Жидкофазное равновесие в растворах глобулинов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

РГ6 од

=■; '• ■ V Ц:,,-.) РОССИЙСКАЯ ¿КАДМИЯ РДУК С, >

овд2«л лекклл икслгот ЗДЕНэдгооРгдшвдскчх совдмшш

'ни. А.Н.НЕСНЗУШОЗА И КСТ'ЛТУТ ЯКЦЕВНХ ЗЧЩЕСТЗ

На правах рукописи УДК 541.12.01?.

ПОПКЛЛО• ИРИНА АЛЕКСЕЕВНА

ШДОМДОХ РДЭД098СКВ В РАСТВОРАС ГЯ0В?Й5Ш0В.

02.00.03 - Химия гысокомолекулярних соединений

Автореферат диссертации ка соискание у;еноП степени кандидата химических

I

Москва - 1593

ï-cuoTt» r..:,ori'.í:,c\ z. .?:п<н:г; '¡';:c г.;т,-j-¿ злесм'^о^;

, r ¡i', - '.гг'-í tiny i'.

j y~.o¿r - ' as t- XII>:'¡4..C::.Í;. '...Г,

ct . i-. ч. -..'i : . ó i.or . i- .'.•••'■•:.■■ "> ■'<.!;.: ij1" - ;,o i -:т

-:,--;[! I:. С. <*' . !/."■ i•. .>i;w у:ц,ц-;.._г.,:: ." гг/;. ,',.í¡íx»!);

¡j:-".'4i! i.;n;!'ii?ci,<>i s.,

.'.-.> ' .'-i1 i1-.. ■ ■. Я'.,:. -

t-vwr.cí: ífííf^^. г v.r..

; i.'C4;"iK¡ C;:r..rt< '.'. fO? . Г? . CJ .-¡o x"-

.in COKC«ü¿»'ÜC ;•" ÍCíc¡; " /-ÜSÜU'C:;;,,!

:;.■•> г. - c^jj iii.ui'u i.«ci <■ í-lMOiíiC^p^^M'/oci^í -"jcj-'í-cu!;! им. Л .51.Íi04.v.:..7:.ori V-MI n"*. ¡>»£C4V- ItTSiC, '!oc«a, ß—, . В: ,2b.

С »¡c«::i/ o&>iaíoü'íYí.c. г U'ù'iCC, ?ДЧ.

рпзосд'-ч VÍS?"__iS£»3 голв .

У\0!1Ы'". сакрс-т^'р:,

С|»сц«адяоиг>овг-;).:осо Союотг. ОПЧ.ЧЬ.О^ г.лнд . . нзук

И. А.:.i.e.v.l.:

обцдя sôpèf еристкм рляот.

Дктуи иьчпгт!. тям1т Важное нос го в физической химии высокомолекулярных соединений запинает нс<:.<едояч:шй термодинамических свойств растворов полиьеров. Это обусдозлйно в первую очередь возможностью изучения стру ктуры подимороп, их внутри- и мэг:мо-лекулчринх взаимодействия. Усложнение стрсеяия полинерп, иадичпэ п его составе различных мономеров, d той числе и ноногенны", затрудняет термодинамическое описание поведения таких ссодиионнЗ 2 сл гных, нногокоипонэнтимх растворителя::. Вое -jto относится т.; описанию поведения в раствори такого saxuoru и многочисленного класса полимеров лак белки. Белки, являясь сложными сополимерами аояоз 20 аминокислот, чрезвычайно разнообразии пп строению и структуре. Являясь полимерами диполнрной и дийальноЛ природы, балки проявляют широхоо разнообразие в пОЕЭдении э растворах и, в первую очередь, в родных растворах. Изменение гаклх свойств водной среды как температура, величина ph', попиая сила, содержание ¡шзкомодекудярнкх органически:; соединений мохет в значительной степени влиять »а поведение бзлкоа в раствора и на их хонформаштю. Ослабляя, или усиливая ззаимодейеттзие макромолекул балка друг с другом л с растворителем, козно регулировать растворимость белка» гызнвая его растворение a ян осакдениэ. Этот подход находит анрокоо применению ка практика. Большинство процессов пы-деления, очистки и переработки биополимеров, в том число и белков, основаны ка фазовом парохода раствор-осадок. Поэтому пссдй-до99.ни» подобных Фазовых переходов ь бедоксодержэщ1Х сис-льмах удаляется больно© внимание.

Крона равновесия типа раствор-осадок ъ некотори:: бахкоиих системах наблюдается равиоаосио типа раствор-высокохонцактриро-вашшй растаор, Яри зтом практически eaci, 5<эдох концвнтрярувтел г; одной Фазо и эго концентрация в ней кэяот достигать Ь0%. Учитн-вая, что этот фазовый пароход обратим и но приводит к денатурации или носбратимой агрогац.чи белка, но то предположить, что лид.ко-фаакоо х^есслсениа в бе.юксодеряащих еистоиах н»й,чяу яироков прн-мепэнко в процессах выделения и парэработки йеякоа.

S 4hcjiv- наиболее распространении;: в природа бзиков иомко oï— несть эппасн1:э бгалхк сэ.члн растений. Зтн 5элйи s порвут очередь являются o«.o;cï£î>î;i пяяо»ой технологи!!. Широкое ксаолглзозанио орс-титядьммх звлкоз в пгщевой технологии обусловлено их более инэхоЛ себестоимостью по стззнепи» с животная« бедками, а такхе возпол-

ностью повышения биологической ценности пищевых продуктов за счет ввэдения в их состав растительных белков, содержащих большое количество незаменимых аминокислот. Растительные белки имеют важное значение как Функциональные добавки, входя в состав пищевых продуктов в качестве гелеобразователей, загустителей, стабилизаторов иен и эмульсий, а также в виде текстуратов.

