Взаимодействие глобулярных белков (легумина и овальбумина) с липофильными соединениями тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. Н. Н. СЕМЕНОВА

На правах рукописи УДК 541.66; 547.96

ВАССЕР/МАН Любовь Александровна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГЛОБУЛЯРНЫХ

БЕЛКОВ (легумпна и овальбумина) С ЛИПОФИЛЬНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ

02.00.06 — химия высокомолекулярных соединений

Авторе ф е р а т диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва — 1997

Работа выполнена в Институте биохимической физики им. Н. М. Эмануэля РАН

Научный консультант — кандидат химических наук

Юрьев В. П.

Официальные оппоненты — доктор химических наук

Иванов В. В.

Ведущая организация —

доктор химических наук, профессор Касаикин В. А.

Институт элементооргани-

ческих соединений

им. А. Н. Несмеянова РАН

Защита диссертации состоится « /У.» 1997 г. в «. .» часов на заседании Специализированного Ученого Совета Д 002.26.05 при Институте химической физики РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики РАН.

Автореферат разослан «

«/4 ^¿г_______________ 1997 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат химических наук

Ладыгина Т. А.

Актуальность проблемы. Хорошо известно, что реальные пищевые системы достаточно сложны и состоят из многих компонентов (белков, полисахаридов, липофильных соединений - липидов, ароматических добавок, витаминов и т.д.). Белки и липофильные соединения являются основными компонентами пищевых систем, которые определяют структуру, вкусовые и питательные качества пищевых продуктов. Поэтому необходимо понимать особенности взаимодействия белков с липофильными соединениями как с научной, так и практической точек зрения. Интерес к выяснению закономерностей взаимодействия белков с липофильными соединениями вызван прежде всего необходимостью создания научных основ технологии получения новых форм пищи из традиционных и нетрадиционных (горох, бобы сои, кормовые бобы и т.д.) источников сырья. Проблема создания искусственных продуктов питания была сформулирована в последние десятилетия и в настоящее время активно разрабатывается. Актуальность.этой проблемы объясняется тем, что мировое производство традиционных продуктов питания не является достаточным для удовлетворения биологических потребностей нашей планеты. Проводится постоянный поиск новых источников пищевого сырья и разработка новых технологий для получения искусственных продуктов питания.

Легумин и овальбумин - глобулярные белки перспективные для применения в пищевой промышленности, поэтому выяснение особенностей взаимодействия этих белков с липофильными соединениями, несомненно, является актуальным. Легумин -основной белок семян бобовых растений, который можно широко использовать для формирования новых форм пищи. Овальбумин - основной белок белка яиц, который широко используется в пищевой промышленности из-за своих гелеобразующих и пенообразующих свойств.

Цель и задачи данной работы состояли в том, чтобы установить основные закономерности взаимодействия легумина и овальбумина с липофильными соединениями. Выяснить, как зависят эти закономерности от природы белка и природы липофильного соединения.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые установлено, что легумин и овальбумин взаимодействуют с липофильными соединениями, содержащими углеводородную цепь, но не взаимодействуют с соединениями, не содержащими углеводородную цепь. В результате гидрофобных взаимодействий

легумина и овальбумина с липофильными соединениями происходит адсорбция липофильных соединений на белковые глобулы. Показано, что молекула легумина, как правило, в большей степени адсорбирует липофильные соединения, чем молекула овальбумина. Установлено, что топография адсорбционных центров глобул легумина и овальбумина резко отличается.

Методом микрокалориметрии установлено, что особенности взаимодействия легумина и овальбумина с липофильными соединениями, их конформационная и термическая стабильность определяются как структурой белков, так и природой липофильного соединения.

Показано, что взаимодействие легумина и овальбумина с липофильными соединениями приводит к ассоциации белковых глобул в растворе.

Сформулированы закономерности влияния липофильных соединений на поверхностную активность легумина и овальбумина в водном растворе.

Построены фазовые диаграммы системы легумин-овальбумин-вода в присутствии липофильных соединений (декана и трикаприна) и выяснено, как влияют липофильные соединения на термодинамическую совместимость этих белков в растворе.

Практическая значимость работы состоит в том, что полученные в ней научные результаты могут быть использованы при создании научных основ переработки легумина и овальбумина в пищевые продукты.

При решении научных задач, сформулированных выше, мы использовали современные методы физической химии полимеров.

Апробация работы. Основные результаты докладывались на:

¡.Международной конференции «Biopolymer Mixtures» (Ноттингем, Англия, сентябрь 1994 г.).

2.Международном конгрессе «International Chemical Congress of Pacific Basin Societies» (Гонолулу, Гавайи, США, декабрь 1995 г.)

3.Международной конференции «Food Colloids - Proteins, Lipids and Polysaccharides» (Истад, Швеция, апрель 1996 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики объектов и методов исследования,

четырех оригинальных глав, выводов, списка используемой литературы из 124 наименований. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 11 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Во введении дано обоснование актуальности и новизны исследований, выполненных в работе, сформулированы цель работы, её научная и практическая значимость.

