АН-ЭА приводит к закономерному уменьшению коэффициентов емкости ТФП, ПГ1 и их комплексов, при этом влияние добавок ЭА на хроматографические параметры протопорфиринатов значительно менее выражено, чем на аналогичные параметры тетрафенилпорфиринатов.

Обнаружено большее различие в хроматографической поведении комплексов металлов с ТФП, чем с ПП. Это обусловлено наличием в молекуле ТФП периферийных фенильных колец, увеличивающих цепь сопряжения, что приводит к большей зависимости перераспределения электронной плотности в

0 2^6 1,ммн 5

Рис.3. Хроматограммы смеси соединений гпТФП (1), РЬТФП (2), ТФП (3), РсГГФП (4), СиТФП (5), колонка 150x3,9 мм, Новапак С-18, ашоснт АН-ЭА (70:30), Р=1мл/мин (а); колонка 64x2 мм, Нуклеосил С-18, элюент АН, Р=200мкл/мин

0 2-468 1,МИН _0 4 8 <2 46 20 24 Рис.4. Хроматограммы смеси соединений ХЛ в (1), ХЛ а (2), ФН в (3), ФН а (4), колонка 150x3,9 мм, Новапак С-18, элюент метанол-ЭА (70:30), Р=0,5мл/мин (а); колонка 64x2 мм, Нуклеосил С-18, элюент АН-этанол-укс. к-та (40:40:16), Р=50мкл/мин (б)

молекуле этого лиганда от природы центрального атома.

Сопоставлены_эффективность_и_селективность

хромахографнческого разлелсния _ПП,. ТФП, ФН а и в и их металлокомплексов на обычной (150x3.9 мм) и микро (64x2 мм) колонках. Обнаружено, что размывание пиков ПП и его комплексов значительно сильнее выражено при хроматографировании на обычной насадочной колонке, в ряде ПФ получить пики соединений в этом случае вообще не удалось. Установлено, что условия разделения комплексов с ТФП практически не зависят от длины колонки. ПО. например, Хп в виде комплекса с ТФП составляет 5,2 нг/мл на микроколонке, 4,8 нг/мл на колонке 150x3,9 мм. Для смесей фотосинтетических пигментов на разных колонках условия анализа существенно различаются (рис.3,4). На колонке 150x3,9 мм разделение пигментов происходит в большом числе подвижных фаз, а в условиях микроколоночной ВЭЖХ анализ фитольных порфиринов возможен лишь при специально подобранном неординарном составе элюента: АН-этанол-укс. к-га (40:40:16), при этом в процессе хроматографирования часть хлорофиллов под действием СН3СООН переходит в соответствующие феофитины из-за недостаточной кинетической устойчивости гюрфиринатов магния. Оба варианта определения могут быть использованы для качественного и количественного анализа смесей пигментов с тонкими различиями в химической структуре. Результаты количественного определения ХЛ в в экстракте из листьев крапивы методом ВЭЖХ представлены ниже:

Размер колонки, сорбент Подвижная фаза Уравнение градунровочного графика* п=3, Р=0,95 ПОхЮ'. моль/л

моль/л моль/г

150x3,9мм Новапак С-18 64x2мм Нукдеосил С-18 Этанол- ЭА (90:10) \Н- этанол-укс. к-ха (40:40:16) Ь=10,3х106с-13,2 т,=2,5х103с 2,2±0,1 2.5±0,4 5,2±0,2 5.9+0,9 4,3 6,0

♦И-высота пика,мм; иц-масса площади пика,г; е-концентрация, М

В целом разделение комплексов ТФП и фотосиитетических пигментов на колонке 150x3,9 мм характеризуется более высокой эффективностью, и как следствие, хорошим разрешением, что обуславливает несколько лучшие метрологические характеристики этого варианта ВЭЖХ. Вместе с тем, хроматографирование на обычной насадочной колонке требует значительного расхода растворителя. Несомненным преимуществом микроколоночной ВЭЖХ является простота и доступность оборудования.