дованни основных закономерностей яидкофазного расслоения в растворах глобулинов семян, в исследовании влияния различных физико-химических факторов на жидкофазное равновесие в системах глобу-лииь!-нейтральная соль-вода.

Б связи с этим были, поставлены следующие задачи: разработать метод выделения основных компонентов глобудиновой фракции семян кормовых бобов н гороха - вицилинов и легуминов, позволяющий получать эти белки в количествах, необходимых'для проведения исследования концентрированных растворов этих белков; разработать методику оценки Фазового состояния растворов глобулинов; исследовать влияние температуры, концентрации нейтральных солей, величины рН, диэлектрической проницаемости среды на яидкофазное равновесие в растворах легуминов и вицилинов.

ворителя получены фазовые диаграмма в координатах состав-температура для систем белок-нейтральная соль-вода, содераацих легумины и вицилины семян кормовых бобов и гороха. Показано, что для всех исследованных систем характерно наличие верхней критической температуры расслоения, а величина критической концентрации балка практически не зависит от состава растворителя и для всех четырех исследованных белков близка к 18%.

Показано, что фазовое состояние исследованных систем белок-нейтральная соль-вода определяется только удаленностью системы от критической точки; Форма бинодали описывается у авнением теории соответственных состояний.

На основании анализа зависимостей критической температуры расслоения растворов легуминов и вицилинов от ионной силы, величины рН, диэлектрической проницаемости среды сделано предположение о том, что яидкофазное равновесие в растворах глобулинов определяется балансом энергий диполь-дипольного и заряд-зарядного (взаимодействий и энергии теплового движения макромолекул биополимера .

Ррлктииягкпо яначрмир! ппл-Учпнннх ря^Упьтлтпв. Данные о закономерностях гидкофа-зного расслоении в растворах легуминов и

. Цель работы заключалась в иссле

.■ В широком диапазоне изменений состава раст-

вицилиноз позволили разработать эффективный метод Фракционирования глобулинов семян кормових бобов и гороха, а также способ получения пищевых белковых волокнистых текстуратов методом бес-фильерного формования на основе глобуличовой фракции семян бобовых растений.

• Апробация ря^птч Результаты работы бсуждались на коллоквиумах лаборатории новых пищевых форм ИНЭОС АН СССР и лаборатории выделения и очистки биополимеров ИПВ РАН, докладывались на 3-ем Меямнародном симпозиуме по пищевым белкам (ГДР, 1988), 3-ей Всесоюзной конференции "Химия пищевых веществ" (Могилев, 1950).

пурник-апми по материалам диссертации опубликовано 31 печатных работ, получено 1 авторское свидетельство.

ние, обзор литературы, экспериментальную часть, список литературы (164 ссылки). Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 43 рисунка и 4. таблицы.

СОДЕРХАПИК ДИССЕРТАЦИИ.

Во введении обоснована акгуальнчсть теми, сформулирована основная цель работы, обоснован выбор объектов исследования. В обзоре литературы представлеяы данные о структуре легуминов и вицилинов семян бобовых растений, расмотрены основные подходи к фракционированию этих белков. Рассмотрены различные типы фазовых равновесий в растворах белков, влияние различных физико-химических факторов на растворимость белков. Систематизированы данные о яидкофазном расслоении в растворах белков, рассмотрены основные концепции, "предложенные для объяснения этого явления. На основании анализа литературных данных сформулированы основные задачи исследования.

Объехты и методы исследования. В работе били использованы препараты легуминов и вицилинов семян кормовых бобов и гороха, полученные по оригинальной методике. Однородность препаратов оценена методами скоростной седиментации и диск-эдектрофореза и полиакриламидном геле. В работе были использованы следующие Физико-химические методы исследования: УФ-спектрофотометрия, золь-анализ, гель-хроматография, диск-электрофорез в полиакриламидном гало, скоростная седиментация, вискозиметрия.

талг-а 2. результаты я обстздешш. '

2.1. <ра^циош;роза:;па rjoôy.-UiHor- из семян KcpixODiu; бобов

ïï l'OpOI'ij.

Несмотря на больное разнообразие подходов к Фрацц.чонированк-.о глобулинов из семлн бобовых ргетс«ий, методы препаративного виде-лвкия отдельных компонентов ;\'обулиновсй Фракции, û т^кае методы, котсрио могут быть нспольэоа?ны ь промышленном масштабе, основами на различии и растворимости экцилинов и легуминов. Б основу метода фракционирования в ицплшю;з и л в гунн и он. из сокяп корковых СсЗов и ioi-iojîû, представленного на Рис.1, 'i'aKse были полосони различия о рг-створимссти этих балков, наблюдаемые при опредолешшх зиачи-hhizx pit среды, ;сон«е:п'рации хлор истого натрия и т&мпературы.

Процесс Сракцнонкгоиания легуминов и вицилинов иожет быть подразделен на пять основных стадий: 1) экстракция растворимых Зел::ов; 2) осаздеиие иолочерастворииых белков; 3) оСааденко sory-миковой фракции; 4) осахдение промежуточной фракции; 5) осааденпс «шцилинозой Фракции.

