Высокоэффективная жидкостная хроматография порфиринов и косвенное спектрофотометрическое детектирование органических молекул тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ
|
Лазарева, Елена Евгеньевна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2000
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.02
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
На правах рукописи
ЛАЗАРЕВА ЕЛЕНА ЕВГЕНЬЕВНА ^ ^ ®л
1 Л
1 ч с.
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ПОРФИРИНОВ И КОСВЕННОЕ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ДЕТЕКТИРОВАНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ
02.00.02 - Аналитическая химия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва - 2000
Работа выполнена на кафедре аналитической хииии Химического факультета Московского государственного
университета им. М.В.Ломоносова
Научные руководители: доктор химических наук, профессор
ШПИГУН О .А.
кандидат химических наук, доцент БРЫКИНА Г. Д.
Официальные оппоненты: доктор химических наук
ЛАНИН С.Н.
доктор химических наук ТИМЕРБАЕВ А.Р.
Ведущая организация: Ивановский государственный химико-
технологический университет
Защита состоится 1 марта 2000 г. в 16 час. 10 мин. вауд. 337 на заседании диссертационного Совета Д.053.05.60 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, ГСП-3, Москва, В-234, Воробьевы горы, МГУ, Химический факультет.
С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан
2000 г.
Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат химических наук
Торочешникова ИИ.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В настоящее время одним из направлений в развитии высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является разработка новых детектирующих систем. Метод косвенного спектрофотометрического детектирования позволяет расширить круг веществ, определяемых методом ВЭЖХ, а в ряде случаев повысить чувствительность определения соединений, не поглощающих или имеющих низкое поглощение в ультрафиолетовой или видимой областях спектра. Однако результаты определения неэлектролитов трудно прогнозировать, поскольку не вполне ясен механизм возникновения косвенного сигнала и мало исследована концентрационная зависимость площади косвенного отклика. Поэтому актуальна разработка различных вариантов косвенного детектирования в ВЭЖХ и поиск новых модификаторов подвижных фаз, поглощающих в видимой области спектра. В соответствии с этим в настоящей работе для косвенного спектрофотометрического детектирования органических молекул (фенолы, спирты, витамины, краун-эфиры. углеводы) предлагается использовать порфирины. Порфирины удовлетворяют основным требованиям, предъявляемым к модификаторам подвижных фаз для косвенного спектрофотометрического детектирования неэлектролитов, однако ранее для этих целей не использовались.
Цель работы: изучение хроматографического поведения порфиринов в различных подвижных фазах на различных сорбентах для выбора модификаторов подвижных фаз и использование этих модификаторов для косвенного спектрофотометрического детектирования неэлектролитов в видимой области спектра.
Для достижения поставленной цели
- изучено влияние природы, состава подвижных фаз. природы неподвижных фаз. структурных особенностей лигандов и их комплексов с металлами на хроматографические параметры удерживания порфиринов;
- рассмотрены механизмы сорбции порфиринов и металлопорфиринов в условиях нормально- и обращенно-фазового вариантов ВЭЖХ;
- спектрофотометрически исследованы эффекты слабых взаимодействий порфирин - сорбат;
- систематически исследованы зависимости косвенного отклика от концентрации анализируемого соединения, концентрации модификатора в подвижной фазе; влияние концентрации модификатора на относительное удерживание и чувствительность определения соединений.
Научная новизна. В условиях нормально- и обращенно-фазового вариантов ВЭЖХ на сорбентах Силасорб 600, Диасорб-130-фенил. Диасорб-130-амин, Нуклеосил Си исследовано и сопоставлено поведение ряда растительных (феофитины а и Ь и их комплексы с (II). ^ (II), РЬ (II), Си (II), Ъл (II), Се (IV)) и синтетических пигментов (тетрафенилпорфирин и некоторые его производные). Найдены условия для разделения лигандов с заместителями различной полярности и их комплексов с металлами. Данные по хроматографическому удерживанию порфиринов обработаны согласно моделям Скотта-Кучеры, Снайдера-Сочевинского, рассчитаны и построены изотермы адсорбции. Предложена теоретическая интерпретация полученных результатов, рассмотрены возможные механизмы удерживания порфиринов на различных сорбентах. В качестве модификаторов подвижных фаз выбраны шесть порфиринов. В результате изучения электронных спектров поглощения (ЭСП) модификаторов - хлорофилла (а+Ь). тетрафенилпорфирина. Рс1(/7-метоксифенил)порфирина - в присутствии витаминов Е и Эз, краун-эфиров (18-краун-6 и дибензо-18-краун-6), углеводов (рамноза, сорбит, мальтоза) показана возможность использования эффекта слабых взаимодействий для косвенного спектрофотометрического детектирования некоторых классов органических молекул (фенолы, спирты, витамины, краун-эфиры. углеводы). Предложены механизмы возникновения косвенного отклика.
Практическая значимость. Показано, что методом ВЭЖХ можно идентифицировать феофитины а и Ь и их комплексы с металлами (М§ (II), (II), РЬ (II), Си (II), Zn (II), Се (IV)) в процессе их синтеза, а также определять эти соединения в интервале концентраций (0,6 - 44,0)х10"6 моль/л. Предложены хроматографические системы для разделения и количественного определения многокомпонентных смесей производных тетрафенилпорфирина. Найдены условия косвенного спектрофотометрического детектирования витаминов Е и 03, 18-краун-6 и дибензо-18-краун-6. Проанализированы фармацевтические препараты, содержащие витамин Е, О.
Положения, выносимые на защиту:
1. Выводы о закономерностях удерживания растительных пигментов (феофитины а и b и их комплексы с Mg (II). Hg (И). Pb (II). Си (II), Zn (II), Се (IV)) и синтетических (тетрафенилпорфирии и некоторые его производные) в условиях нормально- и обращенно-фазовой ВЭЖХ.
2. Результаты сопоставления селективности разделения производных тетрафенилпорфирина на сорбентах Силасорб 600, Диасорб-130-фенил, Диасорб-130-амин, Нуклеосил С|8.
3. Выводы о применении моделей Скотга-Кучеры и Снайдера-Сочевинского для описания удерживания порфиринов.
4. Данные по изучению адсорбции ряда порфиринов методом ВЭЖХ, построению изотерм и расчету термодинамических параметров адсорбции.
5. Результаты спектрофотометрического исследования взаимодействий между порфиринами и молекулами неэлектролитов.
6. Данные по косвенному детектированию витаминов, краун-эфиров и углеводов и механизмам возникновения косвенного сигнала.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ленинские горы - 95» (Москва, апрель 1995), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов -96» (Москва, апрель 1996), International congress on analytical chemistry (Moscow, June 15-21, 1997). International conference on spectroscopy and chemistry of porphyrins (Minsk. September 22-26, 1998), XIX Всероссийском Чугаевском совещании по химии комплексных соединений (Иваново, июнь 1999).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано шесть статей, в том числе обзор «Косвенное спектрофотометрическое детектирование неэлектролитов в ВЭЖХ».
