Взаимодействие кобаламинов и кобинамида с серосодержащими восстановителями, тиоцианатом и моно-сахаридами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

005533133

Деревеньков Илья Александрович

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОБАЛАМИНОВ И КОБИНАМИДА С СЕРОСОДЕРЖАЩИМИ ВОССТАНОВИТЕЛЯМИ, ТИОЦИАНАТОМ И МОНОСАХАРИДАМИ

02.00.04 - Физическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

19 СЕН 2013

Иваново - 2013

005533133

Работа выполнена на кафедре технологии пищевых продуктов и биотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ивановский государственный химико-технологический университет»

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Макаров Сергей Васильевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Воробьсв-Десятовский Николай Владимирович

(Научно-исследовательский испытательный институт (военной медицины) Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова, главный научный сотрудник научно-исследовательского испытательного управления научно-исследовательского испытательного центра (медико-биологической защиты))

доктор химических наук, профессор Поленов Юрий Владимирович

(ФГБОУ ВПО «Ивановский государственный химико-технологический университет», профессор кафедры физической и коллоидной химии)

Ведущая организация:

ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (г.Белгород)

Защита состоится «7» октября 2013 г. в 10.00 на заседании совета Д 212.063.06 при Ивановском государственном химико-технологическом университете по адресу: 153000, г. Иваново, пр. Фридриха Энгельса, д. 7. Тел. (4932) 32-54-33 Факс: (4932) 32-54-33 e-mail: dissovet@isuct.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Информационном центре Ивановского государственного химико-технологического университета по адресу: 153000, г. Иваново, пр. Фридриха Энгельса, д. 10.

Автореферат разослан « 6 » сентября 2013 г.

Ученый секретарь

совета Д 212.063.06

e-mail: Egorova-D6@yandex.ru

Егорова Елена Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Кобаламины (СЫ, витамин В12) являются одной из наиболее распространенных в природе групп металлсодержащих кофакторов. Перенос метальной группы, изомеризация углеродного скелета, удаление ами-но- и гидроксогрупп, дегалогенирование органических субстратов и некоторые другие химические превращения осуществляются в природе при участии коба-ламинсодержащих ферментов. Широкий спектр перечисленных реакций обусловлен уникальным набором свойств каждой из трех форм (Co(III), Co(II) или Со(1)) данного комплекса кобальта с коррином: способностью кобаламина(Ш) вступать в реакции замещения лигандов и образовывать ковалентную Со-С связь, высоким сродством Со(Н)-формы к свободным радикалам и сверхвысокой нуклеофильностью Со(1)-комплекса ("супернуклеофильностью"). Показано, что Cbl(II) эффективно взаимодействует с супероксидом, оксидами азота (II) и (IV), пероксинитритом, а СЫ(1) - с пероксинитритом, нитритом, нитратом. Таким образом, кобаламин можно рассматривать как эффективное средство борьбы с оксидативным и нитрозативным стрессом.

Большое число недавних публикаций посвящено производному кобала-мина, не содержащему диметилбензимидазольный нуклеотид, — кобинамиду (Cbi). Отмечено, что эффективность кобинамида как антидота цианида выше, чем у всех других антидотов - гидроксокобаламина, тиосульфата и нитрита. Сравнительное исследование кинетики реакций с участием кобаламина и кобинамида дает возможность определить влияние диметилбензимидазола на реакционную способность корриновых комплексов кобальта. В связи с вышеизложенным определена цель исследования.

Цель работы: установление механизмов реакций циано-, гидроксокоба-ламинов и дигидроксокобинамида с серосодержащими восстановителями и моносахаридами; Со(Ш) и Со(Н)-форм кобаламина и кобинамида с тиоцианатом; тиосульфата, сульфита и дитионита с Со(1)-формами кобаламина и кобинамида; установление влияния аксиальных лигандов на кинетические характеристики указанных реакций.

Научная новизна. Впервые определены кинетические параметры реакций циано- и гидроксокобаламинов, а также дигидроксокобинамида с гидро-ксиметансульфинатом натрия (ГМС), дитионитом, сульфоксилатом и моносахаридами. Установлено, что при использовании гидроксиметансульфината в щелочной среде происходит образование супервосстановленных форм кобаламина и кобинамида, а при использовании глюкозы и фруктозы — образование супервосстановленного кобинамида. Показано, что скоростьопределяющей стадией реакции цианокобаламина с восстановителями является стадия отщепления диметилбензимидазола. Изучено взаимодействие Со(П1) и Со(П)-форм кобаламина и кобинамида с тиоцианатом. Впервые показана возможность образования шестикоординационного тиоцианатного комплекса Со(П)-кобаламина. Впервые установлено, что супервосстановленные кобаламин и кобинамид способны эффективно восстанавливать дитионит, тиосульфат и сульфит. Изучена

кинетика реакций с Со(1) комплексов с тиосульфатом, сульфитом и дитиони-том, определена стехиометрия реакций, предложены схемы процессов.

Защищаемые научные положения:

- Результаты исследования кинетики реакций циано- и гидроксокобаламинов, дигидроксокобинамида с серосодержащими восстановителями и моносахаридами.

- Механизмы образования Со(П) и Со(1)-форм кобаламинов и кобинамида.

- Механизмы реакций образования тиоцианатных комплексов Co(III) и Со(11)-форм кобаламина и кобинамида.

- Результаты исследования кинетики реакций супервосстановленных форм кобаламина и кобинамида с тиосульфатом, сульфитом и дитионитом.

Практическая ценность. Предложены способы получения кобаламина(1) и кобинамида(1) в сильнощелочной среде с использованием гид-роксиметансульфината натрия и кобинамида(1) — с использованием глюкозы и фруктозы при тех же условиях. Показано, что тиоцианат замедляет связывание цианида кобаламином(Ш). В отличие от кобаламина, эффективность связывающего действия кобинамида практически не зависит от присутствия тиоциа-ната.

Работа выполнена в соответствии с "Основными направлениями научных исследований Ивановского государственного химико-технологического университета по теме "Термодинамика, строение растворов и кинетика жидко-фазных реакций", а также в соответствии с научной программой гранта РФФИ 11-03-00132-а "Реакционная способность восстановленных форм тетрапир-рольных комплексов кобальта" и гранта Президента РФ МК-1145.2012 "Взаимодействие кобаламина и кобинамида с токсичными ионами".

