Взаимодействие ацидоаминоых комплексов платины (II) и палладия (II) с белками крови и обмен координироованных протеинов на цистин или цистеин тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.01 ВАК РФ

ДНТПРОПЕТРОВСЬКИЙ ДЕРЖАВШИ"! УШВЕРС1ГГЕТ

На правах рукопнсу

КАСЬЯН Галина Борис1вна

взлегадтя ацидолмкових комишкыв платинн(И) та плялднхп)

3 Б1ЛКАШ КРОВ1 ГА ЗШНА КООРДИЮВАШОС ПГОТЕ1Н1В НА ЦИСП Ш АБО ЦИСТЕ Ш

02:00.01 - неорган 1чна х!м1я 03.00.04 - б!ох1м1я

Автореферат

днсертаци на здобуття сченого ступоня кандидата х!м1чних наук

Ди1пропетровськ - 1933

Дисертащею е рукопис

Роботу виконано на кафедр! неорганХчно! х1мп Дн1пропетровсько-

го державного ун1верситету. Науков1 кер1вники:

кандидат х1тчних наук, доцент Зегжда ГеорПй Дмитрович, кандидат бхологгчних наук, с.н.с. Жмарьова Олена Миколахвна

0ф1ц1йн1 опоненти:

доктор х1м!чних наук, професор Елахоттк Володим1р Миколайович, кандидат С1олог1чних наук Черненко Галина Петр1вна

Пров1дна орган1вац1я: 1нститут ф1зично1 х1мП 1м. Л.В.

Писаржевського.

Захйст в1дбудеться 13 червня 1996 р. в 11 годин на зас^даши спед1ал!эовано1 вчено! ради К 03.05.04 у Украхнському державному XI-м!ко-технолоПчному ун1версИгет1 за адресов: 320640 Дн1пропетровськ, пр. Гагар1на 8.

3 дисертац!ею можна ознайомитися у науков1й б1бл1отец1 х1м1-ко-технолог1чного унхЕерситету.

Автореферат роа1слании^* ^#//¿-£1936 р.

Вчений секретар спец1ал1зовано1 ради к.х.н., доцент

Н.Р. Молчанова.

ЗАГАЛЬИА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

Лшуальш'сть робот. Пом!ж багатьох об- ект!в та завдань, що об'еднуються "загаинймпоняттям"х!м1я коорд!нац1йних сполук"; увага досл1дник1в звертаеться до реакций кат1он1в метал1в з р1зкими 01омо-лекулами, к1льк1сть яких дедал1 зб!льшуеться. ЗС1льшення к1лькоси метал!в, яни входять у взаемод1ю з р!зними б!осистемами, в!дбуваеть-ся внасл1док техногенного забруднення навколишнього середовища та за рахуиок використовування нових х!м!отерапевтичних засоб!в. В чис-л! останШм часом пост1йно використовуються р!зн1 комплекси платино-вих метал!в, як1 виявляють протипухлеву, против!русну та радХопро-тектсрпу активн1сть.

Сл1д зауважити, що пер»?творення' бюлогччно активних комплексов платини, як наприклад, д!ацидод1ам1нового ряду, у присутност! проте-1н!в залишаються майже невивченнши. Одночасно поза сумн1вом е те, що згадаШ терапевтичШ ефекти, а також токсичн1сть та аллергенн!сть комплекс!в платини переважно визначаеться м1рою '1хнього зв- язування з б1лками та наступним перетворенням у сполуки з природними т!олами - цисте!ном та цистином. Опис реакц1й комплексних сполук платинових метал!в з б!лками е нео0х1дним також для повно'1 уяви про перетво-' рення у (Мологхчному середовищ1. Тому вельми актуальним е досл1джен-ня ацидоашнових комплекс!в РЬ (II) 1 Рс1(11) з пролетами та т!олами.

Меда робопи полягала в вивченн! к1льк!сних характеристик зв-язування ряду б!олог!чно активних комплекс1в ллатини(П) та пала-д!ю(11) з деякими типовими б1лками (альбум!ном, гемоглоб!ном та 1му-ноглобул1ном), досл!дженн1 будови та властивостей утворенних ме-тал-б1Лкових комплекс!в та наступного перероблення '¡х у присутност! цисте1на або цистина. Було передбачено таком використовування отри-маних данних для збагачення уявлень про окрем1 б!олог!чн! процеси, що в!дбуваються за участю згаданих комплекс!в.

Иаукова новизна роботи. Отримано к!льк!сн! характеристики взае-моди б10лог1чно активних комплекс!в РКП) ! Рс1(П) з найвагом1шими б!лками кров!. Визначено константи зв-язування ц1с-д!ацидод!ам!нових комплекс!в платини з сивороточним альбум1ном. Досл!джено вплив при-еднання металокомллекс!в або шпх фрагмент!в на структуру та влас-тивост1 альбум1ну. Вказуеться, що зб!льшення ступеня зв'язування ме-талокомплекс!в з балками тягне за собою втрату токсичност1. Одержано та досл1джеио рлнш нев!дом1 комплекси РК11) з цистином за допомо-гою хш!ч1шх 1 ф1йико-х!м1чних метод!в. Уперше запропоновано експе-

риментальний к!льк1сний п!дх!д до досл!джень затщення б1лк!в у пла-тинових комплексах на цисте!н або цистин. Одержан! дан1 щодо взаемо-дП хлороплатин1ту кал!ю а найвагом1шим компонентом !мунно'1 системи - 1муноглобул1ном в, завдяки чому п1дтверджена участь сполук платини у механ18м! 1мунних реакц!й.

ПршМчпа ц1нн1сть робот. 0держан1 експер1ментальн! дан1 щодо перетворення платина-б1лкових комплексов у платина-цисте1нов! та (чи) цистинов! мешусь бути використан! для розробки новйх метод!в проф1лактики платинових алергоз1в.