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, посвященного косвенному спектрофотометрическому детектированию неэлектролитов, пяти глав экспериментальной части с обсуждением результатов по каждой главе, выводов, библиографии, включающей 97 работ отечественных и зарубежных авторов, и приложения, содержащего
электронные спектры поглощения исследованных соединений. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, включает 24 таблицы и 77 рисунков.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Исходные вещества, аппаратура, методика эксперимента
В работе использовали хлорофилл, полученный нами из листьев крапивы, по известной методике получали феофитин и синтезировали комплексы с Hg (II). Pb (II), Си (II), Zn (И), Се (IV). Тетрафенилпорфирин и его производные синтезированы в лаборатории МГАТХТ им. М.В.Ломоносова.
Работа выполнена на жидкостном хроматографе Милнхром 4 с УФ и модифицированным спектрофотометрнческим детектором (Х=404 нм) и стальными колонками 64x2, 64x3, 80x2 мм и жидкостном хроматографе Waters, USA со спектрофотометрнческим детектором (190-700 нм) и стальными колонками 150x3,9 и 300x3.9 мм. В качестве неподвижных фаз применяли сорбенты Силасорб 600. Нуклеосил С is (фирмы Chemapol, Чехословакия), Диасорб-130-фенил, Диасорб-130-амин (Биохиммак, Россия), ц-Bondapak С|8, Новапак Ci8 (Waters, USA). В качестве подвижных фаз использовали органические растворители: ацетонитрил, этанол, этилацетат, пропанол-2, гексан, декан, тетрагидрофуран и др. и их смеси.
Электронные спектры поглощения (ЭСП) соединений снимали на спектрофотометрах Hitachi-124 и Hewlett Packard А8452,1=1 см.
Хроматографическое поведение растительных и синтетических пигментов
В работе исследовано поведение растительных (феофитины а и b и их комплексы с Mg (II), Hg (II), Pb (II), Си (II), Zn (II), Се (IV)) и синтетических (тетрафенилпорфирин и некоторые его производные) в условиях нормально- и обращенно-фазового вариантов ВЭЖХ.
' СНз феофитин а (Фн а) СНО феофитин Ь (Фн Ь)
Я= СНз феофитинат а (МФн а) СНО феофитинат Ъ (МФн Ь) М= Мё(П), Си(Н), гп(Щ, РЬ(П), ^(Н), Се(1У)
>—я
а
Порфирин М X У г Условное обозначение
Тетрафенилпорфирин н2 н н н Н2ТФП
Тетра(2,6-дифтор-фенил)порфирин н2 ? н н Н2(2,6-диР)4ТФП
Тетра(2,6-дифтор-фенил)порфиринат никеля (II) № ? н н №(2,6-диР)4ТФП
Тетра(пентафтор-фенил)порфирин Н; и р р Н2ТПФФП
Тетра(п-метокси-фенил)порфирин н2 н н ОСНз Н2(п-ОСН3)4ТФП
Тетра(п-метокси-фенил)порфиринат палладия (II) Р<1 н н ОСНз Рс1(п-ОСНз)4ТФП
Тетрамезитилпорфирин н2 СНз н СНз Н2ТМП
Тетра(2,5-диметил-фенпл)порфирннат никеля (II) N1 СНз, Н Н, СНз Н N¡(2,5-диСН3)4ТФП
Нами показано, что в обоих вариантах ВЭЖХ удерживание порфиринов, имеющих в своей структуре полярные и неполярные части, зависит от энергий взаимодействия сорбат - адсорбент, сорбат - элюент, элюент - адсорбент и определяется строением пигмента. Так, в случае феофитинатов в адсорбции на поверхности неподвижной фазы в обращенно-фазовом варианте ВЭЖХ участвует не только тетрапиррольный макроцикл, как в нормально-фазовой ВЭЖХ, но и фитоловый остаток. Причем фитол встраивается в слой углеводородных радикалов С которые образуют в полярной среде благодаря конформационной подвижности в среднем двойной углеводородный слой. Причиной увеличения удерживания соединений ¿-ряда по сравнению с а-рядом в условиях нормально-фазовой ВЭЖХ могут "быть межпигментные взаимодействия на поверхности сорбента (к которым более склонны соединения Ъ -ряда) и наличие формильнои группы у молекул Ь -ряда на краю макроцикла, противоположном месту расположения кето- и сложноэфирной групп. Возможно участие указанных групп в образовании адсорбционной связи с ОН- группами поверхности силикагеля. В адсорбционном взаимодействии с поверхностью дополнительно могут участвовать система макроцикла и атом металла. В соответствии с теорией ВЭЖХ при переходе от нормально-фазового варианта к обращенно-фазовому порядок удерживания лигандов и их комплексов с металлами меняется на обратный: феофитин а и его комплексы с металлами во всех системах удерживаются сильнее, чем феофитин Ь и его комплексы с металлами (рис. 1,2).
Рис. I. Хроматограммы Хл а, Хл Ь, Н£Фн а, ^Фн 6; система гексан - н.бутанол (96:4) - Силасорб 600, 404 нм
Рис. 2. Хроматограммы Хл а, Хл Ь, Фн а, Фн 6, СеФн а, СеФн Ь\ система ацетонитрил - этанол - уксусная кислота (40:40:16) - ц-Вопёарак С|8, 430 нм
Удерживание производных тетрафенилпорфирина на всех адсорбентах определяется суммой неспецифических межмолекулярных взаимодействий с адсорбентом и специфических межмолекулярных связей с полярным элюентом и, как правило, согласуется с полярностью заместителей в фенильных остатках (рис.
о
3,4).