При рн 8.0 в воде, что соответствует условиям экстракции, вицняины i; легуиины полностью растворима. Это обеспечивает махск-иальну» степень извлечения белков из исходного сырья - муки, подушиной измельчением очищенных от оболоче;: семян. Крсмэ глобулинов s раствор при этих условиях переходят альбумины и целочераст-,rophMrfa Репин. Несмотря на го, что иаозлектричвекие точки легумн-нор я вицилинов существенно различаются и соответствуют рн 4.0 к р'Л 5.5 vi минимально; раствориностд этих белков следовало бы оаи-,н1л*ь гелизк этих значений рп, реально наблюдаемые лилипут! растворимости для обоих белков практически совпадают и соответствуют довольно широкому интервалу значений рН от 6.0 до 4,0. В этом яс. интервале рН происходит осаждение н щелочерастворимых белков. Поэтому разделить белки дробыдо осаждением невозможно. Однако, ■лри введении в исходный суммарный экстракт хлористого натрия до 'концентрации 0.5 моль/л для кормовых бобов или 0.6 моль/л для гороха ситуация меняется. Введение соли практически не влияет по растворимость щелочерастворимыя белков и при рн 4.7-4.0 они пол-постьо осаждаются. Глобулины в этих условиях растворима. Таким обраэон • достигается отделение щелочорастворимых белков от Фракии;; глобулинов и альбуминов. Далее, разбавляя полученный солевой -экстракт водой до различных концентраций хлористого натрия, моннс получать препараты глобулинов различного фракционного составе. Тгх, если проводить разбавление экстракта водой при рН 4.В дс 0.3 иозь/л хлористого нагрия. го растворимость .-.егумина кормовых

$к/ауажги 1

сооткошеш ; мука/вода=1/10 рН-'В.О, Т=5С Л, t=l час

Птцы/шия нррлгтпприипгп ортятуд

ценгрифутированив Э500й Т=Э&°С, ^=30 МН1.

супернатант

Пг.пл! шш. ХЗдуя

рН 4.8, Снлс1=0.5 моль/л

центрифугирование 3500Д Т=30°С, 1=30 мин

осадок

осадок

. супавнатант

рИ 4.8, Сн»с1=0.3 мояь/л

Дддл.^жш - лагхичяхд&й-Л&л к ими

центргированиэ ЮООй 7=&5<»С, ^=15 мин

. супернатант

РН 4.8, Сьг„с1=0.3 моль/л, Т=5°С цащ-^ЕГИугированиа ЮООя

¡1гтр[г»угир0ва1и

t=15 мин -

- \ . '

супернатант дсаздемаа., птиипмппй^ц&х.диа

рН 4.8, СааС1=0.15 модь/л, Т=5=°С

Ц 0.4 ТрЙ ф^Г И р О 8-Я.И И О 1000.3

Т-5««г, 1 = 15 иин --

осадок

легункноваа Фракция

осадок

осадок

супернатант ал^бТЗ'Ядавдя фракциа

висдедемосая

Фракция

Рис. 1. Схема Фракционирования легуминоз н ьинихянов из сем:ш кориовых бобов и гороха.

бобов падает до 0.05% и основная часть белка осакдается. Выход препарата при этой составляет 7% от Беса использованной муки. Для легуннпа гороха растворимость и этих условиях составляет около 0.2Х, значительная часть белка остается в растворе и яыход препарата составляет 2%. Г.сяи проводить аналогичное разбавлониз при рН ьыиа или пито 4 .8, то ато приводят к значительному еннхеник похода беяковах препаратов, поскольку рЯ 4.0 соогеетстьуот мшшмуиу раствор:5::ос1И дегумина при данной кокцеиграции ;:мор1>стого натрия и небольшие изменения рН годуг к рззкону возрастанию растворимости лсгуи::иоз.

По данным скоростной сэдикешацни пропа! ты балка, чолу-чышые осажденном при £¡¡,4.8 в присутствия 0.3 ноль/л хлористого натрия, содержат около 70.1 лсгумш:а к 2Ь7, вицилии^. Очистить дог/мин от принеси гицилина хохно его пероосаядекием из 0.6 Я раствора хлористого натрии при рбзСоъяоти: этого раствора водой до 0.0 ноль/я соли при рК 4.В. Содержание хэгуниис о пирвоеаж-

препаратах достигаог 03*. Кромг хогуи-.шо получоннае првпь-ратч содержат около й^ глобулина с ксьФФицнонтом седимситдцшг 155. Этот белок представляет собсй яииор подогуд явгуннна. После пор-зссаздонил выход препаратов догумииа снижается ч составляет Ь7, от геей использоланноЛ муки в случае сеняа корлошлх бобов и 1.53 - в случав сеьян гороха.

После осаждение из солового экстракта йракция, оЗогадэпноЛ хогумииом, » растворе содержатся оицу.аин, алЬвумины, с телке остаток ае-гумна. При разбаслокии этого растгорг от 0.3 ноаь/л до 3o-.se нп;8их концентраций хлористого натрия прл 4.13-5.0 происходит оеггденхз видидина. Чем нике конечная концьнтр-лция сояа ■ тем. Быме *иход балка я гыио его содавланн© а препарате, Одноко ссс иолучаемто тихии с-брозои прзлара»'н содормт примесь яегуинн?, ¿•„■иатхи которого та¡н:а ос«.~дая>гся в эти* условиях. Боле© полного 'Л>икциоН|(ровашгя на этой стадии иог.нс давиться, проводя дро'Зиоо ослпдвние при ионнкении концентрации хлористого натрии и отбирая 4»рсиэхуточ!ше <Грак/:ии с различном сэотзюнанлен кслпононтэз в них

Вояео полного разделит*,;! лигуммое .: анцплиноз полно добить-ел ¡.сполюуя последовательное оглялмио тепп-зрзтуг11 рг-.сагога и гоьделтрации хлористого натри;;. При охлыедечии содзвого эястрак-•.••■> с г,о)1цгягрг.цней хлористого иьтркя 0.3 ноль/л происходит cc.it-доимо промежуточной ФРакцп;;, со.кэг>Ж8«!зй я ь< гун>>иы и бицхаикы. Ъ йкст.'-очто ост&отзп вицихжш V. а/«»сутп«ы. Нослз отдоленчт проиозгу-гочией фракции при разйавяеьии ох.шддечиого до .•»»С р-, ;теог" с ЙО.ЦЦ&НЧК»иЬ«!Й хлористого иатрис п.'2- моль/л Д1 0. 15 КОЛЬ/Л про:

кодит ося^гдешю енцияиков. Выход вицчякиа кормовых бобов состав-îzbt 1-1.5%, а зицияиноз города - 2-2.5% от массы муки. По данник скоростной седиментации эти препараты содержат только один накро-пошюнвнт - ВИЦ',! ЛИН.