Глава I содержит обзор литературы, состоящий из двух частей. В первой части дан сравнительный анализ структурных особенностей используемых глобулярных белков - легумина и овальбумина. Вторая часть посвящена рассмотрению проблем взаимодействия белков с органическими соединениями. Показано, что в результате взаимодействия белков с липофильными соединениями изменяются их функциональные свойства. Однако практически весь материал о взаимодействии белков с липофильными соединениями получен при использовании мембранных белков. Систематического исследования закономерностей взаимодействия пищевых белков (легумина кормовых бобов и овальбумина) с липофильными соединениями не проводилось. Литературный обзор завершается постановкой задачи исследования.

В Главе II описаны объекты и методы исследования.

В работе использовали легумин, выделяемый из семян кормовых бобов по известной методике, и пятикратно перекристаллизованный яичный альбумин (овальбумин) Олайнского завода химреакгивов. По данным скоростной седиментации (фосфатный буфер, рН 7.0 ионная сила 0.1 М) легумин содержал 95% 11S фракции и 5% 15S фракции. Растворимость овальбумина в воде составляла не менее 98%.

В качестве модельных липофильных соединений использовали декан, декановую кислоту и ее производные: деканоат натрия, моноглицерид декановой кислоты (монодеканоилглицерид) и триглицерид декановой кислоты (трикаприн), пальмитиновую кислоту и ее производные: пальмитат натрия и моноглицерид пальмитиновой кислоты (монопальмитоилглицерид).

Для приготовления растворов использовали фосфатный буфер рН 7.0 и рН 7.8 ионной силы 0.1М. Бидистилированная вода использовалась для приготовления фосфатного буфера.

Концентрацию растворов определяли по оптической плотности, рефрактометрически, методом высушивания до постоянного веса и методом седиментационного анализа.

Использовали несколько способов насыщения белков пипофильными соединениями (ЛС). Лиофилизованные белки выдерживали в декане в течение 10 дней (насыщение в сухом состоянии). Насыщение белков жирными кислотами и их производными проводили в растворе. Исследовали системы, в которых после добавления липофольного соединения к раствору белка сохранялось соотношение белок : ЛС = 1% вес.: п (где п = 2, 10, 30 мМ).

Для определения молекулярной подвижности методом электронного парамагнитного резонанса использовали спин-меченные стеариновые кислоты (5-DSA, 12-DSA, 16-DSA (радикалы I-III, соответственно)), 5-доксилдекан (радикал IV), 2,2,6,6-тетраметил-4-(2-додецилоксилэтил)-пиперидин-№оксил (радикал V), 2,2,6,6-тетраметил-4-(карбоксиметил)-пиперидин-Ы-оксил (радикал VI), 2,2,5,5-тетраметил-З-карбоксипирролин-Ы-оксил (радикал VII), формулы которых приведены ниже. Спин-меченые стеариновые кислоты плохо растворимы в воде. При приготовлении растворов этих соединений в буфере использовали два способа. По первому способу навеску радикала помещали в буфер, систему обрабатывали ультразвуком и интенсивно перемешивали при нагревании. По второму способу спин-меченые стеариновые кислоты вводили в фосфатный буфер в виде раствора в этаноле. Радикал V также вводили в буфер в виде раствора в этаноле. Радикалы IV, VI и VII растворяются в воде лучше, чем доксилстеариновые кислоты и радикал V. Растворы этих радикалов в буфере готовили обычным способом. Соотношение белок: спиновый зонд выбиралось таким, чтобы на одну молекулу белка приходилось не более 1 молекулы спинового зонда.

Микрокалориметрические исследования проводили на дифференциальном сканирующем калориметре в области температур 20-110°С при скорости сканирования 2 °/ мин и при постоянном давлении.

Межфазное давление на границе вода/воздух определяли методом Вильгельми. Использовали растворы белков концентрации 0.001 % вес. Рассматривали данные, полученные через 3 часа после начала формирования адсорбционного слоя (в течение

СПИНОВЫЕ ЗОНДЫ

СНз(СН2)17-п- С -- (СН2)п-2СООН СНз(СН2)4-С-(СН2)зСНз

ОН -О- ? N-о-

п=5 ( 5-08А,1), п=12 (12-DSA.II), п=16 (16-05А,П1) (IV)

этого времени достигаются близкие к равновесным значения поверхностного натяжения растворов легумина и овальбумина).

Метод упругого светорассеяния использовали для определения молекулярных и термодинамических параметров растворов белков. Все измерения проводили при 6=90°, т.к. для все исследуемых систем не наблюдалось ассиметрии светорассеяния.

Фазовые диаграммы систем легумин-овальбумин-вода при рН 7.0 и рН 7.8 и в присутствии липофильных соединений строили методом соотношения объемов фаз.

В Главе III обсуждаются результаты исследования взаимодействий легумина и овальбумина с липофильными соединениями в растворах методом спинового зонда.

В качестве модельных липофильных соединений использовали стабильные нитроксильные радикалы, отличающиеся, во-первых, положением нитроксильной группы в углеводородной цепи (спин-меченные стеариновые кислоты (радикалы I-III)), во-вторых, радикалы, которые не имели в своем строении карбоксильную группу, но имели достаточно длинную углеводородную цепь (радикалы IV,V) и, в-третьих, радикалы, которые имели в своем строении карбоксильную группу, но отсутствовала или была очень маленькой углеводородная цепь (радикалы VI, VII).