Рис. 3. Хроматограммы Н2(2,6-диР)4ТФП (1), Н2ТФП (2), Н2ТМП (3), N¡(2,6-диР)4ТФП (4), Ni(2,5-диCHз)4TФП (5). Система: этилацетат - уксусная кислота -вода (9:2:2) - Нуклеосил С^, расход элюента 100 мкл/мин
5
I-,-—,---,-—,-—
0 2С0 400 600 800
V, мкл
Рис. 4. Хроматограммы Н2ТФП (1), Н2(п-ОСН3)4ТФП (2), Н2(2,6-диР)4ТФП (3), №(2,5-диСНз)4ТФП (4), Н1(2,6-диР)4ТФП (5) в системе: а,б - гексан - изопропанол (95:5) - Диасорб-130-амин; расход элюента 100 мкл/мин
Введение центрального атома металла изменяет Хроматографическое поведение соединений, что обусловлено изменением реакционного центра молекулы порфирина М4Н2->Ы4М. Порядок элюирования комплексов определяется рядом факторов, действующих в различных направлениях: электроотрицательностью и эффективным радиусом иона металла степенью их координационной насыщенности, растворимостью, кинетической и термодинамической устойчивостью комплексов. Как правило, координационно-ненасыщенные комплексы (РЬ, Мб, Но), присоединяющие в качестве дополнительных лигандов молекулы подвижной фазы, удерживаются слабее координационно-насыщенных комплексов (Си, Рё) в обращенно-фазовой ВЭЖХ. В нормально-фазовой наблюдается обратный порядок. Гексан - н.бутанол (96:4) - Силасорб 600
ФнМ а: Се < Ъъ < Си < Мб < Н§ < РЬ ФнМ Ь: Се < Си < 2п < < На < РЬ Ацетонитрил - этанол - уксусная кислота (40:40:16) - Нуклеосил С!8 ФнМ а: РЬ < Нб < Мб < гп < Се < Си ФнМ Ь: РЬ < Нб < Мб < Ъп < Си < Се При этом порядок выхода из колонки лигандов и их комплексов одинаков. Обращенно-фазовыи вариант ВЭЖХ:
Н2(2,6-диР)4ТФП < Н2(п-ОСН3)4ТФП < Н2ТФП < Н2ТМП №(2,6-диР)4ТФП < Рс1(п-ОСНз)4ТФП < №(2,5-диСН3)4ТФП Сопоставлена селективность хроматографического разделения производных тетрафеншшорфирина на различных адсорбентах (рис. 5). Модифицированные силикагели можно использовать в разных вариантах хроматографии. При работе в обращенно-фазовом режиме адсорбент Диасорб-фенил может проявлять свойства, близкие к свойствам сорбента Нуклеосил С(8.
12
15 4 3
«и_1_1.
1
3 2
1 2 3 4 5 6 7
1.0
1.2
1.4
1.6
Рис. 5. Ряды селективности для сорбентов Диасорб-амин (а), Диасорб-фенил (б), Нуклеосил С!8 (в). Подвижная фаза - ацетонитрил. 1 - ТПФФП, 2 - Н2ТМП, 3 -Н2ТФП, 4 - Н2(п-ОСН3)4ТФП, 5 - Н2(2,6-диР)4ТФП
В условиях нормально-фазового режима хроматографии (подвижная фаза -неполярный растворитель) адсорбенты Диасорб-фенил и Диасорб-амин близки по свойствам к силикагелю - Силасорб 600. Силикагели, модифицированные фенильными и аминопропильными группами, удобно использовать для разделения порфиринов, сильно различающихся по полярности.
Сложный характер зависимости удерживания порфиринов от состава подвижных фаз определяется, по-видимому, суммой специфических и неспецифических межмолекулярных взаимодействий порфирин - элюент. Поэтому для описания удерживания порфиринов целесообразно применять квазихимическую модель равновесной адсорбции, общую для нормально- и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Модель учитывает межмолекулярные взаимодействия сорбат - сорбент, сорбат - модификатор, модификатор - сорбент, а также ассоциацию компонентов хроматографической системы в подвижной фазе.
Изучение адсорбции порфиринов методом ВЭЖХ
Поскольку порфирины играют важную роль в возникновении косвенного сигнала, необходим правильный выбор модификатора подвижной фазы. Для этого важно выяснить механизм адсорбции самих модификаторов. Поэтому экспериментальные данные по хроматографическому удерживанию порфиринов были обработаны согласно моделям Скотта-Кучеры и Снайдера-Сочевинского, измерены и рассчитаны изотермы адсорбции.
Классические модели описывают концентрационную зависимость удерживания только в ограниченном диапазоне концентраций полярной добавки подвижной фазы (рис. 6). Для адекватного описания механизмов удерживания производных тетрафенилпорфирина целесообразно применять физико-химическую модель мономолекулярной адсорбции, общую для нормально- и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Модель учитывает все факторы, влияющие на удерживание: межмолекулярные взаимодействия сорбат - сорбент, сорбат - модификатор, модификатор - сорбент, ассоциацию компонентов хроматографической системы в подвижной фазе, а также полярность заместителей, растворимость, процессы сольватации.
Методом микроколоночной ВЭЖХ изучена адсорбция Н2(п-ОСНз)4ТФП и его комплекса с Рё, феофитинов а и Ь и их комплексов с металлами в нормально- и обращенно-фазовом вариантах ВЭЖХ (рис. 7).
Величины поверхностной адсорбции соединений в зависимости от их концентрации в подвижной фазе рассчитывали по методу Глюкауфа:
к = сисх-У-ч/8пта-IV
где а - адсорбция, моль/г; сисх,срт11 - исходная и равновесная концентрации, моль/л, соответственно: V - объем пробы, л; g=0,! г масса сорбента; Ь - высота пика, см; ч -скорость движения диаграммной ленты, см/мин; - скорость потока подвижной фазы, л/мин; 5',|„„,5,;,„ - площадь пика и площадь адсорбции, см", соответственно.
1/к' 1,6-]
1,41,21,00.8 -0,! 0,40,2-
0,0'
-1—'—I—1—I— 0,0 0,1 0,2
0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,!
М(ЕЮН)
б 0,8
0,6
0,4 -
0,2-
-0.2-
—I---1---1->-1—
0,8 1.0 1,2 1.4
1.8 2,0 -^М(Щ)
Рис. 6. Зависимость обратной величины коэффициента емкости (1/к') от мольной доли этанола (М(ЕЮН)) в подвижной фазе ацетонитрил - этанол для сорбента Нуклеосил С|в (а). Зависимость логарифма коэффициента емкости (1§ к') от отрицательного логарифма мольной доли изопропанола (-^ М(ИП)) в подвижной фазе гексан - изопропанол для сорбента Силасорб 600 (б). 1 - Н2ТПФФП, 2 -Н2(2,6-диР)4ТФП и №(2,6-диР)4ТФП, 3 - Н2(п-ОСН3)4ТФП и Рс1(п-ОСН3)ДФП, 4 -Н,ТФП, 5 - Н2ТМП и Ы1(2,5-диСН3)4ТФП
Удерживание практически всех порфиринов растет с увеличением концентрации, передние границы хроматографических пиков совпадают. Это характерно для изотерм 5 - класса. Б-образный вид практически всех изотерм обусловлен превышением энергии взаимодействия порфирин - растворитель над энергией взаимодействия порфирин - адсорбент. Отметим, что не удается достигнуть значительных степеней адсорбции металлокомплексов, поскольку велика энергия межмолекулярного взаимодействия этих сорбатов с растворителем.
Расположение изотерм адсорбции, как правило, согласуется с порядком выхода из колонки изучаемых соединений.