11а вахиш вивосться: 1) положения про взаемозв'язок м!ж ток-сичн1стю комплекс!в РЦП) 1 Р<1 (11) тетрахлоро- 1 цис-дихлород!ам!-нового ряду та ступеней зв'яаування данних сполук с б1лками; 2) ме-хан1вм видалення платини 1з комплекс1в в б1лками; 3) положения про участь у координацП з атомом платини в уперше виделених комплексах РКП) з цистином груп -ЫНг, -СООН та атому с!рки.

Апробац1я робот та публ!кацП. Результата роботи допов1дались на таких конференц1ях: Республ1канська конференц1я "Застосування 1муноферментного анал!ву в медицин!" (Харк1в, 1989 р.), Загально-Ра-дянська конференц1я молодих науковц1в "Натальи! проблеми б!отехноло-г11" (Москва, 1989 р.), 1-й Загально-Радянський !мунологичний з'1ад (Сочи, 1989 р.), 35-й конгрес ШРАС ( Стамбул, 1995 р.). Основний зм!ст роботи вм!щений у опубл!кованих 2 статях 1 4 тезах доповШй.

Структура робот. Робота складасться з1 вступу, огляду л1терату-ри, розд!лу, який охоплюе опис метод!в, трьох роздШв обговорення результат!в, висновк!в та перел!ку використано! л!тератури.

Перший розд1л обговорення присвячено досл1дженню утворення мак-, ромолекулярних платино- ! палад!йових б!лкових комплекс!в, вивченню '¡х властивостей та будови. У другому роздШ описуються методи синтезу комплекс1в РКП) з цистином, вивченню Ххньо! будови та властивостей, а також к1нетичн! параметри реакц!й альбум1нового комплексу платини з цисте!ном та цистином. Третий розд1л обговорення присвячено вивченню взаемодП !муноглобул!ну 6 та його фрагмент1в з анти!му-ноглобул!ном в ( модулювання реакцП антиген-антит!ло) у присутност1 хлороплатин1ту кал1ю.

Роботу викладено на 113 стор1нках,. вона вм!щуе 14 таблиць, 18 малюнк!в. У списку л!тератури 122 джерела.

Експериментальн1 дан! одержан! особисто пошукувачем. Досл!дження будови цистинвм!сних комплекс!в платини(П) виконано з участю к.х.н. В!н!ченко 1.Г. .Результата роботи обговорен! з науковими кер!вниками:.

- з -

к.х.н. Зегждою Г.Д. та к.б.н. Жмарьовою О.М.

-----------------------------ОСВОЕНИЙ ЕШСТ РОБОТ!!.

1. ВзаемодШ б1олог!чпо ахтвпих конляекс/в пхпгиваСИ)--------------

ш паладйо(П) тзтрахлоро- та дихлород1аи1нового ряду в альбунИюн, геиоглоМнон па 1ыувогло6уа1воы.

Специф1чн1сть агрегацП 01лк1в.п1д д!ею комплекс1в платиниШ) та палад1ю(П) (КгСМСЦЗ, (ШЦЫРйСЦ], цис-[РШНз)гС12)]. КгСРЮиз, цис-СРЦЯНгОЮгСЫ) була досл!джена методом турб1д1мет-рП. Оптичну густину розчин1в гемоглоб1ну (ГО), сироваткового альбу-м1ну (СА) та 1муноглобул1ну (1г) вим1рювали при 720 нм, коли величину власного поглинання цих б!лк!в при концентрацП 1 г/л мсакна эне-важити. Показано, що досл!джен1 сполуки палад!ю та платини (С-5-10~5) викликали агрегаЩю Гб (С-10~5): через 10 хв зб1льшення оптичноЧ густини розчин1в Гб для комплексу ШНфЭгСРсЮ]^] склало 0.36 од. оптичноЗ густини, для комплексу КгСРсЮЦЗ - 0.42 од. При сп1вв1дношенн1 металокомплекс:б!лок - 10:1 спостер1галося випадання Гб з ровчину у осадок; еа 8 хв весь Гб осаджувався а розчину..

Початок агрегацП Гб у присутност! сполук платини спостер1гали через 30 хв. Через 18 г осадженою виявилась майже половина початко-во! к1лькост1 б!лку. Осадок поступово розчинюеться у надлипку цисти-ну, що е непрямим доказом участ! БН- груп Гб у реакцП з! сполуками платини(П) 1 палад1ю(П). П1дтвердженням цьому також е результати реакц1й з 1муноглобул1ном, молекула якого не вм!щуе БН- груп. Результатом реакц1й сполук палад1ю з 1г, що тривали протягом 3 д10, стали роэчинюем! агрегата, про утворення яких св!дчило зб!льшення 0ПТИЧН01 густини розчин!в 1муноглобулину.

К1льк1сн1 аспекти взаемодП комплексних сполук платини та наладь з б1лками доапджувались методом, твердофазного сорбцШюго ана-л1зу (ТСА). У лунки пол1ст1ролових планшет1в для 1мунолог1чних реак-ц!й по черз1 вносили розчин 01лка, потгм розчин металокомплексу, по-т1м знов ровчин б1лка, мхченого ферментом - пероксидазою, 1, нареш-т1, субстрат для реакцП в ферментом - о-фен!ленд1ам1н. П1сля 1нку-бацП кожного шару протягом 30 хв та видалення розчин1в лунки, проми-вали дистильованою водою. К1льк1сть вабарвленого продукту перокси-дазно! реакцП реестрували спектрофотометрично. Т.ч. в умовах досл1-ду ми спостер!гали формування на поверхн! пол1ст1родового планшету комплексу "б!лок-метал-б1лок". Результати досл1джень наведен!, у табл. 1.

Таблице i. Пор1вняльна характеристика вв'язування сполук Pt CII> i Pd(II) з б!лками у твердофазному сорбц!йному анал!з1.