На Рис. 1 приведены спектры ЭПР 5-08А в растворах легумина и овальбумина. Спектр ЭПР б-ЭБА в буфере соответствует области «быстрого» вращения спинового зонда (время корреляции вращения т « ЗЛО"10 сек). При добавлении белков в раствор радикала спектр ЭПР спинового зонда резко изменяется. Этот результат позволяет сделать вывод о том, что имеет место сильное взаимодействие спинового зонда с глобулами легумина и овальбумина. Однако для двух используемых белков это взаимодействие реализуется по-разному. В растворе, содержащем легумин время корреляции вращения 5-ОБА (х « 1 10"8 сек) почти на два порядка больше, чем время корреляции вращения зонда в буфере; эти различия ' вызваны адсорбцией спин-меченной стеариновой кислоты белковой глобулой. Спектр ЭПР 5-08А, адсорбированной глобулой овальбумина, является более сложным (радикал введен по первому способу), чем спектр ЭПР б-ОБА, адсорбированной глобулой легумина (Рис.1 (б, д)). В центральной части спектра б-ОБА, адсорбированной глобулой овальбумина, присутствует плохо разрешенный синглет. Этот спектр является суперпозицией спектров «изолированных» адсорбированных спиновых зондов (линии соответствующие этим

Рис. 1. Спектры ЭПР 5 - ЭБА а ) в фосфатном буфере (рН 7.0, 0.1 М); б) и г) в растворе легумина ; в) в растворе легумина, в котором содержится деканоат натрия (10 мМ); д) и ж) в растворе овальбумина; е) в растворе овальбумина, в котором содержится деканоат натрия (10 мМ). ; а), б), в), д), е) - б-ББА вводили в буфер по первому способу, г) и ж)- по второму способу (через раствор в этаноле).

радикалам отмечены стрелками (Рис.1 (д)) и радикалов, адсорбированных на «близко» расположенные адсорбционные центры (расстояние между которыми не более 5-10 А) или на центры, способные связывать несколько молекул 5-08А. В последнем случае в спектре проявляются дипольные и обменные взаимодействия неспаренных электронов спиновых зондов (синглет). Эти результаты показывают, что топография адсорбционных центров молекулы легумина и овальбумина различна: стеариновая кислота может адсорбируются на «далеко» расположенные адсорбционные центры легумина и на «близко» расположенные центры овальбумина. Если в растворе вальбумина присутствуют немеченые липофипьные соединения (деканоат натрия, пальмитиновая кислота и пальмитат натрия), то они адсорбируются вместе с 5-Б8А и вероятность того, что несколько спин-меченых молекул окажутся рядом резко уменьшается. В результате в наблюдается спектр (рис. 1 (е)), не взаимодействующих адсорбированных радикалов, аналогичный спектру на рис. 1 (в).

Было показано, что молекула легумина адсорбирует липофильные соединения в большей степени, чем молекула овальбумина. Изменение способа введения радикала 5-ОБА (по второму способу, из раствора в этаноле) слабо влияет на спектр ЭПР радикала в растворе легумина, но сильно изменяет спектр в растворе овальбумина (Рис. 1 (г,ж)). По-видимому, этанол слабо влияет на константу связывания 5-08А с легумином, но заметно уменьшает константу связывания с овальбумином.

Спектры ЭПР 12-08А и 16-08А в растворах легумина являются суперпозицией спектров «свободных» и адсорбированных радикалов (на рис.2 приведены спектры ЭПР 12-08А). Следует отметить, что времена корреляции адсорбированных молекулой легумина спин-меченных кислот практически не зависят от места локализации спиновой метки, что дает возможность предположить, что вся (или почти вся) углеводородная часть молекулы стеариновой кислоты связана с гидрофобными участками глобулы легумина. Важно подчеркнуть, что доля не адсорбированных молекул 12-08А и 16-08А не велика и не превышает 2-3 моль.%. Спектры 12-ОЗА и 16-08А в растворах овальбумина практически не отличаются от спектров этих радикалов в буфере, что показывает, что овальбумин не адсорбирует эти соединения. Таким образом, введение доксильной группы в 12 и 16 положение

а )

10 0 г <

10.0 Г с

Рис. 2. Спектры ЭПР 12 - ОБА радикала а) в фосфатном буфере ( рН 7.0, 0.1 М); б) в растворе легумина ; в) в растворе овальбумина. Пунктиром показан теоретический спектр, рассчитанный в виде суперпозиции спектров радикалов с временами корреляции I! = 1 10"8 с ( мольная доля 0.97) и Т2 = 1 Ю"10 с (мольная доля 0.03).

углеводородной цепи приводит к модификации стеариновой кислоты, в результате которой слабо изменяется константа связывания кислоты с легумином, но сильно уменьшается константа связывания с овальбумином (по сравнению с 5-DSA).

Представлялось важным выяснить, происходит ли взаимодействие белков с спиновыми зондами, содержащими карбоксильную группу, но не имеющими в своем строении углеводородную цепь. Радикалы VI и VII, которые не имеют достаточно длинную углеводородную цепь, но содержат карбоксильную группу, не адсорбируются глобулами легумина и овальбумина. Радикал V, в молекуле которого имеется достаточно длинная углеводородную цепь, но отсутствует карбоксильная группа адсорбируются глобулами белков. Адсорбция глобулой легумина сильнее изменяет вращательную подвижность спинового зонда V, чем адсорбция глобулой овальбумина. Этот результат объясняется тем, что в спиновом зонде, адсорбированном легумином, парамагнитный фрагмент, по-видимому, ближе расположен к адсорбционному центру, чем в спиновом зонде, адсорбированном овальбумином. Спиновый зонд IV (спин-меченый декан) слабо адсорбируется легумином и практически не адсорбируется овальбумином. По-видимому, доксильный фрагмент модифицирует молекулу декана и влияет на ее способность взаимодействовать с белковыми глобулами.