а! О', моль/г
СравнЧО6, М
Рис. 7. Изотермы адсорбции феофитина и феофитинатов металлов в системе гексан - бутанол (96:4) - Силасорб 600
На основании полученных нами данных и требований, предъявляемых к модификаторам подвижных фаз, в качестве модификаторов были выбраны шесть соединений: хлорофилл, феофитин, тетрафенилпорфирин, тетра(2,6-дифторфенил)порфирин, тетра(п-метоксифенил)порфирин, Рс1-тетра(п-метоксифен!1л)порфирнн. В качестве анализируемых соединений выбраны представители некоторых классов неэлектролитов: фенолы, спирты, витамины, краун-эфиры, углеводы. Выбор таких соединений связан с тем, что нужны чувствительные и экспрессные методы определения биологически активных соединений (витамины, углеводы) в пищевых, фармацевтических, косметических и др. препаратах; необходимы методы контроля состава реакционной смеси в процессе синтеза краун-эфиров и витаминов.
Спектрофотометрическое изучение взаимодействий модификаторов с витаминами, краун-эфирами и углеводами
Отметим, что особые свойства порфиринов - высокая стабильность ароматической л-системы, присутствие мощной хромофорной системы, макроциклический эффект, комплексообразующие свойства - позволяют спектрофотометрически исследовать эффекты слабых взаимодействий модификаторов с растворителями и сорбатами.
Известно, что при взаимодействии с л-акцепторами наблюдается сдвиг длинноволновой полосы в коротковолновую область и связь в комплексах пигментов с я-акцепторами имеет донорно-акцепторный характер. Вероятнее всего в образовании связи участвует я-система молекулы пигмента. В то же время при взаимодействии пигментов с «-донорами были обнаружены длинноволновые сдвиги полос и взаимодействие по атому Mg молекулы хлорофилла. Присоединение аксиальных лигандов сопровождается сдвигом полос поглощения на 5-35 нм, направление сдвига зависит от природы центрального атома металла и лиганда.
Чтобы подтвердить наличие взаимодействий модификатор - сорбат, записывали электронные спектры поглощения индивидуальных соединений (модификаторы, сорбаты), смесей модификатор - сорбат с разным соотношением компонентов (от 1:1 до 1:25) и выявляли изменения в спектре хлорофилла, Н2ТФП и Р(1(п-ОСН3)4ТФП в присутствии витаминов Е и D3, краун-эфиров 18К6 и ДБ18К6, рамнозы, мальтозы, сорбита.
В спектрах модификаторов, как правило, имеют место батохромные и гипсохромные сдвиги полос поглощения (2-12 нм), гипо- и гиперхромные эффекты. Указанные изменения в ЭСП хлорофилла наблюдаются в области 220330 нм, а в ЭСП Н2ТФП и Рс1(п-ОСН3)4ТФП в двух областях -250-290 и 410-420 нм.
Экспериментальные данные подтверждают, что электронодонорная способность убывает от хлорофилла к Н2ТФП и Р(3(п-ОСН3)4ТФП, но в металлокомплексе появляется новый центр сольватации - атом палладия. Не противоречат они и вышеизложенным данным о взаимодействии порфиринов с л-акцепторами и «-донорами.
Так в спектре хлорофилла с витамином Е. относящимся к природным фенолам, наблюдается как бато-, так и гипсохромный сдвиги (270-285 нм). На состояние гс-системы хлорофилла, возможно, влияют взаимодействия гидрофобных структур - фитолового остатка хлорофилла и витамина Е.
Поскольку по своей структуре, свойствам и действию краун-эфиры аналогичны порфиринам, возможно л-л -взаимодействие их макроциклических л-электронных систем. Кроме того, атом Mg молекулы хлорофилла, вероятно, взаимодействует с кольцом крауна. Это обусловлено электростатическим ион-дипольным взаимодействием катионов с отрицательно заряженными донорнымп атомами кислорода, расположенными упорядоченно в полиэфирном кольце. А также тем, что Mg имеет координационное число, равное 5. Наши данные подтверждают, что электронодонорная способность атомов кислорода в ДБ18К6 меньше, чем в 18К6.
Заметные изменения в ЭСП хлорофилла происходят при смешивании его с углеводами. Последние, возможно, образуют водородную связь через одну из ОН-
групп с кето-группой в пятом кольце хлорофилла. В образовании водородной связи может участвовать не только кето-группа (С=0) пятого кольца молекулы пигмента, но и группа ЫН или атом азота феофитина, образуя с ОН-группой фенола связи типа ЫН«* ОН или —О.
Заметны изменения в ЭСП НгТФП, обусловленные тг-я - взаимодействием макропиклов ДБ18К6 и тетрафенилпорфирина. Отметим также существенный гиперхромный эффект (Д А=2,5) при взаимодействии витамина 03 и Рс1(п-ОСН3)4ТФГ1.
Таким образом, при использовании элюента, содержащего модификатор, при введении пробы нарушается равновесное распределение модификатора между подвижной и неподвижной фазами за счет взаимодействий определяемых компонентов с модификатором. Это позволяет детектировать соединение, вызывающее указанное нарушение. Интенсивность сигнала пропорциональна степени смещения равновесия.
Определение некоторых групп неэлектролитов методом ВЭЖХ с косвенным спектрофотометрнческим детектированием
Исследовано поведение витаминов, краун-эфиров и углеводов в модифицированных и немодифицированных подвижных фазах. Выбраны условия для косвенного детектирования этих соединений. Изучена зависимость косвенного отклика от содержания анализируемого соединения в пробе, от концентрации модификатора в подвижной фазе (рис. 8).
Рис. 8. Зависимость высоты пика (Ь) от содержания витамина Е (тЕ) при различных концентрациях Хл(а+Ь) в системе ацетоннтрил+Хл - Нуклеосил С|8. 1 -С(Хл)=1,331(Г5 М, 2-С(Хл)=8,89 Ю"6 М, 3 - С(Хл)=4,45'10"6 М
И, а
0.0 0.4 0.8 1,2 1.6 2.0 2.4 2,8 3,2 3,6
тЕ 10!, г
Установлено, что косвенный отклик увеличивается при увеличении концентрации анализируемого соединения и модификатора. Исследовано влияние концентрации модификатора в подвижной фазе на относительное удерживание и чувствительность определения соединений (табл. 1. рис. 9). Проанализированы некоторые фармацевтические препараты (табл.2, рис.10).
Таблица 1. Коэффициенты емкости фенола и п-нитрофенола при различных концентрациях хлорофилла в подвижной фазе.