Зв'язування м1ченого б1лка, умовн1 одиниц!,

Сполуки М±м

Гемоглоб1н Альбум1н 1мунрглобул1н

цис-1 Pt(NH3)2С123 106.3 ± 2.5 110.0 ± 1.5 108.3 ± 2.9

K2tPtCl4] 102.0 ± 1.8 100.0 ± 1.9 104.6 ± 1.3

цис-[Pt(NH20H)2Cl2] 411.6 ± 2.2 229.2 ±3.2 119.0 ± 2.6

K2CPdCl4] 513.7 ± 2.9 394.4 ± 2.8 258.5 ± 1.4

(NH4)2tPdCl4] 440.0 ± 3.1 • 419.8 ± 2.3 249.9 ± 2.1

За даними тур01д!метр1'1 i ТСА складен1 ряди активност1 комплекса в1дносно: а) гемоглоб1ну, б) альбум1ну, в) 1муноглобул1ну; a) K2CPdCl4] > (NH4)2tPdCl43 > imc-[Pt(NH20H)2Cl2] >

> iwc-[Pt(NH3)2Cl23 * K2CPtCl43

, 0) (NH4)2CPdCl43 > K2CPdCl4] > UHC-[Pt(NH20H)2Cl2] >

> UHC-tPt(NH3)Cl2] > K2tPtCl43

B) K2CPdCl43 > (NH4)2[PdCl43 > №C-CPt(NH3)2Cl23 >

> IWC-CPt(NH20H)2Cl23 * K2[PtCl4L

Ц1каво в1дзначити б1льшу реакц1йну 8датн1сть цис-дихлородигидрокси-лам1нплатини пор!вняно з цис-дихлород!ам1нплатиною. Реакц1йна здат-н1сть б1лк1в в!дносно досл1джених сполук зменыпуеться у ряду: Гб, СА, 1г. Певна законом1рн1сть у цьому уявляеться як зв'язок з1 зменьшенням к!льк1ст1 реакц1йноздатних атом1в cipra.

Вплив приеднання металокомплекс1в чи 1х фрагмент1в на структуру альбум1ну був досл1джений методом спектроскоп!! КД. На мал.1 8обра-жен1 спектри КД у дальн1й УФ- облаетi нативного СА та його комплекса al сполуками, щр були досл1джен1. Сп1вв1дношення метал:б1лок -- 2.5:1, середовшце - 0.15 М NaCl, рН - 6.5.

Загальним для сполук е аменшення частки «- сп1ралей у молекул1 альбум1ну. Молярна частка <х-сп1ралей (fot) у нативному альбумш до-р1внювала 0.57. Найб1льш сильно ефект аменшення частки а-сп1ралей виявляеться при вваемодП СА 8 K2CPdCl4l. У цьому випадку. fot знижу-еться до 0.40. Вплив сполуки (NH4)2[PdCl43 менш виражений (fot-0.48) . та наближуеться до впливу сполук платини, як1 однаков! за своею д!ею на вторинну структуру альбум!ну (fa-0.51).

[в]--/О*

- б -

~Ю

~ю

-20

т Ж ¿20 ¿¡О Л'О

Чаяюаок 1. Спектри КД У далыий УФ-област1 СА та його комплекс!в з сполуками, що досл!джувались; 1 - СА, 2 - СА+сполуки платини, • 3 - САИЮЦЫРсЭСЦ], 4 - СА+КгСРсШд].

За допомогою спектр!в КД у ближн!й УЗЬобласт! зареестрован! конформад!йн1 зм1ни молекули СА п!д д!ею металокоыплекс1в. Найб!льш значн1 8меншення д!хро!чного поглинення в!дбуваються в облает! оп-тично! активност! б1лкових З-Б 8в'язк!в, також заф!ксован1 зм!ни в облаот1 оптично! активност! залишк1в РЬе, Туг, Тгр, що св1Дчить про зм!нювання мхкрооточення вказаних хромофор!в. Звехртае на себе увагу значне конформаЩйне перекручення структури альбум!ну внасл!док при-еднання цис~дихлородигидроксилам!нплатини пор1вняно 8! зм!нами, вик-ликаними 1ншими платиновими комплексами. Очевидно, це эв'язано з ви-сокою реакщйною здатн1стю иде! сполуки, п!дтверджено! ран!ше !шпими методами (ТСА, турб1д1метр!я).

Взаемод1я з комплексами РЬ(Н) та Рс!(II) впливав не т!льки на структуру СА, але й на його заряд, що Суло показано методом 1зое-лектричного фокусування (1ЕФ). При 1ЕФ б1лки, таксж як 1 метал-б!л-ков! комплекси розпод1ляються у гелевому сербдовищ1 з град!ентом рН в1дпов1дно з влаенкми значениями поверхневого заряду. Нативний аль-бум1н фокусуеться у вигляд1 розмито! смуги у зон! рН 4.4 - 5.0. Це пов'язано з" м!крогетерогенн!стю альбум!ну, який !снуе у вигляд1 к!лькох !зомерних форм, як! в!др!зняються аа р1. Взаемод1я в комп-лексними сполуками викликае зеув !зоточки СА у лужну область. Сполуки паладш викликають Оыьший зеув заряду, н!ж сполуки платини (р1 лужних фрашдй 5.4 - 6.0 1 5.1 - 5.8 в1дпов!дно). Цис-дихлород1а-м1нплатина на заряд альбум!на не впливае, що може бути пов'язано 8 приеднанням цього нейтрального комплексу до г!дрофобн!й частин! ыо-

лекули.

Певно, деспирал18ац1я мод1ф1кованого металокомплексами альбум!-ну в1дбуваеться внасл!док приеднання до молекули б1лка позитивно ва-ряджених металоцентр1в - продукт1в зам!щення Cl~ íohIb функц!ональ-ними трупами б!лка. 0кр1м того, внасл!док 8м1нення конформацП, про яку вже вгадувалось, негативно варяджен! ам!нокислотн1 залишки можут бути "втягнут!" усередину молекули, чи позитивно заряджен1 эалишки -а'являтися на поверхн1, чи i перше, i друге разом..