Таким образом, было показано, что в результате гидрофобных взаимодействий происходит адсорбция липофильных соединений глобулами легумина и овальбумина и установлено влияние природы белка и особенностей строения липофильных соединений на их адсорбцию белковыми глобулами.

В Главе IV обсуждается результаты исследования взаимодействия легумина и овальбумина с липофильными соединениями методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии.

В результате взаимодействия легумина и овальбумина с липофильными соединениями образуются «новые» соединения, процесс образования которых можно представить в виде следующей схемы:

где Л- липофильное соединений, (Белок+Л)-Белок + Л « * (Белок+Л) соединение, которое образуется в результате к2 взаимодействия. Кроме того, при температуре

денатурации происходит процесс конформационного перехода (обычно этот процесс изображается N

По нашему мнению, экспериментально определяемое значение энтальпии суммарного процесса в присутствии липофильных соединений состоит из двух составляющих - энтальпии денатурации белка и энтальпии взаимодействия белка с липофильным соединением:ДН11<стр. = ДН„,имол. +Д)Нл(,нат С этих позиций мы рассмотрим полученные результаты.

В Табл.1 и Табл. 2 приведены термодинамические параметры (энтальпия суммарного процесса и температура денатурации белков), характеризующие процесс денатурации и взаимодействия белков в растворе с липофильными соединениями.

Прежде всего следует отметить, что в результате взаимодействия декана и деканоата натрия с легумином температура денатурации белка практически не изменяется (другими словами, термическая стабильность легумина не зависит от присутствия в растворе декана и деканоата натрия) (Табл.1). При взаимодействии овальбумина с деканом температура денатурации также не изменяется. Этот результат позволяет предположить, что термодинамические параметры процесса денатурации белков не изменяются, а различия значений энтальпий объясняются тепловыми эффектами процессов взаимодействия белков с липофильными соединениями.

Для легумина и овальбумина энтальпия суммарного процесса зависит от способа введения декана. При насыщении легумина и овальбумина в лиофилизованном состоянии в избытке декана в течение 10 дней суммарная энтальпия процесса для обоих белков возрастает (Табл.1). Это объясняется образованием новых связей в интерьере молекулы белка. При насыщении белков деканом в растворе значение экспериментальной энтальпии процесса для легумина растет, а для овальбумина не изменяется. Этот результат вызван, по-видимому, меньшей адсорбционной способностью глобулы овальбумина, по сравнению с глобулой легумина. (Действительно, как было показано в предыдущей главе легумин адсорбирует, хотя и слабо, а овальбумин практически не адсорбирует 5-доксилдекан).

Рассмотрим влияние деканоата натрия на изменение энтальпии процесса

Таблица 1.

Термодинамические параметры (АНэкс11ер - энтальпия, Та - температура денатурации) суммарного процесса (термоденатурации и взаимодействия с липофнпьными соединениями) легумина и овальбумина в водных растворах в отсутствие и в присутствии декана и деканоата натрия (фосфатный буфер рН 7.0,1 = 0.1М).

Липофильные соединения Легумин Овальбумин

ДНэкспер.» (±1.0) Дж/г Та, (±1.0) К ДНэкоср., (±1.0) Дж/г Та, (±1.0) К

в отсутствие липофильных соединений 24.1 358.8 19.0 349.7

декан (насыщение в сухом состоянии) 42.9 358.2 30.3 349.7

декан (насыщение в растворе (10 мМ)) 35.0 358.2 18.4 348.7

деканоат натрия (2 мМ) 36.5 358.8 16.2 349.1

деканоат натрия (10 мМ) 35.8 358.5 14.6 343.5

деканоат натрия (30 мМ) 25.9 360.8

Таблица 2. Термодинамические параметры (ДН3„пер - энтальпия, Та - температура денатурации) суммарного процесса (термоденатурации и взаимодействия легумина и овальбумина в водных растворах в отсутствие и в присутствии декановой и и пальмитиновой кислот и их производных (2 мМ) (фосфатный буфер рН 7.0,1 = 0.1М).

Липофильные соединения Легумин Овальбумин

АНЭКСпер.» (±1.0) Дж/г Та, (±1.0) К АНэкспер» (±1.0) Дж/г Та, (±1.0) К

в отсутствие липофильных соединений 24.1 358.8 18.9 349.7

деканоат натрия 36.5 358.8 16.2 349.7

декановая кислота 37.5 360.8 26.3 352.0

монодеканоилглицерид 33.1 359.8 19.1 349.7

трикаприн 100.0 361.4 86.1 349.7

пальмитат натрия 12.5 361.4 10.6 349.8

пальмитиновая кислота 13.2 360.0 12.9 350.1

монопальмитоилглицерид 11.0 360.1 19.1 351.2

(Табл. 1). Достаточно добавить 2 мМ деканоата натрия к раствору легумина, чтобы энтальпия процесса увеличилась. Однако увеличение концентрации деканоата натрия

до 30 мМ вызывает уменьшение энтальпии процесса по сравнению с растворами,--------