Анализи руемое соединение Модификатор подвижной фазы
Хлорофилл (а + Ь) Фн Ь Н,(п-ОСНз)4 ТФП
2,1 10-41 1,79' 2,5 10"6М 1,63' 5,0 10"6 М 1,46* 7,4 10"6 М 1,19' 6,8 Ю-7 М 4,32' 3,8 10"8М 1,22'
Фенол 2,84 2.48 2.46 1,79 1,10 1.30
п-Нитро-фенол 4,54 2,25 2,16 2,37 2,07 1,59
* - коэффициенты емкости модификаторов в подвижной фазе
3.6 3,4 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0-5
-4,8 -».6 -4,4 -4.2 -4,0
^(модификатор)
Рис. 9. Зависимость логарифма косвенного отклика метанола (1), этанола (2). изопропанола (3), н.бутанола (4) от логарифма концентрации Н2(п-ОСН3)4ТФП -модификатора хроматографической системы гексан - н.бутанол (96:4) - Силасорб 600
* V
о 4 а 12
16 20 24 28
I мнн
О 4 8 12 18 20 24 28 I, МИН
Рис. 10. Хроматограммы экстрактов «Компливита» (а) и «Гендевита» (б) в системе ацетонитрил + Хл (а+Ь) (8,6 10"6 М) - ц-Вопс!арак С]8,430 нм. 1 - аскорбиновая кислота, 2 - витамин В1, 3 - витамин Е, 4 - модификатор Хл
Таблица 2. Содержание витаминов Е и В в определяемых препаратах (п=3, Р=0,95)
| Объект Подвижная фаза Содержа-
исследо- АН-гХ.1 (8,89 10"ЛМ) АН+Н2ТФП (8,33 10-АМ) ние по
1 вання 404 нм 404 нм паспорту, г
! Ь, мм ШЕ. г 8, мм2 тЕ, г
1 Компливит 2.3 0,011+0,001 11,0 0,0101+0,0006 0,01
1 Масло 7.0 0,072±0,008 40,0 0,0782±0,0008 0,08534
АН+Хл (8,610"6 М)
430 нм
Компливит 13,0 0,0099+0,0002 0,01
Гендевит 12,0 0,0098+0,0002 0,01
АН+Н2ТФП(3,010-7М)
420 нм
И. см шп. г
Юникап 3,2 (12,4+0,3)10'6 12,5 10'6
Пиковит 1,5 (2,1±0,5)10"6 210'6
Гендевит 2,3 (6,2±0,3)'Ю'6 6,25 10"6
Таким образом, установлено, что комплексообразование (л-я-, п-л взаимодействия, образование водородных связей), смещение мономер-димерного равновесия, изменение растворимости и сольватации модификатора в присутствии анализируемых соединений приводит к возникновению косвенного сигнала, который позволяет детектировать органические молекулы в видимой области спектра.
Выводы
1. Синтезированы феофитинаты а и Ъ меди, цинка, ртути, свинца и церия. Найдены условия для разделения лигандов (феофитины а и Ь) и их комплексов с металлами М£(Н), Н§(11), РЬ(Н), Zn(ll), Си(И), Се(1У) в условиях нормально- и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Подтверждено, что удерживание соединений этого класса зависит от свойств неподвижной и подвижной фаз, природы лиганда, центрального атома металла.
2. Сопоставлением селективности хроматографического разделения тетрафенилпорфирина, тетра(2,6-дифторфенил)порфирина и его комплекса с никелем, тетра(п-метоксифенил)порфирина и его комплекса с палладием, тетрамезитилпорфирина, никель-тетра(2,5-диметилфенил)порфирина, тетрапентафторфенилпорфирина на сорбентах Силасорб 600, Нуклеосил С|8, Диасорб-130-фенил, Диасорб-130-амин в условиях нормально- и обращенно-фазовой ВЭЖХ установлено, что модифицированные силикагели можно использовать для разделения порфиринов с заместителями различной полярности.
3. С целью уточнения механизма удерживания порфиринов разных структурных групп методом ВЭЖХ получены и проанализированы изотермы адсорбции. Установлено, что классические модели Скотта-Кучеры и Снайдера-Сочевинского описывают зависимость удерживания порфиринов только в ограниченном диапазоне концентраций полярной добавки подвижной фазы. Подтверждено, что квазихимическую модель равновесной адсорбции, общую для нормально- и обращенно-фазовой ВЭЖХ, целесообразно применять для
адекватного описания механизмов удерживания феофитинатов металлов и производных тетрафенилпорфирина.
4. Установлено, что порфирины удовлетворяют основным требованиям, предъявляемым к модификаторам подвижных фаз для косвенного спектрофотометрического детектирования неэлектролитов, не поглощающих или имеющих низкое поглощение в видимой области спектра. Предложены б соединений: хлорофилл а.Ь, феофитин Ь, тетрафенилпорфирин, тетра(2,6-дифторфеннл)порфирин, тетра(п-метоксифенил)порфирин и его комплекс с палладием в качестве модификаторов подвижных фаз для косвенного спектрофотометрического детектирования неэлектролитов.
5. Найдены условия для разделения и количественного определения витаминов Е и Оз, 18К6 и ДБ18К6 с косвенным фотометрическим детектированием. Проанализированы фармацевтические препараты, содержащие витамины Е и О.
6. На основании анализа ЭСП модификаторов подвижных фаз - хлорофилла а,Ь, тетрафенилпорфирина и Рс1-тетра(п-метокси-фенил)порфирина в присутствии неэлектролитов: витаминов (Е, Бз), краун-эфиров (18К6, ДБ18К6), углеводов (мальтоза, рамноза, сорбит) предложены механизмы возникновения косвенного отклика.
Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:
1. Лазарева Е.Е. Высокоэффективная жидкостная хроматография комплексов феофитина с металлами. Тез. докл. Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 96». Москва. 1996г.
2. Брыкина Г.Д., Лазарева Е.Е., Уварова М.И., Шпигун О.А. Высокоэффективная жидкостная хроматография комплексов металлов с феофитинами а и b // Журн. аналит. химии. 1997. Т.52. №10. С.1067.
3. Брыкина Г.Д., Лазарева Е.Е., Уварова М.И., Шпигун О.А. Хлорофилл как модификатор подвижных фаз для косвенного спектрофотометрического детектирования неэлектролитов в высокоэффективной жидкостной хроматографии//Журн. аналит. химии. 1997. Т.52. №10. С.1073.
4. Lazareva Е.Е., Brykina G.D., Shpigun О.А. Indirect detection in HPLC of phenols. Abs. of International congress on analytical chemistry. Moscow (Russia). 1997. V.2. P. E-52.
5. Лазарева E.E., Коровин И.Ю., Брыкина Г.Д. Исследование адсорбции феофитинатов а,Ъ Се (IV) методом ВЭЖХ // Всстн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 1998. Т.39. №2. С.106.