Вклад автора. Экспериментальные исследования, разработка и подбор оптимальных условий проведения эксперимента проведены лично автором. Общее планирование работы, обработка и обсуждение результатов выполнены под руководством д.х.н., профессора Макарова C.B.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях:

XXV Международная Чугаевская конференция по координационной химии (Суздаль, 2011); XI Международная конференция по физической и координационной химии порфиринов и их аналогов ICPC-11 (Одесса, Украина, 2011); Международная молодежная научная школа "Химия порфиринов и родственных соединений" в рамках фестиваля науки (Иваново, 2012); Debrecen Colloquium on Inorganic Reaction Mechanisms (Debrecen, Hungary, 2013).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 5 статьях в журналах Перечня ВАК и 5 тезисах докладов, опубликованных в трудах научных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 140 страницах, содержит 4 таблицы, 77 рисунков и состоит из введения, двух глав, выводов, библиографического списка, включающего 168 ссылок на цитируемые литературные источники.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 представляет собой обзор литературы. В ней приведена общая характеристика кобаламинов, кобинамида, кобаламинсодержащих ферментов, обосновывается выбор субстратов. Подробно рассмотрены свойства, реакционная способность кобаламинов и кобинамида.

В параграфе 2.1 Главы 2 приведены характеристики использованных в работе реактивов и приборов, методики спектрофотометрических и ЭПР экспериментов и математической обработки данных, расчетов с использованием метода БЕГ. В параграфе 2.2.1 рассмотрены результаты исследования реакций восстановления циано- и гидроксокобаламина ("КС- и ~НО-СЫ(Ш)), дигидрок-сокобинамида ((~НО)2СЫ(Ш)) серосодержащими восстановителями (дитиони-том (82042~), гидроксиметансульфинатом натрия (НОСНгЗСЬКа), сульфоксила-том (8022-)), а также моносахаридами (глюкозой и фруктозой).

Установлено, что взаимодействие цианокоба-ламина с дитионитом приводит к образованию комплекса СЫ(П)-802", (Рис. 1, спектр 4). Кинетические кривые реакции описываются уравнением первого порядка. Скорость процесса в щелочной среде не зависит от рН. Показано, что зависимость наблюдаемой константы скорости (к„абЛ.) от концентрации восстановителя нелинейна и достигает плато в области высоких концентраций дитиони-та (> 0.8 моль/л). Значение константы скорости при высоких концентрациях дитионита (кнабл. = 3 • 10-2 1/с, 25°С) близко к величине константы скорости диссоциации 5,6-диметилбензимидазола (ДМБИ) (4.2-10-2 1/с, 25°С), определенной ранее при изучении реакции образования дициано-комплекса.

Показано, что реакция цианокобаламина с ГМС в силыющелочной среде состоит из двух последовательных стадий: восстановления ТЧС-СЫ(Ш) до " 028-СЬ1(П) и более медленного восстановления ~028-СЫ(П) до СЫ(1) (Рис. 1, спектр 5). Как и в случае восстановления ТЧС-СЫ(Ш) дитионитом, порядок по комплексу равен единице. Зависимость кнабл от [ГМС] для первой стадии нелинейна, константа скорости на плато составляет 3-10-2 1/с. Активационные параметры процесса (АН" = 103 ± 6 кДж/моль, ДБ* = 82 ± 6 Дж/(моль К)) близки к таковым для реакции цианокобаламина с цианидом (АН* = 105 ± 2 кДж/моль,

Рис. 1. ЭСП различных форм СЫ: 1 - ~НО-СЫ(Ш); 2 - ТЧС-СЫ(Ш); 3 - СЫ(П); 4 - СЫ(П)-БОг"; 5 - СЫ(1). [СЫ] = 5-Ю"5 моль/л, рН 13, 25°С.

AS* = 81 ± 6 Дж/(моль К.)). Приведенные результаты говорят о том, что скоро-стьопределяющим этапом в процессе восстановления цианокобаламина дитио-нитом и гидроксиметансульфинатом натрия является отщепление ДМБИ от иона кобальта.

Зависимость наблюдаемой константы скорости от рН в данном случае описывается уравнением S-образной кривой (Рис. 2). Ее обработка позволяет определить значение рКа = 9.40 ± 0.01 при 25°С, I = 1 моль/л. Установлено, что добавки формальдегида не влияют на скорость восстановления гидроксиметансульфинатом. Следовательно, можно полагать, что маршрут с участием продукта распада ГМС - суль-фоксилата не оказывает влияния на скорость процесса (известно, что сульфоксилат с высокой скоростью реагирует с формальдегидом). Поскольку реакционная способность цианокобаламина в щелочной среде не зависит от рН, можно сделать вывод о том, что указанное значение рК соответствует депрото-нированию гидроксиметансульфиновой кислоты. Близкое значение рК было получено при исследовании реакции гидроксокобаламина с ГМС (см. ниже).

Механизм восстановления цианокобаламина гидроксиметансульфинатом представлен на Схеме 1 (восстановление данного комплекса дитионитом имеет аналогичные стадии).

Продуктами первой стадии восстановления гидроксокобаламина и ди-гидроксокобинамида гидроксиметансульфинатом являются комплексы Со(И)-S02~. Показано, что восстановление HO-Cbl(III) и ("HO)Cbi(III) гидроксиметансульфинатом определяется кислотно-основными свойствами комплексов, то есть скорость возрастает при увеличении концентрации в системе аквакобала-мина и аквагидроксокобинамида. Зависимости скорости от [ГМС] в обоих случаях линейны и проходят через начало координат. Пересчет рН-зависимости на долю активной формы комплекса в растворе приводит к ее преобразованию к S-образному виду. Обработка последней позволяет определить рКа = 9.15 ± 0.03 (25°С). На основании экспериментальных данных может быть предложена следующая схема восстановления гидроксокомплексов (реакции 1-3; обозначения "base-on" и "base-off' относятся к комплексам, имеющим и не имеющим фрагмент ДМБИ, соответственно).

рн

Рис. 2. Зависимость наблюдаемой константы скорости реакции ТЧС-СЫ(Ш) с ГМС от величины рН раствора. [ТЧС-СЬ1(Ш)]0 = 5-Ю"5 моль/л, [ГМС] = 1 моль/л, 25°С.

CN'

hoch2so2h = hoch2so2- +

+H+

CN" CN

l н]0 a 6- I-N

N

HOCH2S'

о

+ HOCH2SO2 + CN"

сн2о + S02" + H+

+ so2- с Co"

I-N I-N

Схема 1. Механизм восстановления цианокобаламина гидроксиметан-сульфинатом натрия.

-HO-Cbl(III)base.on ь Н20-СЬ](Ш)Ьаж.оп. (1)

H20-Cbl(III)base.on + H0CH2S02(Hh) «-+ HOCH2SO2 (Н4)—Cbl(III)base-on + Н20. (2) H0CH2S024HVCbl(III)base.0n Cbl(II)base-on + Red" (+ Н+). (3)

Необходимо отметить, что в сильнощелочной среде в случае реакции с участием кобаламина(Ш) возрастает вклад восстановления сульфоксилатом (добавки формальдегида замедляют реакцию).