Тзкии образом, используя только различия s растворимости лir/кинов и вици.пшов при определенных значениях рЯ, температуры концентрации соли, могло добиться практически полного раздчле-M'fK этих белков, обеспечивая при этом их вгеокий зиход. Однако йчкэкие изменения этих параметров не позеолг.|«-т разделить легумнн и 3 5S глобулин. Разделить эти компоненты удалось только при использовании ¿кдкостной препаративно,1 геяь-хроматогра^ии н;д Сола-рэзе CL-6B.

Следуэт отметить, что условия осаждения влияют но только nj реакционный состав получаемых болкозмх препаратов и их выход, но и на концентрацию бедка в нижней Фазе, то есть на степень коицен-трироваи'ля белка. Так, при осавдении балка из водного растворе при рН 4.5-5.0, происходит образование аморфного осадка. Кон гл-ттация белка s такси осадке кв превьшазт 15-20%. При осаждении из ¡¿одно-солевых систем белок выделяется в виде концентрированного ^¿створа. При условии, что осаздениз г.едетсп при рН, соответст-В>юцем минимуму растворимости белка, концентрация белка г> нияней !азе мокат достигать 50-55%. Осаждение белка з виде ¡зысококонцен-грированного раствора не сопровождается денатурацией или несбра тимой агрегацией белка, что часто наблюдается при иэоэлекгричес-к-ом осахдении, и поэтому получаемые белковые прспарати обладаю-;-высокой растворимостью. Кроне этого, такой способ осалдения даот ооэмокность получать раствори белков с концентрацией от 40 дс 55%, ч;>го практически не удаотс? достигнуть при растворении сухих препаратов балков.

Рве^лоенио з растворах i-яобуяинов наблюдается в довольно ¡/-.¡ком интервале значений рй, температуры и концентрации солеП. Поэтому, для того, чтобы иметь возногность целенаправленно изменять Фазовое состояние снстгм, ссдеряацих глобулины, и поручать нрепгратк с требуе::ыь-. составом, необходимо знать зсконоиорнсстг, нвдекик иидко^азного расслоения в растворах белкоп.

4.2. :'и;\ио~и.зио'1 расс."оз:!иа в pac-rtopa^ гjwiv>.

î'.wtivoрк j?t;ryi;ni.c,,B n »t»ui«*t,KOP из семян :«.>рног t.c-t'?,- и !-,огу. п;.ч»,:^рпч!\з'г,1 игюслоемкп iip:-. r,t >■ \-¡'v

rCiiiiicn.T'.-vtii >;гр>_ , c^-j;;«, ^ofiS'it'^uinr n^ù :-Дцч, y .i,'. i,

oie ¿и,-, в» MKi«/>i.r îr'piîU.-* cc>3,-;.'.;:rtïi!îi "■. ¿л. кг ч -

, .->:'ГЧ'Я P.o.'-'-.i: ниои i'iîw.tw-i /. pt et s ï

может быть представлено 'в виде фазовых диаграмм в координатах концентрация полимера (белка) - температура при условии постоянства всех других Физико-химических факторов. Для всех исследованных систем характерно иаличиз верхней критической теипературы расслоения, то есть расслоение рп~твора на две Еидкие фазы происходит при понижении температуры. ХидкоФаздое расслое+ше в этих системах полностью обратимо и при повышении температуры система вновь переходит в однофазное состояние. Следует отметить, что в отличие от фазовых диаграмм, „описывающих хкдкофазнов расслоение в растворах синтетических полимеров, фазовые диаграммы для растворов исследованных белков симметричны относительно гцмзиолинзйного диаметра в интервала 10-15°С ниже критической тонки. Это обусловлено, по-видимому; монодисперсностыо использованных евяковмх препаратов.

Величина критической концентрации белка, отвечающая точке пересечения прямолинейного диаметра*и бинодалк, практически не зависит от природы и концентрации соли, величины рИ и ирисут-стотя в системе глицина или этанола, и для всех иссладовзикых белков близка к.18%. Величина критической объемной дозм для исследованных белков составила Vk =0. 145±j0 .003, что является необычно высоким по сравнению с критической объемной долей, наблюдаемой .для синтетических полимеров с той ве молекулярной массой. Так для синтетических полимеров с молекулярной массой 300 кДа она составляет Ук =0.02-0.04.

Для оценки теоретической величины критической объемной доли белка с молекулярной массой 300 кДа и расчета тоорозги.чоекой бино-дали были использованы'представления теории расГКгров Фяори-Хаггинса и теории, олисИваицай поводаиис рздльннх газов.

Величину критической объемной доад белка р.5считыв5.ан исходя из граничных условий" стабильности двух компонентной circíeMu:

где /¿I - химический потенциал сиэиения'1-того компонента, ^ -объемная доля 1-того компонента в растворе.

Бинодаль расчитывали исходя из условий равновесия меаду фазами в двухкомпонентной системе

<2)

(1>

. 4*=* (3)

. ^ = О (4)

где " разность химических потенциалов смешения 1-того

компонента между двумя Фазами.

Рассчитанная по теории Флори-Хаггинса величина критической объемной доли белка равна =0.009, что значительно ниже экспериментального значения. Рассчитанная бинодлль сдвинута относительно экспериментальной в область меньших концентраций полимера (Рис.2) Эти расхождения являются, по-видимому, следствием того, чт' теория Флори-Хаггинса была развита для растворов полимеров, имепцих конформацию статистического клубка, в то время как молекулы глобулинов имеют конфорнацию жесткой непроьицаемой глобулы.