6. Лазарева Е.Е., Брыкина Г.Д., Шпигун О.А. Косвенное спектрофотометрическое детектирование неэлектролитов в высокоэффективной жидкостной хроматографии (обзор)//Журн. аналит. химии. 1998. Т.53. №3. С.230.
7. Lazareva Е.Е., Brykina G.D., Shpigun О.А. Investigation of adsorption of tetraphenylporphyrin derivatives by HPLC. Application of porphyrins for indirect detection of non - electrolytes in HPLC. Abs. of International conference on spectroscopy and chemistry of porphyrins. Minsk (Belarus). 1998.
8. Брыкина Г.Д., Лазарева E.E., Шпигун О.А. Влияние центрального атома металла и структурных особенностей металлопорфиринов на их хроматографические свойства. Тез. докл. XIX Чугаевского совещания по химии координационных соединений. Иваново. 1999.
9. Brykina G.D., Lazareva Е.Е., Shpigun О.А. High performance liquid chromatographic investigation of tetraphenylporphyrin and its derivatives // Chromatographia. 1999. V.50. №11/12. P. 716.
10. Лазарева E.E., Брыкина Г.Д., Шпигун О.А. ВЭЖХ тетрафенилпорфирина и его производных на модифицированных силикагелях // Журн. физ. химии. 2000. Т. 74. №3. С.519.
ВВЕДЕНИЕ.
Елава 1. Косвенное спектрофотометрическое детектирование неэлектролитов в высокоэффективной жидкостной хроматографии (обзор литературы).
Глава 2. Исходные вещества, аппаратура, расчетные формулы.
Глава 3. Хроматографическое поведение растительных пигментов и их производных.
3.1. Нормально-фазовая ВЭЖХ.
3.2. Обращенно-фазовая ВЭЖХ.
3.3. Обсуждение результатов.:.
Глава 4. Хроматографическое поведение некоторых синтетических порфиринов на различных сорбентах.
4.1. Силасорб 600.
4.2. Нуклеосил С^.
4.3. Диасорб-130-фенил.
4.4. Диасорб-130-амин.
4.5. Обсуждение результатов.
Глава 5. Изучение адсорбции порфиринов.
5.1. Использование моделей Скотта-Кучеры и Снайдера-Сочевинского.
5.2. Построение изотерм адсорбции по данным ВЭЖХ.
5.3. Обсуждение результатов.
Глава 6. Косвенное спектрофотометрическое детектирование органических молекул.
6.1. Косвенное детектирование некоторых фенолов и спиртов.
6.2. Определение жирорастворимых витаминов Е и Б.
6.3. Определение краун-эфиров.
6.4. Определение некоторых углеводов.
Актуальность темы. В настоящее время одним из направлений в развитии высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является разработка новых детектирующих систем. Метод косвенного спектрофотометрического детектирования позволяет расширить круг веществ, определяемых методом ВЭЖХ, а в ряде случаев повысить чувствительность определения соединений, не поглощающих или имеющих низкое поглощение в ультрафиолетовой или видимой областях спектра. Однако результаты определения неэлектролитов трудно прогнозировать, поскольку не вполне ясен механизм возникновения косвенного отклика и мало исследована концентрационная зависимость площади аналитического сигнала. Поэтому актуальна разработка различных вариантов косвенного детектирования в ВЭЖХ и поиск новых модификаторов подвижных фаз, поглощающих в видимой области спектра. В соответствии с этим в настоящей работе для косвенного спектрофотометрического детектирования органических молекул (фенолы, спирты, витамины, краун-эфиры, углеводы) предлагается использовать порфирины. Порфирины удовлетворяют основным требованиям, предъявляемым к модификаторам подвижных фаз для косвенного спектрофотометрического детектирования неэлектролитов, однако ранее для этих целей не использовались.
Цель работы: изучение хроматографического поведения порфиринов в различных подвижных фазах на различных сорбентах для выбора модификаторов подвижных фаз и использование этих модификаторов для косвенного спектрофотометрического детектирования органических молекул в видимой области спектра.
Для достижения поставленной цели
- изучено влияние природы, состава подвижных фаз, природы неподвижных фаз, структурных особенностей лигандов и их комплексов с металлами на хроматографические параметры удерживания порфиринов;
- рассмотрены механизмы сорбции порфиринов и металлопорфиринов в условиях нормально- и обращенно-фазового вариантов ВЭЖХ;
- спектрофотометрически исследованы эффекты слабых взаимодействий порфирин - сорбат;
- систематически исследованы зависимости косвенного отклика от концентрации анализируемого соединения, концентрации модификатора в подвижной фазе; влияние концентрации модификатора на относительное удерживание и чувствительность определения соединений;
- проанализированы фармацевтические препараты, содержащие витамины Е и Б.
Научная новизна. В условиях нормально- и обращенно-фазового вариантов ВЭЖХ на сорбентах Силасорб 600, Диасорб-130-фенил, Диасорб-130-амин, Нуклеосил С18 исследовано и сопоставлено поведение ряда растительных (феофитины а и Ъ и их комплексы с (II), Ь^ (II), РЬ (II), Си (II), Хп (II), Се (IV)) и синтетических пигментов (тетрафенилпорфирин и некоторые его производные). Найдены условия для разделения лигандов с заместителями различной полярности и их комплексов с металлами. Данные по хроматографическому удерживанию порфиринов обработаны согласно моделям Скотта-Кучеры, Снайдера-Сочевинского, рассчитаны и построены изотермы адсорбции. Предложена теоретическая интерпретация полученных результатов, рассмотрены возможные механизмы удерживания порфиринов на различных сорбентах. В качестве модификаторов подвижных фаз выбраны шесть порфиринов. В результате изучения электронных спектров поглощения (ЭСП) модификаторов - хлорофилла (а+Ь), тетрафенилпорфирина, Рс!(и-метоксифенил)порфирина - в присутствии витаминов Е и 03, краун-эфиров (18-краун-6 и дибензо-18-краун-6), углеводов (рамноза, сорбит, мальтоза) показана возможность использования эффекта слабых взаимодействий для косвенного спектрофотометрического детектирования некоторых классов органических молекул (фенолы, спирты, витамины, краун-эфиры, углеводы). Предложены механизмы возникновения косвенного отклика.
Практическая значимость. Показано, что методом ВЭЖХ можно идентифицировать феофитины а и Ъ и их комплексы с металлами (II), Р^ (II), РЬ (II), Си (II), Ъп (II), Се (IV)) в процессе их синтеза, а также определять эти
Выводы
1. Синтезированы феофитинаты а и Ъ меди, цинка, ртути, свинца и церия. Найдены условия для разделения лигандов (феофитины а и Ь) и их комплексов с металлами N^(11), Щ(П), РЬ(П), Си(П), Се(1У) в условиях нормально- и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Подтверждено, что удерживание соединений этого класса зависит от свойств неподвижной и подвижной фаз, природы лиганда, центрального атома металла.