Восстановление СЫ(И) и Cbi(II) гидроксиметансульфинатом протекает в сильнощелочной среде. Порядки реакции по металлокомплексу при избытке восстановителя равны единице. Зависимость наблюдаемой константы скорости от концентрации ГМС нелинейна, однако линеаризуется в обратных координатах (1/кна5л от 1/[ГМС]). Такая зависимость характерна для реакции, протекающей через быстрое обратимое образование комплекса и его последующий распад. Наблюдаемая константа скорости реакции линейно возрастает с увеличением [ОН-], что говорит об участии в процессе гидроксид-иона. Следует также отметить, что добавки формальдегида не влияют на скорость процесса при 25°С. Таким образом, можно полагать, что процесс образования Cbx(I) (х = 1, i) включает реакции 4-5:

Cbx(II)-S02~ + H0CH2SO2~ H0CH2S02Cbx(II) + ОН~ -

«-» -H0CH2S02Cbx(II) + S02". (KcbxdD.T Mc) (4) • Cbx(I) + продукты окисления ГМС. (кСьх(н),гмс) (5)

Константы ксьх(п),гмс и Ксьхоо.гмс, рассчитанные с использованием уравнений (6,7), приведены в таблице 1.

набл.

кшскгмс[шд[он-]

1 + Кшс[ГМС]

. (6) кСЬх тс -

к1

k-'[so2~]

г:. (7)

Таблица 1

Кинетические характеристики реакции восстановления Cbx(II) (х = 1, i) при

25 °С

Исходный комплекс Ксьхплгмс, л/моль ксьхап.гмс Ю2 л/(моль с)

Cbl(II) (получен из "HO-Cbl(III)) Cbl(II) (получен из ТЧС-СЫ(Ш)) 12.71 ±0.91 15.22 ± 1.43 1.02 ±0.04 1.47 ±0.08

Cbi(II) 28.60 ± 0.94 1.98 ±0.03

В работе также изучено восстановление СЫ(П) и Cbi(II) сульфоксилатом. Ранее показано, что продуктом реакции сульфоксилата и Cbx(III) является комплекс Co(II)-S02~. Восстановление Co(II) кобала-мина и кобинамида сульфоксилатом протекает только в сильнощелочной среде. Зависимость от рН описывается уравнением S-образной кривой (рКа = 13.47 ± 0.07 при 25°С соответствует депротонирова-нию аниона S02H~). Это позволяет сделать вывод, что восстановителем Со(П)-форм металлокомлексов выступает анион S022". Зависимости наблюдаемых констант скорости от концентрации сульфоксилата линейны, что свидетельствует о первом порядке реакции по восстановителю. Установлено, что предварительное получение Со(П)-комплексов с использованием аскорбата (для исключения накопления в системе анион-радикала SO2) приводит к увеличению скорости процесса. Последнее подтверждает необходимость отщепления анион-радикала от Со(П)-комплексов, для осуществления переноса электрона от S022-.

Установлено, что добавление дитионита уменьшает степень превращения Со(П) в Со(1), а при [S2042 ] > 0.05 М Со(1) не образуется (Рис. 3). В присутствии в системе дитионита концентрационная зависимость реакции восстановления Со(П) сульфоксилатом отсекает на оси ординат положительный отрезок. Данная ситуация характерна для наличия в системе обратной стадии - окисления образующегося Со(1) дитионитом. Действительно, введение дитионита к Со(1)-комплексам приводит к его окислению до Co(II)-S02~. Механизм взаимодействия Cbl(II) и Cbi(II) с сульфоксилатом представлен схемой 2.

Рис. 3. Кинетические кривые восстановления СЫ(П)-В02~ сульфоксилатом в присутствии различных концентраций Б2042~: 1.7 (1), 3.3 (2), 5 (3) ммоль/л. [СЫ] = 5-10"5 моль/л, [БО/-] = МО"3 моль/л, рН 13, 25°С.

Таблица 2

Константы скорости для реакции восстановления кобаламина(П) и _кобинамида(П) сульфоксилатом при 25°С, рН 13._

Исходное состояние Константа скорости (л/(моль-с)) для комплекса

Кобаламин Кобинамид

Со(1ГН502" 2.83 ±0.11 2.18 ±0.07

Со(П) 5.92 ±0.08 3.30 ±0.11

802" , ЯОг2"

{—- +802";-8022" — ---

'

Х-ДМБИ (СЫ); Н20(СЫ)

Схема 2. Механизм восстановления кобаламина(П) и кобинамида(П) сульфоксилатом

Взаимодействие гидроксокобаламина с глюкозой (ИсН) приводит к образованию СЫ(И). Показано, что кинетика процесса определяется кислотно-основными свойствами двух соединений — гидроксокобаламина и глюкозы. Установлено, что механизм реакции включает в себя протонирование гидроксид-иона в ТЮ-СЫ(Ш) (реакция 1), ионизацию глюкозы (рК^оь) = 12.28 при 25°С, реакция 8) и взаимодействие акваформы комплекса с анионом глюкозы (реакции 9,10). Значения констант составляют: Ксыаго.стс = (15.13 ± 2.13) л/моль, кськтшс = (41.60 ± 4.87) 1/с.

ИсН«-+ С1с" + Н+. (8)

Н20-СЫ(1Н)Ь^П + С 1с" <-> -С1с-СЬ1(Ш)ьа,е-о„ + Н20. (Ксьцлаан) (9) -С1с-СЫ(1П)ьазе-оп СЬ1(11)Ьаж_оп + ас. (кСЬ1аИ)>0|с) (10)

Установлено, что взаимодействие кобинамида с моносахаридами включает в себя две последовательные стадии: восстановления Со(ПГ) до Со(11) и Со(Н) до Со(1). Оба этапа протекают в щелочной среде. Первая стадия протекает с более высокой скоростью, чем восстановление гидроксокобаламина, что обусловлено более высокой концентрацией активной формы кобинамида (аква-гидроксокобинамида) при аналогичных условиях.

Концентрационная зависимость для стадии перехода СЫ(П) в СЫ(1) нелинейна, однако линеаризуется в обратных координатах. Последнее может быть связано с протеканием процесса восстановления через быструю стадию образования промежуточного комплекса Со(П) с моносахаридом. Для данного процесса наблюдался второй порядок реакции по иону ОН", что говорит об участии двух данных ионов в процессе. Вероятно, первый ион участвует в депро-тонировании молекулы моносахарида (реакция 8), а второй взаимодействует с

комплексом аниона моносахарида с кобинамидом(П) (реакции 11,12). Рассчитаны константы скорости процессов с участием глюкозы и фруктозы (Таблица 3). При использовании фруктозы наблюдается более высокая скорость реакции, что было отмечено ранее для реакции данных восстановителей с тетрасульфоф-талоцианином кобальта. Это объясняется разным соотношением концентраций открытой и циклических форм моносахаридов в растворе (в случае фруктозы концентрация открытой формы в растворе выше, чем в случае глюкозы).