Хромагографнческое разделение фикобилинов

В условиях микроколоночной обращенно-фазовои ВЭЖХ разделены и идентифицированы линейные аналоги иорфнринов - фикобилиновые пигменты: фикоэритробилин (ФЭБ), фиковиолобилин (ФВБ), фикоцианобилин (ФЦБ). Пики пигментов на хроматохраммах идентифицировали по объемам удерживания, сравнивая последние с объемами удерживания индивидуальных пигментов и пигментов, содержащихся во фракциях известного состава (таблица).

Сопоставление хроматограмм из Ъ1.т. и М.1. в ПФ ДМСО-вода-АН (47:3:50) выявило их сходство но количеству пиков и объемам удерживания (рис.5а), что указывает на одинаковый пигментный состав сравниваемых цианобактернй. Показано, что хроматограммы свежевыделенных смесей фикобилинов (2 ч.) и этих же смесей после длительного хранения (2 месяца) отличаются (таблица). Это свидетельствует об изменении пигментного состава экстрактов даже при специальных условиях хранения (вакуум, Т=-8° С). Обнаружено, что хроматограммы свежеприготовленных экстрактов

претерпевают резкие изменения в течение первых 1-2 часов, что выражается в увеличении одних и уменьшении других пиков, появлении новых (рис.5б).

Таблица. Объемы удерживания (мкл) фикобилинов. Колонка 64x2 мм, Нуклеосил С-18, элюент ДМСО-вода-АН (47:3:50)

Г1шмекш 1 Л'8 пика на хроматограмме -

1 1 2 з 1 4 1 5

БР ! 1 164 1 I .......

БВ | ! 163 |

ФЗБ (фракция) I ! 168 260 1

ФВБ+ФЦБ /фракция) 140 I 320 ! 380

ФЭБ+ФЦБ (фракция) | 168 | 256 ! 382

экстракт из М.т. [ 140 | 168 289 1 | 327 1 340

(свежеприготов.) 1 I 1

экстр актиз М.1. ! 140 | 168 289 I 327 У 340

(свежепршоюв.) | 1

экстракт из N.1». ' | 163 Т 258 Г 303 1 411

(после хранения) | 1 1 1

экстракт го М.1. | 1бз 258 1 303 | 411

(после хранения) | .].._____ ____ .. . 1 1

Хроматографирование фракций пигментов до и после освещения (>.=600; Х=500нм) позволило наблюдать их фотохромные превращения. На полученных хроматограммах (рис.6) величины и смещения пиков меняются обратимо, что свидетельствует об обратимости фотохромных превращений фикобилинов.

Ь,мм

2

Рис.5. Хромато! рамма свежевыделеиной смеси пигментов из Ы.т. (а), изменение высоты пиков фикобилинов во времени (б):

ФВБ (1), ФЭБ (2), ФЭБ-изомер (3), ФВБ-изомср (4), ФЦБ (5). Колонка 64x2 мм, Нуклеосил С-18, эгаоент ДМСО-вода-АН (47:3:50), Р=100мкл/мин

У,мкл

Рис.6. Хроматограмма смеси ФВБ+ФЦБ из И.ш. до (1) и после освещения Х=600 (2), Х=500нм (3). Колонка 64x2 мм, Нуклсосил С-18, элюент ДМСО - вода - АН (47:3:50), Р=50мкл/'мин '

Изучение адсорбции порфиринов из многокомпонентных растворов

методом ВЭЖХ

Для прогнозирования селективности разделений необходимо детальное изучение механизма адсорбции порфиринов различных структурных групп на поверхности адсорбентов, используемых в ВЭЖХ. Наиболее предпочтительным методом исследования механизма адсорбции является изучение изотерм адсорбции.

Методом микроколоночной ВЭЖХ изучена адсорбция ТФП, его комплекса с 2п, ФН в, ХЛ а и в на обращенно-фазовом сорбенте в системе АН-этанол-укс. к-та (40:40:16). В ходе предварительных исследований установлена перспективность этой системы для разделения лигандов и металлокомплексов порфиринов.