Походячи а в!домих даних та ран!ше викладених м1ркувань, реак-ц!я комплексов типу цис-tPt(NH3)гС1гЗ 8 альбум!ном, узятими у екв1-молярному сп1вв!дношенн1, може бути виражена наступним р1внянням:

tPt(NH3)2Cl2J + Alb - CPtAlbD + 2NH3 + 2C1" У ф!зиолог1чних умовах рН найб1льш ймов!рними м1сцями 8в'язування платини у альбумШ е атоми с!рки цисте1ну, мет!он1ну та, мокливо, цистину, а також у в1дпов1дност1 а умовами утворення циклу азот чи кисень. Враховуючи, що yci досл1ди проводились на фон1 0.15 М NaCl, ступ1нь 8алишення С1~ у початкових комплексах чи можливе входження НгО у внутр1шню сферу повинн! бути об'ектами спец!альних досл!джень.

Важливими характеристиками метал-б1лково! взаемодП е константи зв'явування - умовн1 функцП, у певн1й Mlpl адекватн1 константам ст1йкост! у координац!йн!й х1м11. Константи вв'язування цис-дихлоро-д1ам1кових KOMimenciB платини(П) в ; апьбум1ном визначали методом р1вноважного д!ал1зу а застосуванням граф1чного методу Скетчарда.

Розпод1л експериментальних точок анал!зували на ЕОМ, використо-вуючи метод найменших квадрат1в г рограхунком коефЩ1ент1в кореля-ц11. Для системи СА - цис- [Pt (№3)2012] пряма мае вигляд:

lgCi - (1.2±0.2) + (1.4±0.12)'lgK\ где К' - 16.9 ± 8.2, г - 0.963, So - 0.092. Перев1рка адекватност! модел1 розраховува^ лась э використанням критер1ю Ф1шера; F-0,15, теоретично Ртаел (6; 7; 0.05) * 4.15; F < FTa6ji. отже ця модель адекватна екс-перименту.

Для системи СА - цис-CPt(NH^OH)2CI2I пряма мае вигляд: lgCi - (2.1±0.4) + (1.7±0.1)-lgK', .'где К' - 147.5±63.8; Г-0.979, So-0.102, F-0.04. теоретично FTa6Ji (8; 9; 0.05) * 3.34; F < Ртабл» отже ця модель адекватна експерименту.

Розрахован! за програмою значения. К* для систем СА цис-СРЦШгОЮгСЫ та СА - цис-[РК1Шз)2С12) склали - 147 1 17 в1д-пов1дно. Так як концентраЩя альбум1на в yclx досл1дах склада 1.5 мг/мл ( 2.2-10~5 М), то 1стинна константа зв'яаування (К-К-/Р) для

системи альбум!н-[РЦШ20Н)2С12} дор!виюе 6.7-ЗО6 м-1. Константа зв'яэування для системи альбум!н-[РКЫНз>2С12] в1дпов1дае значению 7.7-ТО5 М-1. Спор1днен1сть до аяьбум1ну Pt(II) виявляеться вище, н1к у б!льшост1 1нших метал!в, для яких в!дом! константи зв'язування (102 - 104 М-1).

Анал1з одержаних даних дозволяе зробити висновок про взаемовв'я-зок токсичност1 та ступеня зв'язування металокомплекс!в з б!лкаыи. Як було показано, за своею активн1стю у в1днивенн1 до 61лк1в палад1-ев! комплекси значно перевишують платинов!. Зокрема, стуШнь зв'язування K2[PdCl4} а б!лками у твердофазному,сорбц!йному анал1з1 у се-редпъечу в 4 рази перевищуе стуШнь зв'язування umc-[Pt(NH3)2CÍ2l. У ТОЙ УГ.С час В1ДОМО, ЩО ТОКСИЧН1СТЬ m?C-[Pt(NH3)2Cl23 б!льш н1к у 30 раз1в перевищуе токсичнЮть K2tPdCl4]. «1домо також, що протипухлин-ний препарат на ochobI uhc-CPt(NH2OH)2cl23 (Платин) менш токсичний, н!ж цис-дихлород1ам!нплатина (ДЦП): адекватн1 за токсичн!стю дози Платину та ДЦП корелюють як 2:1. У той же час ступ1нь та К3в'яз пер-шого комплексу, наприклад з альбум!ном, б1лыпе, н1ж стуШнь та Кзв'яа другого комплексу.

Таким чином, чим вице ступ1нь зв'язування сполук платини(П) та палад1ю(П) у в1дношэ7шг до 61лк1в, ■ тим нижче 1х токсичн1сть. Ций феномен може бути, зокрема, пояснений гим, що слЬлуки, як! циркулю-ють у в1льн1й формi, набагато токсичн!ш! ix макромолекулярних комп-лекс1в. Зв'язування э б!лками (особливо з альбум!ном) значно л1м1туе прояви rocTpo'i токсичност! сполук цих метал i в за рахунок зниження значения в1льно"1 колцентрацП останн!х у кров!.

2. Азаемод/я rjxtpannasmiaaiy mviia йа його ляъбуМиового комплексу а цшзяшом та цисяеНюн.

В1домо, що низькомолекулярн! т1оли берут участь у механ1вм! ви-ведення платини а орган1аму людини. Досл1дження будови та властивос-тей комплекс!в Pt(ll) в тiоам1 ногагслотами мае не т!льки теоретичний, але й практичний iHTepec.