содержащими 2 и 10 мМ . Следует подчеркнуть, что даже в этом случае энтальпия процесса больше, чем для раствора белка в отсутствие липофильных соединений. По-видимому, процесс взаимодействия сопровождается не только образованием соединения белка с липофильным соединением, но и разрушением внутримакромолекулярных контактов белковой глобулы, что сопровождается уменьшением энтальпии суммарного процесса. Взаимодействие деканоата натрия с овальбумином приводит не только к уменьшению энтальпии суммарного процесса, но и к уменьшению термической стабильности глобулы. Так, добавление 10 мМ деканоата натрия к раствору овальбумина сопровождается заметным уменьшением температуры денатурации. Увеличение концентрации деканоата натрия до 30 мМ приводит к полной потери конформационной стабильности (денатурации) овальбумина и к разворачиванию белковой глобулы при комнатной температуре (в этом случае фазовый переход не наблюдается).

Таким образом, легумин и овальбумин по-разному реагируют с липофильными соединениями. Наблюдаемые различия на наш взгляд могут быть связаны с отличиями в топографии адсорбционных центров, рассмотренными нами ранее. Липофилъные соединения адсорбируются глобулой легумина «далеко» друг от друга или на разные глобулы. Только при достаточно большой концентрации деканоата натрия (30 мМ) начинает проявляться отталкивание между полярными группами деканоата натрия, что вызывает уменьшение стабильности по сравнению с растворами легумина, в которых содержится 2 и 10 мМ деканоата натрия. На поверхности глобулы овальбумина адсорбционные центры расположены «близко» друг к другу. Адсорбция молекул деканоата натрия на «близко» расположенные адсорбционные центры приводит к отталкиванию полярных групп деканоата натрия , что вызывает уменьшение конформационной стабильности молекулы овальбумина и способствует разворачиванию глобулы.

Рассмотрим влияние на суммарную энтальпию процесса и температуру денатурации легумина и овальбумина липофильных соединений, отличающихся длиной углеводородного радикала (2 мМ, деканова якислота и её производные,

п=10, пальмитиновая кислота и её производные, п=16) (Табл.2).

Следует отметить, что при добавлении 2 мМ производных декановой кислоты к растворам легумина и овальбумина температура денатурации (термическая стабильность) белков практически не изменяется. Можно предположить, что конформационная стабильность глобул белков при этом не изменяется или изменяется незначительно. Добавление производных декановой кислоты к раствору легумина вызывает увеличение суммарной энтальпии процесса, что, вероятно, вызвано образованием новых связей в интерьере молекулы легумина. При добавлении декановой кислоты к овальбумину суммарная энтальпия процесса увеличивается незначительно, при добавлении монодеканоилглицерида - не изменяется. Интересно отметить, что добавление наиболее гидрофобного соединения - трикаприна вызывает наибольшее возрастание энтальпии суммарного процесса как для легумина так и для овальбумина. Это объясняется тем, тем что трикаприн обладает большей гидрофобностью по сравнению с другими использованными соединениями и может образовывать больше гидрофобных контактов в интерьере молекул белков (Табл.2 ).

Следует подчеркнуть, что взаимодействие легумина и овальбумина с производными пальмитиновой кислоты практически не изменяет термическую стабильность белков (Табл.2). Однако в данном случае мы не можем утверждать, что конформационная стабильность глобул белков не изменяется. Добавление пальмитиновой кислоты и её производных к растворам легумина и овальбумина вызывает уменьшение энтальпии суммарного процесса (Табл.2), что может быть вызвано разрушением некоторых важных гидрофобных контактов в белковых глобулах и их частичным разворачиванием .

Таким образом, молекулы с различной длиной углеводородной цепи по-разному влияют на термодинамические параметры растворов легумина и овальбумина. Добавление липофильных соединений с небольшой длиной углеводородного радикала (декановая кислота и её производные, п=10) вызывает, как правило, увеличение энтальпии суммарного процесса для легумина и овальбумина. Добавление липофильных соединений с большей длиной углеводородного радикала (пальмитиновая кислота и её производные, п=16) приводит к разрушению некоторых

гидрофобных контактов белковых глобул, что может привести к частичному разворачиванию (денатурации) белков.

В Главе V обсуждается влияние липофильных соединений на поверхностную-активность растворов легумина и овальбумина.

Поверхностные свойства биополимеров определяет их ■ способность образовывать пены и эмульсии. В результате адсорбции липофильных соединений молекулами легумина и овальбумина образуются «новые» соединения с иными поверхностно-активными свойствами. Поэтому представлялось важным выяснить как влияют липофильные соединения на поверхностные свойства молекул легумина и овальбумина. Поведение белков па межфазной поверхности количественно описывается термодинамическим понятием - поверхностной активностью.

Для измерения поверхностного натяжения использовали метод Вильгельми. В качестве меры поверхностной активности растворов белков использовали значение межфазного давления

■Я = 5 буф" 5 бел. р-ра,

где 8 6уф - значение поверхностного натяжения буфера (или буфера, содержащего липофилыюе соединение), 5 бел р-ра. - значение поверхностного натяжения раствора белка ( или раствора белка, содержащего липофильное соединение). Рассматривали значения поверхностного натяжения через 3 часа после начала формирования поверхностного слоя (для растворов легумина и овальбумина через 3 часа достигаются близкие к равновесным значения поверхностного натяжения.)