Величины поверхностной адсорбции (рис.7.) соединений в зависимости от их концентрации в подвижной фазе рассчитывали по методу Глгокауфа:

а-( Бадс*еисх * У)/(Бпика )

сравн~к*Ь к ^исх * у щ/Япика *и', где а - адсорбция, моль/г: с„сг - исходная, с„авп - равновесная концентрация, моль/л; V - объем пробы, л; g~<5,1 г масса сорбента; Л - высота пика, мм, </ - скорость движения диаграммной ленты,см/мин, и' - скорость потока подвижной фазы, л/мин, Бпика -площадь пика; Биде - площадь адсорбции.

Для всех порфиринов. кроме феофитина а, передние границы хроматографических пиков совпадают, удерживание растет с увеличением концентрации. Это характерно для изотерм Б-класса (рис.7). Пики феофитина а имеют растянутую заднюю границу, удерживание растет с уменьшением концентрации, что характерно для Ь-изотерм. Расчет значений адсорбции для этого лиганда не проводили, поскольку пики сильно размыты, их границы не совпадают, что свидетельствует о значительном влиянии диффузионных процессов на размывание хроматографических пиков и, следовательно, не правомерно использовать метод Глюкауфа.

Б-образный вид практически всех изотерм обусловлен превышением силы взаимодействия между адсорбированными молекулами над силой взаимодействия между растворенным веществом и адсорбентом.

Отметим, что не удается достигнуть значительных степеней адсорбции металлокомплексов, поскольку велика энергия взаимодействия этих сорбатов с растворителем.

Рис.7. Изотермы адсорбции ФН в (1), ТФП (2), ХЛ а (3), гп'ГФП (4), ХЛ в (5). Колонка 64x2 мм, Нуклеосил С-18, элюент АН -этанол - укс. к-та ("40:40:16)

Расположение изотерм адсорбции согласуется с порядком выхода из колонки изучаемых порфиринов. Наибольший объема удерживания фсофитшта а обусловлен рассмотренным ранее механизмом адсорбции фитольных порфиринов. Адсорбция феофипша и ниже, чем других лнгандов, поскольку для его реакционного центра характерна специфическая сольватация укс. кислотой. Рассчитанные из изотерм адсорбции константы распределения К-а/с систематически возрастают с ростом концентрации и близки к значениям КГеири=¥'^.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Перспективно использование ВЭЖХ для разделения многокомпонентных смесей порфиринов, металлопорфиринов и их линейных аналогов. На хроматшрафическое поведение порфиринов влияют строение порфирина, природа подвижной фазы, природа неподвижной фазы, длина колонки.

Строение порфирина. Многообразие структур тетрапирро.чов дает большие возможности для исследования взаимного влияния функциональных заместителей и центральных атомов на хромагографнческие свойства и параметры адсорбции порфиринов.

Природа металла. Прослеживается влияние природы центрального атома металла на удерживание. Как правило, координационно-ненасыщенные комплексы удерживаются слабее лиганда, а координационно-насыщенные - сильнее. В целом последовательность выхода соединений определяется рядом факторов, действующих в различных направлениях:

координационной насыщенностью комплексов, их растворимостью, электроотрицательностью центрального атома металла, кинетической устойчивостью комплексов.