Цистин NH2(CXX)H)CH-CH2-S-S-CH2-CH(NH2)C00H (умовно HL-LH) теоретично може бути розглянутий як амб!дентатний б!окомплексон, який вм!щуе дв! ам1но-, дв1 карбоксильн1 та д1сульф!дну групи. Взаемод1я на холод! роэчину К2[РЬСЦ] (концентраЩя 0,2 моль/л а екв!молярною к1льк!стю цистину, нейтрал!зованого NaOH, приводила до випадання осадку. *

K2[PtCl4] + HL-LH + 2NaOH -[(HO)Pt(L-LH)3 * 2KC1 + 2NaCl + H20 (1)

3 xImíuhhx властивостей моноцистината, що певним чином характе-

ризують координац1йну емн!сть л!ганду, 1стотною виявилась эдатнЮть ан1ону tPt(L-L)(ОН)]" до подальшого приеднання платини: CPt(L-L)(0Н)]~+ [PtCl4]2"+H2Û - C(H0)Pt(L-LH)PtCl2]+2Cl"+ ОН" (2) • Практично навалку С(HO)Pt(L-LH)] розчиняли у м!н1мальн1й к!ль-kIctI NaOH (1 екв!валент на моль платини) та добавляли р1вну к!ль-к1сть молей КгИ^СЦ]. Осадок починав утворюватись через 30-60 хв п1сля эливання реактив!в. (Вих1д - 80Z).

Комплекс [(H0)Pt(L.-LH)PtCL2l в1др18няеться в!д початкового ана-л1тичними характеристиками та б1лып насиченим оранжевим кольором; в1н не ровчиняеться у вод! та орган1чних розчинниках, переходить у розчин п1д д1ею лугу чи розбавлених м1неральних кислот. 1нш1м способом одержання сполуки може бути безпосередня взаемод1я K2CPtCl4] s цистинат-анЮном у сп1вв1дн0шенн! 2:1. 2[PtCl452" + (L-L)2" + Н20 - t(H0)Pt(L-LH)PtCl23 + Cl" (3) '

Повне вам1щення хлор-1он1в у реакцП (1) та половинне - у рак-ц1ях (2,3) було показана на ochobI виявлення хлору в комплексах, що утворюються, потенц!ометрично в хлор-селективним електродом » ЕМ-С1-01, а також ваговим методом.

У ав'язку з тим, щр обидва комплекси виявляють кислотн! власти-BocTl (роачиняються у лугах), вали ивим уявлялось виявлення групи, яка м1стить протон. 0бидв1 сполуки титруються рН-метрично лугом як одноосновн1 слабШ кислоти, що мають схож! крив1 титрування. Розра-хунок за даними титрування дае величину константи кислотно! диссоц!-ацП комплекс!в - 8-105. Таке значения досить близько в!дпов!дае С00Н груп! координованого цистину.

У 1Ч-спектр! C(H0)Pt(L-LH)] ч!тко видно смуги при - 3200 см"1, як1 були в1днесен1 до коливань координовано! NH2- групи, а такая протоновано! СООН-групи (1720 см"1). Широка смуга при 3400 см-1 в!д-пов1дае коливанням некоординовано! NH2-rpynn та эв'язк1в 0-Н у комплексах.

У облает! 500-600 см"1 у спектр! комплексу C(H0)Pt(L-LH)PtCl2] (табл. 2) спостер1гаються к1лька досить сильних смуг. 3 них частота 573 см"1 характерна для коливань Pt-N, частоти 556 та 540 см"1 в1д-пов1дають розрахунковим аначенням vpt-o з симетр1ею Big. та Aie (571 та 543 см"1 в!дпов1дно). Смуга при 551 .см"1 у спктр1 цистина взноситься до коливання дисульф!дно! групи, у спектр1 комплексу C(H0)Pt(L-LH)PtCl23 вона зсуваеться до 527 см-1. Зм1щення vs-s Сезперечно повинно бути пов'язане з утворенням зв'яаку платина-clp-ка. На Те ж саме показуе зеув смуги, обумовлено! коливанням C-S

________(727-704 СМ"1)____________________________ _____________________________________________

Участь у координацП атом1в азоту ам!ногрупи у комплекс1 [(НО)Р1(Ь-Ш)РЬС123 було Шдтверджено також зсувом резонансного сигналу у спектр! 14Н ЯМР в1д 334.7 м.д. у випадку цистина до 385 м.д. у спектр! комплексу.

ТаВлтя г. Максимуми основных частот поглинання в 1Ч-спектрах цистина та С(Н0)РЬ (Ь-ЬЮРЪС123

1 | цистин 1 1 1 1 • комплекс |

1 ,! | v см-1 | 1 1 1 v см-1 1 1 в1днесення !

1 1 1 551 | 1 Б27 | ^-з • 1

1 1 540 | 1

556 | ум-о(В1вг) 1

1 1 573 | 1

584 |

I 728 I 704 | Vc-S 1

1 1 902 | 1

| 1386 | 1385 | vs(C00~) |

I 1509 | 1491 |

I 1606 | 1619 | уаз(С00-) |

1 1 1 | 1728 | 1 vc-o(cooн) | 1

На п!дстав1 наведених 'даних можна стверджувати, ир у комплекс! платини складу 1;1 цистин виступае як триденгатний л1ганд, у коорди-нацП в атомом платини Оеруть участь групи -№12, -С00Н та атом с1р-ки; четверте координац1йне м!сце вайняте гидроксилом. Подальше комп-лексоутворення С(Н0)РЩ,-Ш)] 8 СРЬСЦ]2- в1дбуваеться за рахунок ам1ногрупи, що залишилася незв'яваною, та другого атбма с1рки.

Бе8посередн!м доказом участ1 дисульф1дно! групи у коорд1нац11 э металом в забарвлення комплекс!в, спричинене переносом заряду ме-тал-с1рка. Важливим е й те, що значения молярного коеф1ц1енту поглинання для смуг у видим1й облает! спектра комплексу КНОРиь-ЬЮРШгЗ (два зв'язки РЬ-Б) удв1ч1 б1льше, н1ж у спектр! С(НО)РЩ-Ш):]. Наявн1сть с!рки у координац!иному вузл1 виявлявться також у пом!тн1й лаб!льност1 транс-розтаиованого. до не! гидроксила. Комплекс [(ВДРЬ^-Ш)] дуже швидко в8аемод!е, наприклад, 8 ам1аком.