н2о-сы(П) + ас" «- С1С-СЫ(П) + н2о. (кСЬ|(1Г№1с) (11) "Ч31с-СЫ(И) + ОН"

СЫ(1) + продукты окисления моносахаридов, (ксырастс) 0 2)

Таблица 3

Кинетические характеристики стадии восстановления СЫ(П) —» СЫ(Г) моноса-_харидами при 25°С._

Восстановитель Ксыап, л/моль ксыап. л/(моль-с)

Глюкоза 29.29 ±3.67 (1.80 ± 0.17)-10~2

Фруктоза 60.30 ±5.03 (6.83 ± 0.43)-10~2

Сравнение кинетики восстановления Со(П) комплексов указывает зависимость механизмов восстановления Со(П)-форм кобаламина и кобинамида от природы восстановителя. Так, восстановление СЫ(П) и СЫ(П) сульфоксилатом и гидроксиметансульфинатом натрия (сильными электронодонорами) протекает с сопоставимыми скоростями, восстановление же данных металлокомплек-сов моносахаридами (более слабыми электронодонорами) проходит иначе. Объяснением данному явлению может служить различие в структуре образующихся в ходе взаимодействия комплексов между восстановителем и ионом кобальта, а именно образованием шестикоординационных комплексов при восстановлении сульфоксилатом и ГМС и пятикоординационных при восстановлении моносахаридами. Важно также отметить, что образование Со(1)-корриноидов (в электронной конфигурации основного состояния которых преобладает «^-конфигурация) протекает намного медленнее, чем образование Со(П)-анион-радикалов (фталоцианинов, порфиразинов и др.).

В параграфе 2.2.2 рассмотрены реакции Со(Ш) и Со(Н)-форм кобаламина и кобинамида с тиоцианатом. В таблице 4 приведены рассчитанные константы равновесия для образования различных комплексов СЫ(Ш). Из литературы известна константа связывания тиоцианата аквакобаламином: Ксысш; = 1.4-103 л/моль, 1 = 3 моль/л, 25°С. На основе полученных в работе и литературных данных была предложена следующая последовательность, отражающая влияние лигандов на прочность связывания тиоцианата: С>Г < БОГ (в СЫ(Ш)(8С>Г)2) < ОН" < ДМБИ < Н20. Ранее в литературе был предложен ряд лигандов, составленный на основе степени влияния р-аксиального лиганда на длину связи Со-Мах (ДМБИ). В этой последовательности тиоцианат расположен близко к молекуле воды. Однако данные настоящей работы показывают, что тиоцианат имеет транс-влияние, близкое к влиянию гидроксид-иона.

Таблица 4

Характеристики равновесий в системе тиоцианат - СЫ(Ш)_

Исходный комплекс Стехиометрия по БСЫ" Константа равновесия, л/моль (1=1 моль/л, 25°С)

СЫ(Ш)(Н20)2 1.10 ±0.11 (1.06 ±0.16)-104

СЫ(1И)(8С1Ч1(Н20) 0.99 ± 0.04 (1.34 ± 0.05)-102

СЫ(ПГ)(0Н-)(Н20) 1.00 ±0.03 (6.16±0.13)-102

СЫ(И1)(С^)(Н20) 0.99 ± 0.04 (1.68 ± 0.13)10

Известно, что аквако-баламин и кобинамид являются эффективными антидотами цианида. Поскольку отравление цианидом приводит к увеличению концентрации тиоцианата (за счет активности фермента-роданазы), высокие концентрации последнего могут препятствовать связыванию цианида кобала-мином и кобинамидом, приводя к уменьшению их эффективности. Хотя кобинамид и кобаламин обладают значительно более высокой связывающей способностью по отношению к цианиду, чем к тиоцианату (К1 > 1014 л/моль, К2 = 108 л/моль для СЫ(Ш)(СМ~)2; К = 1012 л/моль для СЫ(Ш)(СЫ )), что в итоге приведет к переходу всего количества комплексов в циано-формы, необходимо определить влияние тиоцианата на скорость данного перехода. Показано, что физиологические концентрации БСЫ' (3-6 ммоль/л) обладают значительным влиянием на скорость связывания цианида кобаламином(Ш), но не кобинамидом(Ш), который преобразуется в дицианоформу в течение нескольких секунд при рН 7.2, 25°С, [СЫ~] = 5-10 моль/л. При более высоких концентрациях эффект тиоцианата более выражен, что не наблюдается в случае кобинамида.

Показано, что взаимодействие одноэлектронно восстановленных форм кобинамида и кобаламина с ЭСЫ приводит к образованию монотиоцианатных комплексов. Константы равновесия для процессов образования СЫ(И)-8СЫ~ и СЬ1(Н)-8С>Г составляют (23.8 ± 1.1) и (3.7 ± 0.3) л/моль (1=1 моль/л, 25 °С), соответственно. Важно отметить, что величина константы образования СЫ(П)-

Рис. 4. Кинетические кривые реакции аквако-баламина с цианидом в присутствии [БОГ]: 0 (1), 3-10"3 (2) и МО"2 (3) моль/л. [СЫ(Ш)] = 7.5-10"5 моль/л, [СГчГ ] = 5-Ю"4 моль/л, рН 7.2, 25°С, 1 = 0.1 моль/л.

БСЬГ не согласуется со значением для процесса замещения ДМБИ на Со(П)-центре, т.е. тиоцианат взаимодействует с верхней позицией кобаламина(П). С использованием электронной спектроскопии поглощения и ЭПР спектроскопии показано присутствие в комплексе координированной молекулы ДМБИ, то есть данный комплекс является первым примером шестикоординационных комплексов кобаламина(И) с анионным редокс-инертным лигандом.

В рамках теории функционала плотности (БРТ; функционалы ВР86, ВЗЬУР) исследована изомерия связи в комплексах Со(Ш) и Со(И) с тиоциана-том. Показано, что образование 1Я-связанных изомеров во всех случаях энергетически более выгодно. Однако разница энергий между 14- и Б-связыванием тиоцианата незначительна, что говорит о существования двух видов комплексов в растворе. Расчеты подтверждают возможность образования гексакоорди-национных комплексов кобаламина(П) с БСИ" при условии, если один из аксиальных лигандов (ЯСЬГ или ДМБИ) в них является слабосвязанным.

В параграфе 2.2.3 рассматривается взаимодействие кобаламина и коби-намида с тиосульфатом. Показано, что аквагидроксокобинамид связывает тиосульфат более эффективно, чем аквакобаламин: К = (5.37 ± 0.35)-104 л/моль (СЫ(Ш), рН 8.0, 25°С, I = 1 моль/л), 5.25-103 л/моль (СЫ(Ш), 25°С, I = 2.2 моль/л). Понижение степени окисления иона кобальта в кобинамиде приводит к сильному уменьшению константы связывания тиосульфата: К = (2.68 ± 0.14) л/моль (рН 8.4, 25°С, I = 1.5 моль/л).