Природа лиганда. Параметры удерживания порфиринов существенно зависят от структурных особенностей лигандов. Функциональные заместители на периферии макрокольца могут влиять на удерживание в силу различных взаимодействий внутри молекулы в зависимости от природы заместителей,, их расположения в молекуле и т.д. Так в условиях обращенно-фазовой хроматографии наибольшее удерживание тетрапирролов, содержащих фитильную группу, связано с особым механизмом адсорбции этих соединений, который заключается помимо обычных гидрофобных взаимодействий сорбат-сорбент во встраивании, растворении фитила в поверхностном углеводородном слое сорбента. Функциональные заместители, содержащие донорные атомы (К, О и др.) , могут дополнительно координироваться центральным атомом металла. Например, пространственное экранирование реакционного центра К^М ряда геминпептидов происходит за счет координации гистидинсодержащих заместителей, центральным атомом протогемина через атом азота имидазольного кольца гистидина. При наличии гидрофобных или гидрофильных заместителей на периферии макрокольца порфирина наблюдаются обычные закономерности в изменении хроматографического поведения этих соединений в условиях ВЭЖХ.

Природа неподвижной фазы. Обрашенно-фазовая ВЭЖХ значительно превосходит нормально-фазовый вариант по селективности разделения порфиринов. Благодаря высокому реакционному сродству порфиринов к силанольным группам, при взаимодействии с модифицированным силикагелем порфирнны, в частности геминпегггиды, могут сорбироваться по двум механизмам: обращенно-фазовому на неполярной поверхности за счет гидрофобных взаимодействий с улеводородшлми радикалами и по гидрофильному за счет специфических взаимодействий молекул сорбата с силанольньши группами поверхности. Это приводит к экстремальной (проходящей через минимум) зависимости коэффициентов емкости соединений в водно-ацетошприльных подвижных фазах.

Длина колонки. Условия разделения бесфитольных порфиринов практически не зависят от длины колонки, а для смсссй фотоспптетических пигментов на разных колонках они существенно различаются. Анализ фигольных тетрапирролов в условиях мшсроколоночной ВЭЖХ возможен лишь в специально подобранных неординарных условиях, а на колонке 150x3,9 мм разделение пигментов происходит с хорошим разрешением и

высокой эффективностью в большом числе подвижных фаз. В полом разделение порфиринов на обычной насадочной колонке характеризуется лучшими хроматографпческнми параметрами, чем на микроколонкс.

Природа подвижной фазы. Параметры удерживания порфиринов существенно зависят от природы подвижной фазы и ее состава. Ряды хроматографической подвижности соединений могут изменяться в различных подвижных фазах, в частности из-за спепифичегютх взаимодействий компонентов элтоента с молекулами еорбата. Например, в подвижных фазах, содержащих уксусную кислоту, удерживание ФН в мало, что обусловлено специфической сольватацией реакционного центра этого лиганда уксусной кислотой. Уменьшение эчюируюшей силы подвижной фазы приводит к закономерному увеличению удерживания и возрастанию селективности, но сильно увеличивает время анализа. Если в состав подвижной фазы входят содержащие донорные атомы вещества, то они могут выступать в роли дополнительных лигандов в мегаллопорфиринах. При этом в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ с увеличением полярности элюента разница в удерживании .тигандов и координационно-ненасыщенных металлокомплексов увеличиваешь поскольку возрастает способность молекул подвижной фа:;ы выступать » роли дополни 1ельных лигандов.

Пощ'чениые экспериментальные данные могу г быть использованы при создании единой системы поиска эффективных элюентов дтя разделения и определения смесей порфиринов -лигандов и металлокомачексов, а также их .пшенных аналогов методом ВЭЖХ.

ВЫВОДЫ

1. Научено поведение протогемина IX и его пептидных производных - упрощенных моделей гемопротеидов в условиях нормальна-фазовой и обращенно-фазовой микроколоночной ВЭЖХ. Найдены условия определения этих соединений в реакционных смесях в процессе ик синтеза (колонка 64x2мм. сорбент - иуклеосил С-18. элюент ацетонитрил - вода - ДМСО (50:3:47), ГТО 1СГ7 моль/л).