2. Сопоставлением селективности хроматографического разделения тетрафенилпорфирина, тетра(2,6-дифторфенил)порфирина и его комплекса с никелем, тетра(п-метоксифенил)порфирина и его комплекса с палладием, тетрамезитилпорфирина, никель-тетра(2,5-диметилфенил)порфирина, тетрапентафторфенилпорфирина на сорбентах Силасорб 600, Нуклеосил С!8, Диасорб-130-фенил, Диасорб-130-амин в условиях нормально- и обращенно-фазовой ВЭЖХ установлено, что модифицированные силикагели можно использовать для разделения порфиринов с заместителями различной полярности. Построены шкалы селективности.
3. С целью уточнения механизма удерживания порфиринов разных структурных групп методом ВЭЖХ получены и проанализированы изотермы адсорбции. Установлено, что классические модели Скотта-Кучеры и Снайдера-Сочевинского описывают зависимость удерживания порфиринов только в ограниченном диапазоне концентраций полярной добавки подвижной фазы. Подтверждено, что квазихимическую модель равновесной адсорбции, общую для нормально- и обращенно-фазовой ВЭЖХ, целесообразно применять для адекватного описания механизмов удерживания феофитинагов металлов и производных тетрафенилпорфирина.
4. Установлено, что порфирины удовлетворяют основным требованиям, предъявляемым к модификаторам подвижных фаз для косвенного спектрофотометрического детектирования неэлектролитов, не поглощающих или имеющих низкое поглощение в видимой области спектра. Предложены 6 соединений: хлорофилл а,Ъ, феофитин Ъ, тетрафенилпорфирин, тетра(2,6-дифторфенил)порфирин, тетра(п-метоксифенил)порфирин и его комплекс с палладием в качестве модификаторов подвижных фаз для косвенного спектрофотометрического детектирования неэлектролитов.
5. Найдены условия для разделения и количественного определения витаминов Е и 03, 18К6 и ДБ18К6 с косвенным фотометрическим детектированием. Проанализированы фармацевтические препараты, содержащие витамины е и Б.
6. На основании анализа ЭСП модификаторов подвижных фаз - хлорофилла а,Ь, тетрафенилпорфирина и Рс1-тетра(п-метокси-фенил)порфирина в присутствии неэлектролитов: витаминов (Е, 03), краун-эфиров (18К6, ДБ18К6), углеводов (мальтоза, рамноза, сорбит) - предложены механизмы возникновения косвенного отклика.
1. Chaplin M.F., Kennedy J.F. // Carbohydrate analysis, a practical approach. IRL Press, Oxford, 1986.
2. Crommen J., Schill G., Herne P. // Chromatographia. 1988. V.25. P.397.
3. Small H., Miller T.A.//Anal.Chem. 1982. V.54. P.462.
4. Small H. // Anal.Chem. 1983. V.55. P.235A.
5. BidlingmeyerB.A., WarrenF.V. //Anal.Chem. 1982. V.54. P.2351.
6. Stranahan J.J., Deining S.N. // Anal.Chem. 1982. V.54. P.1540,2251.
7. Freiser H., Gnanasambandan T. // Anal.Chem. 1982. V.54. P. 1282.
8. Parkin J.E. // J.Chromatogr. 1984. V.287. P.457.
9. Vigh G.,Leitold A.//J.Chromatogr. 1984. V.312. P.345.
10. Parkin J.e., Lau H.T. // J.Chromatogr. 1984. V.314. P.488.
11. Banerjee S. //Anal.Chem. 1985. V.57. P.2590.
12. Parkin J.e. //J.Chromatogr. 1986. V.351. P.532.
13. Glavina L.L.M., Cantwell F.F. //Anal.Chem. 1993. V.65. P.268.
14. Banerjee S., Castrogivanni M.A. // J.Chromatogr. 1987. V.396. P. 169.
15. Parkin J.e. //J.Chromatogr. 1984. V.303. P.436.
16. Herne P., Renson M., Crommen J. // Chromatographia. 1984. V.19. P.274.
17. Lu В., Stefansson M., Westerlund D. //J.Chromatogr., A. 1995. V.697. P.317.
18. Parkin J.e. //J.Chromatogr. 1986. V.370. P.210.
19. Parkin J.e. //J.Chromatogr. 1987. V.407. P.389.
20. Schill G., Arvidsson E. // J.Chromatogr. 1989. V.492. P.299.
21. McCrossen S.D. Simpson C.F. // Anal.Proc. 1994. V.31. P.9.
22. McCrossen S.D., Simpson C.F. // J.Chromatogr., A. 1995. V.697. P.53.
23. Hackzell L., Schill G. // Chromatographia. 1982. V.15. N7. P.437.
24. Takeuchi Т., Ishii D. // J.Chromatogr. 1987. V.396. P. 149.
25. Шатц В.Д., Сахартова O.B. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Рига: Зинатне, 1988. 390 с.