В Табл.3 приведены значения межфазного давления растворов легумина и овальбумина при добавлении к ним декана (при насыщении в лиофилизованном состоянии в течении 10 дней), декановой и пальмитиновой кислот и их производных.

Из данных, приведенных данных в Табл.3 видно, что введение в растворы легумина и овальбумина липофильных соединений, как правило, вызывает увеличение поверхностной активности белков. Изменение поверхностной активности зависит от природы белка и от природы липофильного соединения. Причиной увеличения поверхностной активности является адсорбция молекул липофильных соединений, вызывающая увеличение гидрофобности поверхности белковых глобул.

Таблица 3.

Межфазное давление растворов легумина и овальбумина в отсутствие и присутствии декана, декановой и пальмитиновой кислот и их производных (2мМ) через 3 часа после начала формирования поверхностного слоя (фосфатный буфер рН 7.0,1 = 0.1 М, 25°С ).

Липофильное соединение Легумин Овальбумин

я, мН / м 7С, мН / м

без липофильных соединений 17.5 14.2

декан (насыщение по сухому) 26.7 19.5

деканоат натрия 21.3 28.2

декановая кислота 22.7 21.1

монодеканоилглицерид 6.3 2.3

трикаприн 40.1 28.3

пальмитиновая кислота 23.0 20.3

пальмитат натрия 20.8 21.5

монопальмитоилглицерид 18.4 19.7

Наибольшее .влияние на поверхностную активность обоих белков наблюдается при добавлении наиболее гидрофобного соединения - трикаприна. Углеводородный радикал трикаприна, по-видимому, ориентируется в направлении менее полярной фазы (воздуха) и вызывает рост поверхностной активности. Уменьшение поверхностной активности растворов легумина и овальбумина наблюдается при добавлении моноглицерида декановой кислоты (Табл.3). Не исключено, что причиной уменьшения поверхностной активности в присутствии моноглицерида декановой кислоты является разрушение поверхностного слоя в результате побочных реакций, которое происходит за время, меньшее чем время установления равновесия.

Следует отметить, что значения поверхностной активности раствора овальбумина в присутствии деканоата натрия и трикаприна отличаются незначительно. Не исключено, что в присутствии деканоата натрия происходит частичная денатурация (частичное разворачивание) глобулы овальбумина, которая приводит к росту гидрофобности поверхности глобулы и, в конце концов, к существенному увеличению поверхностной активности.

Из сопоставления результатов, приведенных в Табл.3 следует, что жирные кислоты с разной длиной углеводородного радикала (п=10, декановая кислота и

п=16, пальмитиновая кислота) практически одинаково влияют на поверхностную активность легумина и овальбумина.

________Методом светорассеяния___было показано, что -добавление-липофильных

соединений к растворам легумина и овальбумина вызывает образование ассоциатов белков, что также является одной из причин увеличения поверхностной активности.

В Табл.4 приведены молекулярные массы глобул легумина и овальбумина в растворе в отсутствие и в присутствии декана и деканоата натрия. В присутствии липофильных соединений молекулярные массы белков возрастают. Наибольшее увеличение молекулярной массы белков наблюдается при насыщении лиофилизованных белков деканом. Не исключено, что при таком способе насыщения Таблица 4.

Молекулярная масса молекул легумина и овальбумина в отсутствие и в присутствии декана и деканоата натрия (фосфатный буфер, рН 7.0,1 = 0.1М).

Молекулярная масса 10"3, кДа

Легумин Овальбумин

без липофильных соединений 350 44

в присутствии декана (насыщение в сухом состоянии) 1900 294

в присутствии деканоата натрия (10 мМ) 1100 109

в присутствии деканоата натрия (30 мМ) 530 220

образуются микроэмульсии, включающие несколько молекул белков. Добавление деканоата натрия к растворам белков приводит к меньшей ассоциации белковых молекул, чем добавление декана. Образование ассоциатов в данном случае вызвано ростом гидрофобности поверхности белковых глобул в результате адсорбции деканоата натрия и усилением гидрофобных взаимодействий между отдельными глобулами белков. Важно подчеркнуть, что как для легумина, так и для овальбумина в присутствии деканоата натрия степень ассоциации белков возрастает и зависит от концентрации деканоата натрия в растворе. Однако в присутствии 30 мМ деканоата натрия степень ассоциации легумина меньше, а овальбумина больше, чем в присутствии 10 мМ деканоата натрия. Эти различия

вызваны, по-видимому, следующим. Адсорбция молекулой легумина небольшого количества деканоата натрия (10 мМ) приводит к росту гидрофобности поверхности и увеличению ассоциации белковых глобул. При увеличении концентрации деканоата натрия в растворе до 30 мМ увеличивается количество молекул, адсорбированных глобулой, и в результате отталкивания одноименно заряженных групп деканоата натрия, принадлежащих разным глобулам, степень ассоциации глобул уменьшается. Иная ситуация имеет место для глобул овальбумина. В главе III было показано, что введение 30 мМ деканоата натрия в раствор вызывает денатурацию глобул овальбумина. В результате денатурации возрастает гидрофобность поверхности глобулы и, как следствие, увеличивается .ассоциация макромолекул овальбумина.

В Главе VI обсуждается влияние рН и липофильных соединений на термодинамическую совместимость легумина и овальбумина в растворе.