2. В условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ исследовано поведение ряда порфириновых лигандов: протопорфнрпна IX. диметпливого эфира иротопорфирина IX, 1,4,5,8 - 1еграмешлпорфирнна, а,|3,у,о-тетрафенилпорфирина и их комплексов с металлами (^и, РЪ, Си, Рс1(Н), Р^Н)). Навдены условия дш разделения многокомпонентных смесей порфиринов-лигандов и их комплексов с металлами методом ВЭЖХ. Подтверждено, что

методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием возможно определение металлов в виде порфиринатов с низкими ПО, поскольку они обладают интенсивной полосой поглощения при 400нм (е=105, полоса Соре). ПО цинка составляет 5,2 нг/мл на микроколонке с нуклеосилом С-18 в системе ацетонитрил-этанол-уксусная кислота (40:40:16); 4,8 шУмл на обычной насадочной колонке с новапаком С-18 в системе ацетонитрил-этанол-уксусная кислота (40:40:4;.

3. Изучены хроматографическне характеристики растительных фотосинтетических пигментов - хлорофиллов а и в. феофитинов а и е. Найдены условия качественного и количественного определения этих соединений в извлекаемых из растений экстрактах сложного состава. ПО хлорофилла в составляет 6,0x10"7

моль/л на микроколонке с нуклеосилом С-18 в системе ацетонитрил-зтанол-уксусняя кислота (40:40:16); 4,3х 10"7моль/л на обычной насадочной колонке с новапаком С-18 в системе этанол -этилацетат (90:10).

4. Сопоставлены эффективность и селективность хромат 1>1рафическох о разделения ряда порфиринов на обычной (150x3,9 мм; и микроколонке (64x2 мм). Установлено, что условия разделения смесей фотоеингетических пигментов на разных колонках существенно различаются, а разделение комплексов тетрафенилпорфирнна практически не зависит от длины колонки.

5. Методом ВЭЖХ изучена адсорбция порфиринов разных структурных групп, рассчитаны и проанализированы изотермы адсорбции.

6. Изучены хроматографичеекие характеристики некоторых желчных и фпкобплиновых пигментов (линейных аналогов порфиринов). Покачана г^кпектинность метода ВЭЖХ дня контроля за изменением состава разных групп водорослей во времени, определения обратимости ряда фотопревращений, обнаружения минорных компонентов в пигментных системах.

7. Предложена теоретическая интерпретация полученных результатов: установлена связь параметров удерживания с природой реакционного центра молекулы и его пространственным экранированием, со свойствами металла- комплексообразователя, функциональных и меаозаместигелей. Предложены возможные механизмы взаимодействия изучаемых соединений с подвижной и неподвижной фазами. Показано, что в зависимости от строения лиганда эти механизмы могут существенно различаться.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ:

КВрыкииа Г.Д.: Васильева"-Л.Н." (Гришина). Шпигун O.A. Сорбиия билирубина из растворов с альбумином ня анионообменнике АВ-17хВ.//Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1992. Т.33.№4. С.383.

2.Брыкина Г .Д., Васильева Л.Г. (Гришина), Шпигун O.A., Евстигнеева Р.П., Желтухша Г.Л., Лубсзггдоржиева Л.П. Хроматографические свойства некоторых пептидных производных нротох смина 1Х.//Коорд. химия. 1994. Т. 20. №3. С.226.

3.Бекасова О.Д.. Оинещеков В.А., Брыкппа Г.Д.. Сннешскова Е.В.. Гришина Л.Е. Минорные компоненты в пигментной системе Nostok Muscorum и Masiigociadus Laminosus. // Биохимия. 1994. T.59. №. C.1045.

4.Брыкина Г.Д., Гришина Л.Е., UlmiryH O.A., Бекасова О.Д. ВЭЖХ металлофеофитинов и некоторых линейных аналогов порфиринов. Тез. докл. I Международной конференции по биокоординационной химии. Иваново. 1994. 20-22 декабря. С.167.

5.Гришина Л.Е., Брыкина Г.Д., Шпнгун O.A. Высокоэффективная жидкостная хроматография порфиринов - лигандов и комплексов с металлами. //Жури, а налит, химии. 1995. Т50. М'9. С.У02.(обзор).