26. Crommen J., Schill G., Westerlund D., Hackzell L. // Chromatographia. 1987. V.24. P.252.
27. Schill G., Crommen J. // TRAC. Tends in anal. ehem. 1987. V.6. N5. P.l 11.
28. Barber W.e., CarrP.W. //J.Chromatogr. 1984. V.316. P.211.i о л1 JJ>
29. Levin S., Grushka E. //Anal.Chem. 1986. V.58. P.1602.
30. Maki S.A., Wangsa J., Danielson N.D. //Anal. Chem. 1992. V.64. N6. P.583.
31. Takeuchi Т., Watanabe S., Murase K., Ishii D. // Chromatographia. 1988. V.25 P.107.
32. Berthod A., Click M„ Winefordner J.D. // J.Chromatogr. 1990. V.502. P.305.
33. Vemulapalli G.K., Gnanasambandan T. //Anal.Chim.Acta. 1984. V.164. P.267.
34. Herne P. // J.Pharm.Belg. 1990. V. 45. N2. P.151.
35. McCormick R.M., Karger B.L. // J.Chromatogr. 1980. V.199. P.259.
36. Geng X., Regnier F.E. //J.Chromatogr. 1985. V.332. P.147.
37. Scott R.P.W., Simpson C.F. // Faraday Symp.Chem.Soc. 1980. V.15. P.69.
38. Stahlberg J., Almgren M. // Anal.Chem. 1985. V.57. P.817.
39. Carr J.W., Harris J.M. // Anal.Chem. 1986. V.58. P.626.
40. Michels J.J., Dorsey J.G. //J.Chromatogr. 1988. V.457. P.85.
41. Stahlberg J., Almgren M. //Anal.Chem. 1989. V.61. P.l 109.
42. Knox .Т.Н., Hartwick R.A. //J.Chromatogr. 1981. V.204. P.3.
43. Arvidsson E., Crommen J., Schill G., Westerlund D. // J.Chromatogr. 1989. V.461. P.429.
44. Gnanasambandan Т., FreiserH. //Anal.Chem. 1981. V.53. P.909.
45. Ishii D., Takeuchi Т. // Кукан кагаку сосэцу. 1990. N9. С. 98,219.
46. Crommen J., Herne P. // J.Pharm.Biomed.Anal. 1984. V.2. P.241.
47. Arvidsson E. // J.Chromatogr. 1987. V.407. P.49.
48. DenkertM., Hackzell L., Schill G., Sjogren E.//J.Chromatogr. 1981. V.218. P.31.
49. Hackzell L., Rydberg Т., Schill G. //J.Chromatogr. 1983. V.282. P.179.
50. Dona A.-M., Verchere J.-F. // J.Chromatogr., A. 1995. V.689. P. 13.
51. Gnanasambandan Т., FreiserH. //Anal.Chem. 1982. V.54. P.2379.
52. Crommen J. //J.Pharm.Biomed.Anal. 1983. V.l. P.549.
53. Massaccesi M.// Farmaco. 1992. V.47(5, Suppl.). P.753.
54. Da S.// Fenxi Huaxue. 1989. V.17. N4. P.372.
55. Hayakawa KM Yakugaku Kenkyu no Shinpo. 1994. V.l 1. P. 127.
56. Hayakawa K., Yamamoto A.// Bunseki Kagaku. 1995. V.44. N6. P.417.
57. Малый практикум по физиологии растений / Под ред. Мокроносова А.Т. М.:МГУ, 1994. 183с.58.0ловянишникова Г.Д. Дис. .канд.хим.наук. М.: МИТХТ, 1979. 59. Ломова Т.Н., Андрианова Л.Г., Березин Б.Д. // Коорд. химия. 1988. Т. 14. №4. С.453.
58. InoueH., FuruyaK., Watanabe Т. et al. //Anal. Sei. 1988. V.4. №6. P.599.
59. Watanabe Т., Hongu A., Hondo К., Nakazato M., Konno M., Saitoh S. // Anal. Chem. 1984. V. 56. P.251.
60. Порфирины: структура, свойства, синтез / Под ред. Аскарова К.А., Березина Б.Д., Евстигнеевой Р.П. и др. М.: Наука, 1985. С. 192.
61. Березин Б.Д., Койфман О.И. // Успехи химии. 1980. Т.49. №12. С.2389.
62. Стыскин Е.А., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М.: Химия, 1986. С.97.
63. Экспериментальные методы в адсорбции и молекулярной хроматографии / Под ред. Киселева A.B., ДревингаВ.П. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1973. С.353.
64. Гришина Л.Е., Брыкина Г.Д., Шпигун O.A. // Журн. аналит. химии. 1995. Т. 50. №9. С.902.
65. Мартыненко Л.И. // Успехи химии. 1991. Т. 60. №9. С.1969.
66. Хроматография. Практическое приложение метода. Т.1. / Под ред. Хефтмана Э. М.: Мир, 1986. 336с.
67. Furuya К., Inoue Н., Shirai Т. // Anal. Sei. 1987. V.3. №4. P. 353.
68. Li S„ Inoue H. // Chromatographia. 1992. V.33. №11-12. P. 567.
69. FuruyaK., Ohki N., Inoue H., Shirai T. // Chromatographia. 1988. V.25. №4. P.319.
70. Inoue H., Imai M., Naemura Т., Furuya K., Shizuri Y. // J.Chromatogr. 1993. V.645. №2. P.259.
71. Березин Б.Д. //Журн. неорган, химии. 1992. Т.37. №6. С. 1260.
72. Кропачева Т.Н., Мамлеева H.A., Некрасов Л.И. // Журн. физ. химии. 1984. Т.58. №3. С.692.
73. Мамлеева H.A., Некрасов Л.И. //Журн. физ. химии. 1989. Т.63. №3. С.735.
74. Грей Т. Электроны и химическая связь. М.: Мир, 1967. С.87.
75. Тимербаев А.Р., Петрухин О.М. Жидкостная адсорбционная хроматография хелатов. М.: Наука, 1989. 288 с.
76. Saitoh К., Kobayashi М„ Suzuki N. // J.Chromatogr. 1982. V.243. N2. Р.291.
77. Saitoh К., Suzuki N. //Anal.Chim.Acta. 1985. V.178. N2. P. 169.
78. Saitoh L. // Bunseki kagaku. 1986. V.35. N11. P.895.
79. Suzuki N., Takeda Т., Saiton K. // Chromatographia. 1986. V.22. N1. P.43.
80. Агеева T.A., Березин Б.Д., Березин М.Б. Успехи химии порфиринов. СПб: Изд-во НИИ Химии СПбГУ, 1997. 384с.
81. Jacob К. //J.Liquid Chromatogr. 1990. V.13. N11. Р.2193.
82. Рощина Т.М., Гуревич К.Б., Давыдов В.Я., Мандругин A.A. // Вести, моек, унта. Сер. 2. Химия. 1996. Т.37. № 1. С. 42.
83. Шеппард У., Шарте К. Органическая химия фтора. М.: Мир, 1972. 480с.
84. Растворы неэлектролитов в жидкостях / Под ред. Никифорова М.Ю., Альпера Г.А., Дурова В .А. и др. М.: Наука,1989. 263 с.
85. Snyder L.R., Poppe Н. //J.Chromatogr. 1980. V.184. Р.363.
86. Ланин С.Н., Никитин Ю.С. //Журн.аналит.химии. 1991. Т.46 №8. С. 1493.
87. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джоне К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. С.178.
88. Хираока М. Краун-соединения. Свойства и применение. М.: Мир, 1986. 363 с.
89. ВЭЖХ в биохимии / Под ред. Хеншена А. М.: Мир, 1989. С.582-593.
90. Ланин С.Н., Никитин Ю.С., Сыроватская Е.В. // Журн.физ.химии. 1993. Т.67. №8. С.1658.
91. Креславский В.Д., Садовникова H.A., Оловянишникова Г.Д., Столовицкий Ю.М. // Журн.физ.химии. 1995. Т.69. №2. С.326.
92. Ланин С.Н., Ланина H.A., Никитин Ю.С. // Журн.физ.химии. 1995. Т.69. №11. С.2045.95.0тавин С.Г., Болдескул И.Е. // Биофизика. 1979. Т.25. С.359.
93. Бондарев С.Д., Гуринович Г.П. // Оптика и спектроскопия. 1974. Т.36. С.687.
94. Креславский В.Д., Маслов В.Г., Садовникова H.A. // Журн.физ.химии. 1981. Т.55. С.977.