В работе исследовано восстановление тиосульфата, сульфита и дитио-нита Со(1)-формами комплексов. Установлено, что добавление тиосульфата к растворам Со(1)-форм приводит к их окислению до Со(Н). Порядки по металло-комплексу и тиосульфату равны единице. Данная реакция не протекает в сильнощелочной среде, однако при уменьшении рН наблюдался значительный рост скорости реакции, т.е. активной формой тиосульфата является монопротониро-ванный анион НБгОз" (реакция 13). Титрование СЫ(1) тиосульфатом в нейтральной среде позволило установить стехиометрию процесса: для восстановления одной молекулы тиосульфата требуется три молекулы СЫ(1), то есть происходит трехэлектронное восстановление субстрата. В ходе реакции два электрона расходуются на восстановление связи Б-Э (реакции 14,15), что приводит к образованию равных количеств сульфита и сульфида (данные продукты образуются также при энзиматическом и электрохимическом восстановлении тиосульфата), а третий электрон - на восстановление образующегося сульфита до БОг":

ЗгОз^+Н^НЭгОз". (13)

НБзОз" + Со1+ НБ" (или НБОз-) + 503" (или + Со2+. (кН5А_) (14) БОз'" (Б*") + Со1+ Б2" (БОз2! + Со2+. (15)

Определены значения кн30- для реакций с участием СЫ(1) и СЫ(1): (3.84 ± 0.10)Т07 и (3.07 ± 0.07) 107 л/(моль-с) (25°С), соответственно.

Установлено, что добавление сульфита к растворам Со(1)-форм кобала-мина и кобинамида приводит их к окислению до комплексов Со(П)-Б02~ (Рис. 5). Порядок реакции по металлокомплексам в данном случае равен единице во всем исследованном диапазоне рН. Скорость реакции, как и в случае реакции с тиосульфатом, значительно возрастает при уменьшении рН среды, а в сильнощелочной среде реакция не протекает.

Наблюдается дробный порядок по окислителю (п = 1.31 ± 0.02, рН 9.8, 25°С), величина которого не зависит от рН и одинакова для коба-ламина и кобинамида. Данное наблюдение является следствием наличия в системе нескольких скоростьопре-деляющих стадий. Очевидно, первый порядок по окислителю характерен для взаимодействия Со(1) с бисульфитом (НБОз-) и гидратирован-ным диоксидом серы (¡302), а второй порядок - для взаимодействия с пиросульфитом (БгОз2-) (реакции 16-18). Участие пиросульфита подтверждается зависимостью порядка реакции по сульфиту от температуры. Так, порядок по сульфиту уменьшается до единицы при повышении температуры, и возрастает при ее уменьшении, что объясняется эндотермической реакцией, сопровождающейся разрывом связи Б-Б в ггиросульфите. Определена стехиометрия реакции: [Со(1)] : [Б(1У)] = 1:1 ([8(1 V)] - концентрация всех форм сульфита в растворе). Для предложенной схемы реакций рассчитаны константы скорости для маршрутов: к50 н_= (50.1 ± 3.0), к50 = (1.26 ± 0.03)-108, к5 оГ= (4.40 ± 0.39)-106 л/(моль-с)

(СЫ(1), 25°С).

Б02 + Со1+ ->■ Со2+-802\ (к50;) (16)

БОзН + Со1+ Со2+—БОг" + ОН". (к50„.) (17)

82052" + Со1+ Со2+-Б02" + БОз2". (к8 0,_) (18)

Кинетика реакций СЫ(Г) и СЫ(1) с дитионитом была изучена при рН 10, где минимален вклад в процесс содержащегося в коммерческом продукте сульфита и образующегося сульфоксилата. Продуктом реакции является комплекс Со(И)-802\ Показано, что порядок реакции по металлокомплексу равен единице. Зависимость наблюдаемых констант скорости от концентрации дитионита

X, нм

Рис. 5. Спектральные изменения, наблюдаемые в ходе окисления СЫ(1) сульфитом. [СЫ] = 610"5 моль/л, [БОз2-] = 1-Ю"2 моль/л, рН 9.4, 25°С.

близка к линейной, однако на оси ординат имеются положительные отрезки, появление которых связано с протеканием реакции по двум маршрутам, окислителями в которых выступают 82042~ и 502 (реакции 19,20). Установлено, что СЬ1(1) и 52042~ реагируют в соотношении 1 : 0.9, т.е. основным является маршрут с участием дитионита (реакция 19), а не ион-радикала Я02 . Константы и к^ для реакции с участием СЫ(1) составляют (4.90 ± 0.45) и (1.35 ±

0.06)'104 л/(моль-с) (25°С, рН 10). Важно подчеркнуть, что реакция между ди-тионитом и супервосстановленным кобаламином является единственным известным примером восстановления данного соединения природным соединением.

82042" + Со1+ Со2+ + 82043" Со2+-802" + 8022". (19)

802~ + Со1+ Со2+ + 8022". (к' ) (20)

вьшоды

1 Определены константы скорости реакций циано- и гидроксокобаламинов и дигидроксокобинамида с сульфоксилатом, гидроксиметансульфинатом натрия, а также моносахаридами. Установлено, что продуктами реакций с ГМС и сульфоксилатом в щелочной среде являются СЫ(1) и Cbi(I); глюкоза и фруктоза способны восстанавливать только Cbi(II). Показано, что скоро-стьопределяющей стадией процесса восстановления цианокобаламина ди-тионитом и ГМС является стадия отщепления диметилбензимидазола.

2 Впервые определено значение рК ионизации гидроксиметансульфиновой кислоты (9.40 ± 0.01; 25°С; I = 1 моль/л).

3 Изучено взаимодействие Со(Ш) и Со(П)-форм кобаламина и кобинамида с тиоцианатом, определены кинетические параметры реакций. Показано, что тиоцианат существенно замедляет связывание цианида кобаламином(Ш), однако не влияет на реакцию кобинамида (III) с цианидом. Методами электронной спектроскопии и электронного парамагнитного резонанса доказано образование гексакоординационного комплекса кобаламина(И) с тиоцианатом. Методом DFT показано, что при взаимодействии тиоцианата с Co(III) и Со(И)-формами кобаламина и кобинамида возможно образование тиоциа-натных и изотиоцианатных комплексов.

4 Впервые показано, что Со(1)-формы кобаламина и кобинамида способны восстанавливать тиосульфат, сульфит и дитионит, определены кинетические параметры процессов. Показано, что в первом случае конечными продуктами восстановления являются H2S и S02~, во втором - S02~, а в третьем — S022-. Определены кинетические параметры процесса.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1 Взаимодействие гидроксокобаламина с глюкозой/ Д.С. Сальников, И.А. Де-ревеньков, С.В. Макаров, Е.Н. Артюшина // Изв. вузов. Химия и хим. технология. - 2011. - Т. 54. - С. 43-46.