Рис. 2. Бинодали для раствора полимера с молекулярной массой 300 кДа, рассчитанные в соответствии с: 1) теорией Флори-Хаггинса, 2) уравнением Ван-дер-Ваальса, 3) уравнением Эйринга.

Учитывая, что макромолекулы дегуминов и вицклинов имеют1

о

размер поряпка 70-100 А, что в десятки раз превипаот разкяр молекул воды, в первом приближении растворитель мозно представить как непрерывную среду, а раствор глобулинов - как реальный газ. Переход однофазный раствор - двухфазная система эквивалентен з таком случае переходу от с^перкритииаского газа к система иаснцонныГ. пар - жидкость. 3 простейшем случае к описанию поведения так.)Г:

системы можно приманить уравнение Ван-дер-Ваадьса:

("-&)•{ Р=#Т (5)

где 1/ - полярный объем газа, П - давление, - газовая постоянная, Т - температура, & - параметр исключенного объема, О. - параметр взаимодействия молекул. Расчет критической объемной доли полимера с использованием уравнения Ван-дер-Ваальса дает величину ^ = 0.083, что также значительно меньше экспериментального значения. Рассчитанная бинодаль смещена относительно экспериментальной в область меньших концентраций полимера. При этом теоретическая область двухфазного состояния системы значительно уже, чем это наблюдается в исследованных системах.

Еолее слояное уравнение состояния реального газа - уравнение Эйринга - учитывает концентрационную зависимость величины исключенного объема:

Р = ПТ/СУ «*>

Рассчитанная по уравнению Эйринга величина критической объемной долк полимера равна У* = 0.146, что практически совпадает с экспериментально определенными значениями. Однако, и в этом случае теоретическая бинодаль отличается от экспериментальной. Возможно такое расхождение обусловлено тем, что энергетический член уравнения Зйринга учитываэт только парные взаимодействия макромолекул, что является определенным приблигением.

Бее фазовые диаграммы, полученные при различних условиях, могут Сыть представлены в обобщенном виде в райках теории соответственных состояний <Рис. 3). Согласно теории соответственных состояний бинодаль описывается уравнением следующего вида:

— ит-Ю/Ъ)* СО

где Тк - критическая температура, - критическая объемная доли белка, Л - критический показатель. В таблице 1 приведены значения рассчитанных критических показателей. Величина критического показателя колеблется от 0.28 для вицилина кормовых бобоа до 0.35 для легумина гороха. В целом полученные величины критического показателя бди~ч к его теоретической волнчине УЗ = 1/3, определяемой законом соответственных состояний, чем г й> - 1/2 как это следует из теории среднего подя, часто используемой для опн-

Т'ТК

-a,oí. -

-0,04 -

-0,06

Рис. 3. Обобщенная Фазовая диаграмма для систем яегумин кормовых бобов-нейтральная соль-вода: О - экспериментальные точки, " ■—"■■■ - бинодаль, рассчитанная по теории соответственных состояний.

Таблица 1. Характеристики обобщенных Фазовых диаграмм растворов глобулинов.

Белок

Критический показатель

Критическая . объемная доля белка

Лэгумин кормовых бобов -1вгумин гороха Вицилнн кормовых бобов Вицилин гороха

0.32 i 0.02 0.35 i 0.05 0.26 ¿ 0.04 0.33 t 0.05

0.145 i0.03 0.145 i.0.03 0.145 i 0.03 0.145 £ 0.03

сания критически:: явлений, в том чис-ве и для яидкофазного расслоения п растворах белков.

Такки образом, в равновесных условиях состава сосуяестйуаяш; Фаз, определяются только удаленностью систеии от критической точки. Это даот возможность зная координаты acaro о/з.чоЯ ючка iúi Синодали, определять составы сосугаос.'вуйци« фаз при явбсЛ таянз-рагурв.

Как уже было отмечено выше, для всех исследованных систем характерно наличие верхней критической температуры расслоения (Tic). Поскольку этот параметр однозначно отражает изменение фазового состояния системы, он был выбран в качества критерия, характеризующего влияние различных Физико-химических факторов но жидкофаэное равновесие в растворах глобулинов. На Рис. 4 представлены зависимости критической температуры расслоения в растворах легукина кормовых бобов от концентрации соли для ряда нейтральных солей. Независимо от природы.использованной соли

т*;с

30 .

20

10

0.2 0J

0,6 0,8 Cs, моль/а

Рис. 4. Зависимости критической температуры расслоения от концентрации различных нейтральных солей для систем легу-мин кормовых бобов-н-ейтральная соль-вода при рК 4.8: О - NaCl, ©- KCl, ©- HaNOa, в" (NtU Ф~ HaaS04.

зависимости Тк=Г(С») имеют один и тот яе вид: критическая температура расслоения снижается при возрастании концентрации соли. Характерным является то, что для систем, содержащих 1-2 электролиты, зависимости Тя=Г(С») снещены в область меньших концентраций соли по сравнению с 1-1 электролитами. Аналогичные зависимости были получены и для растворов других исследованных белков. Необходимо отметить, что при прочих равных условиях растворы вици-линоб претерпевают хидкофаэное расслоение при Более низких концентрациях солеЯ по сравнению с растворами легуминов.

Другим фактором, существенно влияющим на величину критической температуры расслоения в растворах белков, является- наличие в системе таких низкомолекулгрных компонентов как глицин и этанол, которые изменяют диэлектрические свойства среды. На Рис.5 представлены зависимости критической температуры расслоения раствора легумина кормовых бобов от концентрации глицина и этанола.

Рис. 5. Зависимости критической температуры расслоения от концентрации гАицина ( О > и этанола <@) для систем легу-мин кормовых бо6ов-НаС1-вода <рН 4.8, 0.6 моль/л НаС1).

Увеличение концентрации глицина в системе приводит к снижению критической температуры, увеличение концентрации этанола - к ее росту. Аналогичный характер зависимостей Тк=Г(Св1у) и Тк=5(СоО наблюдается и для других исследованных белков.