Обговореним структурам комплекс!в та Тх взаемним перетворенням

в!дпов!дае наступна схема:

/ООО'

S

I

о

ООС^У

HoN«^

Hgtt

CPtCl4]"

Розглянута будова комплекс1в з'ясовуе положения стрибка на кри-в1й титрування, який б!лш зсунутий у лужну область, н1ж це характерно для СООН-групи ам1нок1слот. Хоча комплекси й титруються, як одно-ochobhI кислоти, але у розчин! м1ж 1х протоноакцепторними трупами берперечно установлкються р1вноваги протонного обм1ну; Це може спри-чиняти утворення у розчин1 1зомерних форм, що включають NH3+ чи С00Н-. групи, або нав1ть молекули води.

КоординацП атому с!рки в!дпов1дае i характеристика оптично! активност! комплекс!в. У спектрах КД цистинат!в (мал. 2) зам1сть смуги при 260 км, пов'яаано! в дисульф!дною групою л1ганду, спосте-р1гаються смуги протилежного знаку у област1 300-350 нм. Очевидно, щр у комплексах, як1 ровглядаються, . 1ндукуються в!цинадьн! ефекти Коттона у облает! d-d переход1в металу.

Мождива координац1я, щр в1дпов!дае наведен1й Оудов! комплекс!в, може .бути ' показана на ochobI модел! Дрейд!нга для t(HO)Pt(L-LH)PtClzl (мал. . 3). Два хелатних цикли мають конформац1ю, яка Олизька до кресловвдно!, трет!й - конформац1ю ванни. У незв'яеа-н!й в металом СООН-груп! карбон!льний кисень опиняеться приблизно на однаков1й в1дстан1 в1д атом1в платини, приблизно над центрами кожного в координатйних квадрат1в, що, мабуть, сприяе стабШзацП комплексу.

2 - C(HO)Pt(L-LH)PtCl23, 3 - HLLH. 0

Вежливою лайкой у еагальн1й схем1 метабол1чного лашдога 8 учас-тю сполук платинових метал1в е вникания останн!х з металокомплекс!в. 3 метою з'ясування можливого механ1зму видалення платини з б1лк!в плазми, визначали швйдк!сть утворення комплекс1в платини в цисте!вом та цистином у npoueci обм1ну IohIb Ptz+ у реакц1ях: CPtAlb] + 2LH - tPt(LH)2] +• Alb. CPtAlb] + LH-LH - t(H20)Pt(L-LH)3 + Alb., Експериментальн1 дан1 для побудови кинетично! криво! (приведен! у табл. 3) лягачзть на прям! у координатах lgC - t, ио характерно- для. реакц!й першогр порядку.

У досл!дженому пром!лку часу у обох реакц1ях х!м1чному зам!щен-ню п!длягаг половина зв'яэано! 8 альбум!ном .платини; основну роль -у

даному процес! мабуть, в1д1грав цисте!н - 11/2 - 3 г. 1стотно, що дисульф!дн! форми також беруть участь у "переключены!" платини; 8ро-8ум1ло, що час нап!вперетворення у даному випадку виявляеться вначно б!льшим 1 дор!внюб 48 год. Константа шввдкост1 реакц1й адьбум1нових комплекс1в платини 8 цисте1нш та цистином, обчислен1 за формулою: к - 0.693А1/г склали 3.8-10~3 мин-1 и 2.4-10~4 мин-1 в1дпов!дно. Табмця 3. Дан! для побудови кинетично'1 криво! реакцП

альбум!нового комплексу платини з цисте!ном та цистином.

[PtAlb] + цисте!н

t, хв | • ДСръ, М t. ч ДCpt. м

60 | 3.85-10~5 5 ..3,8-10' -5

70 | 3.78-Ю-5 21 3,6-10" ■5

90 | . 3.72-10"5 23 3,56-10" ■5

100 | 3.68-10"5 26 3,12-ю; ■5-

110 | 3.55-10"5 44 2,93-10' -5

120 | 3.34'Ю"5 45 2,80-10' -5

130 | 3.10-10~5 45 2,70-10" ■5

140 | 2.95-10"5 46 2,56-10" •5

150 | 2.85-10"5 47 2,45-10' •5

•160 2.70-10~5 48 2,3-10" ■5

170 | 2.45-10"5 52 2,72-10' 5

190 | 2.75-10~5

[ptAlb] + цистин

. Перетворення платина-б1лкових комплекс1в у платина-цисте1нов! та (чи) цистинов!, ыабуть, мае в1дношення до !мунох1мП платини: да-яий ефект може бути використаний для розробки методiв проф1лактики платинових алергоз1в.

3. Иов1 експерошешяальвi л!дхода до вивчешш uexauiauy плаяшювих аяергов1в.

Уявлення про можливий механ!зм платинових алергоа!в були отрима-н1 на основ! досл1дження взаёмодП типового алергену - KziPtCl^ з основним компонентом 1мунно1 системи людини - 1муноглобул1ном б, який е представником великого класу б!лк1в, що також в!дом1 як анти-тШ.

Вааемод1я молекули 1муноглобул1ну 6 та i'i фрагмент1в (Fab та Fc) в анти!муноглоОул!ном G (анти IrG) (моделювання реакц!'1 антиген-ан-

тит!ло) у присутносп хлороплатшиту Kanira була досл!джена в засто-

------- - суванням методу !муноферментного анал1зу (1ФА), — Результата - реакцП_______

реестрували по зв'язуванню молекул анти IrG, м!чених ферментом - пе-роксидазою хр!ну. .

У частик! молекули IrG, яка носить назву Fab фрагмент, розташо-ван! облает!, що зв'язують антигешЦ молекули ( ab - ."antigen • bindung" - область, що зв'язуе антиген). Fc-фрагмент - хвостова час-тина молекули, в!д яко! залежить ф!з!олог!чна функц!я 1муноглобул1-ну, аокрема така, як ф!ксац!я антит!л до кл1тин.