На Рис.3 приведены фазовые диаграммы системы легумин-овальбумин-вода при рН 7.0 и рН 7.8. Растворы легумина и овальбумина совместимы в довольно широкой концентрационной области. С уменьшением рН от 7.8 до 7.0 наблюдается сдвиг концентрационной области фазового расслоения в область низких концентраций. Координаты критических точек (значения концентрации белков, при которых составы фаз, образующихся при расслаивании растворов легумина и овальбумина, равны) следующие: при рН 7.0 - Сл„ = 7.8 вес.%, Совал =13.6 вес.%; при рН 7.8 - Слег. = 8.5 вес. %, Сомл. = 18.9 вес. %.

Объяснить термодинамическую совместимость легумина и овальбумина в растворе мы попытались с помощью результатов, полученных методом светорассеяния (Табл.5).

Из данных, приведенных в Табл.5 видно, что с уменьшением р наблюдается небольшая самоассоциация молекул легумина в растворе. При изменении рН от 7.8 до 7.0 значения вторых вириальных коэффициентов уменьшаются, что свидетельствует об уменьшении термодинамического сродства молекул белков к растворителю. При этом взаимодействия между однотипными (легумин-легумин, овальбумин-овальбумин) и разнотипными (легумин-овальбумин) молекулами становятся термодинамически более благоприятными. Это, вероятно, связано с уменьшением отрицательных зарядов молекул легумина и овальбумина и,

25 -

: 15

Рис. 3. Фазовые диаграммы системы легумин -овальбумин-вода при рН 7.0 и 7.8

(фосфатный буфер, 1=0. Ш, Т=25 С): 1 - рН 7.8, 2 - рН 7.0, аиб-

критические точки.

"Р-РА ЛЕГУМИНА

, % вес.

Таблица 5.

Молекулярная масса и термодинамические характеристики растворов легумина и овальбумина при рН 7.0 и рН 7.8 (фосфатный буфер, I =0.1 М, 25°С).

БЕЛКИ

Легумин | Овальбумин Легумин | Овальбумин

рН 7.0 рН 7.8

Средняя молекулярная масса, М\у, кДа 350 44 330 44

Второй вириальный коэффициент, А*б-бХ104, м /моль -39.2 6.5 174.2 22.5

Перекрестный второй вириальный коэффициент А*23 х 104, м3/моль 7.3 70.0

следовательно, с уменьшением сил электростатического отталкивания между одноименно заряженными белковыми глобулами. Влияние рН на термодинамическую совместимость растворов легумина и овальбумина является следствием изменения термодинамического сродства молекул белков к растворителю.

Влияние липофильных соединений на термодинамичекую совместимость растворов легумина и овальбумина исследовали на примере двух соединений - декана и трикаприна.

На Рис.4 приведены фазовые диаграммы системы легумин-овальбумин-вода в отсутствие и в присутствии липофильных соединений. Видно, что в присутствии липофильных соединений концентрационная область сорастворимости белков сдвигается в область меньших концентраций легумина и овальбумина. При добавлении трикаприна термодинамическая совместимость легумина и овальбумина в растворе уменьшается в большей степени, чем при добавлении декана. Это, по-видимому, связано с большими изменениями гидрофобности поверхности глобул белков, вызываемыми трикаприном, чем деканом. В результате адсорбции декана и трикаприна глобулами легумина и овальбумина белковые глобулы ассоциируют (см. Гл.4), что также может быть одной из причин уменьшения

Рис. 4. Фазовые диаграммы системы легумин - овальбумин ■ вода: (1) в отсутствие липофильных соединений, (2) в присутствии декана (насыщение белков деканом в лиофилизованном состоянии), и (3) трикаприна (2мМ). (фосфатный буфер, рН 7.0,1 =0.1 М). а,б,в- критические точки, соответсвенно.

' Р - Р А ЛЕГУМИНА

сорастворимости растворов легумина и овальбумина. Ниже приведены координаты критических точек фазовых диаграмм системы легумин-овальбумин-вода: в присутствии декана - СЛ1Л = 9.0 псс.%, Совад = 7.7 вес.%; в присутствии трикаприна - С„„ = 10.2 вес.%, С08ал = 4.3 вес.%.

Интересно отметить, что верхние ветви бинодалей системы легумин-овальбумин-вода в присутствии декана и трикаприна практически не отличаются друг от друга, тогда как нижние ветви отличаются существенно .

ВЫВОДЫ

1. Методом спинового зонда установлено, что легумин и овальбумин взаимодействуют со спин-меченными липофильными соединениями, содержащими длинную углеводородную цепь, но не взаимодействуют с соединениями, не содержащими углеводородную цепь. В результате гидрофобных взаимодействий происходит адсорбция спинового зонда белковыми глобулами и вращательная подвижность спинового зонда резко уменьшается. Глобулы легумина, как правило, в большей степени адсорбируют липофильные соединения, чем глобулы овальбумина. Показано, что топография адсорбционных центров молекул легумина и овальбумина резко отличается. Спин-меченная стеариновая кислота адсорбируется на отдельные адсорбционные центры легумина, «далеко» расположенные друг от друга (на расстояниях, на которых не проявляются обменные и дипольные взаимодействия парамагнитных фрагментов спин-меченных стеариновых кислот, больше 5-10 А), либо на разные глобулы. С гидрофобными участками глобулы легумина связана вся (или почти вся) молекула спин-меченной стеариновой кислоты. При взаимодействии спин-меченной стеариновой кислоты с глобулами овальбумина в адсорбционном процессе участвуют главным образом «близко» расположенные адсорбционные центры или центры, способные связать несколько молекул. Немеченные липофильные соединения (деканоат натрия, пальмитиновая кислота и пальмитат натрия) адсорбируются глобулой овальбумина вместе со спин-меченной стеариновой кислотой, при этом происходит перераспределение спин-меченной стеариновой кислоты по адсорбционным центрам.