Рассматривая влияние различных физико-химических факторов на хидкофазное равновесие, необходимо исходить из того, что белки имеют диполярнуга и дифильнув природу. Поэтому макромолекула белка в растворе ведет себя как макроион, как диполь и как дифильная частица. В зависимости от условий мелду макромолекулами белка будет преобладать заряд-зарядное, диполь-днпольное или гидрофобной взаимодействие.

Рассматривая влияние солей на аидкофазное равновесие следует отметить, что приведенные выше результаты были получены в диапазоне концентраций солей от 0.2 до 1.0 моль/л. Этот диапазон соответствует области "всеивания" белка. Здесь растворимость

белка растет с увеличением концентрации соли, и роль гидрофобного взаимодействия у макромолекулами белка не велика. Поэтому при дальнейшем обсуждении можно ограничиться рассмотрением только заряд-зарядного и диподь-дипольного взаимодействий.

Зависимости Ти=Г<Св) были получены при значениях рК близких к изоэлектрическим точкам исследованных белков. В этих условиях средний заряд макромолекул белка близок к нулю и их можно рассматривать как нейтральные диполи. Энергия взаимодействия между нейтральными диполями в соответствии с уравнением Фуосса пропорциональна' диподьному моменту макромолекул белка (./I ) и диэлектрической проницаемости среды (£ ):

И>г> Св>

где /Ку - константа.

Присутствие низкомолекулярного электролита в системе про з-ляется в экранирующем действии. При этом энергии ион-дипольного взаимодействия в соответствии с уравнением Кирквуда пропорциональна дипольному моменту макромолекул белка, диэлектрической проницаемости среды и ионной силе ( X ):

Ц0 ~ Кг Х-(Мг/&г). (в)

где Аг - константа.

Условия, когда энергия диполь-дипольного взаимодействия, экранированного Фоном низкомолекулярного электролита, равна энергии теплового движения макромолекул, соответствуют точкам бинодалк. Если концентрация белка в растворе составляет 18Х, то эти условия соответствуют критической точке. Увеличение ионной силы приводит к возрастанию степени экранирования диполь-дипольного взаимодействия. Равновесие между диполь-дипольным взаимодей-тсвием и тепловым движением наступает при более ни&ой температуре, то есть область однофазного состояния системы увеличивается. Увеличение диэлектрической прони аемости среды при постоянной ионной силе приводит к снижению энергии диполь-дипольного взаимодействия. Равновесие мэяду дипэль-дипояышм взаимодействием и тепловым движением наступает при более низких температурах и область однофазного состояния также увеличивается. Экспериментальное данные гфдведенныз на Рис 4,5 глходягся с соответствии с этиха положениями, если представить их в вице Функций Ть-Ш) и Т*=г(!>) (Рнс.6,7). При этом все зависимости

TK,r

JO

20

10

0 i_I. . I_l

0 0,2 0,4 0,6 o,a I, мольjл

Piic.G. Зависимости критической тенпературы расслоения от ионной силы дли систем легукин кормовых бобов-нейтральная соль* -вода при рН 4.8. (Обозначения си. рис. 4)'.

Рис.7.Зависимость критической температура расслоения от диэлектрической проницаемости среды для систекм легумип кормо-гих бобо8-ИаС1-волд (рН 4.8, 0.0 ноль/л НпСХ).

Ти=г{1) стягиваются в' довольно узкий и;1Торвзд ионних сил и влияние природы соли незначительно. Нг5л:одпсм»'з для раэпиг. солеЯ различия могут кыть обуслор;гонн евлзываниен какромолокулв»'И белка ннэкоиолехуллрнц;: ионов.

Более слогная ситуация возникает при значительном отклонении системы о'1 условий иэоэлектрической точки. На Рис.8 приведены зависимости критической температуры расслоения растворов легумина кормовых бобов от величины рН при различных концентрациях хлористого натрия. Эти зависимости проходят через максимум и при увеличении концентрации соли смещаются в область более низких значений рН и более низких температур расслоения без изменения

Рис. 8. Зг исимости критической температуры .расслоения от рН для системы легумин кормовых бобов-ИаС1-вода при различных концентрациях хлористого натрия: О ~ 0.5 моль/л, О - 0.8 моль/л, О - 0.7 ноль/л, ©■ - 0.8 моль/л.

форми. Аналогичные результаты были получены и для других белков. При анализе фо уэвых равновесий в растворах белков при значениях рН, отличных от иэоэлектрической точки, возникает необходимость принимать во внимание то обстоятельство» что макромолекулы белха приобретают средний заряд, и, следовательно, учитывать заряд-зарядное взаимодействие между макромолекулами. В таком случае Фаэовоэ состояние системы будет определяться, балансом сил притя-Яения и отталкивания между иакромолехулами, то есть меяду диполь-дипс^льным и заряд-зарядчим ь^аимодействиями, с одной стороны, н тепловым движением - с другой стороны. При этом низкомолекулярная соль экранирует как дипэдь-дипольнсе, так и заряд-зарядное взаимодействия.