Наводимо схеми посл1довного нанесения роэчин1в реагуючих сполук у лунки аол1стиролових планшет1в длй ЙА: Схема 1ФА N 1

1-й шар - IrG чи Fab-фрагмент IrG.

2-й шар - анти-IrG, м1чений ферментом + КгСРИЦ]

3-й шар - субстрат для реакцП э ферментом (ортофен1ленд1ам1й + '

+ Н2О2).

Схема 1ФА N 2

1-й шар - IrG чи-Fab-фрагмент IrG

2-й пар - розчин KsCPtCl«]

3-й шар - анти-IrG, м!чений ферментом

4-й шар - субстрат для реакцП з ферментом.

TajSjmiii <5. Вплив K2CPPCI4] на реакц1ю анти1муноглобул1нових антит1л з !муноглобул!иом G людини та Fab-фрагментами йрго молекули (умовн! одиниц!).

. . ..... 1

Is С | L . Реакц!я 1г G ~анти1г G |Реакц1я Fab-фрагмент-анти I г G

г 1 K2tPtCl4l 1 1 1 1 1 Схема N1 1 1 1 Схема N2 1 1 Схема N1 1 1 Схема N2

1 0 1 1 1 99,2 ± 2,1 | 100,0 ± 2,0 101,4 ±1,5 100,7 ± 0,9

-6 t 96,3 i 1,8 | 98,7 ± 1,9 | 102,6 ± 1,4 101,3 ± 1.8

-5 | 89,9 ± 1,9 | 112,3 ± 1,9 i 96,3 ± 0,9 95,1 ± 0.8

-4 | 72,4 ±1.11 122,9 ± 2,2 | 84,3 ± 1,1 89.6 ± 0.9,

-з | . 1. 11,7 ± 0,5 | 1 188,1 ± 2,5 1 1г,8 ± 0,7 1 88.3 ± 0.7

3 результат!в табл. 4 виходить, що вплив KgfPtCUJ на реакц!»

антиген - антит!ло е, мабуть, результатом двох процес1в, що проходить у р!зних напрямках. Перший процес - блокування реакц1й анти-ген-атитхло у результат! 1нактивац11 антигензв'язуючого центру у молекул! !муноглобул!ну. У взаемодП антигена, в антитДлом величезне эначення мае комплементарн1сть - стерична в!дпов!дн1сть антигенной детерм1нанти та облает!, що зв'язуе антиген. Будь - яке порушення ц1е'1 в!дпов!дност! веде до блокування реакцП. Другий процес - иоси-лення эв'язування м1ж антигеном та антит1лом за рахунок формуван-ня додаткових центр!в зв'язування в 1нших частинах молекули 1муног-лобул1ну. У цьому випадку ми спостер1гаем' утворення макромолекуляр-них"комплекс!в типу "б!лок-метал-б1лок", про як1 вже шла мова у ров-дЩ 1.

Як вже в!дэначалося ран!ше, константн1 д!лянки молекул 1муног-лобул!н1в (Рс-област1) в!дпов1дальн1 за ф!ксац!ю антит1л до клИин. Зм!на властивостей Рс-фрагмента п!д впливом КгСР1СЦ] досл!джували за допомогою взаемодП Рс-фрагмент - Тс-рецептор плазматичних мембран синципотрофобласту плаценти. В1домо, що останн1й мае велик! д1-лянки, гомолог1чн1 молекулам !муноглобул!н!в. Встановлено, що хло-роплатинит кал!» . стабШэував комплекс л!ганд - рецептор' у всьому досл1дженому д!апазон! концентрац1й.

Анал!з одержаних даних дозволяв висловити деяк! нов1 уявлення щодо механизму платинових алергоз!в. Вважаеться, що сполуки сполуча-ються а власними 61лками орган!зму, котр! внасл!док цього набувають антигенних властивостей 1 тим спонукають до виробництва специф1чних антит1л. Фактично для активацП ефекторних кл!тин алерг1чно'1 реакцП може бути досить под!яти на мембрану кл!тини. Таким впливом може стати утворення агрегат!в молекул 1муноглобул!ну, як1 перебувають у асоц1ац1! 8 рецепторами кл1тин а також зм1на характеру взаемодП ци-тоф1льних !муноглобул!н1в з 1хними рецепторами. Останне можна довести наявн1стю стабШзацП комплексу Гс-фрагмент - Гс-рецептор плазматичних мембран синтрофобласту плаценти п!д д1ею КгЕГ^СЦ].

Коли прийняти вище викладену гипотезу, стае зрозум1лим, чому сполуки. паладШ перевершують сполуки' платини за своею здатнютю до сенсибШаацП. Насл1дки.досл1джень, котр! обговорюються у роздШ 1, вказують, що эдатн!сть комплекс!в палад!ю до утворення сполук типу "б1лок-метал-б1лок" значно переважае здатн!сть платинових комплексе що до утворення метал-б!лкових ол1гомер1в та пол!мер!в. Ций факт може стати вир1шальним у ад!йсненн! мехш(!зм1в алерг!чних реак-Ц1й при контакт! 81 сполуками платинових метал!в.

висновки..

__________1. За допомогою препаративних та ф!зико-х!мичних метод!в дослужено утворення б1лкових~макро!та,шлекс!в ацидоам1нат1в лаладНоШ) 1 платини(II), а також взаемод!ю останн!х з цисте!ном 1 цистином.

2. У 1ндив!дуальном стан1 уперше вщцлен! та вивчен! !ндив!ду-альн! комплекси платини(П) з цистином: ЦНСОРЦИН)] (I) 1 £(НО)Р1(Ь-Ш)РШ23 (П). При застосуванн! 1Ч-спектроскопП, ЯМР 14М, електронно'! спектроскопП доведено,- що у I цистин поводиться як тридентатний л1ганд, у координацП з атомом платини Серуть участь групи -МНг. -СООН 1 атом с!рки. Перех1д в1д I до II зд!йснюеться за рахунск аиПюгрупи та другого атому с1рки цистину.