2 Kinetics of reduction of cobalamin by sulfoxylate in aqueous solutions/ D.S. Salnikov, I.A. Dereven'kov, S.V. Makarov, E.S. Ageeva, A. Lupan, M. Surducan, R. Silaghi-Dumitrescu // Rev. Roum. Chim. - 2012. - V. 57. - P. 353-359.

3 Reactions of Cobinamide with Glucose and Fructose/ I.A. Dereven'kov, D.S. Salnikov, N.I. Shpagilev, S.V. Makarov, E.N. Tarakanova // Macroheterocycles. -2012.-V. 5.-P. 260-265.

4 Взаимодействие цианокобаламина с серосодержащими восстановителями в водных растворах/ Д.С. Сальников, И.А. Деревеньков, Е.Н. Артюшина, С.В. Макаров // Журн. физ. химии. - 2013. - Т. 87. - С. 52-56.

5 Comparative study of reaction of cobalamin and cobinamide with thiocyanate/ I.A. Dereven'kov, D.S. Salnikov, S.V. Makarov, M. Surducan, R. Silaghi-Dumitrescu, G.R. Boss // J. Inorg. Biochem. - 2013. - V. 125. - P. 32-39.

6 Деревеньков, И.А. Получение сверхвосстановленных кобаламина и кобина-мида с использованием сульфоксилата/ И.А. Деревеньков, Д.С. Сальников, С.В. Макаров // Сб.: Труды XXV Международной Чугаевской конференции по координационной химии. - Суздаль. - 2011. - С. 380.

7 Влияние типа лиганда на кинетику и механизм восстановления кобаламина и кобинамида гидроксиметансульфинатом натрия и сульфоксилатом/ Д.С. Сальников, И.А. Деревеньков, Е.Н. Артюшина, Е.С. Агеева // Сб.: Труды XI Международной конференции по физической и координационной химии порфиринов и их аналогов. - Одесса. - 2011. - С. 62.

8 Деревеньков, И.А. Сравнительное исследование процессов восстановления кобаламина и кобинамида моносахаридами/ И.А. Деревеньков, Н.И. Шпаги-лев, Д.С. Сальников // Сб.: трудов Международной молодежной научной школы «Химия порфиринов и родственных соединений». - Иваново. - 2012. -С. 36.

9 Makarov, S.V. Kinetics and Mechanism of Reactions of Cobalamins and Cobinamide with • Inorganic Sulfur Compounds/ S.V. Makarov, D.S. Salnikov, I.A. Dereven'kov // Abstracts of Debrecen Colloquium on Inorganic Reactions Mechanisms. - Debrecen, Hungary. - 2013. - C. 34.

10 Dereven'kov, I.A. Kinetics of Reactions between Thiosulfate, Sulfite or Dithionite and Super-Reduced Cobalamin/ I.A. Dereven'kov, S.V. Makarov, D.S. Salnikov // Abstracts of Debrecen Colloquium on Inorganic Reactions Mechanisms. - Debrecen, Hungary. - 2013. -C. 45.

Подписано в печать 02.09.2013. Формат 60x84 1/16. Бумага писчая. Усл.печ.л. 0,93. Уч.-изд.л. 1,03. Тираж 80 экз. Заказ 3307

ФГБОУ ВПО Ивановский государственный химико-технологический университет

Отпечатано на полиграфическом оборудовании кафедры экономики и финансов ФГБОУ ВПО «ИГХТУ» 153000, г. Иваново, пр. Ф. Энгельса, 7

Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Ивановский государственный химико-технологический

университет»

Взаимодействие кобаламинов и кобииамида с серосодержащими восстановителями, тиоцианатом и моносахаридами

На поавах рукописи

04201361726

Деревеньков Илья Александрович

02.00.04 - физическая химия

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель -доктор химических наук, профессор Макаров С. В.

Иваново — 2013 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................................7

1.1 Свойства кобаламинов и кобинамида.....................................................................7

1.1.1 Общая характеристика кобаламинов, кобинамида и кобаламинсодержащих ферментов.........................................................................................................................7

1.1.2 Свойства и строение кобаламина(Ш), кобинамида(Ш) и их комплексов......14

1.1.3 Свойства и строение кобаламина(П), кобинамида(П) и их комплексов.........18

1.1.4 Строение и реакционная способность кобаламина(Г).......................................21

1.2 Постановка целей работы. Выбор субстратов......................................................25

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...........29

2.1.1 Характеристика объектов и методов исследования..........................................29

2.1.2 Расчет констант равновесия................................................................................30

2.1.3 Расчеты с использованием метода ББТ.............................................................31

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..................................................................33

2.2.1 Взаимодействие Со(Ш) и Со(П)-форм кобаламина и кобинамида с восстановителями..........................................................................................................33

2.2.1.1 Взаимодействие цианокобаламина с дитионитом и гидроксиметансульфинатом.........................................................................................33

2.2.1.2 Взаимодействие гидроксокобаламина с ГМС................................................44

2.2.1.3 Взаимодействие кобинамида с ГМС...............................................................50

2.2.1.5 Взаимодействие гидроксокобаламина с глюкозой........................................63

2.2.1.6 Взаимодействие аквагидроксокобинамида(Ш) и кобинамида(П) с глюкозой и фруктозой....................................................................................................................68

2.2.1.7 Сравнение механизмов восстановления форм кобаламина и кобинамида .77

2.2.2 Взаимодействие кобаламина и кобинамида с тиоцианатом............................79

2.2.2.1 Взаимодействие Со(Ш) кобаламина и кобинамида с тиоцианатом.............79

2.2.2.2 Взаимодействие Со(П) кобаламина и кобинамида с тиоцианатом..............86

2.2.3.3 ББТ расчеты.......................................................................................................93

2.2.3 Взаимодействие кобаламина и кобинамида с тиосульфатом..........................97

2.2.3.1 Взаимодействие Со(Ш) и Со(П)-форм кобинамида с тиосульфатом...........97

2.2.3.2 Взаимодействие Со(1) кобаламина и кобинамида с тиосульфатом и продуктами его восстановления.................................................................................100

2.2.3.2.1 Восстановление тиосульфата Со(1) кобаламином и кобинамидом.........100

2.2.3.2.2 Взаимодействие Со(1) кобаламина и кобинамида с сульфитом..............106

2.2.3.2.3 Взаимодействие Со(1) кобаламина и кобинамида с дитионитом............113

2.2.3.2.4 Сравнение реакционной способности кобаламина(Г) и других

высоковосстановленных тетрапиррольных комплексов кобальта.........................117

Список сокращений и условных обозначений.........................................................119

Список литературы......................................................................................................121