Согласпо литературным данным величина дкпольных моментов белков не ,.ротерпевает значительных изменений в интервале значений рН, который был исследовал в ¿энной работе. Поэтому, в первом приблиаени» можно полагать, что энергия диполь-дипольного взаимодействия постоянна в исследованном интервале значений рИ. Следовательно, изменение критической температуры расслоения исследованных систем при изменении рН связано, главним образом, с электростатическими эффектами. В изоэлектрической течке средний заряд макромолекул белка равен нулю, и оклад электростатических сил отталкивания минимален. Таким образом, в этих условиях критическая температура расслоения раствора белка достигает максимума. Дри отклонении от изоэлектрической точки макромолекулы белка приобретают полоаитольний или отрицательный средний заряд. Это приводит к возникновению электростатического отталкивания меяду :Зд::с;:ис;;но зараженными макромолекулами. Чем больше средний заряд, тем значительнее электростатическое отталянвгние. Поэтому баланс си* притяяения и отталкивания достигается при все более низкой текпердтуре, приводя к увеличении области однофазного состояния системы. Таким образом, в окрестности изоэлектрическСг точки белка зависимость Тк=^(рН) будет проходит через максимум. Величина критической температуры расслоения в точка максимума зависимости Гк-?(рЯ), соотзетствуеющэй изоэлектрической точке, определяется, н основном, энергией днполь-дипольного взаимодействия макромолекул белка, находящихся в ионном окруяеьии. В этом случае повыпе-)ие ¡¡рицэнтрации со^и (то есть ионной' си.та) способствует' экрани->оя?дЦДО аиполь-диподьного взаимодействия.. Ослабление этого взаи-гадойствкя и определяет сннвеиЬе величины критической температуры ¡аезлонио, соответствующей изкеимуму зависимости-Тй=Г<рИ).

Помимо снижения величины ..ритичесяой температуры расслоения | максимуме зависимости Ти=Г(РН), ари увеличения концентрации оли наблюдается такз'е-смещение этой зависимости в целом в об-асть более низких значений рН. Поскольку точка максимума соот-етстоувт изоэлектрической точке белка о данных условиях, можно редположнть, что это смещение отражает изменение именно поло-эния изоэлектрической точки белка, под действием соли. Смещение зоэлектрической точки при введении низкомолекулярной соли абдюдаяось рснее дЪя ряда белков. Этот эффект является, по-<дда.ому, результатом связывания макромосскулаии белков низко->лэкулярных ионов. В исследованиях системах, содэркад.чх юристай натрий, наблюдается сдвиг изоэлектричесхой течки в ;ласть меньиих значений рН. Отсюда модно сдэлегь предположение,

иселедоьанные белки преимущественно связывают анионы хлора. Л

2.3.С>орж>вг:миэ и свойства волокнистых текстуратос ка основе гдобугшюсой фракции корковых бобов.

Интерес к хидкофазнску расслоению в растворах глобулинов сзмян обусловлен возможностью ого использования в процессах получения пищевых белковых изолятов, с одной стороны, и использованием двухфазных бслоксодерлащкх систем и высококонцентрированных белковых растворов в процессах текстурированин, с другой стороны.

Замена традиционной стадии изоэлектрического осаждения белка в процессах получения белковых изолятов позволяет получать белг.о- ~ быз препараты в "мягких" условиях, избегая денатурации белка и ухудиения его растворимости. Кроме этого, осаждение балка в виде високо!<.о"ч011трг.роБашюго раствора существенно повняает эффективность процессов сушки.

При производство лицевых белковых текстуратов наиболее целесообразно последовательно реализовать процессы выделения и те: турировання белка, исключал стадии сушки белковых.изолитоа и приготовления прядильных растворов. Использование жидкофазаого расслоения в процассе выделения белка предоставляет такую возможность. Получаемые при расслоении концентрированные белковые раствори могут без дальнейшей обработки быть нспользованы в качестве прядильных растворов в процессах "мокрого" формование волокон. Были получены препарат:; глобул и новой фракции сомян кормовых бобов, различающиеся содержанием хлористого натрия и величиной рН (ГФ1 - 0.15 моаь/л НаС1, рН 4.8; Г4>2 - 0,125 коль/л. НаС1, рН 8.0>. Зти яозпаратц били использованы в качестве прядильных растворов при получении волокнистых текстуратов методом бесфил:.-ерного прядекия.

Известно, что получение лицевых белковых текстургтов по >штоду мокрого бесфкл'ьерного прядения часто сопровождается значительными потерям« белка в коагуляциопную ванну. 5га определяется термодинамическими свойствами прядильных р^еттюров, к условиям:; гелеобразованч»: балка, Потери балка в коагулециокнуь вапку весьма нахеяст^иьнь; с экономической и технологической точок з?а:ша. Поэтому газной зг.д?.чвй в технологии мокрого бесфня'ьернсгс. прлдэнк« ясляатск овъ«:м>сцив условий коагуляции по ьискпоиу потерь ,

- г.;ь», .:.„ Се л ко« час* о юпго^члот кс.-.ьулс !;.,о;);;г;с, г>аа,'-1 ; тюлсратурол, Г!сс; -уа ;; с. [.¡.он.по^ч- ь

личлтурацкч^ ;; гс^по/гс'1,;; " „о-.^,--." .-¿Сиу зпг. лчг г>,-.т-! _■>,

что пг« термотропном гелсоерчзованнн определенная часть белка не входит d сетку голя и остается в растворе, образуя золь-фракцию. В процессе мокрого бесфильерного рядени,. золь-фракция переходит в коагуляционную ванну и при этом теряется. Одним из способов снижения тахих потерь белка является использование в качестве коагуляционнсЯ ванны растворов солей поливалентных металлов, в частности содс-fi кальция. Минимальные потерн белка в коагуляционную ванну d случав препарата ГФ2 при формовании в горячий 0.005 М раствор хлористого кальцит. В слу(,де препарата r<tl минимум потер* набл^дрзтел при формозгшии в горючую д^стялироранную воду. При отс»! потери белка значительно выяе, чем э случае препарата ГФ2. Зги роил->'"ия связаны, по-видимому, с ген, что температура дена-гураци.ч основного компенонта препарата Til на 4.5°С выие температуры денатурации основного компонента ГС>2), поэтому часть беяка :< ппчпярптг, глТ ко пенатурируот и на участвует s пгоцэссч гелеоб-разозлыи?!, а растворяется ь горячей коагуляциончой чанке.

' Характерной особенностью полуденных текстуратов является наличие анизотропноП структуры.