3. За допомогся методов турб!димехр11 та твердофазного сарбц!й-ного анал!зу вивчена пор1вняльна реакц!йна здатн!сть сполук Р1 (11) та Рс1(11) щодо альбум!ну, гемоглоб1ну 1 1муноглобул1ну. Активн1сть комплекс1в зм!нюеться у так!й посл!довност! :

КгСРсЮЦ] * (МН4)2ЕРС1С143 > ЦИС-СРЬ(МН20Н)гС12] > > дас-ГРиВДгЙг] * КгЕГССЦ]. •

4. Вказуеться, що б1олог1чн! ефекти сполук платинових метал!в до пев но'! м1ри обумовлен!' впливом комплексоутворення на структуру б!опол!мер!в. Методами !зоелектричиого фокусування 1 спектроскопП' КД доведено зм1ну заряду молекули альбум!ну та зменшёння частки а-сп 1 рал ей п1д час взаемодП з сполуками, як1 досл!джувались. У обох випадках виразною рисою е те, що вплив сполук палад!ю(Ш е пом!тн!-шим.

5. Привертав' увагу взаемозв'язок м1ж токсичн!стю комплекс!в платини(Н) ! палад1ю(П) ;тетрахлоро- 1 йис-дихлород!ам!нового'ряду та ступеней зв'язування данних сполук в б1лками.\ чим вище ступ!нь зв'язування, тим менше токсичн1сть металокомплекс1в. Даний ефект можна, зокрема, пояснити тим, що сполуки,. котр1 циркулшть у в!льн!й форм!, е набагато токсичн!шими за 1х метал-б1лков1 комплекси.

6. Методом р!вноваженого д!ал!зу уперше визначено констадти зв'язування комплекс!в цис-1РШНэ)гС12] 1 цис-СРЦМНгОНг)^] в альбум!ном: 7.7'Ю5 М-1 1 6.7-106 М"1 в!дпов1дно. ■ Вшца константа зв'язування е одним з фактор1в, що зменшуе токсичн1сть цис-дихлоро-диг!дроксилам1нплатини та б!льшо! пролонгованост! протипухлинно! дП останньо! у пор!внянн1 а цис-дихлород!ам!нплатиною. •

7. Визначено к!нетичн1. параметри реакц!й альбум!нового комплексу платини(П) з цисте!ном та цистином, яки к!льк1сно характеризуют механизм видаЛення платини з комплекс!в з б!лками через 1! . х!м!чне

- 16 -

эам!щення низькомолекулярними тюлами.

8.. На подстав! досл!джень эв'язування KglPtCl^ з 1муноглобул1-

ном експериментально п1дтверджена участь сполук платини у механ1зм!

1мунних реакц1й.

Публ1кацН за явыою диссерпацИ.

• 1. Касьян Г.Б., Жмарева E.H. Иммунные и неиммунные взаимодействия при развитии платиновых аллергозов: исследование методом иммуно-ферментного анализа//Тез. докл. респ. научн. конференции "Применение ИФА в медицине".-Харьков, 1989.-С. 103-104.

2. Зегжда Г.Д., Касьян Г.В. Изучение молекулярного механизма платиновых аллергозов//Тез. докл. I Всесоюзн. иммунологического съезда. -Сочи, 1989.-Т. 2. -С. 333.

3. Касьян Г.В., Долженко М.И., Горелая М.М. Применение иммунофер-ментного анализа для изучения молекулярного механизма платиновых

. аллергозов//Тез. докл. Всесоюзн. конференции молодых ученых "Актуальные проблемы биотехнологии".-Москва, 1989.-С. 110-111.

4. Зегжда Г.Д., Касьян Г.Б. Жмарева Е'.Н. Связывание платина альбумином и иммуноглобулином//Днепропетровск.-1995.-16 с. -Деп. в ГНТБ Украины, N 899 :Ук 95 от 13.04.95.

5. Zegzda G.D., Zhmariova E.N., Kasyan G.B. et al. Interaction of bioactive platinum and palladium complex compounds with protein£//35th IUPAg.Congress, Istanbul.-1995, -P. 1290.

■ 6. Зегжда Г.Д., Виниченко И.Г., Касьян Г.Б. Хелатообразование в системе тетрахлороплатинит калия - цистин // Журн. неорган, химии. -1995. -Т. 40, N 7.-С. 1172-1175.

Касьян Галина Борисовна. Взаимодействие ацидоаминовых комплексов платины(П) и палладия(П) с белками крови и обмен координированных протеинов на цистин или цистеин. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.01 -" неорганическая химия и 03.00.04 - биохимия. Днепропетровский государственный университет, 1996 г. '

Получены характеристики взаимодействия биологически активных ацидоаминовых комплексов Pt(II) и Pd(II) с белками крови и последующего превращения платина-белковых соединений в цистеиновые или цис-тиновые. Описаны состав и строение новых комплексов платины(П) с цистином. Предложено использование полученных результатов для .расширения представлений о механизмах токсичности и аллергенности платиновых комплексов.

Kasyan 6.В. Interaction of platinum(II) and palladium(II) acidoaminocomplexes with blood protein, and the exchange of coordinated proteins for cystine or cysteine.

Thesis for aquisiMon of scientific degree "candidate. of chemical sciences" on cpecialitis 02.00.01 - Inorganic chemistry and' 03.00.04 - Biochemistry. Dnepropetrovsk State University. 1996.

Characteristics of the interaction have been obtained of bioactive Pt(II) and Pd(II) acidoaminocomplexes with blood proteins and of the consequent transformation of the protein-metal compounds to cysteine or cystine ones. The chemical composition and structure of the new platinim(II) complexes with cystin have been described. His suggested that the obtained results should be used to broaden the concepts of the toxity and allergenicity mechanisms of the platinous complexes. -

" ".М-

Тип.(faГУ Лак. 58? -WO