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Кобаламины (СЫ, витамин В12) являются одной из наиболее распространенных в природе групп металлсодержащих кофакторов. Перенос метальной группы, изомеризация углеродного скелета, удаление амино-и гидроксогрупп, дегалогенирование органических субстратов и некоторые другие химические превращения осуществляются в природе при участии кобаламинсодержащих ферментов [1]. Широкий спектр перечисленных реакций обусловлен уникальным набором свойств каждой из трех форм (Со(Ш), Со(П) или Со(1)) данного комплекса кобальта с коррином: способностью кобаламина(Ш) вступать в реакции замещения лигандов и образовывать ковалентную Со-С связь, высоким сродством Со(П)-формы к свободным радикалам и сверхвысокой нуклеофильностью Со(1)-комплекса ("супернуклеофильностью"). Показано, что СЫ(П) эффективно взаимодействует с супероксидом [2], оксидами азота (II) [3] и (IV), пероксинитритом [4], а СЫ(1) - с пероксинитритом [5], нитритом, нитратом [6]. Таким образом, кобаламин можно рассматривать как эффективное средство борьбы с оксидативным и нитрозативным стрессом [7].

Большое число недавних публикаций посвящено производному кобаламина, не содержащему диметилбензимидазольный нуклеотид, — кобинамиду (СЫ). Отмечено, что эффективность кобинамида как антидота цианида выше, чем у всех других антидотов - гидроксокобаламина, тиосульфата и нитрита [8]. Сравнительное исследование кинетики реакций с участием кобаламина и кобинамида дает возможность определить влияние диметилбензимидазола на реакционную способность корриновых комплексов кобальта. В связи с вышеизложенным определена цель исследования.

Цель работы: установление механизмов реакций циано-, гидроксокобаламинов и дигидроксокобинамида с серосодержащими восстановителями и моносахаридами; Со(Ш) и Со(П)-форм кобаламина и кобинамида с тиоцианатом; тиосульфата, сульфита и дитионита с Со(1)-формами

кобаламина и кобинамида; установление влияния аксиальных лигандов на кинетические характеристики указанных реакций.

Научная новизна. Впервые определены кинетические параметры реакций циано- и гидроксокобаламинов, а также дигидроксокобинамида с гидроксиметансульфинатом натрия (ГМС), дитионитом, сульфоксилатом и моносахаридами. Установлено, что при использовании гидроксиметансульфината в щелочной среде происходит образование супервосстановленных форм кобаламина и кобинамида, а при использовании глюкозы и фруктозы -образование супервосстановленного кобинамида. Показано, что скоростьопределяющей стадией реакции цианокобаламина с восстановителями является стадия отщепления диметилбензимидазола. Изучено взаимодействие Со(Ш) и Со(П)-форм кобаламина и кобинамида с тиоцианатом. Впервые показана возможность образования шестикоординационного тиоцианатного комплекса Со(П)-кобаламина. Впервые установлено, что супервосстановленные кобаламин и кобинамид способны эффективно восстанавливать дитионит, тиосульфат и сульфит. Изучена кинетика реакций с Со(1) комплексов с тиосульфатом, сульфитом и дитионитом, определена стехиометрия реакций, предложены схемы процессов.

Защищаемые научные положения:

- Результаты исследования кинетики реакций циано- и гидроксокобаламинов, дигидроксокобинамида с серосодержащими восстановителями и моносахаридами.

- Механизмы образования Со(П) и Со(1)-форм кобаламинов и кобинамида.

- Механизмы реакций образования тиоцианатных комплексов Со(Ш) и Со(П)-форм кобаламина и кобинамида.

- Результаты исследования кинетики реакций супервосстановленных форм кобаламина и кобинамида с тиосульфатом, сульфитом и дитионитом.

Практическая ценность. Предложены способы получения кобаламина(1) и кобинамида(1) в сильнощелочной среде с использованием гидроксиметансульфината натрия и кобинамида(1) - с использованием глюкозы и фруктозы при тех же условиях. Показано, что тиоцианат замедляет связывание

цианида кобаламином(Ш). В отличие от кобаламина, эффективность связывающего действия кобинамида практически не зависит от присутствия тиоцианата.

Работа выполнена в соответствии с "Основными направлениями научных исследований Ивановского государственного химико-технологического университета по теме "Термодинамика, строение растворов и кинетика жидкофазных реакций", а также в соответствии с научной программой гранта РФФИ 11-03-00132-а "Реакционная способность восстановленных форм тетрапиррольных комплексов кобальта" и гранта Президента РФ МК-1145.2012 "Взаимодействие кобаламина и кобинамида с токсичными ионами".

Вклад автора. Экспериментальные исследования, разработка и подбор оптимальных условий проведения эксперимента проведены лично автором. Общее планирование работы, обработка и обсуждение результатов выполнены под руководством д.х.н., профессора Макарова С.В.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях:

XXV Международная Чугаевская конференция по координационной химии (Суздаль, 2011); XI Международная конференция по физической и координационной химии порфиринов и их аналогов ICPC-11 (Одесса, Украина, 2011); Международная молодежная научная школа "Химия порфиринов и родственных соединений" в рамках фестиваля науки (Иваново, 2012); Debrecen Colloquium on Inorganic Reaction Mechanisms (Debrecen, Hungary, 2013).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 5 статьях в журналах перечня ВАК и 5 тезисах докладов, опубликованных в трудах научных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 140 страницах, содержит 4 таблицы, 77 рисунков и состоит из введения, двух глав, выводов, библиографического списка, включающего 168 ссылок на цитируемые литературные источники.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Свойства кобаламинов и кобинамида 1.1.1 Общая характеристика кобаламинов, кобинамида и кобаламинсодержащих ферментов

Химия витамина В12 (цианокобаламина) берет начало с момента его выделения в кристаллическом виде Смитом, Паркером, Фолкерсом и др. в 1948 г. Впоследствии его структура позднее была установлена методом рентгеноструктурного анализа группой Д. Ходжкин в 1956 г [9].

Кобаламины являются распространенными в природе кофакторами различных ферментных систем (Рис. 1) [1,13]. Они являются комплексами иона кобальта, способного принимать степени окисления +3, +2 и +1, с корриновым тетрапирролом (экваториальный лиганд), 5,6-диметилбензимидазольным нуклеотидом (нижний (а) аксиальный лиганд) и различными группами Я (верхний (Р) аксиальный лиганд).

N112

ЫН2

N112

но о \

Рис. 1. Структурная формула кобаламина

К наиболее важным биологическим формам кобаламинов относятся аквакобаламин (R = Н20), метилкобаламин (R = СН3"), аденозилкобаламин (R = Ado), сульфитокобаламин (R = SO3 "), нитритокобаламин (R = N02~), глутатионилкобаламин (R = GS"), нитроксилкобаламин (R = N0") [10,11]. Помимо вышеперечисленных форм, выделенных из тканей млекопитающих, витаминной активностью обладает цианокобаламин (R = CN"), не встречающийся в природе, однако нашедший широкое применение в медицине.