Ногко предположить, что np«i сочетании стадий w -»romia бэлка и бзефнльеряого прядения а одной технологическом процессе, рас-смотг«ннче подход« могут в принципе конкурировать с гкетрузион-пяна методами токстурирования белков, хотя бм по эффективности

ЬСПО.'П.ЗО ванпя сырья.

nvsom.

1. пперпыо получены заэовио д««пгро:г-ш в ксордииатах состав--ТР>МПРР?ТУР'1 ДМ оистем 6»ЫОП-С9Л7.- ПОДЭ, СОДСрЛаЗДЛ глобулины кор;5огих бобов ¡i гороха, ъ сшроком диглпяоно n?t<e:iGHWft состава годной Показано, что г о не эх схупи'?. бииочгль инеот верх-«й.г> -..ритическук» температуру, а ввличяпп хрпткчсскоЯ концентрации постоянная л равна 133: вес. белка,

2. Похасакс, ':то «разово« оос.тг.янгга исслоеоэдинмх систем Солок-соль-цода определяется только у>э!члг:ос,п>'< от котгическоЛ точчи к гор::а бикодали описывается ура;нан'«!1 «гоооии соответствен«:« eccreuimtt.

3. :ia осно!К1»:ии анализа завпсм,чест<?5 тдаштской тгиперотур." гэсспсвияк ov копией сиди, вчлнч;ч:и ?I¡, даявокт^ячоскоЗ прсниц.-.з--Ч0С7И среди сделано предполокенча о тем, что ч основе аы*л»Аа«шо-VO ПЧЯЧЛЧЯ ГЧДКО^ВЧИОГО рП0СЛ0«НК5» '» С'.'г; ГС.-Л": б^лск-сол;»-года ."Ч-?.нг ba,4í',f.c vaeprmi диполь-днпс;:м;ого rr>atiíW..<f.C7'>K3, гоо~;'-',«Р>'Д-

ного взаимодействия и энергии твидового движения макромолекул биополимера, находящихся в ионном окружении.

4. На основе данных по жидкофазному равновесию в растворах легуминов и видилинов семян кормовых бобов и-гороха разработан, метод Фракционирования этих белков.

5. Разработан способ получения пищевых белковых волокнистых текстуратов, основанный на-переработке высококонцентрированных растворов растительных'глобулинов и позволяющий снизить до минимума потери белка.

Основные результаты работы• изложены в следующих публикациях:

1. Попелло И.А., Сучков В.В., Гринберг В.Я., ТОлстогузов В.Б. Фазовое равновесие в системе вода-глобулнны кормовых бобов--НаС1. - В об.: Новые источники пищевого белка. Тезисы II Всесоюзной конференции, Кобуле^и, 1986, с.53.

2. Сучков В.Б., Попелло .И ;А. ,■ Гринберг В.Я., Толстогузов В.Б." Возможности использования явления жидкофаэного расслоения в системах глобулини-соль-вода для выделения, концентрирования и текстурирования белков. - Деп. ВИНИТИ, 1987, N 7986-В87.

3. Попелло И.А., Сучков В.В., Гринберг В.Я., Толстогузов В.Б. Выделение и очистка IIS глобулинов из семян кормовых бобов и гороха. - Прикладная бг^химия и микробиология, 1888, т.24, с.50-55.

4. Suchkov V.V., Pop.ello I.A., Grinberg V. Ya. , Tolatoguzov V.B. Phase »¿auilibria in broad bean legunin-neutral salt-water system. - Abhandlungen der Akademie der Wissenschaften der DDR, : 1989, Hl, p,45-51.

5. Сучков-В.В., Попелло И.А. Получение белковых изолятоа из семян кормовых бобов и гороха. - В сб.: Химия пищевых веществ.

• Тчзисы III Всесоюзной конференции, Могилев, 1990, c.8¿.

6. Попелло К А., Сучков В. В. йздксфазное рассл«енис в раазгворах глобулинов кормовых бобов и гороха. - В сб. ■■ Химия rora^evx веществ.. Тезисы III Всесоюзной конференции, Могилев, 1890, с.89. '

7. Suchkov V.V. , Fopello I.A., Gr.inberg V.Ya., Tolstogusov V.B. Isolation and purification of 7S and IIS globulins fron

' broad beans and peas. - J.Agrie.Food Chen., 1990, v.38, ..92-95,

C. Popello I.A., Suchkov V.V , Grinbei'3 V.ya., Tolstoausov V.B. Li<(iiid-ii4uiiJ phnso 4cjui librinn in Slobu lin-salt-Hator Oyster : t-aflUDin. - J.Soi.Fooc! ЛЗг"'?., v.51, p.345-353.

9. P"cello Z.A., Suchkov V.V. , Grinberfl V.ya., TolBlogusov V.B. Mquid-liiuid ptiaae э<з» ilibriun in £ilobulin-ai:lt-Hater sya-ten: Vicilin. - J.Soi.Fcoc! Agrio., 1S91.,.V.S4, p.230-214.

id. Popello I. A., "uobkov V.V., Grinbsrjt V.Ya., Tolnto2;izov .. !Jffoots of upon the liquid-liquid phase equilibria in lequuins ^r.O vlciUnp. iron bro. . Ьзспс snd psas. - food HydroooUoids, 1892, v.6, no.2, p. 147-152.

11.Suchkov V.'/., УчЕэогяап L.A., Popallo I.Л., Grinborf! Ч. "п., '¿•olEito/luzfv V.B. Preparation of fibvoua pvotoin fron field boon globulins by not Ticn-spinnar^t r.pirminU. - J.Soi.Food Agrio., 1881, V.54., p.450-489.

12.Д.с. H 1530441 (СССР). Способ получении Солкойы.ч волокон./ Сучков В.В., Попэдло I!./!., Грииборг В.Я., Толстогузог; В.Б., 1900.