2. Методом микрокалориметрии показано, что особенности взаимодействия легумина и овальбумина с липофильными соединениями, конформационная и термическая стабильность белков определяются природой белка, топографией адсорбционных центров и природой липофильного соединения. Взаимодействие с белками липофильных соединений с небольшой длиной углеводородного радикала (декан, декановая кислота и её производные, п =10), как правило, приводит к увеличению энтальпии суммарного процесса (денатурации и взаимодействия белка с липофильными соединениями). При этом термическая стабильность белков не изменяется. Адсорбция деканоата натрия не изменяет термическую стабильность легумина, но уменьшает термическую (и конформационную) стабильность овальбумина., что, вероятно, объясняется различной топографией адсорбционных центров. Адсорбция липофильных соединений с большей длиной углеводородного радикала (пальмитиновая кислота и ей производные, п =16), как правило, не изменяет термическую стабильность, но приводит к уменьшению конформационной стабильности глобул легумина и овальбумина. Наибольшее влияние на энтальпию суммарного процесса (для легумина и овальбумина) оказывает наиболее гидрофобное из использованных нами соединений - трикаприн.

3. Методом светорассеяния показано, что взаимодействия легумина и овальбумина с липофильными соединениями приводят к ассоциации белковых глобул в растворе. Степень ассоциации определяется как природой белка, так и природой липофильного соединения и, как правило, больше для молекул легумина.

4. Установлены закономерности влияния липофильных соединений на поверхностную активность белковых глобул легумина и овальбумина в растворе. В результате адсорбции липофильных соединений глобулами легумина и овальбумина образуются «новые» соединения, поверхностная активность которых, как правило, больше, чем поверхностная активность нативных белков. Наибольшее влияние на поверхностную активность оказывает трикаприн, что связано с наибольшей гидрофобностью этого соединения (из использованных нами). Не исключено, что изменение поверхностной активности связано с частичным разворачиванием белковых глобул и образованием ассоциатов белков в результате адсорбции белками липофильных соединений.

5. Построены фазовые диаграммы системы легумин-овальбумин-вода при рН 7.0 и 7.8. При уменьшении рН от 7.8 до 7.0 термодинамическая совместимость растворов легумина и овальбумйна уменьшается, что вызвано уменьшением термодинамическорго сродства молекул полимера к растворителю. Построены фазовые диаграммы системы легумин-овальбумин-вода (рН 7.0) в присутствии декана и трикаприна. В результате взаимодействия легумина и овальбумйна с липофильными соединениями термодинамическая совместимость белков уменьшается. Трикаприн оказывает большее влияние на термодинамическую совместимость легумина и овальбумйна в растворе, чем декан.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. L A. Wasserman, M.G. Semenova, Effect of the hydrocarbon - decane and fatty acid salt - sodium decanoate on the thermodynamic properties of the proteins in the aqueous medium., J. Carbohydrate Polymers. 1994, 25(3), p.221.

2. LA. Wasserman, M.G. Semenova, E.N. Tsapkina, Thermodynamic properties of the 1 IS Globulin Vicia Faba - Ovalbumin - Aqueous Solvent system: light scattering and phase behavior.. J. Carbohydrate Polymers. 1994, 25 (3), p.220.

3. L.A. Wasserman, M.G. Semenova, A.V. Rodina, Effect of the lipophilic molecules on the food proteins functional properties depending on lipophilic molecules structure in the set: decane - capric acid - 1-monodecanoyl-rac-glycerol - tricaprin., Book of Abstracts of International Congress "1995 International Chemical Congress of Pacific Basin Societies", Honolulu, Hawaii, USA, 1995, part I, AGRO 0021.

4. L.A. Wasserman, M.G. Semenova, Effect of the lipophilic molecules on the food protein surface activity at the air/water interface depending on lipophilic molecules structure in the set: palmitic acid sodium salt - palmitic acid - 1- monopalmitoyl-rac-glycerol., Abstracts of International Conference «Food colloids - proteins, lipids and polysaccharides», Ystad, Sweden, 1996, p. 14.

5. L.A. Wasserman, M.G. Semenova, Effect of lipophilic molecules on food protein surface activity at the air/water interface depending on lipophilic molecule structure., In book «Food colloids - proteins, lipids and polysaccharides» (Eds. E.Dickinson, B.Bergenstahl), RSC, 1997, p. 77-91.

6. L.A. Wasserman, M.G. Semenova, E.N. Tsapkina, Thermodynamic properties of the 1 IS Globulin Vicia Faba - Ovalbumin - Aqueous Solvent system: light scattering and phase behavior., J. Food Hvdrocolloids. 1997, (принято к публикации).

7. L.A. Wasserman, M.G. Semenova, Effect of decane or sodium decanoate on the thermodynamic properties of the proteins in the aqueous medium.,

J. Food Hvdrocolloids. 1997, (принято к публикации).