Необходимо подчеркнуть, что в археях и прокариотах кобаламины являются лишь одной из групп кофакторов-корриноидов. Последние, как правило, различаются природой группы, находящейся в нижней позиции комплекса (ДМБИ, 5'-метоксибензимидазол, аденин или п-крезол) [1].

Ферментативные реакции, катализируемые корриноид-зависимыми ферментами, можно разделить на несколько групп [12]:

- перенос метальной группы;

- процессы с участием аденозильного радикала;

- восстановительное дегалогенирование органических субстратов.

Единственным представителем первого класса ферментов, выделенным из клеток млекопитающих, является метионинсинтаза, осуществляющая перенос метальной группы с метилтетрагидрофолата на гомоцистеин [1,13]. Однако в археях и прокариотах список возможных доноров и акцепторов метальной группы более обширен (Рис. 2) [14-19].

сн3

ЯгН

Я2-Н

|+ Н4" -КГ

Я^СНз: метанол;

метиламины; метилтиолы; метилтетрагидрофолат; ароматические О-метильные эфиры.

ЯгСНз

к2-сп3

К2-СН3: гомоцистеин;

кофермент М;

№1+ в ацил-КоА-синтазе;

тетрагидрофолат.

Рис. 2. Каталитический цикл метилтрансфераз

Каталитический цикл переноса метальной группы включает в себя периодическое образование кобаламина(1) и метилкобаламина(Ш) [13]. Ферменты данного класса сильно подвержены окислительной инактивации (инактивация метионинсинтазы происходит приблизительно один раз в 2000 циклов [1]), что обусловлено, прежде всего, высокой реакционной способностью кобаламина(1). Инактивированный фермент, имеющий степень окисления иона кобальта в кобаламине +2, не способен принимать метальную группу от многих субстратов. Реактивация системы в данном случае возможна путем взаимодействия кобаламина(П) с аденозилметионином и редуктазой метионинсинтазы [13,20].

Класс аденозилкобаламинсодержащих ферментов катализирует многочисленные типы химических превращений [1,12]: перегруппировку углеродного скелета (метилмалонил-КоА-мутаза, глутаматмутаза, метиленглутаратмутаза, изобутирил-КоА-мутаза и т.д.), удаление амино- и гидроксогрупп (этаноламинаминолиаза, диолдегидратаза и т.д.), внутримолекулярное перемещение аминогруппы (лизин-5,6-аминомутаза, орнитин-4,5-аминомутаза), восстановление рибонуклеотидтрифосфата. В клетках млекопитающих из данного класса фермента обнаружена только метилмалонил-КоА-мутаза, осуществляющая изомеризацию токсичного метилмалонил-КоА в сукцинил-КоА [1].

Каталитический цикл данного класса ферментов включает в себя разрыв связи Со(Ш)-А£1о, приводящий к образованию Со(П) и высокореакционноспособного аденозильного радикала, и последующие превращения с участием последнего (Рис. 3). Роль кобаламина(П) в превращениях субстрата точно не установлена. Известно, что расстояние между субстратом и кобаламином(П) в диолдегидратазе и этаноламинаминолиазе достаточно велико для взаимодействия с субстратом, а в метилмалонил-КоА данное расстояние сопоставимо с необходимой для участия металлокомплекса в превращении субстрата [1].

II II II

-с-с- ~—- -с-с- —- -с-с- . нх нх ! х

Аёо-СЫ Ado + СЫ(П) АёоН+СЫ(П)

II II II

-с-с- ^—- -с-с- ^—- -с-с-хн хн х 1

Ado-Cbl Ado* + Cbl(II) AdoH+Cbl(II) Рис. 3. Обобщенный механизм реакций с участием аденозилкобаламина

Связь Co-Ado в аденозилкобаламине, находящемся вне фермента, достаточно стабильна (константа скорости гомолиза составляет 4-10"10 с"1 при 25°С). Однако если аденозилкобаламин находится в составе фермента,

17

происходит увеличение скорости этой связи гомолиза приблизительно в 10 раз [21]. Механизм активации связи Co-Ado является предметом исследования многочисленных работ, но пока это явление не объяснено. Возможные объяснения энзиматической активации гомолиза данной связи включают дестабилизацию Со(Ш)-состояния при вхождении кофактора в белковую оболочку и последующее связывание субстрата, стабилизацию Со(Н)-состояния и радикальных частиц, а также комбинацию процессов стабилизации Со(И) и дестабилизации Co(III) [21,22].

Синтез аденозилкобаламина из кобаламина и АТФ в организме человека катализируется ферментом-аденозилтрансферазой. Данный процесс включает в себя две основные стадии: образование кобаламина (I) и взаимодействие последнего с АТФ. Класс аденозилтрансфераз привлекает исключительный интерес исследователей в последние годы. Это обусловлено тем, что в их структуре экспериментально зафиксирован тетракоординационный кобаламин(П), что позволяет сделать обоснованные выводы о механизме энзиматического образования Со(1) (данный факт подробно рассмотрен далее в работе) [23-25].

Дегалогенирование органических субстратов имеет сходство с реакциями переноса метальной группы. Субстратами в данных реакциях могут выступать тетра- и трихлорэтилены, различные арилгалиды. Продуктами являются ион галогена и соответствующий углеводород. Как правило, кофакторами в данных ферментах являются корриноиды, в которых фрагмент ДМБИ замещен на некоординирующее основание (например, аденин в норпсевдовитамине В12). Лабильный аксиальный лиганд, по всей видимости, позволяет данным ферментным системам легче достигать глубоковосстановленных состояний [12].

Значительное количество публикаций, появившихся в последнее время, посвящено производному кобаламина - кобинамиду (Рис. 4), который является предшественником кобаламина в биосинтезе [26]. В данном соединении, в отличие от кобаламина, отсутствует нуклеотидная часть.

лн2

ын2

ын2

он

Рис. 4. Структурная формула дигидроксокобинамида

Известно, что аквакобаламин является эффективным антидотом цианида [27]. Исследования, проведенные с кобинамидом(Ш), также показали его высокую эффективность как ловушки цианида [28]. Однако лучшие результаты были получены при использовании в качестве антидота комплекса кобинамида(Ш) с сульфитом [29]. В отличие от аквагидроксокобинамида, его внутримышечные инъекции не вызывали пареза, связанного, по-видимому, с взаимодействием с оксидом азота(П) [30], и сорбция вещества тканями в данном случае была значительно выше [8,29]. На сегодняшний день эффективность сульфитокобинамида [8] и смеси сульфитокобинамида с димером 3-меркаптопирувата [31] как антидотов цианида значительно превосходит ту, которая наблюдается при использовании нитрита, тиосульфата, аквакобаламина. Преимущества сульфитокобинамида в данном случае обусловлены его низкой то